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RAFAEL FERRAZ ALVES Desenvolvimento e caracterização de vetores não virais para entrega gênica baseados em proteínas e lipossomas São Paulo 2014
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RAFAEL FERRAZ ALVES
Desenvolvimento e caracterização de vetores não virais para entrega
gênica baseados em proteínas e lipossomas
São Paulo
2014
RAFAEL FERRAZ ALVES
Desenvolvimento e caracterização de vetores não virais para entrega
gênica baseados em proteínas e lipossomas
Dissertação apresentada à Escola Politécnica da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Mestre em Ciências
São Paulo
2014
RAFAEL FERRAZ ALVES
Desenvolvimento e caracterização de vetores não virais para entrega
gênica baseados em proteínas e lipossomas
Dissertação apresentada à Escola Politécnica da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Mestre em Ciências
Área de Concentração: Engenharia Química
Orientador: Prof. Dr. Adriano Rodrigues Azzoni
São Paulo
2014
Aos meus pais pelo amor e por sempre estarem ao meu lado.
Agradecimentos
Primeiramente gostaria de agradecer ao meu orientador Adriano pela paciência
e dedicação despedido para a minha formação ao logo do mestrado. Neste
sentido através de inúmeras discussões científicas pude compartilhar de seus
valiosos conhecimentos que reacenderam em mim ainda mais a curiosidade
pelas descobertas, sempre visando o bem para a sociedade. Além disso,
através da sua simplicidade, respeito e disposição em ouvir e ajudar ao
próximo foi capaz de aumentar minha esperança e fé na fraternidade do ser
humano.
Eu também gostaria de agradecer de maneira especial à Professora Lucimara,
pela colaboração científica e pelas inúmeras reuniões que acrescentaram muito
à minha pesquisa e a dissertação. Vale ressaltar que, mesmo não existindo no
regimento da Pós-graduação da USP a figura de co-orientador para o
Mestrado, fica aqui registrado que a Professora Lucimara o foi de fato,
desempenhado esse papel de forma impecável.
À Professora Iolanda do Instituto de Química da USP (Bloco 10) por permitir o
uso do equipamento Zetasizer para a realização das medições dos parâmetros
físico-químicos dos complexos, e à Márcia pelo suporte técnico.
Ao Professor Sandro da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da USP (Bloco
17) pelo uso do Citômetro de Fluxo. Em especial gostaria de agradecer à
Renata Albuquerque pelo suporte técnico e pelos inúmeros conselhos dados
quando os resultados obtidos não eram agradáveis e nem animadores.
A todos os professores do GenBio, Aldo, Andreas, Pedro e Beatriz, pelas
inúmeras discussões científicas e por todo o suporte em geral.
Aos amigos da Unicamp, Marcelo, Marianna e Tiago pelos ensinamentos
compartilhados para a realização deste projeto.
Aos amigos do Genbio e agregados: Luis Mercier, Wesley, Bruno Labate,
Pedro Henrique, Letícia, Bianca, Giovani, Luiz Castelhano, Fernanda Bacciotti,
Maira, Tião, Bruno Oishi, Geise Ferreira, Guilherme, Daniel Campos, Paula,
Mari, Lidiane, Valter, Orlinda, Andrea e Mira. O tempo que passamos juntos foi
fundamental do ponto de vista científico, mas principalmente pelos momentos
de descontração extramente necessários para um ambiente profissional
saudável.
Aos amigos Joca, Rodrigo, Lucas Caixeta, Bruna Fernandes, Janaína, Eduardo
Razza, Lucas Palma, Danilo Bezerra, Marta Lopes e Leonardo Mendes que
sempre me apoiaram e ajudaram em todos os momentos. A jornada por mais
árdua que seja sempre é mais tranquila quando se tem um ombro amigo para
contar.
À minha namorada, Priscila pela paciência nos momentos de mau humor, mas
principalmente pelo amor e carinho que sempre me amparou nos momentos
difíceis e turbulentos.
À toda a minha família, em especial meus pais Mauro e Rose por transmitirem
para mim todos os valores essenciais (amor, esperança, honestidade,
fraternidade e confiança) para poder buscar a felicidade a cada momento. Ao
meu irmão, Danilo, pelos conselhos e pelas “brigas” que sempre me motivaram
a querer o melhor e a não desistir nunca. A família é à base da vida.
À Fapesp, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, pelo
auxilio financeiro, tanto na forma de minha bolsa de estudos, como também de
auxílio à pesquisa, permitindo assim a realização deste trabalho.
Ao CNPq, pela bolsa de estudos nos meses iniciais do mestrado, e também
pelo auxílio financeiro à pesquisa.
“ A ciência sem religião é paralítica – a
religião sem ciência é cega”
Albert Einstein
Resumo
Um dos principais limitantes do desenvolvimento de protocolos eficientes de
terapia gênica e vacinação com DNA provém da baixa eficiência de
transferência gênica por parte dos vetores não-virais. Isso surge,
principalmente, pela dificuldade de transporte de DNA estrangeiro do exterior
para o núcleo das células alvo, devido à presença de inúmeras barreiras. O
principal objetivo do trabalho realizado foi o desenvolvimento e caracterização
de novos vetores não virais multifuncionais, capazes de realizar eficientemente
a entrega de material genético (DNA plasmidial, pDNA) ao núcleo de células de
mamífero (HeLa). Para esse fim, complexos binários (CBs) foram formados
combinando-se pDNA à protamina ou proteínas recombinantes (TRP3)
anteriormente desenvolvidas por nosso grupo. Foi também estudado o
encapsulamento destes CBs em lipossomas catiônicos, formados pelos lipídios
EPC:DOPE:DOTAP, gerando então complexos pseudo-ternários (CPTs). Os
estudos com a protamina revelaram que os CPTs formados apresentavam
tamanhos relativamente pequenos (< 123 nm) e com valores de potencial zeta,
variando de +22,8 mV a +36,3 mV, nas várias relações mássicas
(pDNA:protamina) estudadas (1:0,5; 1:0,7, 1:0,9 e 1:1). Os ensaios de
transfecção mostraram que o CPT na relação 1:0,5 (CB) obteve o melhor nível
de transfecção das células (17,1%) com um nível de viabilidade celular de
73,2%. Os ensaios utilizando a TRP3 mostraram que os CPTs formados
adquiriram tamanhos pequenos (< 134 nm) e valores de potencial zeta entre
+36,8 mV e +11,9 mV dependendo da relação mássica do CB (1:1, 1:30 e
1:60). Os ensaios de transfecção mostram que os CPTs formados com a TRP3
aumentaram o nível de transfecção em todas as relações de pDNA-TRP3
usadas (1:1; 1:30 e 1:60). Vale ressaltar que nas relações mássicas 1:30 e 1:60
houve um aumento significativo na transfecção (25,2% e 24,5%,
respectivamente). Os ensaios de citotoxicidade mostram que os CBs não
afetaram a viabilidade célular, entretanto quando combinada ao lipossoma foi
observado aumento da citotoxicidade. Finalmente, os resultados indicam que
a TRP3 associada ao lipossoma (CPTs) aumenta a eficiência de entrega de
pDNA sugerindo um efeito sinérgico entre essas duas moléculas na superação
das várias barreiras físicas, químicas e difusionais encontradas na célula.
Abstract
One of the major challenges on the development of efficient protocols for gene
therapy and DNA vaccination is the low efficiency of gene transfer by non viral
vectors. This is mainly attributed to the fact that, during the traffic to target cells
nuclei, plasmid vectors must overcome a series of physical, enzymatic and
diffusional barriers. The objective of this work was the development and
characterization of new multifunctional non-viral vectors, based on lipids and
proteins, able to delivery efficiently the foreign pDNA (plasmid DNA) to the
nucleus of mammalian cells. A model pDNA containing the reporter gene GFP
was complexed to protamine or the recombinant protein (TRP3), forming “binary
complexes” (BC). In addition, we studied the ability of the cationic liposomes
(EPC:DOPE:DOTAP) to encapsulate this binary complexes to form “pseudo-
ternary complexes” (PTCs). The studies of size (DLS) and zeta potencial
revealed that both proteins were able to condense pDNA to form small
complexes (BCS and PTCs) (~100 nm) and positively charged (+11,9 mV a
+36,8 mV), both interesting characteristics for transfections. However, the CPTs
formed by TRP3 was that showed the highest transfections level (25,3%). The
cytotoxicity assays indicated the BCs had a low effect on the cell viability. On
the other hand, the biggest effect on cell death was found when PTCs were
used. The results indicated the TRP3 associated to liposomes (PTCs)
increased the delivery efficiency due to differences in the intracellular trafficking,
suggesting a synergic effect between these different molecules in the vector in
order to overcome the barriers found inside the cell.
Lista de Figuras
Figura 1. Vetores utilizados para transporte Vetores utilizados para
transporte de material genético (DNA/RNA) em ensaios clínicos
registrados na base de dados do periódico Journal of Gene
Medicine, Inglaterra. ....................................................................19
Figura 2. Principais barreiras à expressão gênica durante o tráfego de
vetores de pDNA: (1) degradação do pDNA por nucleases
extracelulares, (2) entrada na célula; (3) endocitose; (4)
degradação de pDNA no endossoma; (5) escape do endossoma;
(6) degradação de pDNA por nucleases citosólicas; (7) entrada no
núcleo; (8) transcrição; (9) exportação do mRNA; (10)
tradução........................................................................................22
Figura 3. . Estrutura molecular de cada um dos lipídios normalmente usados
para a formação do lipossoma catiônico: A, EPC (lipídio
estrutural); B, DOTAP (lipídio catiônico) e C, DOPE (co-lipídio ou
“helper”)........................................................................................30
Figura 4. Esquema ilustrativo da proteína recombinante TRP3 desenvolvida
por nosso grupo contendo os seguintes domínios específicos:
cauda de histidina (H6); domínio de ligação ao DNA
(DNAbinding); cadeia leve da dineína RP3; e peptídeo
membranoativo TAT....................................................................34
Figura 5. Ilustração dos diferentes domínios e sequências da proteína
TRP3 e da sua complexação com pDNA, originando um
complexo binário (CB) de carga
positiva.........................................................................................34
Figura 6. Ilustração das etapas de complexação, entrada na célula e
tráfego intracelular de um vetor baseado em cadeias leves de
dineína, como a TRP3. O complexo binário (CB) formado entre o
pDNA e a proteína recombinante (TRP3) pode ser ou não
encapsulado em um lipossoma formando o complexo pseudo-
ternário (CPT) antes de ser apresentado às células. Essa
estratégia, desenvolvida e estudada por nosso grupo, busca
partículas capazes de entrar na célula, facilitar o escape dos
endossomas e explorar a rede de microtúbulos para facilitar o
tráfego intracelular e entrada no núcleo (Figura adaptada de
Toledo et al., 2012).......................................................................40
Figura 7. Mapa do plasmídeo pVAX1GFP descrito em detalhe por Azzoni
et al. (2007). O plasmídeo foi desenvolvido originalmente com a
denominação pVAX1 pela empresa Invitrogen para utilização em
estudos de vacinação por DNA....................................................41
Figura 8. Análise qualitativa do pDNA pVAX1GFP purificado (Kit ILLustra
MiniPrep- GE) através da técnica de eletroforese em gel de
agarose (0,8%). 1) Marcador de peso molecular (1Kb
Fermentas);2) pVAX1GFP purificado pelo Kit..............................50
Figura 9. Análise da interação do pDNA com a protamina pelo ensaio de
retardo em gel de agarose (0,8%). Foram estudadas cinco
relações mássicas pDNA:protamina (1:0,5; 1:1; 1:2; 1:5; 1:10),
como mostrado na legenda da figura...........................................51
Figura 10. Determinação do tamanho médio de partículas do CB
(pDNA:protamina) em várias relações mássicas, mostrando que
com uma maior quantidade de protamina o complexo tende a se
manter estável (diâmetro reportado está ponderado em número
de partículas). Os números próximos a cada ponto indicam as
relações mássicas usadas
(pDNA:protamina)......................................................................52
Figura 11. Determinação do potencial zeta dos CBs (pDNA:protamina) para
diferentes relações mássicas, mostrando a mudança para
valores positivos a partir da relação
1:1,5...........................................................................................54
Figura 12. Análise da incorporação do complexo binário (pDNA:protamina)
pelos lipossomas para formação dos CPTs em gel de agarose
(0,8%). M, marcador de massa molecular (1 Kb, fermentas),
pDNA (Controle) e as 5 relações mássicas estudadas do
complexo pDNA:protamina (1:0,5; 1:0,7; 1:0,8; 1:0,9 e
1:1).............................................................................................55
Figura 13. Distribuição do tamanho dos CPTs formados pela combinação
do pDNA:protamina emrelações mássicas variadas (1:0,5; 1:0,7;
1:0,9; 1:1 e 1:1,5) com o lipossoma catiônico (quantidade
fixa).............................................................................................56
Figura 14. Determinação do potencial zeta dos CPTs formados a partir da
combinação do CBs (relações mássicas variadas) com o
lipossoma catiônico EPC/DOPE/DOTAP (volume
fixo).............................................................................................58
Figura 15. Gel SDS-PAGE (13,5%) mostrando a expressão da TRP3 em
E.coli BL21 (DE3) e a purificação por cromatografia de afinidade
Ni-NTA. Legenda: (M) Marcador de massa molecular; (1) Fração
solúvel contendo a proteína; (2) Fração de eluição com 500 mM
de imidazol (concentrada); (3) Fração de eluição com 500 mM
de imidazol.................................................................................59
Figura 16. Análise da interação do pDNA com a TRP3 (CBs) pelo ensaio
de retardo em gel de agarose (0,8%). Foram estudadas seis
relações mássicas pDNA:TRP3 (1:0,5; 1:1; 1:2; 1:5; 1:30 e 1:60),
como mostrado na legenda do gel............................................60
Figura 17. Determinação do diâmetro médio, em número, do complexo
binário (CBs) pDNA:TRP3 em várias relações mássicas. Os
números próximos a cada ponto indicam as relações mássicas
(pDNA:TRP3) estudadas............................................................61
Figura 18. Medidas da potencial zeta dos CBs (pDNA:TRP3) para
diferentes relações mássicas (1:4, 1:8, 1:30 e 1:60), mostrando a
mudança para valores positivos a partir da relação 1:8. O ensaio
foi feito em triplicata... ...............................................................62
Figura 19. Análise da incorporação do complexo binário (pDNA:TRP3)
pelos lipossomas em gel de agarose (0,8%) para a formação dos
CPTs. pDNA (Controle positivo) e as 4 relações mássicas
estudadas do complexo pDNA:TRP3 (1:1; 1:4; 1:30;
1:60)...........................................................................................63
Figura 20. Distribuição dos tamanhos, em número, dos complexos
pseudo-ternários (CTPs) formados pela combinação do
pDNA:TRP3 em relações mássicas variadas (1:1, 1:4, 1:30 e
1:60) com o lipossoma (quantidade
fixa).............................................................................................64
Figura 21. Medidas do potencial zeta dos complexos pseudo-ternários
(CTPs) formados a partir da combinação do pDNA:TRP3
(relações mássicas variadas) com o lipossoma catiônico
(quantidade fixa).........................................................................65
Figura 22. Eficiência de transfecção das células HeLa utilizando-se os
complexos binários pDNA:protamina (1:0,1; 1:0,5 e 1:1,5) e
pDNA:TRP3 (1:1; 1:30 e 1:60), e complexos pseudo-ternários
nas mesmas relações avaliadas para o complexo binário. Os
complexos pDNA:Lipossoma e pDNA:lipofectamina incluídos
como controles. Os ensaios foram realizados em triplicata.......66
Figura 23. Ensaio de citotoxicidade de todos CBs, CPTs, lipossoma e
lipofectamina, usando tanto a protamina como a TRP3 como
agente condensador do material genético. As barras de erros
indicam o desvio entre ensaios realizados em
triplicata......................................................................................72
Figura 24. Ensaio de transfecção em célula HeLa utilizando-se diferentes
dosagens (1,5 µg, 1,0 µg, 0,8 µg, 0,5 µg e 0,3 µg) dos CPTs
contendo a proteína TRP3 na relação 1:30. O experimento foi
realizado em triplicata e as barras de erro indicam o desvio
padrão........................................................................................74
Figura 25. Ensaio de citotoxicidade em célula HeLa utilizando-se diferentes
dosagens (1,5 µg, 1,0 µg, 0,8 µg, 0,5 µg e 0,3 µg) dos CPTs
contendo a proteína TRP3 na relação 1:30. O experimento foi
realizado em triplicata e as barras de erro indicam o desvio
padrão........................................................................................75
Figura 26. Ensaio de transfecção usando a droga cloroquina para se avaliar
o envolvimento dos endossomas na eficiência de transfecção de
células HeLa. Os complexos usados foram: CB (1:60), CPT
(1:30) e DNA:lipossoma. Os experimentos foram realizados em
triplicata.....................................................................................76
Figura 27. Ensaio de transfecção utilizando a droga nocodazol para se
avaliar o envolvimento dos microtúbulos na eficiência de
transfecção de células HeLa. Os complexos usados foram: CB
(1:60), CPT (1:30) e DNA:lipossoma. Os dados obtidos do CB
(*) foram obtidos pela aluna Marianna Favaro (Favaro, 2012). Os
experimentos foram realizados em triplicata.............................78
Figura 28. Ensaio de Acessibilidade ao DNA. Os resultados comparam a
intensidade de fluorescência do DNA presente nos CBs e CPTs
em relação ao DNA livre, usado como controle do
experimento................................................................................79
Figura 29. Microscopia eletrônica de transmissão dos complexos binários
(CBs) nas relações 1:30 (A) e 1:60 (B), e dos complexos
pseudo-ternários (CPTs) nas relações 1:30 (C) e 1:60 (D). As
setas vermelhas mostram o halo do lipossoma formado nos
CPTs. As escalas de barras indicam 100 nm em todas as
micrografias (A, B, C e
D)................................................................................................81
Lista de Tabelas
Tabela I. Tamanho médio e polidispersidade dos CPTs formados com
diferentes relações mássicas (pDNA:protamina)
.....................................................................................................57
Tabela II. Tamanho médio e polidispersidade dos CPTs formados com
diferentes relações mássicas (pDNA:TRP3)................................64
Sumário
1. Introdução......................................................................................................17
2. Revisão Bibliográfica.....................................................................................21
2.1 Entrada de Transgenes nas Células............................................................22
2.2 Tráfego Intracelular de Transgenes e o Papel dos Microtúbulos................23
2.3 Translocação pela Membrana Nuclear........................................................25
2.4 Lipossomas como Vetores de Entrega Gênica............................................27
2.5 Proteínas e Peptídeos como Vetores de Entrega Gênica...........................30
2.6 Vírus Artificiais.............................................................................................35
3. Objetivos........................................................................................................39
3.1 Objetivos Gerais..........................................................................................39
3.2 Objetivos Específicos...................................................................................39
4. Metodologia...................................................................................................41
4.1 Purificação de Plasmídeos..........................................................................41
4.2 Purificação da Proteína Recombinante TRP3 ............................................42
4.3 Formação dos Complexos Binários.............................................................42
4.4 Formação dos Complexos Pseudo-ternários...............................................43
4.5 Ensaio de Migração em Gel de Agarose.....................................................43
4.6 Tamanho Hidrodinâmico Médio...................................................................43
4.7 Potecial Zeta................................................................................................44
4.8 Acessibilidade ao DNA................................................................................46
4.9 Microscopia Eletrônica de Transmissão .....................................................46
4.1.0 Cultura e Transfecção de Células de Mamíferos......................................47
4.1.1 Viabilidade Celular....................................................................................48
5. Resultados e Discussões...............................................................................50
6. Conclusões....................................................................................................82
7. Sugestões......................................................................................................84
8. Referências....................................................................................................85
17
Introdução
A terapia gênica nasceu há 50 anos com estudos pioneiros conduzidos
por Szybalska e Syzbalski (1962), nos quais os pesquisadores relataram a
primeira transferência gênica a células de mamíferos. Assim a terapia gênica
pode ser definida como um procedimento destinado a introduzir em um
organismo vivo, com o uso de técnicas do DNA recombinante, genes sadios
para substituir, manipular ou suplementar genes inativos ou não funcionais
(Linden, 2010). Com os avanços tecnológicos atuais, a medicina moderna
acrescenta, a cada dia, descobertas importantes em áreas de investigação
destinadas ao desenvolvimento de novos tratamentos para doenças ainda
incuráveis. Neste sentido, a expectativa de curar doenças genéticas baseia-se
na identificação de genes responsáveis pela sua patogênese e sobre os
avanços das tecnologias do DNA recombinante que permitam a manipulação
do genoma de forma eficiente e segura (Watson et al., 2006). Ao mesmo
tempo, avanços nas áreas de biologia celular e molecular relativos à
compreensão dos mecanismos associados a eventos patogênicos, aumentam
a expectativa de que a manipulação genética possa ser aplicada a uma série
de doenças (Colleman e Tsongalis, 2009). Assim, a primeira aplicação da
terapia gênica na clínica médica aconteceu nos anos 90 em um paciente que
sofria de uma doença causada pela deficiência da enzima adenosina
desaminase (ADA), importante para o desenvolvimento do sistema imune. Na
ocasião, depois de relativo sucesso com o tratamento convencional a base de
administração desta enzima, o paciente voltou a apresentar sintomas da
doença. Assim, os médicos optaram por um tratamento experimental baseado
18
na terapia gênica, na qual foi comprovada a eficácia da abordagem utilizada
(Anderson et al., 1990).
Uma das principais barreiras ao desenvolvimento da terapia gênica para a
prática médica ainda é a segurança, que está diretamente relacionada aos
vetores de entrega gênica (Linden, 2010). Vetores são definidos como os
agentes que, associados ao gene terapêutico, são responsáveis pela sua
proteção e transporte do exterior para o interior das células alvo, fenômeno
este também chamado de “entrega gênica”. Os vetores virais, apesar de serem
mais eficientes na entrega do material genético em comparação aos vetores
não virais, estão geralmente associados às respostas imunológicas adversas e
inflamatórias algumas vezes graves (Edelstein et al., 2007; Saccardo et al.,
2009). Nesse sentido, tem crescido as pesquisas focadas no desenvolvimento
de vetores não virais eficientes (Samadikhah et al., 2011; Hoyer e Neundorf,
2011; Arukuusk et al., 2013), de forma que estes possam incorporar as
principais vantagens dos vírus (condensação do DNA, reconhecimento celular,
entrada na célula, tráfego intracelular e translocação nuclear), entretanto
evitando as propriedades indesejadas dos mesmos (patogenicidade, toxicidade
e reações inflamatórias e imunes) (Rubanyi, 2001). A Figura 1 sumariza os
principais vetores utilizados em testes clínicos até o ano de 2012.
19
Figura 1. Vetores utilizados para transporte de material genético (DNA/RNA) em ensaios
clínicos registrados na base de dados do periódico Journal of Gene Medicine, Inglaterra.
Seguindo este raciocínio, vários esforços têm focado no aumento da
eficiência de vetores não virais e, para isso, tem-se intensificado a utilização de
adjuvantes de natureza catiônica capazes de interagir com o pDNA (DNA
plasmidial contendo o gene terapêutico) de forma a condensar e proteger esse
material genético dos fluidos extracelulares. Dentre estes veiculadores
podemos destacar os lipossomas catiônicos capazes de proteger o DNA dos
fluídos intersticiais e de interagir com as células (Gregoriadis, 1993; Lasic,
1997), e as proteínas multifuncionais que através de domínios específicos são
capazes de mimetizar as atividades virais relevantes para entrega do material
genético (Espín et al., 2011).
Entretanto, apesar de bons resultados terem sido alcançados através do
desenvolvimento de vetores não virais usando lipossomas catiônicos e
proteínas multifuncionais, a falta de estudos sistemáticos e comparativos tem
20
comprometido o entendimento dos efeitos que as diferentes moléculas e
ligantes exercem no mecanismo de transfecção (Ferrer-Miralles et al., 2008).
No sentido de aumentar as expectativas relativas à aplicação da terapia
gênica na prática médica, este trabalho visa a contribuir com o
desenvolvimento e a caracterização de novos vetores não virais, baseados na
incorporação de proteínas recombinantes e lipossomas catiônicos em um
mesmo complexo (vetor), buscando correlacionar parâmetros físico-químicos
(tamanho, potencial zeta, dentre outros) com eficiência de transfecção do
material genético em células de mamíferos. Assim como o trabalho visa o
desenvolvimento de um vetor eficiente para uma futura aplicação terapêutica in
vivo, é de extrema importância avaliar a citotoxicidade destes complexos (CBs
e CPTs) nas células HeLa.
21
2. Revisão da Literatura
A entrega eficiente e segura de material genético é um problema
recorrente nos estudos de terapia gênica e vacinação com DNA (Edelstein et
al., 2007, Cohen et al., 2009). Neste contexto, a escolha do vetor a ser utilizado
na entrega do material genético é fator de importância fundamental. De forma
geral, esses vetores são classificados como vetores virais e não virais, e a
escolha daquele a ser utilizado baseia-se, principalmente, na natureza da
doença a ser tratada e nas necessidades relativas ao tempo e a intensidade da
expressão do gene terapêutico a ser inserido (Audouy et al, 2002). Vetores
virais continuam sendo os mais eficientes, pois suas características naturais
permitem o reconhecimento celular mediado por receptores específicos,
internalização na célula, escape de vesículas endossomais, transporte ao longo
dos microtúbulos e translocação nuclear. Entretanto, vetores virais são
complexos e custosos de se produzir, além de estarem associados a respostas
imunológicas e inflamatórias algumas vezes graves (Edelstein et al., 2007;
Saccardo et al., 2009). Considerados mais seguros, os vetores não-virais são
menos eficientes no transporte do material genético quando comparados aos
vetores virais. Isto ocorre devido à elevada degradação por nucleases extra e
intracelulares, dificuldade de internalização por endocitose e locomoção do
pDNA no congestionado ambiente intracelular, além da dificuldade de superar
a barreira representada pela membrana nuclear (Ruponen et al, 2009) (Figura
2).
22
1
2 3
4
5
6
7
8
9
10
Figura 2. Principais barreiras à expressão gênica durante o tráfego de vetores de pDNA: (1)
degradação do pDNA por nucleases extracelulares, (2) entrada na célula; (3) endocitose; (4)
degradação de pDNA no endossoma; (5) escape do endossoma; (6) degradação de pDNA por
nucleases citosólicas; (7) entrada no núcleo; (8) transcrição; (9) exportação do mRNA; (10)
tradução.
2.1 Entrada de Transgenes na Célula
Aumentos expressivos na eficiência de internalização celular de vetores
não virais (principalmente DNA plasmidial) têm sido alcançados utilizando-se
adjuvantes de natureza catiônica que interagem, condensam e protegem o
material genético, formando nanopartículas com características físico-químicas
(tamanho de partículas e cargas) essenciais para interação com a membrana
celular, primeiro passo para a entrada na célula. Dentre estes adjuvantes estão
os lipídeos ou lipossomas catiônicos (Audouy et al., 2002), lipossomas
fusogênicos sensíveis à variação de pH (Yuba et al., 2008), polímeros
modificados de polietilenoimina (PEI) (Nimesh et al., 2007) ou conjugados
lipossomas-procatiônico-protamina-DNA (Zhong et al., 2007). Além de facilitar
a internalização do pDNA através da endocitose, a formação dos complexos
adjuvante-pDNA é eficiente na proteção do plasmídeo contra a degradação
por nucleases (de Paula et al., 2007).
23
Sabe-se que esses vetores não virais, também conhecidos como “vírus
artificiais”, para serem capazes de transfectar o DNA de maneira eficiente nas
células, precisam estar com tamanho e morfologia adequados (nanoescala)
para que possam interagir eficientemente com a membrana celular e serem
absorvidos, similarmente ao que ocorre com as partículas virais naturais (Jiand
et al., 2008). Também é relatada na literatura a importância da carga líquida
positiva da partícula, visto que os complexos geralmente entram na célula após
a interação com a membrana carregada negativamente (Frohlich, 2012;
Medina-Kauwe et al., 2005).
2.2 Tráfego Intracelular de Transgenes e o Papel dos Microtúbulos
Apesar da entrada do pDNA nas células ser grandemente facilitada pelo
uso de lipídeos ou polímeros catiônicos (até centenas de milhares de cópias
por célula), poucas cópias chegam efetivamente ao interior dos núcleos, sendo
a maior parte retida na região perinuclear e degradada no interior dos
endossomas tardios e lisossomas (Zabner et al., 1995; Azzoni et al., 2007).
Uma das principais diferenças entre a entrada de vetores virais e não virais nas
células está no recrutamento, por parte dos vetores virais, de proteínas
motoras associadas aos microtúbulos (MT) para o rápido transporte intracelular
até a periferia do núcleo da célula alvo (Leopold e Pfister, 2006). Os
microtúbulos são filamentos polarizados do citoesqueleto formados por
heterodímeros igualmente orientados de α e β-tubulina e também proteínas
associadas ao MT como a kinesina 1 e as dineínas citoplasmáticas (Döhner et
al., 2005; Kunwar et al, 2013). Sua extensa rede é utilizada para o transporte
de uma variedade de cargas (organelas membranosas e proteínas) para
24
regiões celulares específicas (Schroer & Sheetz, 1991). Em células cuja rede
de microtúbulos está disposta de forma radial, a extremidade “menos” dos MTs
está orientada para o centrossoma, próximo ao núcleo da célula, enquanto a
extremidade “mais” está orientada para a periferia da célula. Alguns vírus
utilizam os MTs para o movimento intracelular, dentre eles podemos citar o
citomegalovírus, o vírus da imunodeficiência humana, herpes simplex e
adenovírus (Ogawa-Goto et al., 2003; Bukrinskaya et al., 1998; Penfold et al.,
1994; Suomalainen et al., 1999). Apesar dos avanços, ainda há pouco descrito
sobre os mecanismos de interações entre as partículas virais e o sistema de
transporte intracelular via microtúbulos. Sabe-se, entretanto, que esse
transporte geralmente envolve a associação com as dineínas, também
conhecidas como motores moleculares.
Dentre as famílias de proteínas motoras já descritas, são as dineínas
citoplasmáticas as responsáveis pelo transporte intracelular de cargas pela
rede de MTs no sentido da periferia da célula para o centro de organização de
microtúbulos/centrossoma (Tzfira, 2006). As dineínas são complexos proteicos
(20S) constituídos por duas cadeias pesadas (CP, 520 kDa), duas cadeias
intermediárias (CI, 74 kDa), algumas cadeias leves intermediárias (CLI, 53-57
kDa), e várias cadeias leves (CL) das famílias LC8, TcTex/Rp3 e
LC7/roadblock (Döhner et al., 2005). As cadeias pesadas são responsáveis
pela ligação ao MT, hidrólise de ATP e movimento, enquanto as cadeias CI,
CLI e CL são responsáveis pela ligação às cargas e regulação da atividade
motora. Variações na composição das subunidades de ligação (CL e CLI)
acarretam interações com diferentes tipos de cargas (Döhner et al., 2005;
Pfister et al., 2006). Além disso, existe a necessidade de outras proteínas
25
como ativadores ou adaptadores, incluindo as Dinactinas e a Lis 1, para que
possa ser regulada a atividade motora das dineínas (Kardon et al., 2009). Em
um trabalho realizado por Moseley e colaboradores (2007), foi enfatizado o
papel crucial das Dineínas como facilitadoras do translado da proteína P do
vírus da raiva e da poliproteína Gag do vírus M-PMV, através da associação
das proteínas com as cadeias leves de dineína LC8 e TcTex-1,
respectivamente.
Quanto aos plasmídeos, até pouco tempo acreditava-se que o
movimento dessas moléculas no interior de células transfectadas ocorria por
difusão livre ou interações não específicas com componentes do citoplasma
(Lukacs et al., 2000; Lechardeur et al., 2005). Foi apenas mais recentemente
que o trabalho de Vaughan e Dean (2006) demonstrou, ainda que por
mecanismos não elucidados, que o tráfego de plasmídeos em direção ao
núcleo depende da ação de Dineínas em seu movimento pela rede de MTs.
Ondrej e colaboradores (2007) demonstraram que a ligação a microtúbulos e
transporte ao longo destes filamentos polarizados é imprescindível para a
eficiente transfecção de células utilizando-se lipoplexos (complexos pDNA-
lipídeos catiônicos). Nesse contexto, a utilização ou desenvolvimento de
proteínas ou peptídeos capazes de intermediar interações com dineínas tem
sido apontado como uma alternativa promissora para a entrega de agentes
terapêuticos (inclusive DNA) ao núcleo das células (Mastrobattista et al., 2006;
Grosse et al., 2007).
2.3 Translocação pela membrana nuclear
A membrana nuclear, última barreira à entrada do vetor plasmidial no núcleo,
tem sido um obstáculo relativamente mais fácil de superar. Hoje se
26
compreende bem o mecanismo clássico de translado de proteínas para o
interior do núcleo (Alvisi et al., 2006; Stewart, 2007) e sabe-se que, para
adentrar ao núcleo, qualquer molécula maior que aproximadamente 40 kDa
precisa ser transportada ativamente através dos complexos dos poros
nucleares (CPN). Múltiplas cópias de aproximadamente 30 diferentes proteínas
(nucleoporinas) formam esses grandes complexos moleculares (~120 nm de
diâmetro e 70 nm de profundidade) que se localizam no envelope nuclear
(Stewart, 2007). O translado de proteínas para o núcleo envolve o
reconhecimento de sequencias de localização nuclear (um ou dois “clusters” de
resíduos de aminoácidos básicos) na proteína alvo por parte de proteínas
importadoras (α e β importinas). O complexo é então reconhecido e
transportado através do CPN (Alvisi et al., 2006; Stewart, 2007). O translado de
pDNA através de CPNs tem sido estudado através da utilização de peptídeos
ou proteínas contendo sequências de localização nuclear (SLN). Parker e
colaboradores (2005) estudaram a utilização de polilisina (Lis16) para a
condensação e importação nuclear de pDNA. Foi verificado aumento da
expressão do gene repórter, principalmente para células em divisão. Mais
recentemente, um abrangente estudo realizado por Collins e colaboradores
(2007) utilizando SLN SV40 mostrou que, apesar de importantes, essas
sequências por si só não são eficientes na transfecção de células que não
estejam em divisão.
27
2.4 Lipossomas como vetores de entrega gênica
Os lipossomas são estruturas agregadas de fosfolipídios em forma de
bicamada cujo volume aquoso central encontra-se circundado por uma ou
várias lamelas concêntricas, com diâmetros variáveis (dezenas de nanômetros
a dezena de micra) (Lasic, 1993). Esses compostos têm como características
possuírem compatibilidade química e biológica com as membranas celulares, o
que facilita a entrega de fármacos e material genético às células. Os
lipossomas tem mostrado uma melhora na farmacocinética e na distribuição de
agentes terapêuticos e, além disso, são eficazes na proteção das moléculas da
degradação e na liberação sustentada do material encapsulado (Chang e Yeh,
2012).
Os lipossomas catiônicos surgiram como uma promessa para a entrega
gênica devido a sua relativa baixa toxicidade e imunogenicidade (Duarte et al.,
2012). Além disso, são capazes de interagir eletrostaticamente com o DNA
(carregado negativamente), produzindo um complexo condensado e compacto
que reduz sua susceptibilidade a nucleases, favorecendo a transferência
eficiente do material genético (El-Aneed, 2004). Esses lipossomas podem
conter apenas o lipídio catiônico ou ainda incorporarem lipídios neutros como o
DOPE (1,2-Dioleoil-sn-Glicero-3-fosfoetanolamina) e Colesterol. Vários lipídios
catiônicos têm sido empregados, dentre eles podemos destacar os que contêm
grupos quaternários de amônio, como o DDAB (brometo de dimetildioctadecil
amônio), DOTAP (1,2 dioeloil-3-trimetilamônio-propano) e o DODAP (1,2 Diacil-
3 dimetilamônio-propano) que são os mais usados pelos seus benefícios na
transfecção (Labas et al., 2010). Vale destacar a necessidade de utilização
concomitante de lipídios estruturais como o EPC (Fosfatidilcolina de Ovo) para
28
a formação dos lipossomas, visto que apenas os lipídios catiônicos não
induzem a formação dos lipossomas. Além disso, pensando no processo de
liberação do material genético no citoplasma celular, é necessário que estes
sejam liberados da membrana endossomal após a entrada por endocitose.
Nesse sentido, é importante a presença de lipídios auxiliadores (“helpers”),
também conhecidos como fosfatidil-etanolaminas (PEs) que intensificam o
processo de liberação por possuírem propriedade fusogênicas, que facilitam a
desestabilização da membrana endossomal (Felgner et al, 1994, Mochizuki et
al., 2013). Dentre essa classe de moléculas, podemos citar o DOPE como de
grande utilidade nos estudos de transfecção in vitro de lipídios catiônicos
(Nayerossadat et al., 2012). A figura 3 representa a estrutura molecular de
cada um dos lipídios citados anteriormente, normalmente utilizados para a
formação de lipossomas catiônicos: lipídio estrutural (EPC), lipídio catiônico
(DOTAP) e o lipídio helper (DOPE).
A Lipofectamina (Invitrogen) é um exemplo bastante usado de lipídeo
catiônico que atua como adjuvante complexando moléculas de ácido nucleico
para que estas possam superar a repulsão eletrostática da membrana celular.
Apesar de aumentar a eficiência da entrega de pDNA, lipídeos catiônicos
podem apresentar como desvantagem a super-estabilização do complexo, o
que inibiria a liberação do DNA através da interação com poliânions no interior
da célula (Oana et al., 2009), além da toxicidade associada à sua propriedade
natural de fusão a membranas (Zhang et al., 2001; Vázquez et al., 2008). Em
um trabalho realizado por De La Torre e colaboradores (2009) foi desenvolvido
um lipossoma catiônico composto por EPC/DOPE/DOTAP para veiculação de
uma vacina gênica contra tuberculose. Para isso o plasmídeo DNA-hsp65 foi
29
incorporado no interior das estruturas lipídicas. Os resultados se mostraram
reprodutíveis, apresentado níveis de citotoxicidade próximos aos encontrados
com a utilização apenas do DNA. Também, foi demonstrado o efeito profilático
desta vacina, com a vantagem adicional de ser menos invasiva pela
administração intranasal (Rosada et al., 2008; de La Torre et al., 2009).
Em sequência a esse estudo, Balbino e colaboradores (2012) buscaram
correlacionar as propriedades físico-químicas e estruturais dos complexos
contendo pDNA/lipossomas catiônicos com eficiência de transfecção in vitro.
Os resultados mostraram que diferenças na relação de cargas dos complexos
(R +/-) causam um impacto significativo no número de lamelas e, por
conseguinte na conformação dos complexos, o que resultou em diferentes
níveis de transfecção. Em outro trabalho desenvolvido pelo mesmo grupo,
foram avaliados os parâmetros do processo de produção do mesmo complexo
(pDNA/Lipossoma catiônico) usando dois dispositivos microfluídicos
(focalização hidrodinâmica simples e o misturador com barreiras em
microcanais) e o efeito destes na transfecção de células de mamíferos. Os
resultados obtidos pelos pesquisadores mostraram que o pDNA incorporado
dentro das estruturas lipídicas foi diferente nos dois dispositivos, e que a
temperatura influencia apenas no tamanho médio das partículas produzidas
pelo dispositivo simples (Balbino et al, 2013).
30
A
B
C
2.5 Peptídeos e Proteínas como vetores de entrega gênica
Mais recentemente, tem sido intensificado o estudo de peptídeos
membrano-ativos, ricos em arginina e lisina, como facilitadores da entrega
gênica (Ferrer-Miralles et al., 2008). Como os lipídeos e polímeros anteriores, a
natureza catiônica destes peptídeos permite a condensação e proteção do
ácido nucleico (Ferrer-Miralles et al., 2008). Exemplos destes peptídeos são o
TAT do vírus da imunodeficiência humana (HIV) e o peptídeo penetratina (ou
antennapedia de Drosophila) (Astriab-Fisher et al., 2002; Moschos et al., 2007).
O TAT é um peptídeo de 11 aminoácidos capaz de carrear moléculas tanto
através da membrana plasmática quanto nuclear (Nitin et al., 2009). Já a
penetratina é um peptídeo anfifílico que possui diversos resíduos de arginina e
lisina em sua cadeia, que interagem e condensam DNA, além de atuarem
ativamente na transposição de membranas, facilitando assim a internalização
Figura 3. Estrutura molecular de cada um dos lipídios normalmente usados para a formação
do lipossoma catiônico: A, EPC (lipídio estrutural) R1 e R2, nas posições Sn-1 e sn-2
correspondem a cadeias acila de diferentes comprimentos e graus de insaturação; B,
DOTAP (lipídio catiônico) e C, DOPE (co-lipídio ou “helper”).
R1
R2
31
na célula e também o escape de vesículas endossomais (Ferrer-Miralles et al.,
2008). Outra molécula muito utilizada em estudos de entrega gênica é o
peptídeo protamina ou sulfato de protamina (Caracciolo et al, 2011; Chen et al,
2011; Yuan et al, 2013). Esta molécula (massa molecular entre 4000 – 4250
Da) caracteriza-se por possuir uma cadeia de aminoácidos rica em arginina. A
protamina foi primeiramente isolada do esperma de peixes maduros, e sua
principal função é interagir e compactar o DNA genômico para que este possa
ser entregue ao núcleo do óvulo (Tsuchiya et al, 2006). Sua aplicação nos
estudos de entrega gênica se deve principalmente a esta característica
intrínseca de compactação do material genético, ajudando a superar um dos
principais obstáculos nessa área, a degradação intra e extracelular por
nucleases. Além disso, a protamina possui sinal de localização nuclear o que
pode favorecer a entrada do complexo no núcleo das células (Reynolds et al,
2005). No estudo realizado por Sanz et al (2012) foi desenvolvido um vetor não
viral, baseado em nano tubos de carbono complexado com a protamina e a
cloroquina. Os resultados mostraram que este novo vetor foi capaz de
aumentar a entrega gênica e a expressão do gene repórter (luciferase). Dentre
os motivos para essa melhora da eficiência de transfecção os autores citam a
capacidade de translocação nuclear proporcionada pela protamina devido ao
seu sinal de localização nuclear.
De forma geral, a condensação de DNA plasmidial de forma a criar
partículas toroidais capazes de penetrar em células de mamífero requer uma
sequência de aminoácidos positivos (lisinas ou, principalmente, argininas) de
no mínimo 6 a 10 resíduos (Rudolph et al., 2003). A forma de entrada dos
vetores não-virais nas células pode ser a endocitose mediada por clatrina,
32
caveolae, macropinocitose, entre outras diferentes formas de interação e é
também dependente do tamanho da partícula (Ferrer-Miralles et al., 2008).
Apesar de vários trabalhos terem abordado o tema, pouco ainda se sabe sobre
os mecanismos de entrada celular e a rota intracelular em transfecções
mediadas por peptídeos e proteínas. Mais recentemente, o consenso de que
um único tipo de vetor pode ser internalizado por diferentes rotas (clatrina
dependente, caveolae, etc.) e que estas, de forma geral, levam aos
endossomas tardios e lisossomas, enfatiza que o escape de endossomas é
fundamental para uma transfecção eficiente (Vázquez et al., 2008). Nesse
sentido, a adição de resíduos de histidina nos peptídeos e proteínas pode
facilitar a liberação dos complexos através de um efeito conhecido como
“esponja de prótons”. Esse efeito relatado anteriormente acontece devido a
entrada facilitada de prótons para dentro da vesícula, que causa um aumento
da pressão osmótica, responsável pelo rompimento mecânico do
endossoma.(Midox et al., 2009).
Recentemente nosso grupo tem trabalhado no desenvolvimento de
vetores não virais capazes de melhorar a eficiência da transfecção de DNA
plasmidial em células de mamíferos (Hela). Para isso, têm sido desenvolvidas
proteínas multifuncionais com diferentes domínios, cujas funções visam
superar as inúmeras barreiras encontradas (entrada celular, escape
endossomal, proteção contra nucleases, transporte intracelular e entrada
nuclear) no transporte deste material genético ao logo do citoplasma até a
expressão proteica no núcleo da célula alvo. Nesse sentido, no trabalho de
Toledo et al. (2012) sob orientação do Dr. Adriano R. Azzoni foi produzida uma
proteína recombinante (LC8, cadeia leve da dineína) com diferentes domínios
33
(ligação ao DNA e interação com motores moleculares), visando aumentar a
eficiência de transfecção em células de mamíferos. Os resultados mostraram
que a proteína de fusão LC8 foi capaz de condensar o pDNA e formar
complexos carregados positivamente e interagir in vitro com a cadeia leve da
dineína. Os ensaios de transfecção indicaram que a LC8 foi capaz de
transfectar eficientemente células HeLa, e com uma baixa citotoxicidade. Em
outro trabalho recente desenvolvido pelo grupo, foi produzida outra proteína
recombinante (RP3-Db) baseada na cadeia leve da dineína (RP3) e possuindo
um domínio de ligação ao DNA para entrega gênica. Os resultados mostraram
que a RP3-Db foi capaz de interagir com os motores moleculares e interagir
eficientemente com o material genético. Os ensaios de transfecção indicam
que a abordagem utilizada foi capaz de aumentar a eficiência de transfecção
em células HeLa (Toledo et al, 2013). Tendo em vista os resultados
promissores obtidos anteriormente com a RP3-Db o grupo decidiu investir
esforços nesta proteína. Seguindo esta mesma estratégia para entrega gênica,
foi desenvolvida outra proteína multifuncional (TRP3) baseada na cadeia leve
da dineína (RP3), possuindo um domínio de ligação ao pDNA (citado
anteriormente) e ainda fusionada com um domínio TAT (peptídeo membrano
ativo) para facilitar a entrada nuclear do complexo. Os resultados mostram que
a TRP3 foi capaz de condensar o pDNA, formando partículas toroidais com
tamanho pequeno (< 100 nm) e com potencial zeta positivo. Os ensaios de
transfecção em células de mamíferos (HeLa) mostram que o complexo formado
pela TRP3 teve uma excelente capacidade de transferência do material
genético (superior às proteína estudada anteriormente, LC8 e RP3-Db) e com
um baixa citotoxicidade nas células (Favaro et al, 2012). A Figura 4 mostra de
34
forma ilustrativa a proteína TRP3 com os diferentes domínios, desenvolvida por
nosso grupo e que foi utilizada neste trabalho em combinação com o lipossoma
catiônico para a formação de um novo vetor não viral para entrega gênica. Na
Figura 5 podemos observar de maneira ilustrativa a proteína recombinante
TRP3 interagindo com o pDNA para a formação do complexo binário (pDNA-
TRP3) carregado positivamente.
Figura 4. Esquema ilustrativo da proteína recombinante TRP3 desenvolvida por nosso grupo
contendo os seguintes domínios específicos: cauda de histidina (H6); domínio de ligação ao
DNA (DNAbinding); cadeia leve da dineína RP3; e peptídeo membranoativo TAT.
Figura 5. Ilustração dos diferentes domínios e sequências da proteína TRP3 e da sua
complexação com pDNA, originando um complexo binário (CB) de carga positiva.
35
2.6 Vírus Artificiais
Dentro da concepção de que vetores virais são pouco seguros e os
vetores não-virais são pouco eficientes, foi criado o conceito de “vírus
artificiais”, que seria um sistema capaz de unir a segurança de vetores não-
virais com e eficiência de vetores virais, o que pode ser obtido adicionando-se
(i) ligantes de diferentes naturezas que estimulam o direcionamento celular e
facilitam a entrada na célula, (ii) peptídeos fusogênicos que evitam a
degradação endossomal, (iii) sinais de localização nuclear que tornam a
entrada no núcleo mais eficiente, sempre em diferentes associações com o
pDNA em busca de mimetizar os vírus verdadeiros (Müller et al., 2001;
Mastrobattista et al., 2006). Em geral, os efeitos das moléculas ligantes
utilizadas para aumentar a eficiência dos vetores não-virais são estudados
isoladamente, de modo que o desenvolvimento de vírus artificiais bem
sucedidos tem sido comprometido pela falta de estudos sistemáticos e
comparativos (Ferrer-Miralles et al., 2008). Uma vez que o vírus artificial deve
anexar pequenos peptídeos e proteínas, além de polímeros ou lipídeos
catiônicos ao DNA, é importante que estas moléculas sejam incorporadas sem
inibir ou dificultar a função do vetor em si (Roth e Sundaram, 2004; Ferrer-
Miralles et al., 2008). O primeiro trabalho a demonstrar a viabilidade de
utilização in vivo destes complexos foi o reportado por Li e Huang (1997), onde
foi mostrado que a inclusão de protamina ao sistema DNA-DOTAP (lipídeo
catiônico) aumentou sensivelmente a estabilidade e eficiência de entrega
gênica do vetor em camundongos. A criação de novos vetores de entrega
gênica, intitulados “vírus artificiais”, formados a partir da conjugação de
diferentes estratégias (peptídeos catiônicos, polímeros ou lipídeos) em um só
36
vetor e capazes de congregar diferentes capacidades tem gerado novas e
promissoras expectativas na área de terapia e vacinação gênicas (Ferrer-
Miralles et al., 2008; Lamarre e Ryadnov, 2011). Nesse sentido, a interação de
lipídios catiônicos com o DNA, por meio de interação eletrostática para a
formação de lipoplexos (Ma et al., 2007) tem se destacado como um promissor
sistema de entrega, se tornando um componente chave para o
desenvolvimento de carregadores multicomponentes (Koyanova e Tenchov,
2011). Além disso, para se aumentar a eficiência de transfecção, estes lipídios
podem ser associados a peptídeos membrano ativos, como a TAT
(Transcriptional Activator Protein) (Gupta et al, 2007), o peptídeo SAP ("Sweet
Arrow Peptide") (Del Pozo- Rodrigues et al, 2009) ou a protamina (Yuan H. et
al, 2010).
Um estudo realizado por Delgado et al. (2012) avaliou a capacidade de
transfecção de um novo vetor não viral baseado na combinação de protamina,
nanopartículas lipídicas sólidas (NLS) e dextrana depois da administração
sistêmica a ratos. Os resultados obtidos mostraram que o vetor Dex-Prot-DNA-
NLS teve maior capacidade de transfecção nas células com alta taxa de
atividade de endocitose mediada por clatrina/caveolae. Outra abordagem
interessante no desenvolvimento de vetores não virais multicomplexos foi o
relatado por Li Peng et al. (2012). Neste trabalho eles desenvolveram um
carregador multifuncional pH sensitivo baseado na técnica “layer by layer”
(“camada por camada”). Para isso, primeiramente o DNA foi condensado com
protamina dentro de um núcleo catiônico, posteriormente foi adicionado outra
camada de DNA, seguida pelo lipossoma catiônico e finalmente a chitosana.
Os resultados de transfecção in vitro e in vivo demonstraram que o complexo
37
não só foi capaz de se proteger das interações (não específicas) com
componentes do soro como também aumentou o tempo de circulação no
sangue e a eficiência de transfecção.
Os trabalhos desenvolvidos pelo nosso grupo de pesquisa tem mostrado
que a estratégia usada no desenvolvimento de vetores não virais para entrega
gênica tem sido pertinente. Como já descrito anteriormente, nos trabalhos de
Toledo e colaboradores (2012 e 2013), sob orientação do Prof. Adriano R.
Azzoni foram produzidas proteínas recombinantes baseadas em cadeia leve da
dineína (LC8 e RP3), contendo diferentes domínios de ligação ao DNA, visando
a aumentar a eficiência de transfecção em células de mamíferos. Os resultados
mostraram que essas proteínas de fusão foram capazes de condensar o pDNA
e formar complexos carregados positivamente, além e interagir in vitro com a
cadeia leve da dineína. Os ensaios de transfecção indicaram que a LC8 foi
capaz de transfectar eficientemente células HeLa, e com uma baixa
citotoxicidade.
Como relatado anteriormente, no trabalho conduzido por Balbino e
colaboradores (2012) sob orientação da Profa. Lucimara Gazziola (co-
orientadora deste trabalho) caracterizou-se as propriedades físico-químicas dos
complexos formados pela combinação do pDNA com lipossomas catiônicos
(LC) formados por EPC/DOPE/DOTAP. Os resultados obtidos mostraram que
diferentes razões de carga molar do complexo (pDNA/lipossoma) resultam em
diferentes eficiências de transfecção. Dando continuidade às pesquisas do
grupo, a proposta deste trabalho é o desenvolvimento e a caracterização de
complexos pseudo-ternários formados pela combinação do pDNA, proteínas
recombinantes de fusão e o lipossoma catiônico, buscando utilizar duas
38
estratégias diferentes de entrega gênica (transporte via microtúbulos por parte
da proteína e melhora na entrada na célula e escape endossomal por parte do
lipossoma), sempre buscando correlacionar os parâmetros físico-químicos à
eficiência de transfecção em células de mamíferos.
39
3. Objetivos
3.1 Objetivos Gerais
- Desenvolvimento de novos vetores não-virais baseados em DNA plasmidial,
proteínas recombinantes e lipídios (complexos pseudo-ternários ou “vírus
artificiais”), capazes de atuar como transportadores de transgenes, em estudos
de terapia e vacinação gênicas.
- Contribuir para um melhor conhecimento do efeito das características físico-
químicas dos complexos pseudo-ternários sobre a entrada de transgenes nas
células e transporte intracelular através do citoplasma, correlacionando-os com
a eficiência de transfecção.
3.2 Objetivos Específicos
- Expressão em E. coli e purificação da proteína de fusão TRP3 baseada na
cadeia leve de dineína e já desenvolvida por nosso grupo (Favaro, 2012).
- Estudos de condensação (pDNA-proteína) e encapsulação deste complexo
binário em lipossomas catiônicos, resultando em complexos pseudo-ternários.
Vale lembrar que, uma vez que o lipossoma catiônico é formado por diferentes
lipídios (EPC, DOPE e DOTAP), foi adotado a nomenclatura de complexo
“pseudo-ternário” ao invés de ternário, como relatado por de La Torre et al.
(2009).
- Caracterização físico-química dos complexos binários e pseudo-ternários
formados através de determinação do potencial zeta, diâmetro e distribuição de
tamanho das partículas, e análise morfológica através de microscopia
eletrônica de transmissão (MET).
40
- Estudos de transfecção buscando-se correlacionar os parâmetros ou
características físico-químicas dos complexos com a eficiência de transfecção
de células de mamífero em cultura (HeLa).
A Figura 6 demonstra a estratégia geral utilizada neste trabalho para a
formação do vetor não viral, baseado na utilização da proteína recombinante
(TRP3) e no lipossoma catiônico para a formação do complexo pseudo-ternário
(CPT), buscando mimetizar as características importantes presentes nos
vetores virais responsáveis pela alta eficiência de transferência do material
genético para o núcleo da célula alvo.
Figura 6. Ilustração das etapas de complexação, entrada na célula e tráfego intracelular de um
vetor baseado em cadeias leves de dineína, como a TRP3. O complexo binário (CB) formado
entre o pDNA e a proteína recombinante (TRP3) pode ser ou não encapsulado em um
lipossoma formando o complexo pseudo-ternário (CPT) antes de ser apresentado às células.
Essa estratégia, desenvolvida e estudada por nosso grupo, busca partículas capazes de entrar
na célula, facilitar o escape dos endossomas e explorar a rede de microtúbulos para facilitar o
tráfego intracelular e entrada no núcleo (Figura adaptada de Toledo et al., 2012).
41
4. Metodologia
4.1 DNA plasmidial (pDNA): Nos ensaios de caracterização in vitro dos
complexos e também nos ensaios de transfecção foram usados o plasmídeo
modelo pVAX1GFP (3697 pb), descrito em detalhe por Azzoni et al. (2007)
(Figura 7). Trata-se de um plasmídeo desenhado para emprego em vacinas de
DNA, mas contendo o gene da proteína repórter GFP. Em resumo, o vetor
possui um promotor do citomegalovírus humano (CMV), gene repórter (green
fluorescent protein – GFP), gene de resistência à Kanamicina e origem de
replicação procariota pMB1.Para a obtenção dos plasmídeos em quantidade e
qualidade adequada para os ensaios posteriores, as células de E.Coli (DH 5α)
forma colocadas para crescer em tubos falcon (1,5 ml) contendo meio LB
(Luria-Bertani) e kanamicina (30µg/mL), sob agitação e temperatura adequada
(37°C) overnight. Posteriormente as células contendo os plamídeos foram
purificados através do Kit comercial da GE Healthcare (ILLustra PlasmidMini
Spin Kit) seguindo as recomendações do fabricante.
pVAXlGFP
3697 bp
Kan
GFP
BGH polyA signal
CMV promoter
Kan promoter
pUC origin
Bpu AI (1717)
Hin d III (713)
Eco R I (754)
Xba I (1491)
Bam H I (731)
Bam H I (1485)
Nde I (286)
Nde I (762)
Spe I (51)
Spe I (737)
Figura 7. Mapa do plasmídeo pVAX1GFP descrito em detalhe por Azzoni et al. (2007). O
plasmídeo foi desenvolvido originalmente com a denominação pVAX1 pela empresa Invitrogen
para utilização em estudos de vacinação por DNA.
42
4.2 Purificação da proteína recombinante TRP3: Para expressão e
purificação da TRP3, foi utilizado o protocolo desenvolvido pela aluna Marianna
Favaro em sua dissertação de mestrado (Favaro, 2012). Em resumo, células
de E.coli (BL 21) contendo o plasmídeo (pet 28) de expressão da proteína
foram colocadas para crescer em frascos Erlenmeyer contendo meio LB (Luria-
Bertani), 30 µg/mL de kanamicina e colocadas a 37°C sob agitação (300 rpm)
até atingirem um OD600 de 0,8 quando foram induzidas com IPTG na
concentração de 100 mM. Após 20 horas, as células foram recolhidas por
centrifugação, suspensas em tampão apropriado e rompidas por sonicação
como descrito por Azzoni et al. (2004). A TRP3 foi purificada por cromatografia
em resina de agarose-IDA-Ni2+ por meio da interação com o His-Tag. A
avaliação da pureza da proteína purificada foi realizada por eletroforese SDS-
PAGE.
4.3 Formação do complexo binário pDNA:protamina e pDNA:TRP3: Para a
formação do complexo binário nas diferentes relações mássicas, foi adicionado
primeiramente 1 µg de DNA (127 ng/µL) ao microtubo e posteriormente
quantidades crescentes de protamina ou TRP3 (1 mg/mL), e completado com
PBS (pH 7,4) e Hepes (pH 7,3), respectivamente, para um volume final de 30
µL. Esses complexos foram incubados à temperatura ambiente (24°C) por 10
minutos. Para a realização dos ensaios físico-químicos (tamanho de partículas
e potencial zeta), completamos essa solução contendo os complexos com água
(Milli-Q) filtrada (0,22 µm) para um volume final de 1 mL e transferimos para
cubeta apropriada (Altmann-DTS 1061) para posterior leitura no equipamento
Zetasizer (Malvern).
43
4.4 Formação do complexo pseudo-ternário pDNA:protamina:lipossoma e
pDNA:TRP3:lipossoma: Para a formação do complexo pseudo-ternário,
primeiramente foi formado o complexo binário da mesma forma como foi
explicado anteriormente, adicionando o pDNA, protamina ou TRP3
(quantidades variadas) e completando o volume para 30 μL com PBS (pH 7,4)
ou Hepes (pH 7,3) e incubado por 10 minutos à temperatura ambiente (24°C).
Posteriormente, a essa solução contendo os complexos binários foram
adicionados 15 μL de lipossoma (quantidade fixa de lipossoma em todas as
relações binárias) na concentração de 2,4 mM, seguido por agitação em vórtice
por 40 segundos e incubação em gelo (0-4°C) por 10 minutos. Seguiu-se uma
nova agitação em vórtice por 10 segundos e incubação a temperatura ambiente
por 30 minutos. Para os ensaios de tamanho de partículas e potencial zeta foi
adicionado água (Milli-Q) filtrada (0,22 µm) para um volume final de 1 mL.
4.5 Ensaio de migração em gel de agarose: A técnica de eletroforese em gel
de agarose (0,8%) foi usada para determinação da relação mássica para a
completa condensação do pDNA pela protamina e pela TRP3 (complexo
binário), e posteriormente para a completa incorporação desses complexos
dentro das estruturas lipídicas (complexo pseudo-ternário). As corridas foram
realizadas em tampão TAE a voltagem constante de 60 V.
4.6 Determinação do diâmetro hidrodinâmico médio: O diâmetro
hidrodinâmico médio e a distribuição do tamanho dos complexos binário e
pseudo-ternários foram determinados pelo espalhamento de luz dinâmico
(Zetasizer Nano ZS, Malvern) usando o laser Ne-He e as medidas do ângulo
de espalhamento de 173° (backscattering). Essa técnica baseia-se na
dependência das flutuações de intensidade do espalhamento de luz em função
44
do tempo, devido ao movimento browniano das partículas em suspensão.
Partículas menores se difundem mais rápido que as maiores e a taxa de
flutuação da intensidade de luz espalhada variam de acordo com a velocidade
de difusão (New, 1990). O diâmetro hidrodinâmico das partículas foi calculado
através do valor do coeficiente de difusão translacional aplicado à equação de
Stokes-Eistein (abaixo).
Onde: d(H) é o diâmetro hidrodinâmico; D é o coeficiente de difusão
translacional; K é o coeficiente de Boltzmann, T é a temperatura absoluta e ƞ é
viscosidade absoluta do solvente. O diâmetro médio das partículas e o índice
de polidispersidade das mesmas foram estimados por análise de algoritmo
CONTIN através de transformação inversa de Laplace da função de
autocorrelação. Para a determinação experimental, os complexos binários e
pseudo-ternários foram formados como descrito anteriormente em um volume
final de 30 µL. Posteriormente essa solução contendo os complexos foi
completada com 970 µL de água Milli-Q (filtrada em membrana de 0,22 µm),
totalizando um volume final de 1 mL, que foi transferido para a cubeta
apropriada (Altmann/ DTS 1061) antes das análises. Todas as medidas foram
feitas em triplicatas a 24°C, de modo que as amostras foram estabilizadas por
2 minutos no equipamento antes da leitura.
4.7 Determinação do potencial zeta: O potencial zeta (ζ) é uma medida
eletrocinética que envolve os efeitos do movimento e fenômeno elétrico na
dupla camada (Stern e difusa). Estas camadas são formadas pela presença de
45
contra-íons ao redor da superfície coloidal para neutralizar essas cargas. A
camada stern é a mais próxima e a primeira a envolver o coloide, sendo
formada apenas pelos contra-íons, já a camada difusa também é formada por
contra-íons que sofrem repulsão pela camada Stern ao tentar se aproximar do
coloide. Essa variação de contra-íons que ocorre entre a superfície do coloide e
o seio do líquido promove a formação de um potencial elétrico, que é
denominado potencial de superfície. Assim, se um campo elétrico é aplicado, o
fenômeno de eletroforese ocorre, pois a partícula coloidal irá se movimentar,
com velocidade que depende do potencial elétrico criado entre a camada que
envolve a partícula e o seio do líquido, além da viscosidade, da constante
dielétrica do meio e da intensidade do campo elétrico. Nesse contexto, o
potencial zeta é a medida de um fenômeno de superfície definido como
potencial elétrico no ponto que separa a camada Stern e a camada difusa.
Assim, o potencial dos complexos estudados foi medido pela aplicação de um
campo elétrico através das amostras, e os valores dos potenciais zeta foram
obtidos pela medida da velocidade de mobilidade eletroforética das partículas
usando a técnica anemométrica de Laser Doppler. De maneira resumida, os
complexos binários e pseudo-ternários foram formados como descrito
anteriormente em um volume final de 30 µL. Posteriormente essa solução
contendo os complexos foi completada com 970 µL de água Milli-Q (filtrada em
membrana de 0,22 µm), totalizando um volume final de 1 mL, que foi
transferido para a cubeta apropriada (Altmann/ DTS 1061) antes das análises.
Todas as medidas foram feitas em triplicatas a 24°C, de modo que as amostras
foram estabilizadas por 2 minutos no equipamento antes da leitura. Tanto as
medidas de tamanho quanto do potencial zeta das partículas foram realizadas
46
no laboratório coordenado pela professora Dra. Iolanda M. Cuccovia do
Instituto de Química da USP (Bloco 10).
4.8 Acessibilidade da sonda de fluorescência ao DNA incorporado nos
complexos binários (CBs), pseudo-ternários (CPTs) e ao lipossoma: Foi
avaliada a acessibilidade ao DNA dos complexos binário (CB), pseudo-ternário
(CPT) e lipossoma através da fluorescência utilizando a sonda comercial
PicoGreen, que possui propriedade de fluorescência quando conjugada a
DNA fita dupla em solução. Resumidamente, a solução de trabalho foi
preparada através da diluição (200x) da solução stock do Pico Green em
tampão TE (10 mM Tris-HCl/ 1 mM EDTA, pH 5). Para a realização do ensaio
foram adicionados 100 µL da solução de trabalho ao mesmo volume dos
complexos estudados e então incubado por 3 minutos. A intensidade de
fluorescência foi mensurada usando um fluorímetro de placa (Gemini XS,
Molecular Device) usando os comprimentos de onda de excitação e emissão
de 485 nm e 525 nm, respectivamente. A intensidade de fluorescência foi
expressa em valores percentuais, em relação à intensidade de fluorescência
emitida pelo DNA livre.
4.9 Morfologia dos complexos binário (CB) e pseudo-ternário (CPT)
através de microscopia eletrônica de transmissão (MET): A técnica de
microscopia eletrônica de transmissão foi utilizada para a visualização da
morfologia dos complexos binários (CBs) e pseudo-ternários (CPTs).
Resumidamente, aproximadamente 3 µL de cada amostra (CB ou CPT)
produzida segundo protocolo descrito anteriormente, foi diluída 10x e colocada
em telas de cobre contendo filme de carbono, sendo ali incubada por 5
minutos. O excesso do líquido foi removido com papel apropriado. Para a
47
coloração negativa das telas, foi utilizada uma gota de acetato de uranila (1%
p/v) em solução salina 0,9%, que foi então adicionada às telas e incubada
durante 1 minuto a temperatura ambiente, de modo que o excesso também foi
eliminado e o material foi mantido a temperatura ambiente para que a tela
pudesse ser seca ao ar. O modelo do microscópio usado foi o Leo 906E
(Zeiss, Germany) com voltagem de 100 kV, junto com uma câmera MEGA
VIEW III/Olympus e o software ITEM E 23082007/Olympus Soft Imaging
Solutions GmbH.
4.1.0 Cultura e transfecção de células de mamífero: Células HeLa (“Human
epitheloid carcinoma”), foram crescidas em meio F-12 (Ham - nutrient mixture,
Gibco, Inglaterra) contendo 10% (v/v) de soro fetal bovino (Gibco, Inglaterra).
As células foram primeiramente crescidas em frascos de cultura para células
aderentes de 25 cm2 e incubadas em ambiente umidificado contendo 5% de
CO2 e à temperatura de 37°C. Após atingirem a confluência, as células foram
tripsinizadas e semeadas em placas de cultura de 24 poços (5 x 105 células por
poço). As células foram incubadas por 48 horas até atingir o nível de
confluência de 70-80% e então transfectadas com as diferentes soluções
contendo os complexos pDNA-protamina/TRP3 (1,0 μg de pDNA + massas
crescentes de protamina ou TRP3 em 100 μL de meio, por poço) e
pDNA:protamina/TRP3:lipossomas (1,0 μg de pDNA + massas crescentes de
protamina ou TRP3 + 15 μL lipossoma (2,4 mM) em 100 μL de meio, por poço).
A determinação do nível de transfecção dos complexos estudados foi realizada
após 24 horas do início do experimento através da utilização do Citômetro de
Fluxo modelo FACSCANTO II (BD). Também foi realizado um ensaio de
transfecção com diferentes dosagens dos CPTs (1:30) para buscar uma
48
quantidade de material que atingiriam um eficiente nível de transporte do pDNA
com uma menor taxa de morte celular, buscando dessa forma uma aplicação in
vivo segura e eficiente. Para avaliar a contribuição do microtúbulos no tráfego
intracelular dos complexos, as células foram pré-incubadas por 2 horas com
nocodazol (25 µM) para rompimento dos microtúbulos. A droga foi dissolvida
em DMSO, e para o controle negativo foi usada uma solução de igual volume
sem a droga. As transfecções na presença de cloroquina foram realizadas
para avaliar a contribuição da degradação endossomal aos complexos binários
e ternários estudados. As células foram pré-incubadas por 4 horas com
cloroquina (100 µM). Para todos os ensaios com as drogas mencionados
anteriormente, as células pré-tratadas foram incubadas na presença de
diferentes complexos por 4 horas, depois que o meio foi substituído por um
meio de crescimento fresco. Depois de 24 horas, as células foram coletadas, e
a expressão do gene repórter GFP foi mensurado como descrito anteriormente.
Os ensaios utilizando o citômetro foram realizados no laboratório coordenado
pelo Prof. Dr. Sandro Rogério de Almeida no Departamento de Análises
Clínicas e Toxicológicas da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da USP
(Bloco 17).
4.1.1 Determinação da citotoxicidade: Células vivas com membranas
intactas são diferenciadas pela capacidade de excluir corantes que penetram
facilmente em células mortas ou danificadas. Nesse sentido o corante Iodeto
de propídio (IP) tem sido utilizado para corar células inviáveis de vários tipos.
Para avaliarmos se os complexos estudados possuem efeito na viabilidade
celular realizamos o teste com o IP. Seguindo as instruções do protocolo, foi
adicionado 1 µL de Iodeto de propídio (2,0 mg/mL) em aproximadamente 105
49
células lavadas e ressuspendidas em 1,0 mL de PBS em tubos de cultura de
poliestireno. Posteriormente as células foram incubadas por 5 minutos em
gelo, no escuro e analisadas no citômetro de fluxo com excitação a 488 nm e
emissão coletada a 550 nm.
50
5. Resultados e Discussão
5.1 Purificação do DNA Plasmidial (pDNA)
A primeira atividade desempenhada neste trabalho foi o estabelecimento
de uma metodologia adequada para a purificação do pDNA utilizado nos
experimentos. A extração e purificação utilizando o kit comercial GE ILLustra
resultou em pDNA de elevada pureza, com relação A260nm/A280nm próxima de
1,9 e majoritariamente na forma superenovelada. A Figura 8 apresenta uma
análise qualitativa do pDNA purificado, análise esta que foi feita através de
eletroforese em gel de agarose (0,8%). A determinação da concentração desse
material, por espetrometria utilizando o equipamento NanoDrop (Thermo
Scientific), indicou a concentração de 127 ng/µL, adequada aos ensaios
subsequentes.
1 2
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2.0 KB
Figura 8. Análise qualitativa do pDNA pVAX1GFP purificado (Kit ILLustra MiniPrep- GE)
através da técnica de eletroforese em gel de agarose (0,8%). Legenda: 1) Marcador de peso
molecular (1Kb Fermentas) 2) pVAX1GFP purificado pelo Kit.
51
5.2 Caracterização Físico-Química dos Complexos Formados com a
Utilização da Proteína Protamina
5.2.1 Caracterização do Complexo Binário (pDNA:protamina)
Para avaliação da interação entre a protamina e o pDNA nas diferentes
relações mássicas utilizamos a técnica de mobilidade em gel de agarose
(Figura 9). Os resultados mostram que com o aumento da relação mássica de
protamina, o material genético (pDNA) interage intensamente com a mesma e
começa a se condensar, formando partículas que não migram no gel, devido a
sua forma (geralmente esféricas) e carga positiva (o pDNA é originalmente
"negativo"). Dessa forma, há uma alteração no padrão de migração do pDNA
justamente devido à interação eletrostática entre o pDNA (negativo) e a
protamina (carga líquida positiva).
Figura 9. Análise da interação do pDNA com a protamina pelo ensaio de retardo em gel de
agarose (0,8%). Foram estudadas cinco relações mássicas pDNA:protamina (1:0,5; 1:1; 1:2;
1:5; 1:10), como mostrado na legenda da figura.
52
Observa-se na Figura 9 que, a partir de 0,5 μg de protamina por
micrograma de pDNA, já verifica-se interação entre as moléculas, o que fica
mais evidente na relação mássica de 1:1.
A Figura 10 apresenta o perfil de tamanho das partículas formadas pela
interação do pDNA com a protamina, em diferentes relações mássicas
(pDNA:Protamina). Em todas as relações estudadas nos ensaios foram
utilizados 1 µg de DNA, desse modo foi variada apenas a massa de protamina
adicionada (0,5 µg, 1 µg, 2 µg, 2,5 µg e 5 µg). As medidas de tamanho das
partículas, indicam que em uma baixa relação mássica (1:0,5) o complexo
possui um tamanho médio menor quando comparado a relações crescentes de
protamina. Pode-se observar que com o aumento de protamina o complexo
começa a se formar, sendo que o diâmetro médio encontra-se ao redor de 800
nm e valor máximo na relação 1:1(em torno de 1300 nm).
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
Diâ
me
tro
Mé
dio
(nm
)
Relação Mássica (pDNA:protamina)
1:0,5
1:1
1:1,5 1:21:2,5
1:5
Determinação do Potencial Zeta dos CBs (pDNA:protamina)
Figura 10. Determinação do tamanho médio de partículas do CB (pDNA:protamina) em
várias relações mássicas, mostrando que com uma maior quantidade de protamina o
complexo tende a se manter estável (diâmetro reportado está ponderado em número de
partículas). Os números próximos a cada ponto indicam as relações mássicas usadas
(pDNA:protamina).
53
Nossos resultados estão em acordo com os obtidos por Caracciolo et al.
(2011) que relataram que esse fenômeno ocorre devido a partícula exibir nessa
relação mássica uma carga próxima da neutralidade, que tende a favorecer a
agregação. Posteriormente, aumentos sucessivos de protamina levam a uma
diminuição do tamanho e estabilidade dos complexos formados. Considerando-
se que tanto o pDNA como as membranas celulares são carregadas
negativamente, uma característica necessária aos vetores que transportam
DNA é possuírem uma carga superficial positiva, de modo a haver uma
interação eletrostática entre estes vetores e a superfície celular, passo inicial
para a entrada na célula via endocitose.
A Figura 11 mostra o perfil do potencial zeta do CB (pDNA:protamina)
nas diferentes relações mássicas estudadas. As medidas de potencial zeta
feitas em triplicatas indicam que, ao adicionar quantidades crescentes de
protamina, a carga superficial negativa do complexo muda para valores
positivos. Além disso, observa-se que a partir da relação 1:1,5, os valores da
carga tendem a se manter constantes, mesmo adicionando quantidades
crescentes de protamina. Os resultados de diâmetro, migração e potencial zeta
estão em acordo. As proporções mássicas 1:1 a 1:1,5 referem-se à região de
isoneutralidade, onde o potencial zeta cruza a região de valor zero. Nesta
região, o diâmetro dos complexos tende a ser máximo devido à aglomeração
das moléculas, o que pode ser evidenciado no pico da Figura 8 na relação 1:1.
Além disso, foi notado que nesta mesma relação (1:1) houve a completa
incorporação de todo o DNA na estrutura formada, obsevado pelo gel na figura
7. A partir da relação 1:1,5, com aumento da quantidade de protamina, as
propriedades físico-químicas (potencial zeta e diâmetro médio) mantém-se
54
constantes, indicando que esta é uma faixa ótima para os estudos de
transfecção.
-50
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
40
50
Po
ten
cial
Ze
ta (
mV
)
Relação Mássica(pDNA:protamina)
1 :0,5
1:1
1:1,51:2 1:2,5
1:5 1:10 1:15 1:20
5.2.2
5.2.2 Caracterização dos Complexos Pseudo-ternários (CPTs,
pDNA:protamina:lipossoma)
A habilidade dos lipossomas catiônicos em incorporar o CB
(pDNA:protamina) em diferentes relações mássicas dentro de suas estruturas
foi avaliada através do ensaio de migração em gel de agarose (0,8%) (Figura
12). O pDNA livre migra em direção ao pólo positivo, gerando dois tipos de
bandas, como pode ser observado na Figura 10. Nota-se que o lipossoma foi
capaz de incorporar os complexos binários nas várias relações mássicas
Figura 11. Determinação do potencial zeta dos CBs (pDNA:protamina) para diferentes
relações mássicas, mostrando a mudança para valores positivos a partir da relação 1:1,5.
55
pDNA:protamina estudadas (1:0,5; 1:0,7, 1:0,9 e 1:1), indicando que mesmo
em elevadas concentrações, a presença da protamina não inibe o
encapsulamento do CB, o que poderia acontecer devido a carga altamente
positiva da protamina (repulsão eletrostática com o também positivo
lipossoma). Para todas as relações mássicas de pDNA:protamina usadas
foram adicionadas quantidades fixas de lipossomas (15 µl na concentração de
2,4 mM) para a formação do complexo pseudo-ternário. Vale ressaltar que
essa quantidade de lipossoma escolhida para a o encapsulamento dos
complexos binários (pDNA:protamina) foi baseada no trabalho de Balbino e
colaboradores (2012), onde os melhores resultados de transfecção do
complexo pDNA/lipossoma foram obtidos quando se utilizou a relação molar de
cargas (R+/-) de 3. Assim, convertendo-se estes valores para relações
mássicas, chegamos ao volume de lipossoma usado no presente estudo.
M pDNA 1:0,5 1:0,7 1:0,8 1:0,9 1:1
Figura 12. Análise da incorporação do complexo binário (pDNA:protamina) pelos lipossomas
para formação dos CPTs em gel de agarose (0,8%). Legenda: M, marcador de massa molecular
(1 Kb, fermentas), pDNA (Controle) e as 5 relações mássicas estudadas do complexo
pDNA:protamina (1:0,5; 1:0,7; 1:0,8; 1:0,9 e 1:1).
3.0 Kb
2.0 Kb
56
A Figura 13 apresenta a distribuição dos tamanhos dos complexos
pseudo-ternários formados pela combinação do pDNA:protamina (diferentes
relações mássicas) com o lipossoma. Pode-se observar que nas relações
usadas para a formação do complexo pDNA:protamina não houve uma
variação considerável do tamanho quando essas partículas foram combinadas
com o lipossoma para a formação do complexo pseudo-ternário. Foram obtidos
também valores da polidispersidade dos complexos pseudo-ternários
formados, como podemos observar na Tabela I. Pode-se notar que, nas
relações 1:0,7, 1:0,9 e 1:1 do complexo binário combinado com o lipossoma, os
valores obtidos de polidispersidade foram maiores quando comparados às
demais relações estudadas.
0
20
40
60
80
100
120
140
Diâ
me
tro
Mé
dio
(nm
)
Relação mássica (pDNA:protamina)
1:0,5
1:0,71:0,9 1:1
1:1,5
Figura 13. Distribuição do tamanho dos CPTs formados pela combinação do
pDNA:protamina em relações mássicas variadas (1:0,5; 1:0,7; 1:0,9; 1:1 e 1:1,5) com o
lipossoma catiônico (quantidade fixa).
57
Relação Mássica Diâmetro Médio
(nm)
Polidispersidade
(PDI)
1:0,5 123,1 ± 2,3 0,310 ± 0,015
1:0,7 101,9 ± 0,9 0,588 ± 0,066
1:0,9 108,6 ± 3,9 0,662 ± 0,061
1:1 106,0 ± 3,9 0,566 ± 0,162
1:1,5 110,4 ± 0,9 0,379 ± 0,050
Lipossoma Vazio 96,4 ± 0,4 0,115 ± 0,011
Os valores de diâmetro médio obtidos para os complexos pseudo-
ternários, variando entre 100 nm e 120 nm, são parecidos aos obtidos por
Balbino e colaboradores (2012), onde a combinação do pDNA com o lipossoma
catiônico formou partículas com tamanho variando entre 100 nm e 130 nm. É
interessante ressaltar que os complexos pseudo-ternários apresentaram
diâmetro menor quando comparados aos complexos binários, indicando a
capacidade de estabilização dos lipossomas.
A Figura 14 mostra o perfil de distribuição do potencial zeta dos
complexos pseudo-ternários formados pela combinação do complexo
pDNA:protamina em várias relações mássicas (1:0,5; 1:0,7; 1:0,9; 1:1 e 1:1,5)
com o lipossoma catiônico. Pode-se observar que para todos os casos
estudados, os complexos apresentaram potencial zeta positivo, mostrando a
viabilidade para as transfecções in vitro. Além disso, para os casos em que a
proporção pDNA:protamina estava entre 1:0,5 até 1:0,9 com a incorporação
dos lipossomas, os valores de potencial zeta tornaram-se positivos, sugerindo
Tabela I- Tamanho médio e polidispersidade dos CPTs formados com diferentes relações
mássicas (pDNA:protamina).
58
a incorporação deste complexo binário aos lipossomas, em comportamento
similar ao observado no trabalho de Rosada et al (2012), utilizando os mesmos
lipossomas, porém com outro peptídeo.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Po
ten
cial
Ze
ta (
mV
)
Relação Mássica (pDNA:protamina)
1:0,5
1:0,7
1:0,9 1:1
1:1,5
5.3 Caracterização Físico-Química dos Complexos Formados com a
Proteína TRP3
5.3.1 Expressão e Purificação da Proteína Recombinante TRP3
Foi implementada em nosso laboratório a metodologia de expressão,
purificação e análise de proteínas recombinantes produzidas em E. coli e
desenvolvido originalmente pela aluna Marianna Favaro em sua dissertação de
mestrado (Favaro, 2012). A Figura 15 mostra um gel SDS-PAGE (13,5%)
Figura 14. Determinação do potencial zeta dos CPTs formados a partir da combinação do
CBs (relações mássicas variadas) com o lipossoma catiônico. EPC/DOPE/DOTAP (volume
fixo).
59
indicando a proteína TRP3 (18,6 KDa) corretamente expressa em E. coli
(linhagem BL21(DE3)) e purificada em um único passo através de
cromatografia de afinidade em íon metálico imobilizado (IMAC) utilizando-se
coluna contendo a resina Ni-NTA. Após a purificação, foi sempre realizado um
processo de diálise em tampão Hepes 40 mM pH 7,3 de forma a favorecer a
estabilidade da proteína para os demais ensaios.
M 1 2 3
17 kDa
25 kDa
5.3.2 Caracterização dos Complexos Binários (CBs, pDNA:TRP3)
O primeiro ensaio realizado foi o de migração em gel de agarose com o
objetivo de avaliar a interação entre a TRP3 e o pDNA, utilizando diferentes
relações mássicas, de forma a comparar com os resultados obtidos utilizando-
se a proteína protamina. De maneira geral, observa-se que a partir da relação
mássica 1:5 ocorre condensação do pDNA e alteração no padrão de migração
do pDNA no gel de agarose (0,8%) (Figura 16).
Figura 15. Gel SDS-PAGE (13,5%) mostrando a expressão da TRP3 em E.coli BL21 (DE3) e
a purificação por cromatografia de afinidade Ni-NTA. Legenda: (M) Marcador de massa
molecular; (1) Fração solúvel contendo a proteína; (2) Fração de eluição com 500 mM de
imidazol (concentrada); (3) Fração de eluição com 500 mM de imidazol.
60
M pDNA 1:0.5 1:1 1:2 1:5 1:30 1:60
TRP3
A Figura 17 apresenta o perfil do diâmetro médio dos complexos
formados pela interação do pDNA com a TRP3 em diferentes relações
mássicas (pDNA:TRP3). As medidas de tamanho de partículas foram
realizadas em triplicata e indicam que, em baixas quantidades de TRP3 (1:0,5
à 1:4), o complexo possui um tamanho relativamente pequeno (<200 nm). A
partir da relação 1:5 há aumento de tamanho do complexo formado,
provavelmente devido a região de isoneutralidade que leva a agregação como
dito anteriormente. Aumentos sucessivos de TRP3 em combinação com o DNA
indicam que, nas relações 1:30 e 1:60, o complexo formado obteve tamanhos
médios menores que 100 nm, evidenciando a capacidade acentuada de
condensação do matérial genético por parte da TRP3. Estes resultados estão
de acordo aos obtidos anteriormente com a mesma proteína (TRP3) pelo nosso
grupo de pesquisa cujo trabalho se encontra em fase de submissão para
publicação em revista científica.
Figura 16. Análise da interação do pDNA com a TRP3 (CBs) pelo ensaio de retardo em gel
de agarose (0,8%). Foram estudadas seis relações mássicas pDNA:TRP3 (1:0,5; 1:1; 1:2; 1:5;
1:30 e 1:60), como mostrado na legenda do gel.
61
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
Diâ
me
tro
Mé
dio
(n
m)
Relação Mássica (pDNA:TRP3)
1:0,5 1:11:2
1:4
1:51:8
1:30 1:60
A Figura 18 apresenta o perfil de potencial zeta dos CBs (pDNA:TRP3)
na diferentes relações mássicas estudadas. Na formação dos complexos,
foram combinados 1 µg de pDNA com quantidades crescentes de TRP3 (1 µg,
4 µg, 30 µg e 60 µg). As medidas do potencial zeta foram feitas em triplicata e
indicam que, ao se adicionar quantidades crescentes da proteína ao pDNA,
ocorre uma inversão de valores negativos para valores positivos de potencial
zeta a partir da relação mássica 1:8. Além disso, observa-se que a partir da
relação anteriormente citada os valores tendem a continuar positivos
adicionando-se quantidades maiores de proteína.
Figura 17. Determinação do diâmetro médio, em número, do complexo binário (CBs)
pDNA:TRP3 em várias relações mássicas. Os números próximos a cada ponto indicam as
relações mássicas (pDNA:TRP3) estudadas.
62
-25
-20
-15
-10
-5
0
5
10
15
20
25P
ote
nci
al Z
eta
(m
V)
Relação Mássica(pDNA:TRP3)
1:4
1:81:30
1:60
5.3.3 Caracterização dos Complexos Pseudo-Ternários (CPTs,
pDNA:TRP3:Lipossoma)
Assim como foi feito com a protamina, foi avaliada a capacidade do
lipossoma de incorporar os CBs (pDNA:TRP3) para a formação dos CPTs
(pDNA:TRP3:lipossoma), através do ensaio de migração em gel de agarose
(0,8%). O pDNA livre migra em direção ao pólo positivo, gerando dois tipos de
bandas, como pode ser observado na Figura 19. Nota-se que o lipossoma foi
capaz de incorporar os CBs nas várias relações mássicas pDNA:TRP3
estudadas (1:1; 1:4, 1:30 e 1:60). Em todas as relações mássicas de
pDNA:TRP3 usadas foram adicionadas quantidades fixas de lipossomas (15 µl
na concentração de 2,4 mM) para a formação do CPT, assim como foi feito
quando utilizamos a protamina como agente condensador do pDNA.
Figura 18. Determinação do potencial zeta dos CBs (pDNA:TRP3) para diferentes relações
mássicas (1:4, 1:8, 1:30 e 1:60), mostrando a mudança para valores positivos a partir da
relação 1:8. O ensaio foi feito em triplicata.
63
pDNA 1:1 1:4 1:30 1:60
A Figura 20 apresenta a distribuição dos tamanhos dos complexos
pseudo-ternários formados pela combinação do pDNA:TRP3 (diferentes
relações mássicas) com o lipossoma. Pode-se observar que não houve
alterações significativas nos tamanhos dos complexos pseudo-ternários
formados, independentemente das relações mássicas de pDNA:TRP3 usadas
em combinação com o lipossoma. A Tabela II mostra com mais detalhes os
valores obtidos dos tamanhos de partículas pseudo-ternárias, variando a
relação mássica do CB (pDNA:TRP3), e também os valores de
polidispersidade. Podemos observar que os valores de polidispersidade
encontrados foram baixos, evidenciando a homogeneidade da solução
contendo os complexos.
Figura 19. Análise da incorporação do complexo binário (pDNA:TRP3) pelos lipossomas em
gel de agarose (0,8%) para a formação dos CPTs. pDNA (Controle positivo) e as 4 relações
mássicas estudadas do complexo pDNA:TRP3 (1:1; 1:4; 1:30; 1:60).
64
0
20
40
60
80
100
120
140
160D
iâm
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o M
éd
io (n
m)
Relação Mássica (pDNA:TRP3)
1:1
1:41:30
1:60
Relação Mássica
(µg/µg)
Diâmetro Médio
(nm)
Polidispersidade
(PDI)
1:1 134,4 ± 7,7 0,336 ± 0,013
1:4 106,0 ± 1,1 0,337 ± 0,085
1:30 101,0 ± 0,3 0,260 ± 0,008
1:60 90,5 ± 1,9 0,315 ± 0,051
Lipossoma Vazio 96,4 ± 0,4 0,115 ± 0,011
Figura 20. Distribuição dos tamanhos, em número, dos complexos pseudo-ternários (CTPs)
formados pela combinação do pDNA:TRP3 em relações mássicas variadas (1:1, 1:4, 1:30 e
1:60) com o lipossoma (quantidade fixa).
Tabela II - Tamanho médio e polidispersidade dos CPTs formados com diferentes relações
mássicas (pDNA:TRP3).
65
A Figura 21 mostra o perfil de potencial zeta dos complexos pseudo-
ternários formados pela combinação dos complexos binários pDNA:TRP3, em
relações mássicas variadas (1:1, 1:4, 1:30 e 1:60), com o lipossoma catiônico
(quantidade fixa). Pode-se observar que, em todas as relações mássicas
estudadas para a formação do complexo pseudo-ternário, foram obtidos
valores positivos deste complexo o que demonstra sua viabilidade para as
transfecções in vitro. Além disso, em relações mássicas baixas (1:1 e 1:4),
nota-se que a carga superficial do CPT formado pela combinação com o
lipossoma manteve valores mais altos (>+30 mV) quando comparados a
relações mássicas maiores do complexo binário (1:30 e 1:60). Vale ressaltar
ainda que na relação 1:60 o valor do potencial zeta obtido para o complexo foi
menor (+11,9 mV) que o obtido nas demais relações mássicas estudadas.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Po
ten
cial
Ze
ta (
mV
)
Relação Mássica (pDNA:TRP3)
1:1
1:4
1:30
1:60
Figura 21. Medidas do potencial zeta dos complexos pseudo-ternários (CTPs) formados a
partir da combinação do pDNA:TRP3 (relações mássicas variadas) com o lipossoma catiônico
(quantidade fixa).
66
5.4 Ensaios de Transfecção em Células de Mamífero (HeLa)
Foram realizados ensaios de transfecção dos complexos binários e
pseudo-ternários (utilizando-se as proteínas protamina e TRP3) em células
HeLa buscando-se correlacionar os parâmetros físico-químicos obtidos nos
estudos anteriores com a eficiência de entrega gênica in vitro. Assim, a
eficiência de transfecção é aqui apresentada na forma de porcentagem de
células transfectadas, assim definidas por expressarem a proteína verde
fluorescente (GFP), cujo gene está inserido no pDNA entregue às células
("gene repórter") pelos diferentes vetores estudados. A quantificação da
transfecção foi realizada por citômetria de fluxo e os ensaios foram feitos
sempre em triplicata (Figura 22).
0
5
10
15
20
25
30
Cé
lula
s Tr
ansf
ect
adas
(%
)
0,5
14,4
0,4
11,7
0,7
12,5
0,3
10,0
0,6
25,3
13,7
24,6
11,1
23,2
Figura 22. Eficiência de transfecção das células HeLa utilizando-se os complexos binários
pDNA:protamina (1:0,1; 1:0,5 e 1:1,5) e pDNA:TRP3 (1:1; 1:30 e 1:60), e complexos pseudo-
ternários nas mesmas relações avaliadas para o complexo binário. Os complexos pDNA:Lipossoma
e pDNA:lipofectamina incluídos como controles. Os ensaios foram realizados em triplicata.
67
Vale ressaltar que, em todos os complexos (CBs, CPTs, Lipossoma e
Lipofectamina) utilizados neste ensaio, foi usada a quantidade fixa de 1 µg de
pDNA. Dessa maneira em cada ”poço”, contendo 50.000 células, havia 1 µg de
material genético. Pelos resultados obtidos, nota-se que o complexo binário
pDNA:protamina nas relações mássicas usadas (1:0,1; 1:0,5 e 1:1,5) não foi
capaz de transfectar eficientemente as células, o que é demonstrado pela baixa
expressão do gene repórter GFP. Podemos notar que quando foi adicionado o
lipossoma para a formação do complexo pseudo-ternário (1:0,1) foi obtido um
número levemente superior de células transfectadas (14,4%) quando
comparado aos outros complexos do mesmo tipo e também ao complexo
pDNA:lipossoma (11,1%), ainda que esse resultado não seja estatisticamente
significativo.
Estes resultados não estão completamente em acordo com os obtidos
por Chen et al. (2011), onde a combinação da protamina com o DNA mostrou
uma atividade de transfecção muito baixa, mas quando combinada com os
lipossomas catiônicos, aumentou consideravelmente (37 vezes) a eficiência de
transfecção em células A549. Outro estudo realizado por Dokka et al. (2000)
avaliou a eficiência de transfecção de lipoplexos combinados com protamina e
DEAE-dextran em macrófagos. Os resultados obtidos mostraram que a
protamina sozinha ou em combinação com a DEAE-dextran não teve nenhum
efeito significativo na transfecção gênica. Por outro lado, foi demonstrado que a
protamina aumentou efetivamente a atividade de transfecção em combinação
com todos os agentes lipossomais testados, sugerindo que, devido a sua
versatilidade e simplicidade, poderia ser usada como um adjuvante em uma
variedade de protocolos para transferência gênica. Outro trabalho desenvolvido
68
por Yuan et al. (2010) mostrou que a combinação de nanopartículas lipídicas
aniônicas com protamina e DNA (LN:protamina:DNA) aumentou a eficiência de
transfecção mesmo na presença de soro, com uma expressão gênica (gene
repórter Luciferase) de 72 horas. Nesse mesmo estudo, relatou-se que o
complexo binário DNA:protamina foi capaz de transfectar razoavelmente as
células, entretanto, a relação mássica usada (1:2) foi maior em comparação a
usada neste trabalho. Além disso, existe a diferença entre a expressão dos
genes repórteres GFP e LUC (Luciferase) que deve ser levada em
consideração, de modo que o LUC possui como característica uma maior
sensibilidade, devido a sua detecção ser baseada na relação enzima/substrato
(Van Gaal et al., 2011). De maneira geral, a melhor eficiência de transfecção
dos complexos LPD (Lipídio:protamina:DNA) em relação aos lipoplexos
(lipídios:DNA) é atribuída a maior capacidade fusogênica dos LPDs, fenômeno
relacionado a maior interação dos lipídios celulares aniônicos e catiônicos
devido a ausência de competição com DNA dentro do envelope lipídico e ao
menor número de camadas do lipídio que precisa ser retirada (Caracciolo et al.,
2011).
Ao analisarmos os complexos (CB e CPT) formados pela proteína TRP3
desenvolvida pelo grupo, podemos observar que a TRP3 em combinação com
o pDNA (CB) na relação 1:1 não foi capaz de transfectar eficientemente as
células (0,1%). Já na relação 1:30, houve um ligeiro aumento da transfecção
(0,6%). Entretanto, ao adicionarmos uma quantidade maior da proteína (60 μg),
foi verificada uma melhora significativa na transfecção das células (13,6%).
Esta melhora significativa da eficiência de transfecção na relação 1:60 foi
observada mesmo constatando que este complexo possui potencial zeta menor
69
(+11,2 mV) quando comparado ao complexo na relação 1:30 (+18 mV). Em
relação ao tamanho dos complexos nas mesmas relações, não houve diferença
significativa do diâmetro médio (1:30/65,5 nm e 1:60/75,83 nm). Estes
resultados sugerem que o potencial zeta positivo apesar de ser importante para
a transfecção, não necessariamente precisa ter um valor muito elevado para
uma eficiente transfecção. Esse fato pode ser evidenciado pela constatação
que o CB na relação 1:60 foi capaz de transfectar eficientemente as células
mesmo possuindo valor de potencial zeta menor em comparação ao CB na
relação 1:30. Neste sentido, somos levados a inferir que a superioridade de
transfecção do complexo na relação 1:60 provavelmente se deve à facilitação
do tráfego intracelular proporcionado pela maior relação DNA:TRP3.
Ao adicionar-se lipossoma aos CBs, houve aumento da eficiência de
transfecção das células em todas as relações mássicas estudadas (1:1, 1:30 e
1:60) em comparação aos complexos binários nas mesmas relações, sendo
alcançados valores de eficiência de 10,0%, 25,3% e 24,6%, respectivamente.
Analisando-se os CPTs nas duas relações com maior eficiência de transfecção
(1:30 e 1:60), nota-se novamente que o valor mais elevado do potencial zeta
(1:30/+25,7 mV; 1:60/+11,9 mV) não proporcionou um efetivo aumento da
eficiência dos complexos. Os valores de diâmetro médio dos complexos nas
relações 1:30 e 1:60 foram ligeiramente diferentes, sendo obtidos valores de
101 nm e 90,5 nm, respectivamente. Vale destacar que o CPT na relação 1:60
não foi capaz de atingir níveis de transfecção maiores do que os encontrados
na relação 1:30. Portanto, os dados físico-químicos referentes aos CPTs
sugerem, assim como aos CBs, que um valor positivo de potencial zeta é
importante para a viabilização na transfecção. No entanto, valores positivos
70
mais elevados não necessariamente levam a um aumento da eficiência da
transfecção.
Em relação ao tamanho, podemos deduzir que valores iguais ou menores
que 100 nm são responsáveis por aumento da eficiência do processo de
transfecção. Isso fica mais evidente comparando-se os valores apresentados
na Tabela 2. Já o lipossoma complexado diretamente com o pDNA foi capaz
de transfectar 11% das células, e a lipofectamina, 23,2%. Esses resultados de
transfecção utilizando a TRP3 em combinação ao lipossoma indicam que o
CPT formado em relação aos CBs e ao lipossoma foi capaz de melhorar a
eficiência de transfecção das células, provavelmente explorando a capacidade
dos lipossomas de melhorar a entrada na célula e facilitar o escape
endossomal e a capacidade da TRP3 de condensar o pDNA, além de facilitar o
tráfego intracelular e a entrada no nucleo. Estes resultados obtidos são
concordantes aos obtidos por Yamano et al. (2011), onde foi demonstrado que
a combinação do lipídio FuGene com uma sequência modificada do peptídeo
TAT foi capaz de aumentar a eficiência de transfecção em cinco linhagens
celulares testadas, quando comparada ao lipídio e ao peptídeo administrados
sozinhos. Os autores sugerem que essa melhora na eficiência do complexo
ternário se deve a condensação do material genético por parte do peptídeo,
similar ao uso da protamina, o que levou ao aumento do potencial zeta,
diminuição do tamanho das partículas e melhora na absorção do complexo
pela via da endocitose. Outro trabalho, desenvolvido por Del Pozo Rodrígues
et al. (2009), mostrou que a adição do peptídeo SAP (Sweet Arrow Peptide) ao
DNA, com posterior incorporação em nanopartículas de lipídios sólidos (SLN)
foi capaz de aumentar a eficiência de transfecção em células HEK293 e
71
ARPE-19 comparado aos vetores SLN:DNA. Esse aumento da transfecção,
pelos complexos SAP:DNA:SLN é explicado pelo aumento da entrada destes
vetores nas células por endocitose do tipo caveolae/raft ao invés da endocitose
por clatrina. A combinação de peptídeos com lipossomas também foi estudada
por Rosada et al. (2012), onde foi desenvolvida uma vacina de DNA contra a
tuberculose. Nesse estudo, foi demonstrado que a complexação de um
peptídeo sintético, contendo sinal de localização nuclear, com o DNAhsp65, e
posteriormente incorporação dentro das estruturas lipossomais, proporcionou
efeitos terapêuticos maiores que quando comparados ao lipossoma/DNAhsp65
ou apenas o DNA. Ademais, foi notada uma efetiva redução da quantidade de
DNAhsp65 administrada através de uma rota indolor nos animais. Outra
abordagem interessante foi a estudada por Cheng et al. (2013) onde os
pesquisadores desenharam e sintetizaram quatro pequenos peptídeos
conjugados com uma cadeia de colesterol para formar complexos com a
capacidade de formar vesículas similares aos lipossomas para entrega gênica.
Os resultados mostraram que o complexo anfifílico peptídeo-colesterol formado
foi capaz de se auto agregar dentro de micelas catiônicas em baixas
concentrações (<85µg/mL). Além disso, as micelas formadas aumentaram a
densidade da carga catiônica e condensaram mais eficientemente o DNA, o
que levou a um aumento da expressão gênica tanto nas células HEK-293 e
MCF-7.
5.4.1 Estudos de Citotoxicidade
No desenvolvimento de um novo vetor de entrega gênica, outros
fatores são importantes além da eficiência de entrega gênica. Um destes
72
fatores é a toxicidade. Para avaliar se os complexos estudados levam ao
aumento da morte celular in vitro, foram realizados ensaios de viabilidade
celular depois do tratamento com os complexos estudados (Figura 23).
Analisando-se os resultados, pode-se observar que os complexos binários
(CBs) formados pela protamina (1:0,1; 1:0,5 e 1:1,5) não tiveram efeito
significativo sobre a viabilidade celular. Quando se incorporou o lipossoma para
a formação dos CPTs, houve uma diminuição de aproximadamente 25% da
viabilidade nas relações (1:0,1 e 1:0,5), e de 36% na relação 1:1,5. Ao
analisarmos os complexos formados pela TRP3, podemos inferir que apenas a
TRP3 em combinação com o pDNA (complexo binário) na relação 1:1 não teve
efeitos significativos na viabilidade celular (99,4%). Em relações maiores da
proteína (1:30 e 1:60), houve uma ligeira diminuição da viabilidade, para 92,9%
e 93,3% respectivamente.
0
20
40
60
80
100
120
Via
bil
idad
e C
elu
lar
(%) 100
74,7
98,9
75,8
99,3
73,2
97,9
63,5
99,4
70,6
92,9
45,4
93,3
32,9
83,3
Figura 23. Ensaio de citotoxicidade de todos CBs, CPTs, lipossoma e lipofectamina, usando
tanto a protamina como a TRP3 como agente condensador do material genético. As barras de
erros indicam o desvio entre ensaios realizados em triplicata.
73
O complexo pDNA:lipossoma foi responsável por uma diminuição de
25% da viabilidade das células, o que já é significativo em se pensando em
futura utilização (estudos) in vivo desses complexos. Entretanto, foi observado
que os complexos pseudo-ternários, em todas as relações mássicas de
pDNA:TRP3 (1:1, 1:30 e 1:60), causaram uma diminuição da viabilidade das
células, mesmo comparada ao complexo pDNA:lipossoma. Assim, diante dos
resultados obtidos para a transfecção, foi verificado que o complexo pseudo-
ternário contendo a TRP3 na relação 1:30 foi que obteve a maior eficiência de
transfecção (25,3%). Entretanto, também foi constatada uma maior morte
celular, sendo obtidos valores de viabilidade de 45,4%, o que é um fator
negativo tendo-se em vista uma possível aplicação in vivo destes complexos.
Ainda nesse sentido, é notável a eficiência razoável e baixa citotoxicidade do
complexo binário pDNA:TRP3 na relação mássica 1:60.
5.4.2 Efeito da Dose do CPT (1:30) sobre a Transfecção e a Citotoxicidade
Foram realizados ensaios de transfecção utilizando-se diferentes
dosagens do CPT (pDNA:TRP3 na relação mássica 1:30), buscando-se avaliar
a melhor dose onde fosse obtida menor citotoxicidade com a maior eficiência
de transfecção (Figura 24). A análise dos dados permite inferir que há um
aumento da porcentagem de células transfectadas a medida que se aumenta a
dosagem testada (1,5 µg; 1 µg; 0,8 µg; 0,5 µg e 0,3 µg). A Figura 25 mostra o
nível de citotoxicidade desses CPTs estudados nas várias dosagens testadas.
74
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Cé
lula
s T
ran
sfe
cta
da
s (%
)34,7
27,7
22,7
10,0
4,3
10,5
Os ensaios de citotoxicidade nas diferentes dosagens dos CPTs
revelaram que, de maneira semelhante à eficiência de transfecção, houve uma
tendência ao aumento da morte das células quando aumentamos a dosagem
dos complexos. Assumindo-se uma porcentagem máxima de morte celular
aceitável de aproximadamente 10%, apenas a dosagem de 0,3 µg enquadrou-
se nessa faixa de valores, com uma eficiência de transfecção de 4,3%. Esse
valor de eficiência de transfecção é de aproximadamente um terço do valor
obtido para o complexo binário pDNA:TRP3 na relação mássica 1:60, que
apresentou níveis similares de citotoxicidade.
Figura 24. Ensaio de transfecção em célula HeLa utilizando-se diferentes dosagens (1,5 µg,
1,0 µg, 0,8 µg, 0,5 µg e 0,3 µg) dos CPTs contendo a proteína TRP3 na relação 1:30. O
experimento foi realizado em triplicata e as barras de erro indicam o desvio padrão.
75
0
20
40
60
80
100
120
Via
bil
ida
de
Ce
lula
r (%
)
30,437,4
46,5
74,2
89,9
73
100
5.4.3 Avaliação do Tráfego Intracelular dos Complexos (CBs e CPTs)
Para conhecermos melhor os mecanismos relacionados a maior
eficiência de transfecção de alguns complexos com a TRP3 usando 1µg de
DNA (padrão) (CBs/1:60 e CPTs/1:30), foram realizados ensaios de
transfecção usando-se duas drogas, a cloroquina e o nocodazol. A primeira
constitui-se de uma base fraca usada no tratamento contra a malária. Outra
função desempenhada pela cloroquina é capacidade de se acumular nas
vesículas lisossomais, impedindo a acidificação dos mesmos, levando também
à expansão do volume e fragilização da membrana, facilitando assim o
rompimento das vesículas. Neste sentido, este composto é muito utilizado na
área de terapia gênica para investigar o aprisionamento de complexos no
interior de endossomas e lisossomas. Vale ressaltar que o escape endossomal
Figura 25. Ensaio de citotoxicidade em célula HeLa utilizando-se diferentes dosagens (1,5 µg,
1,0 µg, 0,8 µg, 0,5 µg e 0,3 µg) dos CPTs contendo a proteína TRP3 na relação 1:30. O
experimento foi realizado em triplicata e as barras de erro indicam o desvio padrão.
76
é uma das barreiras críticas para uma eficiente entrega gênica. Já o Nocodazol
é uma droga que atua na despolimerização da rede de microtúbulos. Desse
modo, é possível se avaliar a contribuição da rede de microtúbulos para o
tráfego intracelular dos complexos formados. Os resultados referente as
transfecções usando a cloroquina são mostrados na Figura 26.
0
50
100
150
200
250
300
350
400
Efic
iên
cia
de
Tra
nsf
ecç
ão r
ela
tiva
(%
)
100
300
100 100
216
135
Podemos observar pelos resultados que a cloroquina promoveu um
aumento mais acentuado (3 vezes) na eficiência de transfecção no CB (1:60)
quando comparado ao CPT (2 vezes) e ao complexo pDNA:lipossoma (apenas
35%). Esses dados corroboram com os encontrados na literatura que apontam
os lipossomas como facilitadores do escape endossomal, devido a sua
capacidade fusogênica com membranas (Akita et al., 2004). Seguindo este
raciocínio, nossos resultados indicam que a cloroquina melhorou pouco a
Figura 26. Ensaio de transfecção usando a droga cloroquina para se avaliar o envolvimento
dos endossomas na eficiência de transfecção de células HeLa. Os resultados dos complexos
com a cloroquina mostrados sempre foram comparados em relação ao mesmo complexo sem
a droga, justamente por isso estes são considerados 100%. Os complexos usados foram: CB
(1:60), CPT (1:30) e DNA:lipossoma. Os experimentos foram realizados em triplicata.
77
eficiência de transfecção quando utilizamos o complexo pDNA:lipossoma. No
entanto, no caso do CB (1:60) observou-se uma melhora significativa na
eficiência de transfecção quando foi utilizada a cloroquina, sugerindo que a
proteína por si não é eficiente em facilitar o escape endossomal, mesmo
contendo uma sequência de histidinas. Em relação ao CPT, foi observado uma
melhora na eficiência de transfecção que tende a um valor intermediário ao
encontrado nos outros dois complexos (CB e pDNA:lipossoma), sugerindo um
efeito combinado entre TRP3 e lipossoma. Portanto, os resultados indicam
alteração do tráfego intracelular dependendo da composição dos complexos. A
adição do lipossoma ao complexo binário, formando os complexos pseudo-
ternários, parece facilitar o escape endossomal, levando a maior eficiência de
transfecção e, também, maior citotoxicidade.
De forma a avaliarmos o envolvimento dos microtúbulos na transfecção
dos diferentes complexos estudados, foram realizados ensaios de transfecção
usando o Nocodazol (Figura 27). Podemos observar que, através da utilização
do Nocodazol, houve uma diminuição de 92% da eficiência de transfecção do
CB (1:60), o que sugere uma elevada dependência dos microtúbulos no tráfego
intracelular do complexo utilizando TRP3. Este fato sugere que a elevada
capacidade de transferência do material genético por parte do CB (1:60) se
deve a um conjunto de fatores como a compactação e carga positiva da
partícula, como mostrado através dos ensaios mostrados anteriormente, mas
também devido ao rápido transporte do pDNA pela rede de microtúbulos,
facilitando o tráfego intracelular. Em relação ao CPT (1:30) não foi notado
diferença significativa em relação a eficiência de transferência do material
genético. Já quando analisamos o complexo pDNA:lipossoma, notamos que o
78
Nocodazol foi responsável por um aumento de duas vezes na eficiência. Essa
diferença entre as eficiências de transfecção dos complexos na presença do
Nocodazol mais uma vez indica rotas e interações distintas durante o tráfego
intracelular dos diferentes complexos. É possível que, no caso do lipossoma, a
rede de microtúbulos funcione como uma barreira física ao tráfego intracelular,
diferentemente do que acontece quando a TRP3 está exposta no complexo
(caso do CB), o que pode facilitar o movimento pelo interior das células através
da rede de MTs pela interação com dineínas.
0
50
100
150
200
250
Efic
iên
cia
de
Tran
sfec
ção
Rel
ativ
a (%
)
100100 100
201,7
93,5
8
Figura 27. Ensaio de transfecção utilizando a droga nocodazol para se avaliar o envolvimento
dos microtúbulos na eficiência de transfecção de células HeLa. Os complexos usados foram:
CB (1:60), CPT (1:30) e DNA:lipossoma. Os dados obtidos do CB (*) foram obtidos pela
aluna Marianna Favaro (Favaro, 2012). Os experimentos foram realizados em triplicata.
* *
79
5.4.4 Acessibilidade ao DNA presente nos CBs e CPTs usando a TRP3
Foi realizado um estudo de acessibilidade ao pDNA incorporado aos
CBs (1:60) e CPTs (1:30) utilizando também a TRP3 para avaliar se a diferença
nas eficiências de transfecção poderiam estar relacionadas ao pDNA
empacotado ou exposto para a ação de nucleases. Os resultados são
mostrados na Figura 28.
0
10
20
30
40
50
60
CB (1:30) CB (1:60) CPT (1:30) CPT (1:60) DNA:lipossoma
Flu
ore
scê
nci
a R
ela
tiv
a(%
do
co
ntr
ole
)
7,9 7,2 8,3 7,2
53,4
Podemos observar pelos resultados que não houve diferença
significativa em relação à acessibilidade ao DNA presente tanto nos CBs
quanto nos CPTs. Isso, entretanto, indica uma capacidade acentuada da TRP3
em condensar e compactar o pDNA (CBs e CPTs), sendo obtidos valores de
acessibilidade menores aos encontrados para o complexo pDNA:lipossoma
(53,4%). Esses resultados indicam que, além das diferenças relativas ao
Figura 28. Ensaio de Acessibilidade ao DNA feito através do Kit de quantificação de DNA fita
dupla (PicoGreen Quant-iT, Invitrogen). Os resultados comparam a intensidade de
fluorescência do DNA presente nos CBs e CPTs em relação ao DNA livre, usado como
controle do experimento.
80
tráfego intracelular comentadas acima, a presença da proteína TRP3 nos
complexos aumenta o grau de proteção do pDNA contra a degradação por
nucleases durante o tráfego intracelular, o que está reportado ser um dos
fatores a afetar a eficiência de transfecção (Azzoni et al. 2007).
5.4.5 Estudo da Morfologia dos Complexos
Foi feita uma análise morfológica das estruturas formadas a partir da
complexação inicial do pDNA com a TRP3 para a formação dos complexos
binários (CBs), seguido pela adição do lipossoma para a formação dos
complexos pseudo-ternários (CPTs) (Figura 29). As condições detalhadas para
a formação desses complexos foram descritas anteriormente, de modo que são
as mesmas usadas para os ensaios de transfecção. A técnica utilizada para a
detecção das imagens foi a do tipo negativa (negative staining), utilizada em
vários trabalhos do mesmo tipo (Espín et al., 2011; Yuan et al., 2010; Peng et
al., 2012)) para a visualização de partículas através da microscopia eletrônica
de transmissão (MET). Podemos observar nas micrografias que os CBs (A e
B) formados apresentam morfologia aproximadamente esférica, apresentando
certo grau de agregação e polidispersidade. Esses resultados usando a TRP3
como agente condensador estão em acordo com os obtidos por Villaverde e
colaboradores (2011), onde foram estudadas duas proteínas de fusão (HKRN e
HNRK) para estudos de entrega gênica. Neste caso, os pesquisadores
estudaram a arquitetura das proteínas e suas interações com o DNA e
observaram que as partículas formadas (complexos binários) tinham tamanho
de aproximadamente 80 nm e imagens de MET semelhantes às obtidas neste
trabalho. Ao analisarmos as micrografias dos CPTs (C e D) é possível observar
81
partículas de variada morfologia, desde estruturas esféricas até estruturas
alongadas. Vale ressaltar que nestes complexos é possível a visualização de
um halo ao redor do complexo da ordem de 4 nm, que acreditamos ser o
lipossoma catiônico, visto que e metodologia usada para a produção do
lipossoma catiônico é unilamelar (Balbino, 2012) com estruturas mais
uniformes. Esses resultados, portanto, indicam que o complexo binário
contendo pDNA e TRP3 foi encapsulado em uma estrutura unilamelar.
100 nm100 nm
100 nm 100 nm
A B
C D
6. Conclusões
Diante dos resultados obtidos podemos tirar as seguintes conclusões:
Figura 29. Microscopia eletrônica de transmissão dos complexos binários (CBs) nas
relações 1:30 (A) e 1:60 (B), e dos complexos pseudo-ternários (CPTs) nas relações 1:30 (C)
e 1:60 (D). As setas vermelhas mostram o halo do lipossoma formado nos CPTs. As escalas
de barras indicam 100 nm em todas as micrografias (A, B, C e D).
82
6. Conclusões
Os resultados obtidos nos levam as seguintes conclusões enumeradas a
seguir:
1) A protamina como agente condensador do DNA não foi capaz de melhorar a
eficiência de transfecção mesmo quando combinada ao lipossoma catiônico
para a formação dos complexos pseudo-ternários (várias relações estudadas);
2) Ao utilizarmos a TRP3 como agente condensador do pDNA, foi observado
que a proteína em combinação com o DNA (CB) na relação 1:60 foi capaz de
efetuar uma transfecção eficiente, obtendo valores semelhantes ao complexo
pDNA:Lipossoma mas com menor citotoxicidade;
3) Ao adicionarmos o lipossoma para a formação dos complexos pseudo-
ternários (CPTs) foram obtidos valores muito melhores de transfecção, tanto na
relação 1:30 como na 1:60, evidenciando o efeito sinérgico do lipossoma e da
TRP3 na superação das barreiras intracelulares para expressão gênica;
4) Foi observado que o valor de potencial zeta positivo, apesar de ser
importante para a entrada na célula (interação eletrostática), não precisa ser
necessariamente elevado para que o complexo proporcione uma alta eficiência
de transfecção;
5) O tamanho dos complexos se mostrou de extrema importância no processo
de transfecção, sugerindo a utilização de vetores com tamanhos iguais ou
menores que 100 nm;
83
6) Os ensaios de transfecção utilizando o Nocodazol sugerem que os
microtúbulos desempenham um papel importante no transporte intracelular de
cargas da periferia ao núcleo da célula;
7) As transfecções utilizando a cloroquina demonstraram que os CBs têm
maiores dificuldades de realizar o escape endossomal, de forma que sem esta
barreira o CB (1:60) seria provavelmente o melhor sistema da entrega;
8) O ensaio de acessibilidade indicou que os CBs e CPTs formado pela TRP-3
(1:30 e 1:60) não apresentaram grandes diferenças em relação ao pDNA
exposto a ação de nucleases;
9) Os ensaios de citotoxicidade revelaram que a TRP3 em combinação direta
ao pDNA tem um baixo efeito na morte das células, entretanto em combinação
ao lipossoma, que já possui alta toxicidade, acentuou ainda mais a morte
celular;
10) Assim, podemos concluir que os CPTs formado pela combinação da TRP3
com o lipossoma catiônico apesar de alcançar uma alta eficiência de
transfecção, causa efeitos citotóxicos elevados nas células, o que
impossibilitaria a aplicação in vivo. Dessa forma acreditamos que seria mais
interessante à utilização unicamente da TRP3 para a formação de um vetor
não viral eficiente e com baixa citotoxicidade nas células.
84
7. Sugestões para Continuação dos Trabalhos
Tendo em vista os resultados obtidos ao logo do trabalho, mais
especificamente em relação à alta eficiência de transfecção dos CPTs usando
a TRP3 como agente condesador e, também, a alta taxa de morte celular, seria
interessante usar outra molécula que pudesse intercalar a interação entre a
TRP3 e o lipossoma catiônico. Assim, recentemente o grupo tem trabalhado
com nanopartículas de prata em combinação com a protamina para a produção
de vetores não virais para entrega gênica. Os resultados iniciais mostraram que
o complexo formado (pDNA:protamina:Nanopartículas) foi capaz de promover a
transferência do material genético com baixo efeito na viabilidade celular.
Nesse sentido, visando unir as duas estratégias, de modo a aumentar a
eficiência de transfecção minimizando os efeitos na morte celular, uma ideia
interessante seria produzir um complexo formado pelo pDNA, TRP3,
nanopartículas de prata e lipossoma catiônico. Vale ressaltar que as interações
eletrostáticas de cada molécula permitiriam essa formação, visto que as
nanopartículas possuem cargas negativas e os lipossomas cargas positivas.
Outra possibilidade seria tentar otimizar a composição do lipossoma, de forma
a tentar reduzir a citotoxicidade dos CPTs. Essa estratégia deveria ser pensada
com calma em conjunto com o grupo da Professora Dra. Lucimara da Unicamp
com grande experiência no assunto.
85
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