RAQUEL BRAGHINI

Efeitos da radiação gama no fungo Alternaria alternata e nas micotoxinas alternariol e alternariol monometil éter em amostras de

cereais artificialmente contaminadas

Tese apresentada ao Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, para obtenção do título de Doutor em Ciências.

Área de concentração: Microbiologia Orientador: Benedito Corrêa

São Paulo 2009

Resumo

BRAGHINI, R. Efeitos da radiação gama no fungo Alternaria alternata e nas micotoxinas alternariol e alternariol monometil éter em amostras de cereais artificialmente contaminadas. 2009. 101 f. Tese (Doutorado em Microbiologia) - Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2009.

O presente trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos da administração de

diferentes doses de radiação gama no crescimento de Alternaria alternata e na

produção das toxinas alternariol (AOH) e alternariol monometil éter (AME), em

amostras de sementes de girassol, de grãos de milho, trigo e arroz. Para este fim,

após irradiação com 2, 5 e 7 kGy, a massa de esporos foi ressuspendida com água

destilada estéril e inoculada nas amostras de cereais. Foi realizada a contagem do

número de unidades formadoras de colônias por grama, utilizando Dicloran Rosa de

Bengala Cloranfenicol e Ágar Dicloran Cloranfenicol Extrato de Malte, a pesquisa de

AOH e AME, empregando-se Cromatografia Líquida acoplada a Espectrômetro de

Massa. Doses de 2; 5 e 10 kGy, foram empregadas nos cereais, para análise

bromatológica, das vitaminas pantotenato de cálcio e niacina, ácidos graxos e para

análise estrutural do fungo por Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV). Como

resultado das análises realizadas, nos grãos de arroz e nas sementes de girassol

observou-se diminuição do número unidades formadoras de colônias,

proporcionalmente à dose de radiação utilizada. Diversamente, entretanto, o

aumento da dose de radiação, nos grãos de trigo e milho, resultou-lhes aumento das

unidades formadoras de colônias. A análise micotoxicológica revelou, nos grãos de

trigo e sementes de girassol tratados pelo processo de irradiação, menor produção

de AOH, comparativamente ao grupo controle. Já nos grãos de arroz e milho, o

grupo irradiado com 5 kGy, foi o que mais produziu AOH. Resultado semelhante foi

constatado em relação à produção de AME. Nas análises, bromatológica, dos

minerais, das vitaminas pantotenato de cálcio e niacina e dos ácidos graxos, não

foram observadas alterações relevantes em comparação ao grupo controle. A MEV

possibilitou a visualização de alterações estruturais provocadas pelas diferentes

doses de radiação gama empregadas. Análises dos padrões das toxinas AOH e

AME irradiados, não revelou alterações, comparativamente ao grupo controle. Nas

condições de realização deste trabalho, o emprego da radiação gama revelou-se

uma alternativa no controle de A. alternaria e, conseqüentemente, de AOH e AME

em sementes de girassol, grãos de arroz, milho e trigo. Este é o primeiro estudo

sobre os efeitos da radiação gama nas toxinas AOH e AME.

Palavras-chave: Alternaria alternata; Alternariol; alternariol monometil éter;

Radiação gama; Cereais.

ABSTRACT

BRAGHINI, R. Effects of gamma irradiation on the fungus Alternaria alternata and on mycotoxins Alternariol (AOH) and Alternariol Monomethyl Ether (AME) in artificially contaminated cereal samples. 2009. 101 p. Ph. D. thesis (Microbiology) – Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2009. The present study aimed to evaluate the effects of different gamma irradiation doses

on the growth of Alternaria alternata and on production of mycotoxins Alternariol

(AOH) and Alternariol Monomethyl Ether (AME) in samples of sunflower seeds, corn,

wheat and rice grains. For this purpose, after irradiation with 2, 5 and 7 kGy, the

spore mass was ressuspended in sterile distilled water and inoculated into cereal

samples. The number of colony- forming units per gram (CFU/g) was determined

after culture on Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol and Dichloran

Chloramphenicol Malt Extract Agar. The presence of AOH and AME was investigated

by Liquid Chromatography coupled to Mass Spectrometry. Doses of 2, 5 and 10 kGy

were applied on cereals for bromatological, vitamins (calcium pantothenate and

niacin) and fatty acids analysis. In addition, fungal morphology after irradiation on

cereals was also analyzed using Scanning Electron Microscopy. The results showed

a significant reduction in the number of CFU/g in rice grains and sunflower seeds,

which were proportional to radiation dose used. However, in corn and wheat grains

was observed an increase in the number of CFU/g with the increase of gamma

irradiation. The radiation doses used resulted in a reduction of AOH levels when

compared to the nonirradiated control group. In rice and corn grains, the production

of AOH was highest in the group irradiated with 5 kGy. Similar result was obtained

with relation to AME. Bromatological, minerals, vitamins (calcium panthothenate and

niacin) and fatty acids analysis didn´t reveal any alterations when compared to the

control group. Scanning electron microscopy (SEM) made it possible to visualize

structural alterations on A. alternata induced by the different γ-radiation doses used.

Analysis of irradiated AOH and AME toxins standards didn´t show any alteration,

when compared to the nonirradiated control group. Under the conditions of the

present research, gamma radiation was found to be an alternative for the control of

A. alternata and, consequently, of AOH and AME production in sunflower seeds, rice,

corn and wheat grains. This is the first study about effects of gamma radiation on

AOH and AME toxins.

Keywords: Alternaria alternata; Alternariol; Alternariol monomethyl ether; Gamma

radiation; Cereals.

1 INTRODUÇÃO

1.1 Considerações gerais sobre o girassol, o milho, o arroz e o trigo

O girassol é uma dicotiledônea anual pertencente à família Compositae,

gênero Helianthus l., espécie annus; cultivado principalmente como planta

oleaginosa. Originário da América do Norte foi utilizado pela população na Europa,

no século XVI, pela beleza de suas flores conquistou espaço como planta

ornamental e hortaliça. Entretanto, na antiga União Soviética, a partir da Primeira

Grande Guerra iniciou-se a expansão desta cultura, após estudos pelos quais se

pretendia o melhoramento genético da planta e a introdução de genótipos com altos

teores de óleo.

As propriedades nutricionais e organolépticas do óleo de girassol são

bastante conhecidas [Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA,

2008a)]. Além da utilização do óleo na alimentação humana, o girassol pode ser

utilizado como aperitivo na forma de sementes torradas, na composição de barras de

cereais, biscoitos, papas de bebês, alimento de pássaros, ração para cães e gatos,

na forma de silagem ou farelo. Nos países eslavos, as sementes de girassol são

torradas e moídas e utilizadas como sucedâneo do café. Ademais vem sendo

beneficiado pela indústria farmacêutica na produção de cosméticos, tintas e

materiais, sem mencionar os seus desígnios na chamada adubação verde, ou como,

biodiesel. Outras alternativas de utilização desta planta dizem respeito à sua

aplicação na construção civil (da casca, na confecção de móveis e do caule, na

produção de isolantes térmicos e acústicos) (VRÂNCEANU, 1974; PELEGRINI,

1985).

No Brasil, nos anos de 2007 e 2008, a safra de girassóis ocupou 113,9 mil

hectares, destacando-se o estado do Mato Grosso como o maior produtor, seguido

do Rio Grande do Sul, de Goiás, do Mato Grosso do Sul, do Rio Grande do Norte, do

Ceará, e do Paraná [Companhia Nacional de Desenvolvimento (CONAB, 2008)].

No que concerne às características do milho, trata-se de uma

monocotiledônea pertencente à família das gramíneas (Gramineae), atualmente

Poaceas, gênero Zea, cientificamente denominada Zea mays L. (FANCELLI, 1983).

Apresenta-se como produto importante na alimentação humana, na medida em que

contém carboidratos, sobretudo amido, proteínas, óleo e vitaminas (MOURA e

OLIVEIRA, 1980; Food and Agricultural Organization (FAO, 1993). Devido à sua

constituição é utilizado no preparo de mais de 500 derivados (NOGUEIRA JÚNIOR

et al., 1987), na alimentação humana e animal. É tido como importante instrumento

no equilíbrio sócio-econômico das populações em razão de funcionar como matéria-

prima básica de compostos agroindustriais (FANCELLI e DOURADO NETO, 2000).

Quanto à sua safra, no período de 2007/2008, ocupou 14.796,4 mil hectares

do Paraná, maior produtor, do Mato Grasso, de Minas Gerais, de Goiás, e de São

Paulo (CONAB, 2008).

O trigo, por sua vez, pertence à família das gramíneas e ao gênero Triticum.

Em sua maioria, classifica-se em três espécies: a Triticum aestivum L., predominante

na produção mundial; a Triticum compactum Host. e a Triticum durum Dest. O trigo

Triticum aestivum se subdivide em 4 classes: “Hard Red Winter”, “Hard Red Spring”,

“Soft Red Winter” e “Soft Red Spring” (MATTERN, 1991). Origina-se de regiões

montanhosas do sudoeste da Ásia (Irã, Iraque e Turquia), tendo sido cultivado como

uma das mais importantes fontes de cereais da alimentação humana na Pérsia

antiga, na Grécia e no Egito. Provas destas circunstâncias podem ser atribuídas aos

achados de grãos de trigo carbonizados, datados de cerca de mais de 6 mil anos,

quando já se procedia o beneficiamento desta espécie de cereal naquelas regiões

(EMBRAPA, 2008b).

Vale registrarmos que se trata de um alimento nobre, abrangendo por volta de

30% da produção mundial de grãos. Seus maiores produtores são a China, a

Comunidade Européia, a índia e a Rússia, países que representam 64% do total

mundial (EMBRAPA, 2008c). No Brasil, a área de trigo cultivada na safra de

2007/2008, foi de 1.818,9 mil hectares, sendo o estado do Paraná seu maior

produtor, seguido do Rio Grande do Sul, São Paulo e Mato Grasso do Sul (CONAB,

2008).

Sobre o último cereal estudado, o arroz, Oryza sativa L, é uma planta da

classe monocotiledonea, família gramineae, da subfamília oryzoideae, gênero Oryza

e da espécie sativa L. Das suas cerca de 19 espécies, a Oryza sativa é a mais

conhecida e cultivada, constituindo-se no alimento essencial a grande parte da

população do globo terrestre (FONSECA et al., 1983; ANSELMI, 1985), daí

depreende-se a sua vital importância.

Acredita-se que a Oryza sativa origina-se do sudoeste da Ásia, as ilhas

adjacentes e a China, datando sua expansão no começo da Era Cristã, expandiu-se,

seguindo-se em direção ao Egito e mais tarde para a Europa, para a África,

Américas e Austrália. Da China, espalhara-se para a Coréia e ao Japão (FONSECA

et al., 1983). Atualmente, 90% da produção e consumo concentram-se na Ásia.

Tal qual mencionado, uma vez cultivado e consumido em todos os

continentes, o arroz destaca-se pelo montante de sua produção, assim como pela

extensão de sua área de cultivo; portanto constitui-se instrumento referencial à

economia e às sociedades, por se apresentar como um dos alimentos que provê

ótimos índices nutricionais, fornecendo 20% da energia e 15% da proteína per capita

necessárias ao homem. Além disto, como cultura extremamente versátil, adaptável

às diferentes condições de solo e do clima, funciona como excelente incremento no

combate à fome no mundo. Aproximadamente 90% de todo o arroz do mundo é

cultivado e consumido na Ásia (EMBRAPA, 2008d).

No mais, a safra correspondente aos anos de 2007/2008 alcançou 2.874,9 mil

hectares, tendo o Rio Grande do Sul, como maior estado produtor, seguido do

Maranhão, Mato Grosso e Santa Catarina (CONAB, 2008).

1.2 Micotoxinas

Os grãos de cereais e sementes oleaginosas utilizadas como fontes de

alimentos são expostos a uma ampla variedade de contaminantes, especialmente

por fungos, considerado um dos principais fatores de deterioração (CHRISTENSEN

e KAUFMANN, 1965). A ação dos fungos tem efeito nos vários tipos de alimento

desde o cultivo até a colheita, assim como no transporte, armazenamento e nas

diferentes fases de produção, ocorrendo com maior intensidade sob condições de

temperatura e umidade favoráveis (FRISVAD e SANSON, 1991).

Neste processo, entende-se que a invasão fúngica, dentre outros patógenos,

resulta na diminuição do poder de germinação, emboloramento visível,

descoloração, odor desagradável, perda de matéria seca e aquecimento

(CHRISTENSEN e KAUFMAN, 1969).

A palavra micotoxinas é derivada da justaposição dos termos gregos “mykes”

(fungo) e “toxicon”, (toxina ou veneno) (GOLDBLATT, 1972). Compreende um

complexo de substâncias tóxicas, produzidas por fungos filamentosos que,

dependendo da sua concentração nos alimentos e rações, causa graves problemas

à saúde humana e a animal (MOSS, 1998). Este aspecto deve ser ressaltado,

porque dos cerca de 400 tipos de micotoxinas conhecidos, apenas 30 foram

detalhadamente estudados (ETZEL, 2002).

O desenvolvimento dos fungos toxigênicos, com consequente produção de

micotoxinas, depende de uma série de fatores, tais quais (CIEGLER, 1978): (a)

susceptibilidade do substrato à colonização do fungo produtor; (b) fatores físicos

adequados como temperatura ambiente, umidade do substrato, umidade relativa do

ar durante o armazenamento, aeração, danos mecânicos, tempo de

armazenamento; (c) fatores biológicos como capacidade genética do fungo na

produção de micotoxinas, quantidade de esporos viáveis, interação de diferentes

fungos no mesmo substrato, interação de micotoxinas e presença de insetos nos

grãos armazenados. Dentre estes desencadeadores, o tipo de substrato adotado,

tanto como os índices de umidade e de temperatura são os que mais influenciam a

produção de micotoxinas (CORRÊA, 2000).

7 CONCLUSÕES

Com base nos objetivos propostos no presente trabalho e nas suas condições

de realização, conclui-se que:

• Sob condições favoráveis, A. alternata irradiada com 2, 5 e 7 kGy demonstrou

grande capacidade de germinação e produção de toxinas;

• A. alternata mostrou grande resistência nas doses de radiação utilizadas;

• O emprego da radiação gama diretamente na cepa de A. alternata, com

posterior inoculação nas amostras de trigo e de milho, propiciou aumento no

número de UFC/g, comparativamente ao número do grupo controle;

• Com o emprego da radiação gama diretamente na cepa de A. alternata, com

posterior inoculação nas amostras de arroz e girassol, houve diminuição de

número de UFC/g, comparativamente aos valores do grupo controle;

• A microscopia eletrônica de varredura possibilitou a nítida visualização das

alterações morfológicas das células fúngicas, proporcionalmente à dose

radiação aplicada;

• Quanto às doses de radiação aplicadas no tratamento das amostras, não

foram observadas, em comparação ao grupo controle, alterações relevantes

nas análises, bromatológica, de minerais, das vitaminas pantotenato de cálcio

e niacina e na análise dos ácidos graxos;

• Nas soluções padrão, irradiadas com 2, 5 e 10 kGy, não foram observadas

alterações nos respectivos espectros das toxinas;

• Os experimentos revelaram ser importante a escolha adequada da dose de

radiação a ser adotada, tanto quanto do substrato, de modo a que haja a

completa eliminação de Alternaria alternata.

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