REGINALDO FRANKLIN EFEITOS DA LEUCOANTOCIANIDINA …
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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
FACULDADE DE MEDICINA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS MÉDICAS
REGINALDO FRANKLIN
EFEITOS DA LEUCOANTOCIANIDINA NO TECIDO HEPÁTICO DE COELHOS
ALBINOS (Oryctolagus cuniculus) SUBMETIDOS À ESTEATOSE HEPÁTICA NÃO
ALCOÓLICA EXPERIMENTAL
Niterói, RJ
2018
REGINALDO FRANKLIN
EFEITOS DA LEUCOANTOCIANIDINA NO TECIDO HEPÁTICO DE COELHOS
ALBINOS (Oryctolagus cuniculus) SUBMETIDOS À ESTEATOSE HEPÁTICA NÃO
ALCOÓLICA EXPERIMENTAL
Dissertação submetida ao Programa de Pós
Graduação em Ciências Médicas da
Universidade Federal Fluminense como parte
dos requisitos necessários à obtenção do Grau
de Mestre. Área de Concentração: Ciências
Médicas.
ORIENTADOR: PROF. DR. MARCIO ANTONIO BABINSKI
COORIENTADOR: PROF. DR. JORGE HENRIQUE MARTINS MANAIA
Niterói, RJ
2018
REGINALDO FRANKLIN
EFEITOS DA LEUCOANTOCIANIDINA NO TECIDO HEPÁTICO DE COELHOS
ALBINOS (Oryctolagus cuniculus) SUBMETIDOS À ESTEATOSE HEPÁTICA NÃO
ALCOÓLICA EXPERIMENTAL
Dissertação submetida ao Programa de Pós
Graduação em Ciências Médicas da
Universidade Federal Fluminense como parte
dos requisitos necessários à obtenção do Grau
de Mestre. Área de Concentração: Ciências
Médicas.
Aprovado em ___ de ___________________ de ________.
BANCA EXAMINADORA
____________________________________________________________________
Prof. Dr. Vinicius Schott Gameiro
UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE - UFF
_____________________________________________________________________
Prof. Dr. Marcelo Abidu-Figueiredo
UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO - UFRRJ
____________________________________________________________________
Prof. Dr. Diogo Benchimol de Souza
UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO - UERJ
Niterói
2018
Dedico este trabalho aos Meus pais,
Jorcelino e Marilene, todo o meu
reconhecimento pelo esforço desmedido com
sacrifício de seus próprios sonhos em favor
dos meus. Aos meus filhos Gabriel Fernandes
Franklin, André Philip Franklin e in
memoriam da minha preciosinha Ana Raquel
Beltre Franklin, as razões do meu entusiasmo,
motivação e alegria de continuar nessa carreira
de docência. Aos meus mestres por todas as
oportunidades em aprender com suas
experiências.
AGRADECIMENTOS
Agradecer, certamente, é o momento mais difícil, por falta de palavras que
expressem a dimensão da gratidão para com aqueles que me fizeram mais experiente e
consciente, neste campo apaixonado da pesquisa médica, e para com aqueles que tão somente
protegeram os meus passos e compreenderam a minha ausência nos momentos de dedicação à
confecção desta dissertação.
À minha família, em especial à minha mãe, Marilene Franklin Pereira e saudoso pai,
Jorcelino Ribeiro Pereira.
Aos meus amados filhos Gabriel Fernandes Franklin e André Philip Franklin. À
minha filha (in memorian) Ana Raquel Beltre Franklin.
À Dra Raquel Libanesa Rosário Beltre pelo companheirismo e compreensão.
Aos meus amigos de jornada dos cursos de mestrado e doutorado da Universidade
Federal Fluminense em especial Lucas e Albino.
Ao meu orientador prof. Dr. Marcio Babinski pela paciência, apoio e prestigiosa
competência e ao coorientador Dr. Jorge Henrique Martins Manaia.
Aos professores do estimado curso de pós-graduação em ciências médicas da UFF,
coordenação e secretárias.
Aos professores Dr. Celio Fernando Rodrigues e Dr. Monte Bispo pela prestimosa
colaboração em doar os tecidos experimentados.
Aos meus alunos de Medicina Legal do curso de medicina da Unigranrio, da
Universidade Estácio de Sá, dos cursos de Direito e Farmácia do Centro Universitário
Anhanguera, seus olhares atentos foram não só fontes de entusiasmo, mas, sobretudo, me
fizeram crer que o momento mais precioso de aprender é quando se está ensinando.
Com grande satisfação, manifesto com fidalguia e profunda gratidão a todos,
reiterando meu respeito e admiração.
“Todas as vezes que cometi erros crassos, ou percebi que meu
trabalho foi imperfeito, ou quando fui criticado com desprezo, repeti
dezenas de vezes para mim mesmo que trabalhei no meu máximo e da
melhor maneira que pude, pois nenhum homem pode fazer mais que
isso”.
Charles Darwin (1809-1882)
RESUMO
O objetivo foi avaliar as alterações na densidade volumétrica (Vv) do tecido hepático de
coelhos submetidos à dieta hiperlipidêmica tratados com leucoantocianidina. Trinta coelhos
albinos machos da raça Nova Zelândia (em média 7 meses de idade e 3 kg de peso) foram
distribuídos aleatoriamente em três grupos com dez animais, a saber: Grupo Controle (G1)
cujos animais receberam ração Purina®; Grupo Hiperlipidêmico (G2) ração Purina® + 1,5 g
de colesterol + 10 ml de gema de ovo de galinha (ovo Carnaúba® tipo grande diluído e em
100 ml) dividido em duas ingestões VO ao dia e o Grupo Tratado (G3) que além dos 10 ml de
gema, ingeriu 50 mg/kg/peso de leucoantocianidina de uva, bem como ração. Os três grupos
receberam água ad libitum. A dieta complementar nos grupos G2 e G3 foram preparadas e
administradas diariamente, durante 99 dias. O sangue foi coletado para verificar os níveis
séricos e após 99 dias de experimento, os animais foram submetidos à eutanásia para exérese
do fígado e obtenção de fragmentos. Para a eutanásia, os animais foram previamente
anestesiados com cloridrato de Ketamina®, 9 mg/Kg (IM), associado ao cloridrato de
Xilazina (Rompun®), 30 mg (IM). Após o sacrifício, os espécimes foram fixados em
formalina 10%, incluídos em parafina e processados histologicamente. Os elementos
histológicos foram avaliados pela microscopia de luz usando a técnica de coloração de
tricrômio de Masson. Estudos morfométricos foram realizados através da estereologia. Os
resultados (% média±SD) representam a expressão dos achados microscópicos de 25 campos
histológicos aleatórios para cada espécime de cada coelho. Os resultados foram analisados
pelos testes estatísticos ANOVA, TUKEY, KRUSKAL-WALLIS e o pós-teste DUNNS. No
presente modelo experimental em coelhos, a leucoantocianidina de uva não modifica, os
níveis de colesterol total, LDL, VLDL, HDL, triglicerídeos e lipídeos totais de forma
significante no G3 quando comparado com o G1 e G2. O Vv (%) dos hepatócitos nos grupos
G1, G2 e G3 foram respectivamente: 82,7±4,2, 37,4±13,1 e 72,4±7,8 (p > 0,0001). Nossos
resultados mostram que os hepatócitos dos coelhos do G2 sofreram diminuição significativa
de 54.5% em relação ao G1, enquanto que o G3 apresenta redução de 12.1%. Não houve
diferença estatisticamente significativa entre os grupos G2 e G3. O presente estudo revela que
o consumo de leucoantocianidina tem efeito protetor para o tecido hepático na esteatose
hepática não alcoólica.
Palavras-chave: Leucoantocianidina. Esteatose não alcoólica. Estereologia.
ABSTRACT
This study aims to evaluate the alterations in the volumetric density from the liver of rabbits
submitted to a hypercholesterolemic diet and treated with grape leucoanthocyanidin. 30 male
albino rabbits (New Zealand) (±7 months old, mean weight of ±3 kg) were randomly
distributed in three groups with ten animals each: the control group (G1), in which the
animals received a regular diet (Purina®); the hypercholesterolemic group (G2), in which the
rabbits received regular diet associated with 1.5 g of cholesterol and 10 ml of chicken egg
yolk (Carnaúba®) divided in two oral ingestions daily; and the treated group (G3), which
received the same diet of the G2 associated with 50 mg/kg of grape leucoanthocyanidin. All
three groups received water and food ad libitum. The complementary diet of the G2 and G3
was prepared and administered daily during 99 days. Blood samples were collected
throughout the study as well. On the last day of the experiment (100), the animals were
euthanized with 9 mg/Kg of ketamine and 30 mg of xilazine (Rompun®), both administered
by intramuscular injection. After euthanasia, their liver was excised and fixated in a 10%
formalin solution. Their macroscopical aspects were observed and compared, and histological
samples were also obtained. The liver tissue was fixated and routine histological preparations
were performed. The Masson’s trichrome stain was used. Sterelogical analysis was performed
and the results are expressed as %mean ± standard deviation and were determined by the
analysis of 25 random histological fields for each liver. Statistical analysis was performed by
the ANOVA, TUKEY, Kruskal-Wallis and the DUNNS post-test. It was observed that the
grape leucoanthocyanidin was not able to reduce the LDL, VLDL, HDL triglycerides and
total lipid rates, as there was no statistical significance between groups (G3 vs G1 and G2).
Despite that, it was observed that the grape leucoanthocyanidin had a positive effect on the
liver tissue. The volumetric density of the hepatocytes was 82.7±4.2, 37.4±13.1 and 72.4±7.8
on the G1, G2 and G3, respectively (p < 0.0001). Furthermore, the study conducted herein
showed that the hepatocytes from the G2 had a significant reduction of 52.5%, while the G3
had only a reduction of 12.2%, in comparison to the G1. There was no statistical significant
difference between the G2 and G3. This study concludes that grape leucoanthocyanidin had a
protective effect on the liver in cases of non-alcoholic fatty liver disease in rabbits.
Keyword: Leucoantocianidine. Non-alcoholic fatty liver disease. Stereology.
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 – Composição da dieta (Purina®) utilizada no presente experimento, p. 26
TABELA 2 – Composição da gema de ovo (100 g) utilizada no presente experimento, p. 27
TABELA 3 – Média e desvio padrão do CT, conforme o dia e grupo, p. 35
TABELA 4 – Média e desvio padrão do LDL, conforme o dia e grupo, p. 37
TABELA 5 – Média e desvio padrão do VLDL, conforme o dia e grupo, p. 39
TABELA 6 – Média e desvio padrão do HDL, conforme o dia e grupo, p. 41
TABELA 7 – Média e desvio padrão do nível de triglicerídeos (TGC), conforme o dia e
grupo, p. 43
TABELA 8 – Média e desvio padrão do nível de lipídeos totais (LPT), conforme o dia e
grupo, p. 45
TABELA 9 – Média e desvio padrão do nível de TGP e TGO (mg/dL), conforme o dia e
grupo, p. 46
TABELA 10 – Média e desvio padrão da densidade volumétrica no tecido hepático em G1,
G2 e G3, p. 53
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 – ASPECTO MACROSCÓPICO DO FÍGADO DE COELHO, p. 21
Figura 2 – ADMINISTRAÇÃO DA GEMA DE OVO, p. 28
Figura 3 – SISTEMA-TESTE M42, p. 31
Figura 4 – XANTOMA, p. 32
Figura 5 – ASPECTO MICROSCÓPICO DO XANTOMA, p. 33
Gráfico 1 – EVOLUÇÃO DO PESO DOS ANIMAIS DURANTE O EXPERIMENTO, p. 34
Gráfico 2 – EVOLUÇÃO DAS TAXAS DE COLESTEROL TOTAL DOS ANIMAIS
DURANTE O EXPERIMENTO, p. 35
Gráfico 3 – EVOLUÇÃO DAS TAXAS DE LDL DOS ANIMAIS DURANTE O
EXPERIMENTO, p. 37
Gráfico 4 – EVOLUÇÃO DAS TAXAS DE VLDL DOS ANIMAIS DURANTE O
EXPERIMENTO, p. 39
Gráfico 5 – EVOLUÇÃO DAS TAXAS DE HDL DOS ANIMAIS DURANTE O
EXPERIMENTO, p. 40
Gráfico 6 – EVOLUÇÃO DAS TAXAS DE HDL E LDL DOS ANIMAIS DURANTE O
EXPERIMENTO, p. 41
Gráfico 7 – EVOLUÇÃO DAS TAXAS DE TRIGLICERÍDEOS DOS ANIMAIS
DURANTE O EXPERIMENTO, p. 43
Gráfico 8 – EVOLUÇÃO DAS TAXAS DE LIPÍDEOS TOTAIS DOS ANIMAIS
DURANTE O EXPERIMENTO, p. 44
Gráfico 9 – EVOLUÇÃO DAS TAXAS DE TGP E TGO DOS ANIMAIS DURANTE O
EXPERIMENTO, p. 46
Figura 6 – ASPECTO MACROSCÓPICO DO FÍGADO DOS COELHOS DO GRUPO 1, p.
47
Figura 7 – ASPECTO MICROSCÓPICO DO FÍGADO DOS COELHOS DO GRUPO 1
(MASSON), p. 48
Figura 8 – ASPECTO MACROSCÓPICO DO FÍGADO DOS COELHOS DO GRUPO 2, p.
49
Figura 9 – ASPECTO MICROSCÓPICO DO FÍGADO DOS COELHOS DO GRUPO 2
(MASSON), p. 50
Figura 10 – ASPECTO MACROSCÓPICO DO FÍGADO DOS COELHOS DO GRUPO 3,
p. 51
Figura 11 – ASPECTO MICROSCÓPICO DO FÍGADO DOS COELHOS DO GRUPO 3
(MASSON), p. 52
Gráfico 10 – DENSIDADE VOLUMÉTRICA DOS HEPATÓCITOS, p. 53
Gráfico 11 – DENSIDADE VOLUMÉTRICA DA ESTEATOSE HEPÁTICA, p. 54
Figura 12 – ASPECTO MICROSCÓPICO DO FÍGADO DOS COELHOS DO GRUPO 1
(H&E), p. 55
Figura 13 – ASPECTO MICROSCÓPICO DO FÍGADO DOS COELHOS DO GRUPO 2, p.
56
Figura 14 – ASPECTO MICROSCÓPICO DO FÍGADO DOS COELHOS DO GRUPO 3
(H&E), p. 57
LISTA DE ABREVIATURAS
CT – Colesterol total
D0 – Início do experimento
DHGNA – Doença hepática gordurosa não-alcoólica
EHNA – Esteatose hepática não-alcoólica
G1 – GRUPO 1 (Controle, 200g de ração)
G2 – GRUPO 2 (Hiperlipidêmico, 200g de ração + 10 mL de gema de ovo + 1,5 g de
colesterol)
G3 – GRUPO 3 (Tratado, 200g de ração, + 10 mL de gema de ovo + 1,5 g de colesterol +
leucoantocianidina de uva)
HDL – Lipoproteína de alta densidade
IV – Intravenosa
IM – Intramuscular
LPT – Lipídeos totais
LDL – Lipoproteína de baixa densidade
NS – Não significativo
SM – Síndrome metabólica
TGC – Triglicerídeos
TGO – Transaminase glutâmica oxalacética
TGP – Transaminase glutâmico pirúvica
VLDL – Lipoproteína de muito baixa densidade
Vv – Densidade volumétrica
SUMÁRIO
1 JUSTIFICATIVA, p. 16
2 OBJETIVOS, p. 18
2.1 OBJETIVOS GERAIS, p. 18
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS, p. 18
3 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA, p. 19
3.1 MODELO EXPERIMENTAL DE HIPERLIPIDEMIA EM COELHOS, p. 19
3.2 ANATOMIA, FISIOLOGIA E METABOLISMO HEPÁTICO DE COELHOS, p. 20
3.3 DOENÇA HEPÁTICA GORDUROSA NÃO ALCOÓLICA, p. 22
3.4 LEUCOANTOCIANIDINA, p. 23
4 MATERIAIS E MÉTODOS, p. 25
4.1 CUIDADOS BIOÉTICOS, p. 25
4.2 AMOSTRA, p. 25
4.3 PREPARO E ADMINISTRAÇÃO DA DIETA HIPERLIPIDÊMICA, p. 27
4.4 DOSAGEM BIOQUÍMICA, p. 28
4.5 EUTANÁSIA E PROCESSAMENTO HISTOLÓGICO, p. 29
4.6 ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA E ESTEREOLÓGICA, p. 30
4.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA, p. 31
5 RESULTADOS, p. 32
5.1 ALTERAÇÕES PATOLÓGICAS NA PELE, p. 32
5.2 VALORES BIOQUÍMICOS E PESO DOS ANIMAIS, p. 33
5.2.1 Peso dos animais, p. 33
5.2.2 Colesterol Total, p. 34
5.2.3 Colesterol LDL (lipoproteína de baixa densidade), p. 36
5.2.4 Colesterol VLDL (lipoproteína de muito baixa densidade), p. 38
5.2.5 Colesterol HDL (lipoproteína de alta densidade), p. 40
5.2.6 Evolução do LDL e HDL, p. 41
5.2.7 Triglicerídeos, p. 42
5.2.8 Lipídeos Totais, p. 43
5.2.9 TGP e TGO, p. 45
5.3 AVALIAÇÃO HISTOPATOLÓGICA E ESTEREOLÓGICA, p. 47
6 DISCUSSÃO, p. 58
7 CONCLUSÕES, p. 64
8 OBRAS CITADAS, p. 65
9 ANEXOS, p. 73
9.1 PROTOCOLO DE COLABORAÇÃO CIENTÍFICA, p. 73
9.2 PROTOCOLO DE DOAÇÃO DE MATERIAIS, p. 74
9.3 PARECER DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA DA UFAL, p. 75
9.4 COMUNICADO DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA DA UFF, p. 76
9.5 ESCORE DE ATIVIDADE DA ESTEATOSE HEPÁTICA, p. 77
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1 JUSTIFICATIVA
A doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA), também conhecida como
esteatose hepática não alcoólica (EHNA), é uma doença caracterizada pela infiltração e
subsequente depósito de lipídeos nos hepatócitos. Essa distribuição pode ser difusa ou
focal no tecido hepático. Possui similaridades com a doença hepática alcoólica, apesar
de ocorrer em indivíduos sem ingesta significativa de álcool (Augustin et al., 2017;
Ferramosca et al., 2017; Qiu et al., 2013)
A EHNA é uma doença comum, e estima-se que esta afeta em torno de 27% da
população geral. Está em geral associada com obesidade, diabetes mellitus (tipo 2) e
dislipidemias, sendo estes também fatores de risco para o desenvolvimento da DHGNA
(Khoshbaten et al., 2010).
Alguns autores acreditam que a EHNA deve ser incluída como critério durante o
diagnóstico da síndrome metabólica (Mantovani & Targher, 2017; Massart et al., 2017;
Qiu et al. , 2013).
Não existe tratamento farmacológico aprovado para a EHNA e os pacientes são
orientados a mudarem hábitos de dieta e exercício, além do tratamento das
comorbidades. Devido a isto, diversos estudos objetivam a utilização de substâncias
naturais ou farmacológicas para o tratamento desta doença, infelizmente, sem resultados
positivos ou significativos (Abdelmalek et al., 2009; Augustin et al. , 2017; Ferramosca
et al. , 2017; Machado et al., 2016; Sanyal et al., 2010).
Em contrapartida, os efeitos benéficos do vinho, em doses diárias são bem
difundidos nos meios de comunicação. Ampla também é a divulgação dos seus efeitos
benéficos e protetores contra doenças cardiovasculares. Esses efeitos pesquisados e
propagados são hoje sabiamente conhecidos devidos aos princípios ativos da Vitis
vinifera, dentre eles a leucoantocianidina de uva (pó liofilizado) que é bastante
difundido e comercializado (Beidokhti & Jager, 2017; Fernandes et al., 2017; Howes &
Simmonds, 2014; Ivey et al., 2017; Tangney & Rasmussen, 2013).
Muito se tem pesquisado sobre a relação entre o consumo do vinho e suas
frações flavonoides (antocianidinas, proantocianidinas e leucoantocianidinas). Porém os
efeitos benéficos sobre o tecido hepático não são tão claros, já que o efeito benéfico do
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vinho, do extrato bruto de antioxidante, sejam flavonoides ou outros, dependem dos
seguintes fatores: se o experimento é in vitro ou in vivo, a espécie de animal utilizado,
modelo experimental de indução da patologia, idade dos animais, origem do extrato e
sua via de administração, bem como o tempo de duração do experimento (Fernandes et
al. , 2017; Pizzino et al., 2017; van der Worp et al., 2010).
Após extensa pesquisa na base de dados Scielo e Medline (National Library of
Medicine), não foram encontrados trabalhos experimentais sobre a densidade
volumétrica (Vv) do tecido hepático esteatótico não alcoólico em coelhos submetidos ao
tratamento com a leucoantocianidina de uva, o que justifica a produção deste presente
trabalho.
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2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Verificar o efeito protetor da leucoantocianidina ao avaliar as alterações
morfológicas e morfométricas do tecido hepático de coelhos submetidos à dieta
hiperlipidêmica e tratados com leucoantocianidina.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Verificar através de métodos estereológicos a densidade volumétrica (Vv) dos
hepatócitos de coelhos submetidos a dieta hiperlipidêmica e tratados com
leucoantocianidina.
Verificar os efeitos da leucoantocianidina de uva sobre o: colesterol total, LDL,
HDL, VLDL, Lipídios totais, triglicerídeos, TGP e TGO.
19
3 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
3.1 MODELO EXPERIMENTAL DE HIPERLIPIDEMIA EM COELHOS
O uso de animais em pesquisas biomédicas tem sido recomendado para
aperfeiçoar e validar procedimentos já existentes, desenvolvimento de novos materiais e
compreensão dos diferentes processos fisiológicos e patológicos porque não há modelos
in vitro capazes de imitar completamente a complexidade do organismo humano
(Fagundes & Taha, 2004). Os modelos animais permitem controlar numerosas variáveis
que normalmente não podem ser obtidas em estudos com seres humanos (Bozkurt &
Pekiner, 2006; Traish et al., 2005).
Os roedores e coelhos são muito utilizados para mimetizar doenças humanas e
melhorar o entendimento das causas e da progressão das doenças, e para testar
intervenções terapêuticas potenciais (Torres, 2012).
A dieta moderna, especialmente a dos países Ocidentais, é rica em carboidratos,
como frutose e sacarose, bem como em gordura. O aumento da ingestão de calorias está
associado com muitas complicações induzidas por dieta incluindo a síndrome
metabólica (SM), doenças cardiovasculares e DHGNA (Massiera et al., 2010; Sulaiman
et al., 2017; Torres, 2012).
A combinação de carboidratos e gorduras nos componentes da dieta tem sido
usada em roedores para mimetizar os sinais e sintomas da SM em humanos (Abidu-
Figueiredo et al., 2011; Fonseca Jr et al., 2016; Qiu et al. , 2013; Torres, 2012).
A padronização dos ingredientes utilizados no que se refere à quantidade e
qualidade dos nutrientes foi possível pela publicação de um documento que estabeleceu
o requerimento de macronutrientes e micronutrientes para roedores nas diferentes fases
da vida (Reeves et al., 1993). Desta forma, dietas ricas em lipídios têm sido usadas para
induzir obesidade, dislipidemia e resistência à insulina em roedores (Abidu-Figueiredo
et al. , 2011; Fonseca Jr et al. , 2016; Torres, 2012). Em camundongos, a dieta
hiperlipídica aumenta a pressão arterial sistólica e induz a disfunção endotelial
(Kobayasi et al., 2010).
20
Diferentes tipos de dietas hiperlipídicas têm sido usados com frações de gordura
variando entre 20% a 60% de energia, assim como a origem da gordura, se animal,
como banha de porco e sebo, ou óleos de plantas, como óleo de oliva ou de coco
(Buettner et al., 2006). Roedores alimentados cronicamente com dieta hiperlipídica têm
a massa corporal aumentada (Lei et al., 2007; Qiu et al. , 2013; Sutherland et al., 2008;
Torres, 2012), desenvolvimento de hiperglicemia e sintomas de SM (Abidu-Figueiredo
et al. , 2011; Sutherland et al. , 2008; Sweazea et al., 2010).
Os coelhos utilizados são da classe Mammalia, pertencente à família Leporidae,
ordem Lagomorpha, em geral da espécie Oryctolagus cuniculus. A variedade Albino é
de difícil criação, especialmente a raça Nova Zelândia, que chega a pesar até ±5 kg
(Mapara et al., 2012; Mitchell-Jones et al., 1999).
É um bom modelo experimental para estudo dos efeitos sistêmicos de dietas
hiperlipídicas e aterogênicas, pois o metabolismo do coelho é lento e a dieta gordurosa
em excesso não queimada é armazenada como gordura do corpo, trazendo mais
similaridades com o metabolismo humano no que tange os lipídeos (Fan et al., 2017).
Drogas podem ser administradas por via oral (VO), por meio de sonda
orogástrica ou na água ingerida. Injeções intravenosas (IV) podem ser feitas com muita
facilidade na veia marginal da orelha, pela qual também se pode colher amostras de
sangue para diferentes análises (Stahlke Jr et al., 2004). Tanto a artéria quanto a veia
auricular são excelentes vias medicamentosas, anestésicas e de punção em relação a
outros vasos (Quesenberry & Carpenter, 2012).
3.2 ANATOMIA, FISIOLOGIA E METABOLISMO HEPÁTICO DE COELHOS
O fígado do coelho albino (Figura 1) tem em sua topografia diversas
similaridades com o de humanos: está posicionado caudalmente ao diafragma, e é
dividido em duas grandes metades (lobo direito e esquerdo). Porém, o fígado dessa
espécie é subdividido em um número maior de lobos (lateral e medial esquerdo, lateral e
medial direito, além do logo quadrado e caudado), totalizando ao todo 6 lobos distintos
(Quesenberry & Carpenter, 2012).
21
Figura 1 – ASPECTO MACROSCÓPICO DO FÍGADO DE COELHO
Ilustração mostrando a topografia do fígado do coelho adulto. Fonte: Varga (2013).
A fisiologia hepática do coelho é mais similar a de humano do que os ratos (Fan
et al. , 2017). Isso se deve por inúmeros fatores, como por exemplo: o uso do LDL
como fonte energética em maior quantidade, moléculas de HDL mais heterogêneas, o
papel vital do fígado no armazenamento de colesterol, pouca secreção de bile e no geral
melhores respostas em relação às dietas hiperlipídicas do que ratos (Fan et al. , 2017).
O fígado tem papel de secretar bile e esta por sua vez tem a função de
emulsificar lipídeos. A absorção de lipídeos e triglicerídeos é passiva, ou seja, não
consume energia. Após chegarem à corrente sanguínea, as moléculas já reduzidas em
tamanho circulam como monoglicerídeos de cadeias longas e médias, sendo sintetizados
e cobertos por uma camada lipoproteica – formando quilomícrons, que entram na
circulação linfática (Blas & Wiseman, 2010; Fan et al. , 2017).
22
O coelho é bastante suscetível a dietas ricas em lipídeos, e estas possuem
impacto não somente no sistema gastrointestinal e vascular, mas também são
responsáveis por modificações no leite gerado pelas lactantes (Blas & Wiseman, 2010;
Quesenberry & Carpenter, 2012).
3.3 DOENÇA HEPÁTICA GORDUROSA NÃO ALCOÓLICA
A doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA) é uma condição clínico-
patológica caracterizada pela infiltração e acúmulo de lipídeos no interior dos
hepatócitos com distribuição que pode ser difusa ou focal de gordura no parênquima
hepático (Augustin et al. , 2017; Ferramosca et al. , 2017; Qiu et al. , 2013). O quadro
patológico lembra a lesão induzida por álcool, mas ocorre em indivíduos sem ingestão
etílica significativa (Augustin et al. , 2017; Ferramosca et al. , 2017).
A DHGNA apresenta como principais fatores de risco a obesidade, diabetes
mellitus e dislipidemia. A resistência à insulina parece desempenhar um papel
fundamental na patogênese destas condições, e por isso tem sido sugerido que a
DHGNA (esteatose e esteato-hepatite) seja considerada como mais um critério no
diagnóstico da síndrome metabólica (Mantovani & Targher, 2017; Qiu et al. , 2013;
Tarantino & Finelli, 2013).
Devido ao fato de ser associada com diabetes, obesidade e resistência a insulina,
sua prevalência está aumentando na população de todas as faixas etárias, em especial de
países industrializados (Farrell et al., 2005; Tirosh, 2015). Estima-se que sua
prevalência aumente de forma considerável nos indivíduos portadores das condições
supracitadas (Farrell et al. , 2005).
As estimativas atuais da DHGNA giram em torno de 17% a 33% da população
mundial, e a esteatohepatite não alcoólica – uma de suas complicações mais comuns – é
prevalente em torno de 5,7% a 16,5% da população (Farrell et al. , 2005; Tirosh, 2015).
Algumas alterações contribuem para o desenvolvimento de DHGNA que estão
relacionadas à síndrome metabólica. São elas: anormalidades no metabolismo dos
lipídeos, que promove maior oferta de ácidos graxos livres no fígado; aumento da
síntese endógena de ácidos graxos, intensificação da β-oxidação mitocondrial e maior
23
liberação de ácidos graxos dos hepatócitos, que aumentam a resistência à insulina;
produção anormal de citocinas como interleucina 8 (IL-8), interleucina 6 (IL-6) e fator
de necrose tumoral alfa (TNF-α); estresse oxidativo; inibição do peroxisome proliferator
activated receptor (PPAR) e alterações no metabolismo do ferro (Cruz et al., 2005;
Kassi et al., 2011; Kaur, 2014).
O diagnóstico de pacientes com DHGNA é sugerido quando há hepatomegalia
assintomática (40% a 100% dos casos) ou associada ao desconforto epigástrico ou no
hipocôndrio direito. A histologia hepática demonstra esteatose, alterações celulares
(balonização e/ou necrose), inflamação com ou sem fibrose e corpúsculos de Mallory.
Os métodos de imagem contribuem para o reconhecimento de esteatose (Chalasani &
Szabo, 2016; Cruz et al. , 2005; Farrell et al. , 2005; Kassi et al. , 2011; Tirosh, 2015).
Várias drogas são usadas na redução do colesterol e consequentemente tratam da
DHGNA, tais como: inibidores da enzima HMG-CoA redutase, sequestradores de
colesterol, fitoesteróis, fitofármacos e os fibratos (Augustin et al. , 2017; Dongiovanni
& Valenti, 2017; Ferramosca et al. , 2017; Sanyal et al. , 2010; Younossi, 2008).
Apesar disso, ainda não existe tratamento farmacológico específico para o
controle da esteatose hepática. Portanto, todos os pacientes portadores da DHGNA são
encorajados a reduzir a ingestão de gorduras e realizar exercícios físicos regulares, com
o objetivo de aumentar o gasto energético diário (Augustin et al. , 2017; Dongiovanni &
Valenti, 2017; Musso et al., 2010).
3.4 LEUCOANTOCIANIDINA
As leucoantocianidinas pertencem à família dos polifenóis naturais pertencentes
à classe dos bioflavonoides. Sua característica marcante é a ação antioxidante
hidrossolúvel presente em sua estrutura que chega a ser mais forte que a vitamina E. Sua
ação antioxidante se deve ao fato das leucoantocianidinas eliminarem qualquer espécie
de radicais livres envolvidas no processo (Beidokhti & Jager, 2017; Belwal et al., 2017;
Lee et al., 2017).
O consumo dos flavonoides (leucoantocianidinas, proantocianidinas e
antocianidinas) vem sendo bastante estudado recentemente devido às suas propriedades
24
antioxidativas. Estudos demonstraram que os flavonoides tem o potencial de reduzir o
risco de doenças cardiovasculares, câncer, obesidade e diabetes, elementos intrínsecos
da síndrome metabólica (Fernandes et al. , 2017; Lee et al. , 2017; Mantovani &
Targher, 2017; Pizzino et al. , 2017; Shin & Jung, 2017).
Portanto, práticas como o consumo regulado de vinho e a ingesta de uvas, frutas
vermelhas e nozes vem sendo estimulado, pois tais alimentos e bebidas possuem em sua
composição os flavonoides e outras substâncias antioxidantes (Fernandes et al. , 2017;
Pizzino et al. , 2017).
Apesar do vasto conhecimento adquirido a respeito das leucoantocianidinas, os
efeitos sobre o tecido hepático não são tão claros, pois muitos resultados dependem dos
seguintes fatores: se o experimento é in vitro ou in vivo, a espécie de animal utilizado,
modelo experimental de indução a patologia, idade dos animais, origem do extrato e sua
via de administração, bem como o tempo de duração do experimento (van der Worp et
al. , 2010).
Uma revisão da literatura demonstrou que de fato os flavonoides podem reduzir
o dano realizado por diversas doenças, em destaque, a síndrome metabólica, mas, não
existem estudos que avaliaram o tecido hepático em animais com DHGNA, em
específico (Shin & Jung, 2017).
25
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 CUIDADOS BIOÉTICOS
Este projeto faz parte do protocolo de colaboração científica entre a
Universidade Federal de Alagoas (UFAL) e Universidade Federal Fluminense (Anexos
9.1 e 9.2) e foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (protocolo de pesquisa
nº011034/2007-55) da UFAL (Anexo 9.3).
Além disso, o projeto também foi aprovado em reunião do Departamento de
Morfologia da UFF. Reitera-se que este presente trabalho não necessitou de nova
aprovação pelo CEP da Instituição de Ensino Superior supracitada devido ao fato de
tratar-se de doação de material previamente aprovado (Anexo 9.4).
4.2 AMOSTRA
Foram utilizados 30 coelhos adultos e machos da raça Nova Zelândia (Oryctolagus
cuniculus). Os animais foram desmamados após 40 dias, sendo nessa época admitidos
ao experimento com peso que variou entre 1,5Kg e 1,6Kg, alimentados com ração
Socil® (Tabela 1) e água ad libitum.
Quando os animais atingiram entre 7 e 8 meses iniciou-se o experimento, apesar de
serem criados nas mesmas condições e local, em gaiolas individuais, pesavam entre
2500 e 4100 g. Estes coelhos ficaram em um biotério apropriado com a temperatura e
luz natural onde foram acompanhados por médicos veterinários antes e durante o
experimento.
26
Tabela 1 – Composição da dieta (Socil®) utilizada no presente experimento.
Produto Quantidade (%)
Proteína bruta 15%
Extrato etéreo 2,5%
Matéria fibrosa 16%
Matéria mineral 10%
Cálcio 2,%
Fósforo 0,42%
Umidade 13%
Carboidratos 31,58%
Trinta animais foram alocados em três grupos, sendo denominados de G1, G2 e
G3 com 10 animais cada grupo, sendo um coelho por gaiola. Os coelhos foram pesados
com uma balança digital de precisão Marte®, modelo AS 5000 C com carga máxima de
5kg e mínima 5g. Para evitar a mistura de animais durante as manipulações, cada animal
recebeu um número na face interna da orelha esquerda, com pincel atômico de cor preta.
A descrição dos grupos randomizados é descrita a seguir:
a) O grupo G1 (grupo controle) foi alimentado com 200g da ração Socil® que
tem a composição básica necessária ao animal: proteína bruta (15%), extrato etéreo
(2,5%), matéria fibrosa (16%), matéria mineral (10%), cálcio (2,5%), fósforo (0,42%),
umidade (13%), carboidrato (31,58%). Como os coelhos são lagomorfos, quando a
ração não tinha mais a forma de peletas, era desprezada e substituída por nova.
b) O grupo G2 foi alimentado com 200g da mesma ração do grupo controle,
juntamente com 10 mL de gema de ovo Carnaúba® grande 1,5 g de colesterol puro
(Imprextraco®). A gema de ovo, além de ser uma fonte de colesterol e outros lipídeos,
também foi utilizada como veículo para administração do colesterol que foi dissolvido e
injetado por seringa via orofaríngea (Fonseca Jr et al. , 2016). Os componentes da gema
de ovo estão descritos na Tabela 2.
c) O grupo G3 foi alimentado nas mesmas condições do grupo G2,
diferenciando apenas na administração do antioxidante - leucoantocianidina de uva
50mg/Kg conforme Segura et al. (2003).
27
A administração de colesterol e/ou gema bem como da leucoantocianidina de
uva nos animais dos grupos 2 e 3, foi realizada com sondagem orofaríngea, através de
sonda de nelaton número 18 conectada a uma seringa descartável de 10mL. A
leucoantocianidina de uva, foi administrada 2h antes da dieta aterogênica, diluída em 3
mL de água destilada. A dieta complementar foi preparada diariamente, durante 100
dias.
Para todos os grupos, foi oferecida diariamente, 200 gramas de ração e água ad
libitum, havendo sobra, a dieta era novamente complementada até 200 g.
Tabela 2 – Composição da gema de ovo (100 g) utilizada no presente experimento.
Produto Quantidade
Lipídeos totais (g/100g) 28,7 (0,3)
Colesterol (MG/100g) 997,5 (30,1)
Ácidos graxos (g/100g) -
Saturados 8,53
Monoinsaturados 10,84
Poli-insaturados 4,19
Ômega-3 0,17
Ômega-6 4,02
4.3 PREPARO E ADMINISTRAÇÃO DA DIETA HIPERLIPIDÊMICA
O preparo da dieta foi diário para evitar contaminação dos animais ou do
alimento. Antes da sondagem orofaríngea, o ovo foi lavado com hipoclorito de sódio
diluído em água e deixando-os durante 5 min imersos nessa solução. A retirada da gema
foi realizada com a ajuda de uma colher em seguida foi separada a gema da clara em um
recipiente plástico.
Utilizando uma seringa de 20 mL retirou-se 10 mL de gema que foi colocado em
um recipiente onde continha 1,5g de colesterol previamente pesado. O colesterol foi
misturado à gema com o auxilio de um bastão de vidro. A administração foi realizada
28
utilizando uma seringa de 10 mL que foi acoplada a uma sonda que foi introduzida até a
orofaringe (Figura 2).
Figura 2 – ADMINISTRAÇÃO DA GEMA DE OVO
Gema de ovo ofertada em seringa com 10 ml por via oral. Fonte: Dados da pesquisa.
A leucoantocianidina de uva foi diluída em 3 mL de água destilada e injetada
com a utilização de uma seringa de 10mL acoplada a uma sonda de nelaton número 18 e
repetindo o procedimento semelhante ao do colesterol e a gema 2h depois no grupo G3.
4.4 DOSAGEM BIOQUÍMICA
Foi realizada análise bioquímica do sangue após jejum de 12 a 14 horas em
todos os coelhos, para verificação de suas taxas de colesterol Total, HDL, VLDL, LDL,
lipídeos totais, bem como de triglicerídeos, TPG e TGO. O procedimento foi realizado 4
vezes (início do experimento, dias 33, 66 e 99) em todos os animais.
O sangue foi coletado através da punção da artéria auricular central, com seringa
de 10 mL e armazenado para análise em tubos de ensaio de 5 mL sem anticoagulante.
29
Ao fim da coleta amostras eram encaminhadas ao laboratório onde foram
centrifugadas e seguiu o procedimento operacional padrão para análise do colesterol
total e frações. Após a coleta, as amostras foram levadas ao Centro de Patologia e
Medicina Laboratorial — CPML, da Universidade Estadual de Ciências da Saúde de
Alagoas — e colocadas em um analisador automático modelo AU400e Olympus®.
4.5 EUTANÁSIA E PROCESSAMENTO HISTOLÓGICO
Ao término do experimento os coelhos foram submetidos à eutanásia (100º dia).
Para tanto, foi realizada inicialmente anestesia geral (Xilazina a 2% - Rompum® – e
Quetamina a 5% - Ketalar®), via intramuscular. Com o animal profundamente
anestesiado, foi aplicado lentamente 10 mL de cloreto de potássio 19,1%, via
endovenosa, monitorando o animal até o óbito, sendo que todo este procedimento
sempre foi acompanhado pelo veterinário responsável, respeitando a recomendação do
Conselho Federal de Medicina Veterinária, resolução nº 714 Art. 13, de 20 de junho de
2002.
Cada animal foi submetido a procedimento para a retirada de fragmentos
hepáticos; para isto foi realizada a incisão mediana toracoabdominal e cada animal foi
dissecado por planos até expor todo o fígado para a retirada dos fragmentos que foram
lavados em soro fisiológico 0,9% e fixados com formalina a 10% (tamponada).
Os espécimes foram submersos em solução de formaldeído a 10% e enviados
ao Laboratório de Morfologia Experimental (LAMEx) da UFF os quais foram
processados em rotina histológica para microscopia de luz e corados com Hematoxilina
e Eosina, Tricrômico de Masson e Fucsina-Resorcina de Weigert para microscopia de
luz (Bancroft & Cook, 1994).
Após a obtenção dos fragmentos, esses sofreram a clivagem "ortrip"
(Mandarim-de-Lacerda, 2003) para a realização da estereologia. Esse método consiste
de seccões ortogonais dos fragmentos, três vezes consecutivamente, sendo o primeiro
corte aleatório, o segundo ortogonal ao primeiro e o terceiro também ortogonal ao
segundo. Desta forma, obtêm-se cortes aleatórios uniformemente isotrópicos.
30
4.6 ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA E ESTEREOLÓGICA
Para a análise histopatológica e estereológica, as amostras foram posteriormente
desidratadas em soluções crescentes de álcoois, iniciando com 70% até o álcool
absoluto, clarificadas em xilol e incluídas em parafina. Os cortes de 5 μm de espessura
das amostras coletadas foram corados inicialmente com hematoxilina-eosina para
exclusão do material apresentando artefatos de fixação e ou processamento (Behmer et
al., 1975).
De cada fígado foram retirados 5 fragmentos, que originaram 5 cortes diferentes
de 5 μm de espessura. De cada corte foram analisados 5 campos aleatórios, perfazendo
um total de 25 áreas teste analisadas em cada fragmento hepático.
Utilizou-se a técnica de Tricrômio de Masson onde os cortes selecionados foram
corados para evidenciar o tecido conjuntivo, que se cora em azul em contraste marcante
com as fibras musculares lisas e demais células sanguíneas, coradas em tons de
vermelho, devido ao chromotrope 2R presente na solução (Bancroft & Cook, 1994;
Behmer et al. , 1975). A coloração de Hematoxilina e Eosina também foi utilizada com
o propósito de ter uma visão melhor do tecido adiposo.
As imagens para análise e quantificação bidimensional foram obtidas em
aumento de 400X, em microscópio óptico Olympus acoplado a uma câmera de vídeo
Sony CCD, sendo a imagem dos campos microscópicos transferida para um monitor.
Para a análise histopatológica, foi utilizada a coloração de Hematoxilina e
Eosina e as lâminas foram sujeitas à análise por dois patologistas não envolvidos no
estudo. O escore de EHNA mundialmente consagrado foi utilizado para avaliar a
gravidade e extensão da DHGNA nos animais (Kleiner et al., 2005). O escore está
presente no Anexo 9.6.
Os dados foram obtidos pelo método de contagem de pontos superpondo um
sistema teste M 42 sobre a tela do monitor (Weibel et al., 1966). As características
básicas do sistema-teste são Ap (área do ponto-teste), Pt (número de pontos-teste) e d (a
menor distância entre pontos-teste). A área-teste pode ser conhecida multiplicando-se o
número de pontos-teste pela área de um ponto-teste (Mandarim-de-Lacerda, 1998;
Mandarim-de-Lacerda, 2003; Weibel et al. , 1966). O sistema-teste M42 de Weibel et
31
al. (1966) apresenta 42 pontos-teste (Figura 3), a linha-teste mede 21d e a área-teste
mede: 423
2. .d²
Figura 3 – SISTEMA-TESTE M42
As estruturas que tocam as linhas proibidas (tracejadas) não são contadas. As linhas curtas (d) calibram
esse sistema-teste e suas extremidades são consideradas os pontos-teste (PP) (Mandarim-de-Lacerda,
1998; Mandarim-de-Lacerda, 2003). Fonte: Weibel et al. (1966).
4.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados foram analisados através da estatística descritiva usando como
ferramenta software IBM SPSS (versão 21). Os dados desta análise foram expressos em
média e desvio padrão (SD). Primeiramente foi feito o teste de normalidade em cada
grupo (G1, G2 e G3), para verificar se os dados seguem ou não a distribuição normal.
Para comparações entre os grupos (G1, G2 e G3) foi usado o ANOVA one-way e o pós-
teste de TUKEY para os dados que seguem a distribuição normal. Para os resultados
que não seguem a distribuição normal foi utilizado o teste de KRUSKAL-WALLIS e o
pós-teste DUNNS. Para a avaliação do escore de EHNA, foi utilizado o teste qui-
quadrado. O valor de p < 0,05 foi considerado significativo para os testes estatísticos.
32
5 RESULTADOS
Para melhor análise dos efeitos da leucoantocianidina de uva serão apresentados
inicialmente os resultados da adaptação à dieta de todos os grupos, a saber: alterações
patológicas na pele, resultados dos exames bioquímicos e o peso dos animais, assim
como as alterações hepáticas no tecido macroscópico e microscópico e por fim,
alterações encontradas na avaliação estereológica do tecido.
5.1 ALTERAÇÕES PATOLÓGICAS NA PELE
Durante a necropsia foram observados sinais de hiperlipidemia, como o acúmulo
de gordura subcutânea (xantomas). Estes possuíam comprimentos superiores a 2 cm
(Figura 4).
Figura 4 – XANTOMA
Acúmulo de gordura subcutânea (xantoma) na face interna da pata direita (seta) (Grupo G2 – Ração: 1,5g
de colesterol e 10mL de gema). Fonte: Dados da pesquisa.
Os xantomas foram encontrados em maior tamanho e quantidade nos G2.
Somente três animais do G3 tiveram xantomas,e estes eram menores que 2 cm. Após a
análise macroscópica de todos os animais, os xantomas foram removidos e levados para
33
o laboratório de histologia, onde foram preparados por procedimentos de rotina. O
aspecto microscópico dos xantomas pode ser observado na Figura 5.
Figura 5 – ASPECTO MICROSCÓPICO DO XANTOMA
Fotomicrografia do xantoma corado com Hematoxilina e Eosina (10 X). Podem ser observados
macrófagos espumosos e acúmulo de lipídeos na derme. Xantoma pertencente a um coelho do Grupo
G2 (Ração,1,5g de colesterol e 10mL de gema). Fonte: Dados da pesquisa.
5.2 VALORES BIOQUÍMICOS E PESO DOS ANIMAIS
5.2.1 Peso dos animais
A média do peso dos animais no início do experimento para os grupos foi de
3,4341kg (±0,4093) para o G1, 3,0591kg (±0,3985) para o G2 e 3,3263kg (±0,51281)
para o G3. Observou-se a diminuição do peso dos animais dos grupos G1 e G3 nos
primeiros 33 dias de experimento e aumento de peso dos animais do grupo G2 nos
primeiros 33 dias, no entanto, não houve diferença estatisticamente significativa no peso
dos animais durante todo experimento (p > 0,05), conforme demonstrado no Gráfico 1
sobre a evolução de peso.
34
Gráfico 1 – EVOLUÇÃO DO PESO DOS ANIMAIS DURANTE O
EXPERIMENTO
0 50 100 1502.5
3.0
3.5
4.0G1
G2
G3
DIAS
PE
SO
(K
g)
Representação de evolução do peso dos animais durante o experimento dos grupos: G1, G2 e G3, durante
os 100 dias de experimento. Observa-se que não houve diferença significante entre os pesos dos animais
em todos os tempos do experimento, p = 0,7895. Fonte: Dados da pesquisa.
5.2.2 Colesterol Total
Ao analisar os níveis de colesterol total (CT) dos coelhos do grupo G1, G2 e G3
no dia zero (D0) verificou-se que não houve diferença significante entre os grupos (p >
0,05). Nos dias zero, 33, 66 e 99 observou-se que os níveis do CT do grupo G1
permaneceram normais, já nos grupos G2 e G3 houve aumento significante conforme
demonstram o Gráfico 2 e a Tabela 3.
35
Gráfico 2 – EVOLUÇÃO DAS TAXAS DE COLESTEROL TOTAL DOS
ANIMAIS DURANTE O EXPERIMENTO
Gráfico da evolução do nível de colesterol total dos animais (G1, G2, G3) durante o experimento Fonte:
Dados da pesquisa.
Tabela 3 – Média e desvio padrão do CT, conforme o dia e grupo experimental.
Variável G1 G2 G3
Média SD± Média Desvio
Padrão
Média Desvio
Padrão
CT (dia zero) 54,86 29,58 40,93 9,84 38,46 20,95
CT(dia 33) 38,32 17,19 897,30* 32,97 926,10* 44,44
CT(dia 66) 44,86 19,04 917,20* 39,67 899,60* 46,80
CT(dia 99) 32,80 21,08 892,07* 37,85 910,61* 32,42 *Houve significância em relação ao grupo controle (G1). Fonte: Dados da pesquisa.
No início do experimento (D0), a comparação entre os grupos G1, G2 e G3 não
gerou diferenças estatisticamente significativas (p = 0,1645). No dia 33, a comparação
entre os grupos G2 e G3 apresentou resultado significante quando comparados com o
grupo G1 (p < 0,05).
36
Entre os grupos G2 e G3 o resultado foi não significante no restante do
experimento (p > 0,05). No dia 66, a comparação entre os grupos, G1 e G2 apresentou
resultado significante (p < 0,05).
Entre os grupos G2 e G3 o resultado foi não significante (p > 0,05). Em todas as
comparações anteriores foi utilizado o teste de KRUSKAL-WALLIS e o pós-teste
DUNNS. No dia 99, a comparação entre os grupos, G1 comparados com o G2 e G3
apresentou resultado estatisticamente significante (p < 0,05).
Entre os grupos G2 e G3 o resultado foi não significante (p > 0,05). Em todas as
comparações do dia 99 foi utilizado o teste ANOVA one-way e o pós-teste de TUKEY.
5.2.3 Colesterol LDL (lipoproteína de baixa densidade)
Ao analisar os níveis do LDL, dos três grupos no dia (zero) observou-se que não
houve diferença significante (p > 0,05) entre os grupos G1, G2 e G3, durante os dias
zero, 33, 66 e 99 do experimento. Os níveis plasmáticos do LDL do grupo G1 se
mantiverem sem alterações significantes.
No início do experimento (dia zero), a comparação entre os grupos G1, G2 e G3,
não houve diferença significante (p > 0,05). No dia 33, a comparação entre os grupos,
G1 comparados com o, G2 e G3 apresentou resultado significante (p < 0,05).
Entre os grupos G2 e G3 o resultado foi não significativo, e em todas as
comparações (dia zero e 33) foi utilizado o teste de KRUSKAL-WALLIS e o pós-teste
DUNNS. No dia 66, a comparação entre os grupos, G1 comparados com o, G2 e G3
apresentaram resultado significante (p < 0,05).
Entre os grupos G2 e G3 o resultado foi não significante. Em todas as
comparações foi utilizado o teste ANOVA one-way e o pós-teste de TUKEY. No dia
99, a comparação entre os grupos, G1 comparados com o, G2 e G3 apresentaram
resultado significante (p > 0,05). Entre os grupos G2 e G3 o resultado foi não
significante e em todas as comparações foi utilizado o teste de KRUSKAL-WALLIS e o
pós-teste DUNNS.
Esses resultados estão representados no Gráfico 3 e na Tabela 4.
37
Gráfico 3 – EVOLUÇÃO DAS TAXAS DE LDL DOS ANIMAIS
DURANTE O EXPERIMENTO
Gráfico representando a evolução do nível de LDL dos animais (G1 , G2 e G3) durante o experimento
Fonte: Dados da pesquisa.
Tabela 4 – Média e desvio padrão do LDL, conforme o dia e grupo.
Variável G1 G2 G3
Média Desvio
Padrão
Média Desvio
Padrão
Média Desvio
Padrão
LDL (dia zero) 14,50 19,22 6,22 4,77 12,41 9,23
LDL (dia 33) 6,73 5,56 826,50* 51,17 866,70* 48,352
LDL (dia 66) 14,47 9,82 845,03* 44,98 848,84* 58,34
LDL (dia 99) 17,10 11,39 809,29* 78,67 844,01* 36,91 *Houve significância em relação ao grupo controle (G1). Fonte: Dados da pesquisa.
38
5.2.4 Colesterol VLDL (lipoproteína de muito baixa densidade)
A análise dos níveis do VLDL, no dia (zero) demonstrou que não houve
diferença significante entre os grupos, permaneceu sem alterações significantes no dia
33 (p > 0,05). Nos dias 66 e 99 houve aumento dos níveis plasmáticos dos grupos G2 e
G3 em relação ao grupo G1, e a diferença não foi significante entre si (p > 0,05).
No dia 33, entre os grupos G1, comparado com os grupos G2 e G3 houve
diferença significante (p < 0,05), no entanto, comparando os grupos G2 e G3,
observamos não houve diferença significativa. Em todas as comparações foi utilizado o
teste de KRUSKAL-WALLIS e o pós-teste DUNNS.
No dia 66, a comparação entre os grupos G1 e G2 demonstrou diferença
significativa (p < 0,05), no entanto, comparando os grupos G1 e G3, G2 e G3 o
resultado foi não significante (p > 0,05). Em todas as comparações foi utilizado o teste
ANOVA one-way e o pós-teste de TUKEY.
No dia 99, o resultado da comparação entre os grupos G1 e G2, G1 e G3 foi
significante (p < 0,05), no entanto, comparando os grupos G2 e G3 não houve diferença
significante (p > 0,05). Em todas as comparações foi utilizado o teste de KRUSKAL-
WALLIS e o pós-teste DUNNS.
Os dados referentes a essa análise podem ser conferidos no Gráfico 4 e na
Tabela 5.
39
Gráfico 4 – EVOLUÇÃO DAS TAXAS DE VLDL DOS ANIMAIS
DURANTE O EXPERIMENTO
Gráfico representando a evolução do nível de VLDL dos animais (G1 , G2 e G3) durante o experimento
Fonte: Dados da pesquisa.
Tabela 5 – Média e desvio padrão do VLDL, conforme o dia e grupo.
Variável G1 G2 G3
Média Desvio
Padrão
Média Desvio
Padrão
Média Desvio
Padrão
VLDL (dia zero) 16,01 6,29 12,09 5,51 15,70 10,58
VLDL (dia 33) 13,73 5,20 42,09 17,65 35,07* 20,16
VLDL (dia 66) 14,27 4,47 47,69 20,95 33,73 19,17
VLDL (dia 99) 13,34 5,87 67,17 69,63 38,02* 16,72 *Houve significância em relação ao grupo controle (G1). Fonte: Dados da pesquisa.
40
5.2.5 Colesterol HDL (lipoproteína de alta densidade)
Observou-se que no início do experimento (dia zero), a comparação dos
resultados entre os grupos G1, G2 e G3 não significante (p > 0,05). No dia 33, a
comparação entre os grupos G1 e G2, G1 e G3, G2 e G3 não foi significativa (p > 0,05).
Viu-se que no dia 66, a comparação entre os grupos G1 e G2, G1 e G3, G2 e G3 não foi
significante (p > 0,05). Em todas as comparações (nos dias zero, 33 e 66) foi utilizado o
teste de KRUSKAL-WALLIS e o pós-teste DUNNS.
No dia 99, a comparação entre os grupos G1 e G2, G1 e G3, G2 e G3 o resultado
foi não significante (p > 0,05). Foi utilizado o teste ANOVA one-way e o pós-teste de
TUKEY nesta comparação.
Os dados estão representados no Gráfico 5 e na Tabela 6.
Gráfico 5 – EVOLUÇÃO DAS TAXAS DE HDL DOS ANIMAIS DURANTE O
EXPERIMENTO
Gráfico representando a evolução do nível de HDL dos animais (G1, G2, G3) durante o experimento
Fonte: Dados da pesquisa.
41
Tabela 6 – Média e desvio padrão do HDL, conforme o dia e grupo.
Variável G1 G2 G3
Média Desvio
Padrão
Média Desvio
Padrão
Média Desvio
Padrão
HDL (dia zero) 20,84 8,17 30,41 6,68 26,50 11,24
HDL (dia 33) 27,90 12,48 28,70 12,31 24,38 7,61
HDL (dia 66) 25,04 8,29 24,50 7,96 17,06 7,51
HDL (dia 99) 21,26 9,09 15,63 5,34 16,82 4,24 *Houve significância em relação ao grupo controle (G1). Fonte: Dados da pesquisa.
5.2.6 Evolução do LDL e HDL
Ao analisar os níveis do LDL e HDL, no dia zero pode-se observar que não
houve diferença significante entre os três grupos (p > 0,05). No dia 33 houve um
aumento do LDL com média de 826,50mg/dL para o grupo G2 e 866,70 mg/dL para o
grupo G3, não obtendo diferença significante (p > 0,05).
As taxas de HDL não tiveram diferenças significativas entre os grupos durante
todo experimento (p > 0,05). No entanto, no dia 66 até o término do experimento os
níveis de HDL do grupo G3 deixaram de diminuir e se estabilizaram.
Esses resultados podem ser observados no Gráfico 6.
Gráfico 6 – EVOLUÇÃO DAS TAXAS DE HDL E LDL DOS ANIMAIS
DURANTE O EXPERIMENTO
Gráfico representando a evolução do nível de LDL e HDL dos animais (G1, G2, G3) durante o
experimento Fonte: Dados da pesquisa.
42
5.2.7 Triglicerídeos
Observa-se que no inicio do experimento (dia zero), o resultado da comparação
entre os grupos G1 e G2, G1 e G3, G2 e G3 não foi significante (p > 0,05). No dia 33, a
comparação entre os grupos G1 e G2, G1 e G3, o resultado foi significante (p < 0.05),
no entanto, comparando os grupos G2 com G3 não houve diferença significante (p >
0,05). Em todas as comparações (nos dias: zero e 33) foi utilizado o teste de
KRUSKAL-WALLIS e o pós-teste DUNNS.
Viu-se que no dia 66, a comparação entre os grupos G1 e G2 houve diferença
significante (p < 0,05), no entanto, comparando os grupos G1 com G3 e G2 com G3 não
houve diferença significante em todas as comparações (p > 0,05). Observa-se que no dia
99, a comparação entre os grupos G1 e G2, G1 e G3, G2 e G3 o resultado não foi
significante (p > 0,05), porém, pudemos verificar que os coelhos pertencentes ao G3
obtiveram valores nas taxas de triglicerídeos mais próximos ao grupo controle. Em
todas as comparações (nos dias 66 e 99) foi utilizado o teste ANOVA one-way e o pós-
teste de TUKEY.
Esses dados estão representados no Gráfico 7 e Tabela 7.
43
Gráfico 7 – EVOLUÇÃO DAS TAXAS DE TRIGLICERÍDEOS DOS ANIMAIS
DURANTE O EXPERIMENTO
Gráfico representando a evolução do nível de triglicerídeos dos animais (G1, G2, G3) durante o
experimento Fonte: Dados da pesquisa.
Tabela 7 – Média e desvio padrão do nível de triglicerídeos (TGC), conforme o dia e
grupo.
Variável G1 G2 G3
Média Desvio
Padrão
Média Desvio
Padrão
Média Desvio
Padrão
TGC (dia zero) 73,74 31,09 98,96 88,22 78,52 52,93
TGC (dia 33) 68,67 26,01 210,36 88,21 175,31* 100,86
TGC (dia 66) 69,69 20,66 238,41 104,70 168,63 95,81
TGC (dia 99) 62,36 17,95 335,68 347,85 179,68 87,97 *Houve significância em relação ao grupo controle (G1). Fonte: Dados da pesquisa.
5.2.8 Lipídeos totais
No início do experimento (dia zero), a comparação dos resultados entre os grupos
G1, G2 e G3 demonstrou que não houve diferença significativa (p > 0,05). Evidenciou-
44
se que no dia 33, houve diferença significante na comparação dos resultados entre os
grupos G1 e G2, e G1 e G3 (p < 0,05), no entanto comparando os grupos G2 com o G3
não houve diferença significante (p > 0,05). No dia 66, houve diferença significativa na
comparação dos resultados entre os grupos G1 e G2, e G1 e G3 (p < 0,05), no entanto
comparando os grupos G2 com o G3 não houve diferença significante (p > 0,05).
Em todas as comparações (nos dias zero, 33 e 66) foi utilizado o teste ANOVA one-
way e o pós-teste de TUKEY.
Observou-se que a diferença entre os grupos G1 com G2 e G1 com G3 no dia 99
foi significativa (p < 0,05), porém, comparando os grupos G2 com o G3 não houve
diferença significante (p > 0,05). Em todas as comparações foi utilizado o teste de
KRUSKAL-WALLIS e o pós-teste DUNNS.
Tais dados encontram-se resumidos no Gráfico 8 e Tabela 8.
Gráfico 8 – EVOLUÇÃO DAS TAXAS DE LIPÍDEOS TOTAIS DOS ANIMAIS
DURANTE O EXPERIMENTO
Gráfico representando a evolução do nível de lipídeos totais dos animais (G1, G2, G3) durante o
experimento Fonte: Dados da pesquisa.
45
Tabela 8 – Média e desvio padrão do nível de lipídeos totais (LPT), conforme o dia e
grupo.
Variável G1 G2 G3
Média Desvio
Padrão
Média Desvio
Padrão
Média Desvio
Padrão
LPT (dia zero) 419,51 39,47 389,39 26,38 403,99 53,017
LPT (dia 33) 394,00 27,52 1394,50* 64,24 1388,40* 106,75
LPT (dia 66) 404,48 24,25 1442,60* 117,83 1355,30* 71,77
LPT (dia 99) 384,11 13,96 1514,90* 353,18 1378,30* 90,745 *Houve significância em relação ao grupo controle (G1). Fonte: Dados da pesquisa.
5.2.9 TGP e TGO
Observa-se que no inicio do experimento (dia zero), o resultado da comparação dos
níveis de TGP e TGO não foi estatisticamente significativo (p > 0,05).
Observou-se que a diferença dos níveis de TGO entre os grupos G1 com G2 e
G1 com G3 no dia 99 foi significativa (p < 0,05), assim como a diferença entre o G2 e
os animais do G3 (p < 0,05). Em todas as comparações foi utilizado o teste de
KRUSKAL-WALLIS e o pós-teste DUNNS.
Tais dados encontram-se resumidos no Gráfico 9 e Tabela 9.
46
Gráfico 9 – EVOLUÇÃO DAS TAXAS DE TGP E TGO DOS ANIMAIS
DURANTE O EXPERIMENTO
Gráfico representando a evolução do nível de TGO e TGP dos animais (G1, G2, G3) durante o
experimento Fonte: Dados da pesquisa.
Tabela 9 – Média e desvio padrão do nível de TGP e TGO (mg/dL), conforme o dia e
grupo.
TGP G1 G2 G3 Valor de p
Média Desvio
Padrão
Média Desvio
Padrão
Média Desvio
Padrão > 0,05
Dia 0 41,22 9,15 59,50 8,55 46,96 8,23
Dia 99 30,98 3,91 51,74 10,58 55,70 18,71
TGO G1 G2 G3 Valor de p
Média Desvio
Padrão
Média Desvio
Padrão
Média Desvio
Padrão < 0,05
Dia 0 21,53 8,90 30,54 12,52 18,36 8,72
Dia 99 4,51 1,69 32,68* 8,56 22,36* 9,7 *Houve significância em relação ao grupo controle (G1). Fonte: Dados da pesquisa.
47
5.3 AVALIAÇÃO HISTOPATOLÓGICA E ESTEREOLÓGICA
Não foram encontradas alterações hepáticas macroscópicas e microscópicas nos
animais do grupo controle, conforme Figura 6 e Figura 7.
Figura 6 – ASPECTO MACROSCÓPICO DO FÍGADO DOS COELHOS DO
GRUPO 1
Fotomacrografia de Fígado de um coelho normal (ausência de esteatose) (G1 – Grupo Controle).
Macroscopicamente bem perfundido e sem sinais de esteatose. Fonte: Dados da pesquisa.
48
Figura 7 – ASPECTO MICROSCÓPICO DO FÍGADO DOS COELHOS DO
GRUPO 1 (MASSON)
Fotomicrografia de Fígado de um coelho normal (ausência de esteatose). Tecido hepático denso rico em
sinusóides onde observa-se hepatócito normal (delineados em cor amarelo). Tricrômio de Masson (40X)
(G1 – Grupo Controle). Fonte: Dados da pesquisa.
Os coelhos do G2 adaptaram-se bem à dieta administrada. O experimento foi
iniciado com 10 animais nesse grupo, porém, durante o experimento ocorreram 3 óbitos
(acidente vascular encefálico, infarto agudo do miocárdio e esteatose hepática como
causas). Os óbitos ocorreram no 45º, 60º e 92º dias. O fígado dos demais animais
apresentavam alterações macroscópicas (Figura 8) e microscópicas (Figura 9).
49
Figura 8 – ASPECTO MACROSCÓPICO DO FÍGADO DOS COELHOS DO
GRUPO 2
Fotomacrografia de Fígado de coelho com esteatose hepática não alcoólica (G2). Observa-se aspecto
macroscópico mais amarelado-esbranquiçado devido ao acúmulo de gordura. Fonte: Dados da pesquisa.
50
Figura 9 – ASPECTO MICROSCÓPICO DO FÍGADO DOS COELHOS DO
GRUPO 2 (MASSON)
Fotomicrografia de Fígado de um coelho com esteatose hepática. Tecido hepático desorganizado, pouco
perfundido e com hepatócito aumentado (delineado em cor amarela) e morte celular (delineado em cor
vermelha). Tricrômio de Masson (40X) (G2). Fonte: Dados da pesquisa.
Os coelhos do G3 se adaptaram bem à dieta. O experimento foi iniciado com 10
animais, porém, também ocorreram 3 óbitos durante o estudo (dias 72, 86 e 95, todos
com sinais de acidente vascular encefálico).
Esteatose hepática moderada (com microvilosidades) foi observada na análise
macroscópica nos coelhos que vieram a óbito, assim como nos outros 7 animais do
grupo. Nestes grupos, as fezes apresentaram tonalidade escura. As alterações
macroscópicas (Figura 10) e microscópicas (Figura 11) podem ser observadas à seguir.
51
Figura 10 – ASPECTO MACROSCÓPICO DO FÍGADO DOS COELHOS DO
GRUPO 3
Fotomacrografia de Fígado de coelho com esteatose hepática não alcoólica tratado com
leucoantocianidina (G3). Observa-se provável proteção na perfusão sanguínea de capilares difusamente.
Fonte: Dados da pesquisa.
52
Figura 11 – ASPECTO MICROSCÓPICO DO FÍGADO DOS COELHOS DO
GRUPO 3 (MASSON)
Fotomicrografia de Fígado de um coelho com esteatose hepática microvesicular tratado com
leucoantocianidina. Tecido hepático moderadamente organizado com presença de vários sinusóides,
hepatócito balonizado (seta). Observamos delineados (cor vermelha), hepátocitos morfologicamente
íntegros. Tricrômio de Masson (40X) (G3). Fonte: Dados da pesquisa.
A densidade volumétrica (Vv%) dos hepatócitos nos grupos G1, G2 e G3 foram
respectivamente: 78,4±8,3; 72,4±10 e 25,5±6,4 (p < 0,05) (Tabela 10). Ao analisar o
tecido esteatótico, verificamos que a Vv nos grupos G1,G2 e G3 foram respectivamente:
1,5±2,6; 72,8± e 19,5±5,7 (p < 0,05) (Tabela 10). Logo, foi observado que a Vv de
tecido hepático saudável foi inversamente proporcional a medida que a esteatose se
instalava nos coelhos do G2 e G3.
53
Tabela 10 – Média e desvio padrão da densidade volumétrica no tecido hepático em
G1, G2 e G3.
Variável G1 G2 G3 p
Vv Hepatócitos 78,4±8,3 7,2±10 25,5±6.4 < 0,05*
Vv Esteatose 1,5±2,6 72,8±17,1 19,5±5.7 < 0,05*
*Teste de Kruskal-Wallis e DUNN. P < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
Fonte: Dados da pesquisa.
Os hepatócitos dos coelhos do G2 sofreram diminuição estatisticamente
significativa (p < 0,05) de 90.8% em relação ao G1, enquanto que o G3 apresentou
redução de 32,5%. A proporção inversa (aumento de tecido esteatótico e diminuição do
tecido hepático saudável) também foi estatisticamente significativa (Gráficos 10 e 11).
Gráfico 10 – DENSIDADE VOLUMÉTRICA DOS HEPATÓCITOS
Demonstração gráfica comparativa do percentual de densidade volumétrica (Vv%) dos hepatócitos entre
os grupos analisados (G1, G2 e G3). Fonte: Dados da pesquisa.
54
Gráfico 11 – DENSIDADE VOLUMÉTRICA DA ESTEATOSE HEPÁTICA
Demonstração gráfica comparativa do percentual de densidade volumétrica (Vv%) da esteatose hepática
entre os grupos analisados (G1, G2 e G3). Fonte: Dados da pesquisa.
No que tange a avaliação pelo escore de EHNA, o escore médio do grupo 1 foi
0, o escore médio do G2 foi 6 (Esteatose = 3, Inflamação = 2 e Balonização de
hepatócito = 1) e 4 (Esteatose = 2, Inflamação = 1 e Balonização de hepatócito = 1) para
o G3 (p < 0.05) (Figuras 12, 13 e 14).
55
Figura 12 – ASPECTO MICROSCÓPICO DO FÍGADO DOS COELHOS DO
GRUPO 1 (H&E).
Fotomicrografia de Fígado de um coelho do G1. Algumas concentrações de gordura podem ser
observadas (seta preta), mas, estas não caracterizam EHNA (<5%). Hematoxilina/Eosina (100X). Fonte:
Dados da pesquisa.
56
Figura 13 – ASPECTO MICROSCÓPICO DO FÍGADO DOS COELHOS DO
GRUPO 2 (H&E).
Fotomicrografia de Fígado de um coelho do G2. Mudanças degenerativas podem ser observadas, assim
como esteatose macro e microvesicular (setas pretas) afetando aproximadamente 70% da superfície.
Balonização de hepatócitos pode ser observada nas setas brancas. Hematoxilina/Eosina (100X). Fonte:
Dados da pesquisa.
57
Figura 14 – ASPECTO MICROSCÓPICO DO FÍGADO DOS COELHOS DO
GRUPO 3 (H&E).
Fotomicrografia de Fígado de um coelho do G3. Estes coelhos apresentaram uma redução do foco de
esteatose (setas pretas) e menor quantidade de balonização de hepatócitos (setas brancas) em relação ao
G2. Hematoxilina/Eosina (100X). Fonte: Dados da pesquisa.
58
6 DISCUSSÃO
Como visto anteriormente, os coelhos são modelos animais mais adequados para
o estudo de doenças relacionadas ao metabolismo de lipídeos, visto maior similaridade
em sua digestão e armazenamento com o metabolismo humano (Fan et al. , 2017)
Sendo assim, pesquisadores utilizaram coelhos adultos nos experimentos com
dieta rica em colesterol, gema de ovo e banha, e assim desenvolveram o processo da
arteriosclerose em coelhos (Dornas et al., 2010; Fonseca Jr et al. , 2016; Jaldin et al.,
2006).
No início de administração de uma dieta aterogênica rica em colesterol e gordura
saturada, os níveis das lipoproteínas aumentam em curto prazo (Giroldo et al., 2007;
Kolankiewicz et al., 2008; Saez Lancellotti et al., 2010; Wagar et al., 2010).
Estas informações coincidem com as observadas em nossos resultados, onde a
dieta hiperlipidêmica elevou os níveis das lipoproteínas que atingiu nível superior a 800
mg/dL.
Segundo Ramalho et al. (2007) a concentração do colesterol em ovos de galinha
é de 956 mg/100g, por ter um alto teor de lipídios o ovo é considerado importante para o
desenvolvimento das dislipidemias e arteriosclerose, além do aumento significativo na
concentração de colesterol plasmático.
No presente experimento o colesterol contido na gema de ovo foi de
997,5mg/100g (realizado por cromatografia – HPLC High Performance / Pressure
Liquide Chromatography).
Essas evidências são fidedignas, indicando a importância do tipo de gordura em
relação ao risco das dislipidemias, síndrome metabólica com consequências hepáticas e
cardiovasculares, comprovando que a dieta rica em colesterol e gordura saturada tem
graves consequências para a saúde.
No presente trabalho utilizamos a mesma dosagem que Segura et al. (2003), de
50mg/Kg de proantocianidinas oligoméricas que são capazes de reduzir a oxidação da
LDL e aumentar o HDL, sendo a dosagem reajustada a cada 33 dias, sendo usado o pó
liofilizado (processo de desidratação) de leucoantocianidina de uva.
59
Em experimento em coelhos Nova Zelândia realizado por Teixeira Damasceno
et al. (2007) utilizaram 7,3mg/Kg/dia de isoflavona da soja e mostraram efeitos
hipolipemiantes e de diminuição da subfração pró-inflamatória de LDL no plasma
sanguíneo dos animais.
Já por sua vez, outros autores verificaram a influência da antocianina extraída do
arroz preto na arteriosclerose em ratas (300mg/Kg/dia), tendo êxito na melhora do perfil
lipídico, diminuindo os triglicerídeos, colesterol total e aumentando o HDL (Xia et al.,
2006).
O possível motivo do sucesso do experimento deve-se ao uso do extrato bruto e
não purificado, já que algumas vezes o extrato bruto possui um efeito terapêutico mais
significativo em virtude da soma de todas as substâncias encontradas no presente extrato
(Xia et al. , 2006).
Em nosso experimento não houve melhora estatisticamente significante na
redução do colesterol total, LDL, lipídeos totais, triglicerídeos.
Meyer et al. (1997) relata que as atividades antioxidantes dos extratos fenólicos
de 14 diferentes tipos de uvas frescas foram investigadas através da verificação da
inibição da lipoproteína de baixa densidade (LDL) in vitro.
No entanto, segundo van der Worp et al. (2010) nem sempre experimentos
realizados com resultados positivos in vitro tem o mesmo resultado in vivo e também
nem sempre experimentos in vitro possuem o mesmo grau de reprodutibilidade de
forma plena in vivo.
Finné Nielsen et al. (2005) realizaram um estudo utilizando uma substância
purificada de fração de antocianinas de groselha preta em coelhos.
Neste estudo o extrato purificado aumentou significativamente o colesterol
plasmático e LDL, mas reduziu o VLDL de forma significante.
No presente experimento não houve diferença significante comparando o grupo
tratado com leucoantocianidina de uva e o grupo 2 (1,5g de colesterol e 10mL de gema
de ovo).
Apesar das diferenças estatisticamente significativas do peso corporal e do perfil
lipídico entre o G2 e o G3, os animais do grupo tratados com leucoantocianidina (G3)
tiveram um peso corporal e taxas de colesterol total, triglicerídeos e VLDL diminuídas.
60
Isso pode ter sido resultado dos efeitos anti-obesogênicos da leucoantocianidina,
previamente descrito na literatura (Kuang et al., 2017; Martel et al., 2017)
Em contraste, alguns estudos observaram de fato diferenças estatisticamente
significativas no perfil lipídico de coelhos tratados com flavonoides (baicalina e
escutelarina) em comparação com o grupo hipercolesterolêmico (Zhang et al., 2018;
Zhang et al., 2018).
Em adição, os valores de TGP não tiveram diferença estatisticamente
significante, mas, em relação aos valores séricos de TGO estas diferenças foram
significativas (p < 0,05), o que pode indicar um efeito protetor da leucoantocianidina
nessa enzima, considerada um marcador para doenças hepáticas.
Em contrapartida, o estudo realizado por Zhang et al. (2018) demonstrou
diferenças significativas em ambos marcadores.
Porém, estes estudos (Zhang et al. , 2018; Zhang et al. , 2018) foram realizados
em animais (camundongos) com doses diferentes de flavonoides diferentes, aliados ao
fato de que os animais foram induzidos a um estado de hipercolesterolemia com a
utilização de dietas diferentes e estes estudos supracitados tiveram duração menor do
que a do presente trabalho.
Tais divergências metodológicas dificultam comparação dos resultados entre
diferentes estudos (van der Worp et al. , 2010).
Em relação ao escore de atividade da EHNA, houve redução de 6 para 4 no
grupo tratado em relação ao grupo hipercolesterolêmico. Porém, houve somente redução
significativa da esteatose, e redução não significativa da inflamação.
O estudo realizado por Zhang et al. (2018) demonstrou que a baicalina também
reduziu o escore.
No que se refere a análise estereológica, observou-se, no presente estudo,
redução significativa de 54,5% na densidade volumétrica (Vv%) dos hepatócitos em
resposta à ingestão de 10mL de gema de ovo associado a 1,5g de colesterol puro na
ração (G2), quando comparado com o grupo controle (G1).
Proporcionalmente a redução de hepatócitos, observamos nesse mesmo grupo
(G2), uma remodelação e aumento quantitativo significativo de esteatose
macrovesicular (p < 0,05) em relação ao grupo controle.
61
No grupo que recebeu gema de ovo e foi simultaneamente tratado com a
leucoantocianidina de uva 50mg/Kg (G3), observamos recuperação do tecido hepático
de 12.1%.
Isso nos leva a crer que a leucoantocianidina de uva apresenta um efeito protetor
dos hepatócitos na DHGNA, uma vez que os animais consumiam gema de ovo
associado a ingestão de leucoantocianidina de uva.
A leucoantocianidina possui três vezes mais benefícios do que a Vitamina E
(Fernandes et al. , 2017; Pizzino et al. , 2017; Tangney & Rasmussen, 2013) –
substância utilizada sem sucesso significativo para tratar a EHNA (Machado et al. ,
2016; Sanyal et al. , 2010).
Essa proporção deve-se ao fato de que a leucoantocianidina é um antioxidante,
além de possuir ações imunomodulatórias, vasodilatativas e propriedades anti-
inflamatórias (Fernandes et al. , 2017; Pizzino et al. , 2017; Tangney & Rasmussen,
2013).
Além disso, acredita-se que os bioflavonoides se conectam aos componentes da
matriz extracelular presente nos vasos sanguíneos e aumentam a resistência deles contra
enzimas (Shi et al., 2005).
Desse modo, a leucoantocianidina aumenta o tônus e a resistência das paredes
dos capilares, o que pode ter contribuído para uma melhora na perfusão hepática
encontrada no grupo tratado (G3) nesse presente trabalho.
Recentemente, a escutelarina (Zhang et al. , 2018), a baicalina (Zhang et al. ,
2018) e a rutina (Liu et al., 2017) vem sendo utilizada com certo grau de sucesso para
atenuar os efeitos da DHGNA.
Especula-se que estes flavonoides possuem seus efeitos de redução de lipídeos
devido ao fato de ativarem diferentes vias de sinalização que são capazes de reduzir a
biossíntese de colesterol, ácidos graxos e triglicerídeos pelo fígado (AMPK,
PPARc/PGC-1a-Nrf2 e outras vias).
Outro mecanismo proposto para seus efeitos incluem a regulação negativa de
células inflamatórias e citocinas pró-inflamatórias, assim como seus efeitos
antioxidativos (Cha et al., 2016; Fernandes et al. , 2017; Kuang et al. , 2017; Zhang et
al. , 2018).
62
Outros antioxidantes como o ômega-3, ácido linolênico e óleo de perila também
foram estudados no que tange a redução da EHNA (Cha et al. , 2016).
Dentre as drogas elencadas, aquela que, ultimamente, tem conseguido maior
prestígio parece ser a vitamina E, graças ao seu papel antioxidante (Sanyal et al. ,
2010).
O estudo PIVENS, foi conduzido pela NASH Clinical Research Network e
comparou o uso de 800UI/dia de vitamina E, e o de 30mg/dia de pioglitazona com
biópsias hepáticas antes e depois do tratamento.
Nos dois grupos (Vit E e pioglitazona) de tratamento ocorreu redução
significativa da esteatose, da inflamação lobular e balonização celular foi reduzida
(Sanyal et al. , 2010).
Ambas as substâncias mostraram redução NAFLD Activity Score (escore de
atividade da EHNA).
Porém, há uma inquietação com o uso de pioglitazona devido à observação
recente de uma possível associação do fármaco com câncer de bexiga (Lewis et al.,
2011).
É válido ressaltar que alguns estudos supracitados (Liu et al. , 2017; Machado et
al. , 2016; Xia et al. , 2006; Zhang et al. , 2018; Zhang et al. , 2018) objetivaram os
efeitos de uma única substância, porém, sabe-se que muitos destes compostos naturais
podem ser ingeridos em conjunto através de uma dieta adequada e diversa.
Devido a isso, acredita-se que as propriedades dessas diversas substâncias
podem entrar em sinergia e reduzirem juntas, com maior capacidade, a disfunção
endotelial e o metabolismo exacerbado de lipídeos (Fernandes et al. , 2017; Kim et al.,
2018; Mozaffarian & Wu, 2018; Zhang et al. , 2018).
Outros trabalhos usaram o tratamento farmacológico para obesidade com
sibutramina e a orlistate com melhora na bioquímica, redução de peso, e regressão da
esteatose avaliada pela ultrassonografia, entretanto sem a biópsia hepática seriada que
foi uma limitação do estudo (Sabuncu et al., 2003).
A rosiglitazona também foi satisfatoriamente eficaz no tratamento da DHGNA
(Neuschwander-Tetri et al., 2003; Ratziu et al., 2008), por outro lado, esta droga teve
sua comercialização suspensa após suspeitas de que estivesse associada a risco
63
aumentado de infarto agudo do miocárdio e insuficiência cardíaca (Nissen, 2010; Nissen
& Wolski, 2007).
Portanto, nenhum medicamento isoladamente foi aprovado de forma inconteste
como primeira linha de tratamento (Augustin et al. , 2017; Dongiovanni & Valenti,
2017; Ferramosca et al. , 2017; Mantovani & Targher, 2017; Musso et al. , 2010; Shin
& Jung, 2017).
64
7 CONCLUSÕES
No presente estudo, foi observado que a leucoantocianidina:
- reduziu de forma significativa a esteatose hepática, de acordo com a análise
macroscópica, microscópica e análise do escore de EHNA;
- não foi capaz de reduzir significativamente o peso dos animais nem os níveis
séricos de colesterol total, LDL, HDL, VLDL, lipídeos totais, triglicerídeos e TGP, mas
teve capacidade de reduzir os níveis de TGO de forma significativa.
65
8 OBRAS CITADAS
1. Abdelmalek MF, Sanderson SO, Angulo P, Soldevila-Pico C, Liu C, Peter J, et
al. Betaine for nonalcoholic fatty liver disease: results of a randomized placebo-
controlled trial. Hepatology. 2009;50(6):1818-26.
2. Abidu-Figueiredo M, Costa WS, Chagas MA, Sampaio FJB, Cardoso LEM.
Age-related changes in the concentration of elastic fibers in different regions of the
rabbit penis. Acta Cir Bras. 2013;28(5):378-84.
3. Abidu-Figueiredo M, Ribeiro IC, Chagas MA, Cardoso LE, Costa WS, Sampaio
FJ. The penis in diabetes: structural analysis of connective tissue and smooth muscle
alterations in a rabbit model. BJU Int. 2011;108(3):400-4.
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73
9 ANEXOS
9.1 PROTOCOLO DE COLABORAÇÃO CIENTÍFICA
74
9.2 PROTOCOLO DE DOAÇÃO DE MATERIAIS
75
9.3 PARECER DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA DA UFAL
76
9.4 COMUNICADO DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA DA UFF
77
9.5 ESCORE DE ATIVIDADE DA ESTEATOSE HEPÁTICA NÃO ALCOÓLICA
De acordo com (Kleiner et al. , 2005).