Universidade Presbiteriana Mackenzie

23/03/2012

Extração de DNA genômico bacteriano e analise eletroforética

do resultado

Felipe Tadeu Rocha – 31004741

Julia Zaccarelli – 41019318

Lorenzo De Mingo – 41018435

Marianna Manes – 41052129

Thaislaine Guerner – 31118682

4ª Etapa

Turma B12

Resumo

Este trabalho tem como objetivo a visualização de moléculas de DNA da

bactéria E.coli através do método de eletroforese. Para isso foi feita a extração

do DNA, o preparo do gel e a corrida eletroforética. O resultado foi que as

moléculas de DNA bacteriano migraram muito pouco em direção ao pólo

positivo do gel. Isso aconteceu porque essas moléculas são muito grandes e,

consequentemente, não conseguem se deslocar muito.

1. Introdução

O DNA é formado por genes, que são a parte funcional do DNA

genômico. Os genes contêm as informações do organismo e as que serão

passadas de uma geração para a outra. O Genoma é o conjunto completo de

fatores hereditários contidos nos cromossomos. (COMCIENCIA, 2000).

A molécula de DNA é formada pela ligação de duas fitas, que são

constituídas por nucleotídeos. Estes, por sua vez, são a junção de uma

pentose com função de Desoxirribose, fazendo uma ligação glicosídica com

bases nitrogenadas (A,T,C,G) e uma ligação fosfodiester ao grupo fosfato

(podem ser até três grupos fosfato em um nucleotídeo) .

Um nucleotídeo se liga ao outro na sequência 5’3’. Isso significa que o

grupo OH do carbono 3 da pentose do nucleotídeo inicial da fita se liga ao

grupo fosfato do carbono 5 de outro nucleotídeo. Desse modo, ao analisar uma

fita de DNA, o nucleotídeo inicial da fita terá o seu carbono 5 ligado a um grupo

fosfato e o último nucleotídeo da fita sempre terá o seu grupo OH livre. Assim,

sempre que um nucleotídeo deseja se ligar a fita, ele será acoplado ao carbono

3 - por isso se diz que as fitas de DNA seguem a sequência 5’3’. Essa junção

de nucleotídeos dá origem ao RNA (quando é apenas um fita) ou ao DNA

(quando duas fitas se ligam através de pontes de hidrogênio entre as bases

nitrogenadas) (COMCIENCIA, 2000).

O DNA do cromossomo bacteriano é um filamento circular, constituído

por duas cadeias dispostas em hélice (JUNQUEIRA, 2005) e que fica solto no

citoplasma da bactéria numa região chamada de nucleoide, que fica próxima a

membrana plasmática. Além dos cromossomos do nucleoide, as bactérias

podem apresentar outros pequenos fragmentos de cromossomos circulares,

denominados plasmídeos (JUNQUEIRA, 2005). Os plasmídeos ficam

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localizados no citosol fora do nucleoide. Por não ter uma separação espacial, o

genoma fica exposto aos ribossomos e, por consequência, a tradução e a

transcrição nas bactérias ocorrem simultaneamente.

Neste experimento foi utilizado DNA da bactéria Escherichia coli. Essa

bactéria é um bacilo gram negativo de tamanho moderado, pertencente à

família Enterobacteriaceae. Ela faz parte da flora intestinal do homem. Em

condições especiais esta bactéria pode causar infecções oportunistas, como a

gastroenterite - causando diarréia, disenteria, febre, cólicas abdominais e fezes

sanguinárias (MURRAY, 2010).

Para a visualização dos resultados foi utilizada a técnica da eletroforese

em gel de agarose. A eletroforese é um método de separação de moléculas

criado na década de 1930 pelo químico sueco Arnie Tiseleus. Ele é baseado na

diferença de velocidades em que as moléculas se locomovem quando

submetidas a um campo elétrico de corrente contínua. Essa técnica pode ser

usada em vários tipos de moléculas, como vitaminas, carboidratos, proteínas,

ácidos nucléicos e nucleotídeos (HOLLER, 2002).

O método se inicia colocando a amostra a ser estudada em um suporte

poroso e plano, como, por exemplo, gel. Em seguida, é colocada uma solução

tampão, capaz de estabelecer o pH da solução, facilitando a separação das

moléculas (FERNANDEZ, 2001). Por último, é aplicada uma corrente elétrica

por um par de eletrodos, sendo um em cada lado do suporte (HOLLER, 2002).

Como resultado, há formação de zonas ou bandas, que são

agrupamentos de moléculas de acordo com os seus tamanhos, formas e

cargas (FERNANDEZ, 2001). A velocidade de migração depende da carga e

do tamanho das moléculas. Moléculas menores têm uma velocidade maior e

moléculas com uma carga maior também tem uma velocidade maior (HOLLER,

2002). O período de tempo de migração depende do tipo de molécula que esta

sendo analisada (FERNANDEZ, 2001).

2. Objetivos

Este trabalho tem como objetivo extrair o DNA genômico da bactéria

E.coli utilizando o reagente DNAzol e analisar o resultado utilizando a técnica

da eletroforese em gel de agarose.

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3. Material e métodos

3.1 Material biológico

1 tubo de 3mL da bactéria E.coli em meio LB, cultivada “overnight“ com

agitação

3.2 Reagentes

DNAzol, etanol absoluto gelado, solução tampão TAE ou TBA e TE

(TRIS-EDTA)

3.3 Corantes

Solução bluegreen, solução corante contendo 5% de glicerol, 0,1% de

azul de bromofenol e 0,1% de xylene cyanol.

3.4 Extração do DNA genômico

Centrifugamos a cultura de E.coli a 5000rpm durante 3 minutos. Em

seguida, descartamos o sebrenadante e adicionamos 250 µL de DNAzol.

Misturamos a solução para que ficasse bem homogênea. Na sequência,

transferimos para um microtubo para ser incubada a temperatura ambiente por

3 minutos.

Ao término da incubação, centrifugamos a solução a 10000 rpm por 5

minutos. Depois retiramos o sobrenadante e transferimos a solução para um

microtubo limpo. Adicionamos 125 µL de etanol absoluto gelado ao conteúdo

do microtubo e misturamos por inversão. Em seguida a solução foi incubada no

gelo por 3 minutos e depois centrifugada a 10000rpm.

Após a centrifugação, descartamos o sobrenadante. O DNA extraído da

bactéria ficou precipitado no fundo do tubo. Ressuspendemos o precipitado em

40 µL de tampão TE. Ao término do experimento, estocamos a solução final á -

20ºC.

3.5 Preparação do gel

Pesamos 0,3 gramas de agarose, adicionamos 30mL de solução tampão

TAE ou TBA e fundimos essa mistura em forno de microondas. Deixamos

resfriar até aproximadamente 50ªC. Colocamos depois o líquido no molde

previamente vedado com fita crepe. Posicionamos o pente de acrílico sobre o

molde e esperamos gelificar.

3.6 Preparação das amostras

Misturamos em um microtubo 8 µL de DNA genômico de E.coli, 1 µL de

solução bluegreen e 1 µL de solução corante.

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3.7 Aplicação das amostras

Transferimos o molde com o gel de agarose para a cuba eletroforética e,

em seguida, retiramos o pente e a fita crepe. Adicionamos solução tampão TAE

ou TBA na cuba, até ultrapassar o gel.

Em dois buraquinhos do gel, o primeiro e o último, colocamos a solução

padrão (formada pela mistura de 8 µL de DNA padrão (lambda Hindll), 1 µL de

solução corante e 1 µL de solução bluegreen). Nos outros buraquinhos

colocamos 10 µL de amostra.

3.8 Corrida eletroforética

Para que a corrida eletroforética acontecesse, ligamos os eletrodos à

fonte, aplicando uma voltagem inferior a 5V/cm2. As moléculas migraram do

pólo negativo para o positivo

3.9 Visualização

Ao término do experimento, desligamos a fonte de eletricidade e

retiramos os fios dos eletrodos. Em seguida retiramos a lâmina de acrílico com

o gel. Ajustamos essa lâmina num suporte de papel toalha. Depois colocamos

o gel em um transiluminador de luz U.V.

4. Resultados

As moléculas de DNA genômico da bactéria E.coli migraram pouco para

o polo positivo do gel de agarose.

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λ 1 2 3 4 5 6 λ

Figura 1: Eletroforese em gel de agarose. Colunas λ amostra padrão. Colunas 1, 3 e 5 amostras de DNA genômico. Colunas 2, 4 e 6 amostras de DNA plasmidial.

5. Discussão e conclusão

 O resultado desse experimento foi o esperado, pois o gel de agarose é

muito poroso, o que faz com que moléculas de grandes dimensões, tais como

lipoproteínas e ácidos nucleicos, tenham facilidade em fazer a migração de um lado

para o outro. Desse modo, as moléculas de DNA genômico ficam aglomeradas

perto da cavidade em que foram colocadas para fazer a corrida eletroforética.

Apesar dos resultados serem os esperados, o método empregado para

fazer a extração do DNA, utilizando DNAzol, não foi o mais adequado. Existem

técnicas mais precisas, como o tratamento com formol e clorofórmio, que permite

uma melhor precipitação do DNA. Outros métodos utilizados são os kits de

extração, como, por exemplo, o Kit Qiagen TM e o Kit Invitrogen easyDNA, que

são próprios para que a análise seja feita por espectrofotometria, eletroforese

em gel de agarose ou PCR.

Há também outro fator a ser considerado. As pessoas que realizaram a

extração do DNA não possuíam nenhuma experiência na realização desse

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procedimento. Esse fato pode ter acarretado numa má qualidade de visualização

do resultado.

Foi possível concluir que a corrida eletroforética é extremamente útil na

análise de DNA genômico. Também foi possível perceber que as moléculas

presentes no material são muito grandes e, por isso, migram uma distância

muito pequena em uma velocidade muito reduzida.

6. Referências bibliográficas

COMCIENCIA. Projeto genoma: a ciência de ponta no Brasil. 06/07/2000.

Disponível em: <http://www.comciencia.br/reportagens/genoma/genoma10>.

Acesso em: 17 mar 2012

Entrevista com José Fernando Perez, diretor científico da FAPESP

FERNANDEZ, C.G., GARCIA, S.M.L. (2001) Capítulo 1: Ferramentas

metodologicas para o estudo de problemas de biologia do desenvolvimento. In:

FERNANDEZ, C.G., GARCIA, S.M.L. Embriologia. 2ª Ed, Editora Artmed,

Porto Alegre, p.21-32

HOLLER, F.J., NIELMAN, T.A., SKOOG, D.A. (2002) Capítulo 30: Eletroforese

capilar e eletrocromatografia capilar. In: HOLLER, F.J., NIELMAN, T.A.,

SKOOG, D.A. Princípios de análise instrumental. 5ª Ed, Editora Bookman,

Porto Alegre, p.687-702

JUNQUEIRA, L.C., CARNEIRO, J. (2005) Capítulo 14: Células Procariontes. In:

Biologia celular e molecular. 8ª Edição, Editora Guanabara Koogan, São

Paulo, p. 267-281

MURRAY, P.R., PFALLER, M.A., ROSENTHAL, K.S. (2010) Capítulo 30:

Enterobacteriaceae. In: MURRAY, P.R, PFALLER, M.A., ROSENTHAL, K.S.

Microbiologia médica. 6ª Ed, Editora Elsevier, São Paulo, p.299-313

POMBEIRO, A.J.L.O. (2003) Capítulo 19: Técnicas eletroforéticas. In:

POMBEIRO, A.J.L.O., Técnicas e operações unitárias em química

laboratorial. 4ª Ed, Editora Fundação Calouste Gulbenkian, Lisboa, p.702-747

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