Relatório - Biologia Celular e Genética

Carlos Neves

Trabalhos Laboratoriais

Licenciatura em Fisioterapia

Escola Superior de Sade Jean Piaget Campus de Viseu 20 de Janeiro de 2011

Trabalhos Laboratoriais

Autor: Carlos A. M. Seia Neves

Orientador: Mestre Alexandre Panteleitchuk

Licenciatura em Fisioterapia

Escola Superior de Sade Jean Piaget Campus de Viseu 20 de Janeiro de 2011

ndice

Introduo.............................................................................................................4 Experincia 1 Parnquima da batata e epiderme da cebola............................5 1.1 Parnquima da batata e epiderme da cebola..........................................5 1.2 Procedimento Experimental:....................................................................7 1.2.1 Procedimento Cebola........................................................................8 1.2.2 Procedimento Batata.........................................................................9 1.3 Resultados.............................................................................................10 1.4 Discusso...............................................................................................11 Experincia 2 Colorao de Gram..................................................................13 2.1 Enquadramento sobre a Colorao de Gram........................................13 2.2 Procedimento Experimental:..................................................................14 2.3 Resultados.............................................................................................16 2.4 Discusso...............................................................................................17 Experincia 3 Meiose e Mitose........................................................................18 3.1 Enquadramento sobre Meiose e Mitose................................................18 3.2 Procedimento Experimental:..................................................................21 3.3 Resultados.............................................................................................22 3.4 Discusso...............................................................................................23 Concluso...........................................................................................................24 Bibliografia..........................................................................................................25

Introduo

No decorrer da disciplina de Biologia e Gentica Celular, tivemos a oportunidade de frequentar aulas prticas, onde pudemos ver vrias estruturas ao microscpio ptico e ver as alteraes ao serem coloradas com diferentes corantes, consoante a estrutura que desejvamos observar em evidncia. Foram realizados quatro trabalhos, dos quais nos foi pedido que escolhssemos trs e realizssemos um trabalho sobre os mesmos, e tambm seguindo a nossa curiosidade, fossemos pesquisando fora da aula, e colocando dvidas ao professor. Deste modo foi realizado um pequeno trabalho sobre estas trs experincias: Parnquima da batata e epiderme da cebola; Colorao de Gram e Meiose e Mitose O trabalho seguinte, vem estruturado em trs partes, uma relativa a cada experincia, com fundamentao terica, procedimento tcnico, resultados, dentro de cada uma das partes temos ainda uma pequena discusso de resultados, seguidamente vem a concluso, bibliografia e anexos.

Biologia Celular Trabalhos Laboratoriais

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Experincia 1 Parnquima da batata e epiderme da cebola

1.1 Parnquima da batata e epiderme da cebolaA batata um tubrculo subterrneo da batateira, muito empregue na alimentao sendo constitudo por clulas que formam um tecido o parnquima amilceo, com forma arredondada, em que o citoplasma apresenta inmeros corpsculos ovides ou elpticos os amiloplastos. Estes organitos tm como principal funo o armazenamento de uma substncia de reserva o amido, sob a forma de gros de amido. O bolbo da cebola consiste num caule subterrneo apresentando tnicas carnudas e sobrepostas. Cada tnica uma folha modificada com a forma de escama, que acumula substncias de reserva. Na superfcie cncava de cada tnica existe uma epiderme, ou seja uma pelcula fina, que se pode destacar facilmente e constituda por uma s camada de clulas. A clula um pequeno elemento autnomo de dimenses microscpicas, considerada a unidade morfolgica e funcional constituinte dos seres vivos. Podemos ter dois tipos de clulas: as clulas eucariticas e as clulas procariticas. As clulas eucariticas so organismos com maior complexidade do que as clulas procariticas e distinguem-se destas pelo facto de possurem o seu material gentico organizado num compartimento, o ncleo, encontra-se separado do resto da clula por uma membrana plasmtica. Geralmente dividimos as clulas eucariticas em dois grupos: clulas animais e clulas vegetais. As clulas vegetais possuem organelos similares aos das clulas animais, no entanto possuem organelos nicos tais como: a parede celular, os plasmodesmos, os cloroplastos e os vacolos, que embora em nmero inferior aos das clulas animais apresentam maiores dimenses. A figura abaixo esquematiza as principais diferenas entre a clula eucaritica animal e a clula eucaritica vegetal.


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Figura 1 - Esquema de clula animal e vegetal

A observao de material microscpico prev a aplicao de diversas tcnicas de modo a obter uma melhor visualizao dos seus componentes, dado que as clulas para alm das suas reduzidas dimenses no apresentam contraste entre os seus constituintes. Essas tcnicas tm como objectivo permitir que o material seja melhor visualizado, tentando no alterar as suas caractersticas originais, e conservando-o por um perodo de tempo mais longo do que o habitual, pois as clulas vo-se danificando rapidamente devido evaporao do meio de montagem, que acompanhado por um processo progressivo de degradao e autlise. As preparaes podem ser temporrias ou definitivas, sendo as estudadas temporrias, ou seja, o meio de montagem um meio lquido onde o material biolgico est imerso numa substncia que no o altere ou danifique como por exemplo a soluo de Ringer, que permite manter as clulas vivas, e utilizado maioritariamente nas clulas vegetais. A colorao tem especial importncia em microscopia, por permitir evidenciar estruturas celulares pouco perceptveis. Tornando-se vivel, visto que determinados constituintes celulares tendem a absorver certos corantes, enquanto outros no tm essa capacidade. Deste modo, nesta actividade experimental utilizamos a soluo de vermelho neutro, soluto de Lugol e a soluo de azul metileno.


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O vermelho neutro um corante que em baixas concentraes, penetra na clula sem a matar (corante vital); assim, enquanto a clula se mantiver viva, o citoplasma e os organitos permanecem incolores, introduzindo-se o corante no vacolo, que cora de vermelho. Por outro lado, o azul metileno um corante bsico actuando preferencialmente sobre o ncleo, que fica corado de azul. Os corantes possuem tambm tcnicas de aplicao, sendo uma delas a tcnica de irrigao, que consiste na aplicao de uma gota de corante num dos bordos da lamela, e no lado oposto da lamela, colocar uma tira de papel de filtro, para efectuar a suco, permitindo ao material biolgico entrar em contacto com o corante. Outra tcnica a imerso, consiste em colocar o corante na lmina ou no vidro relgio, seguidamente colocar a clula no material de montagem e o corante ir actuar como meio de montagem. Com a utilizao destes processos possvel realar as estruturas que no contrastam suficientemente, tornando-as distintas umas das outras e permitindo que compreendamos melhor as diferenas entre os organitos que compem a clula eucaritica vegetal e que no existem na clula eucaritica animal, lembrando a importncia dos processos de colorao na observao dos mesmos.

1.2 Procedimento Experimental:

Material - Microscpio ptico Composto; -Pina; - gua; -Bisturi; Biologia Celular Trabalhos Laboratoriais 7

-Conta-gotas; -Papel de filtro; -Bolbo da cebola; -Lminas; -Lamelas; -Esguicho c/gua destilada; -Agulhas de disseco; -Vidro de relgio; -leo de imerso; -gua iodada diluda; -Corantes: soluto de azul metileno e o soluto de vermelho neutro pouco concentrado.

1.2.1 Procedimento Cebola - Corta-se o bolbo da cebola em quatro partes e desataca-se uma das escamas; - Com a ajuda da pina e do bisturi retirou-se uma pequena poro da epiderme que recobre a face interna dessa escama; - Introduziu-se rapidamente um fragmento da epiderme num vidro de relgio com gua e, utilizando enrolasse; duas agulhas de disseco distende-la, procurando evitar que esta se


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- Com o auxlio do bisturi, corta-se um fragmento dessa poro de epiderme e montamo-lo entre a lmina e a lamela, utilizando gua como meio de montagem; - Observou-se a preparao ao microscpio, primeiro utilizando a objectiva de menor ampliao e em seguida com as restantes objectivas; - Aplicar uma a duas gotas de soluto azul-de-metileno ao longo de um dos lados da lamela, fazendo-o entrar em contacto com a preparao, recorrendo ao efeito absorvente do papel de filtro colocado no lado oposto; - Observar de novo a preparao ao microscpio utilizando as vrias objectivas;

1.2.2 Procedimento Batata - Seccionou-se a batata em quatro partes. - Com ajuda de um micrtomo de mo (em alternativa ao bisturi), fizeramse dois cortes muito finos num dos fragmentos. - Introduziu-se um dos cortes em gua, num dos vidros de relgio. - Introduziu-se o segundo corte no outro vidro de relgio onde previamente foi colocar uma soluo muito diluda de gua iodada. Deixou-se actuar durante breves minutos. - Montou-se, separadamente, cada um dos fragmentos numa gota de gua entre a lmina e a lamela. - Observou-se ao microscpio utilizando a objectiva de menor ampliao, seguida das restantes objectivas.


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1.3 Resultados


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1.4 Discusso

As observaes realizadas tiveram como objecto de estudo a epiderme da cebola e parnquima amilceo da batata, por apresentarem apenas uma camada de clulas, permitindo, assim, observar clulas eucariticas vegetais. No entanto, temos de realar dois aspectos que dificultam a observao dos componentes celulares: as pequenas dimenses das clulas e seus organelos, e tambm a sua transparncia e consequente falta de contraste entre as estruturas. Assim, existem algumas tcnicas de microscopia, como a colorao que facilitam a visualizao das microestruturas biolgicas. A colorao apresenta um papel bastante importante em microscopia, dado que permite evidenciar diversos componentes celulares, com alteraes mnimas das suas caractersticas originais, proporcionando deste modo um trabalho mais pormenorizado e credvel ao observador. Esta tcnica baseia-se no facto de determinados constituintes celulares absorverem alguns corantes, enquanto que outras estruturas no o fazem. Tendo conhecimento desta tcnica, utilizmos o azul-de-metileno, a gua iodada ou soluo de Lugol e o vermelho neutro, para evidenciar vrias estruturas celulares como: o ncleo, a parede celular e os vacolos das clulas. Com a utilizao do azul-de-metileno (corante que usado em baixa concentrao penetra na clula sem a matar corante vital) atravs da tcnica de imerso (consiste em colocar o corante na lmina, actuando como meio de montagem, seguindo-se a colocao do material em estudo), manteve-se o citoplasma e alguns organitos incolores, tendo este, apenas sido absorvido pelo ncleo, apresentando uma tonalidade azul. Utilizando a gua iodada, foi-nos possvel observar, de forma acentuada, a parede celular e o ncleo, uma vez que s estes componentes celulares absorveram o corante, ficando com uma tonalidade amarela, permitindo-nos,


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assim, realar estruturas que no contrastavam suficientemente umas em relao s outras. No entanto, ao utilizar o vermelho neutro (que tambm um corante vital), este introduziu-se no vacolo, conferindo-lhe uma cor rosada ou avermelhada. Sendo as clulas, clulas eucariticas vegetais era de esperar que se observassem cloroplastos, facto que no acontece, dado que a cebola um caule subterrneo, deste modo no efectua a fotossntese (processo de sntese de matria orgnica que ocorre nas clulas dos produtores, envolvendo os pigmentos que se encontram nos cloroplastos) e, assim, no tem cloroplastos, pois no necessita desses organitos.


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Experincia 2 Colorao de Gram

2.1 Enquadramento sobre a Colorao de GramAs Bactrias so organismos unicelulares procariticos, deste modo, apresentam uma estrutura simples. So constitudas por parede celular de peptidoglicanos, cpsula (quando so patognicas), membrana citoplasmtica, podem ter flagelos ou no (para se movimentarem), assim, apresentam estruturas dentro e fora da parede celular sendo necessrio a utilizao de tcnicas especiais para serem visionadas, como podemos observar pela tcnica de Gram. Esta tcnica foi descoberta pelo fsico dinamarqus Hans Christian Gram em 1884, que obteve com a colorao realizada uma melhor visualizao das bactrias em amostras de material infectado. Tendo, no entanto, verificado que nem todas as bactrias coravam com este mtodo, sugerindo a possibilidade de ser usado um contrastante. Gram morreu em 1935 sem ter conseguido obter o devido reconhecimento da importncia do seu mtodo de colorao. Actualmente, esta tcnica fundamental para a taxonomia e identificao das bactrias, sendo utilizada como tcnica de rotina em laboratrios de bacteriologia. A tcnica de Gram permite-nos dividir as bactrias em duas classes, Gram Negativas (apresentam cor vermelha) e Gram Positivas (apresentam cor prpura). Ou seja, a diferenciao entre as duas classes relaciona-se com a estrutura da parede celular das bactrias, sendo a parede celular das Gram positiva formada por um camada espessa de peptidoglicano, por sua vez, a parede celular das Gram negativa apresenta uma camada fina de peptidoglicano, rodeada por uma camada externa de lipopolissacarideo e protena. Por este motivo a colorao Gram mostra ser uma ferramenta essencial na classificao e diferenciao de baterias.


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A tcnica de colorao de Gram apresenta a seguinte sequncia: Corante primrio violeta de cristal (cora o citoplasma de prpura) Mordente soluo de iodo (aumenta a afinidade entre o violeta de cristal e a clula formando com o corante um complexo insolvel dentro da clula) Agente descolorante lcool, acetona ou ambos (solvente lipdico) Contrastante safranina ou fucsina bsica (cora o citoplasma de vermelho)


Material - Suporte para lminas; - Pina de madeira; - Lminas; - Ansa; - Cristal de Violeta; - Lugol; - lcool; - Safranina; - Esguicho com gua.


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Procedimento - Preparao e fixao de esfregao: 1. Colocar na lmina uma gota de gua estril qual se mistura um pouco de colnia com uma ansa e espalha-se. 2. Secar o esfregao, aquecendo levemente chama, tendo o cuidado de evitar o aquecimento excessiva da lmina.

- Colorao: 1. Cobrir o esfregao com cristal violeta e deixar actuar durante 30 seg. 2. Lavar com gua. 3. Cobrir o esfregao com Lugol e deixar actuar durante 30 seg. 4. Lavar com gua 5. Lava e lmina com lcool durante 15-20 seg. 6. Lavar com gua 7. Cobrir o esfregao com safranina e deixar actuar durante 30 seg. 8. Lavar com gua 9. Secar a lmina 10. Observar ao microscpio.


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2.3 Resultados


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2.4 Discusso

Durante a realizao da experincia pudemos ir verificando algumas particularidades das diferenas celulares, como na aplicao do corante primrio violeta de cristal, que evidenciou o citoplasma com cor prpura, ou o lcool que descolora as clulas, sendo este processo mais rpido nas Gram negativas, tendo verificado que o tempo de actuao do agente descolorante essencial para obter uma boa colorao. No fim de aplicados os corantes e de ser limpa a amostra, as clulas coradas de roxo so designadas de Gram positivo e as coradas de rosa, de Gram negativo. Verificamos que as paredes celulares dos dois tipos de bactrias so estruturalmente diferentes, sendo que as clulas de Gram positivo apresentam uma camada de peptidoglicano mais espessa, enquanto que as bactrias Gram negativo apresentam uma camada mais fina e uma membrana externa. Ou seja, as bactrias das Gram Negativas tm uma parede celular mais complexa e diferenciada, observando-se uma estrutura menos homognea, mas estratificada. A camada mais interna destas bactrias rgida, electrodensa, constituda por peptidoglicanos; a mais externa principalmente constituda por lipopolissacarideos, fosfolpidos e protenas. No entanto, durante a etapa de diferenciao pelo lcool, parte dos lpidos so dissolvidas pelo lcool, formando-se poros na parede por onde o corante de violeta de cristal sai das clulas. Ficando estas transparentes aps esta etapa, apresentando no final uma cor para o rosa/ prpura. Por outro lado, as bactrias de Gram positivo apresentam uma parede espessa, homognea, geralmente no estratificada e com predominncia do peptidoglicano. Assim, o precipitado insolvel que se forma fica retido no interior da clula pela camada espessa de peptidoglicano, logo, estas clulas permanecem com a colorao conferida pelo corante a cor roxa.


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Experincia 3 Meiose e Mitose

3.1 Enquadramento sobre Meiose e MitoseTemos dois tipos fundamentais de diviso celular: a mitose e a meiose. Na mitose, uma clula divide-se, originando duas clulas-filhas exactamente iguais clula inicial em relao qualidade e quantidade de material gentico. Nesse caso dividir significa duplicar. A mitose o modo pelo qual os organismos unicelulares se reproduzem e as clulas de organismos multicelulares se multiplicam, possibilitando o crescimento e a substituio de clulas mortas. Por outro lado, a meiose, apenas ocorre em organismos multicelulares restringindo-se s clulas destinadas reproduo sexuada. Ocorrem duas divises, obtendo-se como resultado final quatro clulas com exactamente metade dos cromossomas existentes na clula-me. vulos e espermatozides (animais), e esporos (vegetais) so produzidos por meiose.

- ETAPAS DA MITOSE: Mesmo sendo um processo contnuo, para melhor compreendermos o seu mecanismo, geralmente divide-se a mitose em quatro etapas, pela seguinte ordem: prfase, metafase, anafase e telofase. Profase Constitui o incio da mitose. Durante a qual ocorre a desorganizao e o consequente desaparecimento da carioteca e do nuclolo. D-se a duplicao de centrolos iniciando cada par a migrao para plos opostos da clula. volta destes surgem fibras proticas constituindo o ster. Entre os centrolos, que se afastam, surgem as fibras proticas do fuso mittico. Algumas delas, as fibras contnuas, estendem-se de um centrolo a outro; as fibras cromossmicas ligam-se aos cromossomas.


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Os cromossomas, duplicados desde a interfase, passam por um processo de condensao, comeando a torn-los visveis ao microscpio ptico. Cada um ento constitudo por duas cromtides. Ligadas pelo centrmero e chamadas de cromtides-irms. Metafase os cromossomas atingem o estado mximo de condensao nesta fase, tornando-se bem visveis apresentando-se na placa equatorial da clula. No final desta fase ocorre a duplicao dos centrmeros. Levando separao das cromtides-irms, que passam a constituir cromossomas-filhos. Anafase Aps a duplicao dos centrmeros, as cromtides-irms separam-se e cada cromossoma-filho originado migra para um dos plos da clula. Isto deve-se ao encurtamento das fibras do fuso que ligam os centrolos aos centrmeros. Esta fase termina quando os cromossomas-filhos chegam aos plos. Telofase Nesta fase os cromossomas j se apresentam nos plos celulares e descondensam-se. H uma reorganizao da carioteca em torno de cada conjunto cromossmico, determinando a formao de um novo ncleo, em cada plo da clula. Os nuclolos tambm se reconstituem. A Telofase abrange uma srie de eventos praticamente opostos queles que ocorreram na prfase. No final da Telofase completa-se a cariocinese, isto , a diviso nuclear; consequentemente temos a formao de dois novos ncleos. Depois inicia-se a citocinese, com a separao do citoplasma em duas regies, levando formao de duas novas clulas-filhas. O esquema seguinte mostra uma representao das fases descritas e da sua ordem, tal como explicado acima.


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Figura 2 Esquema ilustrativo da Mitose No processo da Meiose, a quantidade de cromossomas reduzida a metade, sendo que a clula me diplide (2n), origina quatro clulas haplides (n) aps a diviso. Nas clulas humanas diplides, existem 46 cromossomas. Atravs da meiose, estas passam a ter 23 cromossomas. No processo de fecundao humana, ocorre a unio de dois gmetas, materno e paterno, resultando de um ovo com 46 cromossomas. Assim, a meiose responsvel pela diversificao do material gentico nas espcies recombinao gentica. Em vez de criar duas novas clulas com nmero de cromossomas idnticos (como na mitose), neste processo, as clulas fazem uma segunda diviso (meiose II) logo aps a primeira diviso (meiose II). Nesta segunda diviso observa-se uma diviso do nmero de cromossomas. Com apenas metade do nmero de cromossomas, as clulas so chamadas de haplides. As clulas diplides so exactamente o oposto das haplides. O esquema seguinte mostra as diferentes fases da Meiose I e II, sendo as trs primeiras referentes primeira etapa da meiose, e as trs ltimas referentes segunda etapa.


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Figura 3 - Esquema ilustrativo da Meiose


Nesta observao no houve procedimento experimental, exceptuando a observao das amostras definitivas de dois tecidos.


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3.3 Resultados


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3.4 Discusso

No poderemos obter muitas concluses desta observao, dado que eram amostras previamente preparadas, e preparadas para durar longos perodos, podendo ser observadas diversas vezes, e por isso no necessrio aplicar tcnicas para recolha e preparao da amostra a ser observada. Observando apenas e procurando pelas diferentes fases da meiose e mitose. Apenas uma breve explicao da preparao de uma amostra definitiva, primariamente um utilizado um fixador, para parar toda a actividade celular, tentando manter todos os constituintes celulares na posio em que se encontram, seguidamente retirada toda a gua da amostra, e mergulhada em parafina onde fica em estufa antes de ser cortada em dimenses extremamente reduzidas, para depois ser colada lmina, novamente desidratada e desparafinizada, sendo depois colorada e montada, para podermos, assim, observar as estruturas em qualquer altura.


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Concluso

Quanto primeira experincia foi-nos possvel ter um contacto mais prximo com a microscopia ptica e as suas tcnicas, destacando a colorao, tendo sido a tcnica que nos permitiu observar de forma clara as clulas eucariticas vegetais e os seus constituintes. Tivemos a oportunidade de observar o modo como os corantes utilizados, azul-de-metileno, gua iodada e vermelho neutro, actuaram sobre diferentes estruturas celulares, ou seja, o modo como eram absorvidos por uns organitos. Os resultados obtidos corresponderam ao previsto inicialmente, tendo os objectivos sido cumpridos Em relao segunda experincia, posso concluir, que a tcnica de Gram permite distinguir as duas principais classes de bactrias em microscopia ptica, ou seja, divide as bactrias em Gram Positivas e Gram Negativas. Apresenta-se como uma forma rpida e fcil de avaliar a estrutura da parede celular bacteriana. A membrana exterior das bactrias de Gram Negativo contribui no s para a resistncia mecnica da parede e confere proteco aos componentes do invlucro, como tambm intervm na manuteno da forma celular e condiciona a colorao Gram. Relativamente terceira experincia com as observaes efectuadas foi possvel identificar algumas das diferenas fases da mitose e da meiose das clulas eucariticas, que se revela um processo de extrema importncia para os vegetais e animais, pois possibilita o seu crescimento e desenvolvimento. Repetindo-se desde o aparecimento da primeira clula eucaritica, e permitindo a continuidade da vida na Terra. Garantindo deste modo, a estabilidade quantitativa e qualitativa do cdigo gentico dos eucariontes.


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Bibliografia

- AZEVEDO, C.; Biologia Celular e Molecular", 4 Edio, Lidel, edies tcnicas, Lisboa, 2005; - PURVES, W.K et al.; Vida: a cincia da biologia, 6 Edio. Porto Alegre: Artmed, 2002; - SEELEY, STEPHENS e TATE; Anatomia e Fisiologia, 3 Edio, Lisboa, Lusodidacta, 2001; - Observao microscpica de bactrias - colorao de Gram (Biologia)(pgina consultada a 9 de Janeiro de 2011). Observao microscpica de bactrias colorao de Gram [online], http://www.e-escola.pt/topico.asp?hid=306; - Tcnica de Colorao de Gram (pgina consultada a 12 de Janeiro de 2011). Tcnica de colorao de Gram [online], http://www.prof2000.pt/users/biologia/tcolgram.htm.


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Relatório - Biologia Celular e Genética

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