Relatório Bioquímica Analítica - Versão Final

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Isolamento, purificao e caracterizao do citocromo c de uma estirpe de Saccharomyces cerevisiae16

Bioqumica Analtica

Isolamento, purificao e caracterizao do citocromo c de uma estirpe de Saccharomyces cerevisiae

Ana Pereira, n. 24112 ([email protected])Ana Duarte, n. 23512 ([email protected])Cntia Carreira, n. 24097 ([email protected])Cludia Caleiro, n. 23313 ([email protected]) Dbora Melo, n. 25594 ([email protected])

Turno P3, Grupo 1

Licenciatura em BioqumicaResumo

No presente trabalho experimental procedeu-se ao isolamento, purificao e caracterizao do citocromo c de uma estirpe Saccharomyces cerevisiae, tendo-se obtido 10,747 mg de citocromo c, de peso molecular 12,2 kDa. A quantidade total de protena obtida no ltimo passo de purificao foi 20,865 mg. O rendimento do ltimo passo de purificao foi 14,7% e o coeficiente de pureza foi 0,9758. O nmero de hemos obtido foi 1,29.De modo a proceder ao isolamento do citocromo c, foi necessrio lisar as clulas atravs da suspenso de fermento de padeiro, previamente desfeito, em acetato de etilo e cloreto de sdio. Posteriormente, de modo a purificar o citocromo c, efectuou-se uma cromatografia em batch, adicionou-se sulfato de amnio para precipitar as protenas contaminantes (salting out) e, para finalizar, efectuou-se uma cromatografia HPLC. Aps a cromatografia em batch, efectuou-se uma dilise e foi retirada uma pequena amostra para anlise espectroscpica, assim como, aps a precipitao com sulfato de amnio.Posteriormente, recorreu-se ao mtodo de Lowry para determinar a quantidade total de protena e foram efectuadas uma electroforese em gel de poliacrilamida em condies desnaturantes, para determinar o peso molecular do citocromo c, e uma electroforese em gel de poliacrilamida corado para deteco de hemos. De modo a determinar o contedo em hemos por molcula de protena, recorreu-se ao mtodo da piridina hemocromo.

Introduo

Os citocromos so hemoprotenas, ou seja, contm um grupo prosttico designado por grupo hemo que consiste num tomo de ferro no centro de um anel de porfirina. O tomo de ferro tem um nmero de coordenao 6. Os quatro ligandos do plano equatorial so tomos de azoto do anel de porfirina e as posies de coordenao axiais so asseguradas por resduos laterais de aminocidos da cadeia polipeptdica da protena. A quinta posio de coordenao ocupada por um resduo de histidina e a sexta posio preenchida por uma metionina. O ferro hmico possui spin baixo e o estado de oxidao do ferro varia entre o estado reduzido (Fe2+) e o estado oxidado (Fe3+).Os citocromos distinguem-se pelo tipo de hemo, natureza da cadeia polipeptdica e propriedades espectroscpicas. Das quatro classes distintas de citocromos (a, b, c e d), apenas foi estudado o citocromo c. O citocromo c distingue-se dos restantes por possuir um grupo hemo ligado covalentemente cadeia polipeptdica atravs de uma ligao tioter com dois resduos de cistena da sequncia de aminocidos e por ser uma protena solvel.

Figura 1 Estrutura tridimensional do citocromo c.

Figura 2 Estado de spin do ferro hmico do citocromo c.

O citocromo c um componente essencial da cadeia respiratria mitocondrial, actuando como transportador electrnico entre os complexos III e IV. A sua estrutura tridimensional foi determinada por cristalografia de raios-X, revelando a presena de uma regio rica em lisinas com carga positiva a valores de pH fisiolgico. A protena pode ser facilmente obtida na sua forma pura e mantm-se estvel em soluo, sendo resistente desnaturao e a alteraes da sua estrutura tridimensional nativa em condies adversas de pH, temperatura e fora inica.O citocromo c encontra-se dividido em quatro classes[6]:

Classe I Inclui o citocromo c solvel e de spin baixo das mitocndrias e bactrias. Possui o stio de ligao do grupo hemo junto do N-terminal da histidina e o sexto ligando junto do C-terminal de uma metionina. Classe II Inclui o citocromo c de spin alto. Apresenta o stio de ligao do grupo hemo fechado para o N-terminal da histidina. Classe III Compreende os vrios citocromos com grupo hemo de baixo potencial redox. Os grupos hmicos do tipo c no so estrutural e funcionalmente equivalentes e apresentam potenciais redox diferentes, variando entre 0 e -400 mV. Classe IV Originalmente criada de modo a conter protenas complexas que possuem grupos prostticos para alm do hemo c.

No presente trabalho experimental procedeu-se ao isolamento do citocromo c de uma estirpe Saccharomyces cerevisiae. O citocromo c de Sccharomyces cerevisiae constitudo por uma cadeia polipeptdica com 104 resduos de aminocidos e tem um peso molecular de cerca de 12,6 kDa[5].Como referido anteriormente, o estado de oxidao do ferro hmico varia entre o estado reduzido (Fe2+) e o estado oxidado (Fe3+). Atravs de anlise espectroscpica, possvel verificar se o ferro se encontra no estado reduzido ou oxidado. O citocromo c no estado oxidado apresenta uma banda intensa de absoro no espectro de UV-Vis devido presena do grupo hemo, denominada banda Soret e detectada a cerca de 410 nm, assim como um conjunto de bandas menos intensas na regio 550-600 nm, denominadas bandas Q. A reduo do citocromo c acompanhada pelo desvio da banda Soret para 420 nm e pelo aumento de intensidade do pico de absoro da forma reduzida do citocromo c a cerca de 550 nm. A banda de absoro a 280 nm deve-se presena de protenas com cadeias laterais aromticas.

Figura 4 Espectros de absoro do citocromo c no estado oxidado ( esquerda) e do citocromo c no estado reduzido ( direita).

Resultados

Os resultados obtidos permitem verificar a eficincia das diversas tcnicas utilizadas no isolamento, purificao e caracterizao do citocromo c. Como tal, aps cada passo de purificao foi retirada uma alquota para posterior anlise espectroscpica da sua pureza. A alquota 1 corresponde amostra retirada aps a cromatografia em batch, a alquota 2 corresponde amostra retirada aps a precipitao com sulfato de amnio e a fraco B corresponde fraco mais pura obtida aps a cromatografia HPLC.

Aps a cromatografia em batch e dilise do eludo, obteve-se uma amostra de colorao avermelhada, com volume total de 34 ml e qual foi retirada uma alquota de 1 ml para posterior estudo espectroscpico.

Grfico 1 Anlise espectroscpica da alquota 1, correspondente amostra obtida aps cromatografia em batch.

Da mesma forma, aps a precipitao das protenas contaminantes com sulfato de amnio ((NH4)2SO4), centrifugao e dilise do sobrenadante, obteve-se uma amostra com volume total de 102 ml e qual foi retirada uma alquota de 1 ml para posterior estudo espectroscpico.

Grfico 2 Anlise espectroscpica da alquota 2, correspondente amostra obtida aps precipitao com sulfato de amnio.

Aps a cromatografia HPLC, foram obtidas 17 fraces. possvel identificar a presena de citocromo c, nas diversas fraces, atravs da colorao vermelha, caracterstica da protena.

Atravs dos valores de absorvncia a 550 nm, a 570 nm e a 280 nm, possvel determinar o coeficiente de pureza(1) que corresponde, no fundo, razo entre a quantidade de citocromo c e a quantidade total de protena. O valor de absorvncia a 550 nm corresponde absorvncia do citocromo c e o valor de absorvncia a 280 nm corresponde absorvncia de protenas com cadeias laterais aromticas. O valor de absorvncia a 570 nm utilizado como branco.

(1)

Tabela 1 Valores de absorvncia dos tubos a 280 nm e 410 nm, no estado oxidado, e a 550 nm e 570 nm, no estado reduzido, razo entre as absorvncias a 410 nm e a 280 nm e coeficiente de pureza.TuboForma OxidadaForma ReduzidaCoeficiente de pureza

Aborvncia280nmAbsorvncia410nmAbsorvncia550nmAbsorvncia570nm

30,0310,0920,018-0,0032,9850,675

50,1670,6900,1630,0024,1420,968

70,0420,1810,0480,0044,2701,019

90,0760,3140,0810,0054,1291,002

110,0700,2500,0620,0033,5590,845

130,0310,1320,0400,0064,2061,086

150,3160,7990,170-0,0012,5300,543

170,2620,3580,040-0,0061,3650,178

Grfico 3 Representao grfica da razo entre as absorvncias a 410 nm e a 280 nm e do coeficiente de pureza, determinados para cada tubo.

O clculo da razo de pureza tem como objectivo estimar a pureza das vrias fraces obtidas e escolher as mais puras, ou seja, as fraces que tm um coeficiente de pureza superior a 1.Considerando os resultados obtidos, possvel considerar as fraces 7 a 13 puras, uma vez que apresentam um coeficiente de pureza superior a 1, excepo da fraco 11. Como tal, juntaram-se as fraces mais puras, ou seja, as fraces 7 a 13, tal como referido anteriormente, e obteve-se a fraco B com volume total de 34 ml.

Grfico 4 Anlise espectroscpica da fraco B, correspondente amostra obtida aps cromatografia HPLC.

Tabela 2 Banda Soret e bandas Q do citocromo c e respectivos valores de absorvncia, no estado nativo e no estado reduzido.AmostraForma NativaForma Reduzida

(nm)Absorvncia (nm)Absorvncia

Alquota 14140,5034150,553

5200,0635200,069

5490,1005490,118

Alquota 24110,6294150,748

5200,0755200,094

5490,0985490,164

Fraco B4110,3054150,359

5210,0385200,043

5490,0525490,073

De modo anlogo ao efectuado para as diversas fraces obtidas aps cromatografia HPLC, possvel determinar o coeficiente de pureza para as amostras obtidas aps cada passo de isolamento e purificao do citocromo c.

Tabela 3 Valores de absorvncia da alquota 1, da alquota 2 e da fraco B a 280 nm, no estado oxidado, e a 550 nm e 570 nm, no estado reduzido e coeficiente de pureza.AmostraForma OxidadaForma ReduzidaCoeficiente de pureza

Aborvncia280nmAborvncia550nmAborvncia570nm

Alquota 10,3170,1150,0080,338

Alquota 20,2480,1580,0100,597

Fraco B0,0710,0730,0050,958

A relao entre os valores de