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RENATA MOURA XAVIER

VARIAÇÕES MENSAIS DOS METABÓLITOS SECUNDÁRIOS DE

DUAS ESPÉCIES DE PLANTAS MEDICINAIS CONHECIDAS COMO

GUACO: MIKANIA GLOMERATA SPRENGUEL E MIKANIA

LAEVIGATA SCHULTZ, AO LONGO DE UM ANO.

CAMPINAS

2015

RENATA MOURA XAVIER

Variações mensais dos metabólitos secundários de duas espécies

de plantas medicinais conhecidas como guaco: Mikania glomerata

Sprenguel e Mikania laevigata Schultz, ao longo de um ano.

CAMPINAS

2015

ORIENTADOR: Profa Dra Alexandra Christine Helena Frankland Sawaya

Dissertação apresentada ao Instituto de

Biologia da Universidade Estadual de

Campinas como parte dos requisitos exigidos

para a obtenção do Título de Mestra em

Ciências, na área de Fármacos, Medicamentos

e Insumos para Saúde.

Campinas, 06 de agosto de 2015.

COMISSÃO EXAMINADORA

AGRADECIMENTOS

A Deus pelas bênçãos concedidas, pelo conforto nas horas difíceis e por ter me

encaminhado por sábios caminhos.

Ao meu pai e irmãos, que são meus verdadeiros amigos, pela educação, carinho e apoio

dado durante todo o percurso da minha vida.

A minha professora, orientadora e amiga Dra Alexandra C H F Sawaya pelos

ensinamentos, estímulos e apoios dados para desenvolvimento deste trabalho até a etapa final.

Aos professores Dra Ildenize, Dr Paulo e Dr Rafael pelas sugestões dadas para o

melhoramento deste trabalho.

Ao Cepagri (UNICAMP) pelas informações fornecidas para o desenvolvimento deste

trabalho.

Aos amigos e colegas do Instituto de Biologia, em especial à Begoña e Cláudia pela

ajuda no desenvolvimento deste trabalho. E muito obrigada a todos os outros pelo apoio em

momentos difíceis e por proporcionarem muitos momentos de descontração.

A todos os nossos amigos pelo apoio e momentos de alegria.

A todos os professores e amigos que nos encaminharam para o trabalho, para a cultura e

para o progresso.

A todos aqueles que acreditaram em nossa capacidade de realização deste trabalho.

Muito Obrigada!

RESUMO

O uso de plantas medicinais e fitoterápicos na política de saúde do Brasil vem sendo

incentivado de maneira crescente por diretrizes governamentais em todos os níveis. O xarope à

base de Mikania glomerata Spreng é atualmente fornecido por postos do Sistema Único de

Saúde (SUS) como fitoterápico para bronquite e tosse. Porém, variações nas concentrações de

princípios ativos, afetando a segurança, qualidade e eficácia esperada dos fitoterápicos, podem

ocorrer devido à época do ano que a droga é coletada e hora do dia da coleta.

O estudo realizado foi referente às variações mensais dos princípios ativos das duas

espécies de guaco de interesse terapêutico (M. glomerata e Mikania laevigata Schultz). Como

ambas constam do 1º Formulário de Fitoterápicos da Farmacopeia Brasileira, aparentemente

podendo ser usadas indiscriminadamente, elas foram estudadas em paralelo. As folhas de

exemplares das duas espécies foram coletadas em três horários diferentes, em um dia por mês

durante um ano, imediatamente congeladas, mantidas congeladas, liofilizadas e os metabólitos

extraídos com água e com solução hidroalcoólica. A composição dos extratos foi avaliada por

cromatografia líquida com espectrometria de massas, acompanhando o teor do seu marcador

(cumarina) e do ácido clorogênico bem como o perfil dos outros componentes majoritários.

A maior variação entre os metabólitos secundários foi encontrada entre as duas espécies:

Mikania glomerata e Mikania laevigata, para os dois tipos de solventes extratores, sendo que o

solvente hidroalcoólico foi mais eficiente para extrair compostos bioativos das duas espécies de

guaco. Maiores teores de cumarina em M. laevigata foram encontrados nos períodos mais frios,

o que mostra um possível efeito da temperatura média do ar na produção dos metabólitos

secundários para esta espécie. Já para M. glomerata foi possível notar a influência de fatores

ambientais como chuva e temperatura média do ar na produção dos metabólitos secundários.

ABSTRACT

The use of medicinal plants and herbal medicine have been encouraged by Brazilian health

politics, in a increasing manner, by government directives in all levels. The syrup of Mikania

glomerata Spreng, is currently provided by health care system (SUS) as a herbal medicine for

bronchitis and cough. However, variations of the active principle, affecting its safety, quality and

effectiveness which is expected from herbal medicines, may occur because of the time of the

year when the drug is collected and also the time of the day in which it´s collected.

The study was related to the monthly variation of the active principle of two species of the

guaco of therapeutic interest (M. Glomerata and Mikania Laevigata Schultz). With both of them

being in the 1st formulary of herbal medicines of the Brazilian Farmacopeia, apparently being

used indiscriminately, they were studied in parallel. The leaves of the two species were collected

in dat three different times of the day, once a month for a year, and immediately frozen and kept

in such a manner, and finally extracted with water and in a hydro alcoholic solution. The

composition the extracts were then analyzed by a liquid chromatography with a mass

spectrometry, following the level of its marker(coumarin) as well as the profile of the other

components.

The main variation between secondary metabolites was found between the species:

Mikania glomerata e Mikania laevigata, for both extractive solvents, but the hydroalcoholic

solvent extracted more efficiently the bioactive compounds of both species of guaco. M. laevigata

seems to suffer principally the influence of air temperature on the production of secondary

metabolites; higher yields of coumarin are found in the colder periods. Diversely, for M. glomerata

it was possible to note the influence of rainy periods and temperature on the production of

secondary metabolites.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Rota biossintética da cumarina e do ácido clorogênico. ---------------------------------------22

Figura 2. Plantas adultas de guaco das espécies Mikania glomerata (A) e Mikania laevigata (B)

cultivadas no campo experimental do Instituto de Biologia da UNICAMP. -----------------------------25

Figura 3. Temperatura do ar em °C (A) e acumulado de chuva em mm (B). Dados obtidos do

Centro de Pesquisas Meteorológicas e Climáticas Aplicadas a Agricultura (CEPAGRI) Unicamp,

de dezembro de 2012 a novembro de 2013. -------------------------------------------------------------------29

Figura 4. Cromatogramas (UHPLC-MS) dos extratos aquosos e hidroalcoólicos das folhas de M.

laevigata e M. glomerata coletadas no mês de dezembro de 2012, obtidos em modo positivo e

negativo. ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------30

Figura 5. Análise dos componentes principais dos íons encontrados nos extratos aquosos e

hidroalcoólicos das folhas de M laevigata e M. glomerata. (A) Amostras vermelhas (extrato

hidroalcoólico de M. glomerata); laranja (extrato aquoso de M. glomerata), azul (extrato aquoso

de M. laevigata) e verde (extrato hidroalcoólico de M. laevigata) (B) loadings ou íons e seus

tempos de retenção. --------------------------------------------------------------------------------------------------31

Figura 6. Variação mensal das áreas dos picos referentes ao íon m/z 147 – cumarina, no extrato

hidroalcoólico das duas espécies de guaco. As médias marcadas pela mesma letra não diferem

estatisticamente entre si (Teste de Tukey ao nível de variância de 5% de probabilidade) dentro

da mesma espécie. Resultados expressos em média e erro padrão. ----------------------------------35

Figura 7. Variação mensal de cumarina no extrato aquoso de M. laevigata. As médias marcadas

pela mesma letra não diferem estatisticamente entre si (Teste de Tukey ao nível de variância de

5% de probabilidade). Resultados expressos em média e erro padrão. --------------------------------35

Figura 8. Relação entre temperatura média do ar no dia da coleta e teor de cumarina (μg / mL)

encontrados no extrato hidroalcoólico (A) e aquoso de Mikania laevigata (B) no período de

dezembro de 2012 a novembro de 2013. -----------------------------------------------------------------------37

Figura 9. Variação mensal de ácido clorogênico no extrato hidroalcoólico de M. glomerata e M.

laevigata. As médias marcadas pela mesma letra não diferem estatisticamente entre si (Teste de

Tukey ao nível de variância de 5% de probabilidade). Resultados expressos em média e erro

padrão. -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------38

Figura 10. Variação mensal dos principais íons encontrados no extrato aquoso de M. glomerata

em modo positivo. As médias marcadas pela mesma letra não diferem estatisticamente entre si

(Teste de Tukey ao nível de variância de 5% de probabilidade). Resultados expressos em média

e erro padrão. ---------------------------------------------------------------------------------------------------------40

Figura 11. Relação entre a temperatura média do ar no dia da coleta e a área do pico do íon m/z

190 (A) e m/z 381 (B), e a relação entre o acumulado de chuva no mês da coleta no período de

dezembro de 2012 a novembro de 2013 e área do pico do íon m/z 474 (C), encontrados no

extrato aquoso de M. glomerata analisado por UHPLC-MS em modo positivo. ----------------------41


em modo negativo. As médias marcadas pela mesma letra não diferem estatisticamente entre si


e erro padrão. ----------------------------------------------------------------------------------------------------------42

Figura 13. Variação mensal dos principais íons encontrados no extrato hidroalcoólico de M.

glomerata em modo positivo. As médias marcadas pela mesma letra não diferem

estatisticamente entre si (Teste de Tukey ao nível de variância de 5% de probabilidade).

Resultados expressos em média e erro padrão. --------------------------------------------------------------43

Figura 14. Relação entre temperatura do ar no dia da coleta de dezembro de 2012 a novembro

de 2013 e área do pico do íon m/z 293(A), 287( B), 302 (C), 255 (D) e 177 (E), encontrados no

extrato hidroalcoólico de M. glomerata analisado por UHPLC-MS em modo positivo. -------------45


glomerata em modo negativo. As médias marcadas pela mesma letra não diferem



Figura 16. Relação entre acumulado de chuva no mês da coleta no período de dezembro de

2012 a novembro de 2013 e área do pico do íon m/z 499 (A) e m/z 399 (B) encontrados no

extrato hidroalcoólico de M. glomerata analisado por UHPLC-MS em modo negativo. ------------47

Figura 17. Variação mensal dos principais íons encontrados no extrato aquoso de M. laevigata



e erro padrão. ----------------------------------------------------------------------------------------------------------48

Figura 18. Relação entre a temperatura média do ar no dia da coleta no período de dezembro

de 2012 a novembro de 2013 e área do pico dos íons m/z 337e 251, encontrados no extrato

aquoso de M. laevigata analisado por UHPLC-MS em modo positivo. ---------------------------------49




e erro padrão. ----------------------------------------------------------------------------------------------------------50


de 2012 a novembro de 2013 e área do pico dos íons m/z 325 (C), m/z 433 (B), m/z 191 (A) e

m/z 487 (D), encontrados no extrato aquoso de M. laevigata analisado por UHPLC-MS em modo

negativo. -----------------------------------------------------------------------------------------------------------------51


laevigata em modo positivo. As médias marcadas pela mesma letra não diferem estatisticamente

entre si (Teste de Tukey ao nível de variância de 5% de probabilidade). Resultados expressos

em média e erro padrão. --------------------------------------------------------------------------------------------52


de 2012 a novembro de 2013 e área do pico dos íons m/z 350 (A) e m/z 286 (B), encontrados

no extrato hidroalcoólico de M. laevigata analisado por UHPLC-MS em modo positivo. -----------53

Figura 23 Variação mensal dos principais íons encontrados no extrato hidroalcoólico de M.

laevigata em modo negativo. As médias marcadas pela mesma letra não diferem





no extrato hidroalcoólico de M. laevigata analisado por UHPLC-MS em modo negativo. ---------55

LISTA DE TABELAS

Tabela1: Metabólitos secundários encontrados e identificados nos extratos aquosos das duas

espécies de guaco-----------------------------------------------------------------------------------------------------32

Tabela 2: Metabólitos secundários encontrados e identificados nos extratos hidroalcoólicos das

duas espécies de guaco ---------------------------------------------------------------------------------------------33

Tabela 3: Teor de cumarina em µg/ml encontrado nos extratos das duas espécies de guaco-------

------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------36

Tabela 4: Teor de ácido clorogênico em µg/ml encontrado no extrato hidroalcoólico de M.

glomerata ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------39

SUMÁRIO:

1 Introdução e Justificativa --------------------------------------------------------------------------------------15

2 Revisão Bibliográfica --------------------------------------------------------------------------------------------17

2.1 Histórico e uso terapêutico -----------------------------------------------------------------------------------17

2.2 Composição dos extratos e rota biossintética de dois componentes: cumarina e ácido

clorogênico --------------------------------------------------------------------------------------------------------------20

2.2.1 Via de biossíntese da cumarina e ácido clorogênico ------------------------------------------------21

3 Objetivo --------------------------------------------------------------------------------------------------------------24

3.1 Objetivo geral -----------------------------------------------------------------------------------------------------24

3.2 Objetivos específicos --------------------------------------------------------------------------------------------24

4 Materiais e Métodos ----------------------------------------------------------------------------------------------25

4.1 Equipamentos -----------------------------------------------------------------------------------------------------25

4.2 Reagentes e Solventes -----------------------------------------------------------------------------------------25

4.3 Material Vegetal ------------------------------------------------------------------------------------------------- 25

4.4 Liofilização e Obtenção dos Extratos Aquosos e Hidroalcoólicos----------------------------------- 26

4.5 Análise dos Extratos por UHPLC-MS -----------------------------------------------------------------------26

4.6 Análise do teor de cumarina e ácido clorogênico --------------------------------------------------------27

4.7 Estatística ----------------------------------------------------------------------------------------------------------28

5 Resultados e Discussão ---------------------------------------------------------------------------------------29

5.1 Condições ambientais durante o período estudado -----------------------------------------------------29

5.2 Variação diária dos íons ----------------------------------------------------------------------------------------34

5.3 Variação mensal de cumarina m/z 147 e ácido clorogênico m/z 353 ------------------------------34

5.4 Cumarina -----------------------------------------------------------------------------------------------------------34

5.5 Ácido clorogênico ------------------------------------------------------------------------------------------------38

5.6 Variações mensais de outros íons nos extratos de M. glomerata -----------------------------------40

5.6.1 Extrato aquoso de M. glomerata analisado por UHPLC-MS em modo positivo ---------------40

5.6.2 Extrato Aquoso de M. glomerata analisado por UHPLC-MS em modo negativo -------------42

5.6.3 Extrato hidroalcoólico de M. glomerata analisado por UHPLC-MS em modo positivo ------43

5.6.4 Extrato hidroalcoólico de M. glomerata analisado por UHPLC-MS em modo negativo -----46

5.7 Variações mensais de outros íons nos extratos de M. laevigata-------------------------------------48

5.7.1 Extrato aquoso de M. laevigata analisado por UHPLC-MS em modo positivo ----------------48

5.7.2 Extrato aquoso de M. laevigata analisado por UHPLC-MS em modo negativo ---------------50

5.7.3 Extrato hidroalcoólico de M. laevigata analisado por UHPLC-MS em modo positivo --------52

5.7.4 Extrato hidroalcoólico de M. laevigata analisado por UHPLC-MS em modo negativo -------54

6 Discussão das variações mensais -------------------------------------------------------------------------56

7 Conclusões ---------------------------------------------------------------------------------------------------------58

8 Referências Bibliográficas -------------------------------------------------------------------------------------59

Anexo I -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------65

Anexo II ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------74

15

1 INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA

A procura por terapias utilizando plantas medicinais para a prevenção, tratamento e

recuperação da saúde, vem sofrendo grande impulso no Brasil [Min. Saúde, 2006 b] [Min.

Saúde, 2008]. Com isso cresce a procura por informações sobre o efeito dos fitoterápicos. Um

bom exemplo é o xarope à base de Mikania glomerata Spreng que é atualmente fornecido por

postos do Sistema Único de Saúde (SUS) como fitoterápico para bronquite e tosse. Porém,

variações nas concentrações de princípios ativos, afetando a segurança, qualidade e eficácia

esperada dos fitoterápicos, podem ocorrer devido à época do ano de coleta. Poucos estudos

referentes às variações dos princípios ativos das duas espécies de guaco de interesse

terapêutico, Mikania glomerata e Mikania laevigata Schultz, foram encontrados. Os estudos

existentes referem-se apenas a variação de teor da cumarina e tratam apenas de uma das

espécies, como ocorre nos estudos realizados por Passari (2014) e Pereira et al (2000).

Portanto este estudo teve como objetivo comparar a variação na composição de extratos

de folhas de M. laevigata e M. glomerata coletadas ao longo do ano. Para evitar que as

variações genéticas entre plantas da mesma espécie afetem os resultados, foram usadas mudas

identificadas destas espécies cresceram no campo experimental do Instituto de Biologia da

Unicamp. O estudo foi baseado na avaliação do teor de cumarina (seu marcador) e ácido

clorogênico (substancia importante encontrada principalmente em M. glomerata) bem como o

perfil dos outros componentes nos extratos de folhas de M. glomerata e M. laevigata. Feita a

coleta as amostras das folhas foram imediatamente congeladas em nitrogênio líquido e

posteriormente congeladas em freezer para serem todas analisadas ao mesmo tempo.

Além dos extratos hidroalcoólicos preconizados nas Farmacopeias, foram obtidos extratos

aquosos para simular o chá de guaco usado popularmente, e ambos os extratos foram

analisados por cromatografia líquida de ultra-alta eficiência com espectrometria de massas. A

16

média (n=3) da área dos picos dos principais íons encontrados foram comparados

estatisticamente, permitindo a identificação de possíveis diferenças significativas que podem

ocorrer em diferentes épocas do ano.

Considerando que as duas espécies são frequentemente usadas indiscriminadamente,

estas foram estudadas comparativamente ao longo do ano a fim de esclarecer dúvidas se

apresentam diferenças na composição e teores de substâncias ativas que podem resultar em

diferenças no tratamento terapêutico do paciente, devido à variabilidade sazonal.

17

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 Histórico e uso terapêutico

O gênero Mikania Wild. apresenta cerca de 430 espécies, distribuídas principalmente nas

Américas do Sul e Central, e somente nove no Velho Mundo. [Barroso, 1958; Ritter; Miotto,

2005]. No Brasil encontra-se cerca de 170 espécies, localizadas entre o sudeste e o sul do

Brasil, com algumas espécies se estendendo até a Argentina, Uruguai e Paraguai [Ritter;

Miotto,2005]. Espécies do gênero Mikania são popularmente conhecidas no Brasil como guaco,

coração de Jesus, guaco-cheiroso, cipó-caatinga, erva de cobra ou guaco trepador [Castro et al.,

2003; Vidal et al., 2006; Bakir et al., 2004].

As duas espécies mais utilizadas pela medicina popular são Mikania laevigata Schultz Bip.

ex Baker e Mikania glomerata Spreng. Tradicionalmente são usadas para várias condições

inflamatórias e alérgicas do sistema respiratório [Freitas et al., 2008] como asma, bronquite e

para acalmar a tosse. Também são usadas para tratar reumatismo [Graça et al., 2007], malária

[Botsaris, 2007], nevralgias [Agra et al., 2008] e picada de cobras [Floriano et al., 2009]. Como

essas espécies compartilham o mesmo habitat e geralmente são encontradas nas regiões

neotropicais, dificilmente são distinguidas, uma vez que, possuem diversas características

químicas, morfológicas e organolépticas em comum. [Gaspareto et al., 2010].

A extinta Central de Medicamentos (CEME) iniciou em 1980 um programa nacional para a

pesquisa nas áreas de atividade de plantas medicinais; o Programa de Pesquisas de Plantas

Medicinais (PPPM). Devido à importância do uso tradicional, o PPPM-CEME avaliou a eficácia e

segurança de M. glomerata, porém a M. laevigata não foi estudada [Ministério da Saúde, Brasil,

2006].

Na última década ressurgiu o interesse em usar medicamentos derivados de plantas

medicinais. A ANVISA emitiu duas resoluções em 2004 referentes a fitoterápicos: a RDC 48

18

[ANVISA, 2004a] determinou como deve ser feito o registro de medicamentos fitoterápicos,

comprovando sua eficácia, segurança e boas práticas de fabricação. A RE 89 [ANVISA, 2004b]

definiu uma lista de 34 espécies de plantas medicinais cuja segurança e eficácia já se

consideravam devidamente comprovados e por isso o registro de fitoterápicos usando estas

plantas poderia ser simplificado. Nesta listagem constam de forma sucinta: o nome cientifico e

nome vulgar da planta, parte usada, os marcadores, formas de uso, indicações, dose, vias de

administração e restrições. Essa lista foi ampliada para 36 espécies na Instrução Normativa (IN-

5) de 2008 [Min. Saúde, 2008]. Acompanhando este renovado interesse em fitoterápicos está a

Portaria 971 [Min. Saúde, 2006] e o Decreto 5813 [Brasil, 2006] instituindo a Política Nacional de

Práticas Integrativas e Complementares (PNPIC) no SUS. O objetivo da proposta do PNPIC era

ampliar as opções terapêuticas dos usuários do SUS (incluindo a Medicina Tradicional Chinesa,

Acupuntura, Termalismo e Homeopatia), sendo que a Fitoterapia se destacou pela possibilidade

de utilizar produtos e conhecimentos de origem nacional. Em 2011 foi lançado o 1º Formulário de

Fitoterápicos da Farmacopeia Brasileira [ANVISA, 2011] com a missão de fornecer formulações

reconhecidas como oficiais que poderiam ser manipuladas para estabelecer um estoque mínimo

em farmácias de manipulação e farmácias vivas. Nela constam 47 plantas medicinais, e algumas

possíveis formulações. Aparecem, por exemplo, as duas espécies, M. glomerata e M, laevigata,

com instruções para preparo de tintura exatamente na mesma proporção de folhas secas para

solvente. Porém, estudos recentes mostraram que a quantidade do marcador (cumarina) varia

de maneira expressiva entre estas duas espécies [Melo e Sawaya, 2015].

Em 2014 a ANVISA determinou a publicação do Guia de orientação para registro de

Medicamento Fitoterápico e registro de notificação de Produto Tradicional Fitoterápico, desta

forma criou-se uma nova classificação, conhecida como Produto Tradicional Fitoterápico. Nela

encontram-se os extratos vegetais de uso tradicional e com efeitos comprovados no país. Logo,

se a indústria escolher por registrar um produto nesta nova categoria, poderá considerar apenas

o seu uso tradicional como critério de eficácia, ou seja, não será mais necessária a realização de

19

estudo clínico. Desde que, seja comprovado o uso seguro e efetivo da planta por um período

mínimo de 30 anos.

Além dos estudos realizados pelo PPPM-CEME, vários ouros estudos avaliaram as

atividades anti-inflamatórias e analgésicas da M. glomerata. O extrato aquoso desta espécie

apresentou atividade analgésica e anti-inflamatória [Rupelt et al., 1991], inibiu o efeito de veneno

de algumas espécies de cobra [Floriano et al., 2009; Maiorano et al., 2005], mas não todas [de

Paula et al., 2010]. Para avaliar o efeito antialérgico do extrato etanólico de M. glomerata, este

foi fracionado e a atividade das frações comparadas com o extrato inicial e com cumarina pura.

A fração mais rica em cumarina, bem como o padrão puro, apresentou efeito menor que o

extrato inicial, indicando que a cumarina não seria a única substância responsável por essa

atividade [Fierro et al., 1999]. Apesar disso, a cumarina, ainda é considerada o único marcador

químico para a espécie. Estudos da atividade bronco dilatadora do extrato de M. glomerata

apresentaram um resultado similar, indicando que esta atividade era causada por cumarina e

também outras substâncias [Moura et al.,2002 ]. Uma fraca atividade antibacteriana também foi

observada [Holetz et al., 2002; do Amaral et al., 2003].

O ácido clorogênico, outra substância importante encontrada em M. glomerata [Melo e

Sawaya, 2015] tem seu efeito terapêutico relacionado com a sua propriedade antioxidante,

sendo muito utilizado como: anti-inflamatório, anti-hipertensivo e antidiabético. [Kempf et al.,

2010; Watanabe et al., 2006].

Extratos de M. laevigata também apresentaram atividade anti-inflamatória [Suyenaga at al.,

2002; Alves et al., 2009], relaxando a traqueia [Graça et al., 2007] e atividade antiulcerogênica

[Bighetti et al., 2005]; estes dois últimos efeitos foram correlacionados com a presença de

cumarina. Estudos comparativos indicaram que o efeito protetor do pulmão, avaliado nos

extratos de ambas as espécies, pode ocorrer por mecanismos diferentes nas duas espécies

[Freitas et al., 2008]

20

2.2 Composição dos extratos e rota biossintética de dois componentes: cumarina

e ácido clorogênico.

Vários estudos encontrados na literatura se referem ao material vegetal pelo nome popular

de guaco, sem especificar a espécie. Notamos que, em diversos artigos e documentos, não há

um consenso sobre a espécie a ser usada, nem se há paridade entre as espécies relativas às

concentrações necessárias para seu uso correto. Nota-se, porém, que as duas espécies são

usadas intercambiavelmente, inclusive pela população [ANVISA, 2011].

Todos os estudos que apresentaram a composição de somente uma espécie, ou que

apenas indicaram o nome popular, nos fornecem apenas informações parciais. Resta sempre a

dúvida se as duas espécies apresentam composição e teores parecidos.

A revisão mais recente [Gaspareto et al., 2010] relata um bom número de substâncias já

identificadas nestas espécies, mas mostra a quase completa inexistência de estudos

comparativos entre as 2 espécies. O fato de uma substância ter sido reportada em uma espécie

e não em outra, não é definitivo, pois frequentemente os estudos usaram métodos diferentes.

Santos et al.(2006) relataram que o extrato de M. glomerata tinha aproximadamente o dobro de

cumarina do extrato de M. laevigata, e que o processo de liofilização afetou a composição e

atividade dos extratos. Bolina et al. (2009) compararam o teor de cumarina em extratos das

duas espécies por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e concluíram que, embora a

M. laevigata tenha apresentado maior teor de cumarina (0,43%) que a M. glomerata (0,30%), as

duas poderiam ser usadas indistintamente; outras substâncias não foram identificadas. Já

Bertolucci et al. (2009) também pesquisaram outras substâncias por HPLC, observando a

presença de terpenos como o ácido caurenóico, benzoilgrandiflórico e cinamoilgrandiflórico em

proporções diferentes em ambas espécies, mas a ausência de ácido o-cumárico e de cumarina

em M. glomerata e 0,30% de cumarina em M. laevigata. Os autores concluíram que havia

21

marcantes diferenças na composição dos extratos das duas espécies, o que contrasta com o

estudo de Bolina et al. (2009). Estudos preliminares desenvolvidos por Melo e Sawaya (2015)

também indicam uma marcante diferença na composição dos extratos das duas espécies, com

baixos teores de cumarina em M. glomerata.

Estas incongruências entre os resultados de diversos estudos sobre as duas principais

espécies de guaco, M. laevigata e M. glomerata, podem ser o resultado de erros na identificação

botânica das amostras, variabilidade genética das espécies com diferentes quimiotipos,

diferenças nas condições de cultivo, diferenças no modo de secagem e extração. Diferenças na

composição química das plantas medicinais devido à época do ano em que é feita a coleta

também devem ser consideradas.

Os princípios ativos de plantas medicinais são produtos do metabolismo secundário, cuja

composição e teores sabidamente variam de acordo com fatores intrínsecos e extrínsecos

[Gobbo-Neto e Lopes, 2007]. As plantas com desenvolvimento rápido (como as Mikanias)

tendem a ter uma concentração maior de metabólitos secundários. Para a utilização de plantas

para fins medicinais é fundamental saber como os teores dos princípios ativos podem variar e,

portanto, influenciar na atividade terapêutica dos fitoterápicos nos pacientes.

Via de biossíntese da cumarina e ácido clorogênico

A biossíntese da cumarina ocorre pela via do ácido o-cumárico [Gestetner & Conn, 1974].

Após a formação do ácido cinâmico, pela enzima fenilalanina amônia-liase (PAL), ele é então

orto-hidroxilado pela ação da enzima cinamato 2-hidroxilase (C2H) produzindo o ácido o-

cumárico. Em seguida, este ácido é então glicosilado e passa por uma isomerização cis-trans da

dupla ligação da cadeia lateral [Kosuge & Conn, 1961] e a formação da cumarina se dá por

lactonização espontânea [Dewick, 1997].

Para biossíntese do acido clorogênico, a primeira reação é a desaminação do aminoácido

fenilalanina, por essa enzima, gerando o ácido trans-cinâmico. Esse ácido é então para-

22

hidroxilado pela enzima cinamato 4-hidroxilase (C4H) para produzir o ácido p-coumárico, que é

ativado pelo tio éster CoA correspondente, pela enzima 4-coumarato CoA ligase (4CL),

resultando no ρ-coumaroil CoA, seguido da hidroxilação do coumaroil pela enzima C3’H,

formando o ácido clorogênico [Schilmiller et al., 2009].

Os núcleos benzo-2-pirona comuns na biossíntese da cumarina e do ácido clorogênico

derivam do esqueleto fenilacrílico do ácido cinâmico.

NH2

O

OH

O

OH

OH O

OH

Fenilalamina Ácido cinâmico Ácido o- cumárico

O

OH

OH

O

OH

OH

O

OH

SH

O O

OH

OH

OH

O

OH

O

O

OH

OH

Figura 1. Rota biossintética da cumarina e do ácido clorogênico.

NH2

PAL

Fenilanina

amônia liase

C2H

Glicose

Β-D-glicosideo do ácido cumárico

Cumarina

Lactonização espontânea

Ácido p-cumárico

CoA

P-cumaril quinato

Ácido clorogênico

C3H

C4H

C4Cl

P-cumaril CoA

HCT

2 coumarato

23

A produção de metabólitos secundários é o reflexo da interação química entre a planta e

fatores ambientais, desta forma, como já foi citado por Gobbo-Neto e Lopes (2007), a síntese é

frequentemente afetada pelas condições ambientais tais como:

Nutrientes: a deficiência de nutrientes como carbono e nitrogênio no solo, pode levar a

uma menor taxa de desenvolvimento da planta.

Chuva: que afeta diretamente o processo de fotossíntese, a mobilização de reservas e o

crescimento.

Temperatura do ar e do solo: talvez estes sejam os fatores de maior influência sobre a

produção de metabólitos secundários, uma vez que, está diretamente relacionado com o

desenvolvimento da planta.

Altitude: muitas vezes em maiores altitudes as plantas ficam mais susceptíveis a exposição

da radiação ultravioleta.

Índice de radiação ultravioleta: os compostos fenólicos possuem a função de protegerem

as plantas contra a foto destruição, estando presentes em maior quantidade quando a incidência

de luz é maior (Waterman, Mole, 1994; Tatini et al , 2004).

Poluição atmosférica: pode alterar o metabolismo de alguns derivados fenólicos devido ao

aumento nos teores de O3 e CO2.

Ciclo dia - noite: podem ocorrer variações circadianas, principalmente em óleos voláteis.

Ataque de patógenos ou indução por estimulo mecânico: as plantas tendem a produzir

mais de alguns metabólitos em resposta ao ataque sofrido como forma de defesa.

Todos estes fatores citados, muitas vezes podem influir em conjunto no metabolismo

secundário das plantas, não atuando isoladamente [Gobbo-Neto e Lopes, 2007]. Para as plantas

cujo estudo é realizado no campo devemos ainda considerar as alterações que ocorrem devido

ao metabolismo primário (por exemplo, as alterações hormonais) e devem ser consideradas em

conjunto.

Para evitar que as variações genéticas entre as plantas da mesma espécie afetem os

resultados, foram usadas plantas identificadas destas espécies e que cresceram no campo

experimental do Instituto de Biologia da Unicamp.

24

3. OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GERAL

Acompanhar a variação dos metabólitos secundários de duas espécies de plantas

medicinais conhecidas popularmente como guaco: Mikania glomerata Sprenguel e Mikania

laevigata Schultz, ao longo de um ano.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Comparar a composição de extratos hidroalcoólicos e aquosos de folhas de Mikania

laevigata e Mikania glomerata coletadas mensalmente.

Comparar as variações mensais de metabólitos secundários nas duas espécies.

Determinar as concentrações de cumarina e ácido clorogênico nos extratos de folhas de

Mikania laevigata e Mikania glomerata coletadas mensalmente.

Avaliar a relação das variações observadas nos metabolitos secundários com a

temperatura do ar e chuva na região.

25

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Equipamentos

®Liofilizador Liotop ٭ modelo L1O1

®Banho ultrassônico Unique ٭ USC1400

Balança analítica Marte modelo AM 550 ٭

®Balança semi-analítica BEL Enginnering ٭ modelo Mark 500

Cromatógrafo a Líquido de Ultra-Alta Eficiência - UPLC - TQD Acquity (Waters - USA)٭

acoplado a Espectrômetro de massas TQD ESI Acquity (Waters - USA)

4.2 Reagentes e solventes

Álcool etílico grau PA (Ecibra ®)٭

Ácido fórmico 85% grau PA (Synth ®)٭

Acetonitrila grau HPLC (J.T. Baker ®)٭

Padrão de cumarina (Sigma Aldrich ®)٭

Padrão de ácido clorogênico (Sigma Aldrich ®)٭

4.3 Material vegetal:

Matrizes de plantas adultas de guaco, das espécies Mikania glomerata e Mikania laevigata,

obtidas do Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas da Unicamp –

CPQBA – Unicamp (Paulínia – SP), foram adaptadas e cresceram no campo experimental do

Instituto de Biologia, UNICAMP. Suas exsicatas estão depositadas no herbário da Universidade

Estadual de Campinas sob egistro nº 102046 para a M. laevigata e nº 102047 para a M.

glomerata.

Figura 2. Plantas adultas de guaco das espécies Mikania glomerata (A) e Mikania

laevigata (B) cultivadas no campo experimental do Instituto de Biologia da UNICAMP.

A B

26

Amostras das folhas foram coletadas de manhã entre 08:00 e 9:00, no meio do dia entre

12:00 e 13:00 e a tarde entre 15:30 e 16:30 em um mesmo dia do mês. Este procedimento foi

repetido mensalmente entre os meses de dezembro de 2012 e novembro de 2013. As folhas das

duas espécies de guaco coletadas foram imediatamente congeladas em nitrogênio líquido e

mantidas em freezer a -80°C.

4.4 Liofilização e obtenção dos extratos aquosos e hidroalcoólicos

O processo de secagem das folhas foi realizado com estas ainda congeladas, em

liofilizador por 50 horas, como já foi realizado no estudo realizado por Melo (2015) e apontou não

interferir no teor de metabolitos encontrados. Posteriormente, as mesmas foram trituradas em

gral de porcelana e tamisadas a fim de se obter a droga vegetal com granulometria inferior a

0,84 mm, sendo esta utilizada para o preparo dos extratos.

Avaliamos os extratos hidroalcoólicos das folhas por ser a extração preconizada nos

compêndios oficiais [ANVISA, 2011]. Desta forma, 1g das folhas pulverizadas foi extraído com

10 mL de uma solução de com etanol 70% em banho de ultrassom por 30 minutos e filtradas.

Depois de preparados os extratos hidroalcoólicos estes foram diluídos em água purificada milli-Q

na proporção 1:2 extrato-água.

Os extratos aquosos foram obtidos mantendo 1 g de folhas pulverizadas em infusão com

10 mL de água purificada milli-Q aquecida a 60°C em banho de ultrassom por 30 minutos e

filtradas. Depois de preparados os extratos aquosos foram diretamente injetados para serem

analisados por UPLC-MS.

4.5 Análise dos extratos por cromatografia líquida de ultra-alta eficiência acoplada a

espectrometria de massas (UHPLC-MS)

Uma alíquota de 2µL de cada extrato foi analisada por cromatografia líquida de ultra alta

eficiência acoplada ao espectrômetro de massas triplo-quadrupolar TQD Acquity (Waters - USA).

Utilizou-se uma coluna C18 (50 mm x 2,1mm x1,7µm). A detecção foi feita por um espectrômetro

de massas (TQD-Acquity da Waters) com fonte de ionização por eletrospray (ESI), realizando

varredura em modo positivo e modo negativo nas seguintes condições: capilar de ± 3000 V,

cone de ± 35 V, extrator de 1,0 V, temperatura da fonte de 150 °C e temperatura de

dessolvatação de 300 °C. As análises UHPLC-MS adquiridas em modo de varredura, entre m/z

100 a 1000, em modo positivo e negativo, obtendo assim o perfil cromatográfico da composição

do extrato. Os cromatogramas resultantes foram comparados entre si para determinar a relação

27

massa/carga (m/z) dos principais íons e picos encontrados nos cromatogramas das amostras,

seguida da extração das áreas dos picos e finalmente a fragmentação (MS-MS) dos principais

íons marcadores. As injeções de cada amostra foram feitas em duplicata.

Como os extratos trabalhados aqui possuem moléculas em solução que são compatíveis

com os solventes mais frequentemente usados em HPLC por fase reversa (metanol, água e

acetonitrila), a ionização por ESI foi escolhido neste estudo pode ser usada como interface entre

separações por HPLC ou UHPLC e identificação dos compostos por espectrometria de massas

simples (MS) ou sequencial (MS/MS). Para analisar moléculas [M] com sítios básicos como a

cumarina foi adicionado 0,1 % de ácido fórmico na solução facilitando a protonação do analito,

formando íons [M + H]+ e sua análise foi feita em modo positivo. Para moléculas contendo sítios

ácidos como o ácido clorogênico ocorreu a perda de um próton da molécula, formando [M - H]- e

análise foi feita em modo negativo [Sawaya, 2006].

4.6 Análises do teor de cumarina e ácido clorogênico

A validação do método desenvolvido para a quantificação da cumarina e do ácido

clorogênico foi realizado com base nos critérios da RE n° 899 de 29 de maio de 2003 da ANVISA

e já havia sido realizada por Melo e Sawaya (2015).

Após a avaliação qualitativa inicial dos extratos preparados (extrato aquoso e

hidroalcoólico), o teor da cumarina foi quantificado, comparando a área dos picos encontrados

com uma curva de calibração construída a partir da diluição seriada de uma solução estoque dos

padrões, preparadas na concentração de 1 mg.mL-1 ( diluições de 1 μg.mL-1 a 100 μg.mL-1) em

solução do extrato isento dos analitos de interesse. A quantificação foi feita comparando a média

da área (n=3) dos picos dos íons com uma curva de calibração (R2=0,9908) para a cumarina e

com uma curva de calibração (R²=0,9863) para o ácido clorogênico.

28

4.7 Estatística

O tratamento estatístico foi realizado para as áreas de picos encontrados por UHPLC-MS

em modo TIC nos cromatogramas dos extratos aquosos e dos extratos hidroalcoólicos de ambas

as espécies.

Os dados resultantes das áreas dos picos dos principais íons foram agrupados e tabulados

de diferentes formas no programa Microsoft Office Excel 2010, obtendo gráficos para visualizar

se houve variação ao longo dos meses na composição dos extratos aquosos e hidroalcoólicos.

Ainda foi calculada a média (n=3) e o erro padrão da área de cada um dos íons principais.

Foi realizada uma análise multivariada PCA, com o software The Unscrambler

10.2, com todas as áreas geradas pelos picos resultantes dos principais íons obtidos pelos

cromatogramas. Os dados encontrados foram previamente autoescalados e normalizados pelas

médias para que pudéssemos padronizá-los.

Para complementar os resultados, os dados obtidos da área do pico do íon por UHPLC-MS

foram submetidos à análise de variância (ANOVA), sendo cada média obtida de três coletas

realizadas em três horários de um mesmo dia, uma vez ao mês Os resultados foram expressos

como média ± erro padrão e foram comparados pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade (p <

0,05).

29

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 Condições ambientais durante o período estudado:

Segundo a classificação de Köppen, o clima na região de Campinas é do tipo Cfa, ou seja,

clima temperado subtropical, com as estações de inverno e verão bem definidas e chuvas

distribuídas durante todo ano com intensidade maior nos meses de verão [Peel, Finlayson,

McMahon, 2007].

A Figura 3 mostra que no período de realização das coletas, de dezembro de 2012 a

novembro de 2013, houve períodos chuvosos durante todos os meses do ano, sendo que, os

meses com maiores volumes de chuva foram dezembro 2012 com 153 mm, março com 362 mm,

janeiro com 220 mm O mês mais seco foi maio com 5 mm de precipitação. Quanto ao regime

térmico, o mês com maior temperatura média foi dezembro com 31°C, cujo valor máximo chegou

a 37°C. O mês de menor temperatura média foi julho com temperatura média de 20°C e o valor

mínimo do período foi registrado no mês de agosto (6,5°C).

Deste modo, vemos que, em geral, a temperatura e regime de chuvas durante o período

avaliado se encaixaram na classificação. Porem nos dias de coleta em fevereiro e março as

temperaturas médias foram de 25°C, sendo que em maio a temperatura média no dia da coleta

foi de 27°C, ou seja maior que no verão. Portanto as condições climáticas em certos dias nem

sempre seguem o padrão da classificação de Köppen.

Figura 3. Temperatura do ar em °C (A) e acumulado de chuva em mm (B). Dados obtidos do

Centro de Pesquisas Meteorológicas e Climáticas Aplicadas a Agricultura (CEPAGRI) Unicamp,

de dezembro de 2012 a novembro de 2013.

30

Os extratos aquosos e hidroalcoólicos obtidos a partir das folhas de M. glomerata e M.

laevigata foram analisados através de UHPLC-MS, com ionização em eletrospray (ESI) com

varredura em modo positivo e negativo e foram obtidos os cromatogramas abaixo.

Comparando os cromatogramas da Figura 4 podemos notar que o perfil cromatográfico

(UHPLC-MS) dos extratos aquosos e hidroalcoólicos obtidos em modo positivo e negativo das

folhas de M. glomerata e de M. laevigata não apresenta semelhança entre as espécies.

Figura 4. Cromatogramas (UHPLC-MS) dos extratos aquosos e hidroalcoólicos das folhas de M.

laevigata e M. glomerata coletadas no mês de dezembro de 2012, obtidos em modo positivo e

negativo.

Extrato Aquoso de M. laevigata em modo -

Extrato Hidroalcoólico de M. glomerata em modo + Extrato Hidroalcoólico de M. laevigata em modo +

Extrato Hidroalcoólico de M. glomerata em modo - Extrato Hidroalcoólico de M. laevigata em modo -

Extrato Aquoso de M. glomerata em modo + Extrato Aquoso de M. laevigata em modo +

Extrato Aquoso de M. glomerata em modo -

Cumarina

Cumarina

31

A cumarina (m/z 147, tempo de retenção 3.8 min) é o principal pico observado no

cromatograma UHPLC-MS (modo positivo) do extrato aquoso e hidroalcoólico de M. laevigata

(Figura 4). Considerada marcador químico destas espécies, a cumarina foi claramente

encontrada nos extratos aquosos e hidroalcoólicos de M. laevigata, confirmando a presença de

cumarina em grande abundância nesta espécie, como já citado por Melo e Sawaya (2015). Já

nos extratos da M. glomerata, este íon não se distinguia do ruído, portanto estava em baixa

concentração ou ausente nestes extratos.

Na Figura 5 observamos uma análise de componentes principais de todas as corridas

cromatográficas realizadas. Este estudo foi feito em uma tabela com todas as áreas geradas

pelos picos resultantes dos principais íons obtidos pelos cromatogramas e permite observar a

variação de metabólitos secundários encontrados nas duas espécies de guaco estudadas aqui.

A maior diferença é observada entre as duas espécies (Fig. 5A) e essa diferença está

relacionada principalmente a presença de cumarina (m/z 147) em grande quantidade na M.

laevigata (Fig. 5B). As amostras de M. glomerata foram divididas em dois grupos de acordo com

o solvente extrator, mostrando a maior eficiência do solvente hidroalcoólico.

Figura 5. Análise dos componentes principais dos íons encontrados nos extratos aquosos e

hidroalcoólicos das folhas de M laevigata e M. glomerata. (A) Amostras vermelhas (extrato

hidroalcoólico de M. glomerata); laranja (extrato aquoso de M. glomerata), azul (extrato aquoso

de M. laevigata) e verde (extrato hidroalcoólico de M. laevigata) (B) loadings ou íons e seus

tempos de retenção.

B A

32

Os principais picos e seus respectivos íons foram selecionados. Desta forma, foi possível

identificar alguns compostos que já são conhecidos nas duas espécies, por comparação com

padrões ou dados da literatura, como mostram as tabelas 1 e 2.

Tabela1: Metabólitos secundários encontrados e identificados nos extratos aquosos das duas

espécies de guaco.

Compostos marcados por * não foram detectados

Estrutura Química Referências

mz / tr (modo) Composto M. glomerata M. laevigata

147/3,84 (+) Cumarina * Detectado

Alves et al., 2009 , Biavatti et al., 2004 ,

Bighetti 2005 , FB04, Fernandes and Vargas

2003, Ferreira and Oliveira 2010, Muceneeki et

al., 2009- , Pedroso 2007-, Rufatto et al., 2013,

Yatsuda et al., 2005,

325/2,51 (-) Cis ou Trans melilotosídeo * Detectado Ferreira ; Oliveirra 2010

133/0,81 (-) Ácido Málico Dectectado Detectado

163/3,48 (-) Ácido o ou p cumárico * Detectado

Braz 2012, Peregrino and Leitão, 2005 , Taleb

contini -2006, Veneziani and Oliveira., 1999

Muceneeki et al., 2009, Pedroso 2007, Rufatto

et al., 2013.

Compostos Encontrados no Extrato Aquoso

O O

OH

O

O O

OH

OH

OH

OH

O

OH

OH

O

OH

OH

OH

O

33

Tabela 2: Metabólitos secundários encontrados e identificados nos extratos hidroalcoólicos das

duas espécies de guaco.

Compostos marcados por * não foram detectados

Estrutura Química Referências

mz / tr (modo) Composto M. glomerata M. laevigata

147/3,84 (+) Cumarina Detectado Detectado

Alves et al., 2009 , Biavatti et al., 2004 ,

Bighetti 2005 , FB04, Fernandes and Vargas

2003, Ferreira and Oliveira 2010, Muceneeki et

al., 2009- , Pedroso 2007-, Rufatto et al., 2013,

Yatsuda et al., 2005,

325/2,51 (-) Cis ou Trans melilotosídeo * Detectado Ferreira ; Oliveirra 2010

133/0,81 (-) Ácido Málico Dectectado Detectado

163/3,48 (-) Ácido o ou p cumárico * Detectado

Braz 2012, Peregrino and Leitão, 2005 , Taleb

contini -2006, Veneziani and Oliveira., 1999

Muceneeki et al., 2009, Pedroso 2007, Rufatto

et al., 2013.

353/3,36 (-) Ácido clorogênico Detectado Detectado da Silva , 2006.

121/3,60 (-) p hidroxibenzaldeido * Detectado Ferreira; Oliveira, 2010

515/3,35 (-) Ácido dicafeoilquínico Detectado *

Compostos Encontrados no Extrato Hidroalcoólico

O O

OH

O

O O

OH

OH

OH

OH

O

OH

OH

O

OH

OH

OH

OH

O

OH

O

O

OH

OH

OH

O H

OH

OH

O

OH

OH

O

O

OHOH

OO

OH

O

OH

OH

34

5.2 Variação diária dos íons

Para as duas espécies, nos extratos aquosos e hidroalcoólicos, não houve diferença

significativa nos picos dos principais íons m/z encontrados em três diferentes horários de um

mesmo dia (ver anexo I, figuras 1 a 8). Deste modo as amostras obtidas nos três períodos do

mesmo dia foram usadas como replicatas biológicas (n=3) para fins estatísticos em todas as

análises.

5.3 Variação mensal de cumarina m/z 147 e ácido clorogênico m/z 353

Considerando que a cumarina é o marcador químico das duas espécies de guaco aqui

estudadas [ANVISA, 2011] e os ácidos cafeoilquínicos, dentro destes o ácido clorogênico, são os

principais compostos encontrados em M. glomerata [Melo e Sawaya, 2015]. Estes foram

avaliados separadamente nos extratos aquosos e hidroalcoólicos das duas espécies.

5.4 Cumarina

O estudo permitiu compararmos a variação mensal das médias das áreas dos picos

encontrados do íon m/z 147 – cumarina, nas duas espécies de guaco. Na análise dos dados, foi

aplicado o Teste de Tukey e considerados como significativas diferenças de p<0,05. As médias

marcadas na Figura 6 pela mesma letra não diferem estatisticamente entre si. Podemos notar

que o teor de cumarina (expressos como áreas dos picos nos cromatogramas) nos extratos

hidroalcoólicos das duas espécies estudadas variam significativamente entre espécies, como já

foi observado anteriormente por Melo (2015). As espécies foram marcadas por bolas (M.

laevigata) e quadrados (M. glomerata), desta forma nota-se que a espécie Mikania laevigata

possui maior teor de cumarina que a Mikania glomerata durante todo o ano.

Nota-se ainda que dentro da mesma espécie (representados pelas letras maiúsculas A-D)

o teste não demonstrou haver variação mensal significativa no teor de cumarina para M.

glomerata, ou seja, o mês em que foi realizada a coleta não interferiu no teor de cumarina

encontrado no extrato hidroalcoólico. Já para M. laevigata, o teste aplicado indicou haver

diferenças significativa entre os teores de cumarina encontrados em diversos meses do ano.

Podemos ver que nos meses de novembro, dezembro e janeiro as áreas encontradas eram

semelhantes entre si (meses marcados com a letra D), porém, reduzem de forma significativa

dos meses de fevereiro, abril, maio e junho (A). Já o teor de cumarina encontrada nos meses de

março, agosto (mês de floração) e setembro não apresentaram diferenças significativas quando

comparados entre si e nem quando comparados com os outros meses.

35

Figura 6. Variação mensal das áreas dos picos referentes ao íon m/z 147 – cumarina, no extrato

hidroalcoólico das duas espécies de guaco. As médias marcadas pela mesma letra não diferem

estatisticamente entre si (Teste de Tukey ao nível de variância de 5% de probabilidade) dentro

da mesma espécie. Resultados expressos em média e erro padrão.

Conforme foi mostrado na figura 4 a cumarina foi o principal pico observado no

cromatograma do extrato aquoso de M. laevigata. Já nos extrato aquosos de M. glomerata, este

íon não se distinguia do ruído, portanto, estava em baixa concentração ou ausente neste extrato.

Desta forma não foi possível quantificá-lo e nem analisar variações mensais significativas.

A cumarina no extrato aquoso de M. laevigata apresentou variações significativas com p<

0,05 entre o mês de fevereiro (maior pico) e os meses de outubro e novembro (menor pico)

como podemos ver na Figura 7. O extrato aquoso obtido mês de fevereiro apresentou a maior

área correspondente à cumarina do ano, da mesma forma que o extrato etanólico obtido no

mesmo mês.

Figura 7. Variação mensal de cumarina no extrato aquoso de M. laevigata. As médias marcadas

pela mesma letra não diferem estatisticamente entre si (Teste de Tukey ao nível de variância de

5% de probabilidade). Resultados expressos em média e erro padrão.



36



solução do extrato isento dos analitos de interesse. A quantificação foi feita comparando a área

dos picos com uma curva de calibração (R2=0,9908), conforme mostrado na tabela 3.

Tabela 3: Teor de cumarina em µg/ml encontrado nos extratos das duas espécies de guaco.

A tabela 3 mostra presença de cumarina em menor quantidade no extrato hidroalcoólico de

M. glomerata, o que confirma a diferença entre as duas espécies estudadas aqui. Confirma

também a maior solubilidade da cumarina em extratos hidroalcoólicos, onde podemos observa

que o teor de cumarina encontrado em M. laevigata em todos os meses mostrou-se

significativamente maior quando comparado com o extrato aquoso, confirmando novamente a

maior solubilidade de cumarina no solvente hidroalcoólico.

Como no extrato hidroalcoólico de M. laevigata, foi observada variação significativa do teor

de cumarina (p<0,05) entre diversos meses (Figura 6); foi efetuado um estudo para verificar a

influência de fatores climáticos (Figura 8) no teor de cumarina desta espécie, sendo eles:

temperatura média do ar no dia da coleta, e índice pluviométrico no mês da coleta.

Pode-se notar que no extrato aquoso e principalmente do extrato hidroalcoólico de M.

laevigata ficou nítido que a época de coleta das folhas de guaco influenciou no teor de cumarina

encontrado nas folhas desta espécie. Ao correlacionarmos com alguns fatores climáticos nota-se

que as folhas coletadas no período de inverno e em meses que ocasionalmente foram mais frios

como, por exemplo, fevereiro e maio, houve um maior teor de cumarina, demonstrando

influencia da temperatura média no dia da coleta com o teor de cumarina. Estes dados vem de

encontro com o estudo realizado por Pereira et al (2000), onde também foi observado maior

rendimento de cumarina nos meses mais frios, com condições climáticas semelhantes às de

Campinas, SP com temperaturas mais baixas e sem a presença de chuva.

Dez Jan Fev Mar Abr Maio Jun Jul Ago Set Out Nov

179 173 305 164 234 188 233 204 211 227 162 164

300 283 823 580 708 738 753 656 552 507 291 393

56 58 61 59 55 58 55 55 57 55 58 57Extrato Hidroalcoólico de M. glomerata

Teor de Cumarina µg/ml

Extrato / Espécie

Extrato Aquoso de M. laevigata

Extrato Hidroalcoólico de M. laevigata

37

Figura 8. Relação entre temperatura média do ar no dia da coleta e teor de cumarina (μg / mL)

encontrados no extrato hidroalcoólico (A) e aquoso de Mikania laevigata (B) no período de

dezembro de 2012 a novembro de 2013.

Embora no extrato aquoso tenha se observado a influência da temperatura sobre o teor de

cumarina, notamos que no extrato hidroalcoólico essa influência foi mais nítida, pois a água

tende a extrair componentes com polaridade mais alta e menor teor de cumarina. Para o extrato

hidroalcoólico de M. glomerata não foi feita a correlação entre as variáveis porque nesta espécie,

não houve diferença significativa mensal.

38

5.5 Ácido clorogênico

A Figura 9 mostra a variação mensal das médias das áreas dos picos encontrados do íon

m/z 353 – ácido clorogênico, nos extratos hidroalcoólicos das duas espécies de guaco. Na

análise dos dados, foi aplicado o Teste de Tukey ao nível de variância de 5% de probabilidade (p

<0,05). As médias (n=3) marcadas pela mesma letra dentro da mesma espécie não diferem

estatisticamente entre si, podemos notar que entre as duas espécies estudadas há variação

significativa na área do pico encontrado de ácido clorogênico; mostrando que a espécie Mikania

laevigata possui menor teor de ácido clorogênico quando comparada a Mikania glomerata.

Percebe-se também que dentro da mesma espécie não houve diferenças significativa entre

extratos das folhas de M. laevigata, ou seja, o mês em que foi realizada a coleta não interferiu no

teor de ácido clorogênico encontrado. Já na M. glomerata, o teste aplicado indicou uma variação

significativa entre os meses do ano. Podemos ver que, no mês de julho, que também foi o mês

mais frio e ainda ocorreu floração, houve redução significativa da média da área do pico deste

íon. O teste apontou variação significativa entre o mês de julho e os meses de janeiro, março,

junho, agosto e setembro, apresentando (p<0,05).

Figura 9. Variação mensal de ácido clorogênico no extrato hidroalcoólico de M. glomerata e M.

laevigata. As médias marcadas pela mesma letra não diferem estatisticamente entre si (Teste de

Tukey ao nível de variância de 5% de probabilidade). Resultados expressos em média e erro

padrão.



39



solução do extrato isento dos analitos de interesse. A quantificação foi feita comparando a área

dos picos com uma curva de calibração (R2=0,9863), obtendo-se os teores da tabela 4.

Tabela 4: Teor de ácido clorogênico em µg/ml encontrado no extrato hidroalcoólico de M.

glomerata.

A tabela 4 mostra o teor de ácido clorogênico encontrados nos extratos hidroalcoólicos de

M. glomerata. Nota-se que este ácido está claramente presente nesta espécie. Já na outra

espécie estudada aqui, M. laevigata, apesar de detectados em algumas amostras, o mesmo

estava em quantidades muito baixas ou fora do limite de detecção e não foi possível a sua

quantificação.

Foram obtidas informações climáticas de temperatura e precipitação em Campinas durante

o período, porém, o ácido clorogênico não apresentou correlação com estes dois fatores. Não foi

possível obter dados sobre a radiação incidente, apesar da radiação incidente em determinadas

épocas do ano poder influenciar o teor de ácido clorogênico. Segundo Waterman e Mole (1994)

a rota biossintética dos fenilpropanoides é influenciada pela luz e desta forma induzindo as

enzimas evolvidas na rota de sua biossíntese. Portanto compostos como o ácido clorogênico são

produzidos na planta com a finalidade de protegê-la da foto destruição, uma vez que, estes

compostos são capazes de absorver e ou dissipar a energia solar, agindo como uma barreira

para se evitar danos nos tecidos interno, ou seja, como um filtro UVB (Waterman, Mole 1994;

Tatini et al, 2004).

Dez Jan Fev Mar Abr Maio Jun Jul Ago Set Out Nov

253 453 346 534 162 385 483 86 416 422 235 341

Teor de ácido clorogênico µg/ml

Extrato / Espécie

Extrato Hidroalcoólico de M. glomerata

40

5.6 Variações mensais de outros íons nos extratos de M. glomerata

5.6.1 Extrato aquoso de M. glomerata analisado por UHPLC-MS em modo

positivo

Ao analisarmos os principais íons encontrados no extrato aquoso de M. glomerata por

UHPLC-MS em modo positivo, notamos que em alguns íons ocorre variação mensal,

apresentando diferenças significativas (p<0,05) na área dos picos encontrados entre alguns

meses, como ocorre com os íons 291, 381, 219, 294, 190, 474 e 369. Já os íons m/z 350 e 412

não apresentaram variação significativa, dados apesentados na Figura 10.




e erro padrão.

41

Para os íons que apresentaram variações significativas nas áreas em diversos meses foi

avaliado se havia correlação entre a área dos picos com a temperatura média do ar no dia da

coleta ou com o volume de chuva no mês. As relações estão expressas na Figura 11. O íon m/z

190 apresentou correlação positiva entre a temperatura do ar e área do íon encontrada, ou seja,

a área do pico do íon obtido por UHPLC aumenta conforme o aumento da temperatura média. Já

o íon m/z 382 apresenta uma correlação negativa, onde a área do pico do íon encontrado tende

a diminuir com o aumento da temperatura média do ar. Dos íons encontrados no modo positivo o

único que apresentou correlação com a chuva foi o m/z 474 que tende a aumentar a área do

pico do íon em meses mais chuvosos.

Figura 11. Relação entre a temperatura média do ar no dia da coleta e a área do pico do íon m/z

190 (A) e m/z 381 (B), e a relação entre o acumulado de chuva no mês da coleta no período de

dezembro de 2012 a novembro de 2013 e área do pico do íon m/z 474 (C), encontrados no

extrato aquoso de M. glomerata analisado por UHPLC-MS em modo positivo.

Ár

ea

do

pic

o

do

íon

Ár

ea

do

pic

o

do

íon

Ár

ea

do

pic

o

do

íon

42

5.6.2 Extrato Aquoso de M. glomerata analisado por UHPLC-MS em modo negativo

A figura 12 mostra que nos principais íons encontrados no extrato aquoso de M. glomerata

ocorrem variações mensais significativas com p<0,05 ao longo do ano.




e erro padrão.

Para os íons que apresentaram variações significativas nas áreas em diversos meses foi

avaliado se havia correlação entre a área dos picos com a temperatura média do ar no dia da

coleta ou com o volume de chuva no mês. Em nenhum destes íons houve uma correlação nítida

com estes dois fatores ambientais, quando avaliados isoladamente. Neste caso a correlação

com fatores ambientais podem estar ocorrendo com mais de um fator ao mesmo tempo e ainda

devemos considerar as alterações endógenas ocorridas nas plantas em determinadas épocas.

43

5.6.3 Extrato hidroalcoólico de M. glomerata analisado por UHPLC-MS em modo

positivo

A Figura 13 apresenta como os principais íons encontrados em modo positivo no extrato

hidroalcoólico de M. glomerata variam mensalmente ao longo do ano. Nota-se que dentre os

íons selecionados o único que não apresentou variação significativa mensal foi a cumarina como

já foi discutida anteriormente. Os demais íons apresentaram diferenças significativas p<0,05

entre os meses do período estudado.


glomerata em modo positivo. As médias marcadas pela mesma letra não diferem


Resultados expressos em média e erro padrão.

44

Os íons que apresentaram diferenças significativas (p<0,05) nas áreas dos picos mensais foram

comparados com as variáveis climatológicas de chuva e temperatura no período da coleta, como

mostra a Figura 14. Os íons que apresentaram correlações com variáveis climáticas estão

apresentados a seguir.

O íon m/z 293 apresentou aumento significativo na área média do pico encontrado nos

meses de junho, julho (mês de floração) e agosto de 2013, como mostram as Figuras 13 e 14.

Na Figura 14 podemos ver que no período de inverno como temperaturas médias mais baixas no

dia da coleta e que variaram de 21 a 24 oC, foram encontrados as maiores áreas médias do pico

do íon. Nota-se que no mês mais quente, em dezembro de 2012 a temperatura média no dia da

coleta foi de 31 oC, foi encontrado a menor área média do pico do íon m/z 293, sinalizando que a

quantidade deste metabólito pode estar sendo influenciado pela temperatura do ar. Já os íons

m/z 287, 255, 302 e 177 apresentaram diminuição significativa nas áreas medias nos meses de

junho e julho, meses mais frios, mostrando que a temperatura no dia da coleta pode estar

influenciando a área do pico do íon encontrado. Ou seja, nos meses com temperaturas medias

mais baixas a área encontrada tende a ser menor que nos meses com temperaturas médias

mais elevadas como mostra a Figura 14.

45

Figura 14. Relação entre temperatura do ar no dia da coleta de dezembro de 2012 a novembro

de 2013 e área do pico do íon m/z 293(A), 287( B), 302 (C), 255 (D) e 177 (E), encontrados no

extrato hidroalcoólico de M. glomerata analisado por UHPLC-MS em modo positivo.

Não houve correlação observada entre a área do pico dos principais íons encontrados no

extrato hidroalcoólico de M. glomerata vistos em modo positivo com os volumes de chuva

ocorridos ao longo do período estudado.

46

5.6.4 Extrato hidroalcoólico de M. glomerata analisado por UHPLC-MS em modo

negativo

Nota-se na Figura 15 que no extrato hidroalcoólico de M. glomerata quando visto em

modo negativo, todos os íons apresentam alguma diferença significativa (p<0,05) entre as

médias mensais ao longo do ano.


glomerata em modo negativo. As médias marcadas pela mesma letra não diferem



Ao correlacionarmos a variabilidade identificada mensalmente nos principais íons

encontrados no extrato hidroalcoólico de M. glomerata em modo negativo com as variações

climáticas ocorridas durante o período experimental (Figura 16) é possível notar que, o volume

47

de chuvas possivelmente influenciou a variação destes metabólitos. O pico do íon m/z 499

apresentou áreas médias maiores nos períodos mais chuvosos como em março e janeiro, e área

menor em agosto e setembro que foram meses mais secos. Já para o íon m/z 399, foram

encontradas maiores áreas médias do pico do íon nos períodos com regime pluviométrico mais

baixo. Em março (mês mais chuvoso) foi o mês em que foi registrada a menor média da área do

pico do íon.

Figura 16. Relação entre acumulado de chuva no mês da coleta no período de dezembro de

2012 a novembro de 2013 e área do pico do íon m/z 499 (A) e m/z 399 (B) encontrados no

extrato hidroalcoólico de M. glomerata analisado por UHPLC-MS em modo negativo.

O íon m/z 515, ácido dicafeoilquínico, apresentou variações muitos parecidas com a do

ácido clorogênico (m/z 353 que foi discutido anteriormente) como é visto na Figura 15. Ambos

apresentam características químicas muitos semelhantes, sendo ambos compostos fenólicos,

provenientes da mesma via biossintética e possuem a função de proteção da planta contra a

fotodestruição. Portanto é provável que a variação destes metabolitos esteja relacionada como a

intensidade de luminosa sobre a planta em determinadas épocas do ano (Waterman, Mole 1994;

Tatini et al, 2004), porem não foi possível obter estes dados.

Os íons do extrato etanólico de M. glomerata encontrados em modo negativo não

apresentaram correlações com a temperatura do ar, pelo menos quando analisada

isoladamente.

48

5.7 Variações mensais de outros íons nos extratos de M. laevigata

5.7.1 Extrato aquoso de M. laevigata analisado por UHPLC-MS em modo positivo

A Figura 17 permite visualizarmos que somente a área média do pico do íon m/z 381 não

apresentou diferenças mensais significativas, os outros íons apresentaram diferenças

significativas entre alguns meses (p<0,05) ao longo do ano. Apesar dos extratos apresentarem o

íon de m/z 147 (cumarina) em todos os meses, este íon foi excluído dos gráficos a seguir, pois já

foi discutido anteriormente.




e erro padrão.

49

Ao avaliarmos possíveis influências de fatores climáticos na área do pico dos íons

mostrados na Figura 18, nota-se que há uma diminuição na área média dos picos dos íons m/z

337 e 251 com a diminuição da temperatura do ar, ou seja, nos meses mais frios como: junho,

julho e fevereiro. Da mesma forma pode-se ver que nos meses com temperaturas mais elevadas

como janeiro, novembro e março, a área média dos picos destes íons tende a aumentar.



aquoso de M. laevigata analisado por UHPLC-MS em modo positivo.

Os principais íons encontrados no extrato aquoso de M. laevigata analisado por UHPLC-

MS em modo positivo, não apresentaram correlação com os índices pluviométricos ocorridos

durante o ano em que foi realizado o estudo.

50

5.7.2 Extrato aquoso de M. laevigata analisado por UHPLC-MS em modo negativo

A Figura 19 permite visualizarmos que somente as áreas médias do pico do íon m/z 439

não apresentaram diferenças mensais significativas, os outros íons apresentaram diferenças

significativas entre alguns meses (p<0,05) ao longo do ano.




e erro padrão.

51

As áreas médias dos picos de alguns íons do extrato aquoso de M. laevigata parecem se

relacionar com a temperatura do ar, como se pode ver na Figura 20. As áreas médias dos picos

dos íons m/z 191 e 325 diminuem nos meses mais quentes como em dezembro de 2012 e

setembro, outubro e dezembro de 2013. O inverso ocorre em meses mais frios como fevereiro,

maio e junho, cujas temperaturas médias no dia da coleta não ultrapassava 25 oC. Já áreas

médias dos picos dos íons de m/z 433 e 487, aumentavam a média da área (n=3) do pico do íon

quando havia aumento da temperatura média no dia da coleta., como observa-se em dezembro

(2012), setembro outubro e novembro (2013). Não foi observada relação com os níveis de

precipitação.




negativo.

52

5.7.3 Extrato hidroalcoólico de M. laevigata analisado por UHPLC-MS em modo

positivo

O extrato hidroalcoólico de M. laevigata apresenta diferenças significativas entre alguns

meses (p<0,05) para as áreas médias dos picos de todos os íons na Figura 21. Apesar dos

extratos apresentarem o íon de m/z 147 (cumarina) em todos os meses, este íon foi excluído dos

gráficos a seguir, pois já foi discutido anteriormente.


laevigata em modo positivo. As médias marcadas pela mesma letra não diferem estatisticamente

entre si (Teste de Tukey ao nível de variância de 5% de probabilidade). Resultados expressos

em média e erro padrão.

A

53

Ao correlacionarmos as variações mensais ocorridas nas áreas médias dos picos dos

diversos íons no extrato hidroalcoólico de M laevigata em modo positivo observa-se que o íon

m/z 350 apresentou correlação negativa em relação à temperatura média obtida no dia da coleta

das folhas. Já o íon m/z 286 apresentou correlação positiva entre a temperatura média

encontrada no dia da coleta e a área do pico obtida (Figura 22). Para os demais íons que

tiveram variações significativas ao longo do ano, não foi observada correlação com

características climáticas como índice de precipitação e variação térmica.



no extrato hidroalcoólico de M. laevigata analisado por UHPLC-MS em modo positivo.

54

5.7.4 Extrato hidroalcoólico de M. laevigata analisado por UHPLC-MS em modo

negativo

A Figura 23 mostra que a área média dos picos da maioria dos íons encontrados por

UHPLC-MS em modo negativo na espécie M. laevigata apresentaram diferenças significativas

entre alguns meses (p< 0,05) ao longo do ano. As exceções foram os picos dos íons de m/z 133

(ácido málico) e m/z 353 (acido clorogênico) cujas áreas médias não apresentaram diferenças

significativas ao longo do ano.

Figura 23 Variação mensal dos principais íons encontrados no extrato hidroalcoólico de M.

laevigata em modo negativo. As médias marcadas pela mesma letra não diferem



55

Na Figura 24 observa-se que, para o íon m/z 191, temos uma correlação negativa, onde a

área do pico do íon tende a aumentar como o decréscimo da temperatura média do ar. Já para o

íon m/z 433 detecta-se uma correlação positiva, onde a área do pico do íon tende a aumentar

com aumento da temperatura média no dia da coleta das folhas de guaco. Para os outros íons

não foi observada correlação com características climáticas como índice de precipitação e

variação térmica.


de 2012 a novembro de 2013 e área do pico dos íons m/z 191 (A) e m/z 433 (B), encontrados no

extrato hidroalcoólico de M. laevigata analisado por UHPLC-MS em modo negativo.

56

6 DISCUSSÃO DAS VARIAÇÕES MENSAIS

Os extratos aquosos de M. glomerata renderam poucas informações, provavelmente por

extrair poucos componentes e em baixa concentração da matriz vegetal. Nestes extratos não

foram observados nem cumarina, nem acido clorogênico. Não existem outros estudos na

literatura comparando extratos aquosos com hidroetanólicos, apesar do uso rotineiro de chás

pela população.

Já nos extratos hidroalcoólicos de M. glomerata foi possível quantificar o ácido clorogênico

e detectar o ácido dicafeoilquínico, que são provenientes da mesma via biossintética. Baixos

teores de cumarina também foram quantificados nestes extratos. Porém, para estes três

compostos, não foi possível encontrar correlação de sua concentração com temperatura, ou com

a pluviosidade. Não foi possível obter os dados de radiação incidente na região, mas sabe-se

que o ácido clorogênico e o ácido dicafeoilquínico são produzidos na planta com a finalidade de

protegê-la da foto-destruição (Waterman e Mole, 1994) e, portanto, é possível que sua

concentração se correlacionasse com este fator. Dos íons observados em modo positivo com

variações significativas de suas áreas médias entre diversos meses do ano, quatro diminuíram

nos meses mais frios de junho e julho (m/z 287, 255, 302 e 177) e um aumentou (m/z 293). Em

modo negativo, a área de m/z 499 aumentou nos meses chuvosos e a área de m/z 399 diminuiu

nos meses chuvosos. Estes resultados indicam que uma complexa rede de condições

ambientais rege a composição de metabólitos secundários de M. glomerata.

A cumarina pode ser quantificada em extratos aquosos e hidroetanólicos de M. laevigata,

mostrando haver maior quantidade de cumarina nesta espécie. Nos dias de temperaturas mais

baixas (24 a 26 oC) houve maiores concentrações de cumarina. Este resultado vem de encontro

com os resultados de Pereira et al (2000), onde também foi observado maior rendimento de

cumarina nos meses mais frios, com condições climáticas semelhantes às de Campinas (SP)

com temperaturas mais baixas e sem a presença de chuva. Porem nossos resultados diferem

daqueles apresentados por Passari et al;. (2014) que encontrou maiores concentrações de

57

cumarina nas amostras coletadas no verão provenientes de Londrina (PR); região que apresenta

temperaturas anuais mais baixas que as de Campinas e região. Deste modo a temperatura, mais

do que a estação, pode estar afetando os teores de cumarina.

Nem o ac. clorogênico nem o ac. dicafeoilquínico foram detectados nos extratos aquosos

de M. laevigata. O teor de ac. clorogênico não apresentou variações significativas ao longo do

ano nos extratos hidroetanólicos, talvez por estar em concentração menor em M. laevigata. O

íon de m/z 433 (modo negativo) observado em extratos aquosos e hidroetanólicos de M.

laevigata apresenta uma correlação positiva com a temperatura no dia da coleta. Nenhuma

variação na composição parece estar relacionada à pluviosidade para M. laevigata.

Os poucos estudos encontrados na literatura sobre sazonalidade na composição química

dos extratos de guaco, avaliam somente o teor de cumarina, o que dificulta comparação dos

outros metabolitos encontrados nessas amostras com resultados da literatura. Os fatores

exógenos atuam nas plantas no campo simultaneamente [Gobbo-Neto e Lopes, 2007] sendo

impossível isolar um fator do outro nesse contexto, porem dos metabólitos que apresentaram

variações mensais significativas nas suas áreas relacionadas a fatores ambientais, a maioria

apresentaram uma relação com a temperatura, mais do que com a pluviosidade ou estação do

ano. Portanto a temperatura do ar do dia da coleta foi o fator mais importante detectado neste

estudo.

58

7. CONCLUSÕES

A maior variação entre os metabólitos secundários foi encontrada entre as duas espécies

de guaco, Mikania glomerata e Mikania laevigata, para os dois tipos de solventes extratores.

Nos extratos aquosos foram encontrados teores menores de cumarina em Mikania

laevigata e identificados um número menor de compostos, em comparação aos extratos

hidroalcoólicos. Já o teor de ácido clorogênico, outro constituinte importante só pode ser

quantificado no extrato etanólico de M. glomerata, estando abaixo do limite de quantificação nos

extratos de M. laevigata. Portanto o solvente hidroalcoólico é mais eficiente para extrair

compostos bioativos das duas espécies de guaco.

M. laevigata parece sofrer principalmente influência da temperatura do ar na produção de

metabólitos secundários; são encontrados maiores teores de cumarina nos períodos mais frios.

Já para M. glomerata foi possível notar a influencias de períodos mais chuvosos e da

temperatura na produção de metabólitos secundários.

59

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65

ANEXO I

Figura 1. Influência da sazonalidade no perfil dos íons encontrados no extrato aquoso das

folhas de M.glomerata em modo positivo coletadas em três horários diferentes, manhã, tarde e

noite.

66


folhas de M.glomerata em modo negativo coletadas em três horários diferentes, manhã, tarde e

noite.

67


folhas de M.laevigata em modo positivo coletadas em três horários diferentes, manhã, tarde e

noite.

68


folhas de M. laevigata em modo positivo coletadas em três horários diferentes, manhã, tarde e

noite.

69

Figura 5. Influência da sazonalidade no perfil dos íons encontrados no extrato hidroalcoólico

das folhas de M.glomerata em modo positivo coletadas em três horários diferentes, manhã,

tarde e noite.

70


das folhas de M. glomerata em modo negativo coletadas em três horários diferentes, manhã,

tarde e noite.

71


das folhas de M. laevigata em modo positivo coletadas em três horários diferentes, manhã,

tarde e noite.

72


das folhas de M. laevigata em modo negativo coletadas em três horários diferentes, manhã,

tarde e noite.

73

ANEXO II

Figura 1. Correlação entre a área dos picos dos íons encontrados no extrato aquoso de M.

glomerata em modo positivo fatores ambientais. Em A e B temos uma correlação positiva entre a

temperatura média do ar no dia da coleta e a área do pico do íon m/z 190 e m/z 381

respectivamente. Em C é possível observar a influencia do volume de chuva no mês da coleta e

área do íon m/z 474.

Figura 2. Correlação entre a área dos picos do íon m/z 147 (cumarina) encontrado no extrato

aquoso (A) e extrato etanólico (B) de M. laevigata em modo positivo X temperatura do ar em °C.

74

Figura 3. Correlação entre temperatura do ar no dia da coleta de dezembro de 2012 a novembro

de 2013 e área do pico do íon m/z 293(A), 287( B), 302 (C), 255 (D), encontrados no extrato

hidroalcoólico de M. glomerata analisado por UHPLC-MS em modo positivo.

Figura 4. Relação entre acumulado de chuva no mês da coleta no período de dezembro de 2012

a novembro de 2013 e área do pico do íon m/z 499 (A) e m/z 399 (B) encontrados no extrato

hidroalcoólico de M. glomerata analisado por UHPLC-MS em modo negativo.

75

Figura 5. Correlação entre a temperatura média do ar no dia da coleta no período de dezembro


aquoso de M. laevigata analisado por UHPLC-MS em modo positivo.




negativo.

76



no extrato hidroalcoólico de M. laevigata analisado por UHPLC-MS em modo positivo.


de 2012 a novembro de 2013 e área do pico dos íons m/z 191 (A) e m/z 433 (B), encontrados no

extrato hidroalcoólico de M. laevigata analisado por UHPLC-MS em modo negativo

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