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20 - Introdução

Este trabalho, de revisão bibliográfica, trata do tema Células Estaminais do Sangue do

Cordão Umbilical, na tentativa de elucidação do que são e, qual a sua importância ao

nível da investigação no futuro da medicina.

Em primeiro, pretende-se conhecer os benefícios destas células, o que possibilitou a

pesquisa sobre este tema e o aprofundamento da parte teórica, seguindo a ordem;

1. O que são?

2. Que tipo de células estamianais existem?

3. Que propriedades as fazem únicas?

4. Que potencialidades terapêuticas existem na sua aplicação médica?

5. Que processos são usados para as extrair?

6. Que doenças se podem tratar com o uso de células estamianais?

7. Que futuros terá a medicina com os avanços na área das células estamianais?

8. Que doenças se poderão tratar futuramente e porquê?

Posteriormente, estudou-se as abordagens que existem sobre a investigação de células

estaminais, ou seja, o ponto de vista em relação aos diversos campos de aplicação

nomeadamente;

9. Medicina Regenerativa;

10.Clonagem terapêutica;

11.Criopreservação.

Em conclusão, tentará este trabalho, rever a mais recente investigação nesta área

científica de franca ascensão, no que concerne às patologias que até hoje são

reconhecidamente de mau prognóstico e até mesmo incuráveis.

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21 - Métodos

O presente trabalho, realizado no âmbito do Mestrado em Análises Clínicas, da

Faculdade de Farmácia de Lisboa, cujo tema é “Células Estaminais do Sangue do

Cordão Umbilical”, teve como objectivo principal a realização de uma revisão

bibliográfica dos conhecimentos científicos mais recentes nesta área.

Durante o processo de pesquisa e selecção da informação, foram seleccionados e

analisados múltiplos artigos publicados em distintas revistas da área, em compêndios

científicos, valorizando-se as publicações mais recentes, bem como a filtragem de

informação disponibilizada por sítios da internet, tanto em laboratórios de investigação

internacionais de Hematologia, como em empresas especializadas na área da

criopreservação das células estaminais.

Recorreu-se, concomitantemente, a diferentes bases de dados, disponíveis em

bibliotecas e na própria internet, nomeadamente: Pubmed e Medline.

Alguns artigos, foram analisados pela sua actualidade e, por eles próprios serem artigos

de revisão citados.

No desenvolvimento deste trabalho, o recurso aos meios informáticos, balizaram-se

palavras-chave, nomeadamente: “umbilical cord blood”, “stem cell”, “bone marrow”,

“cryopreservation”, “transplant”, “regenerative medicine”, bem como a conjugação

destas.

Da análise e selecção de artigos valorizou-se os publicados em revistas e jornais

conceituados como Blood, Bone Marrow Transplantation, Biology of Blood and

Marrow Transplantation e New England Journal of Medicine.

Procurou-se seleccionar informação fidedigna, científica e actualizada de forma a

realizar um trabalho credível.

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22 - Células Estaminais

Células estaminais (CE) são, por definição, células com capacidade de auto-renovação e

proliferação, tendo a capacidade de se diferenciarem indefinidamente em múltiplas e

diversas linhagens celulares (figura 18). Desta forma, o seu grande potencial está na

origem, por processos de divisão simétrica, de populações celulares idênticas, contudo,

sob determinadas condições, a sua diferenciação possibilita o aparecimento de

diferentes tipos de células (por divisão assimétrica), as quais adquirem propriedades

(expressão génica e fenotípica) e características do tecido a que dão origem, sofrendo

uma redução da sua capacidade de proliferação [1].

Figura 18 – Propriedades das Células Estaminais.

De acordo com a sua origem, as CE dividem-se em dois grupos principais: células

estaminais embrionárias e células estaminais adultas [2]. As CE embrionárias

pluripotentes provêm da massa celular interna (MCI) do blastocisto podendo dar origem

a qualquer tipo de célula humana, com excepção dos tecidos extra-embrionários (figura

19) [3]. Apesar do seu elevado potencial, existem obstáculos de natureza técnica e

questões éticas e morais que limitam a utilização clínica das CE embrionárias [1].

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Figura 19 - Células estaminais pluripotentes, isoladas da MCI do blastocisto

As CE não embrionárias ou CE adultas, encontram-se em muitos tecidos do organismo

adulto sendo, regra geral, multipotentes [4]. Estas células têm sido isoladas dos mais

diversos tecidos, como é o caso da medula óssea (MO), (figura 20) do sangue periférico,

da pele, do epitélio intestinal, do fígado, do cérebro, dos músculos, do tecido adiposo,

do bolbo dentário e do pâncreas [5]. São células imaturas que, para além de

contribuírem para a homeostase tecidular, também promovem a regeneração e a

recuperação em situações de stresse ou trauma [6].

Figura 20 - Células estaminais adultas isoladas da medula óssea.

Blastocisto

100-200 Células

Músculo Cardiaco

Sangue

Células Neuronais

Medula Óssea

Células Pancreáticas

Células Estaminais Pluripotentes

Massa Celular Interna

Célula Adiposa

Cérebro

Músculo Cardiaco Neurónios

Célula Epitelial

Vasos sanguineos

Celulas Estaminais do SNC

Figado

Medula Óssea

Musculo Esqueletico

Osso

Celula Mesenquimal

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Existem CE ou células tronco em tecidos neo-natais, tais como o sangue do cordão

umbilical (SCU), a matriz do mesmo ou a placenta. Estas incluem-se no grupo das CE

adultas, uma vez que podem ser obtidas após o nascimento do indivíduo. No entanto,

alguns autores defendem que devia ser atribuído um grupo próprio para este tipo de

células, já que reúnem características intermédias, que não permitem classificá-las

inequivocamente, nem como adultas, nem como embrionárias devido ao seu elevado

potencial proliferativo e características pluripotentes. De entre as fontes neo-natais, a

melhor caracterizada é o SCU, a partir do qual é possível isolar várias populações de CE

[6].

Designam-se por células estaminais embrionárias totipotentes as células resultantes das

primeiras divisões celulares (figura 21). Após a formação do zigoto estas células são

capazes de se diferenciar em qualquer tecido do organismo humano possuindo um

grande poder de multiplicação e especialização podendo formar todos os tecidos

incluindo a placenta e os anexos embrionários [7] [8]. Estas constituem o primeiro

grupo até às 16 - 32 células, e são formadas aproximadamente nas primeiras 72 horas

após a fecundação do óvulo, não sendo possível identificar neste grupo de células

qualquer diferenciação de tecido específico [9]. A formação da placenta e dos anexos

embrionários ocorre somente quando as células totipotentes são implantadas no útero

[10].

Figura 21 – Células estaminais embrionárias totipotentes resultantes das primeiras

divisões celulares.

Aproximadamente quatro dias após a fertilização as células totipotentes começam a

especializar-se e formam o blas

podem ser distinguidas; A massa celular externa (MCE) e a massa celular interna

[9]. A MCE, também conhecida como trofoblasto, dá origem à placenta

embrionários como a bolsa amniótica

necessários para o desenvolvimento do feto no útero [7

por embrioblasto encontram-

retêm a capacidade de originar células

germinativas; endoderme (que origina o

outros), mesoderme (que origina os

ectoderme (que origina os tecidos da epiderme e

do blastocisto constituída por aproximadamente 32 a

formação do embrião propriamente dito, ou seja, de todos os tecidos e órgãos humanos

[7]. Embora as células presentes na MCI

todos os tipos de células encontrada

organismo, pois são incapazes

facto de o seu potencial não ser total, tais células não são totipotentes

implantarmos apenas as células da MCI no útero, est

um novo embrião [7] [10].

Figura 22 - Células estaminais

maioria dos tecidos.


se e formam o blastocisto, ao atingir este estadio duas populações

podem ser distinguidas; A massa celular externa (MCE) e a massa celular interna

, também conhecida como trofoblasto, dá origem à placenta e aos

a bolsa amniótica e, o córion entre outros componentes da pl

envolvimento do feto no útero [7]. Na MCI também designada

-se as células estaminais embrionárias pluripotentes

retêm a capacidade de originar células capazes de se diferenciar nas diferentes lin

(que origina o tracto gastrointestinal e, os pulmões

), mesoderme (que origina os músculos, ossos e, sangue, entre outros) e

origina os tecidos da epiderme e sistema nervoso) (figura 22

constituída por aproximadamente 32 a 64 células é a respons


a as células presentes na MCI do blastocisto possuam a capacidade de formar

encontradas no corpo humano, sozinhas não podem

es de originar a placenta e os anexos embrionários.

seu potencial não ser total, tais células não são totipotentes, d

enas as células da MCI no útero, estas não são capazes de d

estaminais pluripotentes com capacidade de se diferenciarem

107


duas populações celulares

podem ser distinguidas; A massa celular externa (MCE) e a massa celular interna (MCI)

e aos anexos

o córion entre outros componentes da placenta,

Na MCI também designada

células estaminais embrionárias pluripotentes pois

nas diferentes linhagens

pulmões, entre

ntre outros) e

(figura 22). A MCI

é a responsável pela


a capacidade de formar

m formar um

acenta e os anexos embrionários. Pelo

, de facto, se

desenvolver

pluripotentes com capacidade de se diferenciarem na

108

Em fases subsequentes do embrião, algumas células passam a estar comprometidas com

uma determinada linhagem celular pertencente a um dos três folhetos embrionários [7].

Estas células somáticas encontradas nos tecidos adultos, passam a ser reconhecidas

como células estaminais multipotentes, pois podem originar qualquer tipo celular

restrito ao folheto embrionário ao qual está comprometido mas num número limitado

(figura 23) [1]. Um exemplo de CE multipotente é a célula estaminal hematopoiética -

que se pode diferenciar em diversos tipos de células do sangue, mas não se pode

diferenciar em células neuronais ou outros tipos de células [8].

Figura 23 - Células estaminais multipotentes que dão origem

a um tipo celular restrito.

Por fim, as células unipotentes, possuem a capacidade de se diferenciarem apenas num

único tecido, ou seja, o tecido a que pertencem. As células mais comuns deste tipo são

as células da pele [11].

Em linhas gerais, podemos dizer que, quanto mais primitiva é a linha de

desenvolvimento embrionário, maior é o potencial de diferenciação de uma célula

estaminal (figura 24) [2] [4].

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Figura 24 - Ordem decrescente de potencialidade - células estaminais totipotentes,

pluripotentes e multipotentes.

Devido ao seu grau de desenvolvimento e maturação as CE do SCU estão mais

próximas das CE embrionárias/fetais, do que a maioria das CE adultas, pelo que o seu

potencial de diferenciação e proliferação é superior [12] [13].

Actualmente, o SCU é considerado uma fonte promissora de CE na área da medicina

regenerativa, tendo actualmente uma importância clínica reconhecida nos transplantes

hematopoiéticos, para o tratamento de diversas doenças hematológicas benignas e

malignas [14] [15].

110

A capacidade de diferenciação das CE em vários tipos de células, podendo substituir

células lesadas ou destruídas e regenerar tecidos danificados, explica o grande interesse

na utilização destas células no contexto da terapia celular [16]. As HSCs (células

estaminais hematopoiéticas) são aquelas que têm tido maior relevância na prática

clínica, particularmente em doenças nas quais é necessário regenerar o sistema

sanguíneo e imunológico do doente [17]. No indivíduo adulto as HSCs estão

maioritariamente localizadas na medula óssea (MO), (figura 25) e originam todas as

células que constituem o sangue e sistema imunitário, podendo diferenciar-se em

linfócitos (B e T), eritrócitos, plaquetas, neutrófilos, monócitos, eosinófilos, basófilos e

macrófagos. O SCU é também uma importante fonte destas células, razão pela qual se

tornou, nos últimos anos, numa alternativa à MO nos transplantes de células HSCs [14].

Figura 25 – Células resultantes da diferenciação da célula estaminal

multipotente hematopoiética.

As CE possuem 2 propriedades que as distinguem das outras células; são células não

especializadas, que se renovam através de divisão celular por longos períodos e, sob

determinadas condições fisiológicas, podem ser induzidas a transformar-se em células

com funções específicas, como por exemplo células produtoras de insulina do pâncreas

[7].

111

O facto de as CE do SCU se poderem diferenciar e constituir diferentes tecidos do

organismo, bem como a sua capacidade de auto-replicação, ou seja gerar cópias

idênticas delas mesmas, possibilitou a investigação para a terapia de muitas doenças,

através da substituição dos tecidos lesionados por estas mesmas células [7].

Em suma, uma célula estaminal é um tipo especial de célula que tem a capacidade

singular de gerar outra célula estaminal ou gerar um tipo de célula especializada [8].

A possibilidade de terapia em patologias diversas de difícil resolução na prática clínica,

como: diabetes mellitus, esclerose múltipla, doença de Parkinson, cardiomiopatias,

patologias hepáticas e distrofias musculares, assim como, numa série de lesões agudas

entre as quais queimaduras, lesões na medula espinhal, acidentes vasculares cerebrais e

enfarto do miocárdio, utilizando uma única fonte de células, era uma realidade

impossível de ser efectuada no passado. No entanto, publicações recentes acerca da

obtenção de CE do SCU e a sua posterior derivação em diferentes tecidos possibilitam

uma nova realidade [18]. Embora na actualidade, a utilização clínica do SCU se

restrinja fundamentalmente a doenças do foro hematológico, as CE isoladas desta fonte

representam uma fonte promissora para o tratamento de várias outras patologias. [19]

Diante do exposto, o referido trabalho tem como principal objectivo explanar a

importância das CE do SCU, as suas funções e implicações nas pesquisas científicas de

forma a recuperar tecidos danificados por várias doenças.

22.1 – Células estaminais do sangue do cordão umbilical Até há cerca de três décadas, o cordão umbilical era considerado como apenas mais um

excedente do parto, no entanto, Knudtzon (1974) descreveu pela primeira vez a

existência de HSCs no SCU [20]. A possibilidade de utilizar CE do SCU nos

transplantes hematopoiéticos, em alternativa à MO, contribuiu para o estudo científico

do SCU como fonte de CE, tendo actualmente uma importância reconhecida [14].

112

Estudos publicados nos últimos anos demonstram que, para além de HSCs, o SCU

contém também uma população de diferentes tipos de células estaminais que vão desde

células mais primitivas com características semelhantes às CE embrionárias a células

mais diferenciadas, tais como CE mesenquimais e células progenitoras endoteliais [5]

[21]. Em consequência desta diversidade, é possível, a partir de uma amostra de SCU,

diferenciar vários tipos de células, tais como;

� Células Estaminais Hematopoiéticas, caracterizadas pelo marcador CD34+,

que dão origem a todos os tipos de células da linhagem sanguínea, sendo as que

se encontram em maior quantidade e possuem, na actualidade, uma importância

clínica reconhecida (figura 26) [5] [21];

Figura 26 – Origem de todos os tipos de células da linhagem sanguínea

através da HSC.

� Células Estaminais Endoteliais, as quais se diferenciam em células endoteliais,

constituintes dos vasos sanguíneos [5] [21];

� Células Estaminais Mesenquimais, com capacidade de diferenciação em

diversas linhagens celulares, tais como células ósseas, cartilagem, células

musculares e células do tecido adiposo; alguns trabalhos sugerem a

113

possibilidade de diferenciar células neurais a partir de células estaminais me-

senquimais (figura 27) [5] [21];

Figura 27 – Células estaminais mesenquimais

� Células USSC (do inglês unrestricted somatic stem cells), também designadas

como células estaminais somáticas não-restritas, alguns autores consideram estas

células pluripotentes como uma população de células estaminais mesenquimais

mais primitiva, uma vez que também se podem diferenciar, em células do tecido

adiposo, células neurais, células ósseas, cartilagem e, ainda, em células

sanguíneas e do músculo cardíaco [5] [21];

� Células estaminais embryonic-like, capazes de dar origem a células

características das três linhas germinativas (ectoderme, mesoderme e

endoderme), podendo-se destacar, respectivamente, as células neurais,

sanguíneas e hepáticas [5] [21].

114

22.2 - Características biológicas das células do sangue do cordão

umbilical

Há mais de 10 anos foram descritos os diferentes compartimentos hematopoiéticos do

SCU humano, observando-se que a concentração de CE no SCU, calculada pelo número

de colónias formadas, é maior que a encontrada na MO. A frequência de CE no SCU (1

a 5 para 1.000 células mononucleares) é também maior que no sangue periférico (SP) de

um indivíduo adulto (1 a 5 em 20.000) [24]. A observação do número de unidades

formadoras de colónias (CFU), obtidas a partir de cultura in vitro com células de SCU,

em meio semi-sólido, sugeriu a possibilidade do SCU ser uma fonte de células

hematopoiéticas usadas para transplante [24].

O número médio de colónias CFU-GM encontradas nas unidades de SCU é de 3,31 ±

0,60 x105 [28] e o percentual de células CD34+, calculado por citometria de fluxo, é

menor no SCU que na MO, 0,92 ± 0,28 versus 1-3% [22].

No entanto, o percentual de células mais primitivas CD34+/CD38- é maior no SCU,

cerca de 16% ± 8,8% do total de células CD34+, comparando ao percentual encontrado

na MO: 4,7%± 3,0% resultando em números totais comparáveis de células

CD34+/CD38- em ambas as fontes de células [22].

Hao & al. (1995), descreveram características funcionais diferentes entre as células

CD34+/CD38- do SCU e da MO; as células originadas do SCU apresentam maior

resposta proliferativa a citocinas e geram cerca de sete vezes mais progenitores

hematopoiéticos em cultura, do que as células CD34+/CD38- da MO [23]. Embora não

haja evidência da existência de células primitivas exclusivas no SCU, que não são

encontradas na medula óssea, alguns estudos evidenciaram características que sugerem

uma maior imaturidade das células progenitoras do SCU, como a presença de telómeros

mais longos e o número e tamanho das colónias hematopoiéticas [24]. Uma

investigação efectuada em murganhos com SCID (imunodeficiência combinada severa),

nos quais se injectaram simultaneamente, células CD34+ provenientes da medula óssea

e de SCU, permitiu observar que o número de células CD34+ de SCU era marcadamente

superior ao de células CD34+ da medula óssea; 100% dos ossos injectados

apresentavam células de SCU e, em apenas 50% dos ossos injectados se encontravam

células de MO [24].

115

Ao analisar a expressão de antigénios de maturação e diferenciação nas células CD34+

do SCU observou-se que a maioria, cerca de 62 a 73%, expressam os marcadores

mielóides, CD13+ e CD33+, enquanto que apenas 10% expressam antigénio linfóide B

(CD19+) [23]. As análises das subpopulações de linfócitos T presentes no SCU são

objecto de estudo frequente, desde o início do uso terapêutico deste material biológico.

As células do SCU apresentam propriedades imunológicas diferentes daquelas

encontradas noutras fontes de CE. Tanto os linfócitos T, como as células Natural-Killer,

isoladas de SCU, apresentam uma função reduzida quando comparada com a das células

do indivíduo adulto, ou seja, a sua actividade citotóxica é menor. Este facto pode estar

relacionado com a menor prevalência de GVHD (doença do enxerto contra o

hospedeiro) nos transplantes que utilizam SCU [25]. A maioria dos linfócitos T do SCU

é CD45RA, enquanto que a maioria dos linfócitos adultos é CD45RO. Esta diferença de

fenótipo das células imaturas do SCU resulta na não produção de interleucina-2 (IL-2)

quando estimulada. As células T do SCU têm menor capacidade de produzir TNF-α

(factor de necrose tumoral α), interleucina 4(IL-4) e interleucina 10 (IL-10). De uma

maneira geral, as células do SCU têm menor capacidade de produzir citocinas que as

células adultas, podendo ser o reflexo da sua imunidade imunológica. Além disto, os

linfócitos T do SCU apresentam menor capacidade de apresentação de antigénios [25].

A actividade lítica das células NK (Natural Killer) do SCU é reduzida, podendo estar

relacionada com a baixa percentagem de linfócitos CD56+ nas unidades de SCU. A alta

proporção de células CD16+/CD56- é um dado que reafirma a imaturidade das células

NK do SCU. Estas apresentam produção diminuída de interferão-y e, portanto, menor

toxicidade. O nível de actividade NK das células do SCU é cerca de 4,6% enquanto que

no sangue do indivíduo adulto é de cerca de 41,7% [26].

A actividade lítica induzida por citocinas (linfokine actived Killer – LAK) é semelhante

entre as células mononucleares de SP e de cordão umbilical. Ensaios utilizando células

LAK obtidas de SCU após estimulação com IL-2 e IL-12, demonstram que estas células

têm capacidade de destruir células malignas de pacientes com leucemia mielóide aguda,

como acontece com as células LAK da MO e do SP estimulado [27].

A proporção de células T supressoras CD8+/CD28- está aumentada no SCU, no entanto,

a citotoxicidade dependente de anticorpo (ADCC) é satisfatória e semelhante aquela

observada em células sanguíneas adultas. [35].

116

23 - Criopreservação das células estaminais do sangue do

cordão umbilical

A colheita do SCU é um procedimento simples, totalmente indolor e não apresenta

qualquer risco, nem para a mãe nem para o bebé. O sangue deve ser recolhido no

ambiente estéril da sala de parto, imediatamente após o nascimento (natural ou

cesariana) e antes da expulsão da placenta (sem alteração dos procedimentos normais do

parto) [28].

Imediatamente após o nascimento, na última fase do parto, o cordão umbilical é

limitado com duas pinças cirúrgicas o mais perto possível do abdómen do recém-

nascido, uma vez que as CE migram rapidamente nessa direcção (Figura 28).

Figura 28 – Cordão Umbilical Limitado por Pinça Cirúrgica.

O sangue é aspirado por punção na veia umbilical e é armazenado num saco estéril com

anticoagulante CPD - citrato, fosfato e dextrose. Poderá ser necessário picar a veia em

mais do que uma zona de forma a obter o maior volume de sangue possível, em caso de

gémeos o procedimento deverá ser repetido para cada bebé [29]. No fim da recolha, o

saco da amostra é devidamente selado e acondicionado de forma a não sofrer variações

de temperatura, as células devem ser mantidas à temperatura ambiente até serem

processadas e recomenda-se que o processamento seja feito entre as 24H e 48H após a

colheita (figura 29) [30].

117

Figura 29 – Saco estéril com glóbulos vermelhos, leucócitos, plaquetas e células

estaminais resultantes da colheita do SCU.

Ao chegar ao laboratório a amostra é registada e é, então, dado início ao processo de

isolamento e criopreservação das CE, o processamento da amostra reduz o volume de

sangue, obtendo-se fracções de plasma, glóbulos vermelhos e buffy-coat (a parte rica em

células estaminais). Inicialmente é realizado um rigoroso controlo de qualidade,

seguidamente é determinado o volume de sangue colhido, é calculado o número de

células mononucleadas e estaminais hematopoiéticas (CD34+) e é testada a viabilidade

celular. Após o processamento do sangue e o isolamento das células mononucleadas

estas são novamente contadas, tal como as células CD34+ [29].

De seguida, são feitos testes para verificar se a amostra sofreu algum tipo de

contaminação bacteriológica, durante e após a recolha. São realizadas análises,

assegurando, em definitivo, a qualidade do sangue no que diz respeito a eventuais

contaminações por CMV, Sífilis, Hepatite B, Hepatite C e HIV I/II. Estas

determinações analíticas, além de esclarecerem a segurança da amostra, evitam que a

mãe necessite de efectuar novas análises após o parto [31] [32].

As CE ficam armazenadas num saco de 25 ml com dois compartimentos distintos

(figura 30), permitindo que, em caso de necessidade de realização de novos testes, a

unidade não necessite de ser descongelada na sua totalidade. O processo de congelação

é efectuado através de um decréscimo de temperatura controlado, utilizando o agente de

118

criopreservação - dimetilsulfóxido (DMSO) que evita a formação dos cristais de gelo

(que poderiam destruir as estruturas intracelulares de modo irreversível) impedindo,

assim, a destruição das células a temperaturas baixas. [33].

Figura 30 – Saco de armazenamento de células estaminais dividido em 2

compartimentos distintos.

A criopreservação das CE do SCU é realizada em azoto líquido, a uma temperatura de

196ºC negativos, (figura 31) para que toda a actividade biológica das células cesse,

mantendo-as num estado latente e permitindo o armazenamento por um longo período

de tempo [31].

Figura 31 – Criopreservação de células estaminais em azoto líquido.

119

23.1 Bancos de sangue do cordão umbilical - Privados versus Públicos

Desde a realização do primeiro transplante com SCU, em 1988, [34] seguido da sua

ampla utilização em tratamentos de doenças hematológicas benignas e malignas com

resultados satisfatórios, algumas instituições públicas e privadas tomaram a iniciativa de

criar bancos para armazenamento e criopreservação de amostras de SCU para uso futuro

em transplantes alogénicos (sendo o dador uma outra pessoa que não o paciente) ou

autólogos (em que o paciente utiliza as sua próprias células anteriormente

criopreservadas) [35]. Desta forma, o SCU estabeleceu-se como uma excelente fonte de

HSCs, sendo uma opção às células provenientes da MO, e proporcionando o interesse

pela criopreservação das células nele contidas. [36]

Existem dois modelos principais de bancos de SCU: os bancos públicos e os bancos

familiares ou privados [37]. Os bancos de SCU públicos armazenam unidades de SCU

doadas pelos pais – estas unidades passam a estar disponíveis para uso alogénico, por

qualquer pessoa que necessite de um transplante [38] [39] [40].

Os bancos privados armazenam unidades de SCU para uso autólogo ou alogénico no

contexto familiar. As amostras armazenadas são propriedade do dador, não estando

disponíveis para o uso geral na comunidade [31].

O primeiro Banco de Sangue de Cordão Umbilical de carácter público foi fundado pelo

Doutor Pablo Rubinstein em Nova York, em 1992, permitindo o desenvolvimento de

outros bancos públicos em todo o mundo, como por exemplo em Barcelona e

Dusseldorf. Em 2010, com aproximadamente 350.000 unidades de SCU armazenadas

em bancos públicos mundiais, é quase sempre possível encontrar para a maioria dos

doentes, um dador compatível. [41]

Em Portugal, foi inaugurado o primeiro banco público de CE do cordão umbilical, o –

LusoCord, - situado nas instalações do Centro de Histocompatibilidade do Norte [55],

após Despacho publicado em Diário da República n.º 14879/2009 de 2 de Julho de 2009

“A existência de um banco público de células do cordão umbilical permite colocar à

disposição de todos os cidadãos células progenitoras hematopoiéticas necessárias para a

terapêutica de transplantação em determinadas doenças hematológicas, imunológicas ou

120

outras. O banco público aceitará apenas dádivas altruístas, que serão colocadas à

disposição de todos os potenciais receptores (…)”

Os bancos de natureza privada de SCU, comummente associados a centros de

biotecnologia, também foram constituídos com o objectivo de colher e criopreservar

células do cordão umbilical, mas somente para a utilização exclusiva da própria criança,

bem como para o uso familiar [43].

Em 2003, foi criado o primeiro laboratório privado de SCU no nosso País, a

Crioestaminal (figura 32) constituído por um conjunto de profissionais e empresas da

área da saúde, sendo actualmente líder no isolamento e criopreservação de CE do SCU,

com mais de 40.000 unidades criopreservadas [44]. Actualmente, encontram-se

implementados, a nível nacional, cerca de seis laboratórios privados de criopreservação

das CE do SCU.

Figura 32 – Crioestaminal - Primeiro laboratório privado de SCU no nosso País.

“A presente lei estabelece o regime jurídico da qualidade e segurança relativa à dádiva,

colheita (…) preservação, armazenamento (…) e aplicação de tecidos e células de

origem humana (…) O disposto na presente lei é aplicável (…) tecidos e células de

origem humana destinados à utilização em seres humanos, incluindo células estaminais

hematopoiéticas (…) do sangue do cordão umbilical (…)” In Diário da República - Lei

n.º 12/2009 de 26 de Março de 2009.

121

23.2 – Comparação entre bancos públicos e privados do SCU

Em Março de 2008, publicou-se um estudo por Nietfeld no Jornal Biology of Blood and

Marrow Transplantation, no qual se calculava a probabilidade vitalícia (até à idade de

70 anos) de um indivíduo nos Estados Unidos se submeter a um transplante de CE. A

probabilidade de um transplante autólogo usando as suas próprias CE é de 1 em 435,

enquanto a probabilidade de um transplante alogénico de um dador compatível (como

por exemplo um irmão) é de 1 em 400 e a probabilidade exacta de qualquer tipo de

transplante com CE é de 1 em 217 [45].

O National Marrow Donor Program prevê que, por volta de 2015, ocorra, a nível

mundial, 10.000 transplantes de SCU por ano, resultantes de SCU armazenado em

bancos públicos. É pois, de importância vital, aumentar as dádivas de SCU em todo o

mundo [46].

Em Maio de 2006, A World Marrow Donor Association (WMDA) (Associação

Mundial de Dadores de Medula) através da sua Policy Statement for the Utility of

Autologous or Family Cord Blood Unit Storage (Declaração de Princípios para a

Utilidade da Armazenagem de Unidades de Sangue do Cordão, Autólogo ou de

Familiares), estipulava que, o uso de células autólogas de SCU para tratamento da

leucemia infantil é contra-indicado uma vez que as células pré-leucémicas estão

presentes na altura do nascimento. Assim sendo, as células autólogas do SCU são

portadoras das mesmas anomalias genéticas do dador e não devem ser usadas no

tratamento de doenças genéticas [47].

O factor limitante para o uso de células do SCU como fonte de células progenitoras

hematopoiéticas é o número reduzido de células contidas em cada unidade colhida

fazendo com que os bancos do SCU atendam preferencialmente crianças ou doentes

com baixo peso corporal [48]. Por outro lado, a limitação dos bancos privados ou

familiares para transplante autólogo de SCU, relaciona-se com quantidade de células

obtidas num único cordão que poderá servir para o tratamento de doentes que não

excedam 50 quilos [49]. Os bancos públicos, ao contrário dos bancos privados, têm a

possibilidade de utilizar mais do que uma unidade de SCU compatível, devido ao

elevado número disponível de amostras, sem o inconveniente de os mesmos erros

122

congénitos serem novamente transfundidos ao doente. Por outro lado, o transplante

alogénico substitui as células anómalas da MO, permitindo uma nova hematopoiese e

um novo sistema imunitário o que resulta na erradicação de células sobreviventes ao

tratamento antes da transfusão, no caso de doenças malignas [50].

No futuro, a criopreservação do células do SCU no mundo terá tendência para ser

efectuada em bancos públicos, esta evolução já se começa a verificar nos Estados

Unidos, onde se concentra o maior número de unidades em bancos privados [51].

Entendimento similar é enfatizado pela Organização Mundial da Saúde e pelo Conselho

da Europa ao apontarem que o uso do SCU, num contexto autólogo, não é geralmente

recomendado [52] [53].

A importância da criopreservação das CE do SCU é um dado inquestionável, sendo

reforçado pelo próprio Estado Português, ao criar o primeiro Banco Público no nosso

país. No entanto, existem diferenças a salientar entre bancos públicos e privados, entre

as quais [54];

• O direito sobre as CE - nos bancos públicos o dador renúncia aos direitos de

posse das CE, enquanto que nos bancos privados o cliente é o proprietário das

CE e todos os direitos sobre as mesmas são exclusivos;

• A nível financeiro - no banco público o serviço é gratuito, dado estarmos

perante uma doação, enquanto que no banco privado o cliente paga o serviço ao

laboratório de criopreservação;

• O acesso às células - no banco público ficam ao dispor da comunidade, não

ficando ‘reservadas’ para o uso exclusivo do dador, no banco privado os pais

têm a garantia que a amostra está ao seu dispor e só poderá ser utilizada

mediante a autorização destes ou do bebé, quando este atingir a maioridade. Nos

casos de medicina regenerativa é muito vantajoso que os próprios tenham acesso

às suas células;

• O acesso à informação - no banco público, está ao dispor dos bancos

internacionais, no banco privado toda a informação é confidencial;

123

• As oportunidades terapêuticas futuras - no banco público as células poderão

não estar disponíveis, num banco privado as células estarão disponíveis para o

próprio para qualquer terapia;

• Disponibilidade da amostra - a localização de um dador compatível pode

demorar semanas ou meses no caso de bancos públicos, muitas vezes, poderá

não se conseguir localizar uma amostra compatível, no banco privado a amostra

é disponibilizada imediatamente,

• A incidência de GVHD - Num banco público é maior a incidência de GVHD ao

contrário do que ocorre num banco privado, em que o transplante é efectuado

num contexto autólogo, ou seja o dador e receptor são, em geral, aparentados;

• A Compatibilidade - no banco público a compatibilidade varia, podendo ser

difícil obter células compatíveis, especialmente, para as minorias étnicas e casais

com identidade mista. No banco privado o transplante Autólogo é 100%

compatível e, entre irmãos, apresenta 25% de probabilidade de compatibilidade.

24 – Transplante de células estaminais do sangue cordão

umbilical

A obtenção de dadores de HSCs é um desafio global. Mesmo no mundo ocidental, em

que existem mais de nove milhões de dadores registados, cerca de 50% dos doentes que

necessitam de dadores HLA (Human Leukocyte Antigen) compatíveis são incapazes de

o conseguir. Além disto, o tempo entre encontrar um dador compatível e o transplante

propriamente dito pode levar 6 meses ou mais. O transplante de CE do SCU tem

aumentado a disponibilidade de células alogénicas para transplantes em doentes nos

quais a procura de dadores adultos foi negativa ou demorada [57].

Na última década, vários estudos demonstraram o potencial da utilização do SCU como

fonte de HSCs, podendo ser utilizado na reconstituição da hematopoiese, em doentes,

após tratamento com altas doses de radioterapia e quimioterapia. Actualmente, o SCU é

124

uma fonte alternativa de HSCs, sendo utilizado por várias instituições nacionais e

internacionais de transplante como uma modalidade efectiva e de utilização crescente

[57].

Diversos estudos têm demonstrado que o SCU, quando recolhido imediatamente após o

parto, contém CE que permanecem viáveis após criopreservação por um período de pelo

menos 15 anos [58] [45]. Após quimio e radioterapia mieloablativa, o transplante de

HSCs (CD34+) do SCU criopreservadas, pode repor e substituir funcionalmente a

hematopoiese [38].

O primeiro transplante de SCU como fonte de células para reconstituição de medula

óssea ocorreu em 1988, quando uma equipa de cientistas franco-americana em França,

tratou com sucesso uma criança com anemia de Fanconi [60]. Foi utilizada uma amostra

de SCU, previamente recolhida e criopreservada nos EUA, pertencente ao irmão que

apresentava compatibilidade HLA, com o objectivo de reconstituir a função medular

após quimioterapia mieloablativa. Um ano mais tarde, 98% do sistema linfático do

doente era originado a partir de células do dador sem manifestações hematológicas da

patologia [60]. Na altura, ficou demonstrado que o SCU contém HSCs em quantidade

suficiente para a reconstituição hematopoiética e imunológica da medula do doente.

Este procedimento clínico pioneiro veio despertar o interesse (e consequentemente a

investigação) sobre o potencial das CE do SCU no tratamento de diversas doenças. Em

1993, nos EUA, foi efectuado o primeiro transplante de HSCs do cordão umbilical de

um dador não relacionado com o doente. [39]

Em 2007, realizou-se no nosso País, o primeiro transplante com recurso a CE do SCU

criopreservadas num banco privado português. A criança, de 14 meses, após o

diagnóstico de SCID, foi submetida ao transplante de HSCs recorrendo ao SCU do seu

irmão, que os pais tinham criopreservado. A intervenção foi realizada com sucesso no

Instituto Português de Oncologia do Porto, tendo a criança desenvolvido um sistema

imunitário funcional [61].

Decorridos vinte anos após o primeiro transplante com células do SCU, é cada vez

maior o interesse nesta fonte não controversa de CE, tendo sido realizados mais de 20

000 transplantes em todo o mundo, cerca de metade em indivíduos adultos [62] [63]. A

125

grande maioria destes transplantes foi efectuada num contexto alogénico [38]. Neste

contexto, as CE do SCU podem ser utilizadas em diversas doenças tais como anemias,

leucemias, linfomas, tumores sólidos e outras doenças hereditárias ou adquiridas do

sistema sanguíneo ou imunitário. Na tabela 6, encontram-se descritas várias patologias

em que a aplicação do SCU pode resultar numa terapia com sucesso [37] [39] [40].

Num contexto autólogo, as aplicações, embora presentemente em menor número,

abrangem doenças como; a anemia aplástica adquirida e alguns tipos específicos de

tumores sólidos (neuroblastomas e retinoblastomas) [64].

Nas leucemias e linfomas assim como em doenças genéticas e/ou congénitas a

utilização autóloga poderá estar limitada, uma vez que a amostra poderá conter

“clusters” leucémicos ou células anómalas. Contudo, um estudo recente indica que a

eliminação das células patológicas, que possam estar a contaminar a amostra de SCU,

poderá alargar a gama de doenças tratadas num contexto autólogo, tal como tem

ocorrido com a utilização de sangue periférico mobilizado [65]. Um artigo publicado,

em 2007 pelo jornal oficial da Academia Americana Pediátrica, relata um caso clínico

de uma criança diagnosticada com leucemia linfoblástica aguda que recebeu CE do seu

próprio SCU, que haviam sido criopreservadas à nascença. Dois anos após o

transplante, a criança mantém-se saudável e sem recaídas [66].

Tabela 6 - Patologias em que podem ser utilizadas células estaminais do sangue do

cordão umbilical;

Patologias malignas:

o Leucemia linfoblástica aguda;

o Leucemia mielóide aguda;

o Leucemia mielóide crónica;

o Leucemia mielóide crónica juvenil;

o Linfoma de Burkitt;

o Liposarcoma;

o Síndrome Mielodisplásico;

Deficiências Medulares;

o Anemia aplástica;

o Anemia aplástica idiopática;

o Síndrome Schwachman-Diamond;

o Disqueratose congénita;

o Anemia de Fanconi;

o Trombocitopenia megacariocítica;

o Sindroma de Kostmann;

126

o Tumores sólidos (ex. neuroblastoma ou retinoblastoma);

o Doença de Hodgkin;

o Linfoma Não-Hodgkin;

Hemoglobinopatias:

o Talassémia (anemia de Cooley);

o Anemia das células falciformes;

Patologias metabólicas:

o Adrenoleucodistrofia;

o Doença de Batten;

o Doença de Gunther;

o Doença de Krabbe;

o Síndrome de Hunter;

o Síndrome de Hurler;

o Síndrome de Lesch-Nyhan;

o Síndrome de Maroteaux-Lamy;

Imunodeficiências:

o Síndrome de Omenn;

o Deficiencias imunitárias combinadas severas;

o Disgénese reticular;

o Displasia tímica;

o Leucodistrofia celular globóide;

o Síndrome de Wiskott Aldrich;

o Síndrome Linfoproliferativo ligado ao cromossoma X;

Outras doenças:

o Síndrome de Evans;

o Osteopetrose;

o Histiocitose das células de Langerhans;

127

24.1 – Comparação entre transplante de células estaminais do sangue

do cordão umbilical e células estaminais da medula óssea.

O sangue do cordão umbilical é hoje considerado uma fonte viável de HSCs, com uma

eficácia semelhante à das células provenientes da MO, mas com algumas vantagens a

destacar tais como [6] [14] [67];

1. A colheita de sangue do cordão umbilical é não invasiva sem qualquer risco para

a mãe ou para o bebé;

2. Existe menor probabilidade de induzir risco de GVHD aguda e crónica [39];

3. Em transplantes alogénicos não é necessário um nível tão elevado de

compatibilidade para o sucesso do transplante (são aceites 1-3 discrepâncias

HLA) [68] [69];

4. Uma vez que as amostras são criopreservadas a sua disponibilidade é imediata,

possibilitando uma maior acessibilidade e menor tempo de espera aquando do

transplante, (esta vantagem é de 21 a 37 dias, em relação aos dadores de MO)

[70];

5. As amostras podem ser facilmente caracterizadas, criopreservadas e guardadas

durante anos sem que ocorra perda de viabilidade;

6. Menor risco de infecção por vírus latentes como CMV e o vírus Epstein-Barr

(menos de 0,1% dos recém-nascidos saudáveis são positivos para CMV, contra

10%- 60% dos dadores adultos voluntários),

7. São células neonatais e por isso possuem uma ontogenia primitiva não tendo

sido expostas a desafios imunológicos [69];

8. Apresentam maior capacidade de proliferação e expansão. quando comparadas

com as células da MO [70];

9. As células são mais primitivas (em termos imunológicos e de desenvolvimento),

apresentando um potencial proliferativo superior, taxas de divisão mais elevadas

e telómeros maiores [69] [70] [71];

10. As células do SCU não foram sujeitas a agressões, não acumulando por este

motivo lesões ao longo da vida (especialmente ao nível do DNA); uma vez

colhidas e congeladas, as células não sofrerão agressões ambientais como

radiação, agentes químicos e contactos virais, estando assim protegidas e

prontamente disponíveis para o uso;

128

A maior limitação do transplante com células do SCU está relacionada com a

quantidade de células CD34+ existentes na amostra [72]. Apesar da concentração de CE

no SCU ser elevada, o volume de sangue normalmente colhido é inferior ao volume

processado a partir da MO de um adulto, pelo que a quantidade real de células obtidas a

partir do SCU é menor (aproximadamente um log a menos de células progenitoras

hematopoiéticas). Esta limitação pode condicionar o TSCU (transplante de sangue do

cordão umbilical) em adultos, pois o peso do doente determina o número de CE

necessárias para o transplante. Apesar desta limitação, o número de doentes adultos

transplantados com HSCs do SCU tem aumentado consideravelmente [73].

Por outro lado, as baixas doses de CE do SCU estão associadas a um atraso na

reconstituição hematopoética e imunológica em comparação com o transplante de MO,

com um consequente maior período de neutropenia, maior necessidade de suporte

transfusional, e maior duração de hospitalização [74]. A ocorrência de infecções

oportunistas no período de mielossupressão é um dos principais eventos adversos

relacionados com o transplante de HSCs, que influencia o sucesso do transplante e

consequentemente a sobrevida do paciente [75].

Como foi descrito atrás, o número de células transplantadas é um dos principais factores

de recuperação e sobrevivência após o transplante [14] [15], pelo que diversas

estratégias (algumas em ensaio clínico) têm sido avaliadas para aumentar o número de

células transplantadas e/ou facilitar a recuperação hematológica e imunológica do

doente, entre as quais se destacam; [62] [76];

1. A transplantação múltipla, que consiste na infusão de várias unidades de SCU;

2. A expansão ex vivo das células CD34+, que poderá ser conseguida através da

aplicação de citocinas, que promovem a sobrevivência e proliferação celulares;

3. A co-transplantação das células do SCU com:

• Células hematopoiéticas do cordão expandidas ex vivo;

• Células CD34+ haploidênticas provenientes, por exemplo, da medula

óssea;

• CE mesenquimais, que desempenham uma função de suporte, fornecendo

um microambiente necessário para a reconstituição hematopoética;

129

4. A aplicação directa das células na MO vs as infusões endovenosas, evitando a

perda de células que poderiam ficar retidas noutros órgãos (como os pulmões e o

fígado).

Ultrapassada a limitação da dose celular, a taxa de sucesso do transplante de SCU é

comparável ou mesmo superior à do transplante de MO [62].

24.2 – Dose celular na unidade de sangue do cordão umbilical

A análise de alguns bancos de SCU revela que, apenas cerca de 25% das unidades

armazenadas contêm células suficientes para a realização de um transplante em

indivíduos acima de 50 kg [48].

No contexto de TSCU, uma colheita bem sucedida possui, em média, 120ml (variação

de 60 a 300ml) e contém entre 0,8 a 3x109 células nucleadas totais (CNT). A colheita da

amostra, o processamento e o descongelamento, geralmente resultam numa perda de

células totais, células CD34+ e CFU, na ordem de 10% a 20% do volume inicialmente

colhido [77]. A maioria dos bancos de SCU processa a unidade colhida para concentrar

a fracção mononuclear e reduzir o volume das unidades, com o objectivo de ampliar a

capacidade de armazenamento das unidades de SCU congeladas. A dose celular

registada geralmente refere-se àquela antes do congelamento, após o processamento

[78].

Para um transplante com sucesso recomenda-se, pelo menos 2x107 CNT por kg do

paciente, sendo que o número de CNT correlaciona-se directamente com a

probabilidade e a velocidade de recuperação. Deste modo, a maioria dos centros de

transplante pediátrico procura como alvo valores mais altos, como 5x107 CNT/kg. Para

adultos, raramente uma única unidade terá mais do que 3x107 CNT/kg [79]. Além da

celularidade, outro factor que parece influenciar a repopulação mais lenta da MO é a

imaturidade das células progenitoras do SCU, que pode necessitar de um número maior

de divisões para se diferenciar [80].

130

O número de CNT é semelhante entre os bancos de SCU para produtos semelhantes.

Entretanto, o número de subpopulações celulares, como as células CD34+, pode variar

muito, em função das variações na remoção de neutrófilos durante o processamento, o

que torna a comparação da quantidade de células CD34+ entre os bancos difícil de

interpretar [77].

Apesar das contagens de células CD34+ e das CFU serem realizadas no momento da

criopreservação, na maioria dos bancos de SCU a contagem de CNT é a mais utilizada

na escolha da unidade, por ser mais facilmente padronizada. Quando disponível, a

contagem de células CD34+ pode ser utilizada para a triagem de unidades provenientes

de crianças portadoras de síndromes de imunodeficiências graves [77].

Para minimizar os riscos de baixa celularidade, os bancos de SCU devem tomar todas as

medidas necessárias para reduzir a perda de células das unidades de SCU. Ao escolher

uma unidade de SCU, deve-se sempre considerar a perda e calcular a dose celular

desejada, considerando-a. Não existe correlação entre o tempo de criopreservação do

SCU e os resultados do transplante. Unidades criopreservadas, há mais de dez anos,

estão a ser usadas com sucesso actualmente [104].

A média de tempo para se atingir a contagem de granulócitos acima de 500/µl é de

cerca de 29 dias para crianças e 32 dias para adultos, conforme o levantamento de 527

transplantes de SCU de dadores não-relacionados. Neste grupo de doentes, o número

médio de células nucleadas infundidas foi de 1,7 x107/ kg, nos receptores adultos e 4,5

x107/kg, nas crianças [81]. A recuperação da contagem plaquetária também é lenta,

ocorrendo por volta de 57 dias após a infusão [81]. Quando se analisa apenas a

população adulta submetida a transplante de SCU não-relacionado, este tempo é ainda

maior, levando cerca de 69 dias para se atingir a contagem de plaquetas acima de

20.000/mm3 [82]. Um número baixo de células nucleadas utilizado no transplante de

SCU está relacionado com um pior prognóstico no pós-transplante, provavelmente

relacionado com a ocorrência de infecções oportunistas [81].

O Eurocord é um registo internacional sediado em Paris, que conta com a participação

de mais de 100 centros médicos de transplante, localizados principalmente na Europa.

No levantamento realizado pela Eurocord, de 102 crianças portadoras de leucemias

131

agudas e tratadas com transplante de células de SCU familiar ou não relacionado, o

factor mais importante que influenciou a recuperação dos neutrófilos, foi a dose de

células nucleadas infundidas maior que 3,7 x 107/kg do receptor. Este mesmo

levantamento confirmou a baixa taxa de incidência de GVHD crónica, cerca de 13% nos

transplantes com dador de SCU relacionado, e 28% dos transplantes com SCU não-

relacionado, quando comparados com os pacientes tratados com transplante de MO não-

relacionados, cuja incidência é de cerca de 50 a 60% [83].

24.3 – Utilização de duplo cordão

Para sobrepor a limitação da dose celular, o uso simultâneo de duas unidades de SCU

tem sido utilizado nos últimos anos com resultados interessantes e encorajadores. A

acção sinérgica das duas unidades permite atingir o número mínimo de células para a

realização do transplante, contudo, poderá gerar uma maior resposta aloimune e maior

efeito de GVHD [84] [15]. Apesar das duas unidades serem usadas concomitantemente,

apenas uma contribui para a hematopoiese. Não foram identificados até o momento, os

factores para determinar qual a unidade que será a "vencedora". Nenhum dos factores

estudados (contagem de CNT, CD34+, CD3+, compatibilidade HLA, viabilidade,

compatibilidade ABO, sexo e ordem de infusão) parece contribuir para o predomínio de

uma unidade sobre a outra [15]. Para se seleccionar as duas unidades, devem-se

respeitar os mesmos critérios de compatibilidade HLA, não sendo permitidas mais que

duas incompatibilidades em HLA-A e -B de baixa resolução e HLA-DRB1 de alta

resolução entre o dador e o receptor e entre as duas unidades de SCU. O duplo TSCU,

entretanto, está associado a maior risco de GVHD aguda e possivelmente GVHD

crónica [85]. A GVHD pode ocorrer até ao dia +100 pós-transplante, sendo os órgãos

mais afectados a pele, fígado e tracto gastrointestinal a tabela 7 mostra os níveis de

graduação das principais manifestações da GVHD aguda. A GVHD crónica é

classificada como limitada e extensa (tabela 8) [115].

Grau Pele Figado Intestino

I Exantema Maculopapular <25%

da superfície corporal.

Bilirrubina entre 2-3

mg/dl

Diarreia 500 –

1000ml/dia

132

Tabela 7 – Manifestações clínicas da GVHD aguda

Tabela 8 – Manifestações clínicas da GVHD Crónica

25 – O potencial do sangue do cordão umbilical em medicina

regenerativa

A possibilidade de aplicação do SCU em doenças não hematológicas tem suscitado

bastante interesse na comunidade científica. Este interesse deve-se principalmente à

II Exantema Maculopapular entre

25-50% da superfície corporal.

Bilirrubina entre 3-6

mg/dl

Diarreia 500 –

1000ml/dia

III Eritroderma Generalizado. Bilirrubina entre 3-6

mg/dia

Diarreia > 1500

ml/dia

IV Descamação e bolhas. Bilirrubina superior

a 15 mg/dl

Dor intensa – Ílio

paralítico

GVHD Crónica limitada

Um ou ambos os critérios;

1- Envolvimento da pele localizado

2- Disfunção hepática devido a GVHD crónica

GVHD Crónica extensa

1- Envolvimento generalizado da pele ou

2- Envolvimento localizado e/ou disfunção hepática devido à GVHD crónica

Mais

3- A) Histologia hepática mostrando hepatite crónica, com necrose e cirrose ou,

B) Envolvimento ocular ou

C) Envolvimento das glândulas salivares ou mucosa oral demonstrado em

biópsia ou

D) Envolvimento de outros órgãos alvo

133

identificação, no SCU, de diversas populações de CE, algumas das quais com uma

elevada plasticidade e apresentando características muito semelhantes às CE

embrionárias. No entanto, ao contrário das CE existentes nos tecidos embrionários ou

fetais, a utilização clínica das CE do SCU (consideradas células adultas) não levanta

quaisquer questões éticas ou morais.

A medicina regenerativa é uma área da ciência que aplica princípios da biologia celular

e de engenharia para a reparação e/ou substituição de tecidos ou órgãos que perderam as

suas funções devido ao envelhecimento, doença, lesões ou defeitos congénitos. A

terapia com CE do SCU constitui um campo promissor e de rápido desenvolvimento na

medicina regenerativa, podendo vir a ser muito útil no tratamento de patologias que,

hoje em dia, ainda não têm tratamento eficaz [86].

Embora no presente a aplicação das CE do SCU se restrinja fundamentalmente a

doenças hematológicas benignas e malignas, experiências em modelos animais sugerem

que, no futuro, a gama de aplicações na terapia celular com estas células poderá alargar-

se a doenças de foro não hematológico ou imunológico, como doenças

neurodegenerativas, diabetes, disfunções hepáticas e lesões vasculares [87]. Em 2002,

foi isolada uma subpopulação de CE mesenquimais pluripotentes da medula óssea, ou

seja, CE capazes de se diferenciar em diferentes tipos celulares do organismo adulto,

desde hepatócitos a neurónios [88]. CE mesenquimais com propriedades similares

foram recentemente identificadas no SCU [89]. As CE do SCU podem deste modo

transformar-se não só em células do sistema hematopoiético, mas igualmente em células

de outras linhagens celulares, como células neuronais [89] células do fígado, [89] [87]

[90] células ósseas, células adiposas, [91] ou células endoteliais [92]. Em seguida

descrevem-se alguns dos avanços mais relevantes.

25.1 – No tratamento de patologias cardiovasculares / vasculares

As doenças cardiovasculares são uma das principais causas de morte e incapacidade,

sobretudo ao nível dos países mais desenvolvidos, constituindo um dos grandes desafios

da medicina actual. As CE do SCU são uma fonte interessante para a terapia celular no

134

contexto cardiovascular, dado o seu potencial cardiomiogénico. Diversos trabalhos têm

demonstrado que, em modelos animais, as células do SCU contribuem para a

angiogénese, melhorando a função cardíaca [93].

Um estudo realizado, demonstrou a facilitação de neovascularização em murganhos

com SCID que receberam infusões de células CD133+ do SCU, após ligação da artéria

coronária descendente anterior [94]. Num estudo semelhante, uma equipa de

investigadores demonstrou a diferenciação de células CD133+ no SCU em células

semelhantes a cardiomiócitos, existentes em culturas paralelas, procedendo à injecção

destas mesmas células no miocárdio de murganhos. Apesar de as células serem

alogénicas, não foram verificados eventos de rejeição nestes animais [95]. A

diferenciação in vitro de células de SCU em cardiomiócitos também foi reportada por

outros autores, demonstrando a sua capacidade de diferenciação e seu potencial no

tratamento das DCV (doenças cardiovasculares). A terapia combinada de injecção de

células do SCU com o factor de crescimento de fibroblastos (FGF) promoveu a

neoangiogénese nas regiões isquémicas, porém sem efeitos na melhoria da função

ventricular [96]. Utilizando o mesmo modelo de injecção de células de SCU combinada

ao FGF, um estudo na mesma linha que o anterior demonstrou uma melhoria da função

do ventrículo esquerdo e ausência de rejeição após o transplante de SCU humano em

camundongos [94]. Resultados similares foram obtidos com a injecção de células

CD34+ de SCU em camundongos com EAM (enfarte agudo do miocárdio),

demonstrando o grande potencial angiogénico das CE do SCU, sendo observada uma

melhoria do desempenho cardíaco [97].

Embora existam diversos estudos pré-clínicos da aplicação de CE do SCU no

tratamento das DCV, poucos são os relatos da sua prática clínica. No entanto, num

estudo realizado em 2008, num doente com cardiomiopatia dilatada que recebeu CE do

SCU, observou-se uma melhoria da fracção de ejecção de 30% para 55% e diminuição

da insuficiência cardíaca [98].

Um dos parâmetros que tem sido estudado é o modo de administração das CE. A

aplicação destas células pode ser feita através da infusão directa na zona lesada

(miocárdio), (figura 33) na circulação sanguínea ou nas coronárias. Geralmente, ocorre

migração selectiva das CE para o tecido danificado, observando-se um aumento da

densidade de capilares no local, diminuição da área do enfarte e melhoria da função

cardíaca, mesmo na ausência de miogénese [99].

Figura 33 – Aplicação das células do SCU directamente na zona lesada do miocárdio

Apesar dos mecanismos da

conhecidos, várias hipóteses têm sido levantadas: 1) há quem defenda que as CE do

SCU se diferenciam em cardiomiócitos, no entanto, por si só, esta diferencia

seria suficiente para a recuperação da função cardíaca [100]; 2) outros estudos

evidenciam que o principal mecanismo de recuperação resulta da produção de factores

de crescimento angiogénicos, devido à hipó

como in vitro a formação de novos vasos sanguíneos, bem como a migração de CE

endógenas do próprio coração; 3) um outro fenómeno, que também poderá contribuir

para a recuperação cardíaca, é a capacidade de

conseguida através do controlo da expres

resposta inflamatória [101].

25.2 – No tratamento de patologias do sistema nervoso central

As agressões que atingem o SN

perinatal ou pós-natal. No período

cérebro fetal, podem ocorrer doenças genéticas (

cal, diminuição da área do enfarte e melhoria da função

a de miogénese [99].

Aplicação das células do SCU directamente na zona lesada do miocárdio

Apesar dos mecanismos da regeneração cardíaca não serem ainda totalmente


SCU se diferenciam em cardiomiócitos, no entanto, por si só, esta diferencia

para a recuperação da função cardíaca [100]; 2) outros estudos

pal mecanismo de recuperação resulta da produção de factores

de crescimento angiogénicos, devido à hipóxia tecidular, observando-se tanto

ção de novos vasos sanguíneos, bem como a migração de CE


para a recuperação cardíaca, é a capacidade de modelação da inflamação, que é

conseguida através do controlo da expressão de moléculas pertencentes à cadeia da

No tratamento de patologias do sistema nervoso central

As agressões que atingem o SN (sistema nervoso) podem ocorrer no período pré

natal. No período pré-natal e perinatal, durante o desenvolvimento do

odem ocorrer doenças genéticas (como erros inatos do metabolismo),

135

cal, diminuição da área do enfarte e melhoria da função

Aplicação das células do SCU directamente na zona lesada do miocárdio.

regeneração cardíaca não serem ainda totalmente


SCU se diferenciam em cardiomiócitos, no entanto, por si só, esta diferenciação não

para a recuperação da função cardíaca [100]; 2) outros estudos

pal mecanismo de recuperação resulta da produção de factores

se tanto in vivo

ção de novos vasos sanguíneos, bem como a migração de CE


modelação da inflamação, que é

são de moléculas pertencentes à cadeia da

podem ocorrer no período pré-natal,

natal e perinatal, durante o desenvolvimento do

mo erros inatos do metabolismo),

136

agressões ambientais (como infecções por CMV, toxoplasmose, entre outros), acidentes

vasculares cerebrais e encefalopatia isquémica pós-anóxica. Na vida pós-natal poderá

ocorrer traumatismo crânio-encefálico, trauma raquimedular, meningoencefalites,

epilepsias do lobo temporal, acidente vascular cerebral isquémico, ou hemorrágico,

doenças auto-imunes, (esclerose múltipla) e doenças degenerativas como a doença de

Parkinson, Coréia de Huntington, Esclerose Lateral Amiotrófica e Alzheimer. A

capacidade de regeneração do SNC (sistema nervoso central) é bastante reduzida, pelo

que a terapia com CE exógenas poderá ter um papel importante na regeneração neural,

contribuindo para a recuperação funcional dos doentes [102].

Através de marcadores específicos, vários estudos mostraram ser possível diferenciar in

vitro células do SCU em neurónios e oligodendrócitos funcionais. Esta capacidade que

as células do SCU possuem para se diferenciarem em vários tipos de células neurais

parece ser um dos factores chave para a regeneração das lesões da medula espinal em

murganhos [102]. Em estudos realizados em animais relativamente a doença de

Parkinson, de Alzheimer e de Huntington, verificou-se que a infusão endovenosa de CE

do SCU parece retardar a progressão da doença, bem como aparecimento dos sintomas,

com prolongamento da sobrevida [103]. Da mesma forma, a administração endovenosa

de SCU em murganhos com acidente vascular cerebral (AVC) induz angiogénese no

tecido isquémico, contribuindo para a neurogénese, bem como para a redução da área

afectada e consequente recuperação dos défices físicos e comportamentais associados à

doença. Os efeitos observados parecem ser dependentes tanto da via de administração

(intravenosa ou intraperitoneal), como da dose celular [103] (figura 34).

Figura 34 – Aplicação de células do SCU numa região saudável do cérebro, muito

próxima do local deteriorado em consequência de um AVC.

137

O objectivo é que estas libertem químicos que estimulem novas células cerebrais e que

permitam aos vasos sanguíneos se desenvolverem, enquanto o tecido começa a

regenerar e a reduzir a inflamação.

Em modelos animais demonstrou-se que, após a infusão de células do SCU, as CE

transplantadas migram para a zona da lesão, permitindo a regeneração dos axónios e a

recuperação da função motora [102]. Relativamente a estudos em doentes, foi publicado

o caso de uma paciente paraplégica de 37 anos que, após transplante com células do

SCU, apresentou uma recuperação parcial da percepção sensorial e da mobilidade nos

membros inferiores [104].

Em modelos pré-clínicos de isquémia cerebral, observou-se que a injúria cerebral

estimula a migração de células do SCU para o local da lesão. O uso de CE (CD34+), 48

horas após o AVC, desencadeou um aumento da vascularização cerebral local. Apesar

da administração das células de SCU, 24 horas após o AVC ter sido eficaz, o tempo

óptimo para a sua utilização após o acidente não foi estabelecido. À semelhança do que

se passa com o tecido cardíaco, ainda são desconhecidos os mecanismos moleculares

responsáveis pela regeneração neural após o transplante de células, mas a redução da

inflamação, a protecção contra a apoptose, a neovascularização, a migração de células

progenitoras neurais endógenas e a reorganização da fibra nervosa parecem contribuir

para tal [101].

Recentemente foi iniciado um outro ensaio clínico com o objectivo de avaliar a

segurança e eficácia da infusão autóloga das células do cordão umbilical de recém-

nascidos com encefalopatia isquémica neonatal. Para além deste ensaio, que se encontra

a recrutar doentes, nos últimos três anos foram usadas várias amostras criopreservadas

de bancos privados para a utilização autóloga em crianças com paralisia cerebral e outro

tipo de lesões cerebrais. As amostras têm sido solicitadas pela Duke University, do

estado da Carolina do Norte. Há relatos de melhorias significativas nalguns doentes no

período pós-infusão, não estando ainda publicados os resultados [99].

138

25.3 – No tratamento da Diabetes Mellitus

Uma das patologias para a qual está a ser avaliada a utilização das células do SCU, já

em humanos, é a diabetes tipo 1 (figura 35). O objectivo do ensaio clínico em curso, a

decorrer desde 2005, é estudar o potencial do TSCU autólogo para minimizar o ataque

auto-imune do organismo e restaurar a produção de insulina, indispensável no controle

dos níveis de glucose no sangue. Este ensaio tem por objectivo avaliar a hipótese

terapêutica de que as células do SCU poderão induzir uma tolerância imunológica,

impedindo a destruição das células β-pancreáticas, com a consequente produção de

insulina [105]. Foram examinadas 20 crianças com diabetes tipo I, de idades

compreendidas entre os dois e os sete anos. Sete crianças receberam uma infusão

intravenosa de CE isoladas a partir do seu próprio SCU, criopreservado à nascença. As

restantes receberam tratamento normal com insulina. Nas crianças tratadas com SCU

observou-se um aumento das células T reguladoras (células com papel central na

regulação da resposta imune). Adicionalmente, estas crianças apresentavam melhorias

nos níveis de glucose no sangue, necessitando de menores doses diárias de insulina.

Face aos resultados, os investigadores pretendem agora alargar o estudo a mais doentes,

para explorar os benefícios da terapia com células do SCU na diabetes tipo I [105].

Figura 35 – Células do SCU no tratamento da diabetes tipo I

139

Os primeiros dados, apresentados no 67º Congresso da Associação Americana para a

Diabetes, demonstram um decréscimo nos níveis de HbA1c e menor dependência de

insulina diária, sugerindo um efeito benéfico das infusões autólogas de SCU nos

pacientes com diabetes tipo 1. Os autores sugerem ainda que as células do SCU possam

ter uma função de suporte daqueles tecidos ainda viáveis, favorecendo a proliferação

das células pancreáticas endógenas [106].

25.4 - Na terapia génica em doenças hematológicas

O transplante de HSCs é utilizado com sucesso no tratamento de um grande número de

doenças congénitas e adquiridas que envolvem o sistema linfo-hematopoético, contudo

as maiores limitações para aplicação do transplante de CE no tratamento de doenças

genéticas são as complicações imunológicas secundárias ao transplante alogénico,

incluindo a rejeição do enxerto e a necessidade de imunossupressão. Estas limitações

tendem a considerar a terapia génica utilizando o transplante de CE autólogas,

geneticamente corrigidas, para o tratamento destas mesmas patologias. O sucesso da

terapia génica com as HSCs depende da transferência efectiva do gene corrigido para as

CE pluripotentes, da expressão génica apropriada em células hematopoéticas e linfóides

maduras e da ausência de efeitos adversos na função destas células. As CE do SCU

possuem características especialmente importantes para a terapia génica, pois, por serem

mais jovens e com um potencial proliferativo maior, a repopulação medular por estas

células pode ser mais duradoura, oferecendo a expressão do novo gene para toda a vida

do doente. Existem evidências experimentais de que vectores retrovirais podem ser

utilizados para transferência de genes para CE do SCU [107].

Existem poucos estudos clínicos utilizando CE do SCU em terapia génica. Um estudo

realizado em 1995, relatou o tratamento com CE autólogas derivadas de SCU em três

recém-nascidos portadores de deficiência de adenosina desaminase (ADA). As células

CD34+ foram transfectadas com DNA complementar contendo o gene normal da ADA e

transplantadas num esquema não mieloablativo. Foi observada a presença destas células

e a expressão continuada do gene introduzido nos leucócitos da medula e do sangue

periférico até 18 meses após o transplante. Este resultado indica que as CE do SCU

podem ser modificadas geneticamente e transplantadas em recém-nascidos [108].

140

Por outro lado, a falta de disponibilidade de sangue para transfusões continua a ser um

problema crónico nos hospitais, dado que a procura é superior à oferta existente nos

bancos de sangue. De forma a colmatar esta situação, diversos investigadores têm

procurado encontrar uma solução para este problema, através da produção in vitro de

componentes sanguíneos e sangue artificial. Giarratana et al (2005) descreveram um

protocolo laboratorial em 3 passos que permitiu a expansão das HSCs do SCU por um

factor de 2 milhões, e a diferenciação completa destas células em glóbulos vermelhos. A

aplicação deste protocolo em larga escala poderá permitir que uma unidade de SCU

origine cerca de 4-10 triliões de glóbulos vermelhos adultos, equivalentes a 2-4

unidades de concentrados de eritrócitos [109].

25.5 - No tratamento de erros inatos do metabolismo

Os erros inatos do metabolismo constituem um grupo heterogéneo de doenças genéticas

raras que causam deficiência em várias enzimas e resultam na acumulação tecidular de

metabolitos. Por mais de duas décadas, o transplante de HSCs mostrou-se benéfico no

tratamento da síndrome de Hurler, adrenoleucodistrofia, leucodistrofia metacromática e

doença de Krabbe. Experiências com o uso de CE provenientes do SCU nas doenças

metabólicas têm vindo a aumentar nos últimos anos e os resultados são promissores

[110].

O estudo multicêntrico - Cord Blood Transplantation Study (COBLT) cujo principal

objectivo foi avaliar o uso do SCU em transplantes alogénicos, integrou 69 doentes no

total, com doenças de acumulação lisossómica e peroxissomal (mucopolissacaridoses I,

II e III e mucolipidose II – 36 pacientes; adrenileucodistrofia – 8; leucodistrofia

metacromática – 6; doença de Krabbe – 16; doença de Tay-Sachs – 3), os autores

concluíram que o transplante com células do SCU deve ser considerado tratamento de

primeira linha para doentes jovens portadores de doenças de acumulação lisossómica e

peroxissomal [110].

141

25.6 – Em Traumatologia e Ortopedia

Diferentes estudos comprovam o potencial de diferenciação das CE mesenquimais do

SCU em osteoblastos e células osteoprogenitoras [111] porém, poucos demonstram a

aplicação destas células na regeneração do tecido ósseo in vivo. Num trabalho recente,

Jager e colaboradores descrevem a aplicação de CE mesenquimais do SCU, combinadas

a matrizes de colagénio e fosfato tricálcico, no tratamento de deficiências em tíbias de

murganhos. Segundo os autores, os animais tratados com as células expandidas in vitro

apresentaram um aumento significativo na formação de tecido ósseo, quando

comparados com os animais que não receberam estas células [112]. Um estudo

realizado por Choi e colaboradores demonstrou que células mesenquimais do SCU,

quando cultivadas sobre uma membrana de atelocolagénio e na presença de factores

adequados, adquirem o fenótipo de condrócitos maduros, com alta expressão de

colagénio tipo II [113].

Além das HSCs e CE mesenquimais, o SCU é uma fonte importante de CE progenitoras

endoteliais, o que sugere a sua aplicação em terapias angiogénicas dos tecidos músculo-

esqueléticos. Diferentes estudos demonstram a aplicação de células mononucleares do

SCU no tratamento de lesões isquémicas de músculo estriado esquelético. De acordo

com os autores, estas células participam directamente na formação dos novos vasos

sanguíneos, ou, indirectamente, através da actividade parácrina, libertando factores que

estimulam a revascularização [114].

142

26 - Conclusões

A experiência dos últimos 20 anos, indica que as CE do SCU, devido à sua capacidade

de renovação e diferenciação, constituem uma importante ferramenta para a recuperação

funcional de tecidos e órgãos, possibilitando a melhoria e, até mesmo, a recuperação de

várias doenças. À medida que as propriedades destas células vão sendo delineadas e

compreendidas, vai sendo possível uma manipulação mais controlada das mesmas, tanto

in vitro como in vivo, o que permitirá, num futuro próximo, alargar a sua aplicação

clínica, às mais variadas áreas. O SCU é uma fonte importante de HSCs, tendo-se

constituído uma alternativa à MO e ao sangue periférico nos transplantes para a

recuperação da hematopoiese. A rápida disponibilidade do SCU e a baixa taxa de

GVHD, tanto aguda como crónica, na presença de uma maior disparidade HLA

representam as principais vantagens desta fonte de células. Diversos trabalhos têm

demonstrado a existência de diferentes populações de CE no SCU, com capacidade de

diferenciação em linhas celulares características dos três folhetos embrionários -

endoderme, mesoderme e ectoderme - o que, juntamente com a sua fácil obtenção, as

torna ideais para a regeneração de qualquer tecido do organismo. Os estudos em curso,

em modelos animais e em humanos, sugerem que as aplicações clínicas com CE do

SCU poderão estender-se a outras doenças, como por exemplo a doenças cardíacas,

doenças neurodegenerativas, disfunções hepáticas ou diabetes tipo 1, demonstrando o

potencial destas células em terapia celular e medicina regenerativa. É expectável que as

CE do SCU venham a ter um papel cada vez mais importante na medicina do futuro.

A grande desvantagem do transplante de CE do SCU, é o número limitado de células

existentes em cada unidade traduzindo-se numa recuperação lenta da hematopoiese e na

sua restrita utilização em adultos. Os melhores resultados são observados em receptores

que receberam unidades de sangue de cordão com uma dose alta de células

mononucleares, sendo que a dose mínima de células infundidas deverá ser superior a

2X107 CNT/kg do doente. A pouca informação acerca da viabilidade a longo prazo dos

transplantes celulares, da sua capacidade de maturação ou resposta a futuros estímulos

fisiológicos e patológicos está ainda por esclarecer. Será também necessário avaliar o

grau de pureza do transplante, ou seja se as células que surgem no local desejado são, de

facto, de origem estaminal e se ocorreu transdiferenciação. São ainda precisos estudos

que permitam optimizar os métodos de obtenção de um número suficiente de CE, que

143

determinem o número recomendável a transplantar em cada situação e que esclareçam

os mecanismos de migração, adesão e transdiferenciação destas células.

Pelo exposto, a importância da criopreservação do SCU é mais do que reconhecida, no

entanto, a doação a bancos públicos possui alguns critérios que limitam a utilização do

SCU. Por outro lado, o uso de células autólogas para doenças degenerativas, como

acontece hoje nos protocolos clínicos de cardiologia, neurologia e doenças autoimunes,

e de terapia génica, será facilitado a doentes que já possuam o SCU armazenado em

bancos privados.

Concluindo, a evidência recente aponta para o facto de o destino das CE não estar

definido à nascença, mas sim poder, literalmente, ser o que se quiser que seja.

144

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