RESISTÊNCIA DE PLANTAS RESISTÊNCIA DE PLANTAS DANINHAS A HERBICIDAS:DANINHAS A HERBICIDAS:

Pedro Jacob Christoffoleti Pedro Jacob Christoffoleti Área de Biologia e Manejo de Plantas Área de Biologia e Manejo de Plantas Daninhas Daninhas Departamento de Produção Departamento de Produção Vegetal - ESALQ/USPVegetal - ESALQ/USP

DEFINIÇÕES E SITUAÇÃO ATUAL DA RESISTÊNCIA NO BRASIL E MUNDO

RESISTÊNCIA DE RESISTÊNCIA DE PLANTAS DANINHAS A PLANTAS DANINHAS A HERBICIDAS HERBICIDAS

1. INTRODUÇÃO

2. DEFINIÇÕES E SITUAÇÃO DA RESISTÊNCIA NO BRASIL E MUNDO

2.1 Definição de resistência

2.2 Origem da resistência e fatores que interagem

2.2.1 Fatores genéticos

2.2.2 Fatores bioecológicos

2.2.3 Fatores agronômicos

2.3 Bases para a resistência de plantas daninhas a herbicidas

2.3.1 Perda de afinidade do herbicida pelo local de ação

2.3.2 Metabolismo e detoxificação do herbicida

2.3.3 Redução da concentração do herbicida no local de ação2.4 Casos de resistência registrados no Brasil (situação mundial e

brasileira)

2.3. Glyphosate – resistência ou tolerância?

3. CONSIDERAÇÕES FINAIS

1. INTRODUÇÃO

- Evolução das plantas é conseqüência da pressão de seleção - Plantas daninhas apresentam ampla variabilidade

genética que permite sobreviver em diversidade de ambientes- Nos últimos anos, herbicida é o principal método de controle

- Nas últimas décadas têm-se observado seleção de populações de plantas daninhas, a partir de biótipos resistentes a alguns herbicidas (Christoffoleti, 1997)- Conseqüências da resistência:

- restrição ou inviabilização da utilização dos herbicidas

- perdas de rendimento e qualidade dos produtos agrícolas

- maiores custos com o controle de plantas daninhas

Exige mudanças no sistema de produção

2.1 Definição de resistência

Ano 1 Ano 2 Ano 3

População de plantas daninhas antes da aplicação de herbicida

População de plantas daninhas depois da aplicação de herbicida

Aumento da freqüência do biótipo resistente devido à aplicações repetidas e anuais do mesmo herbicida

Planta suscetível Planta resistente

2. DEFINIÇÕES E SITUAÇÃO DA RESISTÊNCIA NO BRASIL E MUNDO

Plantas resistentes ocorrem naturalmente em baixa freqüência

A pressão de seleção exercida pelo herbicida aumenta a freqüência das plantas resistentes

“é a capacidade herdável de uma planta sobreviver e reproduzir após à exposição a um herbicida

“é a capacidade herdável de uma planta sobreviver e reproduzir após à exposição a um herbicida, que normalmente seria letal para a população original”

“é a capacidade herdável de uma planta sobreviver e reproduzir

Definição de resistência

População suscetível após a aplicação de um herbicida inibidor da ALS

Bidens pilosa L.

100 % dos Indivíduossuscetíveis

Bidens pilosa L.

População resistente após a aplicação de um herbicida inibidor da ALS

Indivíduo resistente

Indivíduo suscetível

População resistente após a aplicação de um herbicida inibidor da ALS

100 % dos Indivíduosresistentes

Bidens pilosa L.

Herbicidas(inib. ALS)

GR50

R/SResistente Suscetível

Cloransulan > 0,24 0,035 > 6,85Imazethapyr 0,76 0,064 11,90Imazaquin > 1,2 0,167 > 7,18

Doses (kg i.a./ha) correspondentes aos GR50 dos biótipos resistente (R) e suscetível (S) de Euphorbia heterophylla e a relação R/S.

Fonte: Gazziero et al. (1998)

Doses (g i.a./ha) correspondentes aos GR50 do biótipo de Bidens pilosa

resistente (R) e suscetível (S) aos herbicidas inibidores da ALS

Herbicida Resistente (R) Suscetível (S) R/S

Chlorimuron-ethyl 466,60 11,40 40,92

Nicosulfuron 2173,00 12,50 173,84

Metsulfuron-methyl 39,66 0,69 57,47

Imazethapyr 4402,00 77,00 57,16

Fonte: Christoffoleti (2002)

Doses (g i.a./ha) correspondentes aos GR50 do biótipo de Bidens pilosa

resistente (R) e suscetível (S) aos herbicidas inibidores da ALS

Herbicida Resistente (R) Suscetível (S) R/S

Chlorimuron-ethyl 466,60 11,40 40,92

Nicosulfuron 2173,00 12,50 173,84

Metsulfuron-methyl 39,66 0,69 57,47

Imazethapyr 4402,00 77,00 57,16

Fonte: Christoffoleti (2002)

Herbicidas(inib. ALS)

GR50

R/SResistente Suscetível

Cloransulan > 0,24 0,035 > 6,85Imazethapyr 0,76 0,064 11,90Imazaquin > 1,2 0,167 > 7,18

Doses (kg i.a./ha) correspondentes aos GR50 dos biótipos resistente (R) e suscetível (S) de Euphorbia heterophylla e a relação R/S.

Fonte: Gazziero et al. (1998)

Resistência cruzada:

Resistência cruzada x Resistência múltipla

O que é sítio de ação?

Resistência a diferentes herbicidas que têm o mesmo sítio de ação e/ou mecanismo de ação

Geralmente o mecanismo de resistência é resultante de uma alteração no sítio de ação do herbicida

QQAA

ee--

QQBB

ee--

CytocromoCytocromo

PlastoquinonaPlastoquinona

ee--

ee--

Sítio de ação dos herbicidas inibidores Sítio de ação dos herbicidas inibidores do transporte de elétrons (inibidores da do transporte de elétrons (inibidores da fotossíntese)fotossíntese)

QQAA

ee--

QQBBCytocromoCytocromo

PlastoquinonaPlastoquinona

Planta Planta suscetívelsuscetível

H

QQAA

ee--

QQBB CytocromoCytocromo

PlastoquinonaPlastoquinona

Planta resistentePlanta resistente HH

ee--

ee--

ee--

Sítio de ação dos herbicidas A, B e C

Sítio de ação comum dos

herbicidas A e B

Resistência múltipla:

Resistência cruzada x Resistência múltipla

Resistência a herbicidas não relacionados quimicamente entre si e que apresentam mecanismos de ação diferenciados

Geralmente o mecanismo de resistência é via metabolismo

.. 1616

Classificação dos herbicidas de acordo com o mecanismo/sítio de ação

Herbicide Resistance Action Committee (HRAC)

“The industry get together!” Representantes da Indústria

“o conhecimento dos sítios de ação dos herbicidas nas plantas (mecanismos de ação) é fundamental para compreensão da resistência”

2.2 Origem da resistência e fatores que interagem no desenvolvimento da resistência a herbicidas

Duas teorias de origem da resistência são propostos:Duas teorias de origem da resistência são propostos:

– a teoria da mutação a teoria da mutação (mudança gênica)(mudança gênica)– genes pré-existentes que conferem resistência à genes pré-existentes que conferem resistência à

população população (seleção natural)(seleção natural)

As As mutações mutações ocorrem ao acaso e são ocorrem ao acaso e são pouco freqüentespouco freqüentes

Não existem evidenciasNão existem evidencias que a mutação seja que a mutação seja induzida induzida pelos herbicidaspelos herbicidas

- Dominância dos alelos resistentes

- Tipo de fecundação

- Número de alelos resistentes

- Adaptação ecológica

2.2.1 Fatores genéticos que interagem no desenvolvimento da resistência a herbicidas

- Freqüência inicial do biótipo resistente

Grupo de herbicidas anos

Inibidores de ALS 4

Inibidores de ACCase 6 - 8

Inibidores da biossíntese de caroteno ~10

Inibidores da fotossíntese (Fotossistema II) 10 - 15

Inibidores da fotossíntese (Fotossistema I) 10 - 15

Inibidores da tubulina (Trifluralina) ~10 - 15

Auxinas sintéticas (2,4-D) ~20

Anos para seleção da população resistente, dependendo do grupo de herbicida

A. Freqüência inicial do biótipo resistente

Vidal & Fleck, 1997 – adaptado de Preston, 2003

Inicialmente ocorrem “falhas” na forma de reboleiras

0

5

10

15

0 2 4 6 8

0

2

4

6

8

NPRM2 PRR

PRRNPRM2

Número de anos

Número de plantas resistentes/m2 (NPRM2) (Ovejero & Christoffoleti, 2002)

Simulação da evolução da resistência em função aplicação repetitiva de um herbicida inibidor da ALS.

Freqüência inicial de R = 10-8

Eficácia do herbicida = 98%

Planta daninha gene R dominante e autógama

B. Dominância dos alelos resistentesC. tipo de fecundaçãoD. e número de alelos

Mecanismo de ação Tipo de polinização Dominância do alelo Inibidores da ACCase Autógama, alógama Semidomiante Inibidores da ALS Autógama, alógama Dominante, Semidomiante Hormonais Alógama Dominante Inibidores do FSI Autógama, alógama Dominante, Semidomiante Inibidores do FS2 Autógama, alógama Maternal1 (Semidomiante)2 Inibidores da tubulina Autógama Recessivo

1Herança maternal não envolve recombinação gênica; 2Casos de herança nuclear onde a metabolização é o mecanismo de resistência.Fonte: Vidal & Fleck, 1997.

Freqüência inicial do biótipo resistente

An

os

- 3

0% d

e fr

eq

üên

cia

do

bió

tip

o R

(Gressel & Segel 1985)

2 recessivos ou

4 dominantes

1 recessivo + 1 dominante ou

3 genes dominantes

1 recessivo ou

2 dominantes

1 dominante

(f.=2) f=0,5; =75% ou f=1,0; =50%

Herança da resistência em biótipos de E. Heterophylla

Vargas et al., 2001

- A resistência aos herbicidas inibidores da ALS é controlada por um alelo nuclear dominante

- Não há diferenças no grau de resistência entre os biótipos homozigotos resistentes e heterozigotos quando submetidos a aplicações de inibidores da ALS, sugerindo-se de tratar de um caso de dominância completa para este gene

E. Adaptação ecológica

- capacidade do biótipo em manter ou aumentar sua proporção ao longo do tempo em uma população

Diferenças fisiológicas na fixação de CO2 entre biótipos resistentes (R) e suscetíveis (S) aos herbicidas inibidores da fotossíntese.

Espécies Parâmetros Biótipo (R) Biótipo (S) A. hybridus mg CO2 dm-2 h-1 66,0 82,5 S. vulgaris nmol CO2 cm-2 s-1 1,5 1,8 A. retroflexus mg CO2 dm-2 h-1 17,8 41,7 P. laptipholeum mg CO2 dm-2 h-1 41,0 48,0 B. campestris nmol CO2 cm-2 s-1 1,7 2,0 A. hybridus ug CO2 m

-2 s-1 49,0 56,0 Fonte: Christoffoleti, 1997.

0

20

40

60

80

100

120

140

0 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 84 91

Bidens S

Bidens R

Dias após semeadura

Biomassa (g/pl.)

(Christoffoleti, 2000)

CURVAS DE CRESCIMENTO DOS BIÓTIPOS DE B. pilosa R E S AOS HERBICIDAS INIBIDORES DA ALS

Resistente

Suscetível

(Brighenti et al, 2001)

CURVAS DE CRESCIMENTO DOS BIÓTIPOS DE E. heterophylla R E S AOS HERBICIDAS INIBIDORES DA ALS

SuscetívelResistente

2.2.2 Fatores bioecológicos que interagem no desenvolvimento da resistência a herbicidas

- Espécie- Número de gerações por ano e taxa de

reprodução

- Longevidade das sementes no banco de sementes

- Densidade da espécie

- Suscetibilidade da planta daninha ao herbicida

2.2.3 Fatores agronômicos que interagem no desenvolvimento da resistência a herbicidas

1.Característica do herbicida

- Grupo químico

- Residual

- Eficiência de controle

- Dose utilizada

- Característica do herbicida

Predição do surgimento de plantas daninhas resistentes em função do grau de eficiência do herbicida (Fonte: Powles et al., 1997, citado por Merotto Jr, 1998).

2.2.3 Fatores agronômicos que interagem no desenvolvimento da resistência a herbicidas

2. Práticas culturais

- Utilização exclusiva de herbicidas no controle de plantas daninhas

- Uso repetitivo do mesmo herbicida ou de herbicidas com o mesmo mecanismo de ação

- Freqüência de aplicação

- Sistema de cultivo

Opções de manejo Baixo Moderado Alto

Mistura ou rotaçãode herbicidas

> 2 mec. de ação 2 mec. de ação 1 mec. de ação

Formas de controlede plantas daninhas

Cultural, mecânicoe químico

Cultural e químico Somente químico

Uso do mesmo mec.de ação por ciclo

Uma vez Mais de uma vez Muitas vezes

Sistema de cultivo Rotação plena Rotação limitada Sem rotação

Resistência relativaao mec. de ação

Desconhecida Limitada Comum

Nível de infestação Baixo Moderado Alto

Controle nos últimos3 anos

Bom Decrescente Baixo

Porquê alto risco de seleção de populações resistentes aos inibidores da ALS?

- uso repetitivo na agricultura

- alta eficácia

- atividade residual no solo

- resistência determinada geneticamente por locus simples-semi-dominante

- alelo R tem efeitos mínimos na adaptabilidade do biótipo R na ausência do herbicida

- mutações pontuais que podem conferir resistência a um ou mais herbicidas inibidores da ALS

Sequenciamento do DNA de Sequenciamento do DNA de Bidens Bidens que codifica a região de domínio A da que codifica a região de domínio A da ALSALS

Extração

DNA Total

PCR

Gene ALS5’

3’

Fragmento Amplificado por PCR

Sequenciamento...ATCGGTAC...

Clonagem

Plasmídio PUC 18

CTP

A122 P197 A205 W574 S653

Em todos os casos de resistência estudados até o momento a resistência aos inibidores da ALS tem sido atribuída a mudanças na seqüência dos aminoácidos

0 100 200 300 400 500 600

Número do aminoácido

Seqüência de aminoácidos na ALS

(Sathasivan et al. 1990)

1. Aplicado há mais de 25 anos na agricultura

2. Poucos casos de populações resistentes (4 spp R)

Razões do baixo risco de seleção de populações resistentes ao glyphosate

2. Freqüência inicial baixa do biótipo resistente ao glyphosate:

Teoria de saturação mutagênica com Arabidopsis thaliana Heynh.

Não foi possível isolar mutantes a partir de populações induzidas a mutações

Para os inibidores da ALS foram obtidas altas freqüências de mutantes resistentes

3. Tecnologia atual da EPSPS

Substituição da alanina por uma glicina na posição 96 da Escherichia coli conferiu resistência ao glyphosate

Plantas transgênicas exibiram altos níveis de resistência ao glyphosate

Este tipo de mutação gerou efeito paralelo (pleiotrópico) de redução da afinidade da EPSPS ao PEP que torna a planta incapaz de produzir a demanda de aminoácidos aromáticos

Planta menos competitiva e que não se estabeleceria dentre as plantas daninhas

3. Tecnologia atual da EPSPS

O gene que codifica a EPSPS resistente ao glyphosate utilizado na cultura de soja é de strains de Agrobacterium spp. (CP4)

O grau de homologia da seqüência de aminoácidos entre a EPSPS da CP4 e das plantas é de 23 a 41%

Portanto, seria impossível um gene de planta daninha para EPSPS sofrer mutação tão drástica que fosse altamente resistente e que apresentasse afinidade ao PEP

4. Características bioquímica, química e biológica

Apresenta estrutura química singular

Os herbicidas aplicados em mistura ou em rotação com o glyphosate apresentam mecanismos de ação alternativos

Esta rotação ou mistura de herbicidas é comprovadamente uma estratégia recomendada para prevenção e manejo de populações resistentes

Seleção de plantas daninhas tolerantes ao glyphosate

Trapoeraba

Corda-de-viola

Hours after treatment

2.00 4.00 8.00 12.00 24.00 48.00 72.00

% 14

C-g

lyph

osat

e ab

sorp

tion

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

C. benghalensisI. grandifoliaA. hybridusR G. max L. S. G. max L.

Absorção de 14C-glyphosate por Commelina benghalensis, Ipomoea grandifolia, Amaranthus hybridus e Glycine max resistante (R) e susceptible (S) ao glyphosate.

Monquero et al. (2002)

Soja

SSo

ja R

A.h

ybrid

us

C. benghalensis

I. grandifolia

Horas após tratamento

% g

lyp

ho

sate

14C

ab

sorv

ido

Cromatografia de camada fina das ceras epicuticulares com os valores de Rf (hidrocarbonos (rf=0.9), éster (rf=0.8), alcoóis secundários (rf=0,4), álcool primário (rf=0,1).

C. benghalensis I. grandifolia A. hybridusMonquero et al. (2002)

+ l

ipo

fíli

ca-

lip

ofí

lica

O glyphosate é predominantemente hidrofílico (ácido fraco)

  

C. benghalensis

I. grandifolia

A. hybridus Monquero et al. (2002)

Microscopia eletrônica da superfície foliar

grama-boiadeira

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Tratamentos

% d

e c

on

tro

le15 DAA

30 DAA

15 DAA 20,0 21,7 13,3 26,7 26,7 35,0 33,3 60,0 53,3 0,0

30 DAA 71,7 80,0 88,3 68,3 90,0 98,3 63,3 81,7 78,3 0,0

1 2 3 4 5 6 7 8 92+1 2+2 2+2,5 2,5+1 2,5+2 2,5+2,5 3 4 5 Test. Doses

Efeito da aplicação seqüencial de glyphosate transorb

Monsanto, 2002

Intervalo entre as aplicações = 15 dias

0

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

Se

me

nte

s/ m

2

1 2 3 4 5

Número de aplicações de glyphosate

Testemunha

0,36 kg/ha

1,44 kg/ha

2,88 kg/ha

A. hybridus (sementes/m2) nas diferentes avaliações

C. benghalensis (sementes/m2) nas diferentes avaliações

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

80000

Se

me

nte

s/m

2

1 2 3 4

Número de aplicações de glyphosate

Testemunha

0,36 kg/ha

1,44 kg/ha

2,88 kg/ha

2.3 Bases para a resistência de plantas daninhas a herbicidas

2.3.1 Perda de afinidade do herbicida pelo local de ação

ALS

--dihidroxi--metilvalerato

ISOLEUCINA

VALINA

LEUCINA

Treonina

-cetobutirato

-aceto--hidroxi butirato

Piruvato

-acetolactato

Piruvato

SulfoniluréiasImidazolinonas

2.3.2 Metabolismo e detoxificação do herbicida

HerbicidaHerbicida

Herb.Herb. OHOH

FeFe3+3+.Herbicida.Herbicida fp2fp2 NADPHNADPH

ee--

FeFe2+2+.Herb..Herb. FeFe2+2+. Herb.. Herb.COCO

COCOhvhv

OO22

FeFe2+2+. Herb.. Herb.

OO22

Cyt. b5Cyt. b5 fp1fp1 NADHNADH

ee--

FeFe3+3+. Herb.. Herb.

OO2 2 ==

FeFe3+3+. Herb.. Herb.

OO

FeFe3+3+

OO22

HH22OO22

XOOHXOOH

HH22OO

.2O2

2O2 2H2O2

2H+ + 2H2O

Destruiçãodas membranas

ClCl N N

ClCl N+ N+

Paraquat

e- Paraquat++

. .

2.3.3 Redução da concentração do herbicida no local de ação (compartamentalização)

ClCl N+ N+

Paraquat++

Vacúolo

ClCl N N

e-

Paraquat. .

.2O2

2O2 2H2O2

2H+ + 2H2O

2.3.3 Redução da concentração do herbicida no local de ação (compartamentalização)

2.3.4 Superprodução do alvo de ação do herbicida

0

5

10

15

20

25

Nív

el d

e E

PS

PS

na

pla

nta

S I R H

Linhagens de L. rigidum

t = 0 h + glyphosate t = 48 h + glyphosate

Quantificação do nível da EPSPS na plantaQuantificação do nível da EPSPS na planta

2.4 Casos de resistência registrados no Brasil (situação mundial e brasileira)

0

50

100

150

200

250

300

1950 1960 1970 1980 1990 2000

Ano

Nú

mer

o d

e b

ióti

pos

res

iste

nte

s

260 biótipos resistentes, 156 espécies (94 dicot e 62 monocot) em mais de 210.000 campos

Plantas Daninhas Resistentes a Herbicidas no Brasil

Espécie Nome Comum Ano Mecanismo de ação

1. Bidens pilosa Picão-preto 1993 Inibidores da ALS

2. Bidens subalternans Picão-preto 1996 Inibidores da ALS

3. Brachiaria plantaginea Capim-marmelada1996 Inibidores da ACCase

4. Cyperus difformis Junquinho 2000 Inibidores da ALS

5. Echinochloa crus-galli Capim-arroz 1999 Auxinas sintéticas

6. Echinochloa crus-pavonis Capim-arroz 1999 Auxinas sintéticas

7. Euphorbia heterophylla Amendoim-bravo 1992 Inibidores da ALS

8. Fimbristylis miliacea Cominho 2001 Inibidores da ALS

9. Sagittaria montevidensis Sagitária 1999 Inibidores da ALS

10. Digitaria ciliares Capim-colchão 2001 Inibidores da ACCase

Planta daninha de “inverno” Planta daninha de “verão”

Entrelinha – não usar grade ou herbicidas

roçadeira

Brot. Flor. Frutificação Colheita

Jun. Jul. Ago. Set. Out. Nov. Dez. Jan. Fev. Mar. Abr. Mai.

Plena florada gala fuji

linha – herbicidas

pré prépós (até 45 dias da colheita

3. CONSIDERAÇÕES FINAIS

Definições: tolerância x resistência

Fatores que determinam o aparecimento da resistência

Conhecimento dos mecanismos de resistência é importante para a adoção de estratégias de manejo

Evolução do número de casos de resistência no Brasil e no mundo

Muito obrigado

Pedro Jacob Christoffoleti ESALQ/USP - Dep. Produção VegetalPiracicaba - SP - C. P. 0913418-900

Fone - 19 - 3429 4190 – Ramal 209

E-mail - pjchrist@esalq.usp.br