Roberto Rasslan Efeito da solução salina hipertônica e da ... · orientação inicial e...

Roberto Rasslan

Efeito da solução salina hipertônica e da

pentoxifilina sobre o estresse oxidativo e a

atividade inflamatória na sepse induzida por

obstrução e isquemia intestinal em ratos

São Paulo

2013

Tese apresentada à Faculdade de Medicina da

Universidade de São Paulo para obtenção do Título de

Doutor em Ciências

Programa de: Clínica Cirúrgica

Orientadora: Profa. Dra. Edna Frasson de Souza Montero

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)

Preparada pela Biblioteca da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo

©reprodução autorizada pelo autor

Rasslan, Roberto Efeito da solução salina hipertônica e da pentoxifilina sobre o estresse oxidativo e a atividade inflamatória na sepse induzida por obstrução e isquemia intestinal em ratos / Roberto Rasslan. -- São Paulo, 2013.

Tese(doutorado)--Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. Programa de Clínica Cirúrgica.

Orientadora: Edna Frasson de Souza Montero. Descritores: 1.Solução salina hipertônica 2.Pentoxifilina 3.Sepse 4.Traumatismo

por reperfusão 5.Obstrução intestinal 6.Inflamação 7.Ratos

USP/FM/DBD-107/13

iv

Esta tese está de acordo com as seguintes normas, em vigor no momento desta publicação:

Referências: adaptado de International Committee of Medical Journals Editors (Vancouver).

Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina. Serviço de Biblioteca e documentação.

Guia de apresentação e dissertações, teses e monografias.

Elaborado por Anneliese Cordeiro da Cunha, Maria Julia de A.L. Freddi, Maria F. Crestana,

Marinalva de Souza Aragão, Suely Campos Cardoso, Valéria Vilhena. 3ª ed. São Paulo:

Divisão de Biblioteca e Documentações; 2012

Abreviatura dos títulos dos periódicos de acordo com List Journals Indexed in Index

Medicus.

v

Dedicatória

vi

Aos meus pais, Nilza e Samir. Esta etapa da minha profissão é fruto de todo

investimento e estímulo que recebi. Palavras não expressam o quanto

representam na minha vida.

À minha companheira Maria Fernanda, presente em todas as fases desde

trabalho, inclusive no laboratório. Você transformou esta trajetória mais

suave.

Às minhas irmãs Flávia e Paula, amigas que me apoiam sempre.

À minha avó Toninha, exemplo de determinação e que teve grande

influência na minha educação.

vii

Agradecimentos

viii

Agradecimento especial

Ao Professor Luiz Francisco Poli de Figueiredo, pela sugestão do tema,

orientação inicial e entusiasmo contagiante na realização deste projeto. Será

sempre lembrado como exemplo de Professor e Pesquisador.

ix

À Divisão de Clínica Cirúrgica III do Hospital das Clínicas da Faculdade

de Medicina da Universidade de São Paulo pela formação recebida e

oportunidade de pertencer a essa equipe. Sinto-me honrado em fazer parte

deste Serviço, reduto de cirurgiões de grande prestígio.

À Profa.Dra Edna Frasson de Souza Montero, Professora Associada da

FMUSP e orientadora desta tese, por ter adotado este projeto em

andamento. O destino fez com que tivesse a oportunidade de conhecê-la.

Esse convívio foi para mim um privilégio, pois além dos conhecimentos

adquiridos, acredito que ganhei uma amiga.

Ao Prof.Dr. Edivaldo Massazo Utiyama, Diretor do Serviço de Cirurgia

Eletiva da Divisão de Clínica Cirúrgica III da FMUSP, pelos conselhos,

ensinamentos e amizade. Exemplo de cirurgião, comprometido com a

formação de gerações de médicos.

Ao Prof. Dr. Celso de Oliveira Bernini, Diretor do Serviço de Emergência

do Hospital das Clínicas da FMUSP, pela contribuição decisiva na minha

formação como cirurgião e por ser modelo de médico que todos os jovens se

espelham.

x

À Dra. Jacqueline de Fátima Jackysyn, pesquisadora do Laboratório de

Fisiopatologia Cirúrgica (LIM-62) da FMUSP, presença constante, pela

valiosa ajuda na elaboração dos marcadores inflamatórios avaliados neste

trabalho.

À Nathália Cruz de Victo, colega de pós-graduação, pela contribuição na

realização do Western blot e ELISA.

Aos Professores Ruy Jorge Cruz Junior e Eliezer Silva, pelas sugestões

feitas na prova de qualificação desta tese que contribuíram em muito na

finalização deste projeto.

Ao Prof.Dr. Luiz Fernando Ferraz da Silva, docente da Disciplina de

Patologia, pela análise histológica deste estudo.

Aos funcionários do LIM-62 Mario Itinoshi, Marco de Luna, Luci Takasaka,

Ana Maria Heimbecker e Elisabete Minami pela disponibilidade, simpatia e

amizade que ajudaram este projeto se tornar realidade.

À Sra. Junko Takano Osaka, do Laboratório de Pesquisa em Cirurgia

Experimental (LIM-26), pela ajuda fundamental no início deste projeto.

xi

Aos acadêmicos Thiago Camargo Ferreira e Vitor Alves Pessoa da Costa

que acompanharam a execução do trabalho e permanecem na continuidade

do projeto.

À Dra. Marcia Kiyomi Koike, pelo auxílio e conselhos na análise estatística.

Ao Sr. Elias Aparecido Marcelino, técnico do Laboratório de Pesquisa em

Cirurgia Experimental (LIM-26), por me ensinar os cuidados que todo

pesquisador deve ter com os animais.

Aos colegas Alberto Bitran, Sergio Henrique Damous, Renato Silveira

Leal e Abel Hiroshi Murakami, pela amizade, apoio e cobertura no

ambulatório e centro cirúrgico para realização deste trabalho.

Aos Assistentes da Divisão de Clínica Cirúrgica III, da Cirurgia Eletiva e

da Emergência, pela amizade e agradável convívio.

À Sra. Eliane Falconi Monico Gazzetto, secretária da pós graduação do

Programa de Clínica Cirúrgica, zelosa para o cumprimento dos prazos

xii

Sumário

xiii

Sumário

Lista de Figuras

Lista de Tabelas

Resumo

Abstract

1. Introdução.............................................................................................. 1

2. Objetivos................................................................................................ 10

3. Métodos................................................................................................. 12

3.1. Padronização do modelo experimental........................................... 13

3.2. Amostra .......................................................................................... 14

3.3. Anestesia e preparo dos animais................................................... 14

3.4. Procedimentos operatórios............................................................. 14

3.5. Quantificação do malondialdeído (MDA) no tecido pulmonar e

intestinal.......................................................................................... 21

3.6. Preparo para extração de proteína em tecido pulmonar................. 21

3.7. Quantificação de proteína............................................................... 22

3.8. Dosagens de citocinas.................................................................... 23

3.9. Eletroforese de proteínas e Western blot........................................ 25

3.10 Análise estatística.......................................................................... 26

4. Resultados............................................................................................. 27

4.1. Pressão arterial............................................................................... 28

4.2. MDA no tecido intestinal e pulmonar............................................... 30

4.3. Expressão de citocinas no tecido pulmonar.................................... 33

4.4. Expressão do NF-B no tecido pulmonar....................................... 38

5. Discussão.............................................................................................. 40

6. Conclusão.............................................................................................. 56

7. Anexos................................................................................................... 58

8. Referências............................................................................................ 66

xiv

Lista de Figuras

xv

Lista de Figuras

Figura 1 – Fotografia com exposição do íleo terminal, ceco e do suprimento

vascular........................................................................................................16

Figura 2 – Fotografia mostrando ligadura intestinal e do pedículo

vascular........................................................................................................16

Figura 3 – Fotografia mostrando segmento intestinal isquêmico

.......................................................................................................................19

Figura 4 – Fotografia mostrando distensão intestinal proximal ao segmento

ocluído..........................................................................................................19

Figura 5 – Fotografia com ressecção do segmento intestinal isquêmico

......................................................................................................................20

Figura 6 – Fotografia mostrando anastomose intestinal término-

terminal.........................................................................................................20

Figura 7 – Curva da pressão arterial média durante o protocolo experimental

nos diferentes tempos de avaliação..............................................................29

Figura 8 – Gráfico do tipo Boxplot dos valores do malondialdeído no tecido

intestinal........................................................................................................31

Figura 9 – Gráfico do tipo Boxplot dos valores do malondialdeído no tecido

pulmonar.......................................................................................................32

xvi

Figura 10 – Gráfico do tipo Boxplot da expressão de IL-6 no tecido

pulmonar.......................................................................................................34

Figura 11 – Gráfico do tipo Boxplot da expressão de CINC-1 no tecido

pulmonar.......................................................................................................35


pulmonar........................................................................................................36


pulmonar........................................................................................................37

Figura 14 – Gráfico do tipo Boxplot da expressão de NF-B no tecido

pulmonar .......................................................................................................39

xvii

Lista de Tabelas

xviii

Lista de Tabelas

Tabela 1 – Valores da mediana da pressão arterial média nos diferentes

tempos de avaliação para os grupos de estudo ...........................................29

Tabela 2 – Valores de malondialdeído no tecido intestinal para os grupos de

estudo............................................................................................................31

Tabela 3 – Valores de malondialdeído no tecido pulmonar para os grupos de

estudo............................................................................................................32

Tabela 4 – Expressão de IL-6 no tecido pulmonar para os grupos de

estudo............................................................................................................34

Tabela 5 – Expressão de CINC-1 no tecido pulmonar para os grupos de

estudo............................................................................................................35

Tabela 6 – Expressão de IL-1 no tecido pulmonar para os grupos de

estudo............................................................................................................36

Tabela 7 – Expressão de IL-10 no tecido pulmonar para os grupos de estudo

.......................................................................................................................37

Tabela 8 – Expressão de NF-B no tecido pulmonar para os grupos de

estudo............................................................................................................39

xix

Resumo

xx

Resumo

Rasslan, R. Efeito da solução salina hipertônica e da pentoxifilina sobre o

estresse oxidativo e a atividade inflamatória na sepse induzida por obstrução

e isquemia intestinal em ratos. [tese] São Paulo: Faculdade de Medicina,

Universidade de São Paulo; 2013.

A obstrução intestinal representa uma das afecções abdominais agudas

mais frequentes, com altas taxas de complicações e mortalidade,

principalmente na vigência de sepse decorrente da isquemia intestinal. A

reanimação volêmica precoce na sepse implica em ganho de sobrevida,

entretanto, algumas discussões referentes ao fluido utilizado ou mesmo à

terapêutica associada com drogas persistem atuais. Desta forma, o presente

estudo propõe avaliar os efeitos da solução salina hipertônica e da

pentoxifilina na resposta inflamatória e no estresse oxidativo, em modelo

experimental que se assemelha ao problema clínico. Foram utilizados 36

ratos Wistar machos com peso entre 250 e 300 g. Os animais foram

submetidos à laparotomia exploradora com ligaduras do íleo terminal a 10

cm e 1,5 cm da válvula íleo-cecal, além de oclusão do pedículo vascular

responsável pela irrigação deste segmento intestinal. Após 24 horas, os

animais foram reoperados e distribuídos em grupos (N=6), conforme o

tratamento: sem reanimação volêmica (OI); Ringer lactato - 32 mL/kg (RL);

solução salina hipertônica a 7,5% - 4 mL/kg (SH); pentoxifilina 25 mg/kg

(PTX); Ringer lactato com pentoxifilina (RLPT) e solução salina hipertônica

com pentoxifilina (SHPT). Ao término do tratamento, realizou-se ressecção

do segmento intestinal isquêmico e anastomose para estabelecimento do

trânsito intestinal. Os animais foram observados por duas horas, com

medidas da pressão arterial média (PAM) registradas em 4 momentos. Após

o período de observação, os animais foram submetidos à eutanásia com

coleta do intestino e pulmão para análise. A quantificação do malondialdeído

(MDA), no pulmão e intestino, foi realizada através do TBARS. No tecido

xxi

pulmonar, também foram avaliadas as citocinas inflamatórias (IL-1, IL-6, IL-

10 e CINC-1) pelo método de ELISA e o fator de transcrição nuclear

fosforilado (NF-) por Western blot. Os níveis da PAM, aos cinco minutos

após o tratamento, ficaram mais elevados nos grupos RL e SH (p<0,05),

com valor maior no SH em relação ao RL (p<0,05); aos 45 minutos, não se

observou diferença nos níveis da PAM. A expressão das citocinas IL-1, IL-6

e CINC-1 foi menor nos grupos SH, PTX e SHPT em relação ao OI e RL

(p<0,05). Os grupos SH, PTX e SHPT apresentaram níveis inferiores de

IL-1 e IL-6 comparadas ao RLPT (p<0,05) e os grupos SHPT e PTX foram

iguais entre si. A expressão de IL-10 foi menor no grupo SHPT quando

comparada ao OI (p<0,05). A expressão do NF-B nos grupos SH, PTX e

SHPT foi menor em relação ao OI (p<0,05), sendo que o SHPT ainda foi

menor que o RL (p<0,05). Referente ao estresse oxidativo, no pulmão houve

menor produção do MDA no grupo SHPT comparado aos demais (p<0,05) e

no intestino, o MDA foi inferior nos grupos SH, PTX, RLPT e SHPT

comparados aos OI e RL (p<0,05). Estes resultados permitem concluir que a

solução salina hipertônica a 7,5% associada ou não à pentoxifilina, e a

pentoxifilina isoladamente, atenuam o estresse oxidativo e inibem a ativação

do NF-B, implicando em menor atividade inflamatória com redução na

produção de citocinas.

Descritores: Solução salina hipertônica; Pentoxifilina; Sepse; Traumatismo

por reperfusão; Obstrução intestinal; Inflamação; Ratos

xxii

Abstract

xxiii

Abstract

Rasslan, R. Effects of hypertonic saline and pentoxifylline on oxidative stress

and inflammatory activity in sepsis-induced by intestinal obstruction and

ischemia in rats. [thesis] São Paulo: School of Medicine, University of São

Paulo; 2013

Intestinal obstruction is one of the most common acute abdominal diseases,

with high rates of complications and mortality, especially in the presence of

sepsis due to intestinal ischemia. The early volume resuscitation in sepsis

involves survival gain, however, some discussions concerning the fluid used

or even combination therapy with drugs persist today. The present study

proposes to assess the effects of hypertonic saline and pentoxifylline on

inflammatory response and oxidative stress in an experimental model

resembling the clinical problem. The study included 36 male Wistar rats

weighting between 250 and 300 g. The animals underwent laparotomy with

ligation of the terminal ileum 10 cm and 1.5 cm from the ileocecal valve and

occlusion of the vascular pedicle responsible for the irrigation of this intestinal

segment. After 24 hours, the animals were reoperated and distributed in

groups (N=6), according to treatment: without volume resuscitation (OI);

Ringer lactate - 32 mL/kg (RL), hypertonic saline 7.5% - 4 mL/kg (HS);

pentoxifylline 25 mg/kg (PTX); Ringer lactate with pentoxifylline (RLPT) and

hypertonic saline with pentoxifylline (SHPT). After the infusion of the drugs,

the ischemic bowel was resected and performed the anastomosis for

establishment of intestinal transit. The animals were observed for two hours,

with measurements of mean arterial pressure (MAP) recorded in 4 times.

After the observation period, the animals were euthanized with bowel and

lung collection for analysis. Inflammatory cytokines (IL-1, IL-6, IL-10 and

CINC-1) were assessed by ELISA and phosphorylated nuclear transcription

factor (NF-) was determined by Western blot, both measured in lung

tissue. The quantification of the malondialdehyde (MDA) in the lung and

xxiv

intestine was performed using the TBARS assay. Initial levels of MAP were

higher in groups RL and HS than others (p<0.05), but at the end levels were

similar in all groups. The expression of IL-1, IL-6 and CINC-1 was lower in

the SH, PTX and SHPT groups compared to OI and RL (p <0.05). The SH,

SHPT and PTX groups showed lower levels of IL-1 and IL-6 compared to

RLPT (p <0.05) and SHPT and PTX groups were equal. The synthesis of IL-

10 was lower in SHPT compared to OI (p <0.05). The expression of NF-B in

SH, PTX and SHPT groups was lower compared to OI (p <0.05), whereas

the SHPT was still less than the RL (p <0.05). MDA in the lung was lower in

SHPT compared to the other groups (p<0.05) and in the intestine was lower

in SH, PTX, RLPT and SHPT groups compared to OI and RL (p<0.05). The

results indicate that hypertonic saline 7.5% with or without pentoxifylline, and

pentoxifylline alone attenuate oxidative stress and inhibit the activation of

NF-B, resulting in lower inflammatory activity with reduced production of

cytokines.

Keywords: Hypertonic saline; Pentoxifylline; Sepsis; Reperfusion injury;

Intestinal Obstruction; Inflammation; Rats

1

1. Introdução

2

A obstrução intestinal representa uma das afecções abdominais agudas

mais frequentes, com altas taxas de complicações e mortalidade, que atinge

de 20-30% na presença de necrose de alça. Este elevado índice é atribuído

muitas vezes ao diagnóstico tardio e preparo pré-operatório inadequado 1.

No abdome agudo obstrutivo, a distensão intestinal é resultado da

hipersecreção, comprometimento da motilidade do órgão e diminuição da

absorção, além do acúmulo de gás, decorrente da fermentação bacteriana e

da deglutição. A resposta inflamatória apresenta participação importante na

fisiopatologia dessa afecção. Este processo envolve inicialmente aumento

do fluxo sanguíneo intestinal, seguido de maior ativação de neutrófilos e

macrófagos, que desencadeia a liberação de citocinas, espécies reativas de

oxigênio e óxido nítrico 2, 3. Ressaltando a relevância destes mediadores, Lu

e cols. 2, em modelo de obstrução intestinal, observaram que a inibição do

estresse oxidativo promovia diminuição da lesão tecidual e menor acúmulo

de líquido e distensão do intestino.

A atividade inflamatória implica em sequestro de líquidos na parede e luz do

intestino que determina diminuição da volemia, com agravamento da

condição sistêmica. O acúmulo de água e eletrólitos no interior do órgão

ocorre, inicialmente, devido ao comprometimento da absorção e, mais

tardiamente, devido à secreção aumentada, secundária à lesão da mucosa.

O controle da atividade inflamatória proporciona aumento da capacidade

absortiva em modelo de obstrução intestinal 3. Entretanto, deve-se destacar

a participação das toxinas bacterianas, aumentadas na obstrução intestinal,

no comprometimento da absorção de líquidos e eletrólitos. Em animais livres

3

de bactérias submetidos à obstrução intestinal não se constatou alteração na

absorção e secreção de líquidos, reforçando a participação de bactérias

nesse processo 4.

O aumento do conteúdo intraluminal determina distensão da víscera, de tal

forma que compromete a perfusão tecidual, implicando em alteração da

permeabilidade da mucosa intestinal 5, contribuindo para a translocação

bacteriana, considerada fator importante na patogênese da sepse 6. Samel e

cols. 7 documentaram, em modelo de obstrução intestinal em ratos, a

passagem de bactérias marcadas com fluorescentes da luz intestinal para

outros órgãos. Deitch 8, em trabalho clínico, demonstrou a presença de

bactérias nos linfonodos mesentéricos em 59% dos casos de obstrução

intestinal na ausência de necrose. Entretanto, a participação do intestino na

sepse extrapola o conceito da translocação bacteriana, pois envolve a

liberação de fatores inflamatórios que promovem lesões locais e sistêmicas

6, 9. A obstrução intestinal e outras situações como trauma e choque, que

comprometem a irrigação esplâncnica, faz com que ocorra aumento da

população bacteriana, ativação celular e produção de mediadores que

intensificam a resposta inflamatória, podendo culminar na síndrome de

disfunção e insuficiência de múltiplos órgãos 6, 9, responsáveis pela elevada

mortalidade na sepse.

A etiopatogenia e a fisiopatologia da sepse são assuntos complexos e de

grande interesse, pois o seu conhecimento pode implicar no

desenvolvimento de medidas terapêuticas que podem modificar o desfecho

da doença. A sepse resulta de relação complexa do microrganismo com as

4

respostas imune, inflamatória e de coagulação do hospedeiro, de tal forma

que a mesma agressão pode se manifestar de maneira distinta em cada

doente 10.

A resposta do hospedeiro diante da infecção consiste em identificar e

controlar a invasão do patógeno, com a restauração do tecido, e assim ativar

a resposta celular e humoral, estimulando mecanismos inflamatórios e anti-

inflamatórios 11. A sepse pode ser dividida em duas fases: a precoce, que se

caracteriza por liberação de citocinas inflamatórias, e a tardia, com

predomínio das anti-inflamatórias como IL-10 12. O aumento da expressão

de moléculas de adesão no endotélio e nos neutrófilos promove a

transmigração de neutrófilos para o sítio da infecção. O processo de

interação neutrófilo-endotélio se altera na sepse com ativação inadequada

de neutrófilos e liberação de espécies reativas de oxigênio, que exacerba a

resposta inflamatória 13-15.

Os receptores tipo Toll (TLR) ativados interagem com moléculas que

culminam com a fosforilação do fator de transcrição nuclear B (NF-B),

proteína de transcrição nuclear. Esta proteína localiza-se no citoplasma na

forma inativa, devido à presença da proteína I-B (Inibidora de B). Após

estímulo dos TLR, ocorre a degradação do - por meio da kinase I-K. O

NF-B ativado é considerado marcador de mau prognóstico na sepse, pois

quando ativado penetra no núcleo e é capaz de expressar genes de

citocinas inflamatórias, como fator TNF-, IL-1, IL-6 e CINC-1 (cytokine

induced neutrophil chemoattractant), da classe da IL-8, amplificando a

resposta à infecção 16-18.

5

O tratamento da sepse abdominal no abdome agudo obstrutivo exige a

reanimação volêmica, uso precoce de antibióticos, correção de distúrbios

eletrolíticos e metabólicos com remoção imediata do fator obstrutivo 19, 20.

Rivers e cols. 21 demonstraram a importância da reanimação volêmica

agressiva e precoce na sepse, fase em que ainda é possível reverter o

quadro instalado, período denominado de “hora de ouro”. Nesta fase, as

medidas baseiam-se na restauração do estado hemodinâmico com

recuperação do volume intravascular e ajuste da oferta e demanda do

oxigênio 22.

A estabilização do quadro hemodinâmico exige o uso de grande quantidade

de fluidos, porém a administração excessiva de líquido gera extravasamento

para o interstício com repercussões deletérias, destacando-se entre elas o

edema pulmonar. As soluções de cristalóides são as mais utilizadas,

principalmente o Ringer lactato 23, entretanto, o seu uso está associado à

exacerbação da resposta inflamatória em modelo de choque hipovolêmico,

com ativação de neutrófilos, aumento de morte celular por apoptose e

disfunção endotelial 24-27. Mesmo após estabilização da condição

hemodinâmica do doente, constata-se a persistência da disfunção da

microcirculação e suas consequências como isquemia tecidual 28.

Em virtude dos efeitos deletérios do Ringer lactato, principalmente na

ativação da resposta inflamatória, tem sido estimulado o estudo de novas

soluções na reanimação volêmica no choque 22, 23, 29. Velasco e cols. 30 em

1980, foram pioneiros no estudo da solução salina hipertônica a 7,5%

associado com colóide no choque hipovolêmico e observaram que a

6

reanimação com 10% do volume perdido promoveu a restauração dos

parâmetros hemodinâmicos e nenhuma mortalidade no período avaliado. Na

mesma ocasião, este grupo de pesquisadores testou a solução salina

hipertônica em doze doentes com choque, de etiologia distinta, refratário a

volume e droga vasoativa, e constataram reversão instantânea do choque

em onze deles 31. Tais observações desencadearam o interesse pelo tema,

estimulando vários estudos experimentais e clínicos, inicialmente em trauma

e depois em sepse.

As alterações hemodinâmicas observadas com o uso da solução salina

hipertônica são decorrentes da melhora da contratilidade e débito cardíaco,

aumento da pré-carga, diminuição da pós-carga e restauração da

microcirculação 32-35.

A solução salina hipertônica apresenta propriedades de modular a resposta

imune e inflamatória 35. Esta característica é atribuída à inibição da interação

leucócito-endotélio e atenuação da infiltração de neutrófilos nos tecidos, 36-39

além da inibição da fosforilação do NF-B, com produção diminuída de

citocinas 37, 40-44.

Em virtude dos efeitos animadores da solução salina hipertônica no cenário

experimental, Hannemann e cols. 45 estudaram a solução em doentes com

sepse, e obtiveram aumento na oferta de oxigênio e débito cardíaco, porém

as alterações hemodinâmicas tiveram curta duração.

Em 2012, um estudo prospectivo randomizado proposto por van Haren e

cols. 46 analisaram o uso do medicamento em doentes com choque séptico.

7

Os autores constataram melhora dos parâmetros hemodinâmicos

envolvendo contratilidade cardíaca e do tônus vascular, porém sem

alteração da microcirculação.

Tendo em vista a relevância da resposta inflamatória, inclusive com a

abrangência sistêmica de seus efeitos, tem-se desenvolvido pesquisas

associando terapêutica farmacológica às soluções de reanimação.

Dentro deste contexto, a pentoxifilina, derivada da metilxantina, modifica a

conformação das hemácias com melhora do fluxo sanguíneo na

microcirculação e diminui a atividade inflamatória, reduzindo a ativação de

neutrófilos e a produção de TNF- 47. Devido às propriedades da

pentoxifilina, o uso clínico tem sido preconizado na insuficiência arterial

crônica 48, sepse neonatal e hepatite alcoólica 49. A translocação bacteriana

induzida pelo choque hipovolêmico foi reduzida em animais tratados com

este fármaco, conforme relato de Koyluoglu e cols. 50. Em modelo de

obstrução intestinal, com ligadura do íleo distal, o uso da pentoxifilina

diminuiu a translocação bacteriana, apesar de não haver diferença nos

níveis do TNF-.

O emprego da pentoxifilina, em modelos de sepse, demonstrou menor lesão

pulmonar e hepática 52, 53 e diminuição das citocinas pró-inflamatórias 54, 55.

Derre e cols. 56, em estudo com células humanas estimuladas com

lipopolissacáride, evidenciaram menor fosforilação do I-B e atenuação do

NF-B.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=K%C3%B6yl%C3%BCoglu%20G%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11467403

8

Alguns estudos clínicos propuseram o uso da pentoxifilina na sepse grave e

choque séptico. Staubach e cols. 57, em estudo duplo cego randomizado,

não constataram diferença de mortalidade no grupo pentoxifilina em relação

ao placebo, porém observaram melhora nos parâmetros cárdio-respiratórios.

Shukla e cols. 58, em doentes com peritonite, demonstraram menor

incidência de infecção da ferida operatória e do tempo de internação

hospitalar nos doentes que receberam pentoxifilina.

Em virtude dos efeitos do uso da solução salina hipertônica e da

pentoxifilina, Coimbra e cols. 59 estudaram a associação destes

medicamentos e constataram diminuição de lesão pulmonar, com menor

infiltração de leucócitos neste tecido e diminuição na produção de TNF- e

IL-1, em modelo de choque hemorrágico. Costantini e cols. 60 analisaram

esta estratégia de tratamento e evidenciaram menor fosforilação do I-B e

ativação do NF-B.

No que se refere à sepse, Coimbra e cols 61 estudaram a associação da

solução salina hipertônica à pentoxifilina em células sanguíneas estimuladas

com toxinas, com inibição da ativação de neutrófilos. Kim e Lee 62

analisaram os efeitos dessa estratégia de tratamento em ratos submetidos à

injeção endotraqueal de lipopolissacáride e demonstraram menor produção

de TNF-eIL-6.

Tendo em vista que a injeção de toxinas na indução de sepse representa um

modelo que se distancia do contexto clínico e o limitado número de estudos

no que se refere à reanimação volêmica do doente com obstrução intestinal

9

complicada, o presente trabalho visa testar a hipótese de que a solução

salina hipertônica a 7,5% associada à pentoxifilina atenuaria a resposta

inflamatória e o estresse oxidativo em modelo experimental de sepse,

determinada por obstrução e isquemia intestinal em ratos.

10

2. Objetivos

11

Avaliar os efeitos da reanimação volêmica com solução salina hipertônica a

7,5% associado à pentoxifilina sobre o estresse oxidativo e atividade

inflamatória em modelo de sepse, induzido por obstrução e isquemia

intestinal em ratos.

12

3. Métodos

13

O projeto de pesquisa foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do

Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São

Paulo sob número 172/11, em 2011. Todos os animais foram manipulados

segundo os princípios do National Institute of Health (1985) e The American

Physiological Society (1995) para o cuidado, manipulação e utilização de

animais de laboratório. A padronização do modelo experimental foi

desenvolvida no Laboratório de Pesquisa em Cirurgia Experimental (LIM-26).

A coleta de dados foi realizada no Laboratório de Investigação Médica em

Fisiopatologia Cirúrgica (LIM-62) da Faculdade de Medicina da Universidade

de São Paulo.

3.1. Padronização do modelo experimental

Para o desenvolvimento e padronização do modelo experimental de

obstrução e isquemia intestinal, foram utilizados 103 ratos. A mortalidade

decorrente do modelo experimental ocorreu em 47 animais (45,6%) nas

primeiras 24 horas após a isquemia e obstrução intestinal, sendo os óbitos

assim distribuídos: 30 (63%) antes, oito (17%) durante e nove (20%) após a

reoperação. A mortalidade relacionada à complicação anestésica ou do

cateterismo cervical ocorreu em oito animais (7,7%). Foi realizado

experimento completo em 48 animais e, em virtude de dificuldades no

processamento do material, restaram 36 amostras para análise.

Todos os procedimentos foram realizados pelo mesmo operador na tentativa

de uniformizar ao máximo as variáveis das diferentes etapas do

procedimento.

14

3.2. Amostra

Foram utilizados 36 ratos Wistar, machos, provenientes do Biotério da

Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, com peso de 250 a

300 g. Os animais foram mantidos, nas fases pré e pós-experimental, em

ambiente controlado para temperatura (230C), umidade e exposição à luz

artificial, com ciclo claro-escuro de doze horas com livre acesso a ração e

água.

3.3. Anestesia e Preparo dos Animais

Os animais foram submetidos à anestesia geral com injeção intraperitoneal

de cetamina (50 mg/kg) associada à xilazina (10 mg/kg) na mesma seringa

e, imediatamente após efeito do anestésico, foi realizada tricotomia cervical

e abdominal com antissepsia local. Doses complementares de anestésico

foram administradas pela mesma via para manutenção do plano anestésico.

3.4. Procedimentos Operatórios

Os animais, após a realização da anestesia, foram submetidos à laparotomia

exploradora mediana com exposição do ceco e identificação da válvula íleo–

cecal. Realizada ligadura do íleo terminal, com fio de algodão 4-0,

15

aproximadamente a 10 cm da válvula íleo-cecal, ocasionando obstrução

intestinal e outra ligadura a 1,5 cm da válvula com intuito de impedir refluxo

de sangue colateral para o intestino delgado (Figuras 1 e 2). Em seguida, foi

identificado o pedículo vascular responsável pela irrigação do segmento

intestinal ocluído e feita a ligadura dos ramos terminais dos vasos

mesentéricos com fio de algodão 4–0, gerando isquemia do mesmo

segmento (Figura 2).

16

Figura 1 Fotografia com exposição do íleo terminal, ceco e do suprimento

vascular

Figura 2 Fotografia mostrando as ligaduras do segmento intestinal e do

pedículo vascular

17

Ao término do procedimento, foi injetado 0,5 mL de solução de Ringer lactato

na cavidade abdominal para reposição de líquido perdido para o meio

externo em decorrência da laparotomia exploradora, seguido do fechamento

da parede abdominal com sutura contínua do plano peritônio-aponeurótico e

da pele com sutura interrompida com pontos simples, utilizando fio de Nylon

4-0. Os animais foram mantidos em ambiente controlado para temperatura e

umidade com livre acesso a água e jejum para sólidos.

Após 24 horas de obstrução e isquemia intestinal segmentar, os animais

foram anestesiados, conforme protocolo descrito, e submetidos a novo

procedimento operatório. Realizado acesso cervical, com exposição e

canulação da veia jugular e artéria carótida direita com Intracath 22G

(Bencton–Dickson, EUA), para infusão de volume e medida da pressão

arterial média. A medida hemodinâmica foi obtida por meio da conexão do

cateter ao monitor Dixtal DX2020 (Dixtal Biomédica, Brasil), e registrada nos

seguintes momentos: após cateterização, para obtenção da medida inicial, e

aos cinco, 30 e 45 minutos após a reanimação volêmica.

Os 36 animais foram sorteados para distribuição nos grupos, ficando cada

um dos seis grupos com seis animais:

- Sem Reanimação Volêmica – OI;

- Ringer Lactato (32 mL/kg) – RL;

- Solução Salina Hipertônica 7,5% (4 mL/kg) – SH;

- Pentoxifilina (25 mg/kg) – PTX;

- Ringer Lactato (32 mL/kg) associado com Pentoxifilina (25 mg/kg) – RLPT;

18

- Solução Salina Hipertônica (4 mL/kg) associado com Pentoxifilina

(25mg/kg)– SHPT

A infusão de volume ocorreu manualmente no período de cinco minutos

após a canulação dos vasos cervicais. Em seguida, procedeu–se à

laparotomia exploradora com constatação de distensão de intestino delgado

e isquemia do segmento terminal do íleo (Figuras 3 e 4). Realizado

ressecção do intestino isquêmico com anastomose término–terminal em

plano único total e pontos separados com fio de Polipropileno 6-0, com

posterior fechamento da cavidade abdominal em dois planos com sutura

contínua de fio Nylon 4–0 (Figuras 5 e 6).

A eutanásia dos animais, por exsanguinação sob anestesia, ocorreu duas

horas após o término da ressecção e da anastomose intestinal. Em seguida,

foi feita a remoção cirúrgica dos pulmões e do segmento ileal, cinco

centímetros acima da anastomose.

19

Figura 3 Fotografia mostrando segmento intestinal isquêmico

Figura 4 Fotografia mostrando distensão intestinal proximal ao segmento

ocluído

20

Figura 5 Fotografia com ressecção do segmento intestinal isquêmico

Figura 6 Fotografia mostrando anastomose intestinal término-terminal (seta)

21

3.5. Quantificação do malondialdeído (MDA) no tecido pulmonar e

intestinal

Os tecidos foram homogeneizados em um mL de KCl 1,15% com sonicador

(Polytron PT3100) e utilizado para dosagem do MDA. Determinou-se a

lipoperoxidação das membranas celulares causada pela formação de

radicais livres através do método de substâncias reativas ao ácido

tiobarbitúrico (TBARS), o qual mede a quantidade de TBARS derivado da

lipoperoxidação, sendo seu valor expresso em nanomoles por miligrama de

proteína (nmol/mg de proteína). Após a homogeneização, as alíquotas foram

centrifugadas a 10.000 giros por minuto durante 20 minutos a 4°C

(Centrifugue 5804® Eppendorf, Hamburg, Germany). Para reação,

adicionou-se a 100 µL do sobrenadante 100 µL de duodecil sulfato de sódio

(SDS) a 8,1%, 750 µL de ácido acético a 20% e 750 µL de ácido

tiobarbitúrico (TBA) a 0,8%. A mistura foi aquecida por 50 minutos à

temperatura de 95°C. Após o período estabelecido, amostras de 200 µL

foram analisadas no espectrofotômetro a 532 nm. Os resultados foram

expressos em µg/mg de proteína (Bradford, 1976). Todas as análises foram

feitas em duplicata.

22

3.6. Preparo para extração de proteína em tecido pulmonar

Para extração de proteínas utilizou-se amostras do tecido pulmonar em um

mL de tampão RIPA (50 mM Tris HCl pH8, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,5%

Sodium Deoxycholate e 1% SDS), suplementado com inibidor de proteína

(para cada 10 mL de tampão foi adicionado um comprimido de inibidor de

proteína, Complete mini EDTA-free - Roche).

Em um tubo de dois mL foi acrescentado um mL de tampão RIPA às

amostras. Estas foram homogeneizadas com sonicador (marca Politron) e

em seguida, o material transferido para outro tubo de dois mL. No intervalo

de cada amostra, o sonicador foi lavado em três tubos de 50 mL com água

Milli-Q e por último em álcool 70%, e posteriormente secado delicadamente

com papel.

Após processamento de todas as amostras, os tubos foram centrifugados

por 10 minutos a 2.000 rotações por minuto em uma temperatura de 4ºC.

Após a centrifugação o sobrenadante foi transferido para outro tubo de dois

mL e as amostras foram conservadas em gelo seco.

3.7. Quantificação de proteína

Para a quantificação de proteína das amostras utilizou-se como padrão uma

solução de BSA 2 mg/mL (8 L de BSA 10 mg/mL em 32 L de tampão

23

RIPA). Para fazer a curva padrão foi pipetado 20 L de tampão RIPA em

quatro tubos de um ml e acrescentado 20 l da solução de BSA dois mg/mL

no primeiro tubo e feita uma diluição seriada nos demais tubos. As amostras

foram diluídas 20 vezes (um L da amostra em 19 L de água Milli-Q).

Para as dosagens de proteínas utilizamos o kit BSA Protein Assay (Pierce

Protein Biology Products – Thermo Scientific). Em uma placa de 96 poços

foram pipetados 25 L/poço do reagente A’ (20 l do reagente S com um mL

do reagente A, preparado conforme instruções do fabricante e

homogeneizado), onde foram aplicadas as amostras e a curva padrão. Em

seguida, cinco L/poço das amostras diluídas e da curva padrão também

foram adicionados a 200 L/poço do reagente B. Incubou-se a placa em

temperatura ambiente por 15 minutos e a mesma foi lida em

espectrofotômetro a 690 nm. Cada amostra foi dosada em triplicata.

3.8. Dosagens de citocinas: IL-1IL-6, IL-10 e CINC-1

A dosagem das citocinas no tecido pulmonar previamente congelado em

nitrogênio líquido foi realizada utilizando-se o método de ELISA por Duo-set

(R & D Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA).

Inicialmente, as amostras de tecido foram maceradas e homogeneizadas em

PBS na concentração de um mg/mL. Após este procedimento, as amostras

foram centrifugadas a 2600 rotações por minuto na centrífuga (Eppendorf

5804R Hamburg, Germany) por 15 minutos a 6°C. O sobrenadante colhido

foi utilizado nas dosagens.

24

Na placa com 96 poços foram adicionados 100 µL/poço de anticorpo de

captura anti- citocinas daquelas do presente estudo. Após incubação durante

a noite, a 4°C, o sobrenadante foi desprezado e a placa lavada três vezes

com o tampão de lavagem. Em seguida, foi realizada a reação de bloqueio

adicionando-se 200 µL/poço de albumina sérica bovina a 2% em PBS e

incubação por uma hora à temperatura ambiente (20 a 26°C). A placa foi

novamente lavada por três vezes com tampão de lavagem. Adicionou-se em

duplicata 100 µL/poço do padrão e das amostras, procedendo-se à

incubação da placa por duas horas à temperatura ambiente. Para curvas

padrão, utilizou-se citocinas recombinantes nas concentrações de 62,50;

125; 250; 500; 1000; 2000; 4000 e 8000 pg/mL. Após repetir o procedimento

de lavagem da placa, foram adicionados 100 µL/poço do anticorpo de

detecção biotinilado para cada citocina e a placa incubada por duas horas à

temperatura ambiente. Ao término da incubação, o processo de lavagem da

placa foi repetido e em seguida adicionou-se 100 µL/poço da enzima

estreptoavidina peroxidase na proporção 1:200 de enzima: PBS com 0,05%

de tween-20 e incubação por uma hora à temperatura ambiente e protegida

da luz. Em seguida, o ciclo de lavagem da placa foi repetido e a reaç o

re elada pela adiç o de 00 /poço de , , , tetramethylbenzidina (TMB)

e incubação de 30 minutos a uma hora na temperatura ambiente e protegida

da luz. A reação foi bloqueada adicionando-se 50 µL/poço de H2SO4 (1N),

avaliando-se a densidade óptica das amostras a 450 nm, imediatamente

após o bloqueio da reação. Todas as análises foram feitas em duplicata.

25

3.9. Eletroforese de proteínas (SDS-PAGE) e Western-blot

Este método foi utilizado para verificar a expressão da proteína NF-B,

utilizando como controle a actina.

A análise das proteínas presentes nos extratos de tecido pulmonar foi

realizada por meio da eletroforese em gel de poliacrilamida contendo SDS

(SDS-PAGE - “Sodium dodecyl sulphate gel electrophoresis“), seguida de

Western-blot. Como resultado da presença de um detergente neutralizante,

no caso o SDS, as proteínas das amostras foram desnaturadas e suas

cargas neutralizadas, fazendo com que elas migrassem no gel de acordo

com a massa molecular.

Após o preparo do gel de corrida [mix de acrilamida 30% (1% bisacrilamida:

29% acrilamida); Tris-Cl 1,5 M (pH 8,8); SDS 10%; água miliQ; persulfato de

amônio 10% e TEMED], esse foi acoplado a um sistema vertical (Mini

Protean II, Bio Rad) o qual permanecia em contato com o tampão de

eletroforese (25 mM Tris; 250 mM glicina; 0.1% SDS; pH 8,3). Nessa fase,

foram aplicadas nas cavidades 20 µg de proteína dos extratos de tecido

(para aplicar as amostras foi adicionado azul de bromofenol). Seguiu-se com

a eletroforese a 80-100 V, voltagem constante por cerca de duas horas.

Como as proteínas de interesse possuem semelhantes pesos moleculares, a

porcentagem de poliacrilamida destes géis foi de 12%.

Após a eletroforese, as proteínas dos géis foram transferidas para

membranas de PVDF 0,45 µm (Pierce) utilizando o equipamento semi-dry da

Bio-rad por 50 minutos a 15 V (Tampão de transferência - 39 mM glicina; 48

26

mM Tris base; 37% SDS e 20% metanol, pH 8,3). Após a transferência, as

membranas foram colocadas por duas horas na solução de bloqueio

adequada. Nesse sentido, para a marcação com o anticorpo aqui descrito,

utilizou-se para o bloqueio uma solução 5% BSA em TBS-Tween (150 mM

NaCl; 50 mM Tris-Cl; 0,05% Tween 20, pH 7,5); 0,1% Azida. A seguir, as

membranas foram incubadas com os anticorpos primários overnight a 4°C,

lavadas em TBS-Tween e marcadas por uma hora à temperatura ambiente

com o anticorpo secundário conjugado à peroxidase alcalina apropriado. As

membranas foram novamente submetidas à lavagem por 3-4 vezes

consecutivas em TBS-Tween. A detecção dos imunocomplexos ocorreu pelo

método de quimioluminescência e seguida da exposição das membranas a

filmes de auto-radiografia. O anticorpo primário utilizado foi o NF-B (Santa

Cruz Biotechnology, Inc). Os anticorpos secundários espécie-específico anti-

coelho estavam conjugados à peroxidase alcalina.

3.10. Análise estatística

Os dados foram avaliados pelo teste não paramétrico de Kruskal-Wallis,

sendo a análise posterior (post hoc), dois a dois, com os testes sugeridos

pelo programa Sigma-Stat versão 3.1 (Systat Software, San Diego, CA), a

saber: Teste de Dunn para IL-10 e NF-B; e Teste de Student Newman

Keuls para as demais análises.

Adotou-se o nível de significância de 0,05 para rejeição da hipótese de

nulidade, e níveis descritivos (p) iguais ou inferiores a esse valor foram

considerados significantes.

27

4. Resultados

28

4.1 Pressão arterial

No momento inicial da cateterização cervical a pressão arterial média

apresentava níveis inferiores a 90 mmHg em todos os grupos. A reanimação

volêmica com solução salina hipertônica e Ringer lactato determinou

aumento dos níveis da pressão arterial média, após cinco minutos do

tratamento (T2), ao comparar com os demais grupos. O uso da solução

hipertônica determinou aumento em relação ao grupo RL. O uso da

pentoxifilina cursou com diminuição do valor da pressão arterial em T2,

porém sem diferença estatística em relação aos grupos RLPT e SHPT.

No terceiro momento da medida da pressão arterial (T3), aos 30 minutos do

tratamento, os animais que receberam pentoxifilina, isoladamente ou com

hipertônica, evoluíram com aumento da pressão arterial média em relação

aos demais grupos. Os níveis pressóricos do grupo SHPT, neste período,

foram maiores comparados aos demais, com exceção do grupo PTX. Os

grupos tratados com hipertônica e pentoxifilina isoladamente apresentaram

níveis da pressão arterial maiores que os animais reanimados com Ringer

lactato. Ao término do procedimento, após 45 minutos do tratamento (T4),

todos os grupos apresentaram os mesmos valores de pressão arterial

média, conforme se observa na Tabela 1 e Figura 7.

29

Tabela 1 – Valores da pressão arterial média (expressos em mmHg -

mediana) nos diferentes tempos de avaliação: imediatamente após a

cateterização (T1) e após reanimação volêmica com 5 (T2), 30 (T3) e 45

minutos (T4), respectivamente.

Pressão Arterial Média Grupos OI RL SH PTX RLPT SHPT

T1 77 78 88 81 74 82 T2 82 97 132 74 80 85 T3 73 68 82 87 70 92 T4 80 75 80 74 73 85

Figura 7 – Curva da pressão arterial média durante o protocolo experimental

nos diferentes tempos de avaliação: imediatamente após a cateterização

(T1) e após reanimação volêmica: 5 minutos (T2), 30 minutos (T3) e 45

minutos (T4), respectivamente. (**; p<0,05 em RL comparado a OI, PTX,

RLPT e SHPT; π; p<0,05 em SH comparado a OI, RL, PTX, RLPT e SHPT;

&; em SHPT comparado a OI, RL, SH e RLPT).

PA

M (

mm

Hg)

π

**

&

30

4.2 MDA no tecido intestinal e pulmonar

A quantificação do MDA intestinal apresentou redução dos valores nos

grupos SH, PTX, RLPT e SHPT em comparação aos animais sem

reanimação volêmica (grupo OI) e aos tratados com Ringer lactato (grupo

RL), como se observa na Tabela 2 e Figura 8.

Na avaliação do tecido pulmonar, o grupo SHPT apresentou níveis inferiores

em relação aos demais grupos. Os animais pertencentes aos outros grupos

de tratamento não apresentaram diferença quando comparados ao OI

(Tabela 3 e Figura 9).

31

Tabela 2 - Valores de malondialdeído (expressos em nmol/mg de proteína)

no tecido intestinal para os grupos de estudo, analisado por TBARS

Intestino Grupos OI RL SH PTX RLPT SHPT Mediana 0,42 0,52 0,30 0,30 0,29 0,27 Média 0,40 0,65 0,30 0,28 0,31 0,26 Desvio-padrão 0,05 0,45 0,04 0,06 0,11 0,03

Figura 8 – Expressão do malondialdeído no tecido intestinal (*;p <0,05 em

OI comparado a SH, PTX, RLPT e SHPT, **;p <0,05 em RL comparado a

SH, PTX, RLPT e SHPT).

**

*

32

Tabela 3 – Valores de malondialdeído (expressos em nmol/mg de proteína)

no tecido pulmonar para os grupos de estudo, analisado por TBARS

Pulmão

Grupos OI RL SH PTX RLPT SHPT Mediana 047 0,41 0,42 0,44 0,43 0,30 Média 0,49 0,50 0,51 0,44 0,49 0,30 Desvio-padrão 0,16 0,24 0,18 0,09 0,12 0,03

Figura 9 – Expressão do malondialdeído no tecido pulmonar (&;p <0,05 em

SHPT comparado a OI, RL, SH, PTX e RLPT).

&

33

4.3 Expressão de citocinas no tecido pulmonar

Na análise da IL-6, os grupos SH, PTX e SHPT apresentaram valores

menores em relação aos animais sem reanimação e aos tratados com

Ringer lactato, inclusive quando se acrescentou a pentoxifilina ao Ringer. O

esquema de tratamento com pentoxifilina isoladamente ou em associação à

solução hipertônica promoveu diminuição de IL-6 em relação aos grupos SH

(Tabela 4 e Figura 10).

A expressão de CINC-1 diminuiu em todos os grupos tratados comparados

ao OI. Os animais que receberam Ringer lactato apresentaram níveis

elevados desta citocina em relação aos demais grupos submetidos à

reanimação volêmica. Apesar do valor menor da CINC-1 quando utilizada a

solução salina hipertônica com pentoxifilina comparado aos grupos SH, PTX

e RLPT, não se evidenciou diferença estatística (Tabela 5 e Figura 11).

Os valores de IL-1 são menores nos grupos SH, PTX e SHPT comparados

aos animais sem reanimação volêmica e aos que receberam Ringer lactato,

mesmo associado à pentoxifilina (Tabela 6 e Figura 12).

A produção de IL-10 foi menor nos grupos SHPT em relação aos animais do

grupo OI. Os valores são menores nos grupos: SHPT comparado ao RL e

PTX comparado ao OI, com tendência à significância (Tabela 7 e Figura 13).

34

Tabela 4 - Expressão de IL-6 (em ng/mL) no tecido pulmonar para os grupos

de estudo, analisado por ELISA

IL-6

Grupos OI RL SH PTX RLPT SHPT Mediana 1,84 2,16 0,95 0,53 1,57 0,62 Média 2,04 2,08 1,05 0,59 1,50 0,61 Desvio-padrão 0,63 0,44 0,41 0,22 0,40 0,08

Figura 10 – Expressão de IL-6 no tecido pulmonar (*;p <0,05 em OI

comparado a SH, PTX e SHPT, **;p <0,05 em RL comparado a SH, PTX e

SHPT, π;p <0,0 em SH comparado a PTX e SHPT, ¥;p <0,05 em RLPT

comparado a SH, PTX e SHPT).

** *

¥

π

35

Tabela 5 - Expressão de CINC-1 (em ng/mL) no tecido pulmonar para os

grupos de estudo, analisado por ELISA

CINC-1


Figura 11 – Expressão de CINC-1 no tecido pulmonar (*;p <0,05 em OI

comparado RL, SH, PTX, RLPT e SHPT, **;p <0,05 em RL comparado a SH,

PTX, RLPT e SHPT).

*

**

36

Tabela 6 - Expressão de IL-1 (em ng/mL) no tecido pulmonar para os grupos

de estudo, analisado por ELISA

IL-1


Figura 12 – Expressão de IL-1 no tecido pulmonar (*;p <0,05 em OI

comparado a SH, PTX e SHPT, **; p <0,05 em RL comparado a SH, PTX e

SHPT, ¥; p <0,05 em RLPT comparado a SH, PTX e SHPT).

*

**

¥

37

Tabela 7 - Expressão de IL-10 (em ng/mL) no tecido pulmonar para os

grupos de estudo, analisado por ELISA

IL-10


Figura 13 – Expressão de IL-10 no tecido pulmonar (*;p <0,05, em OI

comparado a SHPT).

*

*

38

4.4 Expressão do fator de transcrição nuclear B ativado (NF-B) no

tecido pulmonar

Os grupos SH, PTX e SHPT demonstraram menor expressão do NF-B em

relação aos animais sem reanimação volêmica (OI). O tratamento com

Ringer lactato isoladamente ou em associação com pentoxifina apresentou

valores menores de NF-B, porém sem significância estatística em relação

ao OI. O único tratamento que resultou em diminuição dos níveis de NF-B

na compararação com Ringer lactato (p<0,05) foi o esquema de solução

salina hipertônica associada à pentoxifilina – grupo SHPT. (Tabela 8 e

Figura 14)

%

39

Tabela 8 - Expressão do NF-B no tecido pulmonar para os grupos de

estudo, analisado por Western-blot

NF-B

Grupos OI RL SH PTX RLPT SHPT Mediana 266493 113220 57981 76217 96425 51114 Média 286301 121379 64337 79111 93435 47347 Desvio-padrão 81767 39290 25061 18467 17145 16597

Figura 14 – A. Western blot do NF-B. A imagem representa três animais

para cada grupo de tratamento. B. Representação gráfica da expressão da

atividade do NF-B no tecido pulmonar (*; p<0,05 em OI comparado a SH,

PTX e SHPT, **; p<0,05 em RL comparado a SHPT).

40

5. Discussão

41

Os modelos de sepse mais utilizados em animais consistem em infusão de

bactérias e toxinas na corrente sanguínea ou na via aérea, que levam à

deterioração rápida do animal e óbito precoce em seis a doze horas,

diferente do que se observa nos doentes em que a instalação da disfunção

de múltiplos órgãos ocorre dias após o início da infecção 63, 64.

As citocinas pró-inflamatórias, nesta situação, cursam com aumento muito

rápido e importante, contrastando com o que ocorre no doente séptico que

apresenta aumentos menos evidentes destes valores, num intervalo de

tempo mais prolongado. Em virtude da piora rápida observada nos animais

nesse modelo, a intervenção terapêutica deve ser precoce, ou antes mesmo

da agressão, fato que se distancia do contexto clínico 65.

A falta de similaridade entre o modelo experimental e a prática médica

poderia justificar os diferentes resultados entre os trabalhos realizados no

laboratório e os ensaios clínicos 63, 64, 66. Outro aspecto de contraste refere-

se ao agente patogênico, infusão de apenas um tipo específico de bactéria,

geralmente germes gram-negativos, e ausência de um foco infeccioso.

Desta forma, foram desenvolvidos modelos de peritonite que consistem em

perfuração intestinal, inoculação de fezes na cavidade abdominal e ligadura

do ceco com perfuração, compatíveis com quadros abdominais da clínica

diária. Esta última situação envolve dois tipos de agressão: necrose do ceco

em decorrência da ligadura e peritonite em virtude do extravasamento de

conteúdo intraluminal. O choque se instala de forma rápida se não instituído

algum tipo de intervenção 63, 65-68, embora a elevação das citocinas seja

42

gradual. Este modelo tem sido muito utilizado nos últimos 30 anos para

avaliar a fisiopatologia da sepse 66. Quando se discute a ligadura e punção

do ceco, este tipo de agressão difere no número de punções e na extensão

da ligadura, com índice de mortalidade variável entre os autores 69.

No presente trabalho, na tentativa de se encontrar modelo de sepse com

quadro evolutivo mais próximo ao que ocorre na clínica, optou-se pelo

modelo com obstrução e isquemia intestinal em ratos, com ligadura

segmentar do íleo distal e do respectivo suprimento vascular, adaptado de

outros modelos 7, 43, 51, 70.

Samel e cols (6) utilizaram modelo de obstrução e isquemia de um segmento

intestinal fechado, porém com extensão muito curta, para avaliar

translocação bacteriana. No presente modelo, aumentou-se o tamanho do

segmento intestinal obstruído. Zanoni e cols. 43, trabalhando com modelo de

obstrução e isquemia intestinal, observaram culturas positivas em 86% de

linfonodos do mesentério e em 57% das culturas do sangue. Kocdor e cols.

51 observaram translocação bacteriana em 100% dos linfonodos do

mesentério em modelo de oclusão simples do íleo terminal sem oclusão

vascular. Entretanto, Akcay e cols. 70 estudaram a translocação bacteriana

na obstrução intestinal em ratos e constataram que os animais submetidos à

obstrução em alça fechada apresentaram maior crescimento bacteriano nos

tecidos analisados, quando comparados com obstrução intestinal simples.

Esses dados referentes à translocação bacteriana em modelos de obstrução

e isquemia intestinal permitem inferir que o modelo adotado neste trabalho

induz quadro de sepse de instalação insidiosa.

43

No presente estudo, a causa da sepse induzida por isquemia e obstrução

intestinal, culminando com a translocação bacteriana, é removida no

momento da reanimação volêmica, de tal forma que o sítio da infecção é

controlado, simulando o que ocorre na clínica. No entanto, os principais

estudos testaram diferentes terapêuticas em condições nas quais o

tratamento primário da sepse não foi praticado 53, 54, 62, 71, 72. Há que se

destacar, ainda, que a reanimação volêmica e ressecção intestinal foram

realizadas 24 horas após a indução da isquemia e obstrução intestinal.

Desta forma, optou-se por um modelo que envolve a isquemia e a obstrução

intestinal segmentar, associando algumas características dos modelos já

referidos.

As limitações deste estudo decorrem dos diferentes momentos de início da

infecção, com avaliação em momento único, sem estabelecer a dinâmica da

resposta inflamatória – desde a translocação bacteriana até a instalação da

sepse. Acrescente-se a dificuldade inerente aos aspectos técnicos do

modelo, que implica numa reoperação após o trauma inicial no animal com

sepse, além da dificuldade técnica, pela anastomose intestinal e tempo para

realização do procedimento. A análise da sobrevida deve ser criteriosa, pois

a mortalidade precoce após a ressecção do segmento intestinal isquêmico

pode ser decorrente da manipulação operatória e suas complicações.

Parker e Watkins 68 consideram que um modelo de sepse deve apresentar

as seguintes características: infecção localizada com evolução para sepse e,

por fim, a instalação da disfunção de múltiplos órgãos de forma gradual em

animais sem anestesia. Baseado nestas informações, a proposta foi estudar

44

sepse utilizando o modelo de obstrução e isquemia intestinal por conferir

estas propriedades.

Este modelo se caracteriza pela sepse em decorrência da translocação

bacteriana e isquemia intestinal, além da hipovolemia secundária à

distensão intestinal com edema e sequestro de líquido intraluminal. O

contexto clínico representado por este modelo pode ser demonstrado em

doentes com abdome agudo obstrutivo e necrose intestinal e o tratamento

exige reanimação hidro-eletrolítica, administração de antibióticos e o

tratamento operatório 73.

Com relação aos níveis da pressão arterial média, os grupos Ringer lactato e

solução salina hipertônica apresentaram aumento cinco minutos após a

infusão da solução, mais acentuado no segundo grupo. Em virtude das

propriedades de vasodilatação da pentoxifilina, a associação desta com a

solução salina hipertônica resultou em discreto aumento cinco minutos após

a reanimação, porém manteve esta tendência até 30 minutos de

procedimento, sendo que nesse momento o nível da pressão arterial média

foi superior aos demais grupos, exceto nos animais tratados com

pentoxifilina. Cruz e cols. 74 não evidenciaram diferença na pressão arterial

média, em modelo de choque hipovolêmico, nos animais tratados com

solução salina hipertônica e pentoxifilina em relação à hipertônica isolada.

Ao final do procedimento, os valores pressóricos se igualaram, confirmando

que os efeitos físicos da solução hipertônica tem curta duração, de acordo

com trabalho clínico de Hannemann 45.Tal fenômeno se deve às

45

propriedades físicas da solução salina hipertônica pelo gradiente de pressão

osmótica com mobilização do líquido do intracelular para o extracelular 34.

Velasco e cols. 30 em modelo de choque hipovolêmico constataram aumento

no volume plasmático de 11 mL/kg após infusão da solução salina

hipertônica, representando um acréscimo de 2,75 mL do volume plasmático

a cada um mL da solução. Por outro lado, a solução salina padrão induziu

uma expansão de 0,33 mL a cada um mL infundido. Esta característica da

solução hipertônica de estabelecer os parâmetros hemodinâmicos com

menor volume de líquido infundido foi demonstrada por Horton e Walker 75

em cães submetidos à injeção de endotoxina. Os animais reanimados com

solução hipertônica tiveram um balanço hídrico cinco vezes menor

comparado ao do grupo Ringer lactato.

A utilização do Ringer lactato teve início na década de sessenta durante a

guerra do Vietnã, após observação da utilização de plasma fresco no choque

hipovolêmico na segunda guerra mundial estar associada com lesão renal.

Na vigência de choque, o líquido presente no interstício é redistribuído para

o espaço intravascular e intracelular, de tal forma que o volume do

cristalóide deve ser acentuado no sentido de repor o interstício e

intravascular. Com a utilização do Ringer lactato se observou uma nova

entidade denominada de “pulm o de choque”, responsá el pela mortalidade

tardia. Posteriormente, tal fenômeno foi constatado nas unidades de terapia

intensiva e recebeu a denominação de Síndrome da Angústia Respiratória

do Adulto 23.

46

A reanimação volêmica com grande volume implica em edema da parede

intestinal que está associado com íleo adinâmico no pós-operatório e maior

período de jejum, além do aumento da permeabilidade do órgão 76. O

aumento da pressão intra-abdominal e as implicações decorrentes da

síndrome compartimental também são reflexos do uso excessivo de líquido

no manejo destes doentes. Radhakrishnan e cols. 77 demonstraram, em

modelo animal de hipertensão abdominal, menor edema e recuperação mais

rápida do trânsito intestinal quando administrada solução salina hipertônica.

Mazzoni e cols. 78 demonstraram que a expansão plasmática ocorre pela

transferência de líquido das células vermelhas e do endotélio, edemaciados

na presença do choque, com perda de 8% do volume para o intravascular .

O edema celular compromete o fluxo capilar e da microcirculação devido ao

edema do endotélio e das hemácias. Portanto, as características físicas da

solução salina hipertônica promovem a restauração do fluxo da

microcirculação.

Desta forma, tendo em vista que o volume infundido de solução salina

hipertônica foi oito vezes menor ao do Ringer lactato, e mesmo assim

determinou aumento dos níveis da pressão arterial média no momento inicial

da avaliação, o emprego da solução hipertônica poderia prevenir os efeitos

deletérios do uso excessivo de fluidos na reanimação volêmica.

A peroxidação lipídica é a reação de radicais livres com lípides insaturados

da membrana celular com destruição da sua estrutura e comprometimento

dos mecanismos de troca iônica, acarretando em condições extremas e

47

morte celular. A perda da integridade da mucosa intestinal se relaciona aos

danos causados pelos radicais livres de oxigênio 15.

Shih e cols. 37, em modelo de punção e ligadura cecal, estudaram o efeito da

solução hipertônica e constataram que a produção de radicais livres de

oxigênio nos diferentes tecidos é menor no grupo tratado com hipertônica.

Theobaldo e cols 44, em estudo recente, após injeção intraperitoneal de

endotoxinas, demonstraram redução da peroxidação lipídica no intestino 24

horas após o tratamento com solução salina hipertônica, sendo que não

havia diferença na análise precoce destes marcadores. A utilização da

pentoxifilina em modelo de isquemia e reperfusão evidenciou diminuição de

malondialdeído, produto final da peroxidação lipídica 14.

No presente trabalho, na análise do malondialdeído pulmonar, a associação

terapêutica pentoxifilina e solução salina hipertônica promoveu redução do

estresse oxidativo, mostrando um efeito na sepse similar ao observado em

modelo de trauma 79. Entretanto, os grupos salina hipertônica e pentoxifilina

associada ou não ao Ringer lactato, quando comparados com os grupos

Ringer lactato e sem tratamento, apresentaram valores menores deste

marcador bioquímico, porém sem significância estatística. Alguns autores

mostraram que ambas, solução salina hipertônica e a pentoxifilina

isoladamente, diminuem o estresse oxidativo em modelo de sepse 14, 37,

entretanto, a diferença entre os resultados pode ser justificada pelos tipos

distintos de modelo de sepse, e também ao curto espaço de tempo entre o

tratamento e análise do tecido. Em relação ao malondialdeído no intestino, a

solução salina hipertônica e a pentoxifilina, isoladas ou associadas entre si,

48

promoveram a redução da peroxidação lipídica. Além disso, a pentoxifilina

atenuou o estresse oxidativo promovido pelo Ringer lactato.

A sepse na fase inicial se caracteriza por intensa atividade inflamatória e

esse momento é responsável pela morbidade e mortalidade precoce. Após

esse período, o sistema imune diminui a produção de citocinas pró-

inflamatórias e se observa aumento na expressão de proteínas anti-

inflamatórias, ocasionando um estado de imunossupressão na sepse 12.

Esta mudança no comportamento da resposta inflamatória justifica os

desfechos desfavoráveis dos trabalhos clínicos com a utilização de

medicamentos inibidores da inflamação 80.

O TNF- IL-1 e IL-6 são as principais citocinas pró-inflamatórias, sendo a

IL-10 de atividade anti-inflamatória. O nível sérico das citocinas é variável e

distinto na sepse 12. O conceito inicial era de que os doentes apresentavam

níveis muito elevados das citocinas, como se observou nos experimentos

animais com injeção de toxinas, sendo que a mortalidade se atribuía à

ativação exacerbada do sistema imune. Esse pensamento sofreu

questionamentos após os resultados desanimadores com terapia para

bloquear a via da inflamação, apesar deste tipo de tratamento diminuir a

mortalidade em alguns estudos de laboratório 80.

O uso de medicamentos que bloqueiam o TNF- em ratos com peritonite

cursou com piora da sobrevida 81, 82. No contexto clínico, a terapia com a

inibição do receptor do TNF- implicou em mortalidade de 53%, contra 30%

no grupo placebo 83.

49

Como a patogênese da sepse é um processo dinâmico e complexo, devido à

transição da fase de inflamação para imunossupressão em tempos

diferentes em cada doente, a modulação do sistema imune talvez deva ser

proposta terapêutica melhor do que o bloqueio completo dos mediadores 12.

No último ano, três trabalhos multicêntricos randomizados avaliando

medicamentos com efeitos antagonistas aos biomarcadores da sepse foram

concluídos e não demonstraram benefício em relação ao tratamento com

placebo. A proteína C recombinante, o antagonista de receptor do tipo Toll e

a talactoferrina foram os medicamentos analisados. Um dos motivos pelos

resultados desanimadores no uso da imunoterapia na sepse é o intervalo de

tempo entre a instalação da infecção e o início do tratamento. Acredita-se

que o uso da imunoterapia deva ser embasada nos níveis séricos dos

biomarcadores para a identificação da fase da sepse, pró-inflamatória ou de

imunossupressão, pois a administração do medicamento deve ser realizada

no momento de concentração máxima das citocinas 84.

Diante deste contexto, a pentoxifilina é um agente capaz de modular a

atividade inflamatória, principalmente na diminuição da síntese do TNF- e

outras propriedades como a menor aderência do neutrófilo ao endotélio,

menor produção de IL-6 e IFN- e inibição da citotoxicidade das células T 85,

86. Da mesma forma, a solução salina hipertônica, além dos efeitos físicos,

também atua no controle dos radicais livres de oxigênio, na inibição da

ativação leucocitária e das citocinas 32, 87.

50

Assim, o atendimento inicial do doente em choque séptico exige a

reanimação volêmica a fim de restaurar os parâmetros hemodinâmicos,

distúrbios da microcirculação, alterações celulares e ajustar a demanda e a

oferta do consumo metabólico que são alterados pelas vias da inflamação 32.

A estratégia do tratamento com solução salina hipertônica e pentoxifilina foi

estudada em modelos animais de choque hipovolêmico e os trabalhos

demonstraram atenuação da resposta inflamatória na fase aguda, com

menor produção de citocinas e redução dos parâmetros inflamatórios nos

tecidos 59-61, 79, 88. Apesar dos efeitos animadores do uso isolado destas

terapêuticas em modelo experimental de sepse 35, 37, 53, 86, 89, 90, a associação

de ambas foi pouco utilizada 62.

Kim e Lee 62, em trabalho recente, estudaram a reanimação volêmica com a

associação de pentoxifilina e solução hipertônica em animais submetidos à

sepse, através da injeção intratraqueal de lipopolissacáride, com avaliação

da resposta inflamatória aguda. O trabalho demonstrou que este tipo de

tratamento confere menor expressão de TNF-, IL-1 e IL-6 comparado ao

grupo Ringer lactato. Nesta análise, o acréscimo da pentoxifilina ao Ringer

lactato não proporcionou diminuição da atividade inflamatória.

O presente estudo mostra uma elevação das citocinas inflamatórias de fase

aguda, podendo-se assim inferir que o momento avaliado reflete a fase

inicial da sepse, período em que a reanimação volêmica e a imunoterapia

acarretam diminuição da mortalidade 20, 84.

51

O tratamento dos animais com solução salina hipertônica, pentoxifilina e

solução salina hipertônica com pentoxifilina resulta em queda dos níveis

destes marcadores quando comparados ao Ringer lactato. A pentoxifilina

associada ou não à solução hipertônica resultou em diminuição dos níveis

de IL-6 em relação ao grupo SH, afirmando o sinergismo de proteção destes

dois medicamentos.

A pentoxifilina não atenuou os efeitos inflamatórios do Ringer lactato neste

modelo de sepse, com exceção da análise da CINC-1, confirmando as

observações de Kim e Lee 62, em 2012. Tais achados diferem dos resultados

em choque hemorrágico conforme relato de Yada – Langhi e cols. 91, 92, que

evidenciaram atenuação da infiltração de neutrófilos e lesão pulmonar nos

animais tratados com Ringer lactato associado à pentoxifilina.

Gogos e cols. 93, analisando doentes de terapia intensiva, constataram que

os níveis elevados de TNF- e IL-10 estavam associados com maior

mortalidade, sendo ainda pior quando os níveis de IL-10 eram mais elevados

que o TNF-. Os autores concluíram que a persistência da síntese elevada

de IL-10 era o principal preditor de mortalidade. Muenzer e cols. 69

estudaram o efeito do bloqueio da IL-10, em modelo de peritonite seguido de

pneumonia, e obtiveram ganho de sobrevida em decorrência do aumento

das citocinas pró-inflamatórias e diminuição bacteriana na corrente

sanguínea.

Vale ressaltar que, no presente estudo em que o grupo SHPT apresentou

menor produção de IL-10, foi analisado apenas o valor desta citocina anti-

52

inflamatória numa fase inicial, sendo necessário avaliação em período de

tempo mais tardio após o tratamento. Desta forma, estes dados apontam a

importância de conhecer o balanço das citocinas pró e anti-inflamatórias e a

relação destas com a fase da resposta imune 69.

Assim, a proposta de atenuar a resposta imune inicial, com diminuição na

síntese das citocinas inflamatórias, pode implicar em menor ativação das

citocinas anti-inflamatórias. Este fenômeno pode ser observado no presente

estudo com produção inferior de IL-1, IL-6 e CINC-1 no grupo solução

salina hipertônica com pentoxifilina, e menor expressão de IL-10.

O mecanismo responsável pela diminuição da síntese das citocinas pró-

inflamatórias está diretamente relacionado com a ativação do NF-B por

meio de estímulos extracelulares como lipopolissacáride, espécies reativas

de oxigênio e outros agentes citotóxicos, dentre estes, as próprias citocinas

inflamatórias 10.

Arnalich e cols.94 avaliaram a atividade do NF-B em doentes com sepse

grave e evidenciaram que os níveis desta proteína estavam mais elevados

nos doentes com maior índice de gravidade e naqueles que morreram,

sendo assim, o NF-B preditor de mortalidade. Tais evidências também

foram relatadas nos doentes com síndrome da resposta inflamatória

sistêmica 95.

Em modelo de choque hemorrágico, a associação solução salina hipertônica

e pentoxifilina promoveu menor produção do NF-B em relação ao Ringer

lactato 60, 88, 96. No presente estudo, os animais tratados com solução salina

53

hipertônica, pentoxifilina e a associação destes dois medicamentos cursaram

com atenuação da expressão do NF-B quando comparados ao grupo sem

reanimação volêmica. Entretanto, a solução salina hipertônica com

pentoxifilina foi o único esquema terapêutico superior ao Ringer lactato,

reiterando o sinergismo destas drogas no controle da atividade inflamatória.

Este sinergismo não tem sido avaliado na literatura, pois não comparam a

associação com a solução salina hipertônica ou a pentoxifilina isoladamente.

No futuro, a imunoterapia deverá ser uma ferramenta no tratamento da

sepse, de tal forma que provavelmente será individualizada com dados

clínicos e laboratoriais 84, 93, 97. Deve haver um esforço para identificar a fase

da sepse em que se encontra o doente, se inflamatória ou anti-inflamatória,

para definir a melhor terapêutica. Trabalhos atuais estão direcionados a

estudar a imunossupressão e os mecanismos de estimular o sistema imune

neste momento, com determinadas citocinas como IL-7 e IL-15 97.

A literatura carece de estudos avaliando a fase de imunossupressão da

sepse após o uso no atendimento inicial da solução salina hipertônica,

isoladamente ou em conjunto com a pentoxifilina.

Este trabalho avaliou o efeito das diferentes soluções na reanimação

volêmica logo após o tratamento, caracterizada pela fase pró-inflamatória da

sepse, devido aos valores elevados das citocinas inflamatórias. Faz-se

necessária uma análise da ação da solução salina hipertônica com

pentoxifilina em intervalo de tempo maior após a terapêutica, para definir a

duração das propriedades protetoras encontradas na avaliação inicial e o

impacto na sobrevida.

54

Apesar dos trabalhos experimentais avaliando a solução salina hipertônica,

isoladamente ou associada à pentoxifilina, no cenário clínico no que se

refere ao doente séptico, poucos foram os estudos desenvolvidos.

Recentemente, van Haren e cols. 46 conduziram um ensaio clínico

comparando a solução salina hipertônica a 7,5% com colóide e seus

resultados preliminares referentes a desfechos fisiológicos, mostraram

melhora da contratilidade miocárdica e do tônus vascular, embora sem efeito

sobre a microcirculação da mucosa gástrica e sublingual. Tais observações

reforçam a importância de estudos com maior número de doentes para

avaliar disfunção de órgãos e mortalidade.

A sepse é uma doença complexa tendo em vista o número de variáveis que

interferem e influenciam na análise da terapêutica e dos resultados, por isso

o modelo experimental visa reproduzir no laboratório esta doença, porém

com controle de variáveis para se compreender a fisiopatologia, assim como

a resposta terapêutica a determinadas estratégias. Desta forma, a translação

do conhecimento experimental poderá ser realizada com maior segurança

para o doente.

A associação da solução salina hipertônica com pentoxifilina demonstrou a

capacidade terapêutica de reanimação volêmica, baseada em menor volume

com atividade anti-inflamatória, capaz de eventualmente diminuir as

disfunções orgânicas através da redução do estresse oxidativo e da

atividade inflamatória. Apesar do tratamento com a pentoxifilina apresentar

resultados semelhantes ao esquema solução salina hipertônica com

pentoxifilina, no contexto clínico não é factível o tratamento do doente com

55

choque sem a restauração dos parâmetros hemodinâmicos. Foram poucos

os trabalhos que avaliaram a associação solução salina hipertônica com

pentoxifilina e compararam esta modalidade de tratamento com o uso

isolado das soluções.

Apesar do conhecimento cada vez mais detalhado da fisiopatolologia e do

investimento no desenvolvimento da imunoterapia, a sepse persiste como

afecção com expressiva mortalidade e seu tratamento é desafio que precisa

de modificações, necessitando novos e contínuos estudos.

56

6. Conclusão

57

A reanimação volêmica com solução salina hipertônica a 7,5% associada ou

não à pentoxifilina, e a pentoxifilina isoladamente em modelo de sepse,

induzido por obstrução e isquemia intestinal em ratos, promoveu redução do

estresse oxidativo e da atividade inflamatória.

58

7. Anexos

59

Anexo 1 – Carta de aprovação do projeto pelo Comitê de Ética em Pesquisa

60

Anexo 2 – Tabelas

Pressão arterial média em T1

Animal OI RL SH PTX RLPT SHPT 78 82 81 86 63 82 75 88 109 95 - 82 51 84 71 84 71 89 81 68 89 71 79 95 94 73 89 75 66 84 83 78 88 84 76 108 65 68 87 78 74 74 74 77 91 66 76 70

Mediana 76 77 88 81 74 82 Média 75 77 85 79 72 81

D. padrão 12 7 6 9 5 15 Intervalo (25-75%)

67-82 69-83 81-89 72-85 66-76 72-92

Tabela A - Valores da pressão arterial média (expressos em mmHg)

imediatamente após a cateterização cervical (T1).


Animal OI RL SH PTX RLPT SHPT 83 96 137 73 68 74 79 101 162 84 - 102 73 92 114 99 83 106 82 77 109 - 82 101 93 113 130 68 75 83 87 76 137 86 86 85 - 102 132 74 80 79 74 98 132 56 67 94

Mediana 82 97 132 74 80 85 Média 81 94 131 77 77 87


74-87 80-101 118-137 68-86 68-83 76-101

Tabela B - Valores da pressão arterial média (expressos em mmHg) cinco

minutos após o tratamento (T2).

61


Animal OI RL SH PTX RLPT SHPT 70 94 85 91 63 92 70 65 101 92 - 92 63 60 73 88 61 106 71 66 75 81 71 109 75 73 82 85 103 91 76 61 87 77 91 97 90 70 80 95 65 72 89 82 84 80 70 102

Mediana 73 68 82 86 70 92 Média 75 71, 80 86 74 92,8


70-85 62-79 75-85 80-91 63-91 83-104

Tabela C - Valores da pressão arterial média (expressos em mmHg) 30



Animal OI RL SH PTX RLPT SHPT 74 91 84 93 72 93 67 75 107 88 - 88 82 59 80 100 - 112 76 78 76 - 73 102 81 65 78 71 80 81 84 63 88 66 - 75 88 75 73 74 66 80 78 78 90 60 85 85

Mediana 79 75 80 74 73 85 Média 78 73 81 78 75 86


74-83 63-78 76-88 66-93 69-82 77-97

Tabela D - Valores da pressão arterial média (expressos em mmHg) 30


62

Intestino Animal OI RL SH PTX RLPT SHPT

0,34 1,51 0,34 0,32 0,22 0,28 0,42 0,48 0,29 0,37 0,28 0,22 0,48 0,36 0,21 0,32 0,42 0,25 0,42 0,56 0,20 0,27 0,18 0,31 0,35 0,71 0,32 0,28 0,48 0,25 0,43 0,27 0,36 0,25 0,31 0,28

Mediana 0,42 0,52 0,30 0,30 0,29 0,27 Média 0,40 0,65 0,30 0,28 0,31 0,26

D. padrão 0,05 0,45 0,04 0,06 0,11 0,03 E. padrão 0,02 0,18 0,01 0,02 0,04 0,01 Intervalo (25-75%)

(0,35-0,43)

(0,36-0,71)

(0,26-0,31

(0,20-0,34)

(0,21-0,42)

(0,24-0,28)

Tabela E - Valores de malondialdeído (expressos em nmol/mg de proteína)

no tecido intestinal para os grupos de estudo, analisado por TBARS.

Pulmão Animal OI RL SH PTX RLPT SHPT

0,50 0,38 0,72 0,48 0,42 0,31 0,68 0,99 0,43 0,41 0,45 0,36 0,45 0,43 0,41 0,35 0,67 0,32 0,70 0,44 0,33 0,60 0,38 0,26 0,30 0,38 0,77 0,35 0,42 0,30 0,34 0,39 0,40 0,50 0,63 0,28

Mediana 047 0,41 0,42 0,44 0,43 0,30 Média 0,49 0,50 0,51 0,44 0,49 0,30


(0,34-0,68)

(0,38-0,44)

(0,40-0,72)

(0,35-0,50)

(0,42-0,63)

(0,28-0,32)

Tabela F - Valores de malondialdeído (expressos em nmol/mg de proteína)

no tecido pulmonar para os grupos de estudo, analisado por TBARS.

63

IL-6

Animal OI RL SH PTX RLPT SHPT 3,00 2,00 1,60 0,50 1,98 0,57 1,81 2,32 1,50 0,57 1,81 0,51 1,70 1,61 0,68 0,45 0,87 0,67 2,60 2,58 1,07 0,57 1,23 0,70 1,88 2,47 0,84 1,05 1,61 0,54 1,27 1,54 0,61 0,44 1,53 0,68

Mediana 1,84 2,16 0,95 0,53 1,57 0,62 Média 2,04 2,08 1,05 0,59 1,50 0,61


(1,70-2,60)

(1,61-2,47)

(0,68-1,50)

(0,44-0,56)

(1,23-1,81)

(0,54-0,68)

Tabela G - Expressão de IL-6 (em ng/mL) no tecido pulmonar para os

grupos de estudo, analisado por ELISA.

CINC-1

Animal OI RL SH PTX RLPT SHPT 0,91 0,66 0,44 0,40 0,54 0,38 0,95 0,55 0,56 0,38 0,56 0,44 0,63 0,70 0,67 0,58 0,63 0,40 0,67 0,69 0,57 0,52 0,52 0,50 0,79 0,57 0,47 0,49 0,53 0,39 0,60 0,66 0,36 0,59 0,43 0,42 Mediana 0,73 0,66 0,52 0,50 0,53 0,41

Média 0,76 0,64 0,51 0,49 0,54 0,42 D. padrão 0,14 0,06 0,11 0,08 0,06 0,04 E. padrão 0,06 0,02 0,04 0,03 0,02 0,01 Intervalo (25-75%)

(0,63-0,91)

(0,57-0,69)

(0,44-0,57)

(0,40-0,58)

(0,52-0,56)

(0,39-0,44)

Tabela H - Expressão de CINC-1 (em ng/mL) no tecido pulmonar para os


64

IL-1

Animal OI RL SH PTX RLPT SHPT 2,83 2,07 1,80 1,70 1,97 1,71 2,60 2,93 1,21 1,31 2,41 1,70 2,47 1,82 1,49 1,52 1,93 1,56 2,72 2,30 1,22 1,48 3,34 1,73 2,16 1,89 1,58 2,19 2,75 1,84 1,62 1,36 1,12 1,31 2,08 1,45

Mediana 2,54 1,98 1,36 1,50 2,25 1,71 Média 2,40 2,06 1,40 1,58 2,42 1,66


(2,16-2,72)

(1,82-2,30)

(1,21-1,58)

(1,31-1,70)

(1,97-2,75)

(1,56-1,73)

Tabela I - Expressão de IL-1 (em ng/mL) no tecido pulmonar para os grupos

de estudo, analisado por ELISA.

IL-10

Animal OI RL SH PTX RLPT SHPT 1,20 0,88 0,22 0,11 0,25 0,07 0,25 0,12 0,24 0,02 0,36 0,13 0,49 0,17 0,06 0,32 0,19 0,10

0,16 0,45 0,33 0,08 0,13 0,09 0,55 0,14 0,11 0,08 0,10 0,01 0,21 0,42 - - - -

Mediana 0,371 0,294 0,219 0,0820 0,190 0,0850 Média 0,476 0,363 0,192 0,123 0,206 0,0782


(0,20-0,55)

(0,13-0,45)

(0,09-0,26)

(0,06-0,16)

(0,12-0,27)

(0,05-0,10)

Tabela J - Expressão de IL-10 (em ng/mL) no tecido pulmonar para os


65

NF-B

Animal OI RL SH PTX RLPT SHPT 1 422864 123240 99636 60109 82950 16758 2 334739 126466 70560 69891 67184 44640 3 261826 83000 44304 101121 105910 57960 4 271161 103200 45402 99982 108864 62496 5 190836 194432 86432 82544 108763 56765 6 236384 97940 39689 61020 86940 45464

Mediana 266493 113220 57981 76217 96425 51114 Média 286301 121379 64337 79111 93435 47347

D. padrão 81767 39290, 25061 18467 17145 16597 E. padrão 33381 16040 10231 7539 6999 6775 Intervalo (25-75%)

236384- 334739

97940- 126466

44304- 86432

61020- 99982

82950- 108763

44640- 57960

Tabela L - Expressão do NFB no tecido pulmonar para os grupos de

estudo, analisado por Western-blot.

66

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