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ROSANE DO SOCORRO POMPEU DE LOIOLA

ASSOCIAÇÃO DOS FATORES DE ADERÊNCIA babA2 E sabA DA

Helicobacter pylori E OS LIGANTES DE GRUPOS SANGUÍNEOS ABH

E LEWIS EM PACIENTES COM GASTRITE CRÔNICA DA

POPULAÇÃO DE BELÉM-Pa

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos e

Parasitários do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará como

requisito parcial para a obtenção do grau de Doutora em Biologia de Agentes Infecciosos e

Parasitários.

Orientadora: Profª Drª Tereza Cristina de Oliveira Corvelo

Instituto de Ciências Biológicas/UFPa

Banca Examinadora: Profª Drª. Ermelinda do R. Moutinho da Cruz (Avaliadora)

Centro de Ciências da Saúde/UFPA

Prof. Dr. Evonnildo Costa Gonçalves (Avaliador)

Instituto de Ciências Biológicas/UFPA

Profª Drª Délia Cristina Figueira Aguiar (Avaliadora)


Profª Drª Hilma Lúcia Tavares Dias (Avaliadora)

Núcleo de Ciência Agrárias e Desenvolvimento Rural/UFPA

Prof. Dr. Antonio Carlos Rosário Vallinoto (Suplente)


Belém 21 de novembro de 2014

2

DEDICATÓRIA

A minha filha Julia Loiola

A minha mãe Francisca Pompeu de Loiola A meu pai Edivaldo Loiola (in memoriam)

3

EPÍGRAFE

A percepção do desconhecido é a mais

fascinante das experiências. O homem que

não tem os olhos abertos para o misterioso

passará pela vida sem ver nada.

(Albert Einstein)

4

AGRADECIMENTOS

Ao iniciar meus agradecimentos lembrei-me de uma frase de Paulo Freire “Se a educação

sozinha não pode transformar a sociedade, tampouco sem ela a sociedade muda.”

Acredito que seja oportuno aqui, porque nenhuma conquista é mérito unicamente de quem

a almeja, mas de todos aqueles que de alguma forma, ainda que nos bastidores,

contribuíram para o seu alcance. Então Meus sinceros agradecimentos

Aos pacientes que aceitaram participar deste estudo

À Profª. Dra. Tereza Cristina de Oliveira Corvelo, pela orientação desta tese, e de toda vida

minha profissional, pelo aprendizado adquirido, pela amizade e carinho dedicado nestes

quase 20 anos de convivência.

À Profª Dra. Ermelinda do Rosário Moutinho da Cruz, pela inestimável orientação e

colaboração neste estudo. Pelo apoio, incentivo, carinho e amizade dedicada a mim.

À Vivian Lúcia Aslan D’Annibale minha parceira de doutoramento e pela coleta do

material biológico.

À Dra. Marileide Serra Carneiro (in memoriam), médica do Setor de Endoscopia do

HUJBB, pela disponibilidade e colaboração na coleta das amostras.

À Eny Valente de Azevedo, pela colaboração e apoio dispensado na realização das técnicas

laboratoriais para a realização deste trabalho.

A Gysele Mattos pela colaboração e apoio durante a realização deste estudo.

Aos alunos de iniciação científica do Laboratório de Imunogenética da UFPA, Marcelo

Vieira, Daniel Ventura e Amanda Pamela, pelo ajuda na realização dos ensaios

laboratoriais.

Ao seu Lenor Mandú, pelo auxilio laboratorial, companhia e pelo cafezinho matutino, que

carinhosamente me oferecia diariamente.

À Kleiffeson Alves de Miranda, Diretor do Laboratório Central do Estado do Pará -

SESPA em 2010, que concedeu a minha licença para realização do curso de doutoramento.

À Regina Guimarães Diretora da EEEEFM Dr. Celso Malcher que concedeu a minha

licença para realização do curso de doutoramento.

Aos meus amigos Waldinei do Carmo, Rosineide Brandão e Joana Darc Bezerra pelo

incentivo e apoio durante a execução deste trabalho.

A minha filha incansável incentivadora do melhor de mim.

5

A minha família Francisca Pompeu de Loiola, minha mãe, Laudemir Crindstistina, Hidir,

Edivaldo Junior, Edifranci, meus irmão, Andreza, Andrei, Tainá, Tiago, Nicole, Nivea,

Leonardo e Sofia, meus sobrinhos; minhas cunhadas Sandra e Renata e cunhado Clebeson

pelo apoio e compreensão nos muitos momentos de ausência.

A meu companheiro Mauricio Santana, imprescindível.

Ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários UFPa,

pela qualidade da formação oferecida e por ter proporcionado a realização deste trabalho.

FAPESPA pelo incentivo financeiro para a execução da pesquisa.

Às diversas pessoas e instituições que direta ou indiretamente contribuíram para o

planejamento, execução e conclusão desta tese.

6

SUMÁRIO

Pág

LISTA DE FUGURAS................................................................

LISTA DE TABELAS................................................................

LISTA DE ABREVIATURAS....................................................

RESUMO.......................................................................................

ABSTRACT..................................................................................

1.0. INTRODUÇÃO............................................................................ 16

1.1. FATORES DE VIRULÊNCIA E PATOGÊNESE DA H. pylori... 18

1.1.1. Urease............................................................................................. 18

1.1.2. A ilha de patogenicidade Cag PAI............................................... 20

1.1.3. Toxina VacA.................................................................................. 24

1.2. ADESINAS E PROTEÍNAS EXTERNAS DE MEMBRANA

(OMPS).......................................................................................... 27

1.2.1. Adesina BabA............................................................................... 28

1.2.1.1. Regulação do gene babA............................................................... 29

1.2.1.2. Mutação genômica na região codificadora do gene babA............. 30

1.2.1.3. Regulação da transcrição do gene babA........................................ 31

1.2.1.4. Função da proteína BabA............................................................... 31

1.2.2. Proteína ligante de ácido siálico (SabA)..................................... 32

1.2.3. Proteína inflamatória externa (oipA)......................................... 34

1.2.4. Lipoproteína associada a aderência (AlpA e AlpB)................... 35

1.3. RESPOSTA IMUNOLÓGICA À Helicobacter pylori................... 36

1.3.1. Macrófagos sinalizadores de linfócitos T na infecção pela H.

pylori.............................................................................................. 36

1.3.2 Macrófago como célula efetora na infecção pela H. pylori...... 37

1.3.3. Células dendríticas...................................................................... 38

1.3.4. Evasão da fagocitose pelos macrófagos...................................... 38

1.3.5. Resposta imunológica mediada por linfócito T.......................... 39

1.3.6. Os linfócitos B............................................................................... 41

1.4. ASSOCIAÇÃO DA INFECÇÃO POR H. pylori COM AS

DOENÇAS GÁSTRICAS............................................................. 41

1.5. ANTÍGENOS DE GRUPOS SANGUÍNEOS ABH e LEWIS E

A INFECÇÃO PELA H. pylori .................................................... 45

1.6. OBJETIVOS................................................................................... 54

1.6.1. Objetivo geral................................................................................ 54

1.6.1 Objetivos específicos..................................................................... 54

2.0. MATERIAL E MÉTODOS......................................................... 55

2.1. CASUÍSTICA................................................................................ 55

2.2. AMOSTRAS E CRITÉRIOS DE INCLUSÃO EXCLUSÃO.... 55

2.3 COLETA E TRATAMENTO DAS AMOSTRAS...................... 56

2.3.1. Amostras de sangue..................................................................... 56

2.3.2. Coleta da saliva............................................................................. 56

2.3.3. Coleta de biopsia gástrica............................................................ 57

2.3.4. Análise histopatológica de biópsias das regiões de antro e

corpo gástrico............................................................................... 57

7

2.4. DETERMINAÇÃO DOS FENÓTIPOS ABO E LEWIS E DO

ESTADO SECRETOR DE ABH.............................................. 58

2.4.1. Determinação do fenótipo eritrócitos.......................................... 58

2.4.2. Determinação do Estado Secretor ABH na saliva................... 58

2.4.3 Análise imunohistoquímica das biopsias gástricas .................. 59

2.4.3.1. Controles da reação imunohistoquímica........................................ 60

2.4.3.2. Análise semi-quantitativa da reação de imunohistoquímica.......... 60

2.5. PREPARAÇÃO DE DNA DE BIOPSIA GÁSTRICA.................. 60

2.6. DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DAS LINHAGENS

TRIPLO POSITIVAS DA H. pylori.............................................. 61

2.7. GENOTIPAGEM DOS GENES FUT2 e FUT3 PELA PCR........ 62

2.7.1. Gene FUT2..................................................................................... 62

2.7.2 Gente FUT3.................................................................................. 63

2.8. EXTRAÇÃO DE RNA PARA ANÁLISE DE PCR EM TEMPO

REAL...................................................................................... 63

2.8.1 Conversão de RNA em cDNA..................................................... 64

2.9. DETECÇÃO DE EXPRESSÃO DOS GENES babA2 e sabA DA

H. pylori PELA PCR EM TEMPO REAL..................................... 64

2.10. ANÁLISE ESTATÍSTICA........................................................ 64

3.0. RESULTADOS............................................................................. 68

3.1. ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA................................................. 68

3.2. ANÁLISE DOS MARCADORES DE VIRULÊNCIA DA H.

pylori.................................................................................... 72

3.3. ASSOCIAÇÃO DA INFECÇÃO PELA H. pylori COM OS

GRUPOS SANGUÍNEOS ABO LEWIS E SECRETOR............. 80

3.3.1. Avaliação dos polimorfismos T59G e G508A no gene Lewis

do G428A no gene Secretor................................................... 85

3.4. EXPRESSÃO IMUNOHISTOQUÍMICA DOS ANTÍGENOS

ABO E LEWIS NA MUCOSA GÁSTRICA.............................. 89

3.5. EXPRESSÃO DE babA2 e sabA NA MUCOSA GÁSTRICA..... 97

4.0. DISCUSSÃO............................................................................... 103

5.0. CONCLUSÕES............................................................................. 114

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS....................................... 116

8

LISTA DE FIGURAS

Figura Descrição Pág

Figura 1. Representação esquemática dos principais resultados clínicos

da infecção pela Helicobacter pylori .................................... 17

Figura 2. Diversidade dos sítios de tirosina fosforilação da proteína

CagA da Helicobacter pylori.............................................. 21

Figura 3 Proteína CagA e os domínios de fosforilação EPIYA............ 22

Figura 4. Desregulação de SHP2 pela proteína CagA............................. 23

Figura 5. Estrutura da proteina VacA da Helicobacter pylori e seus

efeitos funcionais..................................................................... 25

Figura 6. Proteínas de membrana da Helicobacter pylori....................... 27

Figura 7. Localização genômica dos genes babA, babB, e babC em

linhagens J99, 26.695, e HPAG1............................................ 28

Figura 8. Espectro de doenças gástricas associadas com a infecção pela

Helicobacter pylori.......................................................... 42

Figura 9. Representação esquemática das estruturas terminais dos

epitopos ABH e Lewis em estruturas o-glicanos..................... 47

Figura 10. Alteração do padrão de glicosilação da mucosa gástrica frente

à infecção pela Helicobacter pylori................................... 51

Figura 11. Distribuição das doenças gástricas diagnosticadas na amostra

de pacientes atendidos no HUJBB em 2011-2012............. 68

Figura 12. Distribuição dos marcadores de virulência da bactéria

Helicobacter pylori entre regiões do antro e corpo gástrico dos

pacientes analisados......................................................... 72

Figura 13. Correlação entre o índice de lesões histopatológicas e o índice

de combinação dos genes vacAm1s1, cagA, babA2 e sabA da H.

pylori detectados em biópsias de corpo e antro de pacientes

com gastrite crônica atendidos no HUJBB em 2011-

2012................................................................................ 79

Figura 14. Distribuição dos fenótipos Lewis em relação a concordâncias

dos fenótipos Lewis eritrocitário e salivar dos pacientes com

gastrite crônica atendidos no HUJBB em 2011-2012............ 82

Figura 15. Distribuição dos fenótipos do sistema dos tipos Lewis em

relação aos grupos sanguíneos do sistema ABO dos pacientes 83

9

com gastrite crônica atendidos no HUJBB em 2011-2012......

Figura 16. Distribuição dos fenótipos Lewis concordantes e discordantes

em relação a infecção pela H. pylori e ao tipo de grupo

sanguíneo ABO de pacientes com gastrite crônica atendidos

no HUJBB em 2011-2012................................................ 84

Figura 17. Padrão de digestão enzimática das mutações T59G (A) e

G508A (B) no gene FUT3, pelas enzimas de restrição VspI e

PvuII, respectivamente, corado com brometo de etídio em

poliacrilamida 7% de agarose........................................... 85

Figura 18. Distribuição de frequência dos genótipos Lewis entre

pacientes infectados e não infectados pela H. pylori....... 88

Figura 19 Padrão homogeneo de expressão antígenica. (A e B) Padrão

Homogêneo do antígeno H e A respectivamente............... 90

Figura 20. Padrão Heterogêneo de marcação. (C) Perda de Leb em área

de Metaplasia intestinal; (D) Ganho de Lea em área de

Metaplasia intestinal; (E) padrão heterogêneo do antígeno Leb.

Aumento 40x........................................................... 91

Figura 21. Distribuição da expressão dos antígenos dos sistemas ABH e

Lewis na mucosa gástrica dos pacientes com gastrite crônica

atendidos no HUJBB em 2011-2012............................... 92

Figura 22. Distribuição da expressão imunohistoquímica ABH e Lewis

em relação ao nível de inflamação na mucosa gástrica dos

pacientes com gastrite crônica de Belém-Pa, 2011-2012...... 93

Figura 23. Comparação da expressão dos antígenos de grupos sanguíneos

entre na saliva e mucosa gástrica de pacientes com gastrite

crônica de Belém – Pa....................................................... 94

Figura 24. Comparação entre o Ct da expressão do RNAm dos genes

babA2 e sabA verificados na mucosa gástrica de pacientes

com gastrite crônica atendidos no HUJBB em 2011-2012..... 98

Figura 25. Relação entre a detecção dos genes BabA2 por PCR e a

presença de expressão de seus RNAm verificados na mucosa

gástrica de pacientes com gastrite crônica atendidos no

HUJBB em 2011-2012.................................................... 99

Figura 26. Média dos escores de expressão imunohistoquímica dos

antígenos ABH e Lewis em relação a expressão dos genes

BabA2 e SabA da H. pylori detectados na mucosa gástrica de

pacientes com gastrite crônica de Belém-Pa.......................... 102

10

LISTA DE TABELAS

Tabela Descrição Pág

Tabela 1. Infecção por Helicobacter pylori em países da America Latina......... 16

Tabela 2. Anticorpos específicos para antígenos sistemas de grupo sanguíneo

ABO e Lewis................................................................................ 60

Tabela 3. Sequências dos iniciadores para tipagem dos genes FUT2 e FUT3

por RFPL-PCR.................................................................................... 66

Tabela 4. Sequências dos iniciadores para tipagem da Helicobacter pylori... 67

Tabela 5. Lesões histopatológicas presentes no corpo e antro de pacientes com

gastrite crônica atendidos no hospital João de Barros Barreto........ 69

Tabela 6. Comparação dos métodos de detecção da H. pylori entre pacientes

com gastrite crônica atendidos no HUJBB em 2011-2012.................. 70

Tabela 7. Associação das lesões histopatológicas na presença de Helicobacter

pylori nas áreas de corpo e antro gástrico de pacientes atendidos no

Hospital de Barros Barreto 2011..................................................... 71

Tabela 8. Associação dos genes de virulência detectados no estomago dos

pacientes com gastrite crônica atendidos no HUJBB em 2011-2012 73

Tabela 9. Correlação entre os genes de virulência detectados no antro e corpo

gástrico de pacientes infectados por H. pylori atendidos no HUJBB

em 2011-2012............................................................................ 74

Tabela 10. Correlação das diferentes combinações dos fatores de virulência da

H. pylori entre corpo e antro gástrico de paciente com gastrite

crônica atendidos no HUJBB em 2011-2012...................................... 75

Tabela 11. Correlação entre os genes de virulência e lesão histopatológicas

detectadas na mucosa de corpo e antro gástrico de pacientes com

gastrite crônica atendidos no HUJBB em 2011-2012......................... 78

Tabela 12. Distribuição de pacientes com gastrite crônica atendidos no HUJBB

em 2011-2012 de acordo com a infecção pela H. pylori e os tipos de

grupo sanguíneo ABO, Lewis e estado secretor salivar em relação a

população de Belém ........................................................................ 81

Tabela 13. Distribuição de pacientes com gastrite crônica atendidos no HUJBB

em 2011-2012 de acordo os fenótipos Lewis eritrocitário e salivar 81

Tabela 14. Distribuição da infecção pela H. pylori entre pacientes Lewis

concordantes e discordantes com gastrite crônica atendidos no

HUJBB em 2011-2012................................................................... 84

11

Tabela 15. Frequências alélicas e genotípicas dos loci FUT2 e FUT3 entre

pacientes com gastrite crônica atendidos no HUJBB em Belém/Pa

em 2011-2012....................................................................................... 87

Tabela 16. Comparação das frequências genotípica de FUT3 entre pacientes

com gastrite crônica e população de Belém......................................... 88

Tabela 17. Comparação da expressão dos antígenos A, B, H, Lea e Le

b na

camada foveolar da área do antro gástrico entre as graduações forte

e fraca das lesões histopatológicas na mucosa gástrica de paciente

com gastrite crônica atendidos no HUJBB em 2011-2012.................. 95

Tabela 18. Análise da expressão imunohistoquímica dos antígenos ABH e

Lewis na mucosa gástrica em relação à presença dos fatores de

virulência da H. pylori em pacientes com gastrite crônica atendidos

no HUJBB em 2011-2012........................................................... 96

Tabela 19. Distribuição da expressão dos genes BabA2 e SabA em função das

lesões histopatológicas diagnosticadas na mucosa gástrica de

pacientes com gastrite crônica atendidos no HUJBB em 2012-2012 100

Tabela 20. Distribuição dos grupos sanguíneos em função da expressão dos

genes babA2 e sabA na mucosa gástrica de com gastrite crônica

atendidos no HUJBB em 2012-2012................................................... 101

12

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS

L Microlitro

µm Micrometro

Cm Centímetro

AlpA/B Lipoproteínas A e B associadas à aderência

APCs Células apresentadoras de antígenos

baba Gene promotor da proteína BabA

BabA Adesina ligante de antígenos de grupos sanguíneos

cagA Gene promotor da citotoxina CagA

CagA Citotoxina associada ao gene A

cagPAI Região da ilha de patogenicidade do cromossoma da bactéria

c-Met Fator de crescimento de hepatócito

dNTP Desoxirribonucleotídeos

EPIYA Motivo glutamato-prolina-isoleucina-tirosina-alanina

EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético

H Antígeno H de grupo sanguíneo

H. pylori Helicobacter pylori

HCl Ácido Clorídrico

HUJBB Hospital Universitário João de Barros Barreto

IgA Imunoglobulina de cadeia pesada α (alfa)

IgG Imunoglobulina de cadeia pesada γ (gama)

IgM Imunoglobulina de cadeia pesada µ (mu)

IL- Interleucina - 1, 4, 5, 6, 8 e 17

Le Antígeno Lewis de grupo sanguíneo

Lea Antígeno Lewis a de grupo sanguíneo

Leb Antígeno Lewis b de grupo sanguíneo

Lex Antígeno Lewis x de grupo sanguíneo

Ley Antígeno Lewis y de grupo sanguíneo

mM Micromolar

MALT Linfoma de tecido linfóide associado à mucosa

MgCl2 Cloreto de magnésio

mL Mililitro

N Normalidade

nL Nanolitro

nm Nanômetro

13

NaCl Cloreto de Sódio

NaOH Hidróxido de sódio

oipA Gene promotor da proteína OipA

OipA Proteína inflamatória da membrana externa A

OMP Famílias de proteínas da membrana externa

PCR Reação em cadeia da polimerase

pH Potencial hidrogeniônico

pMol Picomolar

rpm Rotações por minuto

SabA Adesina ligante de ácido siálico

Se Secretor

SLex Sialil-Lewis x

T4SS Sistema de secreção tipo 4

ureA Gene promotor da atividade da uréase

UFPA Universidade Federal do Pará

vacA Gene responsável pela toxina VacA

VacA Citotoxina vacuolizante A

ZnCl2 Cloreto de Zinco

Zo-1 Zona oclusiva do complexo de junção epitelial

14

RESUMO

A H. pylori causa doenças gástricas severas. Vários genes bacterianos têm sido

associados com o grau de severidade das doenças gástricas, entre eles o gene cagA,

VacAs1m1, babA2 e sabA, estes últimos se ligam em receptores carboidráticos de grupo

sanguíneo expressos nas células epiteliais gástricas. Estes antígenos de grupo sanguíneo

podem sofrer variações nos padrões de expressão resultado da interação de loci como

ABO, Hh, Sese, Lele. A presença dos SNPs T59G e G508A no gene FUT3 e G428A no

gene FUT2 podem alterar os padrões de glicosilação da mucosa assim como a infecção

pela H. pylori. Assim este estudo investigou a relação da infecção pelo H. pylori com os

polimorfismos de grupo sanguíneos ABH e Lewis. Foram envolvidos 216 pacientes

sintomáticos para doenças gástricas, atendidos no HUJBB. Foram coletadas as amostras de

sangue, saliva e biópsias gástricas. Foram aplicados os ensaios da RFLP-PCR para

verificar os SNPs T59G; G508A e G428A. As expressões antigênicas dos sistemas ABH e

Lewis foram analisadas pela imunohistoquímica, Dot-ELISA e Hemaglutinação direta. Foi

realizada análise histopatológica pela HE e Gram-modificado e detectado fatores de

virulência da H. pylori por PCR e a expressão dos genes babA2 e sabA pela PCR em tempo

real. A H. pylori atingiu taxa de 59,26%. A infeção foi associada com vários achados

inflamatórios, cujo risco relativo variou de 111.78 a 5.36. As frequências dos marcadores

de virulência vacAm1s1, cagA, babA2, e sabA atingiram proporções de 79,69%, 66,40%,

49,21% e 89,84%, respectivamente. Foi verificada correlação significativa (rs = 0.7201; t =

11.1299; <0.0001), entre as diferentes combinações dos fatores de virulência bacteriano

entre corpo e antro e entre o maior número de genes de virulência e o índice de lesão na

mucosa gástrica tanto no antro (rs = 0.2263; p = 0.0125) quanto no corpo gástrico (rs =

0.2083; t = 2.3527; p = 0.0202). A presença dos genótipos Le/_ foi maior entre pacientes

infectados pela H. pylori enquanto a frequência de le*/le* foi maior entre os pacientes sem

infecção. A perda de expressão antigênica A/B foi relacionada a forte inflamação e à

presença de cagA. e a perda de H e Leb foi relacionada a presença do gene sabA. Em

relação à expressão de babA2, 88,3% dos pacientes expressavam o antígeno Leb entre as

bactérias babA2 com ausência de expressão apenas 67,74% expressavam este antígeno. A

presença do alelo Lewis funcional confere maior risco de infecção pela H. pylori. E na

dinâmica da interação bactéria-hospedeiro a expressão dos antígenos Lewis podem ser

alteradas estando relacionada à presença de H. pylori vacAm1s1, cagA+ e sabA+,

concedendo maior risco de transformação maligna no estômago.

15

ABSTRACT

The H. pylori may cause severe gastric diseases. Many bacterial genes have been

related with severity degrees of gastric illnesses, among them the cagA, vacAs1m1, babA2

and sabA genes, these last ones can bind in carbohydrate receptors of blood group

expressed in gastric epithelial cells. These blood group antigens may suffer variations in

their expressions pattern, a result of loci interaction as ABO, Hh, Sese and Lele. The

presence of T59G and G508A SNPs in FUT3 gene and G428A in FUT2 gene might

change the mucosal glycosylation patterns just like the infection by H. pylori. So, this

study investigated the relation of H. pylori infection with polymorphisms of ABH and

Lewis blood groups. Were investigated 216 patients presenting symptoms to gastric

diseases attended at HUJBB. Were collected blood, salive and gastric biopsy samples and

performed the RFLP-PCR to verify T59G, G508A and G428A SNPs. The antigenic

expressions of ABH and Lewis blood groups were analyzed by Immunohistochemistry

assays, Dot-ELISA and direct hemagglutination. The histopathological analysis was made

by HE and Gram-modified staining, the detection of H. pylori virulence factors was

performed by PCR and the babA2 and sabA genes expression was analyzed by real time

PCR. The H. pylori reached a frequence rate of 59.26%. The infection was associated with

many inflammatory findings, whose relative risks varied of 111.78 to 5.36. The

frequencies of vacAm1s1, cagA, babA2, and sabA virulence markers reached proportions of

79.69%; 66.40%; 49.21% and 89.84% respectively. Was verified the significative

correlation (rs = 0.7201; t = 11.1299; <0.0001) among different bacterial virulence factors

combinations in antrum and body gastric regions, the highest number of virulence genes

and lesion index of gastric mucosa found in antrum (rs = 0.2263; p = 0.0125) and body (rs

= 0.2083; t = 2.3527; p = 0.0202) regions. The presence of Le/_ genotypes was higher

among H. pylori-infected patients while le*/le* frequency was higher among non-infected

patients. The loss of A/B antigenic expression was related to strong inflammation and the

presence of cagA, while the loss of H and Leb was related to sabA gene presence. About

babA2 expression, 88.3% of patients demonstrated carry Leb antigen and among babA2

with absence of expression just 67.74% showed this antigen. The presence of functional

Lewis allele confers a higher H. pylori infection risk. In the bacteria-host interaction

dynamic the Lewis antigens expression may be changed if it is related to vacAm1s1, CagA+

and SabA+ of H. pylori, providing a higher risk of malignant transformation in stomach.

16

1.0. INTRODUÇÃO

Helicobacter pylori é um onco-patógeno que coloniza o estômago humano

resultando em infecção assintomática ou com sintomas, que vai de gastrite leve até doenças

mais severas como úlcera, carcinoma gástrico e linfoma de MALT (Marshall, 1989;

Parsonnet et al., 1991; Parsonnet et al., 1994). Este patógeno é um bacilo curvo espiralado,

gram negativo, microareofílico, geneticamente heterogêneo, isto é as cepas apresentam

diferentes padrões de virulência (Marshall & Warren, 1984, McClain et al., 2009).

Esta infecção afeta aproximadamente 50% da população mundial (Parsonnet et

al., 1992) e usualmente é adquirida na infância podendo persistir ao longo da vida, se não

for tratada (Suerbbaum & Micheiti, 2002). Na América Latina dados revelam que a taxa de

infecção varia entre 47,7% a 77,8% (Tabela 1).

Tabela 1. Infecção por Helicobacter pylori em países da America Latina.

Pais Tamanho amostral

(N)

Taxa de

infecção (%) Referência

Argentina 533 56,1 Vega et al.; (2010)

Bolivia 424 74,0 Apud Santos et al.; (2009)

Brasil 1007 70,7 Apud Santos et al.; (2009)

Cuba 996 47,7 Apud Santos et al.; (2009)

México 71 59,2 Apud Santos et al.; (2009)

Venezuela 418 77,8 Apud Santos et al.; (2009)

A progressão para doenças severas resulta da interação entre fatores bacterianos,

fatores do hospedeiro assim como fatores ambientais. Uma das características da infecção

é a resposta inflamatória acentuada e a incapacidade do hospedeiro eliminar a bactéria,

resultando na infeção persistente, com aumento da produção ácida e dano tecidual

(Beswick et al., 2006). A ulceração e a carcinogênese são resultados multuamente

exclusivos desta infecção. A infecção é persistente e em áreas de elevadas prevalências a

reinfecção é muito comum. Pacientes nos Estados Unidos infectados com H. pylori tem 3,5

vezes maior risco de desenvover doença de úlcera péptica do que as pessoas não infectadas

(Covacci et al., 1999). No Norte do Brasil, uma percentagem muito alta de úlceras

gástricas e duodenais (até 93%) é atribuída à infecção por H. pylori (Martins et al., 2002).

17

É bem aceito que a infecção crônica pela H. pylori é um importante fator de risco

no desenvolvimento de câncer gástrico, esta bactéria induz mudanças na mucosa gástrica

(Figura 1) que pode contribuir para surgimento de tumor gástrico (Correa & Piazuelo,

2012).

Figura 1. Representação esquemática dos principais resultados clínicos da infecção pelo H.

pylori (Correa & Piazuelo, 2012).

O câncer gástrico continua sendo a segunda causa de morte por câncer no mundo.

Numa escala global este tipo de tumor responde por cerca de 700.000 mortes anualmente.

Nos EUA foram estimadas 10.540 mortes por câncer de estômago no ano de 2012 (Siegel

et al., 2012). Dados da Agência Internacional para Pesquisa do Câncer revelaram uma

incidência de 5,1% de câncer gástrico, em ambos os sexos, nos últimos 5 anos na América

Latina e Caribe (IARC, 2012). No Brasil a estimativa para o ano de 2012, considerando

100.000 habitates é que fossem diagnosticados 12.670 novos casos entre homens e 7420

entre as mulheres, destes 680 casos ocorrerão no Pará (INCA, 2012).

Mucosa

gástrica

normal

Gastrite não

atrófica

Gastrite não

atrófica

Gastrite

Atrófica multifocal

Mataplasia

intestinal

Displasia

Câncer

H. pylori

CagA-

VacA s2m2

CagA+

VacA

s1m1

18

A infecção pela H. pylori também desempenha um importante papel no

desenvolvimento do linfoma de tecido linfóide associado à mucosa (MALT), a H. pylori

está presente no estômago da maior parte dos pacientes, mas em 75% destes o linfoma

regride após a erradicação da bactéria (Nakamura et al., 1997, Parsonnet & Isaacson 2004).

1.1. FATORES DE VIRULÊNCIA E PATOGÊNESE DA H. pylori

A H. pylori coloniza a superfície apical do epitélio gástrico, mas os mecanismos

precisos de adesão e patogênese ainda estão sendo elucidados. Cepas aderentes são capazes

de sobreviver na mucosa gástrica, colonizar em alta densidade e também de recolonizar,

enquanto as cepas não aderentes são facilmente eliminadas (Hayashi et al., 1998).

Assim, a adesão é crucial para Helicobacter pylori persistir e causar doença, pois

a ligação do patógeno ao epitélio gástrico conduz em transdução de sinal e ativação de

Fator Nuclear-κβ e subsequente indução de interleucina-8, que uma citocina pró-

infamatória importante no combate da infecção (Beswick et al., 2006).

Vários fatores de virulência bacterianos estão presentes nas cepas de H. pylori,

que são implicados no desenvolvimento das doenças gástricas, entre eles estão a urease, a

citotoxina associada ao gene A (CagA) da ilha de patogenicidade cagPAI, algumas

variantes do gene da citotoxina vacuolatizante (VacA), proteína externa de membrana

(OMPs), tais como adesina ligante de grupo sanguíneo H/Leb (BabA), adesina ligante de

ácido siálico (SabA), proteínas externa inflamatória do tipo A (OipA) e lipoproteinas

associadas a aderância (AlpA e AlpB) (Marcus & Scott, 2001; Censini et al., 1996; Telford

et al., 1994; Ilver et al., 1998; Madavi et al., 2002; Franco et al., 2008; Odenbreit et al.,

1999).

1.1.1. Urease

A urease é um importante fator de virulência da H. pylori, presente em

abundância na bactéria, pois é usada para diminuir a acidez do ambiente gástrico. A urease

degrada a ureia, que é secretada como resíduo metabólico, resultando em amônia e

19

carbonato, cuja função principal é tamponar o meio ácido do estomago, permitindo a

sobrevivência da H. pylori (Marcus & Scott, 2001; Hu & Mobley 1990).

A urease é constituída por duas subunidades, a subunidade alfa com

aproximadamente 24 kDa e beta, com 68 kDa. A quantidade de urease produzida pela H.

pylori representa cerca de 5 a 10% das proteínas totais da bactéria (Marcus & Scott, 2001;

Hu & Mobley 1990). Esta enzima é crucial para a H. pylori colonizar o estômago, estudos

realizados por Tsuda et al., (1994) e Karita et al., (1995), relataram que cepas cujos genes

da urease foram nocalteados, não tiveram a capacidade de colonizar espécies animais

devido a incapaciade de tamponar o ambiente gastrico (Tsuda et al., 1994; Karita et al.,

1995). Williams et al., (1996) afirmam que cepas de H. pylori nocalteadas para o gene da

urease não conseguem colonizar o estômago, porque a amônia, gerado pela urease,

também serve como fonte de nitrogênio para sintetizar aminoácidos, assim como na

proteção contra peroxinitrito (Kuwahara, et al., 2000). Outros estudos relatam que a urease

é importante para H. pylori, porque participa do processo de escape da resposta

imunológica, proporcionando um aumento na sobrevida da bactéria no macrófago

(Schwartz & Allen, 2006), escape da fagocitose (Makristathis et al., 1998) e da

opsonização mediada pelo complemento (Rokita et al., 1998).

Embora uma maior quantidade de urease esteja localizada intracelularmente,

algumas moléculas estão presentes na superfície da bactéria (Rokita et al., 2000) podendo,

assim, agir como uma antígeno ligante que induz a síntese de citocinas inflamatórias, pelas

células epiteliais gástricas e macrófagos, (Harris et al., 1998, Takahashi et al., 2004) além

de ativar a apoptose de algumas células (Fan et al., 2000). Como o mecanisno de ação

associado a estas respostas é disparado pela urease, ainda não está totalmente claro. A

indução de apoptose pode resultar como consequência da ligação ao MHCII. A subunidade

β urease também pode se ligar ao CD74 e induzir a produção de IL-8 pelas células

epiteliais gástricas (Beswick et al., 2006). Ambas as respostas são importantes na

patogênese geral observada na infecção pela H. pylori. Diferentes explicações apoiam a

interação da urease com o tecido do hospedeiro, além da atividade catalítica, a urease ativa

macrófago (Gobert et al., 2002a), monócito (Harris et al., 1996), plaqueta, desregula o

complexo de junção das células epiteliais gástricas, induz a produção de citocinas a partir

das células epiteliais gástricas (Harris et al., 1998; Takahashi et al., 1998) através da

ligação ao CD74 (Beswick et al., 2006).

20

1.1.2. A ilha de patogenicidade Cag PAI e o fator de virulência cagA

Devido á heterogeneidade genética presente no genoma da Helicobacter pylori, os

fatores de virulência bacterianos têm um importante papel na determinação do resultado da

infecção. A ilha de patogenicidade cag (cag PAI) é um elemento de inserção de DNA com

40-kb constituído por 27 a 31 genes flaqueado por uma região de repetição direta com 31

pares de bases. Esta ilha contém uma das mais estudadas proteína da H. pylori, a proteína

CagA (Censini et al., 1996; Akopyants et al., 1998; Covacci & Rappuoli, 2000).

A proteína CagA foi inicialmente identificada no inicio de 1990 e sua expressão

foi associada com ulceração péptica (Cover et al., 1990; Crabtreet al., 1991). Devido a

associação com esta manifestação clínica, a ilha cag PAI é um determinante de virulência

muito bem caracterizado da H. pylori e o gene da proteína CagA é frequentemente usado

como indicador da presença desta da ilha.

Aproximadamente 60 a 70% das cepas de H. pylori ocidentais e quase 100% das

do leste asiático expressam CagA (Censini et al., 1996; Tomb et al., 1997; Alm et al.,

1999). Embora todas as cepas induzam gastrite, cepas com a ilha cag PAI aumentam o

risco para gastrite severa, gastrite atrófica e câncer gástrico distal quando comparados a

cepas que não apresentam a ilha (Blaser et al., 1995; Cover et al., 1990; Crabtreet al.,

1991; Crabtreet al., 1993; Kuipers et al., 1995; Parsonnet et al., 1997; Peek et al., 1995;

Queiroz et al., 1998; Rudi et al., 1997; Shimoyama et al., 1998; Torres et al., 1998;

Vorobjova et al., 1998).

O gene cagA sintetiza a proteína CagA que tem 120 a 140 kDa é translocada para

célula do hospedeiro pelo sistema de secreção tipo IV (T4SS), após adesão da bactéria.

Uma vez dentro da célula hospedeira, a CagA é tirosina fosforilada no motivo glutamato-

prolina-isoleucina-tirosina-alanina (EPIYA) e induz mudanças morfológicas na célula,

inicialmente denominada de fenótipo “beija-flor”(Asahi et al., 2000; Odenbreit et al.,

2000; Segal et al., 1999; Stein et al., 2002, Stein et al., 2000).

Até o momento quatro distintos motivos EPIYA (EPIYA-A, B, C e D) foram

identificados na região polimórfica carboxi-terminal da proteína CagA, e eles são

distinguidos por diferenças sequências de aminoácidos envolvendo o motivo EPIYA

(Hatakeyama, 2004; Higashi, et al., 2005; Naito et al., 2006). Quanto ao padrão de

fosforilação, os motivos EPIYA-A e B são fosforilados em menor grau quando

comparados com o EPIYA-C. Os motivos EPIYA-A e B estão presentes em cepas do

21

mundo todo, enquanto o EPIYA-C é encontrada em cepas de regiões ocidentais (Europa,

América do Norte e Austrália). O número de sitios EPIYA-C pode variar, embora a

maioria das proteínas CagA tenha um único motivo EPIYA-C. Em cepas ocidentais, um

aumento do número de CagA EPIYA-C é um importante indicador de risco para o

desenvolvimento de câncer gástrico (Basso, et al., 2008). O motivo EPIYA-D é encontrado

com predominância em cepas do leste asiático, Japão, Coreia do sul e China, e cepas que

contêm este motivo induzem a produção de uma grande quantidade de interleucina-8 (IL-

8) pelas células epiteliais gástricas do que cepas CagA dos tipos A-B-C (Figura 2),

encontradas no ocidente (Hatakeyama, 2004; Argent et al., 2008;).

Figura 2. Diversidade dos sítios de tirosina fosforilação da proteína CagA da Helicobacter

pylori. (Traduzido de Hatakeyama, 2004).

Uma vez fosforilada por membros Ab1 e Src da família das kinases, o complexo

fosfo-CagA interage com numerosos efetores intracelulares, se ligando e ativando uma

tirosina fosfatase eucariótica (SHP-2) (Figura 3), levando a ativação substancial de

proteínas reguladoras de sinal extracelular kinases 1 e 2 (ERK1/2), do adaptador Crk e da

tirosina kinase Src-C (Figura 4). A proteína CagA tipo A-B-C do leste asiático exibe uma

22

forte atividade ligante com SHP-2 do que CagA tipo A-B-C ocidental (Higashi et al.,

2002). A interação da fosfo-CagA com a kinase Src-C ativa rapidamente uma via de

retroalimentação para regular negativamente a sinalização Src (Tsutsumi et al., 2003).

Figura 3. Proteína CagA e os domínios de fosforilação EPIYA. (Adaptado de Peek et al.,

2010)

23

Figura 4. Desregulação de SHP2 pela proteína CagA (traduzido de Hatakeyama, 2004).

Em linhagens de células de adenocarcinoma gástrico (AGS) a translocação e

subsequente fosforilação de CagA resulta no efeito “beija-flor”, um fenótipo associado

com o alongamento da célula (Moeset al., 2004; Segal et al., 1999). Em células AGS, a

interação entre fosfo-CagA e SHP-2 aumenta o tempo de ativação da ERK de uma maneira

independente de ras ou kinase 3 fosfatidilinositol (PI3K), desfosforila e inativa kinase de

adesão focal (FAK) resultando no alongamento da célula (Higashi et al., 2004; Tsutsumi et

al., 2006). A proteína CagA fosforilada induz alongamento porque danifica o mecanismo

de retração celular (Bourzac et al., 2007). Além disso, a atividade catalítica da c-Src é

inibida pela CagA fosforilada, que leva a desfosforilação da tirosina da actina ligante das

proteínas cortactina, ezrina e vinculina levando ao elongamento celular (Moeset al., 2007;

Selbach et al., 2004, Selbach et al., 2003).

24

A proteína CagA não fosforilada também exerce um efeito na célula, que

contribui para a patogênese. A translocação do CagA, mas não sua fosforilação, leva a

ativação aberrante da β-catenina, destruindo o complexo de junção apical e a perda da

polaridade celular (Amieva et al., 2003; Bagnoli et al., 2005; Franco et al.,2005; Murata-

Kamiya et al., 2007; Saadat et al., 2007; Suzuki et al., 2005). Além disso, a CagA não

fosforilada altera a proteína de adesão celular, caderina-E, o receptor do fator de

crescimento de hepatócito (c-Met), fosfolipase gama-C (PLC-γ), o adaptador da proteína

Grb2 e a kinase de particionamento defeituosa 1b, kinase regulatoria microtúbulo 2

(PAR1b/MARK2), que leva a resposta proinflamatória e mitogênica, distruindo a junção

celular com perda da polaridade da célula (Churin et al., 2003; Mimuro et al., 2002;

Murata-Kamiya et al., 2007; Saadat et al., 2007).

A CagA não fosforilada também ja foi associada com a proteína da zona oclusiva

do complexo de junção fechada epitelial (ZO-1) e a molécula A de adesão juncional de

proteína transmenbrana (JAM-A) levando a montagem incompleta do complexo de junção

fechado do sítio ectópico de ligação bacteriana (Amieva et al., 2003). Recentemente, foi

mostrado que CagA está diretamente ligada ao Par1/b/MARK2, um regulador central da

polaridade celular, que uma vez associado inibe a atividade da kinase, assim como

desregula a formação do fuso mitótico, promovendo a perda da polaridade celular (Lu et

al., 2009; Umeda et al., 2009; Saadat et al., 2007).

1.1.3. Toxina VacA

Um lócus da H. pylori associado com risco de doença severas gástrica é o da

toxina VacA (Cover et al., 1992, Cover et al., 1994, Phadnis et al., 1994, Schmit & Haas,

1994). A toxina VacA foi primeiramente identificada com uma proteína citotóxica que

induz vacuolização intracelular de células em cultura (Leunk et al., 1988). Esta proteína é

codificada pelo gene vacA, que codifica uma preprotoxina de aproximadamente 139

kilodaltons , que inclui um peptídio sinal amino-terminal e um domíno carboxi-terminal de

50 kDa, que são clivados na secreção para produzir monômeros maturos da toxina de 87 a

95 KDa (Telford et al., 1994).

25

A proteína VacA suprime a resposta por linfócitos T, que pode contribuir para a

longevidade da infecção gastrica (Gebert et al., 2003; Beevers et al., 2004; Sundrud et al.,

2004)

A proteína VacA é codificado pelo gene vacA que está presente na maioria das

cepas de H pylori, embora diferenças consideráveis na atividade vacuolizante sejam

observadas entre as cepas. Esta variação é atribuída à estrutura do gene vacA, que é

constituído por uma região sinalizadora (s), uma região média (m), e posteriormente uma

região intermediária (i), que está localizada entre as regiões s e m foi descrita (Rhead et al.,

2007).

A região s é estratificada em dois subtipos s1 e s2 e codifica um componente do

peptídeo sinal e a terminação N da proteína madura. A região m codifica parcialmente a

subunidade C-terminal com 55 KDa e é classificada em tipo m1 ou m2 (Figura 5).

Figura 5. Estrutura da proteina VacA da Helicobacter pylori e seus efeitos funcionais.

(traduzido de Polk & Peek, 2010)

Dados da literatura demosntraram que cepas da H. pylori vacAs1m1 têm maior

pontencial de induzir vacuolização quando comparadas com cepas vacAs2m2, (Atherton et

al., 1995; Cover e Blaser, 1992; Rhead et al., 2007, Van Doorn et al., 1999). Não existe

consenso na associação de bactéria vacAs1m1 com a severidade das doenças gástrica, pois

estudos realizados em populações ocidentais, revelaram que o o gene variante VacAs1m1

estava fortemente associado com doenças de úlcera gástrica e duodenal e com câncer

gástrico (Atherton et al., 1995; Atherton et al., 1997; Miehlket al., 2000). Enquanto que

26

outros estudos realizados no leste asiático não demonstraram nenhuma com um resultado

clínico específico.

Outras regiões polimórficas no gene vacA já foram descritas, entre elas uma

região denominada de i, que classificada em dois subtipos i1 e i2; cuja função foi associada

com a atividade vacuolizante, já que cepas vacAs1/i1/m2 são vacuolizante e cepas VacAs1/i2/m2

não induzem vacuolização. Todas as variantes vacAs1m1 são do tipo i1 e as variantes

vacAs2m2 são do tipo i2. As variantes vacAs1m2 podem ser i1 ou i2 (Rhead et al., 2007).

Estudos envolvendo pacientes no Iram demonstrou forte associação entre cepas com região

i1 e o câncer gástrico e no Iraque e Itália esta região i1 foi relacionada ao maior risco de

úlcera gástrica (Rhead et al., 2007; Basso et al., 2008; Douraghi et al., 2009; Hussein et

al., 2008), em relação aos pacientes do leste e sudeste asiático, que apresentam altas taxas

de câncer gástrico, o subtipo i da região i do vacA não foi associado com o risco da doença

(Ogiwara et al., 2008).

Em 2009 foi identificada e denominada de região d, uma deleção de 81 pares de

base entre a região m e a região i; cepas d1 não têm a deleção, enquanto cepas do subtipo

d2 contêm esta deleção (Ogiwara et al., 2009). Um pequeno número de cepas ocidentais

vacA do tipo d1, mas não do leste asiático, foi significativamente associado com infiltração

neutrofílica e atrofia da mucosa gástrica demonstrando que os genótipos da região “d”

constituem um outro locus de risco para câncer gástrico e ulceração péptica (Ogiwara et

al., 2009).

A proteína VacA exerce múltiplos efeitos na estrutura da célula epitelial gástrica

resultando em fenótipo que incluem destruição da função da barreira epitelial gástrica e da

modulação da resposta inflamatória. Outro efeito da proteína VacA é a destruição do

compartimento endossomal posterior, que resulta na formação do vacúolo (Leunk et al.,

1988; Papini et al., 1994), e afeta também a mitocôndria, levando a uma diminuição no

potencial transmembrana mitocondrial, com liberação de citocromo C, além da ativação de

caspase 8 e 9, e indução de apoptose in vitro (Cover e Blaser, 1993; Galmichet al., 2000;

Manentet al., 2008; Peek et al., 1999; Willhitet al., 2003).

Um das várias proteínas em que VacA se liga, nas células epiteliais gástricas, é o

receptor de fosfatase tiroxina Kinase RPTPβ. Este receptor regula a proliferação das

células, diferenciação e adesão, mecanismos estes envolvidos na ulcerogênese (Fujikawa et

al., 2003).

27

1.2. ADESINAS E PROTEÍNAS EXTERNAS DE MEMBRANA (OMPS)

A aderência da H. pylori na mucosa gástrica é muito importante na colonização

inicial e para o longo tempo de persistência no epitélio gástrico humano. A análise de três

genomas completos da H. pylori (cepas 26695, J99 e HPAG1) confirmou a presença de

quatro famílias de proteínas externas de membrana (OMPs), que compreende

aproximadamente 4% do genoma da bactéria. Entre estas famílias os membros do grupo

Hop (proteína externa de membrana de Helicobacter) foram os primeiros a serem

caracterizados. Várias OMPs da família Hop foram descritas como moléculas de adesão

bacteriana, entre elas a molécula ligante de grupo sanguíneo H/Leb (BabA), a molécula

ligante de ácido siálico (SabA), lipoproteína associada a aderência (AlpA e AlpB), proteína

inflamatória externa de membrana (OipA) e HopZ (Yamaoka, 2008) (Figura 6).

A expressão das OMPs foi associada com doenças gastroduodenais e com o risco

aumentado para o desenvolvimento do câncer gástrico (Dossumbekoya et al., 2006).

Figura 6. Proteinas de membrana da Helicobacter pylori (Adaptada de Magalhães & Reis,

2010)

28

1.2.1. Adesina BabA

A adesina ligante de grupo sanguíneo H/Leb (BabA) é uma proteína de 75 K-Da

codificada pelo gene babA, que possui três variantes babA1, babA2 e babB. A forma ativa

do gene é a variante babA2 que tem a capacidade de expressar a proteína BabA (Ilver et

al., 1998).

Estudos independentes usando as cepas 26695, J99 e HPAG1-0876 demonstraram

que cada uma possui um gene babA e um babB (Alm et al., 1999; Oh et al., 2006; Tomb et

al., 1997). A localização genômica dos genes babA e babB são completamente diferentes

nas três cepas (Figura 7). Na cepa J99, babA (JHP0833) está localizado depois do gene

hypD (JHP0835) sobreposto a um gene especifico (JHP0833) da cepa J99, e babB

(JHP1164) está localizado após o gene s18 (JHP1165). Na cepa 26695, as localizações de

babA e babB são reversas. A localização cromossômica posteriores aos genes hypD e s18

são referidas como locus A e B, respectivamente. Na cepa HPAG1, um gene OMP

posicionado na região dos locus A e B das cepas 26695 e J99, foi denominado de babC,

mas a função ainda não é desconhecida (Tomb et al., 1997 Alm et al., 2000; Colcbeck et

al., 2006).

Figura 7. Localização genômica dos genes babA, babB, e babC em linhagens J99, 26695, e

HPAG1 (Yamaoka, 2008).

29

O gene bab foi incialmente clonado da cepa CCUG17875 que têm dois genes

babA e um gene babB Experimento de inativação gênica demosntrou que apenas um gene

(chamado de babA2) tem atividade ligante Leb, enquanto que o outro gene babA1 não tem

(Ilver et al., 1998).

1.2.1.1. Regulação do gene babA

Existem diferentes mecanismos de regulação da expressão babA, tanto ao nível da

transcrição quanto da tradução. Um exemplo de regulação da tradução é a formação de

proteínas quiméricas BabA e BabB, que foi descrito por Pride e Blaser (2002), estes

autores descreveram que dois de 42 (5%) isolados clínicos tivereram os primeiros 56 pares

de base do gene babB substituídos pelos dos babA (quimera babA/B) na extermidade 5'

gene. Além disso, estes autores mostraram que a frequência de conversões gênicas (10-3

)

ocorridas em cepas de H. pylori são eventos recA-dependente e DNase-resistentes,

indicando que o gene quimérico babA/B provavelmente resulta de recombinação

intragenômica. Proteínas quimeras BabA/B também foram descritas na infecção

experimental por H. pylori em Macacos Rhesus (Solnick et al., 2004).

Além das quimeras BabA/B, proteínas do tipo BabB/A também já foram

descritas. Uma cepa mutante babA2 (CCUG17875), incapaz de se ligar ao antígeno Leb,

recuperou a sua atividade por recombinação homóloga do gene silencioso babA1 com o

locus babB, resultando em uma quimera babB/A (Backstrom et al., 2004).

A análises detalhadas do gene quimérico babB/babA mostrou que os primeiros 47

pares de base eram babB específico, os seguintes 66 pb foram partilhados entre ambos

babA e babB, e a sequência restante eram babA específica. Um segundo evento de

recombinação, provavelmente ocorre dentro de uma região onde as sequências do babA1 e

o locus babB são idênticos. A proteína quimérica BabB/A tem o potencial de se ligar ao

antígeno Leb, no entanto, a produção desta proteína está sujeita a variação de fase da

bactéria, que é gerada através do pareamento desigual, resultante do número de repetição

de resíduos de cisteína-treonina na região 5' do gene babB (Yamaoka, 2008).

Inicialmente, foi descrito que apenas cinco genes, que codificam as OMPs na H.

pylori (oipA, Saba, sabB, babB e hopZ), estão submetidos a variações de fase na

extremidade 5' do gene, de tal modo que nem todas as cepas produzem proteínas

30

funcionais (Tomb et al., 1997; Alm et al., 1999;). Mas, estudos posteriores confirmaram

que a variação de fase é um método de regular a produção da proteína BabA em algumas

cepas (Solnick et al., 2004, Colbeck et al., 2006; Hennig et al., 2006).

Análises detalhadas do gene babA com repetições de TC mostraram que o

peptídeo sinal está intimamente relacionado com aqueles das proteínas parálogas de babB,

as seqüências “downstream” foram seqüências típicas de babA (Hennig et al., 2006).

Assim, o gene babA, com repetição CT, pode ser resultado da translocação de babA para

babB, gerando um gene quimérico babB/babA. Um dado observado era que o gene babC

na cepa HPAG1possuía repetição CT no segmento codificador na posião 5', enquanto que

o gene babC da cepa 26695 não apresentava, sugerindo que quimeras babB/C também

pode ocorrer em algumas cepas. Estes foram casos de cepas mistas entre os genes babA e

babB, especialmente no locus B (Colbeck et al., 2006). A freqüência de babA translocado

para o locus babB foi entre 10-3

e 10-4

, que está de acordo com a freqüência em cepas

CCUG17875 (Backstrom et al., 2004).

A investigação detalhada de 10 cepas mostrou que um evento de recombinação foi

identificado a partir de aproximadamente 50 a 200 pb posterior ao códon ATG em cinco

cepas (todas as recombinações ocorraram no locus B) e antes do códon ATG nas outras

cinco cepas. No primeiro caso, o gene resultante forma o babB/A, enquanto a

recombinação completa ocorreu no último caso. Eventos de translocação, em geral é

freqüente entre os genes babA e babB e parece ser o principal mecanismo de regulação da

expressão babA. Portanto, H. pylori utiliza tanto a variação antigênica e a variação de fase

para regular expressão de babA (Colbeck et al., 2006).

1.2.1.2. Mutação genômica na região codificadora do gene babA

O gene babA inicialmente foi clonado de cepas CCUG17875, que contém um

gene silencioso babA1 e um alelo ativo com babA2 (Ilver et al., 1998). A sequencia desses

dois genes diferem unicamente em uma deleção de 10 pares de bases na sequencia

peptídica sinal do gene babA1 que resulta na perda do códon de iniciação da tradução.

Fujimoto et al., (2007) mostraram que pelo menos 80 cepas do leste e oeste asiático tinham

o códon de iniciação ATG intacto no gene baba, enquanto outros estudos detectaram a

ausência da deleção no gene babA1 (Pridet al., 2001; Pride & Blaser 2002; Sheu et al.,

2003; Colbeck et al., 2006; Hennig et al., 2006). De um modo geral a deleção do códon de

31

iniciação da tradução do gene babA1, descrito na cepa CCUG17875, pode ser um evento

raro. A mutação de ponto pode resultar em um códon de parada, deleção e inserção em

outras regiões do gene babA, mas também não são comuns. Hennig et al., (2006)

encontraram 1 cepa no total de 24 babA positivas, que apresentava uma mutação (na

posição do aminoácido 55), que gerava deslocamento de leitura co inibinção da expressão

da proteína BabA.

1.2.1.3. Regulação da transcrição do gene babA.

Segundo Backstrom et al., (2004) a atividade transcricional do gene babA é

regulada pelo número do nucleotídeo adenina (poli A), presentes nos box -10 e -35 na

região promotora do gene babA. Esta região é estável quando existem 10 adeninas,

conferido atividade trancricional do gene babA2, mas se o número adenina se eleva para

14, a atividade transcricional do gene é perdida, uma caracteristica presentes no gene

babA1.

Backstrom et al., (2004) também sugeriram que a região mencionada acima pode

ser propensa à mutações, pois geram deslocamento no quadro de leitura, o que poderia

levar a mudanças nos níveis trasnscricionais do gene. Apesar disso, outros estudos não

confirmaram que este mecanismo tenha um papel importante na regulação da expressão do

gene babA.

Existem pelo menos cinco tipos de mecanismos distintos para cepas de H. pylori

não expressarem o gene babA: a) ausência de gene babA, incluíndo o quimera babA/B; b) o

gene babA está presente, mas está inativo pelo deslocamento no quadro de leitura; c) o

gene está presente sem o código de iniciação da tradução; d) o gene está presente mas com

mutação sem sentido inviabilizando a tradução; e) o gene está presente mas sem mutação

aparente e também sem explicação para a ausência de expressão (Yamaoka 2008).

1.2.1.4. Função da proteína BabA

A proteína BabA se liga ao antígeno difucosilado Leb presente na superfície das

células epiteliais gástricas (Borén et al., 1993; Gerhard et al., 1999; Ilver et al., 1998). Um

32

estudo experimental com ratos transgênicos, que expressam Leb nas células epiteliais

gástricas, indicou que o antígeno Leb é um receptor da bactérial, pois após a infecção

experimental, uma gastrite mais severa foi observada nestes ratos quando comparados com

os tipos selvagens, sugerindo que a colonização mediada pelo Leb pode aumentar o

potencial patogênico da H. pylori (Guruget al., 1998).

A análise de ligantes específicos de cepas de H. pylori sugere que a adesina BabA

está envolvida na modificação do padrão de glicosilação da mucosa gástrica para permitir

que H. pylori se adapte e mantenha a persistência de colonização no seu hospedeiro

(Aspholm-Hurtig et al., 2004; Pohl et al., 2009).

A presença do gene babA2 foi associado com doença gástricas e quando

encontrado com em conjunto com cagA e variante VacAm1s1 aumenta o risco doenças mais

severa como carcinoma e úlcera (Gerhard et al., 1999).

A análise do babA2 como marcador de virulência tem produzido dados

conflitantes em relação a sua expressão e os resultados clínicos, mostrando que a

importância do babA2 nas doenças gástricas dependente da origem geográfica das cepas de

H. pylori. Em populações portuguesas, babA2 não é um biomarcador de doença de úlcera

péptica ou câncer gástrico (Chomvarin et al., 2008; Gatti et al., 2006). Contudo cepas

isoladas na Alemanha, Turkia e ou norte de Portugal a expressão de babA2 está associada

com severidade das doenças gástricas (Azevedo et al., 2008; Erzin et al., 2008, Gerhard et

al., 1999)

1.2.2. Proteína ligante de ácido siálico (SabA)

A adesina ligante de ácido siálico (SabA) é uma proteína de 70 KDa com 651

aminoácidos, que se liga à estrutura carboidrática LewisX sializado expressas nas células

epiteliais gástricas da mucosa inflamada (Madavi et al., 2002). Esta proteína é codificada

por um gene que apresenta uma diversidade genética entre as cepas de H. pylori (Shao et

al., 2010). Shao et al., (2010) demonstraram uma variação genética entre cepas isoladas de

amostras clínicas, atingindo 5 a 11,5% na fita nucleotídica e de 5,1% a 13,5% na sequência

de aminoácido. A análise filogenética, a partir da sequência do gene sabA, demonstrou que

as cepas de H. pylori se agrupam de acordo com sua origem geográfica, assim foi

evidenciado um agrupamento com todos os isolados do Japão e outro com cepas de países

ocidentais (Shao et al; 2010).

33

A expressão do gene sabA está associada com o risco aumentado de câncer

gástrico, mas com risco diminuído para úlcera duodenal (Yamaoka et al., 2006). Além

disto, o gene sabA é regulado pela variação de fase, porque a expressão da proteína SabA

pode ser rapidamente modulada “ON/OFF” para se adaptar às mudanças no nincho

gástrico (Yamaoka et al., 2006).

Yanai et al., (2007) relataram uma alta prevalência de sabA funcional (81%) em

108 isolados de H. pylori, a partir de amostras clínicas de pacientes japoneses. Eles

demonstraram, ainda, uma estreita relação entre o estado do gene sabA e gastrite atrófica,

mas o mecanimo de controle da regulação da expressão do gene sabA ainda é pouco

conhecido.

Um estudo realizado em Taiwan baseado em análise de blotting de 145 isolados

clinicos de H. pylori de pacientes do ocidente detectou que apenas 31% das cepas

expressam a proteína SabA (Sheu et al., 2006). Sheu et al., 2006 sugerem que a regulação

da expressão do gene sabA está submetida a variação de fase da bactéria.

Estudos mostraram que a variação de fase é um método de regulação da expressão

da proteína SabA em algumas cepas (Colbeck et al., 2006; Hennig et al., 2006; Solnick et

al., 2004). A funcionalidade é regulada por um mecanismo de pareamento desigual que é

mediada pelo número de timina-citosina na posição 5 'do gene.

As seqüências do genoma das cepas de H. pylori J99 mostram que o gene sabA

tem nove repetições de timina-citosina fora do quadro de leitura (Mahdavi et al., 2002).

Mahdavi et al. (2002) usaram a cepa J99 como ligante de sLex para identificar expressão

da proteína sabA, embora os isolados possuíssem 10 repetições CT, a proteína SabA ainda

sim era funcional (Mahdavi et al., 2002).

Yamaoka et al., (2002) em estudo experimental, usando o murino como modelo

experimental de infecção para H. pylori, observaram que tanto o gene sabA quanto o sabB

mudam seu estado funcional (de "on" para "off"). Durante o período de experimentação,

quatro semanas após a inoculação, foi verificado que o estado funcional do gene sabA

presente nas cepas JK101, inoculadas e posteriormente isoladas de um dos camundongos

infectados, foi modificado (duas de nove colônias alteraram sabB de "on" para "off" e uma

das nove colônias alterou de sabA de "on” para" off "). Os dados deste estudo revelaram

que, a densidade bacteriana em ratos infectados com H. pylori, que alteraram o perfil para

"off" foi reduzido em comparação com as de camundongos que não demonstram nenhuma

mudança no perfil. Assim, este estudo verificou o estado funcional do gene sabA pode

34

responder rapidamente às mudanças das condições no estômago ou em diferentes regiões

do estômago (Yamaoka et al., 2006).

A análise da repetição TC do gene sabA em cepas isoladas de pacientes de Taiwan

(Sheu et al., 2006), revelou que dentre 145 cepas de H. pylori isoladas, 116 (80%)

apresentavam o gene sabA por PCR, mas apenas 45 (31%) expressaram a proteína SabA,

quando detectada por técnica de IMUNOBLOT. Também foi observado neste estudo, que

o sequencimento dos produtos de PCR sabA positivos, a partir de 92 isolados,

identificaram que 60% (n = 55) tinham a sequencia de repetição CT, ao passo que os

outros 40% (n = 37) tinham repetição de TC diferentes (isto é, CTTTCTCTATCC) na

região 5' do gene sabA. Entre aquelas com um intervalo regular de repetição CT, 18 cepas

tiveram uma seqüência de quadros traduzível (subtipo "on"), mas apenas 13 destes tiveram

a tradução do fragmento completo da proteína.

1.2.3. Proteína inflamatória externa (oipA)

A proteína oipA é outra adesina externa de membrana da H. pylori, que foi

associada significativamente com a presença de úlcera duodenal, câncer gástrico e aumento

da infiltração neutrofílica (Franco et al., 2008, Yamaoka et al., 2006).

A expressão de oipA foi relacionada com o aumento de produção de IL-8

(Yamaoka et al., 2004). Um estudo usando o Moglian gerbilis infectado com cepas de

Helicobacter pylori tipo selvagem e uma cepa isogênica mutante para oipA demonstrou

que oipA induz a produção das citocinas IL-1, IL17 e Fator de Necrose Tumoral alfa

(TNF-α) e conseqüentemente inflamação da mucosa gástrica. A proteína oipA está também

envolvida na regulação positiva da metaloproteínase matrix I, MMP associado com o

câncer gástrico (Wu et al., 2006), na indução da kinase glicose sintetase 3 (GSK-3β)

(Tabassam et al., 2009) e na translocação da β-catenina para o núcleo. O acúmulo de β-

catenina resulta na formação de heterodímero com o fator transcricional LEF/TCF e na

ativação transcricional de genes que podem influenciar na carcinogênese (Franco et al.,

2008).

35

1.2.4. Lipoproteína associada a aderência (AlpA e AlpB)

Lipoproteína associada a aderência (AlpA e AlpB) são proteínas da membrana

externa da Helicobacter pylori envolvidas na adesão às células epiteliais gástricas.

Constituem dois genes homólogos ligados, que codificam uma proteína de 518

aminoácidos cada um. A AlpA carreia uma seqüência sinal para uma lipoproteína

funcional. Já AlpB apresenta uma sequência sinal do tipo padrão N-terminal e mostra uma

grande homologia da sequência de amino-ácido com AlpA. Ambos os genes são

organizados em um operon, mas nenhuma sequência promotora consensual, no síto inicial

da transcrição, foi descrita até o momento para estes genes. A porção C-terminal de ambas

as proteínas formam uma proteína externa da membrana do tipo tubo-beta porina,

consistindo de 14 lâminas-beta transmembrana anfipática (Odenbreit et al., 1999).

Odenbreit et al., (2002) observaram, através de estudos in vitro, que o operon Alp

(que consiste em AlpA e AlpB) está envolvido na adesão da Helicobacter pylori à células

epiteliais gástricas, eles demonstram que o OMPs Alp contribui significativamente para o

sucesso da infecção pela H. pylori em cobaias.

A diminuição acentuada na eficiência de colonização através de AlpA e mutantes

AlpB foi atribuída a uma deficiência dos mutantes em se aderir às células epiteliais

gástricas in vivo (Jonge et al., 2004). Como consequência da inativação da codificação dos

genes destas duas proteínas de membrana externa, a H. pylori pode provavelmente ser

removida com facilidade do estômago, portanto não sendo capaz de persistir na superfície

epitelial e causar inflamação da mucosa gástrica.

A transcrição do gene alpA in vivo em tecido gástrico humano, bem como em

tecido gástrico de murino, está presente nos primeiros 3 meses de infecção (Rokbi et al.,

2001). A transcrição de alpA é dez vezes superior 1 h pós-infecção quando comparda a

transcrição da urease e do 16S rRNA, indicando que essas proteínas desempenham um

papel ativo no estabelecimento e manutenção inicial da colonização gástrica (Rokbi et al.,

2001.).

36

1.3. RESPOSTA IMUNOLÓGICA À Helicobacter pylori

A Helicobacter pylori induz tanto a resposta imunológica humoral quanto a

celular. Uma resposta por anticorpo produzido no local e ao nível sistêmico tem sido

demonstrada e incluem isotipos IgA, IgM e IgG (Crabtre et al., 1991, Rathbon et al., 1986;

Wyatt et al., 1986). Estudos iniciais com modelos de ratos demonstraram que a imunização

com antígenos da bactéria H. pylori podem induzir uma resposta protetora (Marchetti et

al., 1995).

Embora proteínas da H. pylori tenham sido demonstradas na lâmina própria do

estômago (Mai et al., 1992), H. pylori é geralmente considerada como um patógeno não

invasivo, se localizando primeiramente na lâmina do muco extracelular. Contudo, tem sido

demonstrado a habilidade da H. pylori invadir as células epiteliais gástricas tanto in vitro

(Amieva et al., 2002) quanto in vivo usando estômago humano e de macaco (Semino-Mora

et al., 2003), assim como em ratos com gastrite atrófica (Oh et al., 2005).

Já foi demosntrado a ligação da H. pylori em eritrócito de microvasos da lâmina

própria (Aspholm et al., 2006). A técnica de imagem de microscopia eletrônica de

transmissão e a detecção de imunoouro foram usadas para demonstrar que células de H.

pylori estão em contato direto com células imunológicas da lâmina própria na maioria de

pacientes com gastrites e câncer gástrico (Moes et al., 2007).

1.3.1. Macrófagos sinalizadores de linfócitos T na infecção pela H. pylori

Macrófagos são essenciais na resposta imune inata contra a H. pylori e para a

sinalização das células epiteliais gástricas, que estão em contato direto com a bactéria na

superfície da mucosa. Os macrófagos e monócitos são importantes coordenadores da

resposta imunológica desencadeada ao patógeno, e no caso da H. pylori, eles são prováveis

ativadores, junto com células dendríticas (DCs), da imunidade adaptativa pela produção de

fatores, como a IL-12, que estimula células Th1, resultando na produção de citocinas como

IFN-γ (Haerbelet al., 1997, Meyer et al., 2003, Meyer et al., 2000).

A proteína ativadora de neutrófilo (NAP) do Helicobacter pylori contribui para a

polarização da resposta Th1 estimulando a secreção e ambas as citocinas IL-12 IL-23 de

neutrófilos e monócitos (Amedei et al., 2006). A produção de IL-12 na mucosa gástrica

37

está ligada ao desenvolvimento de úlcera péptica na infecção por cepas de H. pylori cagA-

positivo, mas provavelmente devido a estimulação da resposta Th1 (Hida et al., 1999).

Macrófagos também estão envolvidos na amplificação da resposta inflamatória pela

produção das citocinas como IL-1, TNF-α e IL-6 (Gobertet al., 2003, Harris et al., 1998

Mai et al., 1991). A ativação de IL-6 está associada com ativação de TLR4, MAP kinase e

com eventos de sinalização NF-κβ (Pathak et al., 2006).

1.3.2. Macrófago como célula efetora na infecção pela H. pylori

Os macrófagos constituem uma linha de defesa potente contra H. pylori embora

sua própria função efetora falhe no hospedeiro. Um padrão semelhante é a produção de

óxido nítrico (NO) derivado da enzima induzível oxido nítrico sintase (Nois), que é

regulada positivamente pela Helicobacter pylori em macrófagos in vitro (Bussieret al.,

2005; Gobert et al., 2001, Gobert et al., 2002, Wilson et al., 1996) e in vivo (Fu et al.,

1999, Mannick et al., 1996).

A enzima arginase da H. pylori, codificada pelo gene rocF, pode competir

suficientemente com macrófagos pelo substrato da NOSi (L-arginina), prejudicando a

produção de NO no hospedeiro, levando ao aumento da sobrevivência da bactéria por este

mecanismo (Gobert et al., 2001).

A resposta inflamatória do hospedeiro é aumentada pela ativação de macrófago,

mas a apoptose de macrófago pode ter consequências profundamente deletérias. A

liberação de citocinas de células apoptóticas pode ser importante, como originalmente

estabelecido na infecção por Shigella (Zychlinsky et al., 1994). E células apoptóticas

estimulam a infiltração neutrofílica para fagocitar restos celulares, levando a

potencialização da inflamação e aumento do estrese oxidativo pela liberação de oxiradical

pela ativação de neutrófilos. Também é importante o efeito em cascata que diminui a

defesa do hospedeiro com a depleção dessas células efetoras.

38

1.3.3. Células dendrítica

As células dendríticas penetram na monolâmina epitelial gástrica in vitro e na

barreira epitelial gastrointestinal in vivo e se ligam diretamente na H. pylori (Chieppa et

al., 2006, Niess et al., 2005, Rescigno et al., 2001).

A destruição do complexo apical juncional epitelial pela H. pylori (Amieva et al.,

2003; Fedwick et al., 2005) pode facilitar a interação luminal e subepitelial das células

dendríticas com a H. pylori. Após a ativação dos receptores do tipo Toll (TLR), as células

dendríticas, em geral ativam células T por diferentes vias, sendo capaz de induzir qualquer

um dos subtipos celulares Th1 ou Th2/ e célula T regulatória (Treg), que produz IL-10 ou

IL-10 (Banchereau et al., 2000).

Proteínas de membrana de H. pylori como Omp18 e HpaA têm sido descritas

como capazes de induzir a maturação da apresentação de antígenos de células dendríticas

(Voland et al., 2003). A ativação e maturação de células dendríticas derivadas de

monócitos do sangue humano ocorrem independentemente da presença da ilha cagPAI e de

genótipos vacA, e a ativação da produção de citocinas não requerem bactéria vivas

(Kranzer et al., 2005).

As células dendríticas podem fagocitar a H. pylori através da ligação de estruturas

carboidráticas glicoconjugadas da bactéria com molélulas do tipo monointegrina ICAM-

3grab-bing (DC-SIGN/CD209) e ativar receptores intracelulares (Hafsi et al., 2004,

Kranzer et al., 2005).

A identificação da DC-SIGN como novo receptor da Helicobacter pylori pode ser

importante para a compreensão da mudança da resposta por célula T em favor da infecção

persistente (Appelmelk et al., 2003). Especificamente, a expressão dos antígenos Lewis Y

e Lewis X pelo LPS da Helicobacter pylori que pode bloquear a resposta Th1 pela ligação

ao DC-SIGN na célula dendrítrica, representando uma forma de imunossupressão da

resposta Th1 (Appelmelk et al., 2003).

1.3.4. Evasão da fagocitose pelos macrófagos

Outro fator que pode contribuir para falha da resposta imune inata em eliminar a

H. pylori é que a bactéria pode se evadir da fagocitose pelos macrófagos (Allen et al.,

39

2000; Zhang e Jones, 2003). A H. pylori pode ser internalizada pelos macrófagos dentro do

fagossomo, este fagossoma se funde formando o megassomo contendo um grande número

de bactéria viva. Além disso, cepas de H. pylori que contém a ilha de patogenicidade

cagPAI e produzem a proteína VacA funcional, evitam a fusão do fagossomo como os

lisossomos evitando a morte bacteriana. A destruição da maturação do fagossomo é

perdida quando as células são expostas a uma cepa isogênica mutante para vacA (Zheng e

Jones, 2003).

1.3.5. Resposta imunológica mediada por linfócitos T

Os primeiros estudos estabeleceram os conceitos que os linfócitos gástricos de

pacientes infectados por H. pylori têm maior número de linfócitos T produtores de IFN-γ,

consistente com uma resposta de citocinas do tipo Th1 (Bamford et al., 1998; Karttunen et

al., 1995), e que clones de linfócitos T H. pylori específicos, derivado de mucosa gástrica,

exibem um perfil de resposta do tipo Th1 em pacientes com doença de úlcera péptica

(D’Elios et al., 2007). Os linfócitos T da mucosa gátrica na infecção pela H. pylori

produzem níveis elevados das citocinas do tipo Th1 (IFN-γ e IL-2) e baixos níveis de

citocinas Th2 (IL-4 e IL-5) (Bamford et al., 1998; Karttunen et al., 1995). A produção de

IL-12 a partir de monócitos, macrófagos, ou DCs é importante na indução de respostas de

linfócitos Th1 (Guiney et al., 2003; Haeberlet al., 1997, Hafsi et al., 2004; Kranzer et al.,

2005; Meyer et al., 2003, Meyer et al., 2000), bem como o papel das células epiteliais

gástricas como células apresentadoras de antígenos na activação de células Th CD4+

também tem sido demonstrada (Yet al., 1997).

A IL-17 tem sido associada como uma quimiocina mediadora de infiltração de

neutrófilos (Fossiez et al., 1996), e os níveis de IL-17 são aumentados em humanos

infectados (Luzza et al., 2000). Imunização de ratos com lisado de H. pylori aumenta a

expressão de IL-17 na mucosa gástrica e nos linfócitos T CD4+, isoladas a partir de baços e

cocultivada com macrófagos ou células dendrítica estimuladas com fragmentos de H.

pylori; estes resultados foram associados com a inflamação gástrica aumentada e

colonização diminuída (DeLyria et al., 2009). Estes dados sugerem que uma resposta IL-

17/Th17 defeituosa contribui para persistência crônica da bactéria. Outro mecanismo da

disfunção imune foi demonstrada por estudos prévios em que a proteína VacA pode exercer

40

efeitos imunossupressores de linfócito T, por ligação à subunidade do receptor de integrina

β2 (CD18) e utilizando receptores de integrina para causar vacuolização celular (Sewald et

al., 2008).

Investigações adicionais indicam que linfócitos T reguladores (Tregs) atuam na

patogênese da infecção por H. pylori. Linfócitos T de memória circulantes de humanos

infectados pela H. pylori têm menor proliferação e produção de IFN-γ em resposta a

células dendrítica estimuladas com fragmentos de H. pylori do que os linfócitos T virgem

de doadores, este defeito pode ser anulado por depleção de linfócitos T reguladores

CD4+/CD25

high, indicando que linfócitos T reguladores H. pylori específicos suprimem

respostas de linfócitos T de memória e contribuem para a persistência da infecção

(Lundgren et al., 2003).

Ativação de linfócitos T por antígenos específicos envolve a expressão de

moléculas co-estimulatórias, e CTLA-4 inibe este processo. No caso da infecção pela H.

pylori, a inativação funcional de linfócitos T CD4+ recrutadas para a mucosa gástrica pode

estar relacionada com expressão de CTLA-4 na superfície dos linfócitos T e prevenção de

co-estimulação quando APCs envolvem receptores de linfócitos T (Anderson et al., 2006).

O bloqueio do CTLA-4 resulta no aumento da ativação de células T in vitro e em

diminuição da colonização da H. pylori em camundongos, sugerindo que há uma indução

de anergia dos linfócitos T CD4+ gástricas (Anderson et al., 2006). A H. pylori pode inibir

a proliferação de linfócitos (Gebert et al., 2003; Meyer et al., 2000), um efeito atribuído a

uma regulação negativa da proteína VacA da H. pylori sobre a ativação e a translocação

nuclear do fator de transcrição nuclear das linfócitos T ativadas (NFAT) (Boncristiano et

al., 2003, Gebert et al., 2003). VacA também ativa a sinalização MAP quinase que resulta

em ativação do Rac GTPase, levando à ruptura do citoesqueleto (Boncristiano et al., 2003).

De um modo geral, existem inúmeros recursos da função de linfócitos T que são

alterados de forma deletéria na infecção pela H. pylori. Mas, a compreensão do papel das

linfócitos Th17 e Tregs pode levar a novas estratégias terapêuticas para reduzir a

inflamação crônica e o risco de câncer.

41

1.3.6. Os linfócitos B

Existem muitos dados indicando que os linfócitos B também contribuem para a

patogênese da H. pylori. Em camundongos deficientes de linfócitos B (μMT) infectados

com H. pylori, uma redução de 2 log na colonização do H. pylori foi associada com a

inflamação gástrica e aumentada e infiltração de linfócitos T CD4+ (Akhiani et al., 2004).

Enquanto que as respostas por IgG e IgA presentes no soro e na mucosa gástrica,

respectivamente, contra a H. pylori podem estar envolvidos na imunidade protetora

(Akhiani et al., 2005).

Estudos sugerem que as respostas dos linfócitos B mediadas por anticorpos

podem ser contraproducente. O foco principal de investigação tem sido relacionado com o

desenvolvimento de linfoma de MALT gástrico, que surge a partir de linfócitos B ativados.

Esplenócitos de rato sem tratamentos prévios expostos a H. pylori são protegidos contra a

apoptose espontânea e exibem proliferação em resposta a pequena, mas não elevadas,

multiplicidades de infecção, e as células que respondem são derivadas de populações de

linfócitos B (Bussieret al., 2006). Além disso, a infecção crônica por H. pylori protege as

linfócitos B esplênicos da apoptose, indicando uma ativação de linfócitos B com fenótipo

de sobrevivência que pode ter implicações para linfoma MALT (Bussieret al., 2006).

Além de produzir anticorpos antigênos-específicos, também tem sido mostrado

que os linfócitos B produzem anticorpos auto-reativos que podem ser patogênico

(Yamanishi et al., 2006).

1.4. ASSOCIAÇÃO DA INFECÇÃO POR H. pylori E AS DOENÇAS GÁSTRICAS

A infecção pela Helicobacter pylori afeta cerca de 40% a 50% da população

mundial, sua redescoberta em 1983 foi de grande importância para o estudo da

etiopatogenia de algumas doenças, principalmente do aparelho digestivo. Este patógeno é o

principal agente etiológico da grande maioria das gastrites, úlceras gástricas e duodenais,

câncer gástrico e linfoma de MALT (Figura 9) (Parsonnet, 1995; Eck et al., 1997, Kuipers,

1999) e atualmente muitas doenças não gástricas estão relacionadas a esta infecção (Park et

al., 2011; Suzuki et al., 2011).

42

Figura 8. Espectro de doenças gástricas associadas com a infecção pela Helicobacter

pylori. (Traduzido Sachs & Scott, 2012).

Nos últimos anos, tornou-se cada vez mais claro que a Helicobacter pylori na

população humana é muito diversa, e esta diversidade é extremamente importante para o

resultado clínico da infecção. A heterogeneidade da H. pylori pode ser analisada em dois

níveis diferentes: em primeiro lugar, a variação genotípica entre as cepas, e em segundo

lugar, as variações dentro das populações (Blaser, 2012).

Embora, a maioria das pessoas seja infectada, somente 20% evolui para uma

doença gastroduodenal mais grave (Suerbaum e Michetti, 2002, Oliveira, 2003), isto se

deve as interações dos múltiplos fatores relacionados, entre eles: o perfil genético do

hospedeiro; o padrão de cepas virulentas presentes no estômago; fatores ambientais

relativos ao estilo de vida do indivíduo, como o tipo de dieta, com consumo excessivo de

alimentos salgados, defumados, condimentados e apimentados, mas com baixo teor de

fibras e nutrientes antioxidantes; a ingestão frequente de álcool e o hábito de fumar, todos

43

estes fatores podem levar a quebra do equilíbrio da mucosa gástrica e causar inflamação

gástrica exacerbada resultando em dano tecidual e, consequentemente, doenças gástricas

severas (Blaser, 1990; Dunn et al, 1997; Ladeira et al, 2004; Suerbaun & Michetti, 2002).

É consenso que a Helicobacter pylori ao colonizar o epitélio gástrico induz uma

resposta inflamatória na mucosa subjacente (Vaira et al., 2002). Na fase aguda da infecção

é possível observar um infiltrado de leucócitos com predomínio de neutrófilos na mucosa

gástrica, cuja presença denota atividades do processo inflamatório, que pode ser de leve a

grave intensidade, e que poderá evoluir para inflamação crônica, estas evidências foram

observadas em várias investigações (Ermst et al.;1997, Aguiar et al.; 2002 ; Martins et al.;

2006). A melhor evidência de que a infecção por esta bactéria está associada ao

desenvolvimento da gastrite crônica foi demonstrada por Marshall et al., (1984) através

experimento de autoinfecção.

A distribuição do quadro inflamatório no estômago está diretamente associado ao

desenvolvimento das diferentes patologias gástricas, pois a inflamação altera a função de

diversas células gástricas, tal como células D, células G e parietais com conseqüente

modificação na secreção do ácido gástrico (Suerbaun & Michetti, 2002). Neste aspecto, a

infecção pela H. pylori estimula as células G a produzirem gastrina elevando a produção de

ácido clorídrico. Uma maior quantidade de suco gástrico no estômago permite que este

ultrapasse o piloro e alcance o duodeno, causando agressão ao tecido intestinal e

modificação das células intestinais para metaplasia do tipo gástrico, permitindo a

colonização do duodeno pela H. pylori. Ambos, o grande fluxo de ácido para o duodeno e

a colonização deste tecido pelo H. pylori, levam ao desenvolvimento da úlcera duodenal

(Suerbaun & Michetti, 2002).

A associação entre a infecção pela H. pylori com o desenvolvimento da úlcera

péptica já está bem estabelecida (Gisbert et al., 2000). A bactéria está presente em 90% a

100% dos pacientes com úlcera duodenal e em 70% a 90% dos com úlcera gástrica

(Gisbert et al., 2000; Marshall, 1994; Martins et al., 2002).

No Estado do Pará, Martins et al., (2005) detectaram que 26,7% e 25,4% de

pacientes com úlcera gástrica e duodenal, respectivamente, estavam infectados com H.

pylori, sendo que entre os pacientes com úlcera gástrica 92% tinham a cepas de maior

virulência (s1/m1/CagA+), enquando que pacientes com úlcera duodenal, 86% também

estavam infectados pelo mesmo perfil de cepa da H. pylori.

44

Por outro lado, a colonização da H. pylori na região do corpo gástrico induz a

gastrite que resulta na diminuição da produção de ácido clorídrico, devido à inibição das

células enterocromafínicas, produtoras de histamina e das células parientais, levando à

gastrite atrófica.

Vários estudos demonstraram que pacientes com gastrite crônica atrófica estavam

infectados por H. pylori (Ozasa et al., 1999, Carter et al., 1999; Klinkenberg-Knol et al.,

2000; Lundell et al., 2006).

Gastrite crônica atrófica é uma condição inflamatória caracterizada pela perda das

estruturas glandulares gástricas, que são substituídas por tecido conjuntivo (atrofia não-

metaplásica) ou por estruturas glandulares inadequadas para a localização (atrofia

metaplásica) (Rugget al., 2002). A gastrite crônica atrófica está associada a dois diferentes

tipos de tumores: tumor gástrico do tipo intestinal e o tipo difuso (Vannella et al., 2012).

Nesta dinâmica da evolução das doenças gástricas a infecção pela H. pylori pode

estimular a carcinogênese gástrica, cujos mecanismos patogênicos não estão plenamente

esclarecidos. Mas, admite-se que um processo de múltiplos passos esteja envolvido, que se

iniciam a partir da infecção pela Helicobacter pylori, que induz inflamação crônica da

mucosa gástrica podendo evoluir para diferentes espectros clínicos como a gastrite crônica

atrófica, metaplasia intestinal, displasia e, finalmente, o carcinoma gástrico (Correa, 2012).

Essa bactéria altera as condições físicas e químicas do muco gástrico, o que pode

tornar a mucosa do estômago menos resistente aos carcinógenos ambientais e dietéticos. A

infecção também diminui a secreção gástrica de ácido ascórbico, cujos níveis reduzidos

favorecem a formação de compostos N-nitroso que são carcinogênicos (Vermeer, 2002).

A presença de cepas triplo positivas (vacAs1i1mi1/cagA+/babA2) têm mostrado uma

correlação positiva com câncer gástrico (Mizusima et al., 2001; Zambon et al., 2003;

Rhead et al., 2007; Wen & Moss, 2009; Douraghi, et al., 2009).

Levantamentos epidemiológicos mostram que existe uma correlação entre países

com alta prevalência da infecção pela H. pylori, como na Bolívia, Peru, Cuba, México e

Brasil e a elevada prevalência de câncer gástrico (Santos, 2009). Mas, nem todos os

indivíduos com câncer gástrico estão infectados pela H. pylori e nem todas as pessoas

infectadas desenvolvem câncer gástrico. Portanto, a etiologia do carcinoma gástrico

certamente é multifatorial e a infecção pela H. pylori é apenas um dos vários fatores que

contribuem para o seu desenvolvimento.

45

A H. pylori também tem sido associada ao linfoma gástrico. Embora o estômago

normal não tenha tecido linfóide, esses elementos desenvolvem-se em resposta à infecção

local pela H. pylori. Estudos epidemiológicos mostram que nas regiões com elevada

prevalência do linfoma gástrico, existem índices mais altos de infecção pela H. pylori do

que nas regiões com prevalência baixa de linfoma (Marshall, 1994), Outras investigações

demosntraram que 75% dos casos de linfoma de MALT regridem após a erradicação da

bactéria (Nakamura et al., 1997; Parsonnet & Isaacson 2004).

1.5. ANTÍGENOS DE GRUPOS SANGUÍNEOS ABH e LEWIS E A INFECÇÃO PELA

H. pylori

Estruturas carboidráticas expressa na superfície das células por glicoproteínas,

glicolípidos, e proteoglicanos têm sido implicadas em uma ampla variedade de processos

biológicos, tais como inflamação, sistema de interação patógeno-hospedeiro e metástase

tumoral (Varki, 1993; Hollingsworth e Swanson, 2004). Nesta perspectiva, estudos de

associação entre os grupos sanguíneos ABO e Lewis e algumas doenças infecciosas e não

infecciosas têm sido descritos (Mourant et al., 1978; Jaft & O’Brian, 1987).

Antes da H. pylori ser identificada como principal agente etiológico de úlceras

pépticas, gastrite crônica, e uma variedade de sintomas gastrointestinais (Marshall, 1986;

Tytgat et al., 1990; Rosenstock et al., 1997) muitos estudos epidemiológicos descreveram

que indivíduos não secretores de antígenos de grupos sanguíneos ABO e indivíduos do

grupo sanguíneo O eram mais frequentes entre os pacientes com úlceras pépticas (Aird et

al., 1953; Clark, et al., 1956; Borén et al., 1993). A partir desta premissa, muitos autores

relatam uma associação entre o grupo sanguíneo O e infecção por H. pylori (Kanbay et al.,

2005; Alkout et al., 2007; Lin et al., 1998; Henriksson et al., 1993; Hein et al., 1997),

enquanto outros não encontraram tal associatiação (Niv et al., 1996; Dickey et al., 1993,

Loffeld et al., 1991).

Nakao et al., (2011) observaram uma associação significativa entre os genotipos

do locus ABO e pacientes com câncer gástrico, gastrite atrófica e a infecção pela H. pylori.

Contrariante, outros autores como Petrović et al., (2011) e Rasmi et al., (2011), não

demosntraram uma associação dos fenótipos de grupo sanguíneo ABO e a infecção pelo H.

pylori.

46

Por outro lado, estudos mostraram que a H. pylori se liga aos antígenos

carboidráticos H e Leb presentes na mucosa gástrica, cuja aderência é mediada pela adesina

ligantes de grupos sanguineos, BabA, presente na membrana externa da bactéria

(Aspholm-Hurtig et al., 2004; Ilver., et al., 1998). Esta adesina BabA é codificada pelo

gene babA2, um membro de uma família altamente conservada, cepa-específica. BabA.

Assim o sucesso da colonização pela H. pylori depende desta proteína da presença dos

antígenos Leb e H tipo I, expressadas na mucina gástrica (Ilver et al., 1998), estes

antígenos também se expressam nos fluidos e tecidos corporais, tais como endotélio e na

mucosa gastro-intestinal.

A biossíntese dos antígenos ABH e Lewis em glicoproteína e glicolipídio,

expressados pelas células epiteliais gástricas, é controlada e regulada por várias

glicosiltranferases. Estas enzimas transferem unidades de açúcar para um aceptor, que

pode ser um oligossacarídeo alongado em um lipídio ou proteína, incluindo a N-

acetilgalactosaminiltransferases, galactosiltransferase, fucosiltransferase, e

sialiltranferases, cada uma destas transferases apresenta um doador e um aceptor substrato

específico (Paulson & Colley, 1989).

Durante a síntese ocorre a adição seqüencial de monossacarídeos em uma variedade

de diferentes tipos de estruturas precursoras glicoprotéicas e glicolipídicas, formando

estruturas de maior complexidade e diversidade antigênica (Watkins, 1966, 1980; Morgan

& Watkins 1969).

As enzimas A e B requerem a α12 fucose da estrutura H como um substrato para

adicionar o correspondente resíduo terminal GalNAc ou Gal. Logo, os antígenos A e B

podem ser formados apenas a partir do precursor H. Por sua vez, a síntese de estruturas H

está sob o controle de pelo menos 2 sistemas genéticos polimórficos H-h e Se-se (Oriol et

al., 1981), sendo que os genes Se e H codificam distintas α-2-fucosiltransferases

(Betteridge & Watkins, 1986), que trabalham preferencialmente em diferentes cadeias

precursoras tipo 1 e tipo 2 respectivamente (Figura 10).

A H. pylori apresenta-se como um fator de risco para as diversas patologias

gástricas (Parsonneti et al., 1991), devido principalmente aos seus diversos mecanismos de

virulência como, por exemplo, a adesina BabA2, que liga-se a antígenos de grupo

sanguíneo H/Leb expressos na mucosa gástrica do hospedeiro. Entretanto, existem varias

mutações de ponto que alteram o estado funcional da enzima sintetizada pelo gene FUT3

47

(Lewis) como as SNPs (polimorfismo de base única) G508A e a T1067A que provocam

inativação enzimática ou a mutação T59G que reduz a sua atividade (Corvelo et al., 2012).

Dados analisados simultaneamente em diferentes populações parecem ser

sugestivos de que a mutação T59G poderia estar contribuindo para a discrepância do

fenótipo Lewis no eritrócito e na saliva, enquanto que o fenótipo Lewis negativo resulta da

ausência de atividade da enzima FUTIII (Mollicone et al., 1994). Por outro lado, a infecção

pela H.pylori poderia acentuar ainda mais esta discrepância, pois ao colonizar o epitélio

gástrico a bactéria induz alterações morfológicas da mucosa que leva a alteração nos seus

padrões de glicosilações.

Figura 9. Representação esquemática das estruturas terminais dos epitopos ABH e Lewis

em estruturas o-glicanos. Tipo 1 cadeias são caracterizadas pela ligação Galβ1, 3GlcNAc

(representada em preto), enquanto tipo 2 cadeias exibe uma ligação Galβ1, 4GlcNAc

(representada entre parênteses e em vermelho). (Magalhães & Reis, 2010).

48

A base da distribuição histológica destes antígenos (Oriol et al., 1986) é que o

gene H/h normalmente tem expressão em tecidos de origem ectodermal, enquanto que o

gene Se/se se expressa em tecidos de origem endodermal, sendo o gene Se um ancestral do

gene H, esses loci compartilham um elevado grau de similaridades em suas seqüências

(homologia de 67 a 76%) e estão localizados em uma região de 100 Kb (q13.3) do

cromossoma 19 (Larsen et al., 1990; Kelly et al., 1995; Rouquier et al., 1995), sugerindo

que eles evoluíram por duplicação gênica e subseqüente divergência ao longo da evolução

dos primatas (Le Pendu et al., 1985).

A enzima do gene H regula a expressão do antígeno H principalmente nas

hemácias, enquanto a enzima do gene secretor regula a expressão do antígeno H

principalmente nos epitélios e fluidos do corpo como a mucosa gástrica e saliva. Cerca de

20% dos indivíduos em várias populações do mundo apresentam o fenótipo não secretor,

isto é, eles não expressam o antígeno H nas secreções por causa da homozigozidade para

alelos não funcionais (se) da enzima FUT II (Enzima Se). Os secretores têm pelo menos

um alelo Se funcional. Os alelos não funcionais da enzima FUT II mostram uma elevada

especificidade étnica (Kelly et al., 1995, Koda et al., 1996; Liu et al., 1998; Liu et al.,

1999).

O alelo nulo da FUT2 mais comum entre os orientais asiáticos é se385

com uma

substituição nucleotídica de A>T, enquanto o alelo não funcional se428

, com uma mutação

sem sentido G>A tem uma elevada freqüência na África e Europa (Koda et al., 2000).

Quando comparados, o alelo se428

tem sete nucleotídeos diferentes em relação ao

alelo de referência (Se), que foi primeiramente clonado por Kelly et al., (1995), sendo 5

substituições na região codificadora de 984 pares de bases e duas na região de 30 pb na

porção não traduzida do exon 2 da proteína. Por outro lado, somente duas modificações

nucleotídicas foram observadas em relação ao alelo se385

, estabelecendo a possibilidade de

que a origem do alelo se428

possa ser muito antiga.

Adicionalmente, outros alelos não funcionais já foram descritos, como os alelos

se302

e se357

nos indivíduos do sul da Ásia e Corea, enquanto o alelo se571

foi identificado

nos habitantes das ilhas do pacífico com elevada prevalência (Park et al., 2005; Koda et

al., 2003).

Por outro lado, os antígenos Lewis estão bioquimicamente relacionados aos

antígenos ABH, pois eles também são produzidos a partir das mesmas substâncias

precursoras (Watkins, 1966, 1980; Morgan & Watkins 1969). O gene Lewis codifica para

49

uma α1-3/4 fucosiltransferases encontradas em tecidos epiteliais e secreções exócrinas de

origem ecto e endodermal (Johnson et al., 1981,

Prieels et al., 1981). Le

a e Le

b são os

principais antígenos do sistema Lewis, indivíduos possuindo o gene Le sintetizam a

substâncias Lea e a associação de especificidade com determinante antigênico Le

d (Tipo H-

1) em pessoas com gene Se, determina o tipo de antígeno Leb, produto desta interação

epistática entre os loci Secretor e Lewis.

A diversidade antigênica é determinada pela interação dos produtos de vários Loci

polimórficos ABO, Hh, Sese, Lele. Entre os caucasídes se observa as seguintes

combinações fenotípicas (Oriol et al., 1986):

1) Lewis positivo e secretor de ABH, 70% da população expressam antígenos

ABH, Leb e Le

a na saliva.

2) Lewis positivo e não secretor de ABH, apenas o antígeno Lea encontra-se

presente na saliva de 20% da população.

3) Lewis negativo e secretor de ABH representam 9% da população com

somente os antígenos ABH na saliva, sem antígeno Lea e Le

b.

4) 4) Lewis negativo e não secretor de ABH, constitui ausência de antígenos

ABH, Lea e Le

b na saliva representando 1% da população.

No mesmo indivíduo, vários tecidos expressam estes antígenos de maneiras

diferentes, reguladas em função da origem e maturidade celular de cada tecido, com

possíveis implicações durante a diferenciação celular e transformações oncogênicas (Le

Pendu, 1989; Szulman et al., 1980). Tem sido relatado (rntoft et al., 1991) inclusive,

10% de atividade da α1-4-fucosiltransferase em tecidos epiteliais de indivíduos com

fenótipo Lewis negativo tanto no eritrocitário quanto na saliva, sugerindo que o sistema

Lewis é muito mais complexo do que se pensava originalmente (Henry et al., 1993).

Dados de biologia molecular e bioquímico demonstraram que indivíduos

homozigotos para alelo não funcional do gene Lewis, são normalmente associados com os

polimorfismos T202C, C445T, G484A, G667A, G808A, G508A e T1067A, e não

expressam antígenos Lewis nos tecidos (Emlgreen, et al., 1993; Nishihara, et al., 1994;

Kudo, et al., 1996; Nishihara, et al., 1993; Mollicone, et al., 1994; Pang, et al., 1998;

Francez, et al., 2007; Pang, et al., 1998). E um polimorfismo em particular, a mutação

T59G, que determina uma substituição de um aminoácido na região transmembrana,

parece ter um efeito na regulação da expressão diferencial da fucosiltransferases entre os

tecidos (Nishihara et al., 1999).

50

Outro fator que pode afetar a colonização gástrica pela H. pylori é a presença dos

alelos não funcionais do gene Se (se/se), pois indivíduos secretores expressam a enzima

alfa-1,2-fucosiltransferases, atuando na síntese da especificidade antigênica H tipo I, que

se distribui nos epitélios e muco gastrointestinal (Nishihara, et al., 1999). Por outro lado,

este antígeno através da enzima Lewis (Fuc-III), sofre uma difucosilação transformando-

se na especificidade Leb.(Nishihara, et al., 1993; Kudo et al., 1996; Koda et al., 2001;

Narimatsu, et al., 1998). Em contraste, indivíduos com alelo não secretores, com ausência

da enzima Se, expressam apenas o antígeno Lea, sintetizado a partir do precursor de cadeia

tipo I pela ação da mesma enzima Lewis. Assim, Indivíduos nulos para o gene Se

comprometem a interação epistática entre os Loci Lewis e Secretor, que resultaria na

ausência de especificidades antigênica Leb.

Análises anteriores demonstraram que a quantidade de antígeno Leb é afetada pelo

número de alelo Se (Narimatsu et al., 1998).

Deste modo, polimorfismos nos genes Le e Se podem alterar o risco de doenças

gástricas severas induzidas pela H. pylori, como já descrito por Ikehara et al., que

evidenciaram uma taxa menor de infecção em indivíduos com maior número de alelos não

funcional se, de acordo com o estudo, indivíduos se/se são incapazes de expressar

antígenos Leb nas células foveolares gástricas, e esta ausência de expressão do antígeno

Leb inviabilizaria a ligação da Helicobacter na mucosa gástrica via BabA (Ikehara et al.,

2001).

Assim, a presença destas mutações poderia alterar a expressão dos antígenos Leb

na superfície do epitélio gástrico, desfavorecendo a colonização por esta via (Leb-BabA),

mas ainda sim este patógeno colonizaria o estômago via glicoconjugados sializados (sialil-

Lex) expressados durante a inflamação crônica e a adesina ligante de acido siálico (SabA)

(Mahdavi et al., 2002).

A expressão do antígeno sialil-Lex no epitélio gástrico é induzida durante a

infecção pelo H. pylori (Figura 11), sugerindo que esta bactéria pode modular o tecido do

hospedeiro a re-adaptar os padrões de glicosilação da mucosa gástrica para expressar os

receptores da adesina bacteriana (Mahdavi et al., 2002).

51

Figura 10. Alteração do padrão de glicosilação da mucosa gástrica frente à infecção pela

Helicobacter pylori. (Adaptado de Madavi et al., 2002)

O antígeno sialil-Lewisx

(SLeX) carbohidrato tetrasacarídeo que usualmente está

ligado a estrutura O-glicano na surperfície das células. Atua no mecanismo de

reconhecimento célula-célula. Sialil LewisX é um dos mais importantes antígenos de grupo

sanguíneo é exibido na porção terminal dos glicolipídeos que estão presente na superfície

das células. O determinante sialil LewisX (sLe

x), é um ligante de E-selectina, é

constitutivamente expressado nos granulócitos e monócitos e média o extravasamento

destas células na inflamação (Kukowska-Latallo et al., 1990; Berg et al., 1991; Takada et

al., 1991).

Linfócitos T e B em repouso não expressam sialyl-LewisX, mas após a ativação

estas células passam a expressar fortemente este antígeno (Azuma et al., 2007).

A regulação da sua expressão inicia a partir de glicanos com sequência, N-

acetylactosamina, envolvendo dois passos enzimáticos, sendo o primeiro deles a α-(2,3)-

sialilação da galactose terminal (Bertozzi, 1995). Até o momento quatro α-(2,3)-

sialytransferases foram clonadas e duas delas estão envolvidas na síntese sLex (Maly et al.,

1996; Wen et al., 1992; Sasaki et al., 1993; Sasaki 1996). Após a N-acetylactosamina

tornar-se sializada uma α-(1,3) fucosiltransferase atua e transfere uma fucose da GDP-

fucose para GlcNAc. Cinco α-(1,3) fucosyltransferases humanas já foram clonadas e

caracterizadas detalhadamente. Elas parecem ser ligeiramente diferentes, mas apresentam

especificidades que se sobrepõem. Dentre estas enzimas quatro delas fucosilam

eficientemente aceptores sializados, enquanto Fuc-TIV prefere aceptores neutros

(Kukowska-Latallo et al., 1990; Goelz et al., 1990; Kumar et al., 1991; Lowet al., 1991;

52

Weston et al., 1992). A enzima Fuc-TIII tem duas diferentes atividades (α-(1,3) e α-(1,4)

fucosilação), levando a produção de sLex e sLe

a, respectivamente.

A síntese de sLex parece ser regulada por vários processos, se a N-

acetilactosamina é α-(2,6) sialilada então nenhuma outra α-(1,3) fucosilação ocorre

(Paulson et al., 1978). A N-acetilactosamine também pode ser α-(1,2) fucosilada na

galactose, levando a formação do H tipo I, que constitui a estrutura de grupo sanguíneo O.

Além disso, se a N-acetilactosamine é inicialmente α-(1,3) fucosilada na GlcNAc, então a

α-(2,3)sialytransferases é incapaz de formar estruturas sLex.

A expressão do determinante sLex é induzido preferencialmente por em células

ativadas via Th1, mas não nas células ativadas via Th2. A expressão de sLeX é induzido

durante a inflamação crônica da mucosa gástrica, sugerindo que a H pylori pode induzir

alterações no padrão de glicosilação das células epiteliais gástricas do hospedeiro para

aumentar a ligação e colonização (Mahdavi et al., 2002). In Vitro, a H. pylori induz a

expressão de antígenos sLeX via indução de genes que codificam β3GnT5 (Marcos et al.,

2008).

Nuno et al., mostram que indivíduos infectados com cepas cagPAI+ induzem uma

elevação na expressão da enzima β3GnT5, levando a síntese de cadeias carboidráticas tipo

II nos glicolipídios, isso leva ao aumento na expressão do antígeno sLex, receptor da

adesina SabA (Marcos et al., 2008) provavelmente, porque indivíduos mutantes para os

gene Le e Se produzem fucosiltransferases menos competitivas em relação as

sialiltransferases.

Deste modo, a base molecular para os sistemas de grupo sanguíneos ABH e Lewis

exerce uma função intrínseca na resistência a infecção pelo H. pylori, pois aparentemente

interagem na imunidade inata mucosal contra as doenças infecciosas.

Neste sentido, a expressão dos antígenos carboidráticos Lewis é biologicamente

importante, pois favorece as interações entre o hospedeiro e a bactéria, pois esta última

pode modular a expressão destes antígenos via modificação de sinalização intracelular

exercida pelos fatores de virulência injetados na célula. Por outro lado, essa modulação

também depende das diferentes mutações de ponto, como a T59G. Assim, estes

marcadores genéticos do hospedeiro podem ser responsáveis pelos diferentes níveis de

suscetibilidade de infecção pela H.pylori, então é bastante questionado o perfil dos grupos

sanguíneos Lewis na predisposição do hospedeiro.

53

Portanto a partir destas informações, a compreensão de como estes polimorfismos

genéticos, no gene Lewis, podem influenciar na suscetibilidade e/ou na severidade clínica

das patologias gástricas é importante, especialmente no Estado do Pará, que apresenta

taxas de infecção pela H.pylori elevadas nas diferentes doenças gástricas como as de 64%-

74% em casos de gastrite ativa, 82% em pacientes com úlcera gástrica e 90% em pacientes

com câncer gástrico, e apresenta uma das mais elevadas taxas de câncer gástricos do país.

54

1.6. OBJETIVOS

1.6.1. Objetivos geral

Associar os fatores de aderência BabA2 e SabA2 da H. pylori com os ligantes de

grupo sanguíneo ABH e Lewis, por análise modelucar e histopatológica, em pacientes com

gastrite crônica da população de Belém-Pa.

1.6.2. Objetivos específicos:

- Estimar a prevalência da infecção pelas cepas babA+ e sabA

+ do H. pylori entre

os indivíduos sintomáticos para patologias gástricas da população de Belém;

- Verificar a presença de cepas triplo positivas (cagA+/vacA

+/babA2

+) e associar

com a severidade das alterações histopatológicas.

- Estimar as freqüências dos fenótipos ABH e Lewis ao nível salivar e eritrocitário

no grupo de estudo;

- Determinar a distribuição genotípica das mutações T59G e G508A no gene

Lewis e do polimorfismo G428A no Secretor na amostra de pacientes.

- Relacionar os polimorfismos nos genes FUT II e FUT III com os padrões de

expressão immunohistoquímica dos antígenos ABH e Lewis na saliva, eritrócito e mucosa

gástrica frente à expressão dos genes babA2 e sabA da H. pylori detectadas nos pacientes

estudados .

55

2.0. MATERIAL E MÉTODOS

2.1. CASUÍSTICA

O presente estudo foi baseado num modelo observacional, transversal,

propspectivo e analítico. Foram incluídos na pesquisa 216 pacientes com idade superior a

18 anos com sintomas dispéptico, submetidos à endoscopia digestiva alta, atendidos na

seção de Endoscopia Digestiva do Hospital Universitário João de Barros Barretos

(HUJBB), localizado no município Belém, Estado do Pará, Brasil.

Previamente, os sujeitos pesquisados foram informados sobre a pesquisa de

maneira acessível. O estudo foi submetido ao julgamento e parecer de aprovação do

Comitê de Ética em Pesquisa da UFPA. Após o esclarecimento da importância deste

estudo, foi solicitada sua permissão, através da assinatura do Termo de Consentimento

Livre e Esclarecido, conforme rege a Resolução 196/96, do Conselho Nacional de Saúde,

sobre aspectos éticos envolvendo a pesquisa com seres humanos, autorizando suas

participações nesta pesquisa, possibilitando a coleta de material biológico. O estudo foi

protocolado sob o número 30/2009 no Comitê de Ética em Pesquisa do Núcleo de

Medicina Tropical da Universidade Federal do Pará.

2.2. AMOSTRAS E CRITÉRIOS DE INCLUSÃO E EXCLUSÃO

A população estudo constituiu pacienentes de ambos os sexos com idade superior a

18 anos e que consentiram participar do estudo. A coleta das amostras ocorreu no período

de abril de 2011 a março de 2012. Nesta amostragem foram excluídas as gestantes, os

indivíduos menores de 18 anos, os deficientes auditivos graves, os usuários de drogas

ilícitas, os etilistas crônicos, os que apresentaram desordens de comportamento que os

impossibilitassem de decidir por suas participações no estudo, os que tiveram realizado

tratamento regular específico para a infecção pela H. pylori nos últimos seis meses

precedentes à endoscopia, os que estiveram em uso de IBP, subcitrato de bismuto, citrato

de ranitidina bismuto ou antibióticos nos últimos 30 dias, os que tiveram história de

gastrectomia parcial ou total, os que apresentaram risco de sangramentos gastrointestinal,

56

verificado através da história clínica ou da presença de varizes no decorrer do

procedimento endoscópico, e os pacientes sabidamente infectados pelo vírus da

imunodeficiência humana (HIV).

2.3. COLETA E TRATAMENTO DAS AMOSTRAS

As amostras dos pacientes coletadas de forma pareadas incluindo sangue, saliva e

biópsia gástrica das áreas do antro e corpo gástrico para análise de grupo sanguíneo,

detecção de fatores de virulência da H. pylori e análise histopatológica.

2.3.1. Amostras de sangue

Foram coletados aproximadamente 3 ml de sangue de cada indivíduo e, estas

amostras foram acondicionadas em recipientes usando heparina como anticoagulante. O

sangue total foi centrifugado a 3.000 rpm durante 20 minutos, o plasma foi separado e

estocado à - 20º C. As hemácias foram testadas imediatamentes após a separação do

plasma, para as especificidades de grupos sanguíneos ABH e Lewis, o restante foi

glicerolizado e estocado a -20ºC.

2.3.2. Coleta de saliva

Aos indivíduos participantes deste estudo, foi dado um copo descartável para

depositar saliva. O material foi transferido para tubos de ensaio e mantidos sob

refrigeração, por um intervalo de até 2 horas, então as amostras foram fervidas em banho-

maria -por 10 minutos e centrifugadas para separar o sobrenadante e então congeladas -

20oC para posterior realização dos testes de Dot-ELISA para detecção das substâncias

ABH e Lewis.

57

2.3.3. Coleta de biopsia gástrica

Foram coletadas seis biópsias gástricas, sendo três biópsias do antro gástrico e três

do corpo. As biópsias foram usadas para extração de RNA bacteriano, para avaliação da

expressão dos genes babA e sabA da H. pylori; extração de DNA para a caracterização do

perfil de virulência através da análise dos genes cagA e vacA e detecção molecular dos

genes FUT2 e FUT3, e para analisar o ferfil imunohistoquímico dos antígenos de grupos

sanguíneos ABH e Lewis e os aspectos histopatológicos das doenças gástricas.

2.3.4. Análise histopalógica de biópsias das regiões de antro e corpo gástrico

Os fragmentos de mucosa gástrica obtidos por biopsia e acondicionados em

solução de formalina a 10 % foram utilizados para análise histopatológica. Cada fragmento

foi embebido em parafina e seccionado em dimensões de 4 µm. Posteriormente, foram

corados com hematoxilina e eosina. Um patologista experiente avaliou as amostras.

A gradução das gadtrites foi baseda nos critérios do Sistema de Sydney quanto à

densidade da H. pylori, ao infiltrado inflamatório, à atividade neutrofílica, ao folículo

linfoide, à metaplasia intestinal, à displasia e à atrofia glandular. Essas características

histopalógicas foram classificadas visualmente em analogia a uma escala graduada de zero

a três (normal, leve, moderado e acentuado, respectivamente), em conformidade ao

Sistema de Sydney.

A presença da H. pylori nos fragmentos de tecido gástrico seccionados foi

determinada pelo método de Gram modificado (Hucker, 1921), sendo que foram

consideradas suas características morfológicas, como a forma curva e espiralada, além da

coloração azul intensa para definição diagnóstica.

58

2.4. DETERMINAÇÃO DOS FENÓTIPOS E LEWIS E DO ESTADO SECRETOR DE

ABH

2.4.1. Determinação do fenótipo eritrocitário

Nos eritrócitos, os fenótipos ABO e Lewis foram tipificados pelos testes de

hemaglutinação direta. As hemácias foram lavadas com solução de NaCl a 0.09% e

resuspendidas nesta mesma solução a uma concetração de 3%. O teste de hemaglutinação

foi realizado misturando um volume de 25 µL da suspensão de hemácias com igual volume

de cada anticorpo com as respectivas especificidades a serem analisadas (anti-A, anti-B,

anti-H, anti-Lea e anti-Le

b).

2.4.2. Determinação do Estado Secretor de ABH na saliva

Na saliva, a caracterização destas referidas especificidades ABH e Lewis foi

realizada através da técnica dot-ELISA, modificada de Pflug et al., (1989). Assim, um

volume de 2 µL de cada amostra foi gotejado com uma micropipeta em 5 pedaços de uma

membrana de nitrocelulose, de dimensão aproximada de 4 x 7 cm, em seguida deixando

secar por 60 minutos a 37°C. As áreas livres da membrana de nitrocelulose foram

bloqueadas com um tampão bloqueador (0,01M Tris-HCI Salina, pH 7.4; 1% Triton X-

100; 3% BSA) por 45 minutos à temperatura ambiente e com agitação mecânica constante.

Em seguida, cada pedaço da membrana de nitrocelulose foi incuba do com solução

tampão contendo o anticorpo secundário (anti-IgM de rato) conjugado à enzima fosfatase

alcalina, diluído 1/1000, e o anticorpo monoclonal primário em diluição apropriada (anti-A

1/50; anti-B 1/100; anti-H 1/10; anti-Lea 1/1000 e anti-Le

b 1/2000), por 45 minutos à

temperatura ambiente. Após transcorrido o tempo de reação, os pedaços da membrana de

nitrocelulose foram lavados 6 vezes com o tampão de lavagem (0,01M Tris-HCI Salina pH

7.4; 0,05% Triton X-100) durante 5 minutos cada, excluindo Triton X-100 do tampão nas

duas últimas lavagens. A reação antígeno anticorpo foram reveladas usando um tampão

substrato [25 mL 0,25 M Glycina/NaOH pH 10.4; 500 µL 0,1 M MgCl2; 500 µL 0,1 M de

ZnCl2; 100 µL da solução do estoque (50 mg 5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate

59

dissolvido em 1mL dimethylformamide) a 37°C até a visualização de pontos azuis

brilhantes no local da reação; posteriormente as membranas foram lavadas em água

corrente e secas e analisadas.

2.4.3. Análise imunohistoquímica das biopsias gástricas

Os fragmentos de mucosa gástrica foram coletados através de endoscopia

digestiva alta e fixados em formalina tamponada a 10%, processados, incluídos em bloco

de parafinas, cortados de forma serial com espessura que variam de 4 a 5m e dispostos

em lâminas silanisadas para avaliação imunohistoquímica dos antígenos de grupos

sanguíneos ABO e Lewis. Posterior a desparafinização em xilol e hidratação em banhos de

concentrações decrescente em etanol, os cortes foram lavados em tampão PBS, por 3

vezes, e tratados com metanol/H2O2 para bloquear a peroxidase endógena, seguida de nova

lavagem com PBS. As seções de tecidos foram tratadas com solução de ácido cítrico 0,01

molar pH 6.0 aquecendo 3 vezes em forno microondas durante 7 minutos cada, para a

reativação antigênica. Então foram incubados em soro bloqueador (albumina bovina).

Seguiu-se a incubação com anticorpos monoclonais primários com diferentes

especificidades (Tabela 2) adquiridos comercialmente, durante 12 horas a 4 oC. Foram

usados anticorpos secundários anti-mouse (IgG/IgM) conjugada a peroxidase (diluição

1:100), ou imunoglobulina anti-mouse (IgG/IgM) de cabra biotinilada (1:200) e os

complexos de detecção avidina-biotina e biotina-avidina conjugado à peroxidase (1:100),

com os quais os cortes foram incubados durante 1 hora. A reação da peroxidase foi

realizada pela incubação dos cortes de tecido por 6 a 12 minutos com 5 mg de

diaminobenzidina tetrahydroclorido em 100 ml de tampão Tris (pH 7.6) e 100 l de

peróxido de hidrogênio (0,3%). Os cortes foram lavados em água destilada, coloridos com

hematoxilina e desidratados em etanol. As lâminas foram montadas com resina sintética e

lamínula.

60

2.4.3.1. Controles da reação imunohistoquímica

Negativo: Os anticorpos primário e secundário foram substituídos por tampão Tris/salina

na reação.

Positivo: Foram usados cortes histológicos de biópsia gástrica do arquivo de bloco do

Laboratório de Imunogenética, cuja caracterização imunohistoquímica já havia sido

realizada em outros estudos, sendo assim conhecido o padrão de expressão dos antígenos

ABH e Lewis.

Tabela 2. Anticorpos específicos para antígenos sistemas de grupo sanguíneo ABO e

Lewis.

Anticorpos Diluição

Anti-A 1:10

Anti-B 1:10

Anti-Ulex europaeus 1:100

Anti-Lea 1:100

Anti- Leb 1:100

2.4.3.2. Análise semi-quantitativa da reação de imunohistoquímica

As biópsias foram analisadas segundo associando dois critérios de avalião um que

consirerou o percentual de áreas da mucosa gastrica marcada como previamente descritos

Aguiar et al., (2002) multiplicando este percentual pela intensidade da reação antígeno

anticorpo que considerou os escores 1 para marcação fraca, 2 marcação moderada e 3

intensa, resultado assim num escore de marcação imunohistoquímica que variou de 0 a

300. Assim áreas de cada amostra de biopsia gástrica foram classificadas com cut-off, onde

escores abaixo de 30 foram considerados negativos, escores acima de 30 e até 270 foi

considerado heterogêneo e escore acima de 270 foi considerado como padrão homogêneo

de expressão.

2.5. PREPARAÇÃO DE DNA DE BIOPSIA GÁSTRICA.

O DNA da H. pylori e pacienete foi extraído de amostras de fragmentos de mucosa

gástricas da região do corpo e do antro, utilizando a técnica de Fenol-Clorofórmio

61

(Sambrook et al., 1989), realizada isoladamente para cada região de cada paciente. Os

fragmentos da mucosa gástrica de cada paciente foram colocados em microtubos com 300

µL de solução de lise de leucócitos contendo: 100 mM Tris-HCl, 20 mM EDTA, 200 mM

NaCl, 1 % de dodecil - sulfato de sódio, 0,2 % (mercaptoetanol) e 20 µl de proteinase K

(20 mg/mL) (Invitrogen, Brasil). Foi agitado no vortex e posteriormente incubado em

banho-maria a 58°C por toda a noite (12 horas). Após o tempo de incubação na proteinase

K, foi adicionar a cada microtubo 300 µL de tampão saturado de fenol e 300 µL de

clorofórmio, e agitado por 10 minutos em agitador gangorra e centrifugado por 4 minutos a

14000 rpm. Foi retirado o sobrenadante e transferido para um tubo limpo. Esse

procedimento foi repetido mais uma vez. Ao sobrenadante de cada microtubo foi

acrescentada uma solução contendo clorofórmio e isopropanol (diluição 24:1). Os mesmos

foram agitados por 10 minutos e centrifugados por 4 minutos a 14000 rpm. O sobrenadante

foi transferido para um tubo limpo. Um volume de 900 µL de álcool isopropílico foi

adicionado a cada microtubo e centrifugado por 6 minutos a 14000 rpm. Então, os tubos

foram lavados com 200 µL de Etanol a 70 %, e após evaporação do etanol, foram

utilizados 200 µL de água estéril para hidratar o DNA, após hidratação foram estocados em

temperatura de -20oC. O DNA isolado foi usado como modelo para a amplificação da

PCR.

2.6. DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DAS LINHAGENS TRIPLO POSITIVAS DA

H. pylori

Inicialmente, foi detectado o DNA da H. pylori através do uso dos iniciadores P1

e P2 (Tabela 3) os quais amplificam o fragmento de 298 pares de bases presente em todas

as cepas da H. pylori (Hammar et al., 1992). Apenas amostras positivas para P1 e P2 foram

submetidas à detecção de fatores de virulência da bactéria. Para a detecção de segmentos

específicos dos marcadores de virulência cagA, vacA, babA2 e SabA da H. pylori foram

utilizados os iniciadores específicos conforme Tabela 3.

As misturas para a reação da PCR tiveram um volume final de 25 µL contendo 5

pMol de cada iniciador, tampão de PCR 1X concentrado, 1,5 mM de MgCl2, 0,25 mMol de

cada base nitrogenada, 1,25 unidade de taq DNA polimerase com 3 uL de DNA e água

estéril. Estas misturas foram submetidas às seguintes condições de ciclagem: temperatura

62

inicial de desnaturação de 95° por 5 minutos, seguidas de 40 ciclos de 94° por 45

segundos, 58° por 45 segundos e 72° por 1 minuto, a temperatura final de extensão foi de

72° por 7 minutos. A PCR foi realizada em termocicladores Martercycler Personal e

Gradient (Eppendorf).

O produto desta amplificação foi monitorado em eletroforese em gel de agarose a

2% (Amresco), corado com brometo de etídio (10 µg/ml) por 30 minutos, visualizados em

um transiluminador de ultravioleta e registrados fotograficamente (Sistema de

Fotodocumentação de Géis com câmara escura central de comando com monitor LCD de

5", Biosystems, modelo 200240).

2.7. GENOTIPAGEM DOS GENE FUT2 e FUT3 PELA PCR

2.7.1. Gene FUT2

O gene FUT2 foi amplificado pela reação em cadeia da polimerase, os iniciadores usados

na técnica estão listados na tabela 3. Foram adicionados em um tubo 10 pmol de cada

iniciador (Se-F e SeR) a 5 µL de DNA genômico em um volume final de 25 µL contendo

0,2 mM de cada dNTP, 0,1 unidade de Taq polimerase, 0,5 µL de tampão de PCR 10x e 1

mM de MgCl2. Trinta ciclos foram produzidos (94°C/30s, 65°C/30s e 72°C/30s). Uma

Nested-PCR foi realizada para amplificação do alelo G428A usando 1 µL do produto da

primeira PCR como molde para o conjunto de iniciadores (428-F e 428-R). A mistura de

reação de PCR teve um volume final de 25 µL contendo 10 pMol de cada iniciador, 0,2

unidade de Taq polimerase, 0,1 mMol de dNTP, 2,5 µL de tampão de PCR 10X e 0,4 mM

de MgCl2. Esta Segunda PCR foi realizada em condições semelhantes a da primeira. O

produto da segunda PCR foi tratado com a enima de restrição XbaI , e na existência do

sítio de restrição o fragmento de 107 pares de base era clivado em dois fragmentos de 84 e

23 pares de bases respectivamente.

63

2.7.2. Gene FUT3

O gene FUT3 foi amplificado pela reação em cadeia da polimerase, os iniciadores

usados na técnica estão listados na tabela 3. Foi adicionado a um tubo de PCR 5 pmol de

cada iniciador (Sn1 e Sn2) a 5µL de DNA genômico em um volume final de 25 µL

contendo 0,2 mM de cada dNTP, 5 unidades de Taq polimerase, 0,25 µL de tampão de

PCR 10x e 0,25 mM de MgCl2. Trinta ciclos foram produzidos como a seguir 94°C/1min,

60°C/1 min e 72°C/1min.

A amplificação dos alelos T59G e G508A pela PCR foi realizada usando 1 µL do

produto da primeira PCR como molde e foram usados os oligodesoxinucleotídios descritos

na tabela 3 em um volume de reação contendo 25 pmol de cada iniciador, 1,25 mM de

desoxinucleotídio trifosfato, 0,5 unidades de polimerase Taq em 25 µl de tampão (50 mM

KCl; 10 mM Tris-HCl, pH 8,3; 2mM MgCl2). O controle negativo do PCR (amplificação

sem amostras de DNA) foi incluído em todos os experimentos. Para detectar a mutação

T59G, o fragmento gerado na segunda PCR foi digerido com a enzima de restrição MspI

originando dois fragmentos de 68 e 25 pares de bases. E a para detectar o polimorfismo

G508A o produto amplificado com os iniciadores sn8 e snp foi tratado com a emzima de

restrição PuvII, o produto da digestão origina dois fragmentos um 102 e outro de 104 pares

de bases. Os produtos do PCR foram analisados por eletroforese em gel de poliacrilamida a

7% usando como marcadores de peso molecular o de 50 pares de base.

2.8. EXTRAÇÃO DE RNA PARA ANÁLISE DE PCR EM TEMPO REAL

O RNA total foi extraído da biópsia gástrica usando RNeasy isolation kit

(QIAGEN) de acordo com a instrução do fabricante. Um total de 5,0 µg de RNA foi usado

para a transcrição reversa usando o Supercript III Rnase H reverse transcriptase kit

(Invitrogen) de acordo com instrução do fabricante.

64

2.8.1. Conersão de RNA em cDNA

O RNA total isolado da mucosa gástrica foi convertido em cDNA usando o kit

High capacity RNA-to-cDNA da Applied biosystems. Um volume de 20 µL de reação foi

formulado, contendo 10 µL de tampão RT 2x, 1 µL de mistura de enzima RT 20x, 7 µL de

amostra e 2 µL água ésteil. Foram usados os programas e as condição de ciclagem como

segue: 37º C durante 60 minutos, 95 º C durante 5 minutos e após a a reação foi refrigerada

até 4 º C e congeladas a -20º C.

2.9. DETECÇÃO DE EXPRESSÃO DOS GENES babA2 e sabA DA H. pylori PELA

PCR EM TEMPO REAL

As análises da expressão dos genes babA2 e babA da H. pylori em cada uma das

amost ras de biópsias clínicas, foi realizada através do PCR em tempo como descrito por

Wang et al., (2010). Foi usado um volume de 25 µL de reagente SIBRgreen (Appplied

Biosystems) e 0,6 µL de cada primer a 10 mM (Tabela 4) e 4 µL de cDNA diluído 1:40.

Cada amostra foi amplificada em duplicata No ABI Prism 7500 (Appplied Biosystems). A

expressão do gene 16S do RNAr também foi mensurada em duplicata como controle

endógeno da expressão bacteriana.

2.10.. ANÁLISE ESTATÍSTICA

Todas as informações foram incluídas um banco de dados no programa Microsoft

Office Excel 2007 e todos os testes foram realizados mediante o software estatístico

BioEstat, versão 5.0 (Ayres et al., 2007). Neste trabalho, foi admitido um nível de

significância de 5 %. Assim, utilizou-se o teste Qui-Quadrado ou o teste G para verficar as

associações entre a infecção pela H. pylori e as variáveis que descrevem o perfil

histopatológico, além do teste de Odds Rattio, e a distribuição dos grupos sabguíneos do

sitema ABO e Lewis em relação à infecção pela H. pyori. As proporções amostradas foram

avaliadas mediante a aplicação o teste Binomial. Também foi aplicado o teste Qui-

65

Quadrado de Matel-Haenszel para avaliar o método de detecção molecular da H. pylori nas

biópsias de antro e corpo gástrico

Para as correlações dos marcadores genéticos enre corpo e antro foram aplicados os

testes correlação Phi, a fim de avaliar a correlação entre os marcadores de virulência da H.

pylori e o de Sperman para correlacionar estes marcadores com os os achados

inflamatórios. O teste de correlação de Person foi também utilizado para avalaiar a

correlação entre as diferentes combinações gências da H. pylori investigadas nesta

pesquisa e o índice de lesão na mucosa gástrica.

E o teste-T para dados amostrais foi aplicado para avaliar a diferença das médias

dos escores da expressão imunohistoquímica dos antígenos ABH e Lewis frente aos

achados histopatológicos e dos marcadores de virulência da H. pylori. E também foi usado

na avaliação da expressão dos genes babA2 e sabA.

66

Tabela 3. Seqüências dos iniciadores para tipagem dos genes FUT2 e FUT3 por RFPL-PCR.

Gene Nome Fragmento

(pb)

Enzima Referência

FUTII

Se F

R

5’-CTC GAA TTC GGG CCT CCA TCT CCC AGC TAA C-3’ 1170 Kudo et al., 1996

5´-CTC AAG CTT GCT TCT CAT GCC CGG GCA CTC-3’

Se G428A F

R

5’-CGC TTC ACC GGC TAC CCC TGC TTC T-3’ 107 XbaI

5’-AAC TTC TGG GCC TCC TCC CGC A-3’

FUTIII

Le Sn1 5'-CTCGAATTCTAAGCAGGAGATTGTCATCACTGACC-3' 1615 Kudo et al., 1996

Sn2 5'-CTCAAGCTTCGTGCCGTGATGATCTCTCTGCAC-3'

Le T59C Sn3 5'-CCATGGCGCCGCTGTCTGGCCGCCC-3' 93 Vsp I

Sn4 5'-AGTGGCATCGTCTCGGGACACACG-3'

Le G508A Sn8 5'-ACTTGGAGCCACCCCCTAACTGCCA-3' 206 Pvu II

Sn9 5'-TGAGTCCGGCTTCCAGTTGGACACC-3'

66

67

Tabela 4. Seqüências dos iniciadores para tipagem da Helicobacter pylori

Oligos para PCR Tamanho

(PB)

Referência

Gene Oligo Sequência

Antígeno

especifico

P1 5’- TGGCGTGTCTCTATTGACAGCAGCGAGC-3’ 298 Hammar et al., 1992

P2 5’-CCTGCTGGGCATACTTCACCATG-3’

vacA s1/vacA

s2

VAI-F 5’ - ATGGAAATACAACAAACACAC - 3’. 259/286 Chattopadhyay et al.,

2004

VAI R 5’ - CTGCTTGAATGCGCCAAAC - 3’

vacA

m1/vacA m2

VAG-F 5’ - CAATCTGTCCAATCAAGCGAG - 3’ 567/642

VAG-R 5’ - GCGTCAAAATAATTCCAAGG – 3’

CagA CagA-2.SE 5’ - GAA ATT TGG GGA TCA GCG TTA CC - 3’ 180 Monstein, et al.; 2002

CagA-3.AS 5’ - TCC TGC AAA AGA TTG TTT GGC AGA - 3’

BabA2 BabA27F 5’ –CCAAACGAAACAAAAAGCGT-3’ 271 Sheu et al., 2003

BabA27R 5’- GCTTGTGTAAAAGCCGTCGT-3’

SabA sabAF 5’- AGCTATTGACCAGCTCAATG -3’ 480 Chiarini et al.,2009

sabAR 5’- TAGTTGGATTCGTTCTCATTA-3’

Oligos para PCR em Tempo Real

BabA2 babA-F 5’-TGCTCAGGGCAAGGGAATAA-3’ Wang et al., 2010

babA-R 5’-ATCGTGGTGGTTACGCTTTTG-3’

SabA sabA-F 5’-GGTGTGCTGCAACAGACTCAA-3’

sabA-R 5’-CATAAGCTGTTGCGCCAAATT-3’

16SrRNA 16SrRNA-F 5’- CCGCCTACGCGCTCTTTAC-3’

16SrRNA-R 5’-CTAACGAATAAGCACCGGCTAAC-3’

67

68

3.0. RESULTADOS

3.1. ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA

Dos 216 pacientes analisados 96,76% (209/216) foram diagnosticados com

gastrite crônica no antro e 91,16% (196/215) no corpo. A figura 11 demonstra a graduação

das gastrites diagnosticados no corpo e antro dos pacientes atendidos no HUJBB no

período de em 2011-2012. A Tabela 5 demonstra as graduações das lesões histopatológicas

como infiltrado neutrofílico, folículo linfóide, atrofia glandular, metaplasia intestinal e

displasia gástrica, e a comparação deles entre corpo e antro do estômago dos pacientes, de

um modo geral não foram verificadas diferenças significativas.

Figura 11. Distribuição das doenças gástricas diagnosticadas na amostra de pacientes

atendidos no HUJBB em 2011-2012.

05

1015202530354045505560657075

Antro -

ausente

Antro - leve Antro -

moderada

Antro -

acentuada

Pangastrite

4 12

2 1 1

46

10 7 1

9

39

9 1

6

12

55

Nú

mer

o d

e ca

sos

Corpo Acentuada

Corpo Moderada

Corpo leve

Corpo Ausente

69

Tabela 5. Lesões histopatológicas presentes no corpo e antro de pacientes com gastrite

crônica atendidos no hospital João de Barros Barreto.

Lesões histopatológicas Antro (n=216) Corpo (n=215) Teste p-valor

N (%) N (%)

Infiltrado Inflamatório

2

=

6.495

0.0899

Ausente 7 (3.24) 19 (8.84)

Leve 74 (34.26) 64 (29.77)

Moderado 63 (29.17) 58 (26.98)

Acentuado 72 (33.33) 74 (34.42)

H. pylori (Gram)

2 =

0.095

0.9924

Ausente 111 (51.39) 109 (50.70)

Leve 40 (18.52) 39 (18.14)

Moderado 29 (13.43) 31 (14.42)

Acentuado 36 (16.67) 36 (16.74)

Atividade neutrofílica

2 =

1.226

0.7469

Ausente 71 (32.87) 76 (35.35)

Leve 81 (37.50) 71 (33.02)

Moderado 55 (25.46) 52 (24.19)

Acentuado 9 (4.17) 6 (2.79)

Folículo linfoide

G(Williams) =

3.0027

0.3912

Ausente 165 (76.39) 162 (13.49)

Leve 36 (16.67) 29 (7.44)

Moderado 11 (5.09) 16 (3.72)

Acentuado 4 (1.39) 8 (3.72)

Metaplasia intestinal

2 =

2.2961

0.5133

Ausente 188 (87.04) 185 (86.05)

Leve 16 (7.41) 12 (5.58)

Moderado 7 (3.24) 8 (3.72)

Acentuado 5 (0.93) 10 (4.65)

Atrofia glandular

G(Yates) =

0.431

0.5115

Ausente 207 (95.83) 203 (94.42)

Presente 9 (4.17) 13 (6.05)

Displasia gástrica

G(Williams) =

6.063

0.1086

Ausente 211 (97.69) 214 (99.53)

Leve 4 (1.85) - -

Moderado 1 (0.46) - -

Acentuado - - 1 (0.47)

70

A infecção pela bactéria Helicobacter pylori atingiu taxa de 56,48% (122/216)

pela coloração de Gram e de 59,26% (128/216) pela reação em cadeia da polimerase

(PCR). A tabela 6 monstra a distribuição da infecção pela H. pylori, entre as regiões do

antro e corpo gástrico de acordo com a coloração de Gram e PCR. A comparação da

pesquisa de H. pylori pelos dois métodos demonstrou uma associação altamente

significativa entre eles pelo teste de Mantel-Haenszel (2= 278.3326; gl= 1; p < 0,0001),

cujo Odds Ratio indica que um teste Gram positivo tem 28 vezes a chance da PCR também

ser positiva (IC 95% = 17.9346 ≤ µ ≤ 43.8869).

Tabela 6. Comparação dos métodos de detecção da H. pylori entre pacientes com gastrite

crônica atendidos no HUJBB em 2011-2012.

Método de Gram PCR Total

Positivo Negativo

Antro N (%) N (%) N (%)

Gram + 95 (43.98) 10 (4.63) 105 (48.61)

Gram - 26 (12.04) 85 (39.35) 111 (51.39)

Total 121 (56.02) 95 (43.98) 216 (100)

Corpo

Gram + 95 (44.39) 11 (5.14) 106 (49.53)

Gram - 29 (13.55) 79 (36.92) 108 (50.47)

Total 124 (57.94) 90 (42.06) 214 (100)

A análise da presença das lesões histopatológicas na mucosa gástrica em função

da infeção pela de H. pylori, pelo método de PCR, revelou associação estatisticamente

significativas na região do antro gástrico entre infiltrado inflamatório, atividade

neutrofílica, folículo linfoide e densidade bacteriana, cujo risco relativo para estes

indivíduos, que foram positivos pela PCR para H. pylori, apresentarem estas lesões

histopatológicas no antro variou de 111.78 a 5.36. No corpo gástrico, a significância

estatística foi observada para infiltrado inflamatório, atividade neutrofílica e densidade de

H. pylori, sendo que os indivíduos infectados têm, respectivamente, a probabilidade de

118, 14 e 23 vezes mais chance de apresentarem estas lesões histopatológicas na mucosa

do corpo gástrico do que aqueles indivíduos com PCR negativa para esta infecção (tabela

7).

71

Tabela 7. Associação das lesões histopatológicas na presença de Helicobacter pylori nas áreas de corpo e antro gástrico de pacientes atendidos

no Hospital de Barros Barreto 2011.

Lesões histopatológicas

Antro Corpo

H. pylori

Teste GYates p valor OR

H. pylori Teste

GYates p valor OR Positivo

(n=121)

Negativo

(n=95)

Positivo

(n=124)

Negativo

(n=90)

Infiltrado Inflamatório 116.4145 < 0.0001 111.78 13.7157 0.0002 118.72

Presente 119 33 121 74

Ausente 2 62 3 16

Atividade neutrofílica 134.4972 < 0.0001 52.86 68.5385 < 0.0001 14.53

Presente 107 12 109 30

Ausente 14 83 15 60

Folículo linfoide 21.4842 < 0.0001 24.48 2.4044 0.1210 1.76

Presente 25 1 36 17

Ausente 96 94 88 73

Densidade de

colonização 106.0189 < 0.0001

5.36 91.7976 < 0.0001 23.53

Presente 95 10 95 11

Ausente 26 85 29 79

Lesões pré-malignas 0.4555 0.4997 1.42 1.4186 0.2336 1.64

Presente 19 11 27 13

Ausente 102 84 97 77

71

72

3.2. ANÁLISE DOS MARCADORES DE VIRULÊNCIA DA H. pylori

As frequências independentes dos marcadores de virulência vacAm1s1, cagA,

babA2, e sabA da H. pylori, de uma modo geral, atingiram as proporções, respectivamente,

de 79,69% (102/128), 66,40% (85/128), 49,21 (63/128) e 89,84% (115/128) no estômago

dos pacientes analisados neste estudo. Considerando as regiões do antro e corpo gástrico as

frequências destes genes da H. pylori não demonstraram diferenças estatisticamente

significativas como ilustrados na figura 12.

Figura 12. Distribuição dos marcadores de virulência da bactéria Helicobacter pylori entre

regiões do antro e corpo gástrico dos pacientes analisados.

A análise da combinação conjunta dos fatores de virulência da H. pylori,

detectados nas biópsias gástricas dos pacientes analisados neste estudo, independente da

área do estômago amostrada esta demostrada na tabela 8. A combinação gênica

vacAm1s1/cagA+/sabA

+ foi a mais frequente detectada entre as amostras de biópsias

gástricas positivas para a H. pylori, estando representada por 55,47% (71/128), seguida da

combinação vacAm1s1/cagA+/babA2

+ com 33,59% (43/128) dos casos. A combinação tetra

positiva dos marcadores vacAm1s1, cagA, babA2 e sabA2, foi evidenciada em 28,90%

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

m1s1 m2s1 m2s2 Pos Neg Pos Neg Pos Neg

VacA CagA BabA2 SabA

Per

cen

tual

de

paci

ente

s

Marcadores de virulência da H. pylori

Antro

Corpo

73

(37/128) das amostras. A frequência de combinação entre os genes vacAm1s1 e cagA+

atingiu 63,28% (81/128).

Tabela 8. Associação dos genes de virulência detectados no estomago dos pacientes com

gastrite crônica atendidos no HUJBB em 2011-2012.

vacAm1s1/cagA babA2/sabA Total

+/+ +/- -/+ -/-

N (%) N (%) n (%) n (%) n (%)

+/+ 37 (28.91) 6 (4.69) 34 (26.56) 4 (3.13) 81 (63.28)

+/- 7 (5.47) 2 (1.56) 11 (8.59) 1 (0.78) 21 (16.41)

-/+ 2 (1.56) - - 2 (1.56) - - 4 (3.13)

-/- 9 (7.03) - - 13 (10.16) - - 22 (17.19)

Total 55 (42.97) 8 (6.25) 60 (46.88) 5 (3.91) 128 (100)

Adicionalmente, foi realizada a análise de correlação Phi entre esses genes nas

regiões do corpo e antro, foi observada significância estatística entre os genes vacAm1s1 e

cagA, tanto no corpo quanto no antro, e entre os genes vacAm1s1o e sabA no corpo (Tabela

9). Além disso, também foi verificada uma correlação altamente significativa (rs = 0.7201;

t = 11.1299; <0.0001), das diferentes combinações dos gene vacAm1s1, cagA, babA2 e sabA

entre corpo e antro, ou seja, 63 pares de biópsia gástricas de antro e corpo de diferentes

pacientes foram diagnosticados com H. pylori que tinham a mesma combinação destes 4

marcadores de virulência (Tabela 10).

74

Tabela 9. Correlação entre os genes de virulência detectados no antro e corpo gástrico de

pacientes infectados por H. pylori atendidos no HUJBB em 2011-2012.

Corpo

Antro vacAm1s1 cagA babA2 sabA

vacAm1s1 rs = 0.5103 rs = -0.0064 rs = -0.2158

t = 6.5548 t = -0.0705 t = -2.4406

p< 0.0001 p = 0.9439 p = 0.0160

cagA rs = 0.4971 rs = 0.1344 rs = -0.0620

t = 6.2491 t = 1.4978 t = -0.6856

p < 0.0001 p = 0.1367 p = 0.4942

babA2 rs = 0.0378 rs = 0.1380 rs = 0.0541

t = 0.4122 t = 1.5200 t = 0.5981

p = 0.6809 p = 0.1311 p = 0.5508

sabA rs = -0.1264 rs = 0.0106 rs = -0.0780

t = -1.3902 t = 0.1152 t = -0.8536

p = 0.1670 p = 0.9084 p = 0.3950

75

Tabela 10. Correlação das diferentes combinações dos fatores de virulência da H. pylori entre corpo e antro gástrico de paciente com gastrite


Antro

Corpo

vacA

- /cagA

- /babA

2- /s

abA

+

vacA

- /cagA

- /babA

2+

/sabA

-

vacA

- /cagA

- /babA

2+

/sabA

+

vacA

- /cagA

+/b

abA

2+/s

abA

+

vacA

+/c

agA

- /babA

2- /s

abA

-

vacA

+/c

agA

- /babA

2- /s

abA

+

vacA

+/c

agA

- /babA

2+

/sabA

-

vacA

+/c

agA

- /babA

2+

/sabA

+

vacA

+/c

agA

+/b

abA

2- /s

abA

-

vacA

+/c

agA

+/b

abA

2- /s

abA

+

vacA

+/c

agA

+/b

abA

2+

/sabA

-

vacA

+/c

agA

+/b

abA

2+

/sabA

+

vacA

- /cagA

- /babA

2- /s

abA

-

Total

vacA-/cagA

-/babA2

-/sabA

+ 11

1

1

2 15

vacA-/cagA

-/babA2

+/sabA

- 1

1

vacA-/cagA

-/babA2

+/sabA

+ 2

6

8

vacA-/cagA

+/babA2

-/sabA

+ 1

1

vacA-/cagA

+/babA2

+/sabA

+

1

1 2

vacA+/cagA

-/babA2

-/sabA

-

1 3 1

1 6

vacA+/cagA

-/babA2

-/sabA

+

2 5 1

3

2 13

vacA+/cagA

-/babA2

+/sabA

-

1

1

vacA+/cagA

-/babA2

+/sabA

+

1

1 1 2

5

vcA+/cagA

+/babA2

-/sabA

-

3 4 1 1 9

vacA+/cagA

+/babA2

-/sabA

+

3

2 17

4 26

vacA+/cagA

+/babA2

+/sabA

-

1

1 1 3

6

vacA+/cagA

+/babA2

+/sabA

+

2 1 2 2 3

14 24

Total Geral 15 1 6 3 3 15 4 5 8 28 4 23 2 117 vacA+ representa bactérias com a variante gênica vacAs1m1, e vacA- outras variantes gências.

75

76

A presença isolada dos fatores de virulência vacAs1m1, cagA, babA2 e sabA2 da H.

pylori, nas regiões de antro e corpo gástrico, foi correlacionada com os escores das lesões

diagnosticadas na mucosa gástrica dos pacientes, que se estavam infectados pela H. pylori,

para isto foi usado o teste de Correlação de através teste de Sperman. A análise revelou

uma correlação positiva estatisticamente significativa entre a variante vacAm1s1 versus

infiltrado inflamatório crônico, tanto antro quanto no corpo gástrico, e atividade

neutrofílica e com lesões pré-cancerosas na região do antral do estômago. Da mesma

forma, em relação ao gene cagA foi observado uma correlação positiva significativa com

infiltrado inflamatório crônico, a atividade neutrofílica, folículo linfoide e lesões pré-

cancerosas no antro; já no corpo esta correlação ocorreu somente com infiltrado

inflamatório. Os genes babA2 e sabA foram positivamente correlacionados com a

densidade de H. pylori no antro e no corpo, enquanto o gene babA2 também apresentou

uma correlação negativa com folículo linfoide (Tabela 11). Deste modo, um modelo

regressão logística múltipla foi obtido para avaliar o risco de lesões pré-cancerosas no

antro gástrico frente à presença dos fatores de virulência vacAm1s1, cagA+ e sabA

+ da H.

pylori. O teste foi altamente significativo (2= 44.1382; gl = 3; p < 0.0001), indicando que

a presença dos fatores de virulência vacAm1s1 e sabA+ aumenta em 6 e 4,5 vezes a chance

de ocorrência de lesões pré malignas no antro gástrico, com probabilidade de 36,33% se a

bactéria apresentar a combinação vacAm1s1/sabA+.

Adicionalmente, foi verificado também se os níveis de lesão histopatológicas na

mucosa gástrica estavam correlacionados com a presença das diferentes combinações dos

genes vacA, cagA, babA2 e sabA da H. pylori. Para realizar esta análise foi gerado um

índice de lesão histopatológica (IL) usando o método matemático Mudança de Base 4 para

base decimal, cujo valor assumido expressa a representação numérica das graduações dos

lesões histopatológicas como, infiltrado inflamatório, atividade neutrofílica, folículo

linfoide, densidade de H. pylori, metaplasia intestinal, displasia e atrofia glandular. Então,

o índice de lesão foi determinado através da expressão matemática: ∑ , onde n

representa a posição das lesões histopatológicas (6,5,4,3,2,1,0) no grid e X o nível da

graduação histopatológica (ausente (0), leve (1), moderado (2) e acentuado (3).

Partindo do mesmo o principio, um índice de combinação gênica (IG) dos genes

vacA, cagA, babA2 e sabA, foi gerado a partir da representação binária (ausente (0) e

presente (1)) destes marcadores de virulência da H. pylori detectados nas biópsias

gástricas de antro e corpo de cada paciente. Assim, o índice de combinação genica foi

77

definido a partir da expressão matemática ∑ , onde n representa a posição dos

gene no grid (3,2,1,0) e X a presença (1) ou ausência (0) destes genes. Então considerando

os valores dos índices de lesões histopatológicos e das combinações gênicas foi aplicado o

teste de teste de correlação de Person para verificar se as diferentes combinações gênicas

estavam correlacionadas com o índice de lesão histopatológica (IL), foi revelada uma

correlação positiva estatisticamente significativa tanto no antro (rs = 0.2263; p = 0.0125)

quanto no corpo gástrico (rs = 0.2083; t = 2.3527; p = 0.0202). Indicando que quanto maior

o número de fatores de virulência presentes nas H. pylori, maior é o dano na mucosa

gástrica (Figura 13).

78

Tabela 11. Correlação entre os genes de virulência e lesão histopatológicas detectadas na mucosa de corpo e antro gástrico de pacientes com

gastrite crônica atendidos no HUJBB em 2011-2012.

Genes

Lesões histopatológicas

Infiltrado Inflamatório Atividade Neutrofílica Folículo linfoide Densidade de

colonização Lesões pré-malignas

Antro Corpo Antro Corpo Antro Corpo Antro Corpo Antro Corpo

vacAm1s1 rs = 0.25 rs = 0.25 rs = 0.20 rs = 0.13 rs = 0.07 rs = -0.01 rs = 0.03 rs = -0.03 rs = 0.2 rs = 0.09

p = 0.005 p = 0.005 p = 0.027 p = 0.146 p = 0.464 p = 0.923 p = 0.761 p = 0.756 p = 0.044 p = 0.314

cagA rs = 0.18 rs = 0.19 rs = 0.26 rs = 0.11 rs = 0.18 rs = -0.02 rs = 0.16 rs = 0.05 rs = 0.2 rs = -0.05

p = 0.044 p = 0.036 p = 0.004 p = 0.232 p = 0.05 p = 0.854 p = 0.072 p = 0.618 p = 0.029 p = 0.619

babA2 rs = 0.03 rs = -0.03 rs = 0.02 rs = -0.02 rs = 0.10 rs = -0.23 rs = 0.26 rs = 0.10 rs = 0.0 rs = -0.08

p = 0.785 p = 0.732 p = 0.806 p = 0.812 p = 0.266 p = 0.011 p = 0.004 p = 0.278 p = 0.832 p = 0.395

sabA rs = 0.01 rs = 0.00 rs = 0.08 rs = 0.07 rs = 0.02 rs = 0.12 rs = 0.19 rs = 0.11 rs = 0.2 rs = -0.09

p = 0.925 p = 0.986 p = 0.360 p = 0.424 p = 0.837 p = 0.180 p = 0.039 p = 0.221 p = 0.079 p = 0.311

78

79

Figura 13. Correlação entre o índice de lesões histopatológicas e o índice de combinação dos genes vacAm1s1, cagA, babA2 e sabA da H. pylori

detectados em biópsias de corpo e antro de pacientes com gastrite crônica atendidos no HUJBB em 2011-2012.

79

80

3.3. ASSOCIAÇÃO DA INFECÇÃO PELA H. pylori COM OS GRUPOS SANGUÍNEOS

ABO LEWIS E SECRETOR

A distribuição geral dos pacientes, em função dos tipos de grupo sanguíneo ABO,

demonstrou que 58,33% (126/216) eram do grupo O, 33,79% (73/216) pertenciam ao

grupo A, 7,41% (16/216) ao grupo B e 0,46% (1/216) ao grupo AB. Esta distribuição

estava em equilíbrio de Hardy-Weinberg (2 = 2.0674; gl = 1; p = 0,1505). A frequência

do alelo A atingiu 18,98%, o alelo B foi representado por 4,03% e o alelo O foi

evidenciado em 76,99% da amostra. As frequências gerais dos grupos sanguíneos ABO

dos pacientes foram comparadas com aquelas descritas para a população de Belém

(Corvelo et al., 2013) e não foram verificadas diferenças estatisticamente significativas

(Teste G Williams = 2.4415; gl = 3; p = 0,4859).

A tabela 8 demonstra a distribuição dos fenótipos de grupo sanguíneo ABO,

Lewis e estado secretor de substância ABH entre indivíduos infectados e não infectados e a

comparação destas distribuições da amostra de pacientes em relação às frequências

descritas para a população de Belém de acordo com Corvelo e colaboradores (2013). De

um modo geral, as proporções fenotípicas dos sistemas de grupos sanguíneos ABO e Lewis

ao nível salivar não diferiram entre os pacientes infectados e não infectados e nem destes

em relação a amostra da população de Belém (Tabela 12). A maioria dos pacientes,

92,19% (197/216), foi caracterizada como secretora de antígenos A, B, H, Lea e Leb na

saliva e 7,81% (19/216) como não secretora, uma proporção que não diferiu daquela

descrita por Corvelo e colaboradores (2013) para a população de Belém (Tabela 8).

81

Tabela 12. Distribuição de pacientes com gastrite crônica atendidos no HUJBB em 2011-

2012 de acordo com a infecção pela H. pylori e os tipos de grupo sanguíneo ABO, Lewis e

estado secretor salivar em relação a população de Belém.

Fenótipos N Infecção pela H. pylori

População de

Belém 3 Teste G

p-

valor

Sim (n=128) Não (n=88)

n (%) N (%) n (%)

ABO

A 73 44 (34.38) 29 (32.95) 46 (30.67) 1x2 2.746 0.433

B 16 12 (9.38) 4 (4.55) 17 (11.33) 1x3 0.7197 0.869

AB 1 1 (0.78) - - 2 (1.33) 2x3 4.9506 0.175

O 126 71 (55.47) 55 (62.5) 85 (56.67)

Lewis (salivar)

Le(a+b-) 15 8 (6.25) 7 (7.95) 10 (6.67) 1x2 0.2286 0.892

Le(a-b+) 177 107 (83.59) 70 (79.55) 130 (86,67) 1x3 2.1638 0.339

Le(a-b-) 24 13 (10.16) 11 (12.50) 10 (6.67) 2x3 2.4489 0.294

Estado Secretor

Se 197 118 (92.19) 79 (89.77) 138 (92.0) 1x2 0.1367 0.712

NSe 19 10 (7.81) 9 (10.23) 12 (8.0) 1x3 0.0272 0.868 3 – Dados relativos ao estudo de Corvelo e colaboradores (2013)

Considerando os fenótipos do sistema de grupo sanguíneo Lewis, foram

detectadas as seguintes distribuições, ao nível eritrocitário 7,87% (17/216) dos pacientes

eram Le(a+b-), 56,48% (122/216) eram Le(a-b+) e 35,65% (77/216) eram do tipo Le(a-b-);

ao nível salivar 6,94 % (15/216) eram Le(a+b-), 81,94% (177/216) e 11,11% (24/216)

foram caracterizados como Le(a+b-) e Le(a-b-) respectivamente, sendo que as proporções

dos fenótipos Lewis sanguíneo diferiram significativamente dos fenótipos Lewis salivares

(Teste 2 = 38.054; gl = 2; p < 0,0001) (Tabela 13).

Tabela 13. Distribuição de pacientes com gastrite crônica atendidos no HUJBB em 2011-

2012 de acordo os fenótipos Lewis eritrocitário e salivar.

Fenótipo

eritrocitário

Fenótipo salivar Total

Le(a+b-) Le(a-b+) Le(a-b-)

N (%) N (%) N (%) N (%)

Le(a+b-) 5 (2.31) 12 (5.56) - - 17 (7.87)

Le(a-b+)

122 (56.48) - - 122 (56.48)

Le(a-b-) 10 (4.63) 43 (19.91) 24 (11.11) 77 (35.65)

Total 15 (6.94) 177 (81.94) 24 (11.11) 216 (100)

82

A comparação dos antígenos de grupo sanguíneo Lewis ao nível eritrocitário e

salivar (Tabela 13) permitiu classificar a amostra dos pacientes em dois grupos fenotípicos:

Lewis concordante, aqueles com antígenos Lewis idênticos e compatíveis entre sangue e

saliva, e Lewis discordante, aqueles em que os antígenos detectados nos eritrócitos eram

diferentes das especificidades da saliva (Figura 14). A maioria dos pacientes concordantes

(80,79%) integrou o grupo cujos fenótipos eram Le(a-b+)/Le(a-b+) no sangue e saliva,

respectivamente. Os Lewis discordantes foram identificados como paciente que

expressavam os fenótipos Le(a-b-) nos eritrócitos e na secreção salivar expressavam

Le(a+b-) ou Le(a-b+), e ainda aqueles indivíduos com fenótipo Le(a+b-) no sangue e com

Le(a-b+) na saliva. A discordância dos fenótipos Lewis entre sangue e saliva, representou

30,09% (65/216) da amostra de pacientes (Tabela 13). Entre os dados listados na tabela 9,

o maior número observado de discrepância concentrou-se no grupo classificado nos

eritrócitos como Lewis negativo e Lewis positivo na saliva, totalizando 81,54% (53/65)

dos casos discordantes (Figura 4).

Figura 14. Distribuição dos fenótipos Lewis em relação a concordâncias dos fenótipos

Lewis eritrocitário e salivar dos pacientes com gastrite crônica atendidos no HUJBB em

2011-2012.

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

Le(a-b+)/Le(a-b+) Le(a-b-)/Le(a-b-) Le(a+b-)/Le(a+b-) Le(a-b-)/Le(a+b-)

ou Le(a-b+)

Le(a+b-)/Le(a-b+)

Fenótipo Lewis concordante Fenótipo Lewis discordante

80.79%

15.89%

3.31%

81.54%

18.46%

Fre

qu

ênci

a d

e ca

sos

Fenóipo Lewis

Tipo de expressão antigênica sangue/saliva

83

Uma análise realizada, refere-se a distribuição dos pacientes com fenótipos Lewis

concordandes e discordantes em relação aos fenotipos de grupos sanguíneos do sistema

ABO, foi verificada diferença altamente significativa na distribuição de pacientes do grupo

O em relação aos fenótipos A e B (2 = 19.677; gl = 1; p < 0.0001), ou seja, a maioria dos

pacientes Lewis concordantes eram do grupo O, enquanto que entre os Lewis discordantes

a maior parte pertencia aos tipos A/B (Figura 15). Adicionalmente, foi verificada se a

distribuição dos pacientes com e sem infecção pela H. pylori diferia entre os fenótipos

concordante e discordantes (Tabela 14), neste aspecto não foram verificadas diferenças

estatisticamente significativas (2 = 2.262. gl = 1 p = 0.1326). Por outro lado, foi

observada, entre os pacientes Lewis discordantes dos tipos sanguíneos A/B, uma maior

taxa de infecção pela H. pylori, 76,19% (32/42), uma proporção que diferiu

significativamente (Z = 1.9798; p = 0.0239) daquela observada entre os indivíduos que

pertenciam ao grupo O, 52,17% (12/23), neste grupo de pacientes (Figura 16).

Figura 15. Distribuição dos fenótipos do sistema dos tipos Lewis em relação aos grupos

sanguíneos do sistema ABO dos pacientes com gastrite crônica atendidos no HUJBB em

2011-2012.

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

Concordante Discordante

Per

cen

tual

de

caso

s

Fenótipos Lewis

Tipo O Tipo A/B

84

Tabela 14. Distribuição da infecção pela H. pylori entre pacientes Lewis concordantes e

discordantes com gastrite crônica atendidos no HUJBB em 2011-2012.

Fenótipo Lewis Infecção pela H. pylori Total

Positivo Negativo

N (%) N % N %

Concordante 84 (55.63) 67 (44.37) 151 (69.91)

Discordante 44 (67.69) 21 (32.31) 65 (30.09)

Total 128 (59.26) 88 (40.74) 216 (100.00)

Figura 16. Distribuição dos fenótipos Lewis concordantes e discordantes em relação a

infecção pela H. pylori e ao tipo de grupo sanguíneo ABO de pacientes com gastrite


0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

Hp+ Hp- Hp+ Hp-

Lewis concordante Lewis discordante

Per

cen

tual

de

paci

ente

s

Fenótipos Lewis

Tipo O

Tipo A/B

85

3.3.1. Avaliação dos polimorfismos T59G e G508A no gene Lewis do G428A no gene

Secretor.

A caracterização molecular do gene Lewis para os SNPs T59G e G508A, e do

gene secretor, para o polimorfismo G428A, envolveu todos os indivíduos diagnosticados

com infecção pela H. pylori (n= 128) e 41 indivíduos sem infecção, mas que 19 deles eram

dos fenótipos Lewis discordantes, 10 eram do fenótipo Lewis negativos concordantes e 12

que apresentaram reação fraca para a especificidade antigênica Leb na saliva. Assim, o

padrão de restrição para esses SNPs foi investigado em 169 casos, através das enzimas de

restrição MspI para o polimorfismo T59G, PvuII para a mutação G508A e XbaI para o

G428A. Os padrões de restrições destes SNPs estão demonstrados na Figura 17. As

freqüências genotípicas e haplotípicas dos genes FUT2 e FUT3 observadas entre os 169

pacientes analisados estão detalhadas na tabela 15.

Figura 17. Padrão de digestão enzimática das mutações T59G (A) e G508A (B) no gene

FUT3, pelas enzimas de restrição VspI e PvuII, respectivamente, corado com brometo de

etídio em poliacrilamida 7%.

86

As frequências do SNP G428A no gene FUT2, em geral mostrou uma

concordância entre os genótipos observados com o estado secretor ABH na saliva. A tabela

13 sumariza as freqüências genotípicas e alélicas estimadas, verificando-se que estas estão

em equilíbrio de Hardy-Weinberg (2 = 0,3689; gl = 1; p = 0,5436). A frequência do alelo

se428

atingiu 29,30%. Os genótipos Se/_ (48,52%) e Se/se428

(40,83%) predominaram na

amostra investigada, sendo que estes estavam relacionados com a presença de substância

ABH na saliva. Por outro lado, a ausência de substância ABH na saliva foi relacionada

com o genótipo se428

/se428

em 8,28% (14/169), e em 4 casos que não foram detectadas a

presença de antígenos ABH na saliva, 2 (1,18%) deles apresentavam a mutação G428A em

heterozigose e em 2 (1,18%) deles não foi observado qualquer padrão de restrição.

A presença de pelo menos 06 diferentes alelos do gene FUT3 foi inferida, sendo

que os alelos continham as mutações isoladas 59 e 508 ou em combinações 59/508 e este

último atingiu frequência de 12,13% (41/338) (Tabela 11). Globalmente, o polimorfismo

59T>G atingiu uma freqüência de 19,53% (66/338), sendo detectado em 58 indivíduos,

onde em 8 deles estava em homozigose, associada ou não com o SNP 508G>A e em 50

casos estava em heterozigose. A mutação 508G>A exibiu uma freqüência similar a T59G,

ou seja, 19,53 % (66/338), sendo detectada em 59 indivíduos. A análise das frequências

genotípicas indicou que o gene FUT3 está em equilíbrio Hardy-Weinberg (2= 2.3870; gl

= 1; p = 0,1223) nesta amostra de pacientes.

Nesta investigação, se supôs a presença de outra mutação inativante do gene

Lewis, pois em 69,56% (16/23) dos casos com fenótipos Lewis negativo genuíno foram

observadas ausência de clivagem ou apenas ocorreu clivagem parcial pelas enzimas MspI e

PuvII. Destes 16 casos, 5 não foram clivados por nenhuma das referidas enzimas, 4 casos

foram clivados parcialmente pela MspI e 7 indivíduos foi detectada a heterozigosidade para

a mutação 508G>A, sendo que 3 destes indivíduos também tiveram seus produtos de

amplificação clivados ainda pela enzima MspI, mas de forma parcial.

87

Tabela 15. Freqüências alélicas e genotípicas dos loci FUT2 e FUT3 entre pacientes com

gastrite crônica atendidos no HUJBB em Belém/Pa em 2011-2012.

Genótipo N Frequência (%)

(n=169)

Alelo

(2n=338) N Frequência (%) ±SD

FUT2

Se/_ 82 (48.52) Se 233 (68,93) 0.015

Se/se428 69 (40.83) se428 99 (29,29) 0.018

se428/se428 14 (8.28) se* 6 (1,78) 0.005

se428/se* 2 (1.18)

se*/se* 2 (1.18)

FUT3

Le/_ 84 (49.70) Le 226 (66,86) 0.018

Le/Le59

14 (8.28) Le59

21 (6,21) 0.009

Le/le508

16 (9.47) le508

25 (7,40) 0.01

Le/le59,508

28 (16.57) le59,508

41 (12,13) 0.013

Le59

/Le59

3 (1.78) le* 21 (6,21) 0.009

Le59

/le59,508

1 (0.59) le59,

* 4 (1,18) 0.004

le508

/le508

2 (1.18)

le508

/le59,508

1 (0.59)

le59,508

/le59,508

4 (2.37)

le59,

*/le* 4 (2.37)

le508

/le* 4 (2.37)

le59,508

/le* 3 (1.78) le*/le* 5 (2.96)

A distribuição das frequências alélicas do gene FUT3 investigadas neste estudo

foi comparada com aquela descrita para a população de Belém descrita Corvelo e

colaboradores (2013) foram verificadas diferenças altamente significativas entre as

proporções observadas (2= 73.926; gl = 4; p< 0,0001). A presença dos genótipos Le/_ e

le*/ le* foi maior entre os pacientes do que na população de Belém. Por outro lado, o

genótipo Le59

/Le59

foi mais frequente na amostra da população de Belém quando

comparada com a de pacientes (Tabela 16).

88

Tabela 16. Comparação das frequências genotípica de FUT3 entre pacientes com gastrite

crônica e população de Belém.

Genótipo População

Pacientes Belém Partição Lin : Col 2 GL (p)

N (%) N (%)

Le/_ 84 (49.70) 23 (15.33)

Le59

/Le59

3 (1.78) 11 (7.33) 1 02:02 16.1897 1 < 0.0001

Le/Le59

14 (8.28) 62 (41.33) 2 03:02 53.5939 1 < 0.0001

Le/le* 45 (26.63) 44 (29.33) 3 04:02 0.0123 1 0.9117

le*/le

* 23 (13.61) 10 (6.67) 4 05:02 4.1301 1 0.0421

Em relação à distribuição genotípica do FUT3 entre pacientes infectados e não

infectados foi observado uma relação direta entre a positividade para a infecção e a elevada

frequência do genótipo Le/_, e entre os pacientes H. pylori negativo a maior frequência de

genótipos observada foi do le*/le*, conforme demonstrado observado na figura 18.

Figura 18. Distribuição de frequência dos genótipos Lewis entre pacientes infectados e não

infectados pela H. pylori.

0.55

0.016 0.06

0.27

0.101

0.32

0.024 0.15

0.268 0.244

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

Le/_ Le59/Le59 Le/Le59 Le/le* le*/le*

Per

cen

tual

de

cas

os

Genótipos

HP+

HP-

p1 < p2 0.3557

p1 < p2 0.0450

p1 = p2 0.4866 p1 < p2

0.0104

p1 > p2 0.004

89

3.4. EXPRESSÃO IMUNOHISTOQUÍMICA DOS ANTÍGENOS ABO E LEWIS NA

MUCOSA GÁSTRICA

A expressão imunohistoquímica dos antígenos ABH e Lewis, na camada foveolar

do antro gástrico foi avaliada em 107 pacientes. Os pacientes dos grupos A, B e AB, do

sistema ABO foram analisados de forma conjunta devido ao pequeno número amostral dos

fenótipos Be AB, própria da distribuição de frequências destes grupos sanguíneos. Assim

foram incluídos 47 pacientes dos grupos A/B, sendo que dois deles foram caracterizados

como não secretores de substâncias ABH, e 60 pacientes do grupo O, onde 7 deles eram

não secretores.

A marcação imunohistoquímica dos antígenos ABH na mucosa gástrica destes

pacientes se distribui de acordo com o tipo de grupo sanguíneo ABO dos mesmos. A

expressão dos antígenos foi considerada como normal, o padrão homogêneo (Figura 19) e

os casos de ausência de expressão relacionados ao estado não secretor, e como anômalo, os

casos heterogêneo (Figura 20) e aqueles com ausência total de expressão registrado entre

pacientes secretores (Figura 21). Assim, o padrão anômalo heterogêneo, aquele que

considerou a perda de expressão, foi mais evidente para o antígeno Leb no epitélio

superficial seguido do antígeno A/B e H, relativo aos pacientes do grupo O (Figura 19). Os

padrões normais homogêneos e anômalos heterogêneo estão demonstrados na figura 10,

cujas áreas de metaplasia intestinal e de forte inflamação revelam um padrão de expressão

decrescente, particularmente do antígeno Leb.

90

Figura 19. Padrão homogeneo de expressão antígenica. (A e B) Padrão Homogêneo do

antígeno H e A respectivamente. Aumento 10x.

91

Figura 20. Padrão Heterogêneo de marcação. (C) Perda de Leb em área de Metaplasia

intestinal; (D) Ganho de Lea em área de Metaplasia intestinal; (E). Padrão heterogêneo do

antígeno Leb. Aumento 40x.

92

Figura 21. Distribuição da expressão dos antígenos dos sistemas ABH e Lewis na mucosa

gástrica dos pacientes com gastrite crônica atendidos no HUJBB em 2011-2012.

A proporção de perda de expressão na mucosa gástrica dos antígenos A/B dos

pacientes com inflamação forte não demonstraram diferença significativas em relação a

inflamação fraca (Teste binomial = -0.6565; p = 0.5115), assim como do antígeno H (Teste

binomial 0.2730; 07848), mas em relação ao antígeno Leb a perda foi mais visível entre os

pacientes com inflamação forte, cujos casos anômalos representaram 66,66% (50/84), os

quais diferiram proporcionalmente deste mesmo padrão verificado entre os pacientes com

inflamação fraca (Teste binomial 1.7424; p = 0.0407), que foram representados 39,13%

(9/23) dos casos analisados (Figura 22).

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

A/B H Lea Leb

Per

cen

tua

l d

e ex

pre

ssã

o

Expressão dos antígenos ABH e Lewis na mucosa gástrica

Normal - Homogêneo Ausente - normal Anômalo - heterogêneo Anômalo - Nulo

93

Figura 22. Distribuição da expressão imunohistoquímica ABH e Lewis em relação ao nível

de inflamação na mucosa gástrica dos pacientes com gastrite crônica de Belém-Pa, 2011-

2012.

Adicionalmente, as expressões dos antígenos A/B, H, Lea e Le

b no epitélio

gástrico foram comparadas com a presença daquela verificada na saliva. Em relação aos 45

pacientes que pertenciam aos fenótipos A/B e que eram secretores, todos tiveram a

expressão salivar, mas somente 76% (34/45) expressaram estes antígenos na mucosa

gástrica. Ao contrário dos pacientes do grupo O, que demonstraram expressão tissular em

todos os casos. Foram observadas perda de expressão do antígeno Lea no epitélio gástrico,

pois entre 7 pacientes que foram fenotipados como Le(a+b-) na saliva, somete dois

expressaram este antígeno na mucosa. Foram verificadas também diferença na proporção

dos indivíduos que expressam o antígeno Leb mucosal em relação à positividade na saliva.

Neste caso, 91 indivíduos que foram caracterizados como Le(a-b+) na saliva, 15,38%

(14/91) deles não demonstraram a expressão do antígeno Leb na mucosa gástrica (Figura

23). Entre os 107 pacientes 9 foram classificados como Lewis negativo na saliva e todos

concordaram com a ausência de expressão no epitélio foveolar gástrico.

Adicionalmente, a média dos escores da marcação imunohistoquímica, foi

avaliada de acordo com as graduações forte e fraca das lesões histopatológicas pelo Teste-t

(Tabela 13). Não foram observada diferença nas médias de expressão dos antígenos A/B e

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Forte Fraca Forte Fraca Forte Fraca Forte Fraca

A/B H Lea Leb

Pe

rce

ntu

al d

e c

aso

s

Expressão de antígenos ABH e Lewis x inflamação

Normal - Homogêneo Normal - Ausente Anômalo - Heterogêneo Anômalo - Nulo

94

H, considerando os achados inflamatórios fortes e fracos. Em relação ao antígeno Lea, as

médias de expressão diferiram significativamente na atividade neutrofílica, denotando

ganho de expressão desse antígeno na graduação forte. A perda de expressão de Leb foi

significativamente relacionada ao grau forte do infiltrado inflamatório, atividade

neutrofílica, densidade de colonização pela H. pylori e na metaplasia intestinal.

Por outro lado, foi verificada se a média de expressão dos antígenos ABH e

Lewis, na camada foveolar da mucosa gástrica diferia em relação a presença ou ausência

dos marcadores de virulência da H. pylori , vacAm1s1, cagA, babA2, sabA, pelo Teste-t. Foi

verificado ganho de expressão de antígeno Lea na presença dos marcadores de virulência

bacteriano vacAm1s1, cagA e sabA e de perda dos antígenos H e Leb na presença do gene

sabA (Tabela 18).

Figura 23. Comparação da expressão dos antígenos de grupos sanguíneos entre na saliva e

mucosa gástrica de pacientes com gastrite crônica de Belém - Pa.

0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%

100%

A/B O Le(a+b-) Le(a-b+)

1.00 1.00 1.00

1.00

0.76

1.00

0.29

0.84

Pro

porç

ão d

e ca

sos

Grupos sanguíneos ABO e Lewis

Expressão de antígeno salivar Expressão de antígeno mucosa gástrica

n = 7

p = 0.0026

n = 91

p < 0.0001 n = 45

p = 0.0002

95

Tabela 17. Comparação da expressão dos antígenos A, B, H, Le e Leb na camada foveolar da área do antro gástrico entre as graduações forte e

fraca das lesões histopatológicas na mucosa gástrica de paciente com gastrite crônica atendidos no HUJBB em 2011-2012.

Achados

Histopatológico Expressão dos Antígenos na mucosa gástrica região foveolar do antro

A/B (n = 45) H (n = 54) Lea (n = 98) Leb (n = 91)

Média p-valor Média p-valor Média p-valor Média p-valor

Infiltrado

inflamatório 0.8184 0.5831 0.7653 0.0062

Forte 161.88 265.45 24.35 153.08

Fraco 151.82 252.22 20.50 227.25

Atividade

neutrofílica 0.5771 0.4491 0.0322 0.0099

Forte 173.12 354.76 37.36 128.00

Fraco 151.11 268.75 14.83 190.26

Folículo linfóide 0.1870 0.4707 0.2488 0.4401

Presente 127.33 273.12 16.13 178.62

Ausente 178.00 258.91 27.01 159.59

Densidade de H.

pylori 0.2871 0.7559 0.6216 0.0066

Forte 190.00 259.58 20.27 125.15

Fraco 146.00 266.20 25.57 188.71

Metaplasia intestinal 0.7097 0.8597 0.7350 0.0542

Forte 133.33 256.67 16.24 96.67

Fraco 161.25 263.60 24.02 170.53

95

96

Tabela 18. Análise da expressão imunohistoquímica dos antígenos ABH e Lewis na mucosa gástrica em relação à presença dos fatores de

virulência da H. pylori em pacientes com gastrite crônica atendidos no HUJBB em 2011-2012.

Genes de virulência

A/B H Lea Leb

Média dos

escore p-valor

Média dos

escores p-valor

Média dos

escores p-valor

Média dos

escores p-valor

vacAm1s1 0.1828 0.2262 0.0412 0.6460

Positivo 165.42 261.18 31.18 161.23

Negativo 107.27 288.88 10.00 174.50

cagA 0.0358 0.2751 0.0340 0.6942

Positivo 182.22 257.92 36.59 160.00

Negativo 110.00 278.42 12.22 170.14

sabA 0.9496 0.0007 0.0261 0.0451

Positivo 146.55 255.62 29.84 152.46

Negativo 150.00 300.00 7.33 217.14

babA2 0.3345 0.3462 0.1218 0.2277

Positivo 121.54 276.31 15.61 146.33

Negativo 162.21 259.58 32.50 177.79

96

97

3.5.EXPRESSÃO DE babA2 e sabA NA MUCOSA GÁSTRICA

As expressões dos genes de virulência da H. pylori BabA2 e SabA e de controle

endógeno, 16S rRNA, foi detectada através PCR em tempo real na mucosa gástrica dos

pacientes infectados e com positividade para estes referidos genes, pela PCR simples. Foi

considerada amostra com presença de expressão gênica aquela que demonstrou uma

intensidade de fluorescência acima do limiar de detecção. O limite foi definido na região

associada com um crescimento exponencial do produto da PCR em tempo real definido

como Ct (Threshold cycle). Deste modo, o valor numérico aceito para determinar a

presenças de expressão gênica foi representado por Ct, que resulta da diferença entre os

médias dos Ct individuais dos genes BabA2 ou SabA, com ás médias dos Ct do gene de

controle endógeno 16s do RNA ribossomal detectado em cada amostra de paciente.

A descrição estatística dos valores de Ct de BabA2 indicaram uma variação de -

7.2263 a 48.6033 com amplitude total de 55.8296, mediana de 7.7671 e média aritmética

de 11.4460, valores estes que diferiram significativamente pelo teste de Mann-Whitney

daqueles observados para SabA (Z = 3.5097; p= 0,0004), que variou de -3.4812 a 35.5520,

atingindo amplitude de 39.0332, mediana de 21.4648 e média aritmética de 19.7979. Os

baixos valores de Ct são relacionados à alta expressão dos genes e os altos valores com a

baixa expressão gênica (Figura 24).

98

Figura 24. Comparação entre o Ct da expressão do RNAm dos genes BabA2 e SabA

verificados na mucosa gástrica de pacientes com gastrite crônica atendidos no HUJBB em

2011-2012.

Assim, foi verificado que a proporção de casos com expressão gênica foi de

50,79% (32/63) para o gene babA2 e de 33,33% (21/63) para o gene sabA, o gene 16s

rRNA se expressou em 100% (63/63) dos casos analisados. Foi verificado também se a

expressão do RNAm dos genes babA2 e sabA estava relacionados com a presença do genes

(Figura 25), o teste Kappa indicou uma boa concordância (75,78%) entre o gene BabA2 e a

detecção do seu RNAm (Z Kappa= 6.6348, p< 0.0001), ao contrário do gene SabA,

demonstrou uma fraca concordância (40,63%) entre a presença deste gene o seu RNAm (Z

Kappa= 2.5181, p=0,005). A expressão concomitante de babA2 e sabA foi verificada em

25,39% (16/63) dos casos, estes dados demonstram que embora haja uma concordância

entre as expressões concomitantes destes genes (Teste Z = 2.8511; p = 0.0022), ela é

considerada do tipo fraca pelo teste Kappa (0.3368).

99

Figura 25. Relação entre a detecção dos genes BabA2 por PCR e a presença de expressão

de seus RNAm verificados na mucosa gástrica de pacientes com gastrite crônica atendidos

no HUJBB em 2011-2012.

Quando se associou a presença ou ausência de expressão dos genes BabA2 com a

média dos escores das lesões histopatológicas diagnosticada na mucosa gástrica, foi

verificada diferença estatística significativa somente em relação ao folículo linfóide. Em

relação ao gene sabA, as médias dos escores histopatológicos da densidade bacteriana

diferiram entre os pacientes com e sem expressão do gene sabA (Tabela 19).

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Pos Neg Pos Neg

BabA2 SabA2

Per

cen

tual

de

exp

ress

ão

Presença do gene

Expressão Presente Expressão ausente

100

Tabela 19. Distribuição da expressão dos genes BabA2 e SabA em função das lesões

histopatológicas diagnosticadas na mucosa gástrica de pacientes com gastrite crônica

atendidos no HUJBB em 2012-2012.

Lesões

histopatológicas Expressão de babA2 Expressão de sabA

Sim Não

Teste-t p-valor

Sim Não

Teste-t p-

valor

Infiltrado

inflamatório

Média dos escores 2.187 2.419 -1.1302 0.628 2.095 2.405 -1.4315 0.157

Atividade

neutrofílica


Folículo linfoide

Média dos escores 0.125 0.548 -2.4150 0.0192 0.381 0.309 0.3694 0.713

Densidade

bacteriana

Média dos escores 1.594 1.806 -0.7848 0.4356 2.095 1.500 2.136 0.037

Lesões pré-

cancerosas


Por ouro lado, quando se relacionou a expressão de ambos os genes babA2 e SabA

com os fenótipos de grupo sanguíneo não foram verificadas diferenças significativas entre

a distribuição dos fenótipos de grupos sanguíneos do sistema ABO, Lewis, Estado secretor

ABH e a discordância dos fenótipos Lewis (Tabela 20).

101

Tabela 20. Distribuição dos grupos sanguíneos em função da expressão dos genes babA2 e

sabA na mucosa gástrica de com gastrite crônica atendidos no HUJBB em 2012-2012.

Fenótipos Expressão p-valor Expressão p-valor

babA2+ babA2-

sabA+ sabA-

N (%) N (%)

N (%) N (%)

ABO

A 15 (46.88) 12 (38.71) 0.5303 6 (28.57) 21 (50.00) 0.2735

B 1 (3.13) 3 (9.68)

2 (9.52) 2 (4.76)

O 16 (50.00) 16 (51.61)

13 (61.90) 19 (45.24)

Lewis salivar

Le(a+b-) 4 (12.50) 6 (19.35) 0.2406 3 (14.29) 7 (16.67) 0.9343

Le(a-b+) 27 (84.38) 21 (67.74)

16 (76.19) 32 (76.19)

Le(a-b-) 1 (3.13) 4 (12.90)

2 (9.52) 3 (7.14)

Estado secretor

Secretor 27 (84.38) 25 (80.65) 0.9538 17 (80.95) 35 (83.33) 0.9063

Não Secretor 5 (15.63) 6 (19.35)

4 (19.05) 7 (16.67)

Fenótipo Lewis

Concordante 18 (56.25) 22 (70.97) 0.3405 13 (61.90) 27 (64.29) 0.9262

Discordante 14 (43.75) 9 (29.03)

8 (38.10) 15 (35.71)

A média dos escores de expressão imunohistoquímica dos antígenos A/B, H e Leb

verificada na mucosa gástrica dos pacientes que apresentavam expressão para o genes

babA2 e sabA. Estas médias foram comparada entre os pacientes com e sem expressão de

babA2 e sabA e de ambos com um grupo de pacientes que não tinham infecção pela H.

pylori, que foi tomado como controle, neste sentido não foram verificadas diferenças

significativas entre as média dos escores de todos os antígenos, tanto em relação ao gene

babA2 quanto a sabA (Figura 26).

102

Figura 26. Média dos escores de expressão imunohistoquímica dos antígenos ABH e Lewis

em relação a expressão dos genes BabA2 e SabA da H. pylori detectados na mucosa

gástrica de pacientes com gastrite crônica de Belém-Pa.

0

50

100

150

200

250

300

350

A/B H Leb Lea

Méd

ia d

e es

core

de

exp

ress

ão

Expressão de antígenos na mucosa gástrica

BabA2+

BabA2-

Controle

0

50

100

150

200

250

300

A/B H Leb Lea

Méd

ia d

os

esco

re d

e ex

pre

ssão

Expressão de antígenos na mucosa gástrica

SabA+

SabA-

Controle

103

4.0. DISCUSSÃO

A Helicobacter pylori é um dos mais bem sucedidos patógeno humano, que

coloniza a lâmina de muco e o epitélio gástrico de mais da metade da população mundial.

Esta infecção tem grande importância epidemiológica e com marcante impacto clinico-

social nas populações em desenvolvimento (Oleastro & Ménard 2013), pois induz gastrite

crônica ativa, que pode evoluir para doenças gástricas mais severas, como gastrite atrófica,

úlcera péptica, carcinoma gástrico e linfomas de tecido linfoide associado à mucosa

(MALT) (Suerbaum & Michetti, 2002). Estas doenças cursam a partir das interações entre

o hábito de vida, os tipos de cepas albergadas pelos indivíduos e com os fatores genéticos

de predisposição à doença (Tham et al., 2001; Vinagre et al., 2013). Neste último caso, os

sistemas de grupos sanguíneos ABO e Lewis têm sido explorados com vista a definição de

um ou mais fenótipos que possam estar associados às doenças gástricas.

Neste estudo, a maioria dos pacientes investigada foi diagnosticada com

gastrite crônica, que variou de leve a acentuada intensidade, tanto no antro quanto no corpo

gástrico, isto permitiu afirmar que em torno de 93% dos pacientes estavam com pangastrite

crônica, com lesões histopatológicas que se distribuíram de forma semelhante nas duas

áreas do estômago dos indivíduos. Neste aspecto, as formas mais severas das gastrites

foram relacionadas à infecção pela H. pylori, que atingiu taxa de 56,48% pelo método de

Gram modificado por Hucker (1921) e de 59,26% pelo método molecular (PCR). Embora

estas proporções não tenham sido estatisticamente diferentes, é importante considerar que

o método de PCR é sensível e específico, pois permite a detecção da infeção pela espécie

H. pylori e ainda quando a densidade bacteriana é baixa na mucosa gástrica. Além disso, o

método molecular também permite avaliar o tipo de cepa albergada pelo paciente, ao

contrário do método de Gram modificado, que é inespecífico e baseado na visualização

morfológica e pela coloração azul intensa de bactérias íntegras presentes no epitélio

gástrico infectado. Esta exigência do método de Gram modificado pode aumentar a taxa de

casos falsos negativos ou falsos positivos, ainda que o microrganismo detectado esteja num

contexto histopatológico da infecção.

Estudos vêm demonstrando que o estômago humano apresenta uma

microbiota constituída por várias espécies de microrganismos (Bik et al., 2006), podendo

inclusive ser colonizado por mais de uma espécie do gênero Helicobacter. Penã et al.,

(2002) descreveram a presença da espécie similar a H. cinaedi no estômago de pacientes,

104

que apresentavam achados clínicos consistentes com a infecção pela H. pylori, entre estes,

a impressão endoscópica relacionada a gastrite erosiva e a análise histopatológica

associada com gastrite crônica de antro. Nakamura et al., (2007) também relacionaram a

presença de H. heilmannii, no estômago humano com resposta inflamatória, incluindo a

formação de folículo linfoide.

Então considerando o método molecular de diagnóstico avaliado neste

estudo, a frequência de infecção pela espécie H. pylori atingiu 59,29%, cuja prevalência

está de acordo com dados publicados por Souza et al., (2014), que detectaram uma

proporção de 69,2% desta infeção entre pacientes com faixa etária acima de 20 anos na

cidade de Belém. Outro estudo realizado, que também avaliou pacientes com gastrite

crônica provenientes das cidades de Belém e Bragança, demonstrou prevalências de 76% e

87%, respectivamente, nestas cidades (Junior et al., 2013). Resultados relativos a estudos

realizados em Belém-Pa, envolvendo pacientes com gastrite crônica e úlcera gástrica

relataram prevalências de 63,5% entre aqueles com gastrite crônica (Aguiar et al., 2002) e

de 93% entre aqueles com úlcera gástrica (Martins et al., 2002).

Trabalhos realizados no Brasil observaram uma variação na prevalência da

infecção pela H. pylori em diferentes capitais. Em Belo Horizonte (MG) a prevalência

observada foi de 81,7% em pacientes adultos (Oliveira et al., 1999), no Rio de Janeiro (RJ)

foi de 60% (Solaris et al., 1994) e em Botucatu (SP) de 85,18% (Ladeira et al., 2004).

Na América Latina as taxas de infecção entre indivíduos sintomáticos

podem variar de acordo com a região estudada, sendo que a infecção pela H. pylori em

adultos é quase sempre superior a 50%, podendo variar entre países e dentro deles,

dependendo da população e da área geográfica estudada. Em muitas regiões da América do

Sul, a prevalência da H. pylori é alta, afetando cerca de 70% da população que vive em

precárias condições de vida (Coelho & Coelho 2014). Porra et al., (2013) relataram

prevalências que variaram de 70,1 % a 84,7%, em adultos de seis países, Chile, Colômbia,

Honduras, Costa Rica, México e Nicarágua.

As taxas de infecção observadas neste estudo são altas quando comparadas

com outras regiões do mundo (Bures et al., 2012), apesar dos avanços no diagnóstico e

tratamento. Isto leva pressupor que os fatores de risco contextuais para a transmissão,

como hábito de vida, e a precariedade no saneamento básico, educação sanitária e moradia

adequada ainda favorecem os repetidos ciclos de aquisição e transmissão da H. pylori.

105

É consenso que a H. pylori ao colonizar o epitélio gástrico induz uma

resposta inflamatória na mucosa subjacente (Vaira et al., 2002). Nesta análise que

envolveu pacientes com gastrite crônica foi verificada associação significativa entre o

infiltrado inflamatório crônico, atividade neutrofilica e presença de folículo linfoide com a

presença de H. pylori. Correa & Piazuelo (2012) referem que a gastrite induzida pela H.

pylori é caracterizada na fase aguda da infecção pelo aumento do número de leucócitos

polimorfonucleares, com predomínio de neutrófilos na mucosa gástrica, que denota

atividade do processo inflamatório, podendo ser de leve a grave intensidade. No curso da

infecção, a lâmina própria é também infiltrada por leucócitos mononucleares, que

caracteriza a fase crônica da doença. Uma característica observada também na fase aguda

da gastrite associada à H. pylori é a presença de microabscessos, caracterizados pela

aglomeração de neutrófilos no lúmen glandular ou foveolar do epitélio gástrico. Outra

característica deste tipo de gastrite é a presença de agregados linfoides com centros

germinativos (Correa & Pizuelo 2012). Semelhante a este estudo, outras pesquisas que

avaliaram pacientes com gastrite e a infecção pela H. pylori também evidenciaram este

padrão de lesões histopatológicas na mucosa gástrica (Ermst et al.; 1997, Aguiar et al.;

2002).

Na infecção pela bactéria há um predomínio da resposta imunológica tipo

Th1 (Wroblewski et al., 2010), que conduz a ativação de leucócitos polimorfonucleares,

estas células secretam mediadores químicos, tais como citocinas pró-inflamatórias, que

amplificam a inflamação levando a produção de radicais livres, que embora inicialmente

sejam necessários para o combate da infecção, o longo tempo de exposição a eles pode

causar danos aos tecidos e células da mucosa gástrica e consequentemente levando à

transformação maligna (Tsuji et al., 2006).

As alterações inflamatórias podem persistir ao longo de todo o processo pré-

canceroso, mas a sua intensidade tende a diminuir à medida que o mecanismo avança. Na

infecção inicial a H. pylori tem como alvo a mucosa normal com glândulas gástricas bem

preservadas, mas o resultado desta infecção persistente pode levar a substituição do

epitélio gástrico pelo intestinal, como resposta primária a adaptação aos estímulos

inflamatórios de longa duração (Correa & Pizuelo 2012). Assim, neste estudo 13.88%

(30/216) dos pacientes foram diagnosticados com pelo menos um dos três tipos de lesões

pré-cancerosas, metaplasia intestinal, displasia e atrofia glandular, mas contraditoriamente

não foi associada à presença da H. pylori, uma explicação para isto seria o fato de que

106

nestas lesões pré-cancerosas ocorrem alterações do perfil carboidrático e enzimático,

característico das células epiteliais gástricas, que poderiam afetar a colonização da bactéria

no estômago, já que H. pylori utiliza para sua adesão estruturas carboidráticas de

especificidade de grupo sanguíneo (Borén et al., 1993) expressos nestas células e que

tendem a serem perdidas durante este estagio pré-maligno como a metaplasia intestinal

(Aguiar et al., 2002).

Deste modo, a transformação maligna segue o modelo epidemiológico da

causalidade, modulada pela interação de três conjuntos de fatores etiológicos: os ligados ao

agente infeccioso, a susceptibilidade genética do hospedeiro e os relacionados com o

ambiente externo (Correa & Pizuelo, 2012).

Assim, este estudo também avaliou a presença dos fatores de virulência da

H. pylori vacAm1s1, cagA, babA2 e sabA e suas relações com a severidade das alterações

histopatológicas diagnosticas no epitélio gástrico das pacientes analisados. As frequências

observadas destes marcadores foram de 79,69%, 66,4 0%, 49,21% e 89,84%

respectivamente.

A frequência observada do gene vacAm1s1 é similar as descritas em outros

estudos realizados em Belém (Junior et al., 2013) e outras regiões do Brasil (Ramis et al.,

(2010; Gonçalves et al., 2013). A frequência do gene cagA está de acordo com aquela

observada por Souza et al., (2014) que relataram a presença deste gene em 67.2% dos

pacientes com câncer gástrico. Em estudo realizado por Ghose et al., (2005) na Venezuela

foi descrito taxas do gene cagA que variaram de 48% a 83% em diferentes localidades.

Quanto ao gene babA2, suas frequências variam significativamente nas

populações do mundo. No Japão e China a frequência do gene atinge 84,9% e 79,8%,

respectivamente (Mizushima et al., 2001; Yu et al., 2002), ao contrário dos resultados

descritos na população da Itália (36%) (Zambon et al., 2003), Coreia (36,1%) (Kim et al.,

2001) e Bogotá- Colombia (48%) (Quiroga et al., 2005). Montealegre et al., (2010)

detectaram uma frequência de 12,7% de bactérias babA2 positivas entre pacientes

colombianos com gastrite e úlcera gástrica. No Brasil, a frequência do gene babA2 entre

pacientes com gastrite crônica residentes no Estado de Minas Gerais atingiu 31,57%

(Oliveira et al., 2003).

Varias hipóteses já foram levantadas para explicar essas diferenças na

frequência do gene babA2, uma delas se refere a variação no número de CT (citosina,

Timina) na extremidade 5’ do gene, o que poderia diminuir a avidez e a especificidades

107

dos iniciadores usados na PCR. Assim, para confirmar a verdadeira prevalência do gene

babA2 alguns autores (Styer et al., 2010; Ohno et al., 2011; Homan et al., 2014)

pesquisaram a presença deste gene usando diferentes pares de iniciadores, mas as

frequências não diferiram.

A outra hipótese afirma que a frequência do gene babA2 varia de acordo

com o tipo de doença gástrica e da população estudada (Sheu et al., 2010), onde a maior

frequência ocorre entre pacientes com úlcera péptica ou carcinoma gástrico, e a menor

frequência ocorrendo entre aqueles com gastrite crônica. Isto poderia explicar a frequência

de 49,25% deste gene observado entre os indivíduos deste estudo, cuja coorte constituiu

pacientes exclusivamente com gastrite crônica. Neste aspecto, é importante considerar que

a gastrite crônica pode ser o passo inicial para as doenças gástricas severas, pois somente

5% a 20% deste universo poderão evoluir para câncer ou úlcera péptica, o que poderia

concentrar o maior número de pacientes infectados com bactérias babA2+. Assim, o

diagnóstico molecular da H. pylori na gastrite crônica pode servir como uma boa

ferramenta prognóstica e de prevenção do câncer e úlcera péptica.

A alta frequência do gene sabA observada nesta pesquisa também já foi

verificada em outras investigação, como aquela descrita por Pakbaz et al., (2013) que

descreveram uma frequência de 83,33% deste gene entre pacientes com gastrite crônica no

Iran. Outros estudos mostraram frequências de 80%, 86%, 93% entre pacientes com

positividade para H. pylori em Taiwan, França e Alemanha, respectivamente (Sheu et al.,

2006; de Jorge et al., 2004; Lehours et al., 2004).

A associação dos genes cagA e vacAm1s1 na H. pylori tem sido descrita

como fator de alto risco para o desenvolvimento de doenças gástricas graves (Ramis et al.,

2010; Ferreira et al., 2012; Gonçalves et al., 2013). Este estudo encontrou, tanto no antro e

corpo gástrico, correlação positiva entre estes genes e associação de ambos com intenso

infiltrado inflamatório e atividade neutrofílica. Outros autores também já descreveram essa

associação em pacientes da mesma região geográfica (Junior et al., 2013, Souza et al 2014;

Martins et al., 2006) e em outras regiões do mundo. Chariani et al., (2009) relacionaram a

presença da variante vacAm1 em 82,7% de 26 pacientes italianos com gastrite crônica. A

citotoxina VacA induz necrose das células epiteliais da mucosa gástrica com consequente

ativação de moléculas proinflamatórias, sendo considerada uma toxina que induz à morte

celular e contribui na patogênese do câncer e ulceração gástrica (Radin et al., 2011).

108

Outro dado observado foi a correlação tanto do gene vacAm1s1 quanto do

gene cagA com a presença de lesões pré-cancerosas no antro gástrico como já mencionado

em vários outros estudos, que estes fatores de virulência da H. pylori são preditivos do

câncer gástrico. Um dos mecanismos que podem levar a transformação maligna diz

respeito à indução de radicais livres na mucosa gástrica, principalmente as espécies

reativas do oxigênio (ROS). Estas espécimes químicas já foram relacionadas com a

ativação de oncogenes e proliferação celular (Wiseman & Halliwell 1996; Obst et al.,

2000). Papa et al., (2002) relataram uma associação entre a alta produção de espécies

reativas do oxigênio na mucosa gástrica de pacientes com gastrite crônica e a presença de

H. pylori cagA+.

O gene cagA, também foi relacionado a presença de folículo linfoide na

mucosa do antro mas não do corpo gástrico, um estudo conduzido por Achyut et al., (2008)

também relacionaram a presença deste fator de virulência com a formação de folículo

linfoide. Embora os mecanismos de ativação e o papel do fator CagA na formação deste

achado inflamatório ainda não esteja esclarecido, é possível inferir que CagA, por ser uma

proteína altamente imunogênica, seria umas das proteínas responsáveis pela ativação da

resposta imunológica adaptativa nos indivíduos infectados por H. pylori, já que os folículos

linfoides são constituídos por linfócitos T reativos e linfócitos B ativados, os quais

modulam a resposta imunológica adaptativa.

A densidade de colonização pela H. pylori foi correlacionada, neste estudo,

com a presença de ambos os genes babA2 e sabA. Os produtos destes genes medeiam a

ligação da H. pylori no epitélio gástrico, através de estruturas carboidráticas presentes nas

células epiteliais do estômago, conferindo maior virulência a estas bactérias. A capacidade

da H. pylori se ligar a superfície das células gástricas é um passo essencial para

inicialização, estabelecimento e manutenção da infecção, já que a adesão permitirá a

formação do complexo proteico T4SS, entre a bactéria e a célula hospedeira, que serve

como um canal de liberação das proteínas CagA e VacA no citosol das células epiteliais

gástricas (Backert et al., 2011) , e desta forma as bactérias obtêm os nutrientes necessários

para a sobrevivência no estômago gástrico humano. Assim como neste estudo, outras

pesquisas também já relacionaram a presença do gene babA2 e de sabA com a densidade

bacteriana. Sheu et al., (2005) relacionaram a presença do gene babA2 com a alta

densidade de colonização pela H. pylori entre pacientes que expressavam o antígeno Leb

na mucosa gástrica. Em outro estudo Sheu et al., (2006) associaram a presença do gene

109

sabA a alta densidade de colonização pela H. pylori entre pacientes que tiveram fraca

expressão do antígeno Leb na mucosa gástrica.

Neste estudo, foi aplicado um modelo de análise matemática baseada no

Método Mudança de Base 4 para a base decimal, com a finalidade de gerar um índice de

lesão histopatológica, cujo valor assumido reflete a graduação dos vários achados

histopatológicos, mas de forma conjunta, e correlacionar com um índice (valor) de

combinação dos fatores de virulência, partindo do mesmo princípio acima mencionado.

Então os resultados desta análise revelaram uma correlação direta e significativa entre o

maior número de genes de virulência da H. pylori com o maior índice de lesão gástrica.

Isto levou a considerar que a presença combinada dos genes vacAm1s1/cagA+/babA2+/sabA

na H. pylori atua de forma sinérgica na promoção de lesões na mucosa gástrica.

Uma vantagem desta forma de análise é a de permitir verificar as

graduações e de forma combinada dos achados inflamatórios e da transformação maligna

(infiltrado inflamatório mononuclear, atividade neutrofílica, densidade de colonização pela

H. pylori, presença de metaplasia intestinal, presença de atrofia glandular e displasia

gástrica) nas diferentes áreas da mucosa gástrica, podendo quantificar e comparar os níveis

de alterações entre os pacientes, mesmo em um único espectro de doença gástrica, como a

gastrite crônica, e ainda possibilita a relação destas variações com os diferentes perfis das

bactérias infectantes presentes na mucosa gástrica. Outros estudos já relacionaram a

presença associada dos genes vacAm1s1/cagA+ /babA2+ na H. pylori com a severeridade

das doenças gástricas como câncer e úlcera gástrica, mas levando em consideração apenas

o tipo de doença ou analisado os achados inflamatórios na mucosa gástrica de forma

individual (Queiroz et al., 1998; Oliveira et al., 2003; Souza et al., 2014).

Este estudo, também avaliou a distribuição dos grupos sanguíneos ABO, Lewis e

o estado secretor ABH, entre pacientes com gastrite crônica infectados ou não pela H.

pylori, frente aquela descrita para a população de Belém. As distribuições dos fenótipos

ABO e Lewis, tanto de infectados como não infectados, não diferiram da população de

Belém, demonstrando que estes pacientes são representativos desta população.

Os nossos resultados revelaram que o número do genótipo Le /_ diferiu daquele

descrito para a população de Belém, evidenciando-se que o grupo de pacientes com o

genótipo Le/_ representavam mais do que três vezes o número de indivíduos com este

mesmo genótipo verificado entre os indivíduos da população de Belém. Além disto, os

pacientes que estavam infectados pela H. pylori estavam mais concentrados entre aqueles

110

com o genótipo Lewis funcional e contrariamente os não infectados estavam no grupo dos

que tinham os alelos Lewis mutante, que conferem ausência de expressão do antígeno Lea

e Leb no sangue, saliva e mucosa gástrica. Estes dados reforçam a importância dos

antígenos Leb na infecção pela H. pylori, pois eles revestem a mucosa oro-gastrointestinal

e compõem o muco secretório, aumentando o risco de infecção pela H. pylori pela via de

aderência BabA-Leb. Ilver e colaboradores (1998) descreveram que as especificidades

antigênicas O/Leb seriam os prováveis receptores da H. pylori, assim pessoas que

expressassem estes antígenos na mucosa gástrica teriam maior predisposição a esta

infecção e, consequentemente às doenças gástricas. Ikehara et al., (2001) também

descreveram uma associação positiva entre a taxa de infecção pela H. pylori e o número de

alelos Le e Se funcionais.

Tradicionalmente, a expressão dos antígenos Lewis tem sido determinada ao nível

eritrocitário, contudo como são primariamente histoantígenos de grupo sanguíneo, podem

ser acuradamente detectados nas secreções corporais como a saliva (Henry 2001; Marcus

& Cass 1969; Sneath 1955). Neste estudo, 80,79% dos pacientes mostraram positividades

para o antígeno Leb sangue e saliva. No sangue, 35,65% pacientes foram caracterizados

com fenótipo Lewis negativo no sangue, baseado na hemaglutinação convencional. Por

outro lado, 81,54% (53/65) das discrepâncias observadas entre os fenótipos Lewis foram

caracterizados como Lewis negativo nos eritrócitos, mas apresentavam os antígenos Lewis

na saliva, contradizendo os resultados da fenotipagem sanguínea.

Henry e colaboradores (1995) afirmam que a fenotipagem eritrocitária do sistema

de grupo sanguíneo Lewis pode ser influenciada por vários fatores. Sob certas condições

normais ou patológicas, a expressão dos antígenos Lewis pode ser inibida, pois eritrócitos

anteriormente fenotipados como positivos Le(a+b-) e/ou Le(a-b+) podem ser identificados

como Lewis negativos (Henry, 1996). Alterações destes antígenos já foram documentadas

em gestação, cânceres, hepatite crônica, cirrose hepática, pancreatite alcoólica e cistos

hidáticos (Hammar et al., 1981; Langkilde et al., 1991; Yazama et al., 1995; Makni et al.,

1987; Stingendal et al., 1984). Nesta investigação, a proporção de pacientes infectados pela

H. pylori não diferiu entre concordantes e discordantes, mas a associação dos fatores

genéticos com os ambientais podem alterar a expressão eritrocitária dos antígenos Lewis,

entre os genéticos está a ocorrência de mutações em ponto, que podem enfraquecer a

expressão da fucosiltransferase Lewis e reduzir a expressão dos antígenos Lea e Le

b em

seus portadores caracterizando-os como Le(a-b-), entre os ambientais estaria a própria

111

infecção pela H. pylori. Nossos dados revelaram que a discordância ocorreu mais

frequentemente quando os indivíduos eram portadores da infecção pela H. pylori e

pertenciam a grupos sanguíneos A/B.

Uma das explicações para os casos acima mencionados, de indivíduos do grupo A

e ou B não apresentem antígenos Lewis nos eritrócitos, seria a relação intrínseca da rota

biossintética dos antígenos ABH e Lewis, pois as glicosiltransferases A/B seriam mais

eficientes na competição pelo mesmo precursor H tipo 1 do que as fucosiltransferases,

levando a uma redução do antígeno Leb no sangue (Larson et al., 1999).

Outra possibilidade seria a própria a infecção pela H. pylori, que ao colonizar o

epitélio gástrico induz alterações morfológicas da mucosa levando a alteração nos padrões

de glicosilações, com redução da biodisponibilidade dos antígenos Lea e Le

b, que em

condições normais estes antígenos são produzidos pelo trato gastrointestinal e lançados no

plasma e adsorvidos nas hemácias (Henry et al., 1995), então a redução na

biodisponibilidade destes antígenos no plasma, assim como a competição entre as

glicosiltransferases e fucosiltranferases, resultaria nos fenótipos Lewis discrepantes.

Na análise da expressão dos antígenos A, B, H, Lea e Le

b na mucosa gástrica foi

possível verificar perda significativa destes oligossacarídeos em relação a detecção na

saliva, particularmente dos antígenos A/B, Lea e Le

b. Um dado também observado neste

estudo, foi a perda de antígenos H/Leb na presença de bactérias sabA+ e contrariamente

ganho de Lea na presença de bactérias vacAm1s1, cagA+ e sabA+. Estudos demonstram que

na inflamação crônica o antígeno Leb é fracamente expressado, bem como na atrofia

glandular e metaplasia intestinal (Sheu et al., 2005). Isto também foi verificado neste

estudo, onde se constatou que maior perda expressão de Leb ocorreu no infiltrado

inflamatório severo, na forte atividade neutrofílica, na alta densidade colonização pela H.

pylori e no alto nível de metaplasia intestinal. Aguiar et al., (2002) também descreveram

perda de expressão de antígeno Leb no epitélio foveolar e ganho de Lea nas áreas de forte

inflamação e de metaplasia intestinal em aproximadamente 20% da amostra de pacientes

com gastrite crônica. Muitos estudos tem demonstrado a relação dos marcadores de

virulência vacAm1s1 e cagA com a severidade inflamatória, o que poderia justificar a perda

de antígenos H e Leb na presença destes marcadores de virulência.

Por outro lado, o ganho de Lea relacionado a estes marcadores de virulência

também está associada a severidade das alteração gástricas. Torrado et al., (1992)

descreveram que indivíduos do fenótipo Le(a-b+) desenvolvem bloqueio na síntese do

112

antígeno Leb, resultando no acúmulo dos precursores e formação intensificada do antígeno

Lea em casos de metaplasia intestinal. Na rota biossintética o antígeno Lea pode ser

transformado em cadeias sializadas. Estudos realizados têm sugerido que os prováveis

receptores de bactérias sabA positivas são estruturas sinalizadas, entre elas o sialil-Lex e

Sialil-Lea (Yamaoka 2010; Madavi et al., 2002), o que justificaria a associação dos

maiores escores de expressão do antígeno Lea com a presença deste fator de virulência

observado neste estudo.

É importante considerar que a H. pylori é um microrganismo que apresenta uma

grande diversidade genética, que interagem de forma diferenciada com o hospedeiro

resultando no fenótipo da doença, por exemplo, cepas de H. pylori que apresentam o gene

babA e que usam os terminais H/Leb para se aderir ao epitélio gástrico foram mais

detectadas em pacientes com úlcera quando comparadas aqueles com gastrite crônica

(Gerhard et al., 1999). Neste estudo foi verificada uma tendência de associação entre o

fenótipo Le(a-b+) do sistema de grupo sanguíneo Lewis com a presença de expressão da

proteína babA2 da H. pylori, onde a proporção de pacientes que tinham bactérias com

expressão positiva representaram 88,38% versus 67,74% (p = 0.0606) daqueles que não

apresentavam expressão de babA2, provavelmente a ausência de significância estatística,

neste caso, deve-se ao pequeno número amostral de pacientes com H. pylori babA2

positivas. Aspholm-Hurtig et al., (2004) demonstraram que a adesina BabA de adapta aos

antígenos de grupo sanguíneo fucosilados mais prevalentes na população local. Na Europa

e Estados Unidos os grupos A, B e O são comuns e as cepas de H. pylori se ligam nestas

especificidades sendo, portanto designadas de generalistas. Contudo, em populações

indígenas da América do Sul, que apresentam unicamente o fenótipo O a H. pylori se liga

unicamente no determinante H tipo I sendo por isso chamada de especialista (Benktander

et al., 2012). Considerado esta questão, não foi verificado neste estudo uma tendência de

ligação de bactérias que apresentavam expressão de BabA2 em um determinante

específico. Provavelmente devido o efeito da composição genética da população de Belém,

que é formada por Portugueses (47%), africanos (23%) e ameríndios (30%), cuja estrutura

populacional reflete a distribuição dos fenótipos de grupo sanguíneo do sistema ABO

(Guerreiro et al., 1988), isto pode ter fixado da cepa generalista nesta cidade e refletindo

na amostra de pacientes aqui investigados.

Contudo, é importante esclarecer que embora a ligação preferencial da H. pylori

ao epitélio gástrico seja através da via babA2-Leb a ausência de expressão do gene BabA2

113

em aproximadamente 50% dos casos não afetaria a colonização gástrica pela H. pylori, já

que a aderência via receptores Leb não seria a única via de ligação da bactéria, outras

formas de adesão bacteriana têm sido descritas, entre elas o uso de outras proteínas de

membrana, que também podem atuar como ligantes, a exemplo da adesina AlpA, AlpB e a

M2 25000ª; colonização pela interação carboidrato-carboidrato; adesão através de epítopos

Lewis presentes no lipopolissacarídeo da bactéria, que se ligariam à estruturas de lectina

expressas na mucosa gástrica do hospedeiro (proteína surfactante D) (Karlstson et al.,

2000, Appelmelk & Vandenbroucke 2000).

Em conclusão, os dados desta pesquisa demonstraram que a presença do alelo

Lewis funcional confere maior risco de infecção pela H. pylori. E na dinâmica da

interação bactéria-hospedeiro a expressão dos antígenos Lewis podem ser alteradas tanto

ao nível eritrocitário e mucosal, através da modificação dos padrões de glicosilação que

foram relacionas a presença de H. pylori vacAm1s1, cagA+ e sabA+, concedendo maior

risco de transformação maligna no estômago. Assim, pode-se sugerir que a detecção de

bactérias virulentas ainda na fase de gastrite crônica e da avaliação dos padrões

imunohistoquímicos dos antígenos ABH e Lewis, seria uma valiosa ferramenta no

prognóstico e diagnóstico dos pacientes com maior risco de câncer e ulcera péptica.

114

5.0. CONCLUSÕES

A infecção pela bactéria H. pylori atingiu taxa de 59,26% entre os pacientes

avaliados, pelo método da reação em cadeia da polimerase (PCR).

A presença das lesões histopatológicas na mucosa gástrica foi associada com a

infecção pela de H. pylori, cujo risco relativo de apresentar na região do antro gástrico

infiltrado inflamatório, atividade neutrofílica, folículo linfoide e densidade bacteriana,

variou de 111.78 a 5.36. E no corpo gástrico, o risco variou de 118, 14 e 23 vezes de

apresentar infiltrado inflamatório, atividade neutrofílica e densidade de H. pylori.

As frequências independentes dos marcadores de virulência vacAm1s1, cagA, babA2,

e sabA da H. pylori, globalmente atingiram taxas de 79,69%, 66,40%, 49,21% e de

89,84%, respectivamente, contudo as distribuições de frequências destes marcadores de

virulência não diferiram entre as regiões do corpo e antro gástrico.

A análise individual dos fatores de virulência da H. pylori demonstrou correlação

da variante vacAm1s1 e do gene cagA com os achados inflamatórios, mas de forma

diferenciada entre as áreas do estômago dos pacientes analisados neste estudo. E

correlação dos fatores babA2 e sabA com a densidade de colonização pela H. pylori.

Este estudo revelou uma correlação direta entre o maior número de genes de

virulência da H. pylori com um maior índice de lesão histopatológica mucosa gástrica,

tanto de antro quanto de corpo, indicando que a associação entre estes genes atua de forma

sinérgica na promoção de lesões na mucosa gástrica.

A distribuição dos pacientes em função dos tipos de grupos sanguíneos ABO,

Lewis e estado secretor não diferiu daquela descrita para a população de Belém.

Neste estudo, 30,1% dos pacientes foi caracterizada com fenótipo Lewis

discordantes entre sangue e saliva, e destes 81,54% não tinha antígenos Lewis nos

eritrócitos. Esta discordância ocorreu mais frequentemente entre os indivíduos dos grupos

sanguíneos A/B e que eram portadores da infecção pela H. pylori.

115

As frequências dos SNP G428A no gene FUT2 e dos SNPs T59G e G428A

atingiram taxas de 29,30%, 19,53%, 19,53 % respectivamente, verificando-se que as

frequências genotípicas e alélicas estimadas para os loci FUT2 e FUT3 estão em equilíbrio

de Hardy-Weinberg nesta amostra de pacientes.

Os resultados revelaram que o número de pacientes com genótipo Le/_ foi maior

entre aqueles que estavam infectados pela H. pylori e contrariamente os não infectados

estavam no grupo dos que tinham os alelos Lewis mutante, revelando a importância deste

sistema na aquisição da infecção pela H. pylori.

A perda total e/ou o padrão anômalo de expressão imunohistoquímica do antígeno

Leb e ganho de Le

a foram relacionados às áreas de metaplasia intestinal e com graduação

forte dos achados inflamatórios.

O um padrão antagônico de expressão dos antígenos H, Leb e Le

a for de foi

verificado na presença do marcador de virulência sabA, com perda de expressão de H e Leb

e ganho do antígeno Lea, indicando que bactérias que apresentam estes marcador de

virulência podem estar usando estruturas de Sialil-Lea como molécula de ligação.

A expressão dos genes babA2 e sabA foi observada em 50,79% e em 33,33%,

respectivamente entre os pacientes que apresentaram H. pylori positivas para estes gene.

Sendo verificado uma tendência de associação entre o fenótipo Le(a-b+) do sistema de

grupo sanguíneo Lewis com a presença de expressão do gene babA2 da H. pylori.

A presença de expressão dos genes sabA foi relacionado com os maiores escores

de lesões pré-cancerosas detectadas na mucosa gástrica dos pacientes analisados neste

estudo.

116

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