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Detecção dos genes cdtA e cdtB em cepas toxigênicas de Clostridium difficile isoladas no Rio de Janeiro Rosane Ferro Trindade Rio de Janeiro 2009
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Detecção dos genes cdtA e cdtB em cepas toxigênicas de
Clostridium difficile isoladas no Rio de Janeiro
Rosane Ferro Trindade
Rio de Janeiro
2009
ROSANE FERRO TRINDADE
Aluna do curso de Biotecnologia
Matrícula 0623800250
Detecção dos genes cdtA e cdtB em cepas toxigênicas de
Clostridium difficile isoladas no Rio de Janeiro
Trabalho de Conclusão de Curso, TCC apresentado
ao curso de graduação em Biotecnologia, da UEZO
como partes dos requisitos para obtenção do grau de
Tecnólogo em Biotecnologia e realizado sob a
orientação da Prof(a) Eliane de Oliveira Ferreira
TRINDADE, Rosane Ferro
Detecção dos genes cdtA e cdtB em cepas toxigênicas de Clostridium difficile isoladas no Rio de Janeiro/ Rosane Ferro Trindade. – Rio de Janeiro, 2009.
viii. 39p
Trabalho de Conclusão de Curso: Tecnólogo em biotecnologia - Centro Universitário Estadual da Zona Oeste - (UEZO), Instituto de Microbiologia Professor Paulo de Góes.
Orientador: Eliane de Oliveira Ferreira
1.Clostridium difficile 2.Genes cdtA e cdtB 3.PCR 4.Rio de janeiro – I. Ferreira, Eliane de Oliveira. II. Centro Universitário Estadual da Zona Oeste, Curso de Graduação em Biotecnologia. III. Título
ii
Detecção dos genes cdtA e cdtB em cepas toxigênicas de
Clostridium difficile isoladas no Rio de Janeiro
Elaborado por Rosane Ferro Trindade
Aluna do curso de Biotecnologia da UEZO
Este trabalho de graduação foi analisado e aprovado com
Grau: 10,0
Rio de janeiro, 17 de dezembro de 2009
Eduardo de Matos Nogueira Membro, Doutor
Judith Liliana Lemos Membro, Doutor
Eliane de Oliveira Ferreira Presidente, Doutor
Rio de Janeiro – RJ, Brasil.
Dezembro de 2009
iii
Dedico esse trabalho ao meu amado, amigo
fiel, a pessoa do Espírito Santo de Deus e a
minha querida grande família.
iv
Agradecimentos
• Incansavelmente a pessoa mais importante na minha vida e que tenho mais
amor. Por ter enviado seu filho para o propósito de me dar vida e foi pela
sua graça que estou aqui hoje e pela mesma Ele tem me capacitado para o
agradá-lo e cada dia e fazer valer a sua palavra na minha vida. A pessoa do
Espírito Santo de Deus, que a cada dia tem me concedido força, sabedoria,
amor, e principalmente ensinamentos para todos os dias subir mais um
degrau de acordo com a sua vontade. Deus tem me proporcionado muito
mais de tudo àquilo que tenho pedido ou pensado. É o meu melhor amigo
quem quero estar perto todos os meus dias e quem merece todo o meu
louvor e adoração. Que o teu Reino venha e seja feita a tua vontade.
• A minha grande família, por todas as coisinhas que sô meus pais fazem por
mim Elias e Rosana, por toda a força e esforço que fazem para me criar
com muito prazer. Meus irmãos Eric e Enric que eu amo e pela paciência
de me deixaremeu ficar horas com o computador só pra mim e por sempre
me matarem de rir. As minhas tias (Rose, Dorinha e Angélica) e tios
(Natanael e Robson) por todas as orações e broncas e por todos momentos
de risos também. Aos meus primos Léo e Leandrão. Léo por me quebrar
vários “galhos” e por Leandro por me ajudar com todos outros problemas
dos outros. E ainda minhas primas (Alessandra e Andreza) que tive que
expulsar varias vezes do meu computador também. Amos essa Grande
família
• A professora Regina Maria e Eliane Ferreira que me acolheram no
laboratório de biologia de anaeróbios, nossa não caberia nesse trabalho
todas as ajudas por elas dadas, mais serei eternamente grata a essas
grandes mulheres. Agradeço a Deus por me permitir estar próximo de
pessoas de caráter as quais tenho muito respeito e admiração e grande
amizade. Gostaria também de agradecer a Dr Lili em particular por ter me
agüentado todas as vezes que chamei seu nome, foram muitas vezes. E a
todas tantas coisas, principalmente pelos ensinamentos e risadas. Não
poderia deixar de falar da Dr ilana grande amiga que não movia esforços
v
para me ajudar, nossa Ilana muito obrigado por todas as palavras de
incentivo e dicas e artigo e etc.
• Aos amigos do laboratório. Pela paciência do Joaquim por todas as
conversas com a Láis, todos os PCRs, analise de Gram, gel de agarose
tiradas de tubos da ultra centrifuga, das meninas ([Karlinha, Renatinha e],
Heide) etc. e por toda compreensão e carinho dada por todos, e é claro por
todos os momentos descontraídos com o Leandrinho, Felipe e a Natasha
querida e pela amizade e paciência da Mari e as caronas para o metrô. Ahh
é claro não posso me esquecer da Debrinha, Thais e Fabi que são ótima
companhia.
• A minha co-orientadora Dr. Jéssica, por todos os ensinamentos e ajuda e
por ser a responsável por me colocar em companhias de pessoas muito
importantes pra minha vida.
• Não poderia de deixar de agradecer a todas as pessoas que duvidaram,
que foram falsas comigo, que brigaram e que me disserem palavras de
ruins, que debocharam de mim, pois foi por todas essas dificuldades que
consegui terminar esse projeto. Não há vitória sem batalha.
• A minha turma que me proporcionou meus piores e melhores 3 anos da
minha vida, que contribuíram para aprimoramento da minha paciência.
Meus agradecimentos ao Vinny, Diego, Ramom, Laidson, Rômulo e Kayodé
afff. E as meninas Aline, Cyntia, Carol, Jéssica, minha companheira Letícia
que me ajudou muito para a realização desse projeto. E a todos os
funcionários da minha faculdade que me ajudam sempre. E a todos meus
professores.
• A todos meus amigos da igreja pessoas que torceram para que eu
terminasse e que compreenderam a minha ausência. A minha grande
amiga Amanda que tem sido amiga de todas as horas. Toda minha igreja a
meus pastores e pastoras que tem sido referencial para minha vida, e que
se dispuseram a viver pala causam de cristo e a cada dia nos servem a
palavra, maravilhosa de Deus.
• O meu MUITO OBRIGADO.
vi
Resumo
Clostridium difficile é uma bactéria anaeróbica na qual consiste de bactérias Gram-
positivas formadoras de esporos. Estes têm sido associados a casos de diarréia
por antibióticos (DAA) e colite pseudomembranosa (PMC). Entre os vários fatores
de virulência, as toxinas (A) enterotoxina e (B) citotoxina são os principais
determinantes de virulência dessa espécie. Algumas cepas também podem
produzir uma toxina binária CDT (ADP-ribotransferase), mas a participação real de
toxina presente no processo de infecção é ainda desconhecida. CDT é uma toxina
tipo AB e sua expressão está associada com os genes cdtA e cdtB, que
expressam duas subunidades independentes, o CDTA (componente enzimático) e
CDTB (componente de ligação). Ao longo dos anos, um aumento na incidência de
casos de CID (infecção associada a C. difficile) e PMC (colite
pseudomembranosa), em vários países, está relacionado com a rápida
disseminação da cepa hipervirulenta de C. difficile, caracterizada por eletroforese
em gel de campo pulsado (PFGE) e denominada NAP1. Esta cepa tem uma
deleção no gene que regula negativamente a expressão das toxinas A e B,
resultando em uma maior expressão e altos níveis de resistência a
antimicrobianos. Em um estudo anterior, nosso grupo isolou e caracterizou 21
cepas de C. difficile em fezes de pacientes sintomáticos e assintomáticos
relacionadas com a DAA e do ambiente do Instituto de Puericultura e Pediatria
Martagão Gesteira (IPPMG / UFRJ). Essas cepas foram consideradas toxigênicas
pela presença dos genes tcdA e tcdB. Por esse motivo, o objetivo deste estudo foi
a pesquisa para os genes cdtA e cdtB nessas cepas, usando a ferramenta de
PCR. Das 21 amostras analisadas, seis apresentaram somente o gene cdtA.
Novos primers foram desenhados para amplificar uma região diferente do gene
cdtB, com objetivo de confirmar a ausência do mesmo. Todos os fragmentos
amplificados foram seqüenciados para confirmar sua similaridade a partir dos
dados do Gene Bank em comparação com a seqüência genômica da cepa 630 de
C. difficile.
Palavras chave: Clostrifium difficile, PCR, toxina binária.
vii
Abstract
Clostridium difficile is an anaerobic bacteria consisting of Gram-positive spore-
forming. These microorganisms have been linked to cases of antibiotic-associated
diarrhea (AAD) and pseudomembranous colitis (PMC). Among several virulence
factors, the toxins A (enterotoxin) and B (citotoxin) are the major virulence
determinants of the species. Some strains can also produce a binary toxin CDT
(ADP- ribotransferase), but the real involvement of this toxin in the infectious
process is still unknown. CDT is an AB type toxin and its expression is associated
with cdtA and cdtB genes, which express two independent subunits, the CDTa
(enzymatic component) and CDTb (binding component). Over the years, an
increase in the incidence of case ratio of CID (infection associated to C. difficile)
and PMC (pseudomembranous colitis), in several countries, are related to the fast
spread of the hypervirulent strain of C. difficile, characterized by pulsed field gel
eletrophoresis (PFGE) and denominated NAP1. This strain has a deletion in the
gene that regulates negatively the expression of the A and B toxins, resulting in its
over expression and high levels of antimicrobials resistance. In a previous study,
our group isolated and characterized 21 strains of C. difficile from stools of
symptomatic and asymptomatic patients related to DAA and from the environment
of the Puericultura and Pediatria Martagão Gesteira Institute (IPPMG/UFRJ).
These strains were considered toxigenic because by PCR tcdA and tcdB genes
were detected. For that reason, the aim of this study was to search for the cdtA
and cdtB genes in those strains, using the PCR tool. Of the 21 strains analyzed, 6
presented only the cdtA gene. New primers were also designed to amplify a
different region of the cdtB gene, hence we could confirm the absence of the cdtB
gene. All the amplified fragments were sequenced to confirm its similarity to the
sequence from the Gene Bank data and compared to the genomic sequence of C.
difficile 630 strain.
Palavras chave: Clostrifium difficile, PCR, binary toxin.
viii
Índice
Lista de tabelas e figuras........................................................................................................vi Resumo.................................................................................................................................vii Abstract................................................................................................................................viii 1) Introdução...........................................................................................................................1
1.1) Bactérias anaeróbias....................................................................................................1 1.2) Clostridium difficile ....................................................................................................2 1.3) Fatores de virulência ...................................................................................................5
2) Objetivos ..........................................................................................................................10 2.1)Objetivos específicos..................................................................................................10
3) Metodologia .....................................................................................................................11 3.1) Cepas Bacterianas .....................................................................................................11 3.2) Condições de cultivo .................................................................................................11 3.3) Detecção dos genes cdtA e cdtB. ..............................................................................13
3.3.1 Extração de DNA cromossômico. .......................................................................13 3.3.2) Reação da polimerase em cadeia (PCR) ............................................................13 3.3.3) Eletroforese em gel de Agarose .........................................................................15 3.3.4) Purificação e sequenciamento ............................................................................15 3.3.5) Análise bioinformática .......................................................................................16
4) Resultados ........................................................................................................................17 4.1) analise eletroforética .............................................................................................17
4.2) Bioinformática...........................................................................................................19 4.3) Análise dos resultados...............................................................................................21
5) Conclusão..........................................................................................................................23 6) Referencias Bibliográficas................................................................................................24
ix
Lista de Figuras
Figura 1 - Locus Gênico da toxina da toxina binária. As setas indicam as regiões amplificadas pelos pares de primers utilizados em nosso estudo. Tais regiões são meramente ilustrativas. Fonte: Stare et al., 2007...................................................15 Figura 2 - Gel de agarose demonstrado a amplificação do gene cdtA para as cepas de C. difficile. Linha 1- 1Kb; linha 3- controle negativo; linha 4- NAP (controle positivo); linhas 5, 7, 8, 9, 10 e 11 – cepas positivas para o gene cdtA..19 Figura 3 - Gel de agarose demonstrando a amplificação da região da toxina binária com o par de nucleotídeos cdtAF e cdtBR1. Linha 1 - 1Kb; Linhas de 2-10 cepas positivas para o gene da toxina cdtA/cdtB; linha 12 Nap1 027 (controle positivo); linha 13- controle negativo......................................................................20
Lista de Tabelas Tabela1 : Cepas de Clostridium difficile utilizadas no estudo para análise da presença do gene da toxina binária........................................................................12
Tabela 2: Sequência de oligonucletídeos utilizados para a amplificação das sequências internas do gene da toxina binária......................................................14
Tabela 3 : Análise da presença do gene da toxina binária por PCR das cepas de C.difficile.................................................................................................................18
1
1) Introdução
1.1) Bactérias anaeróbias As bactérias anaeróbias são organismos incapazes de sobreviver na
presença do oxigênio molecular ou incapazes de se multiplicar na presença do
mesmo. Sua importância e papel têm sido evidenciados nos últimos anos por não
somente como patógenos, mas pelo fato de serem integrantes da microbiota
anfibiôntica normal humana e de animais. A maioria delas participa do
metabolismo desses organismos ao realizar a produção e elaboração de enzimas
e vitaminas essenciais, além de ajudar no metabolismo de certos polissacarídeos
(FERREIRA, DOMINGUES & UZEDA, 2003). No entanto, com o aprimoramento
de técnicas de identificação, as bactérias anaeróbias têm chamado a atenção por
sua importância na clinica médica humana e veterinária, pelo fato de causarem
infecções graves e freqüentemente fatais como abscessos (cerebral, pulmonar e
peritonial), bacteremia e septicemia (ENGELKIRK, 1992).
Seu maior predomínio é no trato gastrintestinal onde superam em número
as bactérias facultativas em até 1000:1, principalmente no cólon e podem ainda
estar presente em regiões como pele, cavidade oral e trato urogenital (FINEGOLD
& GEORGE, 1989). Os quadros infecciosos envolvendo esses microrganismos
acontecem normalmente por um desequilíbrio no sítio da colonização. Estes estão
relacionados principalmente com o uso indiscriminado de antimicrobianos e
processos invasivos (cirurgias e traumas), que facilitam a sua passagem da luz
intestinal para sítios extra-intestinais usualmente estéreis, levando ao
desenvolvimento de infecções ditas endógenas (FERREIRA, DOMINGUES &
UZEDA, 2003).
Devido à dificuldade relacionada ao isolamento e cultivo desses
organismos, sua identificação e associação com algumas infecções, ainda
permanecem negligenciadas. Contudo, é possível distinguir as principais bactérias
anaeróbias de interesse médico de acordo com suas características morfo-
tintoriais, por exemplo: bastonetes Gram-positivos esporulados (Clostridium spp.,
bastonetes Gram-positivos não esporulados (Actinomyces spp., Bifidobacterium
spp., Eubacterium spp., Lactobacillus spp., Propionibacterium spp.); cocos Gram-
2
positivos (Peptostreptococus spp., Peptococus spp.); bastonetes Gram-negativos
(Bacteroides spp., Fusobacterium spp., Porphyromonas spp., Protovella spp,
Bilophila spp.); cocos Gram-negativos (Veillonella spp.) (FERREIRA,
DOMINGUES & UZEDA, 2003).
Embora as bactérias do gênero Clostridium sejam caracterizadas pela
capacidade de produzir endosporos (estruturas de repouso formadas dentro da
célula bacteriana, que apresentam alto grau de resistência a fatores adversos),
outras esporulam apenas sob condições ambientais desfavoráveis (ENGELKIRK,
1992). Tal característica contribui não só para um tempo maior de sobrevivência
desse microrganismo no ambiente, mas também para um aumento na resistência
a antimicrobianos, o que dificulta o tratamento de uma infecção associada a este
gênero Bacteriano.
1.2) Clostridium difficile A espécie Clostridium difficile foi descrita pela primeira vez em 1935, como
componente da microbiota intestinal de neonatos saudáveis. Foi inicialmente
assim chamado devido à dificuldade dos pesquisadores de isolá-lo. A espécie foi
inicialmente classificada como sendo constituída de bacilos Gram-positivos,
formadores de endosporos , que produzem toxinas na forma vegetativa, e
susceptíveis a antimicrobianos (McDONALD, 2005). Por outro lado, na forma
esporulada, considerada um estado de dormência, a bactéria não produz toxinas,
mas se torna resistente à ação de antibióticos. No ano de 1970, C. difficile foi
identificado como o agente etiológico da colite pseudomembranosa (PMC), desde
então passou a ser associado a quadros de infecções humanas (BARLETT et al.,
1978). Entretanto, estudos têm relatado infecções por Clostridium difficile, CDI,
podem variar de colonização assintomática para uma ligeira diarréia e para
síndromes mais graves da doença, incluindo dor abdominal, febre e leucocitose.
Dentre as complicações estão às lesões inflamatórias com a formação
de pseudomembranas no cólon, sendo tal quadro denominado
de colite pseudomembranosa, megacólon tóxico ou perfuração intestinal, que
podem levar a sepse, seguido de choque e morte (RUPNIK et al., 2009).
3
C. difficile é um colonizador nato do ambiente e encontrado em abundância
em superfícies hospitalares contaminadas. A espécie tem sido descrita na
literatura como agente etiológico da diarréia nosocomial. Contudo, este conceito
está sendo revisado por pesquisadores, visto que houve um aumento no número
de casos de infecções na comunidade (McFARLAND et al., 2007). Em um estudo
realizado recentemente na França observou-se que 19% dos casos ocorridos no
período de 2000-2004 não foram adquiridos no ambiente hospitalar, e sim na
comunidade (BARBUT et al., 2007). Em outro estudo, desenvolvido no hospital
Veterans Administration Puget Sound Health Care System na cidade de Seattle
(Washington, EUA), foi relatado que 11% dos casos de DACD (diarréia associada
a Clostridium difficile) também haviam sido adquiridos na comunidade
(McFARLAND et al., 2007). No entanto, tem sido relatado que os casos adquiridos
na comunidade apresentam um perfil diferenciado, já que a maioria deles (45-
60%) não segue o padrão infeccioso hospitalar (DIAL et al., 2006; McFARLAND et
al., 2007; BAUER et al., 2008).
As infecções causadas por C. difficile estão associadas ao período de
hospitalização do paciente e a antibióticoterapia. Os pacientes mais idosos
apresentam maior risco, isso porque fazem maior uso de antibióticos. Contudo, o
aumento dos casos de CDI em jovens sem qualquer contato com ambiente
hospitalar e sem uso de antibióticos tem aumentado (RUPNIK et al., 2009). Dentre
estes antibióticos os associados à infecção são os de amplo espectro como:
clindamicina, penicilinas, cefalosporinas e principalmente fluoroquinolonas
(levofloxacina, moxifloxacina, gatifloxacina e ciprofloxacina) (SCHROEDER, 2005).
A partir de um desequilíbrio da microbiota normal estável e a aquisição dos
esporos de C. difficile, iniciam o processo de germinação em células vegetativas
no colón (local de ambiente propício) (KELLY, POTHOULAKIS & LAMONT, 1994).
Somente após o desequilíbrio ou ausência da microbiota haverá o
estabelecimento e proliferação do microrganismo patogênico (RUPNIK et al.,
2009). A região do lúmen intestinal quando em equilíbrio é caracterizado por
possuir um pH na faixa de 6,2 a 6,8 (EVANS et al., 1988), baixa tensão de
oxigênio (Bermudez, Petrofsky & Goodman, 1997), temperatura de 37oC,
4
concentrações de cálcio e magnésio de 5 e 2 mM, respectivamente (Tamura et al.,
1994) e níveis baixos de ferro livre (CONTE et al., 1994). A freqüência no uso de
antibióticos orais pode gerar desequilíbrios, tanto do ponto de vista biológico
quanto físico-químico, levando a um desequilíbrio neste sitio.
Dentre os inúmeros métodos de tipagem, tanto fenotípicos quanto
genotípicos, utilizados para análise das cepas isoladas alguns merecem destaque.
(RUPNIK et al., 2001). Dentre os principais métodos fenotípicos de tipagem,
encontram-se a sorotipagem (Delmée et al., 1985) e a análise do perfil protéico
por SDS-PAGE do inglês “sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel
electrophoresis” (DELMÉE, HOMEL & WAUTERS 1985). Dentre os métodos
genotípicos, os de maior destaque estão o PFGE, do inglês “pulsed field gel
electrophoresis” (Klaassen e Horrevorts, 2002), a ribotipagem do espaço
intergênico do rRNA 16S-23S (Stubbs et al., 1999) e a toxinotipagem (RUPNIK et
al., 1998).
A cepa conhecida como BI/NAP1 ou NAP1/027 tem contribuído para
diversos surtos ocorridos em várias regiões da América do Norte, Reino Unido,
Holanda, Bélgica e França. (Pepin et al., 2004; Loo et al., 2005; McDonalde et al.,
2005; Smith, 2005; Tachon et al., 2006). Ele foi identificado pela reação em cadeia
da polimerase como ribotipo 27 (CD027), por PFGE, do inglês “pulsed field gel
electrophoresis” como “North American pulse-field type 1 (NAP1)”, através da
análise de endonuclease de restrição (REA), como grupo de BI, e por
toxinotipagem como toxinotipo III. (OWENS et al., 2006). Além de alta resistência
às fluoroquinolonas, essa cepa epidêmica tem algumas características já
conhecidas, mas pouco comum entre isolados de C. difficile: genes para as
toxinas variante A (tcdA) e B (tcdB), a produção da toxina binária (CDT) e
deleções no gene tcdC (Stare et al., 2007) esta ultima freqüentemente encontrada
em cepas caracterizadas desse ribotipo. Essa deleção é conhecida do inglês
original como “frameshift mutation”, que ocorre no gene tcdC que é o regulador
negativo do “lócus” de patogenicidade PaLoc (Warny et al., 2005).
A crescente incidência no número de casos de CID transformou-se em uma
preocupação mundial, visto que em muitos países principalmente na Europa
5
(região de maiores surtos) os hospitais não possuem sistemas adequados para o
diagnóstico e tratamento da infecção. (RUPNIK et al., 2009). Além disso, o
trabalho de Borgmann et al., 2008, mostrou o grande número de infecções por
outros sorotipos não somente o ribotipo 027. Os mais comuns são o 001, 053 e
106. Além desses, o toxinotipo 078 que vem sendo associado a pacientes mais
jovens. Na Europa, devido ao rápido aumento do numero de casos, nem mesmo a
hipótese de uma infecção, tendo como via de transmissão alimentos, tem sido
descartada (RODRIGUES et al., 2007).
1.3) Fatores de virulência A produção dos fatores de virulência de C. difficile contribui para a ação e
atuação desse enteropatógeno no organismo hospedeiro. Alguns fatores
contribuem facilitando sua colonização, o que promove o desenvolvimento da
infecção. Outros contribuem diretamente com a infecção. Esses aspectos de
virulência foram confirmados por Delmée e Avesani, (1992) que mostraram que
sorotipos específicos eram mais virulentos.
A etapa de adesão é vista como um dos fatores iniciais para a colonização
e desenvolvimento de uma infecção causada por um determinado patógeno. Em
um estudo desenvolvido por Hartley e colaboradores (1979), os pesquisadores
relataram que a capacidade que a bactéria tem de aderir-se à superfície das
células é primordial para dar início à primeira etapa de colonização do intestino
(LANCET, 1977; CHENEY et al., 1980; BOEDEKER, 1982). Já um estudo de
Borriell e Honour, (1988) mostrou que cepas virulentas apresentam altos níveis de
adesão quando comparadas com as cepas fracamente virulentas e não virulentas.
Trabalhos realizados com culturas de células confirmam três pontos importantes
sobre a adesão: o microrganismo pode aderir em vários tipos celulares; essa
adesão é dependente de fatores ambientais; e que são mediadas por vários
componentes protéicos (WALIGORA et al., 1999, 2001). Nesse mesmo estudo foi
realizado a clonagem de um gene que codifica para proteínas da superfície de
C.difficile demonstrando que o aumento no nível de aderência do microrganismo
está relacionado com o nível de estresse ao qual este é submetido.
6
Borrielo & Hatt, (1998) e Bhatt & Borrielo, (1998) demonstraram que o muco
do intestino de diferentes animais e seres humanos serve como um quimioatrativo
para C. difficile, e que o grau de quimiotaxia atua positivamente para com as
cepas virulentas examinadas em modelos animais como o hamster. Para que o
microrganismo desenvolva o mecanismo de quimiotaxia é necessário que ele
exerça motilidade. Relacionados a isso temos o estudo que comprova a existência
de flagelos na estrutura das células de C.difficile. (DODSON & BARC, 1998).
Ainda existem poucos estudos relacionados com a produção de enzimas
hidrolíticas por C. difficile, devido a sua produção estar pouco elucidada, por outro
lado acredita-se que auxiliem no processo da patogênese do mesmo. Estudos
realizados de acordo com a classificação virulenta de cada cepa mostraram que
as principais enzimas produzidas por esses microrganismos são a heparinase,
condroitina-4-sulfatase, hialuronidase e ainda, colagenase (BORRIELO et al.,
2004).
Além dos fatores de virulência de C. difficile, mencionadas anteriormente,
talvez o principal e mais estudado sejam as toxinas produzidas por algumas
cepas. C. difficile produz duas principais toxinas, toxina A (TcdA) e toxina B
(TcdB), estas encontram-se no “locus” de patogenecidade PaLoc (19.6 Kb), que é
composto por cinco genes tcdD, tcdB, tcdE, tcdA, tcdC. (MACDONALD et al.,
2005). TcdA e TcdB pertencem a um grupo de toxinas clostridiais de alto peso
molecular (TCLs), que inclui TcsL e TcsH de
Clostridium sordellii, TcnA de Clostridium novyi e TcpI de Clostridium perfringens
tipos B e C. TCL são proteínas de cadeia única com três principais
domínios funcionais: um domínio de ligação amino-terminal com característica
repetidas, um domínio catalítico carboxi-terminal e um
domínio de translocação putativo (RUPNIK et al., 2009). Estudos realizados por
Akerlund e colaboradores (2008) mostraram que o nível de esporulação é
inversamente proporcional ao nível de produção de toxinas. As toxinas A e B são
citotóxicas e ambas são responsáveis pelos sintomas da infecção que são
produzidos somente durante a fase vegetativa do patógeno. Elas causam o
rompimento do citoesqueleto de actina e das junções do tipo tight, resultando na
7
diminuição da resistência transepitelial, acúmulo de fluido e destruição do epitélio
intestinal. (RUPNIK et al., 2009). Os genes específicos para as toxinas A e B são
tcdA e tcdB, ambos já foram seqüenciados e as massas moleculares de suas
proteínas estimadas nos valores de 308 kDa e 269 kDa respectivamente.
(BARROSO et al., 1990; DOVE et al.,). Além disso, ambas toxinas são
responsáveis pelos primeiros sintomas que precedem a PMC, e após sua ação
acontece à ativação de macrófagos, que é seguida pela liberação de mediadores
inflamatórios aumentando a permeabilidade e secreção de fluidos e
conseqüentemente acarretando a diarréia (Rolfe, 1991).
Estudos de Barbut e colaboradores (1996) constataram que as toxinas
perturbam o citoesqueleto de actina de células epiteliais do intestino por meio de
UDP-glicose-dependente, sendo assim capazes de monoglicosilar proteínas Rho e
Ras, pertencentes à família de GTPases de baixo peso molecular. Não se sabe ao
certo o mecanismo real provocado por essa glicosilação, mas de acordo com
trabalhos desenvolvidos por Giry e colaboradores (1996), esse efeito foi
relacionado em parte com a transdução de sinal. Os autores chamam a atenção
para a glicosilação que além de inativar várias atividades biológicas de moléculas
específicas, pode ainda intermediar eventos celulares produzidos por toxinas
bacterianas. Acredita-se ainda que os mecanismos de apoptose, alterações do
citoesqueleto e inibição da fosfolipase D provocados pelas toxinas A e B são
dependentes da inativação de proteínas Rho e Ras (JUST et al., 1995). Ensaios
de citotoxicidade em culturas de células Vero mostraram que as toxinas do C.
difficile, especialmente a toxina B, causam arredondamento celular (ALCIDES et
al., 2003). Essas mudanças morfológicas, geralmente, são irreversíveis e inibem a
divisão celular. Estudos de FIORENTINI et al., 1991 apontam para a atividade
antiproliferativa dessas toxinas. As toxinas A e B podem agir sinergicamente
(Lyerly et al., 1985), e testes realizados in vitro com células do epitélio humano
confirmaram que a toxina B é mais prejudicial que toxina A, já que causa necrose
da mucosa e diminuição na função da barreira epitelial (RIEGLER e
COLABORADORES 1993). A detecção da expressão gênica que leva a formação
8
dessas toxinas pode ser realizada a partir de Reação da Polimerase em Cadeia
(Polymerase chain Reaction - PCR). (GUIBAULT, 2002).
Além da produção de toxinas A e B, algumas cepas de C. difficile podem
produzir uma terceira toxina chamada toxina binária CDT (ADP-ribosiltransferase
especifico para actina) que foi inicialmente descrita em 1988, (POPOFF et al.,
1988). Essa toxina é codificada por dois genes cdtA e cdtB constituída de dois
canais de proteínas independentes CDTa (componente enzimático) e CDTb
(componente de ligação), (PERELLE et al., 1997). Trabalhos realizados por
Wegner e colaboradores (2001) mostraram que o componente de ligação tem o
papel de reconhecer os receptores da superfície celular atraindo o componente
enzimático que se dirige para o citosol o qual catalisa a ADP-ribosilação dos
monômeros de actina. O trabalho de Glen e colaboradores (2007) mostra a
organização gênica dessas toxinas, enfatizando que os genes para as toxinas
CdtA e CdtB encontran-se em um região distinta do PaLoc e que a produção da
toxina binária é positivamente regulada pelo CdtR, um regulador da familia LytTR.
Entretanto, o papel na patogenicidade do microrganismo e a relevância clínica da
produção de toxina binária, associada a infecções humanas, ainda é pouco
conhecido. Nos últimos anos, inúmeros casos de infecções associadas a esse
microrganismo vêm aumentando nos EUA e Canadá (Loo et al., 2005), e esse
aumento vem sendo relacionado com a rápida propagação de um clone específico
de C.difficile pertencentes ao PCR ribotipo 027 ou pulsotipo NAP1 (North
American Pulsotype), (WARNY et al.,l 2005). Esse ribotipo foi caracterizado por
apresentar uma mutação que é conhecida do inglês original como “frameshift
mutation”, tal mutação ocorre no gene tcdC que é o regulador negativo do “lócus”
de patogenecidade PaLoc com 19.6 Kb (composto por cinco genes tcdD, tcdB,
tcdE, tcdA, tcdC) região que compõe os genes para toxinas A e B (MACDONALD
et al., 2005). As conseqüências dessa mutação são a superexpressão de TcdA e
TcdB, produção de toxina binária (CDT), maior esporulação em menos tempo,
maior capacidade de adesão e resistência a novos antimicrobianos
(principalmente quinolonas) (RUPNIK et al., 2009). Portanto a nova cepa BI/NAP1
de C. difficile parece ser uma exceção à regra de que o tipo da cepa não prediz a
9
gravidade da DACD. Um estudo realizado nos EUA associou o aumento das
colectomias a casos fulminantes ocasionados por dada cepa (McDONALD et al.,
2005). No entanto, ainda não foi definido se o aumento aparente da gravidade dos
casos de DACD causados pela cepa BI/NAP1 é decorrente do aumento da
produção das toxinas A e B, da presença da toxina binária, da resistência a
fluoroquinolonas ou outro fator de virulência ainda não descrito (LOO et al., 2005;
McDONALD et al., 2005; WARNY et al., 2005).
No Brasil, poucos estudos relatam a importância do C. difficile como agente
de infecções graves (ALCIDES et al., 2007). No entanto, um estudo desenvolvido
recentemente (ALCIDES et al., 2007) analisou cepas de C. difficile isoladas de
crianças com diarréia, crianças saudáveis e ambientes hospitalares (total de 39
isolados), a fim de caracterizá-las geneticamente. Cepas hipertoxigênicas de C.
difficile ainda não foram descritas no Brasil (BALASSIANO et al., 2009). No
entanto, como um país em desenvolvimento, no qual a automedicação é um ato
comum, o impacto de doenças associadas a C. difficile é de grande relevância,
uma vez que tal fato pode propiciar a seleção de cepas cada vez mais resistentes
e mais virulentas, como uma cepa hipertoxigênica. A este fato se associa a
possibilidade de disseminação da bactéria no ambiente hospitalar. Assim sendo,
estudos que avaliem a detecção dos genes relacionados à produção de toxina
binária em cepas brasileiras mostram-se interessantes. Essas análises podem
revelar e iminência de cepas hipertoxigênicas, além de semelhanças ou diferenças
importantes entre as mesmas, evidenciando novos parâmetros de estudo com
relação a toxigenicidade de C. difficile no Brasil.
10
2) Objetivos Dessa forma, este trabalho tem como objetivo avaliar a presença dos genes
cdtA e cdtB em cepas de C. difficile isoladas no Rio de Janeiro, utilizando a
técnica da Reação da Polimerase em Cadeia (PCR).
2.1)Objetivos específicos a) detectar a presença dos genes cdtA e cdtB em cepas toxigênicas de C. difficile.
b) comparar as seqüências dessas cepas tixigênicas detectadas por PCR com as
seqüências depositadas no GenBank.
c) verificar a real ausência ou não do gene cdtB.
11
3) Metodologia
3.1) Cepas Bacterianas Foram utilizadas um total de 21 cepas de C. difficile pertencentes a Coleção
de Cultura do Laboratório de Biologia de Anaeróbios do Instituto de Microbiologia
Professor Paulo de Góes da Universidade Federal do Rio de Janeiro (Tabela 1). A
cepa hipervitulenta NAP1/027 foi gentilmente cedida pela Dr. Angela Thompson,
do Centers for Disease Control –CDC (Atlanta, EUA) e usada como controle
positivo em todas as reações de PCR e C. perfringens, como controle negativo.
3.2) Condições de cultivo As amostras foram reativadas em caldo BHI (“Brain Heart Infusion”– Dfico)
–PRAS (“Pre-Reduced Anaerobically Sterilized”) a partir de estoque em BHI-ágar
inclinado, sendo incubadas por 24h a 37ºC. Critérios de viabilidade e pureza foram
utilizados, após semeadura em placas de ágar sangue suplementadas (ASS) com
vitamina K (10 µg/mL, Sigma) e hemina (5 µg/mL, Sigma). Após o período de
incubação, em ambiente de anaerobiose (80% de N2, 10% de H2 e 10% de CO2)
por 48h a 37oC, as colônias foram repicadas para um novo caldo de BHI-PRAS,
para avaliação morfo-tintorial pelo método de Gram e um teste respiratório
realizada para confirmar a pureza das amostras (JOUSIMIES-SOMER et al., 2002;
FERREIRA, DOMINGUES & UZEDA, 2003).
12
Tabela1 : Cepas de Clostridium difficile utilizadas no estudo para análise da
presença do gene da toxina binária.
Amostras Origem das cepas bacterianas.
Sob o uso de antibiótico
Ipn6.1
Ipn6.2
Ipn6.3
Ipn6.4
Ipd3.1
Ipd3.2
Ipd3.3
12Lin-5
Ipn4.2
Ipn4.3
Ipn4.4
Ipn4.5
NP22
NP32
8LS-3
FN6
FN30
12 LE-1
12LE-3
Amb13.1
Amb13.3
Amb13.4
Amb 13.5
Pacientes do IPPMGa
Pacientes de fora do
IPPMGa 2
Crianças saudáveis
Amostras ambientais
Simb
Simb
Simb
Simb
Simb
Simb
Simb
Nãob
Não
Não
Não
Não
Sim
Sim
Não
Não
Não
Não
Não
-
-
-
- a IPPMG- Instituto Pediátrico Prof. Martagão Gesteira; b uso de drogas quimioterápicas.
13
3.3) Detecção dos genes cdtA e cdtB.
3.3.1 Extração de DNA cromossômico. O crescimento bacteriano foi obtido a partir de cultura incubada por 24h em
caldo BHI-PRAS ou de colônias obtidas de placas de ASS (JOUSIMIES-SOMER
et al., 2002; FERREIRA, DOMINGUES & UZEDA, 2003). O DNA foi extraído como
descrito por Pitcher, Saunders & Owen (1989). Brevemente, as células
bacterianas foram ressuspensas em 500µL de tampão TE (10mM de Tris-HCl -
1mM/1 EDTA; pH 8,0; Sigma). Posteriormente, as células foram lisadas em 100µL
de solução de lise (50mM glicose; 25mM Tris/Hcl pH 8,0 10mM EDTA; 2mg de
lisozima) e incubadas no gelo por 10mim. Após o período de incubação, 50µL da
solução de isotiocianato de guanidina 5M foram adicionados (Gibco BRL – Life
Technologies). As suspensões celulares foram agitadas manualmente e incubadas
à temperatura ambiente (TA) por 5 a 10min. Os lisados foram então resfriados
adicionados de 250µL de acetato de amônio (Vetec) a 7,5 M, e após terem sido
agitados incubandos por 10min no gelo. Uma solução de 500µL de
clorofórmio/álcool isoamílico (24:1 v/v - Vetec) foi adicionada e a mistura agitada
com o uso de um Vórtex. Em seguida, foi realizada centrifugação por 10min a
13000 xg. A fase aquosa foi transferida para um novo tubo no qual foi adicionado
isopropanol (Vetec) gelado numa proporção de 0,54 vezes o volume final dos
tubos, ou seja, aproximadamente 430µL. Os tubos foram, então, invertidos por
1min para misturar as soluções. O precipitado fibroso de DNA foi depositado no
fundo do tubo por centrifugação a 7000 xg por 20s. O sedimento de DNA foi então
lavado 5 vezes com etanol (Vetec) 70%. Os tubos permaneceram abertos à
temperatura ambiente para a evaporação do etanol. Finalmente, os sedimentos
foram diluídos em 50µL de tampão TE [TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA, 1 mM) pH
8,0].
3.3.2) Reação da polimerase em cadeia (PCR) Para a amplificação de uma região específica dos genes cdtA e cdtB,
oligonucleotídeos (Tabela 2) descritos por Stubbs e colaboradores, (1999) foram
14
confeccionados. As concentrações dos reagentes que foram utilizados para a
reação de PCR foram: tampão da Taq polimerase; MgCl2 a um 1,5 mM; dNTPs a
0,2mM; oligonucleotídeos a 0,4 mM; 0,5µL de taq polimerase 5U e 5µL de DNA
para um volume final de 25µl. Controles positivo (C. difficile NAP1/027) e negativo
(C. perfringens) foram incluídos em todas as reações. A amplificação das regiões
internas dos genes foi feita em um termociclador (Gene Amp PCR System 9700,
PE Applied Biosystems, USA). Os ciclos utilizados foram: 1x de 94ºC por 5 min
(desnaturação inicial), seguidos por 30 ciclos de 94ºC por 45 s, de 52ºC por 1 mim
e etapa de extensão de 72ºC por 1 min e 20s. A etapa da extensão final foi de
72ºC por 7 min. No entanto para os primers cdtAF e cdtBR1* a programação
realizada foi praticamente a mesma com exceção da etapa de anelamento 47,4ºC
por 0,30s e a etapa de extensão 72ºC por 3 min.
Tabela 2: Sequência de oligonucletídeos utilizados para a amplificação das
sequências internas do gene da toxina binária.
primers Sequência (5’ 3’) Região de
amplificação
Produto da
amplificação
(pb)
CDTAF TGAACCTGGAAAAGGTGATG cdtAf
CDTAR GTTTACCAGGTCATTTTAGGA cdtAr
353pb
CDTBF CTTATTGCAAGTAAATACTGAG cdtBf
CDTBR CTGACTTCGTTCTCTTAGGCCA cdtBr
490pb
CDTBR1 CGGATCTCTTGCTTCAGTCTT cbtBr*
* Este oligonucleotídeo foi confeccionado para que confirmássemos a presença ou ausência do
gene cdtB da toxina binária. Ele amplifica uma região distinta do oligonucleotídeo CDTBR.
15
Figura 1 - Locus Gênico da toxina da toxina binária. As setas indicam as regiões amplificadas pelos pares de primers utilizados em nosso estudo. Tais regiões são meramente ilustrativas. Fonte: Stare et al., 2007.
3.3.3) Eletroforese em gel de Agarose Os produtos de amplificação foram visualizados após serem aplicados num
gel de agarose de 0,7% no tampão de corrida TBE 1x (89 mM de Tris – Sigma, 89
mM de ácido bórico - Vetec, 2mM de EDTA - Sigma, pH 8,25) com 100V por cerca
de 1 h. Após a eletroforese o gel foi corado com uma solução de brometo de
etídeo, por cerca de 10 minutos.
3.3.4) Purificação e sequenciamento Os produtos da PCR foram purificados utilizando o kit comercial GFX PCR
DNA and Gel Band Purification Kit (GE Healthcare Biosciences, Little Chalfont
Buckinghamshire, UK) de acordo com o manual do fabricante. Foram aplicados
500µL de tampão de captura e 100µL do produto da PCR em uma mini coluna.
Após homogeneização suave, a mistura foi centrifugada a 13000 xg por 30s. O
material não retido pela coluna foi descartado e, após a adição de 500 µL de
tampão de lavagem, o material foi novamente centrifugado a 13000 xg por 30s. A
minicoluna foi então transferida para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e 50
µL de tampão de eluição foram adicionados [TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA, 1 mM)
pH 8,0]. Após uma incubação de 1 min a TA a uma nova centrifugação Fo feita a
353 pb 490 pb
1500pb
16
13000 xg por 1 min. O microtubo contendo o DNA purificado foi armazenado a -
20º C.
Após a purificação, as amostras de DNA e uma alíquota dos iniciadores
foram enviadas para o Centro de Estudo do Genoma Humano, no Instituto de
Biociência, na Universidade de São Paulo para o sequenciamento.
3.3.5) Análise bioinformática Após o resultado do seqüenciamento, um alinhamento com as sequências
das toxinas binária depositadas no banco de dados
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/genom_table.cgi) disponível no site do PubMed
foi realizado.
17
4) Resultados
4.1) analise eletroforética Do total de 21 amostras analisadas, 6 foram positivas apenas pra o gene
cdtA (Tabela 3). No entanto, em nenhuma das cepas analisadas foi possível
detectar a presença de bandas correspondentes à amplificação do gene cdtB, nem
mesmo com a utilização dos primers cdtBF e cdtBR1. Os primers utilizados para
essa região foram desenhados para região interna do gene. As amostras
apresentaram uma banda de aproximadamente a 350 pb inclusive a cepa controle
(Figura 1). Todas as amostras positivas para o gene cdtA foram caracterizadas
pelo nosso grupo anteriormente como negativas para as toxinas clostridiais TcdA e
TcdB (ALCIDES et.,al 2007).
Já para os resultados obtidos com os iniciadores desenhados para
amplificarem uma região mais extensa, foram obtidas a amplificação de 12
amostras com bandas de aproximadamente 500 pb (Figura 2). Entretanto a cepa
NAP1 usada como controle positivo, apresentou amplificação de
aproximadamente 1500pb.
18
Tabela 3 : Análise da presença do gene da toxina binária por PCR das cepas de
C.difficile.
Perfil toxigênico Amostras Origem das cepas bacterianas.
Sob o uso de antibiótico
tcdA tcdB cdtA cdtB
Ipn6.1
Ipn6.2
Ipn6.3
Ipn6.4
Ipd3.1
Ipd3.2
Ipd3.3
12Lin-5
Ipn4.2
Ipn4.3
Ipn4.4
Ipn4.5
NP22
NP32
8LS-3
FN6
FN30
12 LE-1
12LE-3
Amb13.1
Amb13.3
Amb13.4
Amb 13.5
CDADab
Fezes normaisa
Diarréiab
Fezes normaisc
-
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Não
Não
Não
Não
Não
Sim
Sim
Não
Não
Não
Não
-
-
-
-
+
+
+
+
+
-
-
+
-
-
-
-
+
+
-
+
+
+
-
-
-
-
+
+
+
+
+
+
-
-
+
-
-
-
-
+
+
-
+
+
+
-
-
-
-
+
-
-
-
-
-
+
+
-
+
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
+
-
-
19
a Pacientes do IPPMG- Instituto Pediátrico Prof. Martagão Gesteira; b Paciente de fora do IPPMG; c Crianças saudáveis.
4.2) Bioinformática O BLAST com a seqüência para toxina binária comprovou uma similaridade de
100% para o gene cdtA da cepa C. difficile 630 e 100% para o gene da cepa 196
(Gene bank: www.ncbi.nlm.nih.gov).
500 pb →→→→→→→→
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 11
Figura 2: Gel de agarose demonstrado a amplificação do gene cdtA para as cepas de C. difficile. Linha 1- 1Kb; linha 3- controle negativo; linha 4- NAP (controle positivo); linhas 5, 7, 8, 9, 10 e 11 – cepas positivas para o gene cdtA
20
Figura 3: Gel de agarose demonstrando a amplificação da região da toxina binária com o par de nucleotídeos cdtAF e cdtBR1. Linha 1 - 1Kb; Linhas de 2-10 cepas positivas para o gene da toxina cdtA/cdtB; linha 12 Nap1 027 (controle positivo); linha 13- controle negativo.
500pb
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
21
4.3) Análise dos resultados A cepa epidêmica caracterizada pelo pulsotipo NAP1 (North American
Pulsotype) tem sido constantemente associada a surtos de doenças relacionadas
à C. difficile em diversas partes do Mundo desde 2001, (MACDONALD et al.,
2005). No entanto, até o presente momento não foram identificados trabalhos que
destaquem a presença de cepas com o mesmo perfil toxigênico no Brasil. Assim,
com o intuito de realizarmos a identificação de um desses perfis (expressão de
genes para toxina binária), nosso estudo realizou a identificação de 6 cepas
positivas apenas para o gene da toxina cdtA. Pelo fato de normalmente as cepas
cdtA positivas serem também cdtB positivas, já que os genes estão localizados em
uma mesmo locus gênico, consideramos estranho o fato de que algumas cepas
fossem apenas cdtA positivas (PERELLE et al., 1997). Especulamos até mesmo,
que talvez essas cepas pudessem ter uma outra função para a proteína cdtA, que
não fosse o de caráter toxinênico. Todavia, para verificar a fidelidade dos primes
usados realizamos o alinhamento dos mesmos na sequência dos genes cdtA e
cdtB depositada no Gen Bank e, para nossa surpresa um dos primers, o CDTBR,
utilizado para a amplificação da região do gene cdtB não alinhava com a
sequência gênica depositada no banco de dados do Gene Bank. Para tanto,
através da mesma sequência confeccionamos um novo primer, denominado
CDTB R1 para confirmamos se as cepas cdtA positivas eram mesmo cdtB
negativas. No entanto, mesmo temos trocado o primer reverse, nossas amostras
ainda eram negativas para o gene cdtB.
Resolvemos então utilizarmos uma outra abordagem, onde nós utilizamos
os primers, CDTAF e o CDTBR1. Para nossa surpresa, quando comparamos o
produto da amplificação das nossas amostras com o controle positivo das nossas
reações, a NAP1, existia uma diferença de pelo menos 500pb entre eles. Desta
forma, podemos especular que talvez as nossas amostras apresentem uma
deleção no gene cdtB, sendo este o mesmo local onde o primer CDTBR deveria
anelar. Ainda não podemos afirmar se esta deleção causaria algum impacto no
fenótipo dessas cepas quanto a produção da toxina binária, já que não dispomos
do teste enzimático do inglês ADP-ribosyltransferase assay, Stubbs et al ., (2000),
22
em nosso laboratório. Contudo, os produtos da PCR foram enviados para
seqüenciamento e esperamos confirmar se a região amplificada no gel pelo par de
primers CDTAF e CDTBR1 possui similaridade com a cepa CDT positiva 196, que
apresenta sua sequência gênica depositada no Gene Bank ou se nossas cepas
são semelhantes à cepa mutada 630 CDT negativa, também depositada nesse
mesmo banco de dados.
23
5) Conclusão 1. Neste estudo foi analisada uma pesquisa dos genes da toxina binária em 21
amostras de C. difficile isoladas de diferentes origens. Seis amostras foram
positivas apenas para o gene cdtA. 2. Um novo primer, CDTBR1, foi utilizado com o CDTAF para amplificação de
outra região do gene cdtB, este foi confeccionado para confirmássemos a sua
ausência. 3. Maiores investigações são necessárias para verificar se nossas cepas
possuem o mesmo perfil toxigenico que a capa mundialmente conhecida
NAP1/027. 4. Aguardamos o resultado do sequenciamento dos amplicons para os primers
CDTAF e CDTBR1 confirmar o mesmo. Serão necessários mais estudos que
testifiquem a função desse componente em nossas cepas com o fim de trazer
a tona o real papel toxigenico dessa toxina em cepas virulentas de c. difficile.
24
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