Roteiro de preenchimento para o PAPES V · Brasil. Diversos pesquisadores no mundo tem buscado...

Universidade Federal de Ouro Preto

Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas

Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia

Danielle Rodrigues de Amorim

IMUNOGENICIDADE DE TRÊS FRAÇÕES ANTIGÊNICAS DE LEISHMANIA

AMAZONENSIS COMO CANDIDATOS VACINAIS AVALIADOS EM

HAMSTER CONTRA LEISHMANIOSE VISCERAL

Ouro Preto, MG

2015

II

Danielle Rodrigues de Amorim

IMUNOGENICIDADE DE TRÊS FRAÇÕES ANTIGÊNICAS DE LEISHMANIA

AMAZONENSIS COMO CANDIDATOS VACINAIS AVALIADOS EM

HAMSTER CONTRA LEISHMANIOSE VISCERAL

Dissertação apresentada ao Programa

de Pós-Graduação em Biotecnologia do

Núcleo de Pesquisas em Ciências

Biológicas da Universidade Federal de

Ouro Preto, como parte integrante dos

requisitos para obtenção do Título de

Mestre em Biotecnologia.

Orientador: Prof. Rodolfo Cordeiro Giunchetti – Laboratório de Biologia das Interações

Celulares (ICB/UFMG) e Laboratório de Imunopatologia (NUPEB/UFOP).

Ouro Preto, MG

2015

Amorim, D.R. Colaboradores

IV

Dra. Amanda Brito Wardini1

Dra. Rita de Cássia Oliveira Sant’Ana1

Dra.Walderez Ornelas Dutra

2

Ms. Kelvinson Fernandes Viana1

Ms. Ludmila Zanandreis de Mendonça1

Laíz Aparecida da Conceição Castro1

Luiza Rodrigues Moreira Guerra1

Shaline Braga Ramos1

Tatiane Boleta1

Dr. Ricardo Fujiwara2

Dra. Maria Norma Melo3

Dra. Denise da Silveira Lemos4

Dr. Alexandre Barbosa Reis5

1 – Laboratório de Biologia das Interações Celulares, Departamento de Morfologia,

Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo

Horizonte, Minas Gerais.

2 – Laboratório de Imunologia e Genômica de Parasitos, Departamento de

Parasitologia,Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais,

Belo Horizonte, Minas Gerais.

3 –Laboratório de Biologia de Leishmania, Departamento de Parasitologia, Instituto de

Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, Minas

Gerais.

4 - Laboratório de Biomarcadores de Diagnóstico e Monitoração, Centro de Pesquisas

René Rachou – FioCruz/MG, Fundação Oswaldo Cruz, Belo Horizonte, Minas Gerais.

5 – Laboratório de Imunopatologia, Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas,

Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, Minas Gerais.

Amorim, D.R. Suporte Financeiro

V

Edital/Chamada: Produtividade em Desenvolvimento Tecnológico e Extensão

Inovadora - DT 2011 – processo 310129/2011-7. Projeto: “Desenvolvimento de

Protótipo para Predição de Imunogenicidade e Eficácia em Candidatos a Vacinais

contra Leishmaniose Visceral Canina”.

Edital Universal – MCTI/CNPq 14/2012 – processo 482249/2012-9. Projeto:

“Estabelecimento da plataforma de testes destinada aos ensaios pré-clínicos vacinais

contra leishmanioses”.

Programa Institucional de Auxílio à Pesquisa de Doutores Recém-Contratados da

UFMG. EDITAL PRPq - 01/2013. Projeto: “Análise da imunogenicidade e eficácia de

diferentes candidatos vacinais contra leishmaniose visceral em uma plataforma de testes

in vivo”.

Edital Universal FAPEMIG 01/2013 – processo APQ-02372-13. Projeto:

“Estabelecimento de um Modelo de Testes in vivo para Avaliação da Imunogenicidade

Vacinal com Implantes de Esponjas em Camundongos BALB/c e C57BL/6”.

Programa de Pesquisa para o SUS – PPSUS - processo CDS - APQ-03576-13. Projeto:

“Desenvolvimento tecnológico para o controle da leishmaniose visceral: uma nova

estratégia empregando-se seleção e teste de alvos vacinais com antígenos do hospedeiro

invertebrado e do parasito em uma plataforma de ensaios pré-clínicos e clínicos

vacinais”.

EDITAL 02/2015 - Programa Pesquisador Mineiro - PPM IX – processo CBB - PPM-

00609-15. Projeto: “Estabelecimento de um modelo de testes in vivo para avaliação da

imunogenicidade vacinal com implantes de esponjas em camundongos BALB/C e

C57BL/6”.

Amorim, D.R. Dedicatória

VI

Ao meu pai Raimundo,à minha mãe

Julienicie e ao meu irmão Diego, dedico,

Amorim, D.R. Prefácio

VII

“É muito melhor lançar-se em busca de

conquistas grandiosas, mesmo expondo-

se ao fracasso, do que alinhar-se com os

pobres de espírito, que nem gozam muito

nem sofrem muito, porque vivem numa

penumbra cinzenta, onde não conhecem

nem vitória, nem derrota.” Theodore

Roosevelt

Amorim, D.R. Agradecimentos

VIII

AGRADECIMENTOS

À Deus pela constante presença em minha vida.

Agradeço à minha mãe Julienicie pela dedicação e orações imprescindíveis para

a minha calma na realização deste trabalho, ao meu pai Raimundo pelo apoio e

interesse, e ao meu querido irmão Diego pela amizade e compreensão e a toda minha

família pelo estímulo e confiança.

À Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP) e ao Núcleo de Pesquisas em

Ciências Biológicas, pela oportunidade de realização do curso.

Ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia pela minha formação.

A CAPES e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e

Tecnológico (CNPq), pela concessão da bolsa de estudo e à Fundação de Amparo à

Pesquisa em Minas Gerais (FAPEMIG) pelo auxílio financeiro para o desenvolvimento

do projeto.

A Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG) pela estrutura e suporte ao

curso.

Ao orientador, Professor Dr. Rodolfo Cordeiro Giunchetti, que sempre me

incentivou, pela oportunidade de trabalhar em seu laboratório.

Agradeço de forma especial aos amigos do LABICpor terem confiado em mim,

incentivado a realização deste trabalho e aberto tantos caminhos, mas principalmente

pela grande amizade e boas conversas. Em especial agradeço aos colegas de laboratório

Amanda, Carol, Ludmila, Maurício, Nayara, Rita e Thaís pelo apoio e imensa ajuda na

reta final do trabalho e pela amizade e carinho fora dele. Sem vocês tudo se tornaria

ainda mais difícil.

Aos professoresVanessa, Juliana, Evandro e Alexandre por aceitarem participar

da banca de defesa.

Às alunas de iniciação científica, Luíza, Shaline, Tatiane e Laíz pela dedicação

com que realizaram as tarefas e pela amizade.

Aos meus amigos Gisele, Flávio, Amanda, Cínthia, Gracielle e meus familiares

por tanta paciência e incentivo durante os momentos difíceis pelos quais atravessei.

Aos meus colegas de trabalho do LANAGRO pela compreensão e incentivo.

Amorim, D.R. Agradecimentos

IX

Às minhas amigas da Capadócia, Bianca, Prímula, Nirlane, Bárbara, Isabela e

Amanda, que mesmo com a distância se fizeram presente em minha vida.

Ao Secretário do Programa de Pós-graduação Josino pela colaboração.

A todos que de uma forma ou de outra, contribuíram e incentivaram para a

conclusão deste trabalho.

“Agradecer é admitir que houve um momento que se precisou de alguém; é reconhecer

que o homem jamais poderá lograr para si o dom de ser autossuficiente”.

Amorim, D.R. Sumário

IX

Sumário

Resumo ..................................................................................................... XV

Abstract ................................................................................................... XVI

1. Introdução ................................................................................................ 1

2. Revisão de Literatura ............................................................................. 4

2.1 Aspectos epidemiológicos da leishmaniose visceral ........................................... 5

2.2 Aspectos imunopatológicos e clínicos da leishmaniose visceral canina ........... 6

2.3 Modelos experimentais utilizados no estudo de vacinas anti-leishmaniose

visceral ......................................................................................................................... 7

2.4 Adjuvantes em vacinas anti-leishmaniose visceral .......................................... 10

2.5 Vacinas como estratégias imunoprofiláticas contra a leishmaniose visceral. 13

3. Justificativa ............................................................................................ 17

4. Objetivos ................................................................................................ 19

4.1 Objetivo Geral ..................................................................................................... 20

4.2 Objetivos Específicos .......................................................................................... 20

5. Animais, Material e Métodos ............................................................... 21

5.1 Animais ................................................................................................................ 22

5.2 Delineamento e protocolo experimental ........................................................... 24

5.3 Obtenção do Antígeno Vacinal .......................................................................... 25

5.4 Avaliação da inocuidade dos imunobiológicos ................................................. 26

5.5 Coleta e procedimentos realizados com as amostras de sangue ..................... 26

5.6 Análises sorológicas para reatividade de IgG total anti-Leishmania por

ELISA ........................................................................................................................ 27

5.7 Immunoblotting para identificação de anticorpos IgG .................................... 28

5.8 Análises Estatísticas ............................................................................................ 29

6. Resultados .............................................................................................. 31

6.1 Hemograma – séries vermelha e branca ........................................................... 32

6.2 Avaliação da resposta humoral ......................................................................... 36

6.3 Identificação de proteínas imunogênicas por western blot .............................. 37

7. Discussão ................................................................................................ 38

Conclusão ................................................................................................... 44

Amorim, D.R. Sumário

X

Perspectivas ................................................................................................ 45

8. Referência Bibliográfica ....................................................................... 46

Anexo .......................................................................................................... 65

Amorim, D.R. Lista de diagrama, figuras e tabelas

XI

Lista de Diagrama, Figuras e Tabelas

Diagrama 1. Esquema do desenho experimental para avaliação de hamsters submetidos

a diferentes protocolos vacinais. ................................................................................... 223

Tabela 1. Eritrograma de hamsters submetidos a diferentes protocolos vacinais. ......... 34

Tabela 2. Leucograma de hamsters controle e submetidos a diferentes protocolos

vacinais. .......................................................................................................................... 35

Figura 1: Reatividade de IgG total no soro de hamsters dos antes da 1ª imunização (pré

imune) e após 15 dias da 3ª imunização nos diferentes grupos avaliados ...................... 36

Figura 2: Western blot com soros de hamsters controle (C) e imunizados com as vacinas

LASap, LASapSol

e LASapPart

......................................................................................... 37

Amorim, D.R. Lista de abreviaturas e siglas

XII

Lista de Abreviaturas e Siglas

BSA – Albumina sérica bovina

C – Grupo controle

Sap – Grupo Saponinae.v. via endovenosa

ELISA – Enzyme linked immunosorbent assay

FML – Fucose-manoseligant(Ligante fucose-manose)

i.p. – via intraperitoneal

IFN-γ - Interferon gamma

Ig - Imunoglobulina

IgG - Imunoglobulina da classe G

IgG1- Imunoglobulina da subclasse G1

IL - Interleucina

NOS - Enzima óxido nítrico sintase

LA – Grupo vacinal composto porantígeno bruto de Leishmania amazonensis

LASol

– Grupovacinal composto porantígeno solúvelde Leishmania amazonensis

LAPart

– Grupo vacinal composto por antígeno particuladode Leishmania amazonensis

LASap – Grupo vacinal composto por antígeno bruto de Leishmania

amazonensisassociado a saponina

LASapSol

– Grupovacinal composto porantígeno solúvelde Leishmania amazonensis

associado asaponina

LASapPart

– Grupo vacinal composto por antígeno particuladode Leishmania

amazonensis associado asaponina

LV – Leishmaniose visceral

LVC – Leishmaniose visceral canina

MAPA - Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento

Amorim, D.R. Lista de abreviaturas e siglas

XIII

NK – Células Natural Killer

NO - Óxido Nítrico

PBS - Tampão Fosfato Salínico

PBS-P - Tampão Fosfato Salínico com 0,5%

de BSA e 0,5% de saponina

PBS-W - Tampão Fosfato Salínico com 0,5%

de BSA

PCR – Polymerase Chain Reaction

ROS – Espécies reativas de oxigênio (radicais livres)

rpm – rotação por minuto

s.c. – via subcutânea

Sb5+ - N-metil glucaminapentavalente

T0 – Tempo antes da imunização

T1 – Tempo 15 dias após a 3º dose de imunização

T2 – Tempo 30 dias após a infecção

Th1 – T helper 1

Th17 – T helper 17

Th2 – T helper 2

Th9 – T helper 9

TLR2 -Toll-like receptor 2

TNF-α - Fator de Necrose Tumoral-alfa

Treg – Células T regulagoras

WHO – World Health Organization

Amorim, D.R. Resumo

XIV

Resumo

A Leishmaniose é um conjunto de síndromes complexas e multifacetadas causadas por

espécies de protozoários do gênero Leishmania, sendo transmitida através da picada de

flebotomíneos infectados. Endêmica em 88 países do mundo estima-se que cerca de 350

milhões de pessoas estão em risco de contrair a doença, e aproximadamente 12 a 14

milhões estão infectadas. Cerca de 500 mil pessoas desenvolvem a forma visceral da

doença, sendo que 90% dos casos ocorrem na Índia, Bangladesh, Nepal, Sudão, e no

Brasil. Diversos pesquisadores no mundo tem buscado respostas para a prevenção da

leishmaniose visceral canina (LVC), através da caracterização de antígenos de espécies

de Leishmania, já que o cão é considerado o reservatório doméstico do parasito e um

importante elo na cadeia epidemiológica de transmissão da doença. Ainda não existe

uma vacina que apresente eficácia vacinal compatível para o controle da LVC e que seja

recomendada pelo Ministério da Saúde de nosso país como medida profilática da

doença. Considerando o hamster amplamente utilizado como modelo experimental em

ensaios vacinais com diversos protocolos anti-Leishmania, estabelecemos uma

plataforma para testes rápidos in vivo buscando avaliar simultaneamente diferentes

candidatos vacinais. Neste sentido, o presente projeto propôs a avaliação de um ensaio

pré-clínico vacinal, em hamsters Mesocricetusauratus, considerando aspectos

relacionados à inocuidade, toxicidade e imunogenicidade dos candidatos contra

leishmaniose visceral, entre os quais: (i) grupo inoculado com salina 0,85% estéril, (ii)

grupo inoculado com adjuvante saponina, (iii) grupo inoculado com antígeno bruto de

Leishmania amazonensis(LA), (iv)grupo inoculado comantígeno solúvel de L.

amazonensis(LASol

), (v) grupo inoculado com antígeno particulado de L. amazonensis

(LAPart

), (vi) grupo inoculado com antígeno bruto de L. amazonensis associado a

saponina (LASap), (vii) grupo inoculado com antígeno solúvel de L. amazonensis

associado a saponina (LASapSol

)e (viii)grupo inoculado comantígeno particulado de L.

amazonensis associado a saponina (LASapPart

). Os resultados mostraram que nenhuma

das formulações vacinais induziu alterações no local do inóculo ou alterações sistêmicas

avaliadas pela inspeção clínica e pelo hemograma. Deste modo, ficou constatado que as

diferentes formulações vacinais não induziram hemólise ou anemia nos diferentes

grupos avaliados. A análise do leucograma revelou linfocitose restrita apenas aos

grupos que receberam antígenos vacinais associados ou não ao adjuvante saponina. De

forma semelhante, a análise de antigenicidade revelou aumento dos níveis de IgG total

anti-Leishmania, acima do cut-off, nos mesmos grupos que apresentaram linfocitose. A

análise do immunoblotting, realizada nas formulações em que foi associado antígeno ao

adjuvante saponina (LASap, LASapSol,

LASapPart

), demonstrou a presença de três

bandas imunogênicas com peso molecular próximas de 40 kDa, 30 kDa e bandas entre

20 e 30 kDa. As proteínas encontradas nesse trabalho abrem perspectivas para a análise

de novas formulações vacinais contra a leishmaniose visceral.

Amorim, D.R. Abstract

XV

Abstract

Leishmaniasis is a set of complex and multifaceted syndromes caused by species of

protozoa of the genus Leishmania and is transmitted through the bite of infected

sandfly. Endemic in 88 countries of the world it is estimated that about 350 million

people are at risk of contracting the disease, and about from 12 to 14 million are

infected. About 500,000 people develop the visceral form of the disease, with 90% of

cases occur in India, Bangladesh, Nepal, Sudan and Brazil. Several researchers in the

world have sought answers for the prevention of canine visceral leishmaniasis (CVL),

through the characterization of Leishmania species antigens, as the dog is considered

the domestic reservoir of the parasite and an important link in the epidemiological chain

of transmission. Although there is no vaccine to present vaccine efficacy compatible for

control of LVC and is recommended by the Ministry of Health of our country as a

prophylactic measure of the disease. Considering the hamster widely used as an

experimental model in vaccine testing with several anti-Leishmania protocols, we have

established a platform for rapid in vivo testing to simultaneously evaluate different

vaccine candidates. In this sense, this project proposed the evaluation of a vaccine pre-

clinical trial, in hamsters Golden Hamster, considering aspects related to safety, toxicity

and immunogenicity of the candidates against visceral leishmaniasis, including: (i) the

group inoculated with saline sterile 0,85%, (ii) the group inoculated with saponin

adjuvant, (iii) the group inoculated with crude antigen of Leishmania amazonensis

(LA), (iv) the group inoculated with soluble antigen of L. amazonensis (LASol

), (v) the

group inoculated with particulate antigen L. amazonensis (LaPart

), (vi) the group

inoculated with crude antigen of L. amazonensis associated with saponin (LASap), (vii)

the group inoculated with soluble antigen associated with L. amazonensis saponin

(LASapSol

) and (viii) group inoculated with particulate antigen L. amazonensis

associated with saponin (LASapPart

). The results showed that none of the vaccine

formulations induced changes in the inoculum local or systemic abnormalities assessed

by clinical inspection and the CBC. Thus it was found that different vaccine

formulations did not induce hemolysis or anemia in the different study groups. Analysis

of the white blood cell count revealed lymphocytosis restricted to the groups that

received vaccine antigens associated or not with saponin adjuvant. Similarly,

antigenicity analysis revealed increased levels of total IgG anti-Leishmania, above the

cut-off, the same groups showed lymphocytosis. The analysis of immunoblotting

performed in formulations wherein the antigen is associated to the saponin adjuvant

(LASap, LASapSol

, LASapPart

) showed the presence of three bands with molecular

weight immunogenic next 40kDa, 30kDa and bands between 20 and 30 kDa. The

proteins found in this work open up prospects for the analysis of new vaccine

formulations against visceral leishmaniasis.

Amorim, D.R. Introdução

1

1. Introdução

Amorim, D.R Introdução

2

A leishmaniose é uma protozoose tropical negligenciada que está entre as seis

endemias de maior relevância mundial e é causada por espécies de protozoários

unicelulares pertencentes ao gênero Leishmania (Kinetoplastida, Trypanosomatidae),

apresentando ciclo heteroxeno. Pode ser classificada de várias formas conforme um

conjunto de características clínicas, destacando-se as formas tegumentar ou cutânea e

visceral (Ready, 2014).

A Organização Mundial da Saúde (OMS) publicou em 2012 os resultados de

um levantamento global sobre a situação da leishmaniose no mundo (Alvar et al.,

2012), indicando que a endemia está presente em 98 países, com mais de 350 milhões

de pessoas sob risco de infecção (Desjeux, 2004). No período de 2001 a 2011 foram

registrados mais de 358 mil casos de leishmaniose cutânea nas Américas, representando

o Brasil 42,36% desse valor. A forma visceral acomete mais de 38 mil pessoas, e o

Brasil corresponde a 96,6% desse total (PAHO, 2013).

A OMS divide as leishmanioses em quatro formas clínicas distintas: cutânea,

mucocutânea, cutâneo-difusa e a visceral (Croft et al., 2001). Em relação à leishmaniose

visceral (LV), Lainson e Shaw (1987) agruparam as trêsespécies causadoras no

subgênero Leishmania, sendo estas pertencentes ao complexo Donovani. Entre as

espécies causadoras presentes neste complexo estão: Leishmania (L.) donovani

(Laveran e Mesnil, 1903), Leishmania (L.) infantum (Nicolle, 1908) presentes no Velho

Mundo e Leishmania (L.) chagasi (Cunha e Chagas, 1937) no Novo Mundo.

Atualmente, mesmo apresentando nomes e localizações geográficas distintas, as

espécies Leishmania (L.) chagasi e Leishmania (L.) infantum são consideradas a mesma

espécie em função de estudos em biologia molecular (Maurício et al., 2000).

A LV é uma doença endêmica em 65 países e apresenta incidência anual de

aproximadamente 500.000 novos casos. Destes casos, 90% apresentam-se concentrados

em países como Bangladesh, Brasil, Índia e Nepal. O Brasil concentra

aproximadamente 90% das ocorrências no continente americano com incidência em 21

estados, sendo a região nordeste responsável por 70% dos casos (Desjeux, 2004; Harhay

et al., 2011). Em 2011 foi relatada a incidência de 3.894 casos de LV no Brasil, sendo

que 262 indivíduos evoluíram ao óbito (SINAN/SVS/MS, 2011).

Amorim, D.R Introdução

3

Na LV em hospedeiros vertebrados como o cão e o homem, ocorre a

disseminação do parasito pelo organismo e o acometimento de alguns órgãos, causando

hepatoesplenomegalia, febre, fadiga e perda de peso. A LV representa a forma mais

grave da doença, sendo fatal se não for tratada adequadamente (Chappuis et al., 2007).

O Ministério da Saúde sugere ações a fim de controlar o avanço da doença,

dentre as quais estão o diagnóstico precoce da LV, o tratamento de humanos infectados,

a redução da população de flebotomíneos pela pulverização de inseticidas com efeito

residual em regiões endêmicas e a eliminação de reservatórios domésticos através da

eutanásia de cães infectados (Ministério da Saúde, 2006).

Nos últimos anos, um número crescente de antígenos de Leishmania tem sido

caracterizado, com o objetivo de constituírem novos candidatos para o diagnóstico e

vacina contra a LV. No campo das aplicações de metodologias destinadas a triagem

racional de candidatos vacinais destaca-se a proteômica, que permite a identificação de

proteínas imunogênicas anti-Leishmania com precisão (Kumari et al., 2008). Neste

contexto, a proteômica é um campo de pesquisa emergente facilitado por numerosos

avanços nos últimos anos em separação de proteínas, espectrometria de massas,

sequenciamento e anotação de genomas e algoritmos de busca de proteínas (Aebersold e

Goodlett, 2001).

Considerando as medidas de controle da LV preconizadas pelo Ministério da

Saúde para conter o avanço da doença, uma vacina anti-leishmaniose visceral que seja

efetiva e possa contribuir em programas de controle é considerada a melhor estratégia a

ser utilizada. Esta estratégia seria capaz de bloquear o ciclo do parasito, resultando no

controle da LV. Neste sentido, diversos pesquisadores vêm buscando respostas para a

prevenção da LVC. No entanto, apesar de existir uma vacina comercialmente disponível

contra a LVC no Brasil (Leish-tech®), até o momento o Ministério da Saúde ainda não

recomenda este produto como medida de controle da doença canina. Este fatoilustra a

importância do estabelecimento de plataformas destinadas a novostestes vacinais pré-

clínicos e clínicos contra a LV, buscando identificar formulações imunogênicas e

efetivas contra esta doença (Gradoni, 2001; MS, 2006; Costa et al., 2011).

Diante do exposto, o presente estudo buscou avaliar a imunogenicidade de três

frações antigênicas de Leishmania amazonensis como candidatos vacinais em hamster

dourado contra leishmaniose visceral.

Amorim, D.R Revisão de Literatura

4

2. Revisão de Literatura


5

2.1 Aspectos epidemiológicos da leishmaniose visceral

A Organização Mundial da Saúde reconhece a leishmaniose visceral (LV)

como um importante problema de saúde pública, sendo considerada uma importante

doença negligenciada. A doença apresenta ampla distribuição, ocorrendo na Ásia, na

Europa, no Oriente Médio, na África e nas Américas, onde também é denominada

leishmaniose visceral americana (LVA) ou calazarneo-tropical (WHO, 2012). Na

América Latina, a LV foi descrita em pelo menos 12 países, sendo que cerca de 90%

dos casos ocorrem no Brasil, especialmente na Região Nordeste (MS, 2006).

As áreas endêmicas para LV tem aumentado nos últimos 10 anos, e, apesar da

subnotificação de casos, cerca de 500.000 novos casos de LV humana ocorrem

anualmente no mundo (WHO, 2012). O principal agente etiológico desta zoonose nas

Américas é a Leishmania chagasi (Sherlock, 1996), apresentando como principal

espécie de vetor o flebotomíneo Lutzomyia (Lutzomyia) longipalpis (Lutz e Neiva,

1912).

No ano de 2011 foram confirmados 3.894 casos de LV humana no Brasil (MS,

2012), sendo o cão considerado o principal reservatório da infecção em áreas urbanas

(Maia-Elkhouryet al., 2008). Nesse sentido, as tentativas governamentais de controle da

LV, baseadas principalmente na eutanásia de cães soropositivos, é uma prática onerosa,

que encontra resistência ética e emocional, e não tem impedido o aumento do número

de casos humanos no país (Courtenayet al., 2002; Maia-Elkhoury, 2008). Segundo

alguns autores, o êxito da vacinação de cães pode reduzir significativamente a

incidência de casos caninos e humanos, sendo a estratégia de controle com melhor

relação custo-benefício a ser adotada (Dye, 1996; Alvaret al., 2004). Diante deste fato,

há necessidade do desenvolvimento de vacinas como uma importante ferramenta e uma

estratégia de custo-benefício interessante para o controle da leishmaniose visceral

canina, uma vez que é um objetivo viável e com impacto direto na leishmaniose humana

(Reis et al, 2009).


6

2.2 Aspectos imunopatológicos e clínicos da leishmaniose visceral canina

A maioria dos cães infectados por L. chagasi, apesar de não apresentarem sinais

clínicos, são soropositivos, reforçando quea sorologia para o diagnóstico da LV e canina

como uma importante ferramenta diagnóstica (Mancianti et al.,1986; Cabral et al.,

1998; Sideris et al., 1999; Moreno e Alvar, 2002; Moshfe et al., 2009, Mohammadiha,

2013). Torna-se difícil predizer sobre a real incidência da LVC, devido a diferenças de

sensibilidade dos métodos diagnósticos e a ausência de trabalhos epidemiológicos em

algumas regiões (López-Céspedeset al., 2012). Entretanto, estima-se que milhões de

cães estejam infectados na América Latina (Wernecket al., 2007), e em algumas regiões

a prevalência da doençacanina poderia alcançar índices de até 75% (Cortada et al.,

2004).

Dentre os sinais clínicos da LVC, é importante destacar que todos são

inespecíficos como febre, anemia, perda de peso, astenia, desidratação, além de outros

comoum quadro viscero-cutâneo com evolução crônica, hepato e esplenomegalia,

(Gramiccia, 2011). Destaca-se ainda que comumente há o aparecimento de lesões

cutâneas, linfadenopatia, ceratoconjuntivite, epistaxe e onicogrifose (Ciaramella, et al.

1997; Giunchetti et al., 2006).

Cães infectados com LV podem desenvolver muitos sinais clínicos resultando na

morte, ou permanecerem assintomáticos ou oligossintomáticos (Ciaramella et al., 1997).

O resultado histopatológico característico presente nos principais órgãos acometidos na

LVC é uma reação inflamatória granulomatosa repleta de macrófagos com amastigotas

de Leishmania em seu interior (Baneth et al., 2008). Deste modo, a doença canina

poderia ser representada do ponto de vista clínico e imunopatológico por uma forma

assintomática, com a presença de resposta de linfócitos Leishmania-específicos que

induzem a secreção de citocinas favorecendo um balanço mais proinflamatório,

resultando na manutenção de baixos níveis de parasitismo (Reis et al.,2009; Menezes-

Souza, et al., 2012). Por outro lado, cães sintomáticos representariam o polo da infecção

associado à evolução com pior prognóstico, visto que apresentam resposta imune com

marcada produção de IL-10 e TGF- que favorecem a manutenção de elevados níveis


7

de parasitismo em diversos órgãos (Giunchetti et al., 2006, Giunchetti et al., 2008a,b,

Reis et al.,2009; Menezes-Souza,et al. 2012).

O organismo de um cão infectado engaja uma variedade de interações, diversas

e complexas, entre componentes da resposta imune inata e adaptativa. Na pele, iniciam-

se as respostas imunes mistas (Menezes-Souza et al., 2011) e ocorrem infiltrados

inflamatórios com alto parasitismo, que geralmente está associado ao acometimento

clínico (Giunchetti et al, 2006). A ativação de macrófagos por interferon-gama (IFN-γ)

e fator de necrose tumoral-alfa (TNF-α), e baixos níveis de IL-10consistem nos

principais biomarcadores relacionados a reposta imune protetora contra LVC (Reis et

al., 2009). Este perfil imunológico induz a produção de óxido nítrico pela via da L-

arginina, o qual tem ação leishmanicida sobre as formas amastigotas do parasito, como

foi observado em cães infectados com L. chagasi (Vouldoukis et al., 1996).

Em baços de cães sintomáticos infectados por L. chagasi ocorre formação de

infiltrado celular mononuclear na polpa vermelha e substituição de linfócitos por

macrófagos na polpa branca (Alexandre-Pires et al., 2006), além de acúmulo de IL-10

em animais com alto parasitismo (Lage et al, 2007). No fígado também ocorrem alto

parasitismo e intensas alterações inflamatórias (Giunchetti et al., 2006, Giunchetti et al.,

2008a,b, Reis et al.,2009; Menezes-Souza,et al. 2012).

Quanto aos leucócitos circulantes, cães sintomáticos e com altos níveis de

parasitismo apresentaram baixos níveis de células T CD4+ e CD8

+, com drástica

redução de células B CD21+e monócitos CD14

+, associado à alta densidade parasitária

na medula óssea (Reis et al., 2006).

Ainda na LVC, animais assintomáticos apresentam baixo parasitismo em

diversos tecidos e, de um modo em geral, mantém a habilidade linfoproliferativa frente

a estímulos com antígenos de Leishmania (Reis et al., 2009).

2.3 Modelos experimentais utilizados no estudo de vacinas anti-leishmaniose

visceral

A escolha de um bom modelo experimental deve levar em conta características

do animal e o perfil de resposta imune. A utilização do hamster como modelo

experimental em estudos de leishmaniose, tem sido proposta para melhor compreensão

da evolução do curso da infecção, bem como em ensaios pré-clínicos vacinais (Garg e


8

Dube, 2006; Gomes et al, 2008;Osorio et al, 2012; Moreira et al, 2012; Gomes-Silva et

al, 2013). Neste sentido, a importância do hamster como modelo experimental para o

estudo da LV está baseada no fato desta espécie animal mimetizar a doença ativa e a

progressão da infecção como ocorre em humanos e em cães (Garg e Dube, 2006;

Moreira NdD et al., 2012;Soong et al., 2012; Hamide et al., 2013; Gannavaram et al.,

2014; Loría-Cervera e Andrade-Narváez, 2014).

A forma como os animais são infectados, que pode ser natural (resposta com

flebotomíneo infectado) ou experimental (inóculo por via parenteral), bem como a via

de inóculo na infecção experimental (intradérmica, intraperitoneal, intracardíaca,

subcutânea), leva a diferenças relevantes tanto no início da infecção, quanto na

progressão e nas respostas a vacinas (Garg e Dube, 2006; Aslan et al., 2013). Na

infecção natural, os parasitos são repassados ao hospedeiro juntamente com proteínas

imunomoduladoras da saliva e gel secretado por promastigotas, processo que incita um

rápido influxo de células até o sítio da picada do flebotomíneo (Rogers et al., 2004;

Aslan et al., 2013). No caso da infecção natural pelo vetor Lutzomyia longipalpis, são

depositados no hospedeirocerca de 4x104 parasitos, ao passo que em infecções

experimentais a dose empregada geralmente é maior (por volta de 1x107

parasitos)

(Garg e Dube, 2006; Kushawaha et al., 2011; Aslan et al., 2013 ). Há diferenças na

resposta imunequanto a forma de infecção entre modelos utilizados, e entre os roedores,

o hamster reproduz o curso da infecçãona LV mais fielmente ao que ocorre com os

humanos (Aslan et al., 2013).

O elevado custo de manutenção para experimentação com cães torna este

modelo de estudo restrito, justificando o grande uso de camundongos e hamsters em

análises imunopatológicas e ensaios pré-clínicos vacinais anti-Leishmania.

A evolução da LVocorre de forma diferenciada nos diferentes modelos

experimentais.Diferentes processos imunológicos críticos estão envolvidos na resolução

da infecção hepática em camundongos tais como a geração de uma resposta do tipo 1, a

formação de um granuloma efetivo e a ativação clássica de macrófagos (Stanley, 2007).

A necessidade de células do tipo 1 produtoras de IFN-γ é demonstrada quando se

observa prejuízo no controle da infecção em camundongos deficientes em fatores de

transcrição envolvidos na sinalização para a geração de respostas efetoras do tipo 1

(Beattie et al., 2011; Paunet al., 2011). As células de Küpffer, fagócitos primários no


9

granuloma hepático, iniciam a resposta efetora pela apresentação de antígenos às células

T, favorecendo o controle do parasito (McFarlaneet al., 2008). A ativação dos

macrófagos por IFN-γ e TNF-α ou outros produtos proinflamatórios, além de

mecanismos efetores ainda não identificados, levam à formação de espécies reativas de

oxigênio (ROS) e NO, os quais contribuem no controle da replicação do parasito

(Murray, 1999).

O baço e o fígado de camundongos infectados com L. donovani expressaram

altos níveis de citocinas relacionadas à resposta do tipo 1, como IFN-γ, IL-2, IL-12 e

TNF-α (Melby et al, 2001; Perez et al, 2006). Juntamente a essas respostas, houve

também aumento da expressão pelo baço de citocinas do tipo 2, tais como IL-4, IL-13,

IL-10, IL-21, e TGF-β (Melby et al, 2001; Osorio et al, 2012).

Gomes-Silva et al.(2013) mostraram através de um estudo com hamsters

infectados com L. braziliensis, o qual realizou análises imunológicas, histológicas e

clínicas, que esse modelo apresenta reações durante o curso da infecção semelhantes às

que ocorrem em humanos, sendo altamente susceptível à infecção por espécies de

Leishmania e por isso tem sido amplamente utilizado como um modelo experimental.

Neste sentido, o modelo hamster Sírio dourado (Mesocricetus auratus) possibilita a

investigação de mecanismos imunopatológicos na infecção por Leishmania,

apresentando carga parasitária marcadamente maior que em camundongos (Osorio et al,

2012). Banerjee et al. (2011) constataramque após 45 dias de infecção com L. donovani,

os hamsters sofrem linfadenopatia aparentemente irreversível mesmo após estímulo

com mitógeno (concavalina A), quando comparado à linfoproliferação normal de

linfonodos de hamsters não infectados. No fígado de hamsters, ocorre alto parasitismo

das células de Küpffer que são rodeadas por um infiltrado inflamatório, mas ao

contrário de camundongos, não há formação de granuloma completamente organizado

(Nieto et al, 2011), favorecendo a progressão da infecção no modelo hamster.Durante a

fase aguda da LV no hamster ocorre um processo de supressão linfoproliferativa, o que

pode explicar em parte a deficiência de controle da doença (Goto e Prianti, 2009). A

falta de habilidade de células apresentadoras de antígenos (APC’s) infectadas em

estimular linfócitos T, juntamente com a morte apoptótica de linfócitos desencadeada

por TGF-β, podem ser acontecimentos chaves para a disfunção tardia na LV em


10

hamsters (Rodrigues Júnior et al., 1992; Banerjee et al., 2010; Mookerjee et al., 2003).

Além disto, o desfecho fatal da infecção na LV em hamsters poderia estar associado

também a perda de funções efetoras dos macrófagos (Melby et al., 2011), a falta da

produção de NO em consequência de defeito na ativação transcricional de NOS2 (Perez

et al., 2006), além da dificuldade das APC’s de processarem e apresentarem antígenos

do parasito às células T (Rodrigues Júnior et al., 1992).

Chang e Dwyer (1978) evidenciaram a ocorrência da fusão fagossomo-

lisossomo indicando quantitativamente uma eficiente interaçãode amastigotas de L.

donovani em macrófagos de hamster (Chang e Dwyer, 1978). A escassez de reagentes

disponíveis, como anticorpos, marcadores celulares e de citocinas, é um fator limitante

no estudo da resposta imune em hamsters (Wilson et al., 2005; Gupta e Nishi, 2011;

Melby et al., 2011), embora do ponto de vista parasitológico seja um excelente modelo

de estudo.

Diante o exposto, fica evidente que o modelo hamster por apresentar um curso

de infecção da LV que se aproxima a doença canina e humana, além de apresentear

baixo custo de manutenção em relação ao cão, consiste em um modelo experimental

muito atrativo para ensaios pré-clínicos vacinais (Garg e Dube, 2006).

2.4 Adjuvantes em vacinas anti-leishmaniose visceral

O adjuvante (do latim= adjuvare, ajudar) é capaz de aumentar a imunogenicidade

de antígenos purificados ou recombinantes em relação à aplicação desses isoladamente,

através do estímulo da captação de antígenos por células apresentadoras de antígenos

(APC) os quais induzem a resposta imune (O’Hagan e Valiante, 2003; Aguilar e

Rodriguez, 2007). O uso de adjuvantes aumenta a velocidade e duração da resposta

imune, melhora a eficácia vacinal em pessoas imunocomprometidas, induz a imunidade

de mucosa, reduz o custo de produção da vacina (McElrath, 1995; Douce et al, 1995;

Dey e Srivastava, 2011) e determina a produção, duração, título e a subclasse de

imunoglobulina produzida pela resposta imune (Rajput et al., 2007).

Compostos como os sais de alumínio são adjuvantes utilizados seguramente em

vacinas humanas contra doenças como as hepatites A e B, papilomavírus humano


11

(HPV) dentre várias outras (Hem e Hogen, 2007). Esses sais ativam a proteína 3

receptora tipo domínio ligante de nucleotídeo (NLRP3) através de dois modelos: no

primeira, células fagocíticas englobam partículas de sal e no segundo sugere-se que a

toxicidade do sal de alumínio recruta células potencializando a resposta imune. O sal

aumenta a liberação de ácido úrico que ativa o inflamassomo NLRP3, o qual pode

direcionar respostas para Th1, Th2 ou Threg (Hornung et al., 2008).

As chamadas emulsões óleo-em-água são adjuvantes que têm sido utilizados com

sucesso em vacinas licenciadas (García e Sanctis, 2013). A emulsão MF59® está

presente na vacina da influenza sazonal sendo hábil em estimular primariamente uma

resposta humoral através da via Th2, em aumentar o título de anticorpos neutralizantes,

além de estimular respostas de células T CD8+ (Podda e Del Giudice, 2003). Outro

exemplo de emulsão usada como adjuvante é o sistema adjuvante 03 (AS03), também

empregado em vacinas da influenza, o qual combina três compostos adjuvantes que

induzem a secreção de citocinas, aumentam a carga de antígeno nos macrófagos e

recrutam granulócitos nos linfonodos, parecendo aumentar, dessa forma, as respostas

imuno adaptativas específicas ao antígeno (Morel et al., 2011; Garçon et al., 2012).

Outros adjuvantes que vêm sendo testados em modelos animais e triagens clínicas

humanas são baseados em receptores tipo Toll (TLR), os quais desempenham papel

importante no sistema imune inato e estão presentes em células como macrófagos,

célulasdendríticas (DC’s), neutrófilos,células do epitélio da mucosa e células endoteliais

(Takeda et al., 2003). Esses receptores atuam no reconhecimento de padrões

moleculares associados a patógenos (PAMP’s) que estão presentes em componentes de

muitos fungos, vírus, bactérias e protozoários (Takeda et al., 2003). O TLR9 é capaz de

reconhecer dinucleotídeos CpG (Thomas et al., 2009; Jurk e Vollmer, 2007) não

metilados, os quais sabe-se que tem efeitos imunoestimulatórios (Messina et al, 2001).

Vacinas contra influenza (Moldoveanu et al., 1995), vírus do sarampo (Koravik et al.,

1999), vírus da hepatite B e toxoide de tétano (Mc Cluskie e Davis, 1998; Brazolot

Millan et al, 1998; Eastcott et al., 2001) apresentam títulos aumentados de anticorpos

específicos de antígenos quando da inclusão de CpG em suas formulações, o que parece

potencializar ou modular respostas imunes já existentes (Pali-Schöll et al., 2013).

Algumas citocinas têm sido avaliadas como bons adjuvantes graças à habilidade em

modificar e redirecionar a resposta imune, tais como IL-1, IFN-γ, IL-12 e GM-CSF


12

(Heath, 1995; Tovey e Lallemand, 2010). Uma citocina que recebe destaque nos estudos

é a IL-15, a qual é reconhecida com efeitos imunomodulatórios em células de ambos os

sistemas imunes inato e adaptativo (Perera et al., 2012). A IL-15 ativa células NK,

NKT, CD8+ e linfócitos T de memória, aumentando a resposta imune e tornando-a

assim, uma alternativa para ser utilizada em vacinas (Perera et al., 2012).

Dentre os adjuvantes, a saponina se constitui de moléculas de glicoalcaloides

esteroidais ou triterpenoides (Santos et al., 1997) que é um adjuvante amplamente

utilizado em estudos com modelos experimentais e animais de produção como: cães,

roedores, primatas não-humanos e bovinos (Santos et al., 1997). A saponina possui

propriedades biológicas importantes como apresentar a capacidade em induzir resposta

imune humoral e celular (Powell et al., 1994; Coughlin et al., 1995; Jackson e

Opdebeeck, 1995; Yen et al., 1995; Santos et al., 1997) e as saponinas de Quillaja

saponaria são utilizadas em formulações vacinais contra várias doenças (Khan et al.,

1991; Bomford et al., 1992; Britt et al., 1995; Santos et al., 1997). A saponina pode ser

fracionada em 4 partes chamadas de QS-7, QS-17, QS-18 e QS-21, as quais são

potentes adjuvantes, sendo QS-18 a mais abundante (Kensil et al, 1991). Apesar disso,

QS-18 é a que possui maior toxicidade, e por isso, a QS-21, menos tóxica e mais

abundante que as outras, vêm sendo amplamente utilizada como adjuvante (Kensil et al,

1991).

O uso da saponina como adjuvante de vacina contra a LV mostrou-se seguro e com

ausência de toxicidade em experimentos realizados em camundongos e hamsters

(Santos et al., 1997, Palatnik et al., 1994; Palatnik et al, 1994). A capacidade de atuar

como adjuvante está diretamente associada ao seu efeito hemolítico, que é indesejável,

tornando inviável para utilização na vacinação humana (Santos et al., 1997; Bomford,

1980). Porém, a fração QS-21 tem sido amplamente estudada e vem sendo utilizada

como estratégia imunoterapêutica em pacientes com câncer após resecção de metástases

sistêmicas ou locais (Ragupathi et al., 2011), para vários tipos de cânceres como de

mama (Gilewski et al, 2000; Gilewski et al, 2001; Gilewski et al., 2007), próstata

(Slovin et al, 2003, Slovin et al, 2005; Slovin et al, 2007), ovário (Sabbatini et al.,

2007) e pulmões (Dickler et al., 1999; Krug et al., 2004a; Krug et al., 2004b). As

triagens de fase I realizadas mostram potentes respostas de anticorpos contra antígenos

de peptídeo e carboidrato em vacinas associadas com conjugado de KLH, e os efeitos


13

colaterais se restringem à eritema local e induração na maioria dos pacientes, assim

como ocasionais sintomas gripais (Ragupathi et al., 2011).

Além do câncer, tem sido realizadas triagens para outras doenças como HIV (Evans

et al., 2001), malária (Kashala et al.; 2002) e hepatite B (Vandepapeliere et al.; 2008).

Além disso, ensaios de fase II têm sido realizados em pacientes com a Doença de

Alzheimer que recebem vacinas contendo QS-21(Ragupathi et al., 2011). Apesar de

alguns inconvenientes do uso desse adjuvante, a saber: a toxicidade local e sistêmica

dependendo da dose empregada (Ragupathi et al., 2011), da instabilidade química da

QS-21(Cleland et al.; 1996) e da disponibilidade limitada de fontes naturais (Martin e

Briones, 2000), os resultados obtidos do uso desse adjuvante estimulam seu uso a fim

de aumentar a potência de vacinas contra doenças infecciosas como a leishmaniose

(Ragupathi et al., 2011).

2.5 Vacinas como estratégias imunoprofiláticas contra a leishmaniose visceral

Uma das tentativas atuais de controlar o avanço da LV é a eutanásia de cães

soropositvos. Porém, diante da relação homem-cão, esta medida encontra dificuldade

em ser implementada na prática para a contenção da doença (Courtenay et al., 2002;

Maia-Elkhoury et al., 2008). Considerando que o cão é o principal reservatório

doméstico do parasito, a vacinação destes animais apresentaria um grande potencial

para atuar no controle da LV humana e canina (Dye, 1996; Alvar et al., 2004 ).

As vacinas são classificadas de acordo com suas composições, podendo ser

denominadas vacinas de primeira, de segunda ou de terceira geração (Noazin et al.,

2008). As vacinas de primeira geração são aquelas compostas por parasitos vivos

atenuados, também chamadas de “vacinas-mortas” (Palatnik de Souza, 2008); as

vacinas recombinantes de segunda geração são constituídas por antígenos purificados de

parasitos ou por bactérias vivas recombinantes as quais possuem genes que expressam

antígenos de Leishmania, enquanto as vacinas com plasmídeos de DNA codificadores

de antígenos representam aquelas de terceira geração (Noazin et al., 2008).

O Brasil é pioneiro na disponibilização de vacinas comerciais para imunização

de cães contra leishmaniose visceral. A vacina Leishmune®

(Zoetis, Brasil), composta

por uma glicoproteína ligante de fucose-manose (FML) de Leishmania donovani


14

associada ao adjuvante saponina, foi licenciada pelo Ministério da Agricultura, Pecuária

e Abastecimento (MAPA) em 2003 (da Silva et al., 2001; Borja-Cabrera et al., 2002;

Parra et al., 2007). Esta vacina estava disponível para comercialização em áreas onde a

LVC é endêmica até o início de setembro de 2014, quando sua licença para

comercialização foi suspensa.

A vacina Leish-Tech®

(HertapeCalier, Juatuba, MG) é composta de antígeno A2,

uma proteína recombinante específica do estágio amastigota de diferentes espécies de

Leishmania também associada ao adjuvante saponina, foi licenciada em 2007 pelo

MAPA (Coelho et al., 2003; Zanin et al., 2007; Fernandes et al., 2008). A vacina Leish-

Tech®,atualmente, tem recebido investimentos de grupos de empresas farmacêuticas

britânicas e o fabricante da vacina no Brasil estuda a possibilidade de registrá-la no

continente europeu. Dessa maneira, a vacina poderá atender a países da região do

Mediterrâneo (Portal Brasil, 2014).

Em 2011 foi autorizada a comercialização da vacina CaniLeish® no mercado

europeu (Leishma News, 2011). Composta por proteínas secretadas e excretadas (ESP)

de L. infantum associadas ao extrato de Quillaja saponaria (QS-21) como adjuvante,

essa vacina apresentou resposta protetora e gerou redução efetiva de carga parasitária

em macrófagos infectados (Moreno et al., 2012). Em estudo recente, confirmou-se o

efeito imune eficiente prolongado gerado pela CaniLeish®

um ano após a imunização

desta vacina (Martin et al., 2014).

Apesar de atualmente o Brasil dispor de uma vacina comercial para a LVC,

ainda permanecem importantes questionamentos relacionados à: distinção pelos

sorotestes entre a infecção natural pelo parasito e a resposta imune vacinal, avaliação da

redução da doença e da incidência de infecção em cães indicando sua ação no bloqueio

do ciclo da LV (Saraiva et al., 2006). Até o momento o Ministério da Saúde do Brasil

ainda não indica nenhuma vacina para ser utilizada nos programas de controle nacionais

(Ministério da Saúde, 2006).

Em um estudo realizado em 2012 utilizando promastigotas de L. infantum

atenuadas sob pressão de 10% de gentamicina, Daneshvar et al. avaliaram o perfil

imunofenotípico de células mononucleares de cães infectados tanto com as

promastigotas atenuadas quanto parasitos selvagens. Neste estudo foi observadoindução

de células T CD4+ e CD8

+ nos cães vacinados com promastigotas atenuadas, sem


15

apresentarem sinais clínicos da LVC, ou alteraçõesbioquímicase hematológicas,

sugerindo que a linhagem atenuada foi capaz de proteger cães contra a cepa selvagem

de L. infantum (Daneshvar et al., 2012). Em outro estudo anterior desse grupo, já

haviam sido encontrados maiores níveis de IFN-γ nos grupos vacinados com antígenos

atenuados com gentamicina em relação aos animais controle (Daneshvar et al., 2010).

Outro estudo realizado em 2013avaliou cães vacinados com L. donovani com o

gene centrina deletado (Ld Cen-/-), afetando a multiplicação de formas amastigotasno

hospedeiro vertebrado (Fiuza et al., 2013). Este grupo vacinal apresentou aumento de

TNF-α e de IL-12,maior proliferação de células T e B,resultando em maior efeito

protetor e imunogênico (Fiuza et al., 2013). A segurança da vacina Ld Cen-/- foi

descrita em camundongos e hamsters (Selvapandiyan et al., 2009).

Nosso grupo de pesquisa vem estudando formulações vacinais anti-LVC, sendo

desenvolvido o imunobiológico LBSap, que possui em sua composição antígenos de L.

braziliensis associado ao adjuvante saponina (Giunchetti et al., 2007). Esta vacina foi

patenteada e está inscrita no Instituto Nacional de Propriedade Industrial (INPI) com a

identificação PI 0601225-6.

Dados do nosso grupo de pesquisa evidenciaram que a vacina LBSap foi capaz

de induzir uma redução expressiva da carga parasitária após infecção por L. chagasi em

diferentes modelos experimentais (Roatt, 2010; Motta, 2011; Mendonça, 2011;

Resende, 2011; Roatt et al., 2012). A redução no parasitismo em cães chegou a 54% no

baço (Roatt et al., 2012). Além disso, em um estudo utilizando camundongos

BALB/ccomo modelo experimental foi observado uma redução de 62% no baço de

animais desafiados por L. chagasi (Mendonça, 2013). Estes resultados demonstram que

cepas dermatotrópicas de Leishmania apresentam alto potencial em induzir

imunogenicidade e de promover o controle do parasitismo em diferentes órgãos

(Giunchetti et al., 2007, Mendonça, 2013).

Vale destacar ainda que vacinas de 1° geração, como a vacina LBSap,

apresentam maior estabilidade e segurança com relação às vacinas de subunidades

purificadas (2° geração) e de DNA (3° geração), tornando o seu custo mais acessível aos

países em desenvolvimento (Giunchettiet al., 2007, Giunchetti et al., 2008a, Giunchetti

et al., 2008b).


16

Diante do exposto, e considerando a experiência prévia de nosso grupo de

pesquisa que verificou uma forte indução na imunogenicidade vacinal da vacina LBSap,

este trabalho se propôs a ampliar os estudos de cepas dermatotrópicas, como racional

para o desenvolvimento de uma vacina contra a LVC. Neste sentido, o presente estudo

buscou avaliar em hamsters sírios dourados da espécie Mesocricetus auratus diferentes

formulações vacinais com antígeno de L. amazonensis e suas subfrações frente à

infecção experimental por L. chagasi.

Amorim, D.R Justificativa

17

3. Justificativa

Amorim, D.R. Justificativa

18

A leishmaniose visceral (LV) está presente em diversas regiões do Brasil e a

cada dia se tornam necessárias medidas a fim de interromper o ciclo de transmissão

nessas regiões. Apesar de contínuos esforços em busca de ações mais eficazes, o

emprego da eutanásia de cães infectados com L. chagasi ainda é recomendado, uma vez

que a terapia canina é ineficaz, justificando assim esta medida para eliminação dafonte

de infecção para humanos e outros cães. Entretanto, a eutanásia é uma medida muito

polêmica, devido à relação afetiva de proprietários de cães com estes animais. Além

dessa medida profilática, os medicamentos empregados no tratamento de pacientes

infectados podem gerar graves efeitos colaterais, sendo relatado frequentemente

resistência ao tratamento com medicamento de escolha (antimoniais pentavalentes) da

leishmaniose visceral humana. Diante deste cenário, aimunoprofilaxia tem se destacado

como alternativa mais racional para o controle da LV.

Considerando o hamster como modelo experimental altamente susceptível ao

desenvolvimento da LV, ao seu baixo custo de manutenção e, por mimetizar a doença

canina e humana, torna-se importanteo emprego deste modelo para a realização de

ensaios pré-clínicos vacinais. Esta estratégia permitiria a identificaçãode novos

candidatos vacinais que possam atuar no controle da LV. Neste sentido, o presente

trabalho propõe o teste de novos candidatos vacinais contra a LV, buscando identificar

aspectos relacionados à imunogenicidade. Esta abordagempoderá favorecer a

identificação de novos candidatos vacinais para serem avaliados em futuros estudos

contra esta doença.

Amorim, D.R. Objetivos

19

4. Objetivos

Amorim, D.R. Objetivos

20

4.1 Objetivo Geral

Avaliar a imunogenicidade de três frações antigênicas de

Leishmaniaamazonensis como candidatos vacinais em hamster dourado, contra

leishmaniose visceral.

4.2 Objetivos Específicos

1. Avaliar a toxicidade e inocuidade após as imunizações considerando

parâmetros clínicos e alterações no local do inóculo;

2.Avaliar aspectos relacionados à imunogenicidade vacinal após protocolo

vacinal considerando o hemograma completo e reatividade sérica anti-Leishmania;

3. Avaliar o perfil de reconhecimento antigênico por anticorpos

séricosinduzidos pelo processo de imunização.

Amorim, D.R. Animais, Materiais e Métodos

21

5. Animais, Material e Métodos


22

5.1 Animais

Neste trabalho utilizaram-se 64 hamsters sírios dourados, machos, da espécie

Mesocricetus auratus, com aproximadamente 6-8 semanas de vida, provenientes do

Biotério de Produção do Centro de Pesquisas René Rachou/Fiocruz – MG. Estes

animais foram mantidos em salas com temperatura controlada, ciclo claro/escuro de

12h, em racks ventiladas lotadas do Biotério de Ensaios Pré-Clínicos do Laboratório de

Biologia das Interações Celulares do Departamento de Morfologia da Universidade

Federal de Minas Gerais. É importante ressaltar que todos os animais passaram por um

período de quarentena, assim que chegaram ao Biotério de Ensaios Pré-Clínicos,

permanecendo em sala separada, onde foi fornecido ivermectina (0,2mg/kg,

100ml/animal) por via subcutânea. Após 10 dias os animais foram encaminhados à sala

de experimentação para início dos experimentos. Durante todo o período do ensaio foi

fornecido água (coletada no biotério e submetida a sistema de dupla filtração e remoção

do cloro) e ração (Nuvilab®, São Paulo, SP, Brasil) à vontade.

Este projeto foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais da

Universidade Federal de Minas Gerais (CEUA-UFMG), inscrito sob o protocolo nº 385

/ 2013 (Anexo 1).


23

Diagrama 1. Esquema do desenho experimental para avaliação de hamsters submetidos a diferentes protocolos vacinais: Controle (C); Adjuvante saponina (Sap); Antígeno bruto de L.

amazonensis (LA); antígeno solúvel de L. amazonensis (LASol

); antígeno particulado de L. amazonensis (LAPart

); antígeno LA associado ao adjuvante saponina (LASap); antígeno LASol

associado ao adjuvante saponina (LASapSol

) e antígeno LAPart

associado ao adjuvante saponina (LASapPart

). T0= coleta de soro antes da primeira imunização. T1= tempo 1; primeira

imunização e análises de inocuidade e toxicidade após inóculo. T1= tempo 2; segunda imunização e análises de inocuidade e toxicidade após inóculo. T3= tempo 3; terceira imunização e

análises de inocuidade e toxicidade após inóculo. T4= tempo 4; Coleta de sangue e procedimentos posteriores.


24

5.2 Delineamento e protocolo experimental

Os hamsters foram divididos em 8 grupos experimentais (n=8 animais/grupo),

conforme descrito a seguir (Diagrama 1):

(i) Grupo Controle (C) – os animais receberam 100µL de solução salina estéril

(Sigma Chemical Co., St. Louis, USA) a 0,9%;

(ii) Grupo Saponina (Sap) –receberam 9µg do adjuvante saponina(Sigma

Chemical Co., St. Louis, USA)diluída em 81µL de solução salina estéril a

0,9%;

(iii) Grupo imunizado com antígeno bruto de L. amazonensis (LA) –receberam

60µg do antígeno bruto de L. amazonensis associado a 100µL de solução

salina estéril a 0,9%;

(iv) Grupo imunizado com antígeno solúvel de L. amazonensis (LASol

) –

receberam 60 µg do antígeno solúvel de L. amazonensis associado a 100µL de

solução salina estéril a 0,9%;

(v) Grupo imunizado com antígeno particulado de L.amazonensis (LAPart

) –

receberam 60µg do antígeno particulado de L. amazonensis associado a 100µL

de solução salina estéril a 0,9%;

(vi) Grupo imunizado com antígeno bruto de L. amazonensis associado ao

adjuvante saponina (LASap) –60µg do antígeno bruto de L. amazonensis

associado a 9µg do adjuvante saponina, diluídos em um volume total de

100µL de solução salina estéril a 0,9%;

(vii) Grupo imunizado com antígeno solúvel de L. amazonensis associado ao

adjuvante saponina (LASapSol

) – receberam 60g do antígeno solúvel de L.

amazonensis associado a 9µg do adjuvante saponina, diluídos em um volume

total de 100µL de solução salina estéril a 0,9%;

(viii) Grupo imunizado com antígeno particulado de L. amazonensis associado

ao adjuvante saponina (LASapPart

)–receberam 60µg do antígeno particulado

de L. amazonensis associado a 9µg do adjuvante saponina, diluídos em um

volume total de 100µL de solução salina estéril a 0,9%;

Todos os inóculos utilizaram a via subcutânea, em três doses intervaladas de 21

dias. Ao final da realização do protocolo vacinal (15 dias após a terceira dose) foi


25

realizada a coleta do sangue por punção cardíaca para realização do hemograma

completo e obtenção do soro para avaliar o perfil de imunoglobulinas pela técnica de

ELISA, bem como, a realização do immunoblotting para identificar possíveis proteínas

imunogênicas presentes no soro dos animais imunizados. As metodologias necessárias

para cumprir essas etapas estão descritas a seguir.

5.3 Obtenção do Antígeno Vacinal

Todo o antígeno vacinal utilizado neste estudo foi produzido a partir de mesma

partida de cultura, conforme descrito por Giunchetti et al. (2007), com algumas

modificações. Neste sentido, para o crescimento da cultura de promastigotas foi

empregada a cepa de Leishmania amazonensis (PH8), cultivada em meio de cultura

alfa-mem (GIBCO, EUA). A cultura axênica foi expandida a partir de um inóculo

inicial de 10mL de meio alfa-mem contendo entre 107 a 10

8 promastigotas/mL de L.

amazonensis em crescimento logarítmico, sendo realizados repiques a cada três dias de

cultivo, correspondendo à fase logarítmica de crescimento do parasito, em capela de

fluxo laminar (Veco, Campinas, São Paulo, Brasil) e em garrafas de cultura de 250mL

(Pyrex Corning, EUA ), que foram mantidas em estufa biológica refrigerada BOD

(FANEM

modelo 347), à temperatura de 23°C 1°C. A cultura foi mantida por no

máximo 8 repiques, sob condições estéreis, sendo homogeneizadas diariamente.

Após 5 dias do último repique, com a cultura em fase estacionária, contendo

cerca de 107 a 10

8 promastigotas/mL, foi iniciada a etapa de lavagem. Deste modo, a

cultura foi removida em capela de fluxo laminar e transferida para tubos estéreis de

polipropileno de 50mL (Falcon

, Becton Dickinson, EUA), que foram submetidos à

centrifugação a 1540xg durante 15 minutos a 4°C. Após descartar o sobrenadante, o

sedimento de promastigotas foi homogeneizado em solução salina estéril (NaCl 0,9%),

e, em seguida foi realizada a centrifugação na mesma condição. Este procedimento de

lavagem foi repetido por mais duas vezes.

Após as etapas de lavagem, realizou-se o rompimento das promastigotas em

ultra-som (Sonifier Cell Disruptor®- Brason Sonic Power Co. – EUA), por um minuto a

40 Watts em banho de gelo. Parte do antígeno foi aliquotado, sendo a concentração

proteica dosada pelo método de Lowryet al. (1951) e congelado a -70°C (Forma

Scientific, EUA), até o momento do uso como antígeno bruto (4000µg de


26

proteínas/mL), conforme descrito nos grupos experimentais deste estudo. A outra parte

da massa de promastigotas foi destinada a obtenção dasfrações antigênicas, aqui

denominadas de antígeno solúvel (660µg/mL) e antígeno particulado (1100µg/mL), que

foram utilizados conforme descrito nos grupos experimentais. Neste sentido, parte da

massa de promastigotas que passou pelo processo de sonicação, foi ultracentrifugada a

18.000 xg durante 90min, a 4oC. Utilizando uma capela de fluxo laminar, em condições

estéreis, o sobrenadante obtido foi separado e aliquotado para ser utilizado como

antígeno solúvel, enquanto o sedimento foi separado, ressuspendido em solução salina

estéril a 0,9% e aliquotado para utilizá-lo como antígeno particulado. Uma alíquota de

cada preparação foi retirada para dosagem de proteína pelo método de Lowry et al.

(1951), e o antígeno foi então mantido congelado a -70°C (Forma Scientific, EUA), até

o momento do uso.

A saponina utilizada no grupo controle e nas formulações foi preparada a partir

da saponina (Sigma Chemical Co., St. Louis, USA) diluída em solução salina estéril

0,85% no momento do inóculo.

5.4 Avaliação da inocuidade dos imunobiológicos

O local do inóculo e o comportamento dos hamsters foram observados nas

primeiras 72h de cada imunização. Desta forma, foi realizada uma análise macroscópica

do local do inóculo, onde foi observado se havia nódulos, pápulas ou feridas, e onde

houve induração, foi medida com paquímetro digital (Stainless Hardened, EUA). Com

relação ao comportamento, foram avaliados sinais clínicos como: dor, agressividade,

apatia, além de sinais clínicos como inchaço, ulceração, pêlo eriçado, alterações

comportamentais, dentre outros.

5.5 Coleta e procedimentos realizados com as amostras de sangue

Após a realização do protocolo vacinal, foi coletado cerca de 400µL de sangue,

por punção intra-cardíaca, de todos os animais (Diagrama 1), utilizando-se seringas

descartáveis de 1mL (BD PlastipakTM

, Paraná, Brasil ). Os animais foram anestesiados

com tiopental sódico 2,5% via intraperitoneal na dose de 30mg/kg de peso. Cerca de


27

40µL do sangue foi transferido para microtubos tipo eppendorf de 1,5mL (Hamburgo,

Alemanha) os quais foram destinados à realização de hemograma completo em um

contador automático de células (Automatic hematolgy analyzer - Bioeasy-2900 Plus),

para realização do leucograma, eritrograma e contagem de plaquetas. Cerca de 10µL de

sangue foi empregado na confecção de lâminas de esfregaço a fim de realizar a

contagem diferencial de leucócitos (linfócitos, neutrófilos, monócitos e eosinófilos),

coradas com Panótico Rápido InstantProv (Newprov®, Paraná, Brasil) e depois lidas em

microscópio óptico (Olympus CX21, EUA). O restante do sangue foi centrifugado a

450 xg durante 15 min para obtenção de amostras de soro, as quais foram

imediatamente armazenadas em freezer -70°C para posterior uso em testes sorológicos e

immunoblotting.

5.6 Análises sorológicas para reatividade de IgG total anti-Leishmania por ELISA

A fim de avaliar o perfil de imunoglobulinas totais da classe IgG, realizaram-se

reações imunoenzimáticas de ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay),

conforme descrito por Moreira et al.(2012). Para isso, empregaram-se placas de

poliestireno de fundo chato de 96 poços (Sarstedt, Alemanha), as quais foram

sensibilizadas com 2µg/well de antígeno solúvel de L. chagasi BH46

(MHOM/BR/1972/BH46) com solução de cobertura (solução de carbonato/ bicarbonato

de sódio, pH 9,6, 100µL/orifício) e incubadas overnight à temperatura de 4°C

protegidas da luz.

No segundo dia, as placas foram lavadas três vezes com solução de lavagem

(PBS 1X contendo Tween 20 a 0,05%) para remoção do excesso de antígeno. Em

seguida foi feito o bloqueio de ligações inespecíficas das placas com solução de

bloqueio [PBS / soro fetal bovino (SFB) 5%, 100µL/orifício], permanecendo incubadas

em estufa (Forma Scientific, EUA) a 37°C durante 90 minutos. Posteriormente, as

placas foram lavadas com a mesma solução de lavagem e os soros foram aplicados

100µL/orifício às placas na diluição de 1:40 e então incubadas em geladeira overnight

(18 horas) protegidas da exposição à luz.

Ao terceiro dia, as placas foram lavadas e o conjugado anti-IgG de hamster

HRPO conjugado (Caltag Laboratories – HA6007) foi aplicado na diluição de 1:2000, e

as placas foram incubadas durante 120 minutos à temperatura ambiente protegidas da


28

luz. Após três lavagens, adicionou-se 100µL/orifício do substrato TMB (Sigma 3, 3’, 5,

5’ - Tetramethylbenzidine, EUA) para revelação no leitor e levou-se à estufa a 37ºC por

20 minutos (Forma Scientific, EUA). Para interromper a reação, aplicou-se

32ug/orifício de ácido sulfúrico (H2SO4) a 2,5 M. Em seguida, realizou-se a leitura em

leitor de ELISA (ELX800 Biotek Instruments VT, USA) a 490nm para IgG e os valores

gerados foram expressos como densidade óptica (absorbância). Utilizou-se em todas as

placas controles positivos e negativos e o ponto de corte “cut-off” foi estabelecido pela

média de leituras dos soros de oito hamsters não infectados.

5.7Immunoblotting para identificação de anticorpos IgG

A técnica de eletrotransferência do experimento de immunoblotting foi

executada de acordo com o método de Towbin et al. (1979), em uma membrana de

polivinilfluorideno (PVDF) (Sigma-Aldrich®, EUA). As alíquotas de 40µg de extrato

solúvel, bruto e particulado de L. amazonensis (para o gel e membrana de 7cm), e de

160µg do extrato solúvel de L. amazonensis (para o gel e membrana de 18cm) foram

submetidas a eletrotransferência do gel de poliacrilamida para membrana de PVDF em

1000 mL de solução tampão de transferência composta por Tris 20 mM, Gly 192 mM,

SDS 0,1% (m/v), pH 8,3 em metanol a 10% (v/v), utilizando-se da cuba de

eletrotransferência Semi-Dry TE 70 (Amersham Biosciences – GE, UK).

Após a medição do comprimento e altura verificou-se que os géis de separação

possuíam as dimensões de 8,6 x 8,4cm. Estas medidas foram utilizadas para recorte das

membranas de PVDF. As membranas recortadas foram imersas em 50mL de metanol a

10% (v/v) para ativação por 1 minuto, depois em 50mL de água por 5 minutos e, em

seguida, as membranas foram imersas em 50mL de tampão de eletrotransferência (Tris

20 mM, Gly 192 mM, SDS 0,1% (m/v), pH 8,3) por 10 minutos juntamente com seis

folhas de papel filtro recortadas em dimensões idênticas as das membranas de PVDF. O

gel de poliacrilamida foi imerso em 50mL do tampão de eletrotransferência por 30

minutos para equilíbrio neste tampão. As folhas de papel, gel de poliacrilamida e

membrana de PVDF foram levados para a cuba de eletrotransferência e empilhados na

superfície do catodo da cuba, colocando-se primeiro as 3 folhas de papel filtro, em

seguida o gel, subsequentemente a membrana e outras 3 folhas de papel filtro. Os

parâmetros elétricos empregados foram 50V, 70mA por 10 minutos para os géis com


29

dimensões de 8,6 x 8,4 cm. Ao adicionar as folhas utilizou-se de um tubo de plástico

para retirada de bolhas de ar que possivelmente diminuiria a eficiência da transferência

das proteínas.

Após a eletrotransferência, a membrana de PVDF foi imersa em 50mL de

solução tampão TBS-Tween 20 a 0,1% (v/v), pH 7,4, 3 vezes de 5 minutos. Em seguida,

a membrana foi imersa em 100mL de tampão TBS-Tween 20 a 0,1% (v/v) e leite em pó

desnatado 5% (m/v), a fim de bloquear as ligações inespecíficas, em temperatura

ambiente por 30 minutos. Após este período a membrana foi lavada com 50mL tampão

TBS-Tween 20 a 0,1% (v/v) 3 vezes de 5 minutos para retirada do excesso de leite. A

solução com 10mL de anticorpos primários foi feita pela solubilização de soro total de

hamsters imunizados com as diferentes frações antigênicas de L. amazonensis em TBS-

Tween 20 a 0,1% (v/v) e leite em pó 5% (m/v) a concentração de 1:200 para a

membrana de 7 cm. No entanto, para a membrana de 18 cm, foi utilizado pool de soros

dos três grupos vacinais LASap, LASapSol

e LASapPart

, sendo 33,3µL obtidos de cada

grupo, que somados, seriam 100µL, volume necessário para a diluição de 1:200, em um

volume final de 20mL de solução. À membrana (8,6 x 8,4 cm) foi adicionada 20mL da

solução descrita acima e submetida à agitação por 3 horas em temperatura ambiente.

Após essa etapa, a membrana foi lavada com 20mL de TBS-Tween 20 a 0,1%

(v/v) pH 7,4, por três vezes durante 10 minutos em TA para remoção de anticorpos em

excesso. A seguir, a membrana foi incubada com a solução de anticorpo secundário

anti-IgG de hamster, HRPO conjugado (Caltag Laboratories – HA6007) na diluição de

1:2000 em TBS-Tween 20 a 0,1% (v/v) por 1 hora, em temperatura ambiente. Após essa

etapa, a membrana foi lavada com 20mL de TBS-Tween 20 0,1% (v/v) pH 7,4 por três

vezes durante 10 minutos cada lavagem a temperatura ambiente. Em sequência, a

membrana foi submetida à revelação por substrato cromogênico 4-Cloro-1-Naftol na

seguinte solução: 6mg de 4-cloro-1- naftol, 1 mL de metanol, 10 mL de solução TBS

pH 7,4 e 50 μL de peroxido de hidrogênio a 30 volumes.

5.8 Análises Estatísticas

As análises estatísticas foram realizadas usando o GraphPadPrism 6.0

(PrismSoftware, Irvine, CA, USA). Depois de demonstrada a normalidade dos dados

usando oteste Kolmogorov-Smirnoff, foi realizada análise de variância (ANOVA one-


30

way) seguidado teste de Tukey para determinar as diferenças específicas entre os grupos.

Em todas as análises estatísticas as diferenças foram consideradas significativas quando

o valor de P foi menor que 0,05.

Amorim, D.R. Resultados

31

6. Resultados


32

6.1Hemograma – séries vermelha e branca

Considerando a escassez de reagentes para análise de aspectos relacionados à resposta

imune em hamsters, este trabalho avaliou a resposta celular pelo estudo de parâmetros

hematológicos. Deste modo, foi realizada a análise da série vermelha, incluindo a contagem

de plaquetas (Tabela 1), além do leucograma (Tabela 2).

Foram realizadas comparações em relação ao grupo controle e saponina em função das

diferentes frações antigênicas após o protocolo vacinal. Nesse sentido, a análise da série

vermelhademonstrou aumento (p<0,05) na global de eritrócitosdos grupos LASol

(7,756±0,5528), LAPart

(7,566±0,2016) e LASap (7,484±0,2878) em relação ao grupo

saponina (6.899±0,7140). Entretanto, vale destacar que os valores relacionados ao global de

eritrócitos, de todos os grupos avaliados, encontram-se dentro do limite normal (6-8 x

106/mm

3), conforme descrito por Lapchil et al. (2009). Não foram observadas outras

alterações hematológicas após o protocolo vacinal para os diferentes grupos avaliados (Tabela

1).

Os resultados referentes ao leucograma (Tabela 2) demonstram que não houve

alteração na contagem global de leucócitos nos grupos avaliados. Entretanto, quando realizada

a contagem diferencial das células observou-se que a fração antigênica composta apenas por

antígeno bruto (LA) apresentouaumento (p<0,05)de eosinófilos (57±12) e linfócitos

(4406±65) em relação ao grupo controle (p<0,05).

Na fração antigênica de antígeno solúvel (LASol

) houve aumento(p<0,05) de linfócitos

(4818±69) quando comparado aos grupos controle, saponina e LA. Na fração antigênica de

antígeno bruto particulado (LAPart

) houve aumento(p<0,05) de eosinófilos (66±23) quando

comparado ao grupo controle (p<0,05). Em relação aos monócitos, houve aumento(p<0,05)

no grupo LAPart

(363±44) quando comparado ao grupo LASol

, bem como aumento (p<0,05)na

população de linfócitos (5058±150) quando comparado aos grupos controle, saponina e LA

(p<0,05).Na fração antigênica de antígeno bruto associado a saponina (LASap) observou-se

aumento(p<0,05) de neutrófilos (1091±62) quando comparado ao grupo LASol

. Em relação

aos eosinófilos (7±4) houve redução(p<0,05) no grupo LASap quando comparado ao grupo

LA e LAPart

(p<0,05), bem como redução(p<0,05)na população de monócitos (171±12)

quando comparado aos grupos controle, saponina, LA, LASol

e LAPart

. Em relação aos

resultados referentes à fração antigênica de antígeno solúvel associado à saponina (LASapSol

)

houve aumento (p<0,05)de neutrófilos (1516±209) quando comparado aos grupos saponina,


33

LA, LASol

, LAPart

e LASap (p<0,05), além de reduçã (p<0,05) de monócitos (240±42)

comparado ao grupo LAPart

, e aumento (p<0,05) de linfócitos (5824±229) quando comparado

aos grupos controle, saponina, LA, LASol

, LAPart

e LASap (p<0,05). Em relação aos resultados

referentes à fração antigênica de antígeno particulado associado à saponina (LASapPart

) houve

redução (p<0,05)de neutrófilos (918±31) quando comparado aos grupos LASap e

LASapsol

(p<0,05), além de redução (p<0,05) de monócitos (129±28) comparado aos grupos

controle, saponina, LA, LASol

, LAPart

e LASapSol

, e aumento (p<0,05)de linfócitos (4391±45)

comparado aos grupos controle e saponinae redução (p<0,05) em relação aos grupos LASol

,

LAPart

, LASap e LASapSol

.

Os componentes vacinais empregados neste trabalho não devem induzir efeitos

tóxicos, tais como: perda de pêlos no local do inóculo, anorexia, apatia, vômito, dentre outros

(Santos et al., 2002).

Levando em consideração os efeitos colaterais causados pela saponina (Cleland et al.,

1996; Ragupathi et al., 2011), no presente trabalho foi realizada avaliação macroscópica do

local do inóculo, bem como acompanhamento do comportamento dos hamsters imunizados.

Dessa forma, foi observada a presença de uma pápula de 2,3mm em apenas um animal do

grupo inoculado com o adjuvante saponina, após 24 horas do inóculo. Para o restante não

houve nenhuma alteração nos animais inoculados após 24, 48 e 72 horas após cada inóculo

das formulações vacinais, na presença ou ausência da saponina.


34

Tabela 1. Eritrograma de hamsters submetidos a diferentes protocolos vacinais.

Eritrograma Após Protocolo Vacinal

Controle Sap LA LASol

LAPart

LASap LASapSol

LASapPart

Eritrócitos (106/uL) 7,363±0,9197 6.899±0,714 7,403±0,347 7,756±0,5528b 7,566±0,2016

b 7,484±0,2878

b 7,349±0,5169 6,861±1,555

Hemoglobina (g/dL)

17,21±1,474 16,80±1,641 17,60±0,7672 17,95±0,7635 17,51±0,3796 17,53±0,5701 17,56±1,053 16,04±3,761

Hematócrito (%)

41,21±4,980 38,26±4,144 39,81±4,113 42,25±3,671 40,74±1,293 40,73±1,529 41,01±2,848 37,70±8,633

Plaquetas (103/uL) 127,5±46,25 133,0±47,57 102,6±22,04 108,5±34,74 114,0±20,43 112,8±22,76 129,5±31,96 116,1±28,89

Grupos: Controle (C, n=8), adjuvante saponina (Sap, n=8), Antígeno bruto de L. amazonensis (LA, n=8), antígeno solúvel de L. amazonensis

(LASol

, n=8), antígeno particulado de L. amazonensis (LAPart

, n=8), antígeno LA associado ao adjuvante saponina (LASap, n=8), antígeno LASol


, n=8) e antígeno LAPart


, n=8). Diferença estatística

(p<0,05) indicada pela presença da letra, onde “a” indica diferença em relação ao grupo controle, “b” em relação ao grupo saponina, “c” em

relação ao grupo LA, “d” em relação ao grupo LASol

, “e” em relação ao grupo LAPart

,“f” em relação ao grupo LASap, e “g” em relação ao

grupo LASapSol

. Os valores se referem à média do grupo ± desvio padrão.


35

Tabela 2. Leucograma de hamsters controle e submetidos a diferentes protocolos vacinais.

Leucograma Após Protocolo Vacinal

Controle Sap LA LASol

LAPart

LASap LASapSol

LASapPart

Global de Leucócitos (mm3) 5163±1762 5388±2759 5713±1159 6050±2265 6600±2108 5938±1029 7675±2870 5438±1655

Neutrófilos Totais 1168±195 1017±144 964±60 946±53 1114±160 1091±62d 1516±209

bcdef 918±31

fg

Eosinófilos 6±6 34±25 57±12a 30±17 66±23

a 7±4

ce 0±0 0±0

Monócitos 297±70 317±62 307±28 257±45 363±44d 171±12

abcde 240±42

e 129±28

abcdeg

Linfócitos 3698±176 4088±152 4406±65ab

4818±69abc

5058±150abc

4743±50abce

5824±229abcdef

4391±45abdefg

Grupos: Controle (C, n=8), adjuvante saponina (Sap, n=8), Antígeno bruto de L.amazonensis (LA, n=8), antígeno solúvel de L. amazonensis

(LASol

, n=8), antígeno particulado de L. amazonensis (LAPart

, n=8), antígeno LA associado ao adjuvante saponina (LASap, n=8), antígeno

LASol


, n=8) e antígeno LAPart


, n=8). Diferença estatística

(p<0,05) indicada pela presença da letra, onde “a” indica diferença em relação ao grupo controle, “b” em relação ao grupo saponina, “c” em

relação ao grupo LA, “d” em relação ao grupo LASol

, “e” em relação ao grupo LAPart

,“f” em relação ao grupo LASap, e “g” em relação ao

grupo LASapSol

. Os valores se referem à média do grupo ± desvio padrão.


36

6.2Avaliação da resposta humoral

A análise de antigenicidade foi realizada através de amostras de soro dos

hamsters dos diferentes grupos experimentais, buscando avaliar a reatividade de IgG

total anti-Leishmania. A Figura 1 ilustra as diferentes densidades ópticas. Após o

protocolo vacinal, foi observado que em todos os grupos em que houve inóculo com

antígeno, independente de sua formulação, apresentaram valores de densidade óptica

acima do cutt-off.Além disto, foi observado aumento (p<0,05)dos níveis de IgG total

nos grupos LA (0,13±0,02), LAPart

(0,17±0,07), LASap (0,29±0,13), LASapSol

(0,56±0,13) e LASapPart

(0,22±0,063) em relação ao grupo controle (0,05±0,01). Houve

aumento (p<0,05) também nos grupos LA (0,13±0,02) e LASapPart

(0,22±0,06) em

relação ao grupo saponina (0,05±0,02). Além disso, foi observado aindaaumento

(p<0,05) dos níveis de IgG total no grupo LASapSol

(0,56±0,13) em relação aos grupos

LASap (0,29±0,13) e LASapPart

(0,22±0,06).

Pode-se observar que o grupo que obteve maiores níveis de IgG total (LASapSol

)

também foi o que apresentou maior aumento de linfócitos em relação ao grupo controle

como pode ser visto na Tabela 2.

Figura 1: Reatividade de IgG total no soro de hamsters dos antes da 1ª imunização (pré imune) e após 15

dias da 3ª imunização nos diferentes grupos avaliados, entre os quais: Controle (C, n=8);Adjuvante

saponina (Sap, n=8); Antígeno bruto de L .amazonensis (LA, n=8);Antígeno solúvel de L. amazonensis

(LASol

, n=8);Antígeno particulado de L. amazonensis (LAPart

, n=8), Antígeno LA associado ao adjuvante

saponina (LASap, n=8); Antígeno LASol


, n=8); e Antígeno

LAPart


, n=8). Os resultados foram expressos como valores

médios de densidade óptica e desvio padrão. Diferenças significativas (p<0,05) entre as densidades

ópticas de IgG dos diferentes grupos vacinais foram representadas pelas letras acima de cada grupo. A

letra “b” representa diferença significativa em relação ao grupo C. A letra “c” representa diferença

significativa em relação ao grupo Sap. A letra “g” representa diferença significativa em relação ao grupo

LASap. A letra “i” representa diferença significativa em relação ao grupo LASapPart

. O “Cut off”= 0,096

está representado no gráfico pela linha tracejada.


37

6.3 Identificação de proteínas imunogênicas por western blot

A fim de identificarpossíveis candidatos vacinais foi realizado o ensaio de

immunoblotting empregando as frações antigênicas vacinais associadas ao soro dos

animais imunizados. Nesse sentido, as quatro tiras à esquerda na figura 2 representam o

gel com o padrão de proteínas e com as bandas marcadas pertinentes às três frações de

L. amazonensis, as quais apresentaram o mesmo perfil protéico. O resultado do western

blot, representado nas quatro tiras à direita da figura 2, indicou que, embora os animais

tenham sido imunizados com diferentes formulações LASap, LASapSol

e LASapPart

, o

padrão de reconhecimento antigênico foi mantido, com bandas próximas de 40 kDa, de

30 kDa e bandas entre 20 e 30 kDa, para as três formulações (Figura 2, painel direito).

Além do potencial vacinal, os resultados aqui encontrados podem ser importantes

também na realização de diagnóstico da leishmaniose.

Figura 2: Westernblot com soros de hamsters controle (C) e imunizados com as vacinas LASap,

LASapSol

e LASapPart

, apresentando perfil de reconhecimento antigênico semelhante, com bandas da

ordem de 40 kDa, 30 kDa e inferiores a 30 kDa.Controle (C, n=8), antígeno LA associado ao adjuvante

saponina (LASap, n=8), antígeno LASol


, n=8) e antígeno

LAPart associado ao adjuvante saponina (LASapPart

, n=8).As quatro primeiras tiras representam o gel

marcando bandas inespecíficas para as três fomulações vacinais. As quatro tiras da direita representam a

membrana reveladora do immunoblotting marcando apenas as bandas específicas para proteínas com

reatividade imunogênica anti-Leishmania.

LASap LASapSolLASapPart Padrão C LASap LASapSolLASapPart

Amorim, D.R. Discussão

38

7. Discussão


39

Um dos grandes desafios relacionados ao controle da leishmaniose visceral

(LV) no Brasil e na Europa consiste na identificação de uma formulação que seja capaz

de proteger o cão. Isto permitiria que o cãodeixasse de ser considerado reservatório do

parasito e, consequentemente, continuasse transmitindo o parasito a outros cães ou

mesmo para o homem (Reis et al., 2010). Atualmente, as vacinas comercialmente

disponíveis contra leishmaniose visceralcanina (LVC) no Brasil (Leish-Tec®) e na

Europa (CaniLeish®

) não são capazes de induzir imunidade estéril. Assim, o cão

imunizado com estas vacinas poderia se infectar com o parasito e manter um quadro

clínico assintomático (Fernandes et al,. 2008; Reis et al., 2009;Bongiornoet al.,

2013;Martin et al., 2014;Olivaet al., 2014; Gradoni et al., 2015). Por este motivo,

mesmo após o processo de imunização, o cão pode ser infectado e transmitir o parasito

na área endêmicapara LV (Bongiornoet al. 2013). Deste modo, o Ministério da Saúde

de nosso país ainda não recomenda a utilização de qualquer formulação vacinal como

estratégia de controle da LVC (Ministério da Saúde, 2006). Nesse sentido há a

necessidade de novos estudos os quais viabilizem uma formulação vacinal que seja

eficaz e contribua efetivamente no combate contra essa doença.

Trabalhos do nosso grupo de pesquisa demonstraram que a formulação vacinal

composta por antígenos de L. braziliensis associado à saponina (vacina LBSap),ou esta

formulação acrescida doextrato da glândula do flebotomíneo (vacina LBSapSal) foram

capazes de induzir forteimunogenicidadee elevados níveis de proteção em cães

(Giunchetti et al., 2007; Giunchetti et al., 2008; Roatt et al., 2012; Resendeet al., 2013;

Aguiar-Soares et al., 2014). Além disso, Grenfell e colaboradores (2010) demonstraram

que empregando extratos antigênicos de cepas dermatotrópicas (L. amazonensis e L.

braziliensis), associados à saponina foram capazes de induzir proteção em

camundongos BALB/c infectados por L. chagasi. Mais recentemente, Guedes e

colaboradores (2014) demonstraram que a vacinação intranasal com serinas proteases

extracelulares purificadas de L. amazonensis foram capazes de conferir imunidade

protetora em modelo murinoinfectado por L. amazonensis.

Vale ressaltar que o grupo coordenado pelo Prof. Mayrink e pelo Prof. Genaro

na UFMG permitiu a formação de uma escola de vacinologia em leishmanioses no

Brasil (Melo et al., 1977; Mayrink et al., 1979; Barros, et al., 1980; Mayrink et al.,

1985; Antunes et al., 1986; Mayrink et al., 1986; Mayrink et al., 1990; Genaro et al.,

1993a,b

; Genaro et al., 1996;Mendonça et al., 1995) e que estabeleceu os pilares ao qual


40

estão apoiadas as linhas de pesquisa atualmente em desenvolvimento por nosso grupo

de pesquisa. Os estudos conduzidos pelo Prof. Odair Genaro no final da década de 80

estimulou o desenvolvimento de vacinas contra LVC, permitindo a identificação de

antígenos de Leishmania indutores ou inibidores da atividade linfoproliferativa in vitro

de células caninas (Genaro, dados não publicados). Neste contexto, foi observado por

Genaro, que células de cães com LV quando estimuladas in vitro com antígeno de L.

chagasi apresentavam atividade linfoproliferativa inibida. Por outro lado, quando se

utilizava antígeno de Leishmania proveniente de cepas dermatotrópicas, a atividade

linfoproliferativa de cães imunizados com os mesmos antígenos aumentava

significativamente. Estes resultados indicaram que cepas dermatotrópicas de

Leishmania poderiam conter antígenos com alta capacidade de induzir imunogenicidade

protetora contra a infecção heteróloga por L. chagasi. Estes achados têm estimulado até

hoje nosso grupo de pesquisa, liderado pelo Prof. Rodolfo C. Giunchetti, e sediado na

UFMG, a triar antígenos de cepas dermatotrópicas de Leishmania como estratégia

racional para o desenvolviemtno de uma vacina protetora contra a LVC.

Diante do exposto, este estudo teve como foco principal estudar diferentes

formulações vacinais contendoantígenos de L. amazonensis a fim de avaliar aspectos

gerais relacionados à inocuidade, toxicidade e imunogenicidade em hamsters.

A primeira abordagem utilizada em ensaios pré-clínicos vacinais preconiza a

caracterização de segurança e inocuidade do imunobiológico empregado. Os dados

desse trabalhosobre avaliação da inocuidade e toxicidade estão de acordo com o

trabalho de Garg e Dube, (2006) e Moreira et al. (2009) que descreveram que hamsters

não apresentam efeito colateral quando inoculadoscom antígeno bruto de Leishmania

associado ou não a saponina.É consenso que o adjuvante atua de forma significativa na

indução de efeitos adversos em vacinas, sendo descrita algumas alterações relacionadas

ao uso da saponina em cães (Parra et al., 2007; Rajput et al., 2007). Entretanto, nosso

grupo de pesquisa não tem verificado efeitos adversos nas formulações vacinais

utilizando a saponina como adjuvante, quando avaliadas em modelo murino (Vitoriano-

Souza et al., 2012), hamsters (Moreira et al., 2009) e em cães (Giunchetti et al., 2007;

Giunchetti et al., 2008).

Moreira e colaboradores (2009) demonstraram que o adjuvate saponina

apresenta-se como um excelente indutor de resposta celular em hamsters. Vale ressaltar

que o adjuvante em questão pode exercer um papel hemolítico de acordo com a dose


41

empregada (Santos et al., 1997). Sendo assim torna-se relevante a realização do

eritrograma para o monitoramento e acompanhamento clínico dos animais após o

inóculo das formulações vacinais. Nesse sentido, no presente estudo não foi observada a

ocorrência de alteraçõeslocal (dor, inchaço e ulceração) ou sistêmica (alterações clínico-

comportamentais e anemia) nos animais vacinados (Tabela 1). Destaca-se ainda que em

todos os grupos avaliados o número de eritrócitos estava dentro dos limites normais

encontrados em hamsters (Lapchik et al., 2009).

O estudo da resposta imune celularé fundamental após a imunização contra

agentes infecciosos. Sendo assim, a realização do leucograma completo é um

importante parâmetro, uma vez que para o modelo hamster há carência de reagentes

para estudo da resposta imune. Dessa forma, o presente estudo avaliou a resposta imune

sistêmica através da análise de leucograma completo (Tabela 2). Ao considerar apenas

as diferenças significativas que foram observadas em relação ao grupo controle, e que

por este motivo, poderiam ser resultado da formulação vacinal, verificou-se: aumento

no número de eosinófilo (grupo LA e LAPart

), além de aumento (LASap) e redução

(LASapPart

) no número de monócitos (Tabela 2). A eosinofilia observada poderia estar

relacionada a eventos alérgicos, embora clinicamente não tenha sido constatada

nenhuma alteração. Este resultado aponta para a importância de se avaliar em futuros

estudos os níveis de IgE antígeno-específicos, buscando verificar se estas formulações

seriam capazes de induzir um processo alérgico. Vale ressaltar que a monocitose

verificada no grupo LASap, também foi observada durante o processo de imunização

com a vacina LBSap (Giunchetti et al., 2007). Neste estudo, Giunchetti et al. (2007)

relacionaram a monocitose como um dos eventos relacionados ao estabelecimento de

uma intensa imunogenicidade para a vacina LBSap. Além disto, Mendonça et al. (2015)

relatou a indução de monócitos CD14+circulantes em camundongos BALB/c, após

imunização com as vacinas LBSap, Leish-Tec® e Leishmune

®. Este resultado foi

relacionadoao estabelecimento de eventos imunoprotetores com manutenção de baixa

carga parasitária após o desafio experimental (Mendonça et al., 2015).

Do ponto de vista das células avaliadas pelo leucograma e que poderiam estar

associadas à imunidade adaptativa, destaca-se o aumento de linfócitos encontrado em

todos os grupos em que foi utilizado antígeno de L. amazonensis (LA, LASol

, LAPart

,

LASap, LASapSol

, LASapPart

; Tabela 2).Este resultado, poderia indicar um efeito

biológico característico da vacinação empregando-se antígenos de espécies


42

dermatotrópicas (Mayrink et al., 1996; Giunchetti et al., 2007; Giunchetti et al., 2008;

Moreira et al., 2009, Mendonça et al., 2015) os mesmos presentes em vacinas como a

Leish-Tec® ou Leishmune

® (Mendonça et al., 2015). Esse resultado poderia

serinteressante para uma vacina contra leishmaniose visceral uma vez que o perfil de

resistência está relacionado à resposta imune celular, sendo os linfócitos as principais

células na defesa contra o estabelecimento da doença (Giunchetti et al., 2007;

Giunchetti et al., 2008; Moreira et al., 2009). Entretanto, embora o aumento de

linfócitos totais tenha sido descrito com um dos marcadores de estabelecimento de

imunogenicidade em vacinas contra a LV, a caracterização da subpopulação de

linfócitos que contribuiria este aumento, bem como o perfil de citocinas e dados de

carga parasitária, seriamfundamentias para relacionar este resultado, de forma mais

segura, com o estabelecimento de imunidade protetora.

O estudo da resposta imune humoral é outro importante parâmetro na avaliação

da resposta imune no que diz respeito à indução de antigenicidade em animais

imunizados. Nesse sentido, foi realizadaa dosagem de IgG total Leishmania-

inespecífico em amostras de soro de hamsters infectados por L. chagasi por ELISA. Os

resultados demonstraram que os níveis de IgG total anti-Leishmania apresentaram-se

acima do limiar estabelecido pelo cutt-off para todas as formulações vacinais (Figura 1),

indicando antigenicidade dos antígenos avaliados.Verificou-se ainda uma tendência de

aumento nos níveis de IgG nas formulações associadas à saponina, especialmente no

grupo LASapSol

(Figura 1). Como as reações de ELISA foram realizadas com antígeno

solúvel de L. chagasi, é possível especular que o aumento dos níveis de IgG total

observado quando utilizado o antígeno LASol

, esteja relacionado ao tipo do antígeno

vacinal e diagnóstico (ambos solúveis). Diferentes estudos têm demonstrado resultados

semelhantes, evidenciando aumento nos níveis de IgG total após o processo de

imunização (Giunchetti et al., 2007, Giunchetti et al., 2008, Kumari et al., 2009, Roatt

et al., 2012, Aguiar-Soares et al., 2014, Mendonça et al., 2015). Bhowmick et al. (2014)

demonstraram que o balanço de IL-4 e INF-γ associado às diferentes subclasses de IgG,

em modelo murino, são importantes para a caracterização de bons alvos vacinais. Nieto

e colaboradores (2011) descrevem a importância do balanço da reposta imune celular e

humoral apresentada por hamsters experimentalmente infectados por LV. Embora no

presente estudo não tenha sido avaliado isotipos de IgG que poderiam demonstrar um

perfil de imunogenicidade protetora, têm sido descrito que antígenos brutos de cepas


43

dermatotrópicas são capazes de induzir elevados níveis de IgG total, com aumento

simultâneo da razão IgG2a/IgG1 (Mendonça et al., 2015, dados submetidos). Este

resultado, aliado ao baixo parasitismo tecidual observado no baço e fígado de

camundongos imunizados com a vacina LBSap e desafiados com L. chagasi indicou o

estabelecimento de imunogenicidade protetora (Mendonça et al., 2015, dados

submetidos). Diante do exposto fica evidente que será necessária a análise de novos

estudos buscando avaliar subclasses de IgG (IgG1 e IgG2), para auxiliar na

caracterizaçãodo perfil da resposta imune induzido pelas formulações avaliadas no

presente estudo.

Na busca pela triagem decandidatos vacinais anti-Leishmania, diferentes

técnicas de biologia molecular vêm sendo utilizadas. Nessa área destaca-se a

proteômica, metodologia que permite a identificação de proteínas imunogênicas com

grande precisão (Kumari et al., 2008). No presente estudo, os resultados do western blot

indicaram que os animais imunizados com diferentes formulações vacinais (LASap,

LASapSol

e LASapPart

) apresentaram o mesmo padrão de reconhecimento antigênico. As

bandas apresentadas foram da ordem de: 25 kDa, 35 kDa e 40 kDa (Figura 2). Grupta et

al. (2007) em um estudo preliminar identificaram uma proteína solúvel de L. donovani

da ordem de 68 a 97 kDa, capaz de induzir uma resposta do tipo 1 em PBMC de

pacientes curados após infecção por Leishmania e hamsters infectados. Kushawaha et

al. (2011) realizaram a clonagem, expressão, purificação e caracterização molecular da

proteína proposta por Grupta et al. (2007) e comprovaramsua capacidade protetora após

desafio experimental, demonstrando a importância dessa abordagem. Kumari et al.

(2012) identificaram bandas da ordem de 50 a 80 kDa utilizando sub-frações antigênicas

da membrana de amastigotas de L. donovani. Essas sub-frações foram capazes de

estimular a linfoproliferação em hamsters, além da produção de INF-γ, IL-12 e óxido

nítrico em pacientes curados e hamsters experimentalmente infectados. Kashino et al.

(2012) empregaram uma abordagem inovadora e identificaram antígenos de L. infantum

que, associados a formulações vacinais, podem induzir proteção em camundongos

desafiados devido a um perfil de resposta do tipo 1, em que foi observado redução da

carga parasitária no baço.

Amorim, D.R. Conclusão

44

Conclusão

As análises sobre toxicidade e inocuidade mostraram que a administração das

formulações vacinais utilizadas é segura e não provocou alterações, de uma forma geral,

em hamsters.

As três formulações contendo antígenos de Leishmania associado ao adjuvante

(LASap, LASapSol

, LASapPart

) mostraram intensa antigenicidade, estimulam a

realização de novos estudos para caracterização da resposta imune celular e análise dos

níveis de proteção.

Os animais imunizados com as formulações LASap, LASapSol

, LASapPart

apresentaram um padrão de bandas identificadas pelo immunoblotting semelhantes (25

kDa, 35 kDa e 40 kDa), associado à indução de linfócitos circulantes e de IgG total anti-

Leishmania, indicando o potencial destas proteínas antigências como potenciais alvos

vacinais ou para serem utilizadas como diagnóstico da leishmaniose visceral.

Amorim, D.R. Perspectivas

45

Perspectivas

A fim de estudar melhor osefeitos protetores das formulações vacinais

utilizadas neste estudo, alguns procedimentos serão importantes tais como:

1. Avaliar as subclasses de IgG presentes na composição de IgG total e

suas dosagens;

2. Purificar e testar as proteínas, encontradas por western blotting, para o

potencial imunogênico e de diagnóstico;

3. Avaliar a eficácia vacinal através de técnicas histopatológicas e

principlamente pela realização de PCR em tempo real (qPCR).

Amorim, D.R. Referência Bibliográfica

46

8. Referência Bibliográfica


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Amorim, D.R. Anexo

65

Anexo

UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS

CEUA COMISSÃO DE ÉTICA NO USO DE ANIMAIS

CERTIFICADO Certificamos que o Protocolo nº. 385 / 2013, relativo ao projeto intitulado “Análise dos níveis de proteção em

plataforma de teste in vivo empregado-se novos candidatos vacinais contra Leishmaniose Visceral”, que tem como

responsável Rodolfo Cordeiro Giunchetti, está de acordo com os Princípios Éticos da Experimentação Animal,

adotados pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA/UFMG), tendo sido aprovado na reunião de 11/03/2014.

Este certificado espira-se em 11/03/2019.

CERTIFICATE

We hereby certify that the Protocol nº. 385 / 2013, related to the Project entilted “Analysis of the protection levels in in

vivo testing platform used to new vaccine candidates against visceral leishmaniasis”, under the supervision of Rodolfo

Cordeiro Giunchetti, is in agreement with the Ethical Principles in Animal Experimentation, adopted by the Ethics

Committee in Animal Experimentation (CEUA/UFMG), and was approved in 11/03/2014. This certificates expires in

11/03/2019.

FRANCISNETE GRACIANE ARAUJO MARTINS

Coordenador(a) da CEUA/UFMG

Belo Horizonte, 11/03/2014.

Atenciosamente.

Sistema CEUA-UFMG

https://www.ufmg.br/bioetica/cetea/ceua/

Universidade Federal de Minas Gerais

Avenida Antônio Carlos, 6627 – Campus Pampulha

Unidade Administrativa II – 2º Andar, Sala 2005

31270-901 – Belo Horizonte, MG – Brasil

Telefone: (31) 3499-4516 – Fax: (31) 3499-4592

www.ufmg.br/bioetica/cetea - [email protected]

Roteiro de preenchimento para o PAPES V · Brasil. Diversos pesquisadores no mundo tem buscado...

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