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Rubéola IgG

Código: Formato: 3 x 12 testes 60400002 Versão: 400/P5

P

O kit ImmunoComb

® II Rubella IgG é um teste para a

determinação quantitativa de anticorpos IgG para o vírus da Rubéola em soro ou plasma humano. Podem ser realizados trinta e seis testes com o kit.

Introdução O vírus da Rubéola é um membro da família Togaviridate, encontrado principalmente em populações humanas. A transmissão se dá principalmente por aerossóis ou por contato direto, com um pico de incidência da doença na faixa etária de 5-14 anos. Em geral, a infecção se manifesta como uma doença benigna e autolimitante, caracterizada por erupção maculopapoular (sarampo), febre tênue e linfoadenopatia. Podem ocorrer ocasionalmente artralgia provisória e artrite suave. Ao contrário, a infecção primária por Rubéola contraída durante o início da gravidez, pode resultar em danos severos ao feto, natimorto ou aborto. Os sintomas de crianças com infecção congênita incluem anormalidades anatômicas e neuro-sensoriais sérias, tais como surdez, defeitos cardíacos, catarata, glaucoma e retardo mental. O retardo no crescimento e a diabete mellitus também foram associados com complicações posteriores da rubéola congênita. A vacinação em massa tem reduzido significativamente a incidência de Rubéola em todas as faixas etárias. Entretanto, 10 a 20% de jovens adultos ainda são suscetíveis ao vírus. A triagem de anticorpos IgG para o vírus da rubéola é uma ferramenta útil para o diagnóstico da doença e para a determinação do estado da imunização. Os anticorpos para o vírus aparecem à medida que a erupção diminui. Nos adultos, os anticorpos IgG geralmente, persistem por toda a vida. Conseqüentemente, um título estável de IgG anti-rubéola demonstra a exposição prévia ao vírus, enquanto um aumento quadruplicado ou maior é diagnóstico de infecção recente. Entretanto, um aumento no título de IgG na ausência de sintomas clínicos, pode também indicar reinfecção. Como os anticorpos IgM não são produzidos na reinfecção, esta possibilidade deve ser excluída por um resultado negativo em um teste anti-rubéola IgM. A produção de anticorpos IgG circulantes contra o vírus da Rubéola por crianças infectadas congenitamente, geralmente persiste até 3-4 anos após o parto. A determinação seriada do nível de IgG anti-rubéola na criança, no entanto, irá ajudar na diferenciação entre Rubéola congênita (nível estável) ou Rubéola neonatal (aumento no título).

Princípio do Teste O teste ImmunoComb® II Rubella IgG é um ensaio imunoenzimático (EIA) indireto em fase sólida. A fase sólida é um pente com doze projeções (“dentes”). Cada dente é sensibilizado em duas posições: Ponto superior – Imunoglobulina humana (Controle Interno). Ponto inferior – Antígenos de Rubéola inativados. A Placa Reveladora tem 6 fileiras (A-F) de 12 cavidades, cada fileira contendo reagente pronto para uso em diferentes etapas do ensaio. O teste é realizado por etapas, movendo-se o Pente de fileira a fileira com incubação em cada etapa. Antes de iniciar o teste, amostras de soro ou plasma são pré-diluídas 1:11 e adicionadas ao diluente nas cavidades da fileira A da Placa Reveladora. O Pente é então colocado nas cavidades da fileira A. Anticorpos contra o vírus da Rubéola, se presentes na amostra, irão ligar-se especificamente aos antígenos de rubéola nos pontos inferiores dos dentes do Pente (Figura 1). Os componentes não ligados são removidos por lavagem na fileira B. Na fileira C, os IgG anti-Rubéola capturados nos pontos inferiores dos dentes, e a imunoglobulina humana dos pontos superiores (Controle Interno), reagirão com anticorpos anti-IgG humano marcados com fosfatase alcalina (FA). Nas próximas duas fileiras, os componentes não ligados são removidos por lavagem. Na fileira F, a fosfatase alcalina ligada irá reagir com componentes cromogênicos. Os resultados são visíveis como pontos cinza azulados na superfície do dente do Pente.

Figura 1. Princípio do Teste O kit inclui um Controle Positivo (IgG anti-Rubéola) e um Controle Negativo para serem incluídos em cada ensaio. Ao término do teste, o dente usado com o Controle Positivo deve mostrar 2 pontos cinza-azulados. O dente utilizado com o Controle Negativo deve mostrar o ponto superior e nenhum ponto inferior, ou um ponto bem claro. O ponto superior deve aparecer também em todos os outros dentes, para confirmar se o kit está funcionando adequadamente e se o teste foi realizado corretamente.

Conteúdo do Kit Pentes O kit contém 3 Pentes de plástico. Cada Pente tem 12 dentes, um dente para cada teste (Figura 2). Cada dente está sensibilizado com duas áreas reativas: Ponto superior – Imunoglobulina humana (Controle Interno). Ponto inferior – Antígenos de Rubéola inativados.

Figura 2. Pente Os pentes são fornecidos em embalagens de alumínio, contendo dessecante. Placas Reveladoras O kit contém 3 Placas Reveladoras, cobertas por folhas de alumínio.

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Cada Placa Reveladora (Figura 3) contém todos os reagentes necessários para o teste. A Placa Reveladora consiste de 6 fileiras (A-F) de 12 cavidades cada. O conteúdo de cada fileira é: Fileira A Diluente de amostra

Fileira B Solução de lavagem

Fileira C Anticorpos de cabra anti-IgG humano marcados com fosfatase alcalina.

Fileira D Solução de lavagem

Fileira E Solução de lavagem

Fileira F Solução substrato cromogênico contendo 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP) e azul de nitrotetrazolium (NBT)

Figura 3. Placa Reveladora Controle Positivo – 1 frasco (tampa vermelha) de 0,2 mL de plasma humano, inativado pelo calor, diluído para um nível de cutoff de 15 IU/mL de anticorpos IgG para o vírus da Rubéola. Controle Negativo – 1 frasco (tampa verde) de 0,2 mL de plasma humano diluído, inativado pelo calor, negativo para anticorpos para o vírus da Rubéola. Diluente da amostra – 1 frasco (tampa transparente) de 5 mL. Perfurador – para perfurar a folha de alumínio que cobre as cavidades da Placa Reveladora. CombScale

TM – para a leitura dos resultados.

Segurança e Precauções • Este kit é somente para uso diagnóstico in vitro.

• Os materiais de fonte humana usados na preparação do kit foram testados e considerados não-reativos para o antígeno de superfície de hepatite B e para anticorpos para hepatite C e para HIV. Como nenhum teste pode garantir completamente a ausência de contaminação viral, todas as soluções de referência e amostras humanas devem ser manipuladas como potencialmente infectantes.

• Usar luvas cirúrgicas e avental. Seguir os procedimentos aceitos de laboratório para trabalhar com soro ou plasma.

• Não pipetar com a boca.

• Descartar todas as amostras, Pentes (a menos que sejam guardados para documentação posterior), Placas Reveladoras e outros materiais usados com o kit como resíduo bioinfectante.

• Não misturar reagentes de lotes diferentes.

• Não usar o kit após o vencimento.

Armazemamento do Kit Armazenar o kit em sua embalagem original de 2 - 8ºC. Nestas condições, o kit permanecerá estável até a data de validade do rótulo. Não congelar o kit.

Manipulação das amostras Tanto o soro como o plasma podem ser testados. As amostras podem ser armazenadas por 7 dias de 2 - 8ºC antes do teste. Para armazenar por mais de 7 dias, congelar as amostras a –20ºC ou inferior. Centrifugar as amostras após o descongelamento. Testar o sobrenadante. Evitar repetidos ciclos de congelamento e descongelamento.

Procedimento do Teste Material Necessário

• Pipetas de precisão e ponteiras descartáveis para dispensar

10 µL, 25 µL e 100 µL.

• Tesoura.

• Cronômetro ou relógio de laboratório.

• Microtubos ou cavidades de microtitulação.

Preparando o Teste Trazer todos os reagentes, Placas Reveladoras, pentes, reagentes e amostras à temperatura ambiente e realizar o teste a temperatura de 22 – 26º C. Preparando a Placa Reveladora 1. Incubar a Placa Reveladora em uma incubadora a 37ºC por

20 minutos; ou deixar à temperatura ambiente (22 – 26ºC) por 3 horas. Trazer todos os outros componentes (pentes, diluente de amostra, controles e amostras) à temperatura ambiente.

2. Cobrir a bancada de trabalho com papel absorvente para ser descartado como resíduo bioinfectante ao final do teste.

3. Misturar os reagentes agitando a Placa reveladora.

Nota: Não remover a folha de alumínio da Placa Reveladora. Furar a cobertura de alumínio usando a ponteira descartável da pipeta ou o perfurador, somente quando for indicado, nas instruções do Teste.

Preparando o Pente Precaução: Para assegurar o correto funcionamento do teste, não tocar nos dentes do pente. 1. Rasgar o saco de alumínio do Pente na extremidade

marcada. Remover o Pente. 2. O Pente e a Placa Reveladora podem ser utilizados total ou

parcialmente. Para usar parte de um pente: a. Determinar quantos dentes são necessários para testar as

amostras e controles. Você precisa de um dente para cada teste. Cada dente mostra o número “00” do código do kit, para permitir a identificação dos dentes destacados.

b. Dobrar e quebrar o Pente verticalmente ou cortar com a tesoura (veja Figura 4) para destacar o número necessário de dentes (nº de testes incluindo 2 controles).

c. Retornar a parte do Pente não utilizada para a embalagem de alumínio (com o dessecante). Fechar bem a embalagem, por exemplo, com um clips, para manter seco. Armazenar o Pente na caixa original do kit de 2 – 8ºC para uso posterior.

Figura 4. Quebrando o Pente

Instruções do Teste Pré-diluição de Amostras e Controles

1. Para cada amostra e controle, dispensar 100 µL do diluente de amostra em um microtubo ou cavidade de microtira.

2. Para cada microtubo ou cavidade, adicionar 10 µL de uma amostra ou do Controle Positivo ou Controle Negativo fornecido no kit. Misturar aspirando e dispensando a solução repetidamente.

Reação Antígeno-Anticorpo (Fileira A da Placa Reveladora)

3. Pipetar 25 µL de uma amostra pré-diluída. Perfurar a cobertura de alumínio de uma cavidade da fileira A da Placa Reveladora com a ponteira da pipeta ou com o perfurador e dispensar a amostra no fundo da cavidade. Misturar aspirando e dispensando repetidamente a ponteira com a solução. Descartar a ponteira da pipeta.

4. Repetir o passo 3 para as outras amostras pré-diluídas, e os dois controles pré-diluídos. Usar uma nova cavidade da fileira A e trocar a ponteira para cada amostra ou controle.

5. a) Inserir o Pente (o lado impresso de frente para você) nas cavidades da fileira A contendo as amostras e controles. Misturar: Inserir e retirar o Pente nas cavidades várias

vezes. b) Deixar o Pente na fileira A por 30 minutos. Ajustar o cronômetro. Próximo ao final dos 30 minutos, perfurar a cobertura da fileira B usando o perfurador. Não abrir mais cavidades que o necessário. c) Ao final dos 30 minutos, retirar o Pente da fileira A. Absorver o líquido residual nas pontas dos dentes em

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papel absorvente limpo. Não tocar a superfície frontal dos dentes.

Primeira lavagem (Fileira B) 6. Inserir o Pente nas cavidades da fileira B. Agitar: Inserir e

retirar o Pente vigorosamente das cavidades e deixar inserido por pelo menos 10 segundos para obter uma lavagem correta. Repetir a agitação várias vezes no período de 2 minutos; neste intervalo perfurar a cobertura da fileira C. Após 2 minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual como no passo 5c.

Ligação de Conjugado (Fileira C) 7. Inserir o Pente nas cavidades da fileira C. Misturar como no

passo 5a. Ajustar o cronômetro para 20 minutos. Perfurar a cobertura da fileira D. Após 20 minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual.

Segunda lavagem (Fileira D) 8. Inserir o Pente nas cavidades da fileira D. Agitar

repetidamente por 2 minutos, como no passo 6. Neste intervalo, perfurar a cobertura da fileira E. Após 2 minutos, retirar o Pente a absorver o líquido residual.

Terceira Lavagem (Fileira E) 9. Inserir o Pente nas cavidades da fileira E. Agitar

repetidamente durante 2 minutos. Neste intervalo, perfurar a cobertura da fileira F. Após 2 minutos, retirar o Pente a absorver o líquido residual.

Reação de Cor (Fileira F) 10. Inserir o Pente nas cavidades da fileira F. Misturar. Ajustar o

cronômetro para 10 minutos. Após 10 minutos retirar o Pente.

Reação de Parada (Fileira E) 11. Inserir o Pente novamente na fileira E. Após 1 minuto retirar

o Pente e deixar secar ao ar livre. Descarte do lixo Descartar as Placas Reveladoras, ponteiras, microtubos ou cavidades de microtitulação, papel absorvente e luvas usadas, como lixo bioinfectante.

Armazenamento da parte não usada do kit Placa Reveladora Se todas as cavidades da Placa Reveladora não foram utilizadas, podem ser guardadas para uso posterior:

• Selar as cavidades utilizadas com fita adesiva de forma que nada possa respingar de dentro delas, mesmo que a Placa Reveladora tenha sido esvaziada.

Outros materiais do kit:

• Retornar o restante das Placas Reveladoras, Pentes, Controles, perfurador, diluente de amostra e instruções de uso à caixa original. Armazenar entre 2 – 8ºC.

Resultados dos Testes Validação Para confirmar o funcionamento correto do teste e demonstrar que os resultados são válidos, as três condições abaixo devem ser cumpridas (veja figura 5). 1. O Controle Positivo deve produzir dois pontos no dente do

Pente. 2. O Controle Negativo deve produzir um ponto superior

(Controle Interno). O ponto inferior não irá aparecer ou aparecerá bem fraco, não afetando a interpretação dos resultados.

3. Cada amostra testada deve produzir um ponto superior (Controle interno).

Caso alguma destas condições não seja cumprida, os resultados são inválidos e as amostras e controles devem ser retestados.

Figura 5. Validação dos testes. Leitura e Interpretação Qualitativa dos Resultados Triagem Comparar a intensidade do ponto inferior de cada dente de amostra com o ponto inferior do dente do Controle Positivo (Figura 6).

• Um ponto com intensidade maior ou igual a do controle positivo indica a presença de anticorpos IgG para o vírus da Rubéola.

• Nenhum ponto ou um ponto com intensidade menor que a do Controle Positivo é considerado um resultado negativo.

Figura 6. Resultados do Teste Interpretação Semiquantitativa por Leitura Visual O nível de IgG anti-rubéola em cada amostra pode ser estimado comparando-se a intensidade de cor do ponto inferior de cada dente com a escala de cor do CombScale fornecido com o kit. Esta comparação se dá como a seguir:

Figura 7. CombScale

1. Calibrar o CombScale. Colocar o ponto inferior do dente do

Controle Positivo sob a intensidade de cor mais semelhante ao da escala. Ajustar a régua de modo que “15; C+” apareça na janela acima da intensidade de cor selecionada.

2. Ler os resultados sem alterar a posição calibrada da régua.

Comparar a intensidade de cor de cada ponto inferior com a intensidade mais parecida da escala de cor. Marcar a concentração (em UI/mL) que aparece acima daquela janela como sendo o nível aproximado de anticorpos IgG para vírus da Rubéola para aquela amostra.

Leitura no Equipamento O refletômetro CombScan

TM (ver o Manual do Usuário do

CombScan para instruções detalhadas) permite uma leitura rápida e objetiva da intensidade da cor dos pontos do ImmunoComb. Ler os resultados dos testes como absorbância relativa usando o programa # 92 do CombScan, designando a leitura do ponto inferior digitando “1” quando aparecer a mensagem “pontos: 1,2,3” na tela. Converter as unidades de absorbância relativa obtidas em valores de título de acordo com a Tabela 1. Tabela 1. Conversão das leituras de absorbância relativa em títulos IgG. * Baseado na calibração utilizando o 2º padrão Inglês para soro anti-rubéola (67/182).

Absorbância Relativa Título (IU/mL)*

0 –799 <15

800 – 1150 15

1151 – 1550 30

1551 – 1850 60

1851 – 2100 120

≥ 2101 ≥ 240

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Documentação dos resultados Como a cor desenvolvida no Pente é estável, os pentes podem ser armazenados para documentação posterior.

Limitações

Como em outros testes destinados ao uso diagnóstico in vitro, os resultados deste teste devem ser avaliados em conjunto com todos os sintomas, histórico clínico e outros dados laboratoriais realizados para o paciente.

Características de Desempenho*

A sensibilidade e a especificidade do kit ImmunoComb II Rubella IgG foram avaliadas em um painel de 398 amostras de soro, em comparação com um teste EIA de referência.

Os resultados estão resumidos na Tabela 2.

Tabela 2. Resultados dos Testes Foram calculadas as seguintes características de desempenho:

• Sensibilidade – 92,6%

• Especificidade – 90,4%

* Informação detalhada disponível mediante solicitação.

Bibliografia Chernesky MA. Mahony JB. 1991. Rubella Vírus. In: Balows A, Hausler WJ, Hermann KL, Isenberg HD, Shadomy HJ, eds. Manual of Clinic microbiology, Fifth Edition. American society for Microbiology, Washington, DC, pp. 918-923. Frenkel LD, Bellanti JA. 1982. Immunology of measles, mumps and rubella virusars. In:Nahmias AJ, O’Reilly RJ, eds. Immunology of Human Infection. Part II: Virusars and parasites; Immunodiagnosis and Prevention of Infectious Diseases. Plenum Medical Book Co., New York. Pp. 135-163. Ray CG. 1984. Virusars of mumps and childhood exanthemes. In: SherrisJC, ed. Medical Microbiology- na introduction to Infectious Diseases, Elsevier, New York. Pp. 383-387. Produzido por: ORGENICS LTD. P.O.Box 360, Yavne 70650 - ISRAEL Registro e Distribuição: ORGENICS DO BRASIL LTDA. Alameda dos Ubiatans, 257 - Planalto Paulista 04070-030 São Paulo - SP CNPJ : 01.767.606/0001-10 Atendimento ao consumidor SAC: (11) 5589-4622 FAX: (11) 5581-3279 e-mail: orgenics@uol.com.br Uso exclusivo para diagnóstico "in vitro" Registro ANVISA nº 10348680025 Resp. Técnico : Wellington Staduto Braga da Silva CRF-SP 13020 CONSERVAR ENTRE 2 - 8ºC

P.O.Box 360 Yavne 70650, Israelh t t p : / / w w w . o r g e n i c s . c o m

ImmunoComb II Rubella IgG Teste de Referência

Positivo Negativo

Positivo 301 24

Negativo 7 66

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Resumo dos Principais Procedimentos do Teste

Resumo do Procedimento de Teste As instruções resumidas abaixo são para usuários experientes do kit ImmunoComb II Rubella IgG. (Para instruções detalhadas, favor ver o texto completo). 1. Trazer todos os reagentes e amostras para a temperatura ambiente e realizar o teste à temperatura de

22 – 26ºC.

2. Pré-diluir 10 µL de cada amostra e controle com 100 µL de diluente de amostra.

3. Dispensar 25 µL de cada amostra e controle pré-diluídos nas cavidades da fileira A da Placa Reveladora e misturar.

4. Inserir o Pente na fileira A e continuar como descrito na Tabela 1: Tabela 1. Resumo do Procedimento de Teste.

Etapa Fileira Proceder como a seguir

Reação antígeno-anticorpo

A Misturar; incubar 30 minutos; absorver.

Lavagem

B Agitar; incubar 2 minutos; absorver.

Ligação do Conjugado

C Misturar; incubar 20 minutos; absorver.

Lavagem

D Agitar; incubar 2 minutos; absorver.

Lavagem

E Agitar; incubar 2 minutos; absorver.

Reação de cor

F Misturar; incubar 10 minutos.

Reação de parada

E Incubar 1 minuto; secar ao ar livre.