SEBASTIÁN ALEJO ROMANO

“MODIFICAÇÕES CONFORMACIONAIS

RECÍPROCAS DAS PROTEÍNAS LIGANTES PRÍON

E HOP/STI1: IMPLICAÇÕES PARA A SINALIZAÇÃO

CELULAR MEDIADA PELA PROTEÍNA PRÍON”

TESE SUBMETIDA À UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO

DE JANEIRO VISANDO A OBTENÇÃO DO GRAU DE

DOUTOR EM CIÊNCIAS

Universidade Federal do Rio de Janeiro Centro de Ciências da Saúde Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho 2 0 0 9

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO

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SEBASTIÁN ALEJO ROMANO

“MODIFICAÇÕES CONFORMACIONAIS

RECÍPROCAS DAS PROTEÍNAS LIGANTES PRÍON

E HOP/STI1: IMPLICAÇÕES PARA A SINALIZAÇÃO

CELULAR MEDIADA PELA PROTEÍNA PRÍON”

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Biofísica), Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em Ciências Biológicas (Biofísica).

Orientador: Rafael Linden Co-orientadora: Débora Foguel

Universidade Federal do Rio de Janeiro Centro de Ciências da Saúde Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho 2 0 0 9

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO

Romano, Sebastián Alejo Modificações conformacionais recíprocas das proteínas ligantes prion e

hop/STI1: implicações para sinalização celular mediada pela proteína príon / Sebastián Alejo Romano. – Rio de Janeiro: UFRJ / IBCCF, 2009.

xiv,159 f. : il ; 29,7 cm. Orientadores: Rafael Linden e Débora Foguel Tese (doutorado) – Universidade Federal do Rio de Janeiro, IBCCF,

Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Biofísica), 2009. Referências bilbiográficas: f. : 110-128 1. Proteína príon 2. Proteína hop/STI1 3. Estrutura 4. Sinalização

celular 5. Neuritogênese 6. Neuroproteção 7. Alterações conformacionais – Tese. I. Linden, Rafael. II Foguel, Débora. III. Universidade Federal do Rio de Janeiro, IBCCF, Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Biofísica). IV. Titulo.

Este trabalho foi realizado no Laboratório de Neurogênese do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro, sob a orientação do Dr. Rafael Linden e co-orientação da Dra. Débora Foguel, na vigência de auxílios concedidos pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pela Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), pelo Programa de Apóio a Núcleos de Excelência (Pronex) e pela Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP).

Aos meus pais, Cristina e Jorge, por me guiarem até aqui. A minha mulher, Ana Raquel, por me acompanhar daqui em diante.

AGRADECIMENTOS

Aos meus orientadores, Rafael e Débora, por confiarem em mim e me darem a liberdade justa e o conselho sábio necessários para poder trabalhar criativamente; Aos meus orientadores informais, Yraima e Maurício, por me guiarem durante todo o trabalho, mesmo quando não receberam todo o crédito merecido: sem vocês nada neste trabalho teria sido possível; A Ana Raquel, minha amada mulher, o precioso presente que Rio de Janeiro me deu, por me apoiar pacientemente durante todo este caminho, escutar minhas angústias e festejar meus sucessos e, mais que nada, por me dar tanto amor; A Cristina, minha mãe, por me fazer quem eu sou, por todo o amor e cuidado brindado, pelo enorme sacrifício nem sempre reconhecido, e por me guiar no meu caminho, mesmo quando ele me afastase dela: você é um modelo de mãe; A Jorge, meu pai, pela amizade e o amor, pelos conselhos e a confiança, pela alegria e inspiração: é um prazer poder viver perto de você; A Julia, Glauce e Jeane, a nova família que Rio de Janeiro me deu, pelo carinho, o apóio, a companhia e as risadas, fico feliz de saber que estarão por perto sempre; A los amigos que traje hasta aqui, Santi, Alejo, Colo, Sole, Mati e Flor: son la mejor companía que puedo pedir, quiero tenerlos cerca de nuevo!; Aos amigos que encontrei aqui, Ana, Diego, Dani, Planet, Thiago, Ana Julia, Gabo e Osvaldo: obrigado pela companhia, diversão e inspiração!; Aos colegas do Fundão que se tornaram amigos, Yra, Mau, Brian, Rachel, Mari, Tati, Mona, Bruno, Vinícius e Maithê: foi um prazer descobrir vocês!; A todo o mundo no laboratório de Neurogênese e LAPA, estudantes e técnicos: obrigado por ensinar a um físico como se trabalha na biociência; A Dra. Vilma Martins, a Dra. Marilene Lopes e a Talita, pela ajuda na purificação de proteínas: obrigado por responder a meus apelos desesperados!; A todos os colaboradores que me ajudaram a concluir este trabalho; A Malú e She-Ra, as gatas mais lindas do universo!

LISTA DE ABREVIATURAS

aa aminoácidos bis-ANS 4,4'-dianilino-1,1'-binaphthyl-5,5'-sulfonate cAMP monofosfato de adenosina (AMP) cíclico CD dicroismo circular Dmax diâmetro máximo molecular DP domínio rico em aspartato e prolina da hop/STI1 ERK proteína cinase regulada por sinais extracelulares FITC isotiocianato de fluoresceína FYN proteína tirosina cinase não receptora GPI glicosil fosfatidilinositol hop/STI1 co-chaperona HSP70-HSP90 organizing protein stress-inducible protein 1 hop/STI1230-245 segmento da hop/STI1 que liga a PrPC HSP proteína de choque térmico Kd constante de dissociação LTP potenciação de longo prazo N-CAM molécula de adesão celular neuronal native-PAGE eletroforese de gel de poliacrilamida em condições não desnaturantes LR/LRP receptor de laminina / precursor do receptor de laminina PI3K fosfatidilinositol 3-cinase PKA proteína cinase A PrP proteína príon recombinante PrPC proteína príon PrPSc proteína príon scrapie PrP106-126 domínio hidrofóbico da proteína príon PrP113-128 segmento da PrPC que liga a hop/STI1 PrP113-132 segmento da PrPC que liga a hop/STI1 PrP121-231 segmento correspondente ao domínio globular da proteína príon PrP23-231 proteína príon madura PrP51-90 segmento de repetições de octapeptídeos da proteína príon PrP95-231

W98F mutante da PrP com a região 23-94 truncada e a mutação pontual W98F PrP-/- animal decificiente em PrPC ou célula obtida de animal deficiente em PrPC p(r) distribuição de distâncias intramoleculares Rg raio de giro molecular RMN ressonância magnética nuclear ROS espécies reativas de oxigênio SAXS espalhamento de raios-X a baixo ângulo SDS-PAGE eletroforese de gel de poliacrilamida-dodecil sulfato de sódio SE-HPLC cromatografia liquida de alta eficiência de exclusão por tamanho SNC sistema nervoso central SOD superóxido dismutase TPR domínio de tetratricopeptídeos repetidos TSE encefalopatias espongiformes transmissíveis

RESUMO

ROMANO, Sebastián Alejo. Modificações conformacionais recíprocas das proteínas ligantes príon e hop/STI1: implicações para sinalização celular mediada pela proteína príon. Rio de Janeiro, 2009. Tese (Doutorado em Ciências Biológicas, Biofísica) – Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio Janeiro, Rio de Janeiro, 2009. A proteína príon (PrPC) é uma glicoproteína abundantemente expressa no sistema nervoso, ligada à face extracelular da membrana plasmática por uma âncora de glicosil fosfatidilinositol (GPI). Apesar de ter sido associada à modulação de diversas respostas celulares e à participação em complexos sinalizadores residentes na superfície celular, suas funções fisiológicas ainda não foram totalmente compreendidas. Em particular, o engajamento da PrPC pela co-chaperona secretável hop/STI1 induz distintos sinais intracelulares neurotróficos. Porém, os mecanismos moleculares envolvidos nestes processos ainda estão longe de ser esclarecidos e ainda não foi elucidado como estas proteínas, que não possuem domínios transmembrana, são capazes de transmitir informação para o compartimento intracelular. Uma hipótese plausível sugere a ação de parceiros moleculares transmembrana que são recrutados de forma coordenada após a interação de PrPC com hop/STI1. Estes eventos de sinalização muito provavelmente dependem, e são modulados, por alterações estruturais alostéricas que podem ser propagadas nos distintos parceiros moleculares envolvidos. Portanto, este trabalho teve como objetivo analisar possíveis alterações conformacionais das estruturas da PrPC e da hop/STI1, disparadas pela interação destas proteínas, que, por seu turno, sejam potencialmente importantes para o recrutamento de outros ligantes que assistam no mecanismo sinalizador. Usando como modelos proteínas recombinantes murinas, tanto selvagens quanto mutantes, assim como peptídeos ligantes, analisamos biofísica e estruturalmente a interação da PrPC com a hop/STI1. Realizamos, dentre outras, medidas de dicroísmo circular (CD), espectroscopia de fluorescência e espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS). Observamos que esta interação dispara uma perda de estruturas em α-hélice da proteína príon, que envolve, pelo menos, uma perturbação estrutural da α-hélice PrP143-153, mas não detectamos modificações da estrutura secundária da hop/STI1. Geramos novos modelos de baixa resolução por SAXS, que revelaram uma sensível compactação do C-terminal da hop/STI1, quando ligada à PrP. Em contraste com modelos recentes diméricos da hop/STI1 humana, tanto ensaios de cromatografia liquida de alta eficiência de exclusão por tamanho (SE-HPLC) quanto dados de SAXS, apóiam uma forma monomérica da hop/STI1 murina livre. Discutimos como alterações da α-hélice PrP143-

153 podem alterar a afinidade da PrPC pelas proteínas transmembrana sinalizadoras precursor do receptor de laminina (LRP) e molécula de adesão celular neuronal (N-CAM), ambas ligantes deste domínio da PrPC, e como ligantes adicionais podem ser engajados pelas alterações da estrutura terciária da hop/STI1. Estas modificações estruturais recíprocas indicam um mecanismo versátil para a sinalização mediada pela interação da PrPC com a hop/STI1, de forma consistente com a hipótese da ação de complexos sinalizadores multiprotéicos dependentes da PrPC.

ABSTRACT

ROMANO, Sebastián Alejo. Modificações conformacionais recíprocas das proteínas ligantes príon e hop/STI1: implicações para sinalização celular mediada pela proteína príon. Rio de Janeiro, 2009. Tese (Doutorado em Ciências Biológicas, Biofísica) – Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio Janeiro, Rio de Janeiro, 2009.

The prion protein (PrPC) is a glicoprotein abundantly expressed in the nervous system, anchored by a glycosylphosphatidylinositol (GPI) to the extracellular face of the plasma membrane. Although associated to the modulation of diverse cellular responses and to the scaffolding of multi-protein signaling complexes, its physiological functions are not completely understood. In particular, engagement of PrPC with the secretable co-chaperone hop/STI1 induces neurotrophic signals. However, the involved molecular mechanisms are far from understood, and it has not yet been shown how these proteins, which do not bear a transmembrane domain, are capable of transmitting information to the intracellular compartment. One plausible hypothesis suggests the action of transmembrane molecular partners that are recruited in a coordinated fashion after the interaction between PrPC and hop/STI1. These signaling events likely depend, and are modulated, by the propagation, through the molecular partners involved, of allosteric conformational modifications. Hence, the goal of this work was to analyze possible binding-triggered conformational alterations of both PrPC and hop/STI1 structures potentially relevant to the recruitment of further signaling ligands. Using recombinant wild type and mutant mouse proteins and binding peptides, we carried out a biophysical and structural analysis of the interaction between PrPC and hop/STI1, by performing circular dichroism (CD), fluorescence spectroscopy and small angle X-ray scattering (SAXS) measurements. We found that PrPC:hop/STI1 interaction triggers a loss of PrP helical structures, involving at least a perturbation of the PrP143-153 α-helix, but no secondary structural modification of hop/STI1 was detected. Novel low-resolution SAXS models showed a significant C-terminus compaction of hop/STI1 when bound to PrP. Differing from a recent dimeric model of human hop/STI1, both size-exclusion chromatography and SAXS data support a monomeric form of free murine hop/STI1. Changes in the PrP143-153 α-helix may engage the transmembrane signaling proteins Laminin Receptor Precursor and NCAM, both of which bind that domain of PrPC, and further ligands may be engaged by the tertiary structural changes of hop/STI1. These reciprocal structural modifications indicate a versatile mechanism for signaling mediated by PrPC:hop/STI1 interaction, consistent with the hypothesis of PrPC-dependent multi-protein signaling complexes.

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 10

1.1 A PROTEÍNA PRÍON CELULAR .......................................................................... 10 1.1.1 A PrPC E AS DOENÇAS POR PRÍONS ............................................................... 10 1.1.2 SOBRE A ESTRUTURA DA PrPC ....................................................................... 16 1.1.3 SOBRE A FUNÇÃO DA PrPC NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL .............. 24 1.1.3.1 INTERAÇÃO COM COBRE E ESTRESSE OXIDATIVO .............................. 26 1.1.3.2 ATIVIDADE SINÁPTICA E EXCITABILIDADE NEURONAL ..................... 28 1.1.3.3 CONTROLE DA SOBREVIVÊNCIA NEURONAL .......................................... 30 1.1.3.4 DIFERENCIAÇÃO E ADESÃO CELULAR ...................................................... 32 1.1.3.5 COMPORTAMENTO .......................................................................................... 34 1.2 A PROTEÍNA HOP/STI1.......................................................................................... 34 1.2.1 SOBRE A ESTRUTURA DA HOP/STI1 ............................................................. 35 1.2.2 SOBRE A FUNÇÃO DA HOP/STI1 ..................................................................... 38 1.2.2.1 ATIVIDADES INTRACELULARES .................................................................. 39 1.2.2.2 ATIVIDADES EXTRACELULARES DA HOP/STI1 INDEPENDENTES DA PrPC ................................................................................................................ 41 1.3 A INTERAÇÃO PrPC:HOP/STI1 E SUA FUNCIONALIDADE ............................ 42 1.4 RACIONAL .............................................................................................................. 47

2 OBJETIVOS .............................................................................................................. 48

2.1 GERAL ..................................................................................................................... 48 2.2 ESPECÍFICOS .......................................................................................................... 48

3 MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................... 49

3.1 REAGENTES ........................................................................................................... 49 3.2 PURIFICAÇÃO DE PrP23-231 RECOMBINANTE .................................................. 49 3.3 PURIFICAÇÃO DE PrP95-231

W98F RECOMBINANTE ........................................... 52 3.4 PURIFICAÇÃO DE HOP/STI1 RECOMBINANTE .............................................. 52 3.5 PEPTÍDEOS SINTÉTICOS ..................................................................................... 54 3.6 MARCAÇÃO COM FITC DE PrP23-231 RECOMBINANTE .................................. 54 3.7 ELETROFORESE EM GÉIS EM CONDIÇÕES DESNATURANTES

E NATIVAS ............................................................................................................. 55 3.8 ANISOTROPIA DE FLUORESCÊNCIA ............................................................... 55 3.9 ESPECTROSCOPIA DE DICROISMO CIRCULAR ............................................. 58 3.10 ESPECTROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA ........................................................ 59 3.11 ESPALHAMENTO DE RAIOS-X A BAIXO ÂNGULO ....................................... 60

4 RESULTADOS ......................................................................................................... 66

4.1 AVALIAÇÃO DA INTERAÇÃO PrP:HOP/STI1 ................................................... 66 4.2 ANÁLISE DO EFEITO DA INTERAÇÃO PrP:HOP/STI1 SOBRE A

ESTRUTURA DAS PROTEÍNAS .......................................................................... 70 4.2.1 EFEITOS SOBRE A ESTRUTURA SECUNDÁRIA ......................................... 70 4.2.2 EFEITOS SOBRE A ESTRUTURA LOCAL ..................................................... 80

4.2.3 EFEITOS SOBRE A ESTRUTURA TERCIÁRIA ............................................. 89

5 DISCUSSÃO ............................................................................................................ 100

5.1 SOBRE AS EVIDÊNCIAS APRESENTADAS NESTE TRABALHO ................ 101 5.2 IMPLICAÇÕES PARA O MECANISMO SINALIZADOR ................................. 104 6 CONLUSÕES .......................................................................................................... 109 7 REFERÊNCIAS ...................................................................................................... 110 APÉNDICE .............................................................................................................. 129

10

1 INTRODUÇÃO

1.1 A PROTEÍNA PRÍON CELULAR

A proteína príon celular (PrPC) é uma proteína altamente expressa no sistema nervoso central

(SNC), originalmente identificada no contexto do estudo das encefalopatias espongiformes

transmissíveis (TSEs, pelo seu nome em inglês, transmissible spongiform encephalopathies),

doenças que envolvem crucialmente esta proteína, assim como patógenos infecciosos

denominados príons, pelo que também são conhecidas como doenças por príons. Já que estas

doenças apresentam características incomuns que provocaram um grande interesse científico,

os estudos iniciais da PrPC foram quase exclusivamente direcionados para o estudo do seu

papel na patogênese, mais especificamente nos mecanismos de infecção. Respeitando este

processo histórico, vamos nos referir primeiramente a relação entre a PrPC e as doenças por

príon.

1.1.1 A PrPC E AS DOENÇAS POR PRÍONS

A família de doenças por príons, ou TSEs, incluem, entre outras, a TSE bovina (BSE,

popularmente conhecida como “mal da vaca louca”), caprina e ovina (scrapie), e variantes

humanas como a doença de Creutzfeldt-Jakob (CJD), a síndrome de Gertsmann-Sträussler-

Scheinker (GSS), a insônia familiar fatal (FFI) e o Kuru (revisto por PRUSINER, 1999)

(Tabela 1). Estas doenças podem se apresentar como distúrbios genéticos, infecciosos ou

esporádicos, mas todas elas têm em comum alterações da fisiologia da PrPC expressa no

11

organismo do portador da doença (revisto por PRUSINER, 1998). Durante o

desenvolvimento destas doenças, todas incuráveis e fatais, podem ser observados diversos

sintomas de disfunções motoras e cognitivas, acompanhados de uma extensa morte neuronal,

gliose astrocitária, acúmulo de agregados protéicos (em alguns casos formando placas

amilóides), e vacuolização do tecido cerebral (responsável pelo termo “espongiforme” que

descreve a família de doenças) (revisto por COLLINS et al., 2004).

Tabela 1. Encefalopatias espongiformes transmissíveis animais e humanas (adaptado de MABBOTT & MACPHERSON, 2006).

12

O estudo das TSEs ganhou enorme atenção científica pelo fato delas envolverem um

agente patogênico sem precedentes: uma partícula proteinácea infecciosa, denominada príon

(PRUSINER, 1982). Diversos estudos demonstraram a resistência deste agente à radiação

ultravioleta (LATARJET et al., 1970; GIBBS et al., 1978), sugerindo que os príons são únicos

no fato de ser capazes de transmitir doenças prescindindo de ácidos nucléicos, e gerando a

hipótese “unicamente protéica” (protein only) (ALPER et al., 1967; PRUSINER et al., 1982).

Coerente com esta teoria, foi demonstrado que uma proteína altamente resistente à proteólise,

enriquecida em cérebros doentes, é necessária para que extratos desses cérebros resultem

infecciosos (PRUSINER et al., 1984). A purificação de material resistente à proteólise de

cérebros doentes isolou uma fração da então hipotética proteína patogênica, com uma massa

molecular entre 27 e 30 kDa (PrP27-30), que forma os agregados protéicos característicos da

doença. O sequenciamento desta proteína permitiu a identificação do gene Prnp, que codifica

a PrPC, demonstrando que a proteína patogênica e a PrPC compartilham a mesma seqüência de

aminoácidos (BOLTON et al., 1982; PRUSINER et al., 1982). Estudos estruturais desta

isoforma anômala da PrPC (conhecida, entre outras denominações, como príon scrapie, ou

PrPSc) demonstraram que o desenvolvimento da doença é acompanhado de uma modificação

conformacional da PrPC, que envolve a conversão de algumas de suas α-hélices nativas em

fitas-β, presentes abundantemente na PrPSc (CAUGHEY et al., 1991; PAN et al., 1993). Esta

transição estrutural desencadeia grandes mudanças nas características físico-químicas da

proteína, tais como a resistência à digestão por proteases e a tendência à formação de

agregados oligoméricos e, raramente, amilóides (PRUSINER et al., 1983; PRUSINER et al.,

1999). Desta forma, doenças por príons, junto com outras doenças como a doença de

Alzheimer, a doença de Parkinson, a doença de Huntington e a esclerose lateral amiotrófica,

são reconhecidas como doenças de conformação de proteínas, um grupo de enfermidades

neurodegenerativas que possuem em comum a alteração da conformação fisiológica de

13

proteínas específicas em prol da aquisição de estruturas ricas em fitas-β que facilitam a

fromação de agregados destas proteínas (ROSS & POIRIER, 2004).

O mecanismo molecular da conversão da PrPC em PrPSc ainda não foi esclarecido. O

modelo mais aceito na atualidade é conhecido como re-enovelamento assistido por molde ou

replicação por molde (Fig. 1). Neste modelo, o agente infeccioso consiste em monômeros da

PrPSc que apareceriam no organismo por infecção ou conversão espontânea. Este último caso

só seria possível na presença de mutações que desestabilizem a PrPC, já que uma alta barreira

energética dificultaria a conversão. A replicação da PrPSc progrediria quando ela se liga à

PrPC, instruindo-a a se converter na isoforma patogênica, em um processo auto-catalítico

alimentado pela presença de PrPC, e provavelmente facilitado por alguma outra molécula

ainda não identificada (WEISSMANN, 1999; AGUZZI & POLYMENDIOU, 2004). Entre os

candidatos para o papel de facilitador, foram sugeridos proteínas (HACHIYA et al., 2007) e

ácidos nucléicos (SILVA et al., 2008). O modelo é consistente com o caráter progressivo das

TSEs e com diversas outras evidências, destacando-se entre elas o fato de que a presença da

PrPC é necessária para a replicação de PrPSc e para a patogênese, já que estes fenômenos não

se desenvolvem após infectar camundongos transgênicos nulos para o gene Prnp com extratos

de cérebros doentes (BÜELER et al., 1993; BRANDNER et al., 1996).

Figura 1. Esquema representativo do modelo de replicação por molde (adaptado de AGUZZI & POLYMENDIOU, 2004).

Diversos estudos pressupõem ou sugerem que a degeneração neuronal e astrocitária é

14

o resultado do acúmulo de PrPSc em agregados depositados no tecido cerebral (revisto por

HARRIS, 1999), mas existe um considerável debate sobre a natureza dos agentes

neurotóxicos nas doenças de conformação de proteínas, sendo que tanto grandes agregados

fibrilares quanto pequenos oligômeros ordenados pré-fibrilares têm sido propostos como

principais responsáveis da degeneração (para uma revisão ver CAUGHEY et al., 2003; ROSS

& POIRIER, 2004). Porém, ambos modelos encaixam-se na hipótese de que a patogênese é

causada pelo ganho de uma função tóxica da PrPSc, cujo mecanismo ainda não foi elucidado.

Não obstante, alguns indícios sugerem que a degeneração neuronal não é uma simples

conseqüência da toxicidade de agregados da PrPSc. A análise minuciosa de animais infetados

revela a falta de correlação espacial significativa entre o acúmulo de depósitos da PrPSc e a

apoptose neuronal decorrente das TSEs (DORANDEU et al., 1998; GRAY et al., 1999;

CHRETIEN et al., 1999). De fato, um estudo recente sugere que a presença dos agregados

protéicos não é suficiente para provocar a neurodegeneração, e reveste de importância à PrPC

no seu estado fisiológico para o mecanismo patogênico. A PrPC é uma glicoproteína que se

encontra ligada à face extracelular da membrana plasmática através de uma âncora

glicosilfosfatidilinositol (GPI). Foi demonstrado que, apesar de que camundongos

transgênicos que expressam uma forma solúvel da PrPC não ancorada à membrana podem

sofrer a replicação infecciosa de amilóides de PrPSc, as manifestações clínicas da doença não

são evidentes, mas observáveis somente quando a PrPC está normalmente ancorada por GPI à

membrana celular (CHESEBRO et al., 2005).

Uma outra hipótese não excludente para explicar o mecanismo patológico é a de perda

de função da PrPC, já que a replicação por molde da PrPSc baseia-se em um mecanismo que

provoca a depleção gradual da PrPC, certamente comprometendo sua atividade (MARTINS et

al., 2002; HETZ et al., 2003; WESTERGARD et al., 2007; LINDEN et al., 2008; AGUZZI et

al., 2008) (Fig. 2). Dentro deste marco, resulta de vital importância analisar o papel

15

fisiológico da PrPC, um aspecto longamente relegado pelos amplos esforços direcionados à

compreensão do inédito mecanismo patogênico das doenças por príon. Para esta análise,

abordaremos brevemente diversos estudos da estrutura, biologia celular e função fisiológica

da PrPC.

Figura 2. As hipóteses de ganho e perda de função na patogênese das doenças por príon. Uma partícula patogênica formada por moléculas de PrPSc (verde claro) pode apresentar-se no sistema nervoso seja por infecção ou como resultado da conversão conformacional da PrPC (em vermelho e azul). A isoforma anormal coopta a PrPC endógena e induz a formação de agregados protéicos constituídos por moléculas de PrPSc (grandes aglomerados em verde claro). A hipótese de ganho de função sugere que a agregação de PrPSc sensibiliza neurônios para a morte celular programada, provocando as doenças por príon. Por outro lado, a hipótese de perda de função sugere que a perda gradual da PrPC endógena, que resulta do mecanismo de replicação de PrPSc, tem como consequência a neurodegeneração e o desenvolvimento das doenças por príon. Ambas hipóteses não são mutuamente exclusivas, e a dependencia entre agregação de PrPSc, morte celular e patogênese ainda não foi esclarecida. (Adaptado de LINDEN et al., 2008).

16

1.1.2 SOBRE A ESTRUTURA DA PrPC

Motivados principalmente pelo fato das TSEs estarem estreitamente vinculadas a uma

mudança conformacional da PrPC, abundante informação sobre a estrutura da PrPC foi obtida

no decorrer das ultimas décadas. Nesta seção, vamos rever algumas informações estruturais

relevantes para o estudo da funcionalidade da PrPC, focalizando estudos estruturais da PrPC

endógena e de seus modelos recombinantes, sem nos estender na literatura sobre a transição

estrutural patogênica que caracteriza as TSEs.

A PrPC é uma glicoproteína abundantemente expressa no SNC e, em menor

quantidade, em vários outros tecidos (revisto por LINDEN et al., 2008). O gene Prnp, que

possui dois éxons em hamsters, humanos e marsupiais, e três éxons em camundongos, ratos,

bovinos e carneiros, codifica para a PrPC em apenas um éxon (PUCKETT et al., 1991;

WESTAWAY et al., 1994a). Nos humanos, Prnp codifica uma seqüência de 253 aminoácidos

(aa) e no camundongo uma de 254 aa. Este polipeptídeo original é translocado para o retículo

endoplasmático (RE) devido à presença de um peptídeo sinalizador N-terminal. Durante o

tráfego pelo RE e complexo de Golgi, a seqüência sofre processamento pós-traducional. A

proteína humana sofre a clivagem de seus primeiros 22 aa e seus últimos 23 aa (24 aa no

camundongo), sendo que o primeiro segmento constitui o peptídeo sinalizador e os últimos

são hidrolisados para a adição da âncora de GPI na extremidade C-terminal. Desta forma, a

seqüência adota a forma madura PrP23-231.

Foi demonstrado que a PrPC pode ser sintetizada no RE em três topologias distintas:

uma forma majoritária que é translocada completamente para dentro do RE e posteriormente

é secretada ao meio extracelular, e duas formas transmembrana carboxi- e amino- terminais

(CtmPrP e NtmPrP, respectivamente), muito menos abundantes, que resultam da inserção

transmembrana de um trecho hidrofóbico da sua seqüência, o segmento PrP110-134. Sabe-se

17

pouco sobre estas duas últimas isoformas da PrPC, mas elas tem sido vinculadas a processos

neurodegenerativos (HEDGE et al., 1998). Também existe evidência de pequenas quantidades

de uma forma citosólica da proteína príon, detectada principalmente após a inibição de

proteassomos e a superexpressão de Prnp em animais transgênicos (MA & LINDQUIST,

2001). O impacto fisiológico desta variedade citosólica ainda não foi esclarecido, porém,

existem trabalhos que a associam tanto a processos neurodegenerativos quanto a

neuroprotetores, como veremos mais adiante. Durante o presente trabalho, vamos nos ater à

análise da forma mais abundante e mais estudada, que é a isoforma ancorada por GPI à face

extracelular da membrana plasmática, derivada da seqüência secretada.

A PrPC contém uma única ponte de dissulfeto entre as cisteínas 179 e 214 (178 e 213

no camundongo) e pode ser N-glicosilada nas asparaginas 181 e 197 (180 e 196 no

camundongo) (HARAGUCHI et al., 1989), pelo que pode ser encontrada na superfície celular

na forma não glicosilada, mono-glicosilada e di-glicosilada. Essa diversidade é ainda

ampliada quando consideramos que também existem pontos de clivagem na região N-

terminal. Consequentemente, a PrPC pode ser encontrada no SNC em formas truncadas que,

por sua vez, podem ser glicosiladas multiplamente por uma grande variedade de N-glicanos

(RUDD et al., 2001), refletindo uma importante heterogeneidade da natureza da PrPC. De

fato, há indícios de que estas diversas formas são distribuídas diferencialmente no SNC

(DEARMOND et al., 1999; BERINGUE et al., 2003).

Trabalhos realizados com a proteína príon recombinante (PrP) purificada ofereceram

grandes esclarecimentos sobre a estrutura da PrPC. Estudos de espectros de ressonância

magnética nuclear (RMN) da PrP mostraram que ela possui dois domínios bem diferenciados:

uma região N-terminal altamente flexível e intrinsecamente desestruturada, que abrange

aproximadamente os primeiros 100 aa, e um domínio globular C-terminal que cobre o

segmento PrP121-231 (DONNE et al., 1997). A região flexível N-terminal, PrP23-120, contém

18

cinco repetições de octapeptídeos no segmento PrP51-90, nos quais existe um domínio de

ligação para íons de cobre (HORNSHAW et al., 1995; BROWN et al., 1997a), assim como

um segmento de características hidrofóbicas, PrP106-126. Um importante avanço deste campo

de pesquisa foi a obtenção, através de RMN, da estrutura em alta resolução da estrutura

tridimensional dos domínios globulares da proteína príon recombinante de várias espécies,

entre as quais podemos destacar a humana e a do camundongo (RIEK et al., 1996; JAMES et

al., 1997; LOPEZ-GARCIA et al., 2000; ZAHN et al., 2000; CALZOLAI et al., 2005;

LYSEK et al., 2005). Para a proteína inteira só existe um modelo de baixa resolução obtido

através de medidas de espalhamento de raios-X de baixo ângulo (SAXS) da PrP recombinante

murina (LIMA et al., 2006). Resulta importante destacar o achado de que a cauda N-terminal

flexível PrP23-120 mantém interações transitórias com o domínio globular, mas não altera a

estrutura tridimensional deste, pelo que os modelos de RMN obtidos da proteína truncada

PrP121-231 devem representar fielmente a estrutura deste domínio na proteína inteira, PrP23-231

(RIEK et al., 1997). Esse conjunto de estudos demonstrou que as PrP de diversas espécies

apresentam um alto grau de similaridade estrutural, como era esperado devido à alta

conservação evolutiva da sequência da PrPC (WOPFNER et al., 1999). Todos os modelos

obtidos representam o domínio globular contendo 3 α-hélices, com pequenas variações no

comprimento delas, sendo que no humano elas cobrem os segmentos 144-153, 172-193 e 200-

222 (143-153, 171-192, 200-222 no camundogo), além de duas pequenas fitas-β em 128-131

e 161-164 que se alinham de forma anti-paralela, tanto no humano quanto no camundongo.

Estas informações são representadas nas Figuras 3, 4 e 5.

Devemos destacar que estes trabalhos usaram como modelo experimental a PrP23-231

expressa heterologamente em Escherichia coli transformada, pelo que não possuem

modificações pós-traducionais da PrPC, tais como glicolisações e a adição da âncora de GPI

(Fig. 5). Para validar a PrP como modelo de trabalho, devemos perguntar se estas

19

modificações têm algum efeito sobre a estrutura tridimensional da PrPC. O único estudo

experimental que abordou esta questão realizou medidas de estabilidade térmica, dicroísmo

circular (CD) e espectroscopia de prótons por RMN (1H–RMN) para a PrP23-231 recombinante

e a PrPC endógena, isolada e purificada do cérebro de bovinos. Concluiu-se que tanto a

estrutura secundária quanto a terciária não são afetadas pelo nível de glicosilação nem pela

adição da âncora de GPI (HORNEMANN et al., 2004), validando a PrP como modelo

experimental para estudos estruturais. Não obstante, as modificações pós-traducionais

poderiam afetar outras propriedades da PrPC relevantes para estudos funcionais, tais como a

interação com ligantes e o tráfego sub-celular. Por exemplo, foi reportado que a glicosilação

modula a capacidade de reconhecimento de várias espécies de PrPC por anticorpos

monoclonais, tanto em células cerebrais quanto em outro tipo de células (LI et al., 2001;

BERINGUE et al., 2003). Este efeito poderia ser o resultado de pequenas alterações

conformacionais ou bloqueios estéricos produzidos pelos N-glicanos ligados à PrPC. Deste

mesmo modo, a interação com ligantes fisiológicos da PrPC também poderia ser modulada

pela glicosilação.

20

Figura 3. Diagrama da estrutura da proteína príon. Abaixo à esquerda são apresentadas as regiões destacadas da seqüência traduzida da proteína príon (apresentada acima em forma de bastonete) e do modelo estrutural, obtido por RMN, do domínio globular da proteína prion recombinante (abaixo à direita). (Adaptado de GILL et al., 2000; AGUZZI & HEIKENWALDER, 2006).

Figura 4. Representação esquemática da estrutura e flexibilidade da cadeia polipeptídica de PrP29-

231. É representada a estrutura tridimensional do domínio PrP90-231 de hamster obtido por RMN (JAMES et al., 1997), conectada à seqüência PrP29-89 desenhada a mão para ilustrar a cauda N-terminal. A escala de cores mostra os valores do efeito nuclear Overhauser (NOE) heteronuclear [1H]-15N, obtidos na caracterização espectroscópica da proteína príon recombinante de hamster PrP29-231, onde vermelho marca as regiões de maior flexibilidade, e azul as regiões mais estruturadas e rígidas. Segmentos que não foram associados a valores de NOE são destacados em cinza. (Adaptado de DONNE et al., 1997).

21

Figura 5. Representação esquemática da PrPC após modificações pós-traducionais. A estrutura da PrP124-231 (o domínio globular) murina é apresentada em vermelho, junto com sua única ponte de dissulfeto em amarelo. A proteína é representada na versão di-glicosilada, sendo que os grupos carbohidratos são mostrados como estruturas azuis. A âncora de GPI é apresentada em amarelo, ligada ao C-terminal da proteína. (Adaptado de JACKSON & CLARKE, 2000).

Considerando que a PrPC está ligada à membrana celular pela âncora de GPI, alguns

grupos estudaram o efeito sobre a estrutura da proteína provocados pelo ambiente lipídico da

membrana plasmática. Estudos iniciais usaram diferentes tipos de modelos experimentais de

vesículas lipídicas que mimetizam os microdomínios de membrana do tipo balsas lipídicas

(lipid rafts), domínios onde a PrPC, assim como a maioria das proteínas ancoradas por GPI, se

localizam preferencialmente (NASLAVSKY et al., 1997; TAYLOR et al., 2006), e

encontraram que a PrP recombinante sofre uma pequena modificação da estrutura secundaria

como resultado de interações com estas vesículas modelo (MORILLAS et al., 1999; EBERL

et al., 2004). Simulações de dinâmica molecular sugeriram que não há alterações

significativas pela interação com os lipídeos, mas que o N-terminal da proteína é capaz de

22

interagir e inclusive atravessar a membrana (revisto por DEMARCO & DAGGET, 2005).

Outro estudo sintetizou uma seqüência semelhante a uma âncora de GPI e a adicionou

covalentemente ao C-terminal da PrP, demonstrando que esta proteína recombinante

modificada era capaz de se ligar a membranas modelo que mimetizam balsas lipídicas de

forma similar à PrPC, mas que não eram produzidas alterações estruturais significativas na PrP

(HICKS et al., 2006). Em conclusão, as evidências sugerem que a ligação da PrPC à

membrana através de GPI não repercutiria sensivelmente na conformação da proteína. No que

diz respeito à funcionalidade da proteína, a ancoragem seguramente modula a atividade da

PrPC, no mínimo pela compartimentalização que ela produz.

Finalmente, por diversos motivos, outro fator relevante para estudos da estrutura e

função da PrPC, consiste na análise do efeito do pH sobre a conformação da proteína. Entre

eles, cabe destacar que a maioria dos modelos da PrP obtidos por RMN foram realizados em

soluções com pH ácido (em vários casos 4.5). Um modelo do domínio globular PrP121-231

humano, obtido também por RMN mas usando pH 7.0, demonstrou que o envolamento global

é conservado com respeito aos modelos da proteína em pH ácido, apresentando alterações

pequenas e localizadas, dentre as quais destacamos um alongamento de um par de aa no

extremo C-terminal da α-hélice 1 (CALZOLAI & ZAHN, 2003). Este estudo também sugeriu

que esta hélice é mais estável em pH neutro, e evidenciou que ela apresenta uma tendência

maior ao desenovelamento em pH ácidos do que as outras estruturas secundárias da proteína.

Outros motivos que justificam a análise do efeito do pH, baseiam-se na fisiologia da PrPC, em

particular quando se considera tanto o contínuo tráfego sub-celular da PrPC (revisto por

PRADO et al., 2004), onde ela poderia encontrar um pH de 4.5-5.0 dentro de endossomos

(LEE et al., 1996), quanto a possível modulação do pH local produzida por microdomínios

ácidos da superfície celular onde a PrPC poderia se encontrar (CHERESH et al., 1986;

ANDERSON, 1998; FREIRE & COELHO-SAMPAIO, 2000). Vários estudos evidenciaram

23

que a estrutura do terminal flexível da PrPC é sensível ao pH, enquanto seu domínio globular

é mais estável. Usando a PrP recombinante como modelo, o uso de técnicas de CD junto com

espectroscopia de fluorescência extrínseca por um lado (SWIETNICKI et al., 1997;

HORNEMANN & GLOCKSHUBER, 1998), e o mapeamento estrutural mediado por

anticorpos pelo outro (MATSUNAGA et al., 2001), demonstrou que o pH ácido não afeta

sensivelmente a estrutura do domínio globular (corroborando os dados anteriores), mas induz

alterações na cauda flexível N-terminal, envolvendo, pelo menos, a região PrP94-112

(MATSUNAGA et al., 2001). Simulações de dinâmica molecular apóiam a evidência

experimental, mostrando que o pH baixo (menor a 4.0) reduz levemente o conteúdo de α-

hélices mas facilita a produção de estruturas estendidas do tipo fitas-β na cauda flexível, que

irão se nuclear nas fitas-β nativas (ALONSO et al., 2001; DEMARCO & DAGGETT, 2005).

Alguns dos estudos sugerem que para afetar a estrutura do domínio C-terminal, condições de

desnaturação suave por agentes químicos devem atuar em conjunto com o pH ácido,

resultando na conversão de estruturas nativas de α-hélice da PrP em estruturas secundárias do

tipo fitas-β, consistentes com as observadas na PrPSc (SWIETNICKI et al., 1997;

HORNEMANN & GLOCKSHUBER, 1998). De fato, um estudo que submeteu frações de

PrPC isolada de cérebros humanos sadios a condições de desnaturação química leve e pH 3.5,

mostrou uma conversão dos monômeros solúveis em agregados insolúveis, mas que não

foram resistentes a proteases (ZOU & CASHMAN, 2002). Cabe destacar, que a análise destes

estudos apresenta o pH 4.5, aproximadamente, como um ponto crítico a partir do qual maiores

acidificações do meio disparam as alterações citadas. De fato, tanto regiões caveolares da

membrana plasmática quanto organelas endocíticas, por onde a PrPC trafega normalmente e

onde o pH se aproxima a este valor (PRADO et al., 2004; LINDEN et al., 2008), foram

postulados como sítios para a conversão da PrPC em PrPSc (BORCHELT et al., 1992;

ANDERSON, 1998); porém, a necessidade de desnaturação por agentes químicos para

24

disparar a transição estrutural ainda deve ser correlacionada com um fator fisiológico.

1.1.3 SOBRE A FUNÇÃO DA PrPC NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL

Após a associação da PrPC às TSEs (BOLTON et al., 1982) e a proposta dos príons

como agentes patogênicos infecciosos (PRUSINER et al., 1982), grandes esforços foram

direcionados para a compreensão do inédito mecanismo de replicação dos príons e do

subseqüente desenvolvimento da enfermidade. Este processo acabou atuando em detrimento

da análise da função fisiológica da PrPC (MARTINS et al., 2002), sendo que até hoje a função

desta proteína ainda é intensamente discutida (revisto por LINDEN et al., 2008; AGUZZI et

al., 2008).

Passaram-se aproximadamente dez anos após a identificação da PrPC até que fossem

feitas as primeiras tentativas importantes de estudar sua funcionalidade, através da geração de

animais transgênicos nulos para o gene Prnp. A criação das primeiras cepas de camundongos

Prnp-/- sugeriu que a PrPC não seria necessária para o desenvolvimento embrionário e pós-

natal, já que a análise inicial dos animais evidenciou uma marcada falta de fenótipos

anatômicos ou comportamentais (BÜELER et al., 1992; MANSON et al., 1994)

acompanhada, no entanto, da impossibilidade destes de replicar PrPSc e desenvolver a

patologia após serem infetados com extratos de cérebros doentes (BÜELER et al., 1993;

BRANDNER et al., 1996). Mecanismos compensatórios ativados durante o desenvolvimento

poderiam estar mascarando a conseqüência funcional da ausência da PrPC nestes animais

transgênicos, porém, a deleção condicional da PrPC dos neurônios de camundongos adultos

não resultou em mudanças histopatológicas 13 meses depois (apesar de que, como veremos

mais adiante, estes animais exibirem alterações da excitabilidade neuronal) (MALLUCCI et

25

al., 2002). Este cenário potencialisou ainda mais o campo de estudo da patologia dos príons e

a hipótese de ganho de função tóxica da PrPSc para explicar a neurodegeneração característica

das TSEs, sem prover indícios conclusivos da ação fisiológica da PrPC e do envolvimento da

perda de função da PrPC na patogênese. Porém, como foi explicado acima, a hipótese de

ganho da função tóxica da PrPSc por si só não parece ser suficiente para a compreensão total

da fenomenologia das TSEs, e alguma função relevante para a PrPC é sugerida pelo fato de

que vários segmentos de sua seqüência são altamente conservados em diferentes espécies

(WOPFNER et al, 1999).

Durante os últimos anos, a análise minuciosa de processos fisiológicos pontuais, tanto

em animais transgênicos para a PrPC quanto em culturas de células in vitro, resultou

extremamente prolífica enquanto a produção de informação funcional desta proteína.

Diversos ligantes da PrPC foram identificados (revisto por LINDEN et al., 2008), dentre os

quais destacamos alguns na Figura 6.

Inclusive, hoje em dia a evidência acumulada apresenta um panorama complexo de

múltiplos achados que pareceriam estar pouco relacionados. Uma visão unificada destes

dados sugere que a PrPC forma parte de uma plataforma dinâmica da superfície celular que

integra módulos sinalizadores através de interações seletivas com vários ligantes e vias

sinalizadoras transmembrana que, por sua vez, são traduzidas em conseqüências de amplo

espectro tanto para a fisiologia quanto para o comportamento (LINDEN et al., 2008). A perda

ou perturbação destes mecanismos sinalizadores é, provavelmente, instrumental para a

patogênese das TSEs. A seguir, discutiremos algumas das funções atribuídas à PrPC.

26

Figura 6. Ligantes da PrPC. A seqüência traduzida da proteína príon é representada em forma de bastonete, onde seus domínios mais importantes são de acordo ao código apresentado acima à direita. As estrelas amarelas indicam a posição dos resíduos que podem ser glicosilados. Cada ligante é indicado junto com o correspondente segmento de aa que contém o domínio de ligação na PrPC murina. GAG, glicosaminoglicanos; HS, heparan sulfato; LRP1, proteína relacionada ao receptor de lipoproteínas de baixa densidade; LRP, proteína precursora do receptor de laminia; LR, receptor de laminina; Pint1, interator da proteína príon 1; CK2, caseína cinase 2; Grb, proteína ligante do receptor de fatores de crescimento; SynIb, sinapsina Ib; APLP1, proteína similar a precursor amilóide; Nrf2, fator 2 relacionado ao fator nuclear E2; GASP, proteína distribuidora associada ao receptor acoplado à proteína G; HnRNP, ribonucleoproteína nuclear heterogênea; AldC, aldolase C/zebrina. Dados obtidos com a PrPC humana, de hamster ou bovina foram transpostos às seqüências murinas homólogas. (Adaptado de LINDEN et al., 2008).

1.1.3.1 INTERAÇÃO COM COBRE E ESTRESSE OXIDATIVO

Uma função na qual a PrPC foi repetidamente implicada é a de transporte e

metabolismo de íons de cobre e proteção contra o estresse oxidativo (revisto por MILHAVET

& LEHMANN, 2002; ROUCOU & LEBLANC., 2003).

27

O cobre é um dos ligantes identificados da PrPC (BROWN et al., 1997a), mas o real

papel fisiológico desta interação ainda é controverso. Estudos in vitro do domínio de

octapeptídeos PrP51-90 demonstraram que esta seqüência liga estritamente Cu2+ dentre outros

íons metálicos em uma interação cooperativa que envolve quatro íons de Cu2+ (HORNSHAW

et al., 1995; STOCKEL et al., 1998; VILES et al., 1999), mas existe evidência de interações

de menor afinidade com outros íons metálicos na PrPC inteira (JACKSON et al., 2001; CHOI

et al., 2006). A afinidade destas interações, mediadas pela cauda N-terminal da PrPC, foram

estimadas dentro da faixa micromolar baixa (MILLHAUSER, 2007). Ao mesmo tempo,

também foram identificados sítios de coordenação de Cu2+ em regiões mais C-terminais,

especificamente nas histidinas 96 e 111 (JACKSON et al., 2001; JONES et al., 2004).

Recentemente foi descrito que, na presença de baixas concentrações de Cu2+, existe um modo

de coordenação distinta que envolve múltiplas histidinas e permite a proteína se ligar a dois

Cu2+ com afinidade na faixa nanomolar (WELLS et al., 2006a, 2006b). A interação com Cu2+

tem conseqüências estruturais para a proteína príon, já que a conformação da PrPC é alterada

pela interação (MIURA et al., 1996; STOCKEL et al., 1998; VILES et al., 1999; QIN et

al., 2000; JACKSON et al., 2001) e o enovelamento da PrP recombinante é afetado pela

presença destes íons (BROWN et al., 1999; WONG et al., 2000, JONES et al., 2004).

A ligação de Cu2+ pela proteína príon induz robusta internalização endocítica da

proteína residente na superfície celular (PAULY & HARRIS, 1999; PERERA & HOOPER,

2001). É interessante notar que a ligação é dependente do pH, sendo a afinidade maior em pH

neutro (WHITTAL et al., 2000; MIURA et al., 2005). Estes dados seriam consistentes com a

PrPC desenvolvendo uma ação quelante ou de transporte de cobre, já que a proteína poderia

ligar Cu2+ na superfície celular e posteriormente liberá-lo dentro de endossomos ácidos. Esta

possibilidade é revestida de importância pelo cobre ser um elemento celular essencial, mas

que pode se tornar extremamente tóxico quando em excesso devido à atividade pró-oxidante

28

de seus íons, que geram espécies reativas de oxigênio (ROS).

Consistente com esta hipótese, uma função atribuída por vários grupos à proteína

príon é a proteção contra estresse oxidativo. Foi mostrado que células resistentes a estresse

oxidativo apresentavam níveis elevados de PrPC (BROWN et al., 1997b). Culturas de

neurônios PrP-/- são mais suscetíveis ao tratamento com peróxido de hidrogênio do que

células selvagens, e este efeito pode ser bloqueado ao tratar as culturas com o peptídeo PrP59-

91 (WHITE et al., 1999). Existe controvérsia sobre o envolvimento neste processo da atividade

Cu/Zn superóxido dismutase (SOD). Por um lado, um grupo sugeriu uma diminuição da

atividade SOD em neurônios PrP-/- (BROWN et al., 1997c), enquanto outro falhou na

tentativa de observar tal fenômeno (WAGGONER et al., 2000). Por outro lado, a evidência de

que a PrP recombinante enovelada na presença de Cu2+ apresenta atividade SOD (BROWN

et al., 1999) foi contrariada por outros estudos (SAKUDO et al., 2003; JONES et al., 2005).

Em suma, a ligação PrPC:Cu2+ parece proteger células contra o estresse oxidativo, mas

os mecanismos envolvidos não foram esclarecidos.

1.1.3.2 ATIVIDADE SINÁPTICA E EXCITABILIDADE NEURONAL

A presença da PrPC em terminais pré e pós-sinápticos foi confirmada por estudos de

imunomarcação em microscopia eletrônica e fracionamento de sinaptossomos (FOURNIER et

al., 1995; SALÈS et al., 1998; HERMS et al., 1999; HAEBERLE et al., 2000). Além disso, a

deposição da PrPSc em terminais sinápticos também foi confirmada (TATESHI et al., 1996),

possivelmente causando a desorganização ou perda sináptica que caracterizam as doenças por

príon (revisto por AGUZZI et al., 2008).

As análises de localização da PrPC podem ser correlacionadas com estudos

29

eletrofisiológicos realizados em fatias hipocampais de camundongos PrP-/-, que mostraram

uma significativa diminuição da potenciação de longo prazo (LTP) das sinapses

glutamatérgicas da via CA3-CA1, concomitante com uma redução da inibição rápida mediada

pelo receptor GABAA (COLLINGE et al., 1994; MANSON et al., 1995; WHITTINGTON et

al., 1995). Ainda mais, o fenótipo destes animais nulos para PrPC foi resgatado pela expressão

de um transgene que codifica a PrPC (WHITTINGTON et al., 1995). Por outro lado, a

expressão de PrPC também suprime a redução de correntes de K+ ativadas por Ca2+

observada

em animais PrP-/- (HERMS et al., 2001). Além disso, quando comparados com animais

selvagens, camundongos PrP-/- apresentaram maior sensibilidade a convulsões (WALZ et al.,

1999). Em marcado contraste, um estudo realizado em fatias hipocampais de camundongos

nulos para PrP não encontrou diferenças na excitabilidade neuronal, inibição sináptica,

potencial de reversão dos potenciais pós-sinápticos inibitórios ou LTP (LLEDO et al., 1996),

ou ainda observaram aumento, e não redução, da transmissão sináptica glutamatérgica no giro

denteado de animais PrP-/- (MAGLIO et al., 2004, 2006). Porém, esta última observação não

refuta os estudos citados acima que observaram uma redução da LTP de sinapses

glutamatérgicas na área CA1, já que os mecanismos moleculares de LTP do giro denteado e

da área CA1 são distintos (MALENKA et al., 2004).

Também existem trabalhos que correlacionam o nível de expressão da PrPC com a

excitabilidade neuronal. Neurônios derivados de camundongos nulos para PrP apresentam

tanto uma menor resistência ao input elétrico quanto à ausência de correntes hiper-

polarizantes pós-despolarização (IAHP), dois efeitos opostos com relação à excitabilidade

neuronal (COLLING et al., 1996). Deleções condicionais do Prnp em camundongos com 12

semanas de vida pós-natal também resultam em correntes IAHP lentas nos neurônios

hipocampais da área CA1, favorecendo a excitabilidade neuronal (MALLUCCI et al., 2002).

Como a depleção de PrPC foi realizada durante a vida adulta destes animais, o efeito

30

observado deve-se a uma disfunção sináptica e não um déficit do desenvolvimento.

A análise destes diversos estudos permite chegar à conclusão de que a PrPC pode ter

efeitos tanto estimuladores quanto inibidores da função sináptica, dependendo da região do

sistema nervoso central e do tipo de neurotransmissor envolvido.

1.1.3.3 CONTROLE DA SOBREVIVÊNCIA NEURONAL

Um fato a ser destacado é que existe evidência de que a PrPC exerce uma função

reguladora da sobrevivência celular (revisto por ROUCOU & LEBLANC, 2005; LINDEN et

al., 2008). Esta atividade é altamente relevante, pois as TSEs são caracterizadas por uma

extensa morte neuronal.

Os primeiros indícios que sugerem que a PrPC regula eventos neuroprotetores, são

dados pela análise da sensibilidade à morte celular induzida por privação de soro em

linhagens de células neurais derivadas de camundongos PrP-/-. Estes neurônios se mostraram

mais sensíveis à apoptose do que neurônios de camundongos selvagens, sendo que a

transfecção do Prnp nas células nulas para PrPC impediu a apoptose (KUWAHARA et al.,

1999). A morte apoptótica de neurônios fetais humanos em cultura induzida pela

microinjeção de Bax é resgatada pela co-injeção de Prnp, e a inibição deste último gene não

induz morte celular, mas potencializa o efeito degenerativo de Bax (BOUNHAR et al., 2001).

Alguns estudos apresentam evidência de que a expressão da PrPC tem efeitos neuroprotetores

durante insultos hipóxicos isquêmicos em cérebros in vivo (WEISE et al., 2004; SHYU et al.,

2005). Como veremos em detalhe mais adiante (Seção 1.3), a interação da PrPC com a co-

chaperona hop/STI-1 induz a transdução de sinais neuroprotetores que resgatam da apoptose

tanto neurônios (ZANATA et al., 2002; CHIARINI et al., 2002; LOPES et al., 2005) quanto

31

astrócitos (ARANTES et al., 2009). Também foi sugerido que a PrPC residente na superfície

celular desenvolve um papel protetor em células granulares cerebelares através de interações

trans heterofílicas (CHEN et al., 2003). As isoformas transmembrana da PrPC foram

associadas a eventos neurodegenerativos (HEDGE et al., 1998), já sua isoforma citosólica foi

associada a eventos tanto protetores (ROUCOU et al., 2003) quanto degenerativos (MA et al.,

2002).

Porém, o efeito ambivalente da proteína príon sobre a sobrevida neuronal não é uma

característica exclusiva da versão citosólica. Foi descrito que a superexpressão transgênica da

PrPC em camundongos provoca um fenótipo que apresenta neurodegeneração do sistema

nervoso central e periférico (WESTAWAY et al., 1994b). Trabalhos realizados em distintas

linhagens celulares sugerem que o nível de expressão da PrPC potencia a morte celular

dependente da caspase-3 (PAITEL et al., 2002, 2003, 2004). Além disso, a ligação cruzada da

PrPC induzida por anticorpos monoclonais que reconhecem epítopos de dentro do segmento

PrP95-105 provoca morte celular no hipocampo e cerebelo de camundongos, enquanto

anticorpos que reconhecem a região PrP113-157 não produziram efeitos observáveis

(SOLFOROSI et al., 2004). Finalmente, o peptídeo PrP106-126 que corresponde ao domínio

hidrofóbico da PrPC, é utilizado como modelo de indução de neurotoxicidade, já que provoca

o aparecimento de sinais característicos de apoptose (BURKLE et al., 1999; SAEZ-VALERO

et al., 2000). O efeito neurotóxico desse peptídeo em culturas de neurônios é dependente da

expressão de PrPC e da presença de células da microglia que, uma vez ativadas pelo peptídeo,

liberam substâncias neurotóxicas, como ROS (BROWN et al., 1996).

Em conclusão, a PrPC parece ser um elemento crítico de uma rede de sinalização que

controla a sensibilidade à morte celular programada, com efeitos finais dependentes do tipo

celular envolvido. Provavelmente o resultado pró- ou anti-apoptótico do engajamento da PrPC

deve ser ditado pela disponibilidade de seus ligantes, determinando assim as vias

32

sinalizadoras que serão ativadas (LINDEN et al., 2008).

1.1.3.4 DIFERENCIAÇÃO E ADESÃO CELULAR

Estudos da regulação da expressão e localização da PrPC em neurônios em

desenvolvimento produziram resultados contraditórios, e não foram capazes de atribuir uma

função clara a esta proteína durante a diferenciação neuronal. Existem trabalhos sugerindo

que a PrPC é superexpressa durante o desenvolvimento de precursores neuronais (STEELE et

al., 2006) e que, durante o desenvolvimento do cérebro de hamsters, a proteína se desloca dos

axônios para regiões sinápticas (SALÈS et al., 2002), onde poderia ter um papel no

endereçamento axonal e na sinaptogênese. Entretanto, um estudo realizado com neurônios

hipocampais confirmou a regulação da expressão da PrPC durante o desenvolvimento, mas

não observou deslocamentos da proteína, nem confirmou sua localização sináptica (GALVAN

et al., 2005). Mesmo assim, a PrPC deve ter um papel na diferenciação neuronal, já que,

comparados com neurônios selvagens, culturas de neurônios hipocampais derivados de

camundongos nulos para PrP apresentam neuritos mais curtos, e este fenômeno pode ser

revertido pela transfecção do Prnp (KUWAHARA et al., 1999).

Esta função é apoiada pela evidência da ligação de alta afinidade da PrPC à laminina.

A interação dessas proteínas está envolvida na neuritogênese, induzida por NGF, de células

PC-12 que crescem sobre substratos de laminina (GRANER et al., 2000a, 2000b). O mesmo

grupo demonstrou recentemente outra interação entre a PrPC e componentes da matriz

extracelular, com conseqüências sobre a diferenciação neuronal: a PrPC liga a vitronectina

induzindo crescimento axonal em gânglios da raiz dorsal de camundongos, e esta sinalização

parece ser compensada em neurônios PrP-/- por mecanismos dependentes de integrinas (HAJJ

33

et al., 2007). Ao mesmo tempo, existem diversos indícios de que a PrPC mantém interações

heterofílicas cis e trans (GAUCZYNSKI et al., 2001; LEGNAME et al., 2002; CHEN et al.,

2003; SANTUCCIONE et al., 2005; KANAANI et al., 2005), podendo resultar em um

aumento da sinaptogênese e do crescimento dendrítico e axonal (CHEN et al., 2003;

SANTUCCIONE et al., 2005; KANAANI et al., 2005).

A PrPC também liga duas proteínas transmembrana envolvidas na diferenciação

celular. Uma destas interações é mantida com o receptor de laminina (LRP) e/ou a presumível

isoforma madura do receptor de laminina (LR) (RIEGER et al., 1997; GAUCZYNSKI et al.,

2001), e a interface de ligação foi mapeada nos segmento PrP143-178 (envolvendo a α-hélice 1

e a alça adjacente) e LRP161-179 (HUNDT et al., 2001). A funcionalidade desta interação ainda

não foi esclarecida, mas foi sugerido que o LRP atuasse como um receptor que regulasse a

internalização da PrPC (GAUCZYNSKI et al., 2001). A outra interação envolve a molécula de

adesão celular neuronal (N-CAM). Foi demonstrado que a N-CAM possui dois sítios de

ligação que abrangem as fitas-β C e C’ nos seus dois domínios FNIII consecutivos, e na PrP a

interface de interação reside em um segmento descontinuo que envolve parte da cauda N-

terminal e, novamente, a α-hélice 1 junto com a alça adjacente (PrP23-88 e PrP141-176,

respectivamente) (SCHMITT-ULMS et al., 2001). Esta interação se desenvolve na superfície

celular de neurônios hipocampais, e promove crescimento neurítico através do recrutamento,

dependente da PrPC, da N-CAM às balsas lipídicas e a ativação da tirosina cinase não

receptora FYN (SANTUCCIONE et al., 2005). A ativação da FYN pela ligação da PrPC com

anticorpos divalentes também foi demonstrada nas linhagens celulares 1C11 e PC12, em um

mecanismo dependente de caveolina (MOUILLET-RICHARD et al., 2000) que estimula a via

RAS-RAF, levando à fosforilação transiente da ERK (PANTERA et al., 2009). Porém ainda

resta esclarecer a relevância biológica deste último modelo de ativação.

Finalmente, como veremos mais adiante (Seção 1.3), a interação entre PrPC e a

34

hop/STI1 promove neuritogênese de neurônios hipocampais em cultura (LOPES et al., 2005)

e diferenciação de astócitos em cultura (ARANTES et al., 2009).

1.1.3.5 COMPORTAMENTO

Vários trabalhos abordaram o papel da PrPC no comportamento e em funções mais

sistêmicas do SNC que, provavelmente, estão relacionadas ao papel da PrPC na função

sináptica e na excitabilidade neuronal. Sem entrar em detalhes dos trabalhos, podemos

mencionar alguns importantes resultados. Animais PrP-/- apresentam alterações do padrão

locomotor, tanto durante a exploração de novos ambientes (ROESLER et al., 1999), quando

sob o efeito de drogas psicotrópicas que afetam sistema glutamatérgico (COITINHO et al.,

2002), ou após ser submetidos a estresse psíquico ou físico (NICO et al., 2005). Estes animais

também demonstram alterações no ciclo sono-vigília (TOBLER et al., 1996, 1997; HUBER et

al., 1999, 2002). Finalmente, animais PrP-/- apresentam deficiência de aprendizado espacial

dependente do hipocampo (CRIADO et al., 2005), e a retenção de memórias de curto e longo

prazo destes animais é afetada, mas somente quando os animais alcançam uma idade

avançada (COITINHO et al., 2003). Consistente com esta evidência, a interrupção da

interação da PrPC com a laminina (COITINHO et al., 2006) ou com a hop/STI1 (COITINHO

et al., 2007) no hipocampo também perturba o processamento mnemônico.

1.2 A PROTEÍNA HOP/STI1

A proteína hop/STI1 foi originalmente identificada em Saccharomyces cerevisiae

35

como uma proteína superexpressa em eventos estressantes relacionados a choques térmicos

(NICOLET & CRAIG, 1989), pelo que recebeu o nome de stress-inducible protein 1 (STI1).

Posteriormente foi reconhecido que ela tem homólogos em outras espécies, tais como

humanos, ratos, camundongos, insetos, plantas, parasitas e vírus (revisto por ODUNUGA et

al., 2004). Enquanto STI1 identifica o homólogo de levedura, o de mamíferos é referido

usualmente por HSP70-HSP90 organizing protein (hop), já que o papel mais conhecido desta

proteína é o de co-chaperona adaptadora para a formação do complexo de chaperonas HSP70-

HSP90 pertencentes à família das proteínas de choque térmico (heat shock proteins, HSPs)

(SMITH et al., 1993; CHEN et al., 1996; DITTMAR et al., 1996; CHEN & SMITH, 1998).

Em conseqüência, ambos os nomes (hop e STI1) tem sido usados na literatura, de forma não

consistente, para indicar a proteína, pelo que optamos por referir-nos a ela como hop/STI1.

A seguir, vamos rever aspectos estruturais e funcionais desta proteína.

1.2.1 SOBRE A ESTRUTURA DA HOP/STI1

A hop/STI1 tem um peso molecular de 66 kDa e uma seqüência de 543 aa que não

sofre alterações pós-traducionais. Ela possui nove motivos estruturais de tetratricopeptídeos

repetidos (TPRs), formados por uma sequência consenso de 34 aa. Estes nove motivos estão

agrupados em três domínios globulares TPR denominados TPR1, TPR2a e TPR2b, sendo que

cada um destes domínios contém três repetições consecutivas de motivos TPR. O domínio

TPR1 ocupa o N-terminal da proteína, e os domínios TPR2a e TPR2b são interconectados por

um pequena cadeia na região mais próxima ao C-terminal (Fig. 7). A análise de proteínas

mutantes indicou que o domínio TPR1 é responsável pela interação com a seqüência C-

terminal da HSP70, e que os domínio TPR2a e TPR2b podem ligar a HSP90, também através

36

da seqüência C-terminal desta última (CHEN et al., 1996; LASSLE et al., 1997; DEMAND et

al., 1998; YOUNG et al., 1998; CARRELLO et al., 1999). As caudas C-terminais dos

membros das famílias de HSP70 e HSP90 possuem a seqüência consenso EEVD, e foi

demonstrado que este motivo é reconhecido eletrostaticamente pelos domínios TPR,

explicando a conservação evolutiva desta seqüência. Porém, TPR1 e TPR2a reconhecem

especificamente HSP70 e HSP90, respectivamente, devido a efeitos hidrofóbicos que

envolvem resíduos upstream da cauda EEVD das HSPs (SCHEUFLER et al., 2000).

Figura 7. Diagrama esquemático da disposição dos domínios da proteína hop/STI1. Os domínios da hop/STI1 são destacados como caixas coloridas e as seqüências que ligam estes domínios são apresentados como segmentos verdes. Os resíduos iniciais e finais são indicados embaixo de cada domínio. O diagrama é esquemático e não respeita escalas.

Proteínas constituídas por repetições em série destes domínios TPR têm sido

associadas à formação de complexos multiprotéicos, pois apresentam estruturas altamente

ricas em α-hélices dispostas de forma tal de delinear um canal anfipático que pode acomodar

cadeias complementares de proteínas alvo (revisto por BLATCH & LASSLE, 1999). Análises

cristalográficas confirmam que este mecanismo é válido para a hop/STI1. O domínio TPR2a

foi cristalizado em complexo com um peptídeo de 5 aa que mimetiza a cauda C-terminal da

HSP90, e o domínio TPR1 com um peptídeo 12 aa que corresponde à cauda C-terminal da

HSC70, uma chaperona 85% homologa à Hsp70 e que, diferentemente desta última, não é

somente expressa em casos de estresse, mas constitutivamente (SCHEUFLER et al., 2000).

Nos modelos obtidos podemos observar os domínios TPR como estruturas globulares ricas

em α-hélices que criam um sulco onde os peptídeos se inserem de forma estendida (Fig. 8).

37

Figura 8. Estrutura dos domínios TPR1 e TPR2a. São apresentadas, em representações cartoon, duas orientações dos domínios TPR1, (A) e (B), e TPR2a, (C) e (D). Ambos os domínios foram cristalizados em complexo com peptídeos das caudas C-terminais de chaperonas que eles reconhecem especificamente. Cada motivo TPR forma duas α-hélices antiparalelas, e ambos domínios apresentam uma α-hélice C-terminal adicional formada por segmentos que não consituem os motivos (Adaptado de SCHEUFLER et al., 2000).

A hop/STI1 também possui dois domínios menores, ricos em repetições de aspartato e

prolina, conhecidos como domínios DP1 e DP2 (CARRIGAN et al., 2004) (Fig. 7). Para estes

domínios, assim como para os segmentos que conectam os domínios globulares da hop/STI1,

não existe informação estrutural.

Tampouco existe modelo de alta resolução da proteína inteira, mas, recentemente, um

estudo realizou medidas de SAXS para o homólogo humano da hop/STI1 (ONUOHA et al.,

2008). Pela interpretação de parâmetros estruturais (raio de giro, distância máxima

intramolecular) de proteínas mutantes truncadas, os autores sugerem que a hop/STI1 humana

se apresenta em solução como um dímero. Isto os levou a criar um modelo da hop/STI1,

impondo simetria P2, e modelando a interface de dimerização por homologia à proteína

GlcNac, uma proteína dimérica rica em domínios TPR (JINEK et al., 2004). O modelo obtido

apresenta um dímero de hop/STI1 com uma estrutura em forma de borboleta (Fig. 9). Porém,

38

existe controvérsia sobre o estado oligomérico de homólogos da hop/STI1. Estudos de

hop/STI1 de levedura (PRODROMOU et al., 1999; FLOM et al., 2007) e hop humana

(CARRIGAN et al., 2004) sugeriram que a proteína é dimérica. Não obstante, o único estudo

que analisou a hop/STI1 murina (a proteína que será usada no presente trabalho), purificada

de três formas distintas, encontrou moléculas monoméricas em duas dos três tipos de

purificações (VAN DER SPUY et al., 2001).

Figura 9. Modelos de baixa resolução da hop/STI1 humana, obtidos por análise de dados de SAXS. Linha superior: modelo do tipo rigid-body modeling, obtido com o programa BUNCH, da hop/STI1 humana. São apresentados os domínios TPR1 (amarelo), DP1 (rosa), TPR2a (vermelho), TPR2b (verde), DP2 (azul). Linha inferior: superposição deste modelo com modelos volumétricos obtidos com o programa GASBOR. Em cada linha são apresentadas três orientações dos modelos. (Adaptado de ONUOHA et al., 2008)

1.2.2 SOBRE A FUNÇÃO DA HOP/STI1

A hop/STI1 poder ser encontrada principalmente no núcleo celular e no citoplasma e,

em menor quantidade, adsorvida à face extracelular da membrana plasmática (ZANATA et al.,

2002; ODUNUGA et al., 2004). No entanto, também foi recentemente demonstrado que ela

pode ser secretada constitutivamente para o meio extracelular por culturas de células de

fibrosarcoma (EUSTACE et al., 2004), glioblastoma (ERLICH et al., 2007) e astrócitos

39

(LIMA et al., 2007). O mecanismo dessa secreção ainda não foi estabelecido, dado que sua

seqüência não contém um peptídeo sinalizador para secreção.

As características de suas funções intracelulares como co-chaperona são bem

descritas, tanto quanto outras funções independentes, como a de modulação de mecanismos

de sinalização intracelular (para uma revisão ver ODUNUGA et al., 2004). Também existe

evidência para funções extracelulares da hop/STI1, tanto dependentes quanto independentes

da interação com a PrPC. Vamos rever brevemente os estudos mais relevantes que abordam

esta questão.

1.2.2.1 ATIVIDADES INTRACELULARES

As chaperonas constituem uma família de proteínas altamente conservada que

desenvolvem funções cruciais da fisiologia celular, já que são facilitadoras do correto

enovelamento das proteínas sintetizadas, evitando o desencadeamento de mecanismos

patogênicos. Elas podem atuar constitutivamente na tradução de proteínas. Enquanto a

tradução protéica não está completa, as cadeias polipetídicas não enoveladas ficam expostas à

interações com outras cadeias em síntese e há superpopulação do citosol, podendo induzir à

agregação. As chaperonas reconhecem especificamente segmentos hidrofóbicos e/ou

esqueletos protéicos ainda na via de enovelamento nativa, impedindo interações impróprias

dentro e entre polipeptídeos e evitando o mal-enovelamento (revisto por HARTL & HAYER-

HARTL, 2002). Elas podem também atuar no re-enovelamento de proteínas que sofreram

desenovelamento como resultado de estresse celular, transporte intracelular, degradação de

proteínas e transdução de sinais (revisto em MUCHOWSKI & WACKER, 2005). Por

exemplo, o estresse induzido pelo aumento da temperatura ativa um programa genético,

40

conhecido como resposta de choque térmico, caracterizado pelo aumento da síntese de

chaperonas não constitutivas da família HSP, de forma a combater o dano protéico resultante

do estresse. As chaperonas exercem sua função facilitadora da conformação ótima dos seus

substratos através de ciclos de ligação e liberação do substrato, regulados pela sua atividade

ATPásica e pelo auxílio de co-chaperonas.

Devido à atividade de chaperonas, as proteínas de choque térmico desenvolvem

funções na proteção em distúrbios de enovelamento protéico, tais como as doenças

neurodegenerativas de Alzheimer, Parkinson e Huntington. Foi sugerido que o mecanismo de

proteção das chaperonas seja o direcionamento da agregação protéica à formação de fibras

inócuas, impedindo a formação de oligômeros intermediários tóxicos (MUCHOWSKI &

WACKER, 2005).

HSP70 estabiliza o enovelamento nativo de proteínas presentes na maior parte dos

compartimentos celulares (BUKAU & HORWICH, 1998) e HSP90 se encontra no citosol

onde, além de estabilizar proteínas mal-enoveladas, regula a atividade de enzimas

sinalizadoras como tirosina cinases e calcineurina (YOUNG & HARTL, 2002). Foi estimado

que 15 a 20% das proteínas atingem sua conformação nativa com a assistência da HSP70 e da

chaperona HSP40, sendo que uma fração destas também requer a participação da HSP90

(HARTL & HAYER-HARTL, 2002). Para a correta ação conjunta de HSP90 e HSP70, a

atividade coordenada de co-chaperonas catalisadoras e adaptadoras é crucial. Uma destas co-

chaperonas é a hop/STI1. Inicialmente, proteínas parcialmente enoveladas são direcionadas a

HSP70 pela HSP40, formando um complexo inicial que, para muitas proteínas, é suficiente

para atingir a conformação nativa. Quando a participação da HSP90 é requerida, a hop/STI1

(também denominada p60 em estudos iniciais) funciona como adaptadora para a aproximação

coordenada da HSP70 e a HSP90, através da ligação de seus domínios TPR às HSPs (SMITH

et al., 1993; CHEN et al., 1996; JOHNSON et al., 1998; YOUNG et al., 1998; SCHEUFLER

41

et al., 2000). A ligação da hop/STI1 com HSP70 é regulada pela atividade ATPásica desta

última (BUKAU & HORWICH, 1998). Além da função adaptadora da hop/STI1, ela modula

a atividade das chaperonas. A HSP90 se desliga das proteínas clientes após hidrólisar ATP

(OBERMANN et al., 1998; PRODROMOU et al., 1999). Esta atividade ATPásica da HSP90

é inibida por hop/STI1, através da interação desta última com o sítio de ligação de ATP da

HSP90 (PRODROMOU et al., 1999).

Finalmente, existe evidência de que as HSPs modulam diretamente vias de sinalização

intracelulares pela interação com componentes da via RAS/RAF (NOLLEN & MORIMOTO,

2002) e de vias reguladoras de mecanismos de morte celular programada (BEERE et al.,

2004), assim como com complexos transcricionais (YOUNG & HARTL, 2002). Também foi

demonstrado que a atividade do complexo HSP90-hop-HSP70 está envolvida na maturação

funcional de receptores de esteróides (revisto por PRATT & TOFT, 2003).

1.2.2.2 ATIVIDADES EXTRACELULARES DA HOP/STI1 INDEPENDENTES DA PrPC

Além das funções intracelulares da hop/STI1, existem vários trabalhos que

demonstram um papel desta proteína no meio extracelular (ZANATA et al., 2002; CHIARINI

et al., 2002; LOPES et al., 2005; COITINHO et al., 2006; ARRUDA-CARVALHO et al.,

2007; ERLICH et al., 2007; AMERICO et al., 2007; CAETANO et al., 2008; ARANTES et

al., 2009). Como veremos na seguinte seção, a maioria das funções demonstradas envolvem a

ação da PrPC, porém, dois estudos recentes, realizados em culturas de células ou explantes de

retina derivados de animais PrP-/-, demostraram que a hop/STI1 também exerce funções

fisiológicas independentes da PrPC. Na presente seção, vamos nos referir a estes estudos.

Foi sugerido que hop/STI1 está envolvida na modulação da proliferação e sobrevida

42

celular na retina de ratos em desenvolvimento, sem precisar da ação da PrPC (ARRUDA-

CARVALHO et al., 2007). Anticorpos policlonais contra a hop/STI1 (anti-hop/STI1)

bloquearam a morte induzida por axotomia de células da camada ganglionar e neuroblástica,

tanto em animais selvagens como nulos para PrPC, e sem envolver vias canônicas de

sinalização como a cAMP/PKA, ERK, PI3K ou PKC. Também foi observado que tratamento

com hop/STI1 ou anti-hop/STI1 produzem efeitos contrários sobre a proliferação celular das

retinas em desenvolvimento, sendo que o primeiro inibe a proliferação, e o segundo a

potencia. Novamente, estes fenômenos não envolvem a PrPC.

Em linha com esta última evidência, um outro estudo mostrou que culturas de

astrócitos tratadas com hop/STI1 também apresentam redução da proliferação celular

(ARANTES et al., 2009). O mecanismo subjacente depende da via de sinalização PKC, mas

independe da PrPC, já que foi observado tanto em culturas derivadas de animais selvagens

quanto nulos para PrPC.

1.3 A INTERAÇÃO PrPC:HOP/STI1 E SUA FUNCIONALIDADE

Para testar a hipótese de uma função neuroprotetora da PrPC, Chiarini e colaboradores

estudaram o efeito produzido pela interação entre a PrPC e um peptídeo de 16 aa,

denominado PrR, reconhecido previamente como um ligante da PrPC (MARTINS et al.,

1997). Naquele trabalho, foi observado que o tratamento de explantes de retinas de rato e

camundongo com o PrR reduz morte celular induzida por anisomicina, sendo que esse efeito

mostra-se ausente em animais nulos para PrP. A estimulação dos explantes com o peptídeo

ativa as vias de sinalização da PKA e da ERK, porém, a neuroproteção foi dependente

somente da primeira. Usando tanto os animais transgênicos mencionados acima, quanto

43

anticorpos anti-PrPC que bloqueariam o acesso à PrPC, bem como a liberação da PrPC da

superfície celular pela clivagem de sua âncora de GPI, foi demonstrado que o efeito protetor é

dependente da interação da PrPC com o peptídeo (CHIARINI et al., 2002). Assim, para que o

mecanismo protetor seja ativado, é necessária a presença da PrPC ancorada à membrana, onde,

por algum meio (possivelmente algum outro ligante), ela é capaz de ativar o sinal protetor.

Esses achados impulsionaram a procura de um ligante fisiológico da PrPC que fosse

mimetizado pelo PrR. Para isso, foi gerado um anticorpo contra o peptídeo PrR, que

identificou uma proteína de 66 kDa em western blots de géis bi-dimensionais. Após o

isolamento e seqüenciamento do spot, foi demonstrado que a proteína reconhecida pelo

anticorpo anti-PrR era a stress-inducible protein 1 (hop/STI1). Esta proteína foi observada co-

localizada com a PrPC na membrana celular e a ligação foi corroborada in vivo por

experimentos de co-imunoprecipitação. Através do uso de bibliotecas de peptídeos sintéticos

que reproduziam segmentos de ambas proteínas, foi demonstrado que a interface de interação

está contida nos segmentos PrP113-128 (na interface da cauda N-terminal com o domínio

globular) e hop/STI1230-245 (em uma alça do domínio TPR2a) (ZANATA et al., 2002) (Fig.

10). Cabe destacar que a interação PrPC:hop/STI1 gerou sinais neuroprotetores contra morte

celular induzida por anisomicina em explantes de retina de camundongos e ratos, similares

aos disparados pelo PrR (ZANATA et al., 2002). O tratamento dos explantes com o peptídeo

hop/STI1230-245 também foi capaz de produzir esse efeito (ZANATA et al., 2002), dependente

da ativação da via cAMP/PKA (Chiarini LB, dados não publicados). A partir destes estudos,

outros trabalhos confirmaram a neuroproteção produzida pela interação da hop/STI1 com a

PrPC.

44

Figura 10. Interface da ligação PrPC:hop/STI. São apresentadas, em representações cartoon, (A) o domínio globular da proteína recombinante murina, PrP121-231; (B) o domínio TPR2a da hop/STI1. Os respectivos sítios de ligação são destacados em vermelho (no caso da PrP, esta representação é parcial, já que o modelo do domínio globular é truncado no resíduo 121, enquanto a interface de ligação foi mapeada em PrP113-128).

Foi demonstrado que a hop/STI1 recombinante liga a PrPC na superfície celular de

neurônios hipocampais em cultura, ativando a via cAMP/PKA e protegendo contra morte

celular induzida por estaurosporina (LOPES et al., 2005). Trabalhando com culturas de

linhagens de células hipocampais, um estudo relatou que o peptídeo hop/STI1230-245 é capaz

de modular a atividade SOD da PrPC e, desta forma, aumentar a sobrevivência dos neurônios

(SAKUDO et al., 2005). Quando explantes PrP+/+ de retinas de ratos em desenvolvimento são

tratados com hop/STI1 recombinante, a morte celular induzida por axotomia de células da

camada neuroblástica é bloqueada, um efeito não observado em animais PrP-/- (ARRUDA-

CARVALHO et al., 2007). Finalmente, o tratamento com hop/STI1 recombinante também

bloqueia a morte celular de astrócitos selvagens, mas não dos nulos para PrP, novamente

através da via PKA (ARANTES et al., 2009).

Além desses efeitos protetores, a interação PrPC:hop/STI1 ativa outros mecanismos

relevantes para a fisiologia celular. No trabalho de Lopes e colaboradores, foi observado

também um efeito neuritogênico para esta interação quando se tratou culturas de neurônios

hipocampais com hop/STI1 recombinante. O efeito, que estava ausente em neurônios nulos

45

para PrPC, foi abolido pelo co-tratamento com anticorpos tanto para a PrPC como a hop/STI1

e mostrou-se dependente da presença do segmento hop/STI1230-245 na proteína recombinante.

Um dado interessante levantado por esse trabalho é que este efeito neuritogênico é

dependente da ativação da via das ERK. Consequentemente, este estudo demonstrou como a

interação da PrPC com a hop/STI1 ativa paralelamente as vias de cAMP/PKA e ERK, com

efeitos positivos sobre a neuroproteção e neuritogênese, respectivamente (LOPES et al.,

2005). O papel central da interação PrPC:hop/STI1 na diferenciação de astrócitos em cultura

também foi evidenciado (ARANTES et al., 2009).

Recentemente, um estudo avaliou a relevância da atividade endocítica para a

sinalização induzida pela interação PrPC:hop/STI1 e concluiu que ela é parcialmente

modulada pela endocitose (AMERICO et al., 2007; CAETANO et al., 2008). A interação das

duas proteínas na superfície celular induz a endocitose da PrPC, de maneira dependente de

dinamina. Ainda mais, a estimulação por parte da hop/STI1 de um mutante de PrPC

desprovido de atividade endocítica não ativou a via ERK, mas sim a PKA, indicando um

papel crucial da endocitose para a primeira via de sinalização (CAETANO et al., 2008).

Também foi sugerido que a interação da PrPC com a hop/STI1 tenha um papel na

regulação da proliferação celular. O estímulo com hop/STI1 recombinante aumentou

significativamente a proliferação de células de glioblastoma da linhagem A172 mas,

interessantemente, não teve efeito em células normais de glia. O efeito observado foi

modulado pelas vias da ERK e da PI3K, e foi anulado pelo co-tratamento com anticorpos para

PrPC (ERLICH et al., 2007).

Outra evidência sugere uma importante função para esta interação no processamento

de memórias em ratos. Coitinho e colaboradores usaram um paradigma de aprendizado

motivado por estímulos aversivos, e demonstraram que a perturbação da ligação da PrPC à

hop/STI1 no hipocampo prejudica a formação de memórias de curto prazo e a consolidação

46

de memórias de longo prazo. Por outro lado, a infusão intrahipocampal do peptídeo

hop/STI1230-245 favoreceu potentemente a performance mnemônica (COITINHO et al., 2007).

Finalmente, é interessante notar que camundongos transgênicos que expressam os

mutantes truncados PrP∆105-125 ou PrP∆94-134, ambas mutações que afetam a integridade da

interface de ligação da PrP para a interação com hop/STI1, apresentam neurodegeneração,

gliose, degeneração da mielina, atrofia e disfunções motoras, que culminam na morte dos

animais durante o primeiro mês de vida pós-natal (BAUMANN et al., 2007; LI et al., 2007).

É notável ainda que os animais não apresentaram agregados das PrP mutantes.

47

1.4 RACIONAL

As controvérsias acerca das funções fisiológicas da proteína príon persistem até hoje.

Entretanto, uma revisão compreensiva dos estudos funcionais da PrPC sugere que ela funciona

como uma plataforma dinâmica de montagem de complexos multiprotéicos de sinalização na

superfície celular (LINDEN et al., 2008). Uma das interações mantidas pela PrPC envolve a

hop/STI1. Como vimos, esta interação promove sinalização com efeitos positivos sobre a

proteção contra morte celular programada, a neuritogênese e a proliferação celular, através da

modulação das vias cAMP/PKA, ERK e PI3K, respectivamente. Desta forma, surge um

panorama no qual esta interação participa ativamente de importantes e múltiplos aspectos da

vida celular.

Porém, o(s) mecanismo(s) moleculares subjacentes a estes processos não estão

estabelecidos, sendo que diversas questões ainda devem ser esclarecidas. Entre elas, destaca-

se a incerteza de como este complexo, ligado à membrana celular e sem componentes

transmembrana, consegue promover transdução de sinais para o interior da célula. A

compreensão do papel sinalizador da PrPC exige novas estratégias de estudo, além da

identificação de respostas celulares.

O presente trabalho consiste de uma tentativa de ampliar esta compreensão, do ponto

de vista estrutural. A hipótese fundamental de trabalho é que a interação de hop/STI1 e PrPC

pode produzir alterações estruturais nestas proteínas que, por sua vez, sejam potencialmente

importantes para o recrutamento de outros parceiros moleculares capazes de transduzir sinais

para o ambiente intracelular.

48

2. OBJETIVOS

2.1 GERAL

• Usando proteínas recombinantes PrP e hop/STI1, analisar in vitro possíveis mudanças

conformacionais das proteínas, ativadas pela formação do complexo PrP:hop/STI1.

2.2 ESPECÍFICOS

• Confirmar a ligação das proteínas recombinantes pela técnica de anisotropia de

fluorescência.

• Realizar medidas de dicroísmo circular que nos permitam observar possíveis

alterações da estrutura secundária das proteínas.

• Analisar processos de enovelamento/desenovelamento modulados pela interação.

• Monitorar o ambiente químico dos resíduos aromáticos por técnicas de fluorescência

intrínseca, visando estudar o efeito da interação sobre a estrutura local das proteínas

• Obter informação sobre alterações das estruturas terciárias e quaternárias das

proteínas, através da realização de medidas de espalhamento de raios-X a baixo

ângulo.

49

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 REAGENTES

Todos os reagentes utilizados foram de grau analítico. A água destilada foi filtrada e

deionizada por sistema de troca iônica para obtenção de elevado grau de pureza, satisfazendo

as exigências de água tipo I.

3.2 PURIFICAÇÃO DE PrP23-231 RECOMBINANTE

A purificação da proteína príon recombinante segue, em linhas gerias, o protocolo

sugerido por Zahn e colaboradores (ZAHN et al., 1997). Descreveremos brevemente o

procedimento.

O Dr. Ralph Zahn (Institut für Molekularbiologie und Biophysik, Eidgenossiche

Technische Hochschule, Suiza) nos cedeu, gentilmente, plasmídeos pRSET-A contendo a

sequência PrP23-231 murina, flanqueada no N-terminal por uma cauda de histidina adjacente a

um sítio de clivagem por trombina. Estes plasmídeos foram inseridos em E. coli (cepa BL21-

DE3) por eletroporação. Uma colônia isolada foi inoculada em 25 mL de meio Luria’s Broth

(LB) (Invitrogen) contendo 100 µg/ml de ampicilina. Este processo permite a seleção das

células corretamente transformadas, já que o plasmídeo confere resistência à ampicilina. O

inóculo cresceu a 37 ºC por aproximadamente 16 horas sob agitação orbital de 200 rpm.

Foram inoculados 4 ml da suspensão de bactérias em 800 ml de meio LB contendo 100 µg/ml

de ampicilina, sendo mantida a 37 ºC sob agitação orbital a 200 rpm, até que a cultura

50

atingisse a fase exponencial de crescimento (absorbância de 0.6 a 600 nm).

Neste ponto do crescimento, foi adicionado 1 mM de IPTG (β-D-tiogalactopiranosídeo

de isopropila) (Bioagency Biotecnologia), com o objetivo de induzir a expressão da proteína

PrP recombinante, uma vez que o promotor inserido no plasmídeo é controlado pela lactose.

Após deixar a cultura crescer a 37oC por 8 horas sob agitação orbital a 200 rpm, as bactérias

foram sedimentadas por meio de centrifugação a 6000 rpm a 4 ºC, por um período de 10

minutos (centrifuga HITACHI SCR 20B, rotor RPR-20.2). O sobrenadante foi descartado, e o

pellet resultante foi congelado em nitrogênio líquido e descongelado lentamente à temperatura

ambiente, começando assim o processo de lise.

O pellet foi ressuspendido em 70 ml de tampão G (cloreto de guanidina 6 M, fosfato

de sódio dibásico 100 mM, Tris-HCl 10 mM, glutationa reduzida 10 mM, pH 8.0), facilitando

a lise celular e permitindo desfazer corpos de inclusão, forma majoritária na qual a PrP

recombinante é encontrada quando superexpressa. Completamos a lise das bactérias

ressuspendidas com o auxílio de uma prensa de French (ThermoSpectronic): foram realizados

3 ciclos de lisado sob alta pressão (16.000 psi), mantendo a solução de bactérias em um

isopor com gelo para evitar o aquecimento excessivo.

A fim de separar as proteínas em solução dos fragmentos celulares, o lisado foi

centrifugado a 13000 rpm e 4 ºC, por um período de 30 minutos. O pellet foi descartado e o

sobrenadante foi incubado em um erlenmeyer com resina NTA agarose (Amersham

Bioscience) carregada com níquel e previamente equilibrada com tampão G, a temperatura

ambiente, por 30 minutos. Para eliminar as proteínas que não aderiram à resina, esta foi

centrifugada a 3000 rpm, por 3 minutos, e o sobrenadante foi descartado. Por duas vezes,

ressuspendemos a resina em tampão G e repetimos a centrifugação. Após descartar o

sobrenadante, a resina foi carregada em uma coluna C-10/40 (Pharmacia Biotech) e lavada

com 30 ml de tampão G. Como este tampão é altamente desnaturante, para permitir o re-

51

envolemento da PrP recombinante ligada à resina, lavamos esta última com um gradiente

linear lento (uma hora e meia de duração, aproximadamente) de 80 ml de tampão G e 80 ml

de tampão B (Tris-HCl 10 mM, fosfato de sódio dibásico 100 mM, pH 8.0). Após a

finalização do gradiente, a coluna foi lavada com 30 ml de tampão B e, em seguida, com 60

ml de tampão I (Tris-HCl 10 mM, fosfato de sódio dibásico 100 mM, imidazol 50 mM, pH

8.0), que permite eluir da coluna ligações inespecíficas. Para eluir a PrP aderida à resina, a

coluna foi lavada com 60 ml de tampão E (Tris-HCl 10 mM, fosfato de sódio dibásico 100

mM, imidazol 500 mM, pH 5.8) e o material eluído foi coletado em alíquotas de 1.5 ml cada.

Descartamos as alíquotas com valores de absorbância a 280 nm menores que 0.1. Para livrar-

nos do imidazol em excesso do tampão E, as alíquotas restantes foram dialisadas contra 5

litros de tampão fosfato de sódio 10 mM pH 6.4, durante um período de 16 h, a 4oC.

A PrP purificada e dialisada foi submetida a clivagem por α-trombina humana

(gentilmente cedida pelo Prof. Luis Mauricio Trambaioli da Rocha e Lima, Faculdade de

Farmácia, UFRJ) para a remoção da cauda N-terminal de histidina. Primeiramente, foi

realizado um teste de clivagem com uma pequena quantidade da PrP, em uma proporção

molar PrP:α-trombina de 1000:1 em tampão C (Tris-HCl 5 mM, pH 8.5), coletando-se

amostras do teste a cada hora, durante um intervalo de 4 horas. Estas amostras foram

submetidas à eletroforese em géis 15% de poliacrilamida-dodecil sulfato de sódio (SDS-

PAGE), de forma de escolher o menor tempo no qual a proteína teve sua cauda clivada. A

clivagem da amostra total foi realizada em tampão C, durante o tempo sugerido pelo teste de

clivagem. Para separar a PrP da α-trombina, a amostra resultante da clivagem foi passada por

uma coluna de troca iônica de carboxi-metil celulose (SIGMA). A coluna foi eluida com um

gradiente linear de 80 ml de tampão C e tampão C contendo 500 mM de NaCl, durante uma

hora e meia, coletando o material eluído em alíquotas de 3 ml. As alíquotas foram dosadas por

absorbância a 280 nm e dialisadas contra 5 litros de água, por um período de 16 h.

52

Para confirmar a integridade e o correto enovelamento da proteína, foram realizados

ensaios de SDS-PAGE e dicroísmo circular. As amostras foram aliquotadas e guardadas a -20

oC.

3.3 PURIFICAÇÃO DE PrP95-231W98F RECOMBINANTE

O protocolo de purificação foi idêntico ao da PrP23-231, mas em vez da seqüência PrP23-

231 murina, o plasmídeo usado para a transformação continha a seqüência PrP95-231 murina,

com o triptofano 98 mutado por uma fenilalanina. Este plasmídeo foi construído pra este

trabalho pela Dra. Marilene H. Lopes, do Instituto Ludwig de São Paulo. Outra diferença foi

no momento de eluição da proteína ligada à resina de NTA agarose: dado que, em comparação

com PrP23-231, PrP95-231W98F apresenta uma menor afinidade pela resina, não foi usado tampão

I mas foi realizado um gradiente linear lento de tampão B e tampão E, e foram coletadas

amostras de 3 ml que foram posteriormente dosadas.

3.4 PURIFICAÇÃO DE HOP/STI1 RECOMBINANTE

Plasmídeos pTrcHis2 contendo a seqüência hop/STI11-543 murina, flanqueada no N-

terminal por uma cauda de histidina adjacente a um sítio de clivagem por trombina

(gentilmente cedidos pela da Dra. Vilma Martins do Instituto Ludwig de São Paulo) foram

inseridos em E. coli (cepa DH5α) por eletroporação.

Uma colônia isolada foi inoculada em 25 mL de meio LB contendo 50 µg/ml de

ampicilina. Este processo permite a seleção das células corretamente transformadas, já que o

53

plasmídeo confere resistência a ampicilina. O inóculo cresceu a 37 ºC por aproximadamente

16 horas sob agitação orbital de 200 rpm. Posteriormente, ele foi diluído 25 vezes em 1 litro

de LB contendo 50 µg/ml de ampicilina e a suspensão de bactérias foi mantida sob agitação

orbital a 37 ºC, até que a cultura atingisse a fase exponencial de crescimento (absorbância de

0.6 a 600 nm).

Neste ponto do crescimento, foi adicionado 1 mM de IPTG com o objetivo de induzir

a expressão da proteína hop/STI1 recombinante, uma vez que o promotor inserido no

plasmídeo é controlado pela lactose. Após 4 horas na presença de IPTG, as bactérias foram

sedimentadas por meio de centrifugação a 4000 x g, por 10 minutos, a 4 ºC. O sobrenadante

foi descartado, e o pellet foi ressuspendido em tampão de lise: 50 mM de tampão fosfato pH

8.0, 300 mM de cloreto de sódio, 10 mM de imidazol (SIGMA), 1mM de fluoreto de fenil

metil sulfonila - PMSF (SIGMA), 2 µg/ml de leupeptina, 2 µg/ml de aprotinina, 2 µg/ml de

pepstatina, 100 mM de ácido etilenodiaminotetracético – EDTA, e 1 mM de ditiotreitol –

DTT. As bactérias ressuspendidas foram lisadas sob alta pressão (16.000 psi), com o auxílio

da prensa de French.

A fim de separar as proteínas em solução dos fragmentos celulares, o lisado foi

centrifugado por 15 minutos a 14000 rpm, a 4 ºC. O pellet foi descartado e o sobrenadante foi

incubado com resina NTA agarose carregada com níquel e previamente equilibrada com

tampão de lise, sob agitação suave a 4 ºC, por aproximadamente 16 horas. Para que as

proteínas que não aderiram à resina fossem eliminadas, a resina foi centrifugada a 3500 rpm

por 3 minutos, a 4 ºC. O sobrenadante foi recolhido e a resina foi lavada duas vezes com

tampão de lise, e mais duas vezes com tampão de lavagem (50mM de tampão fosfato pH 8.0,

300 mM de cloreto de sódio e 50 mM de imidazol). A seguir, a resina foi transferida para uma

coluna e as proteínas ligadas à resina foram eluidas com tampão de eluição (50 mM de

tampão fosfato pH 8.0, 300 mM de cloreto de sódio, 500 mM de imidazol). O material foi

54

coletado em 20 frações de 1 ml cada. As frações contendo His6-hop/STI1 (identificadas

através da detecção da proteína pelo método de Bradford) foram dosadas e então dialisadas

contra TBS (20mM Tris-HCl, 150mM NaCl, pH 7.5). Dada a instabilidade da hop/STI1, as

amostras não tiveram a cauda de histidina clivada.

A integridade e o correto enovelamento da hop/STI1 foram corroboradas por ensaios

de SDS-PAGE e dicroísmo circular. Foi possível observar no gel uma fração minoritária de

degradação, representada por múltiplas bandas de menor peso molecular. Todas as amostras

foram guardadas a -70 oC.

3.5 PEPTÍDEOS SINTÉTICOS

Os peptídeos PrP113-132 (113-GAAAAGAVVGGLGGYMLGSA-132) e hop/STI1230-245

(230-ELGNDAYKKKDFDKAL-245) foram sintetizados quimicamente por Neosystem

(NeoMPS, Estrasburgo, França). Eles foram diluídos em água e guardados a -20o C.

3.6 MARCAÇÃO COM FITC DE PrP23-231 RECOMBINANTE

PrP23-231 na concentração 0.2 mM foi marcada por incubação com 1 mM de

isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Sigma) em tampão fosfato de sódio 10 mM, 150 mM

NaCl, pH 7.8, a temperatura ambiente, por 30 minutos. Após bloquear a reação com Tris 20

mM, FITC livre foi separado de PrP-FITC usando uma coluna Hitrap desalting (GE

Healthscience) equilibrada com o tampão usado durante a marcação. A marcação da PrP foi

confirmada por espectrofotometria de absorbância, de forma de observar as contribuições de

55

PrP e FITC para o espectro de absorbância. A eficiência de marcação foi calculada em ~0.26

mol de FITC-PrP por mol de PrP total. A baixa eficiência de marcação, provavelmente devida

ao pH usado durante a reação, é vantajosa porque diminui a chance de marcação múltipla de

moléculas de PrP, o que poderia resultar na transferência de energia entre fluoróforos ligados

a mesma proteína.

3.7 ELETROFORESE EM GÉIS EM CONDIÇÕES DESNATURANTES E NATIVAS

As amostras de proteína foram submetidas a eletroforese em géis de poliacrilamida

(PAGE), em densidades de 8% e 12.5%, dependendo da massa molecular das amostras

analisadas. Quando comparamos amostras em condições desnaturantes e nativas, não

inserimos dodecil sulfato de sódio (SDS) no gel de poliacrilamida nem no tampão de corrida,

e as amostras não foram fervidas. As amostras em condições nativas foram suspendidas em

tampões de amostra que não possuíam agentes desnaturantes. Já no caso de amostras em

condições desnaturantes, elas foram suspendidas em tampões de amostra contendo 1% β-

mercaptoetanol e 0.5% SDS.

3.8 ANISOTROPIA DE FLUORESCÊNCIA

As medidas foram realizadas em tampão Tris 50 mM, NaCl 100 mM, pH 7.4, a

temperatura ambiente. Foi utilizada uma concentração total fixa de PrP de 2 µM, sendo que

50 nM da proteína era FITC-PrP. Foram adicionadas quantidades crescentes de hop/STI1 e a

anisotropia de fluorescência foi medida em um fluorímetro Jasco FP-6300 (Jasco

56

Corporation), usando um comprimento de onda de excitação de 480 nm e observando a

emissão a 90o usando um filtro WG 3-69. Os polarizadores utilizados são do tipo Gland-

Thompson. Os valores de anisotropia de fluorescência foram calculados conforme a equação:

perpar

perpar

II

IIaAnisotropi

⋅+

−=

2 (1)

sendo Ipar e Iper as intensidades de emissão quando os polarizadores de detecção estão

orientados paralela e perpendicularmente à direção do polarizador de excitação,

respectivamente.

Para o cálculo da constante de dissociação Kd da ligação PrP:hop/STI1 recombinantes,

foi assumido um modelo para o equilíbrio de ligação entre monômeros de PrP e hop/STI1:

P + S ↔ PS (2)

onde P e S representam moléculas de PrP e hop/STI1 monoméricas, respectivamente,

e PS representa a uma molécula do complexo PrP:hop/STI1. Desta forma, a constante de

dissociação Kd deste modelo no equilíbrio seria:

Kd =P[ ]⋅ S[ ]

PS[ ] (3)

onde agora [P], [S] e [PS] são as concentrações molares das moléculas. Sabemos que a

totalidade das proteínas estão em estado monomérico ou formando complexo:

PTot[ ]= P[ ]+ PS[ ] (4)

57

STot[ ]= S[ ]+ PS[ ] (5)

onde [PTot] e [STot] representam as concentrações molares totais de PrP e hop/STI1 em

solução. Também sabemos que a concentração molar do complexo é igual a fração ligada de

PrP:

PS[ ]n

= PTot[ ]⋅ fn (6)

onde fn representa a fração ligada da totalidade de PrP, na condição n de concentração

de hop/STI1. Finalmente, podemos expressar a fração ligada da totalidade de PrP como:

fn =An − Ai

A f − Ai

(7)

onde Ai, Af e An representam a anisotropia de fluorescência da FITC-PrP na condição

inicial (na ausência de hop/STI1), final (no caso [hop/STI1] >> [PrP], ou seja na condição de

saturação da curva) e na condição n de concentração de hop/STI1.

Desta forma, usando as equações 4, 5, 6 e 7 na equação 3, obtemos:

An = Ai + A f − Ai( )⋅PTot + STot + Kd − PTot + STot + Kd( )

2− 4 ⋅ PTot ⋅ STot

2 ⋅ PTot

(8)

Por meio da equação 8 podemos ajustar uma curva teórica aos dados experimatis de

anisotropia de fluorescência, em função dos parâmetros Ai, Af e Kd, e obter a constante de

dissociação Kd.

58

Uma descrição detalhada desta metodologia pode ser encontrada em Principles of

fluorescence spectroscopy (LAKOWIKZ, 1999).

3.9 ESPECTROSCOPIA DE DICROISMO CIRCULAR

O espectro de dicroísmo circular (CD) foi obtido para luz ultravioleta longe do visível

(entre 190 e 260 nm), com um espectropolarímetro Jasco J-715 (Jasco Corporation). Todas as

medidas foram realizadas a 20 oC, em tampão Tris 50 mM, NaCl 100 mM, pH 7.4, utilizando

uma cubeta de quartzo com caminho óptico de 0.2 mm. Os espectros são o resultado da média

de quatro medidas consecutivas, obtidas a uma velocidade de varredura de 50 nm/min.

Realizamos medidas espectroscópicas das amostras em concentrações de 35 µM para

proteínas livres e complexos, e de 500 mM para peptídeos livres. Entre medidas, a cubeta foi

lavada com abundante água e detergente Hellmanex, secada com jatos de nitrogênio, e sempre

foi obtido um espectro da cubeta vazia para corroborar a limpeza desta. Em todos os casos, o

espectro do tampão foi subtraídos do espectro das amostras.

Todos os dados são apresentados em função da elipticidade molar por resíduo [θ],

onde:

θ[ ]=θ

l ⋅ C ⋅ N (9)

sendo θ a elipticidade da amostra (dado bruto obtido no espectrômetro), ℓ o caminho ótico, C

a concentração molar da amostra e N o número de ligações peptídicas na cadeia polipeptídica

da molécula analisada. A unidade desta magnitude é deg x dmol-1 x cm2, onde deg representa

59

graus de elipticidade (ellipticity degrees), a unidade do dado bruto. Quando a amostra contém

múltiplas espécies moleculares, a elipticidade molar por resíduo fica:

θ[ ]=θ

l ⋅ Ci ⋅ N ii

∑ (10)

onde Ci representa a concentração molar da espécie molecular i, e Ni o número de ligações

peptídicas na cadeia polipeptídica de uma molécula da espécie molecular i.

Uma descrição detalhada desta metodologia pode ser encontrada em Circular Dichroism:

Principles and Applications (BEROVA et al., 2000).

3.10 ESPECTROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA

Os espectros de emissão de fluorescência foram medidos em um espectrofluorímetro

ISS-PC1 (ISS), com os braços de excitação e emissão em “L”, usando cubetas de quartzo de 1

cm de caminho ótico e um volume final de 400 µl. A velocidade de varredura utilizada foi

sempre de 1 nm por segundo e as medidas foram realizadas a 20 oC. As amostras foram

diluídas em tampão Tris 50 mM, NaCl 100 mM, pH 7.4. Em todos os casos, o espectro do

tampão foi subtraído dos espectros das amostras.

Durante as medidas de fluorescência do corante bis-ANS (Invitrogen), as amostras

foram excitadas a 360 nm e os espectros de emissão foram coletados de 400 nm a 600 nm.

Para analisar a alteração conformacional de uma determinada proteína, induzida pelo peptídeo

ligante, sempre partimos de uma amostra bis-ANS:proteína na concentração 4:2 µM e

titulamos o peptídeo ligante.

60

Para as medidas de fluorescência intrínseca de proteínas no estado estacionário,

usamos amostras com concentrações na faixa 2 - 3 µM. Quando possível, realizamos

titulações até observar saturação das alterações espectrais. As amostras de proteínas selvagens

foram excitadas em 280 nm, visando observar alterações globais (não seletivas) do espectro

das proteína; já no caso da PrP95-231W98F, ela foi excitada em 295 nm para obter uma excitação

seletiva do Trp144. A largura de banda da excitação foi sempre de 8 nm. As faixas de

comprimento de onda de emissão dos espectros foram ajustadas de forma de minimizar a

contribuição espectral do espalhamento de luz, usualmente presente em comprimentos de

onda próximos ao comprimento de onda de excitação.

Como controle, sempre monitoramos a possível agregação protéica através da medida

do espalhamento de luz elástico (espalhamento de Rayleigh), excitando e medindo a emissão

a 320 nm.

Uma descrição detalhada desta metodologia pode ser encontrada em Principles of

fluorescence spectroscopy (LAKOWIKZ, 1999).

3.11 ESPALHAMENTO DE RAIOS-X A BAIXO ÂNGULO

As medidas de espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS) foram realizadas no

Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (LNLS) em Campinas, São Paulo. A linha utilizada

foi a D11A-SAXS1. As amostras, em solução, foram preparadas no dia anterior à medição,

guardadas e transportadas em gelo até o LNLS. O tampão usado foi Tris 50 mM, NaCl 100

mM, pH 7.4 As medidas foram realizadas a 20 oC. As amostras foram irradiadas com um

feixe monocromático com comprimento de onda de λ=1.488 Å, e os perfis de espalhamento

foram medidos com um detector bi-dimensional MARCCD sensível à posição. Para cobrir

61

uma larga faixa de ângulos de emissão, duas distâncias amostra-detector foram usadas: 603.8

mm e 1406.8 mm. Obtivemos a media circular do perfil através do programa FIT2D

(HAMMERSLEY et al., 1996) e as curvas de espalhamento resultantes foram

individualmente normalizadas pela intensidade do feixe incidente e a absorção da amostra.

Após unir as curvas obtidas com as duas distâncias amostra-detector usando o programa

PRIMUS (KONAREV et al., 2003), o vetor de espalhamento q = (4π/λ) sin(θ), onde 2θ é o

ângulo de espalhamento, cobriu a faixa 0.012 Å-1 to 0.3 Å-1. Devido à possível degradação

das amostras induzida pela exposição aos raios-X, escolhemos dividir o período de irradiação

em 3 intervalos consecutivos de 400 segundos. Após subtrair o espalhamento do tampão do

espalhamento das amostras, cada perfil de espalhamento foi inspecionando individualmente

visando controlar por degradações durante o período de irradiação. Também subtraímos

espalhamento de fundo (background) não específico, de forma de que os perfis de

espalhamento obedeçam à lei de Porod, estabelecendo I(q) α q-4, para q grandes (GLATTER

& KRATKY, 1982). Medimos os perfis de espalhamento em duas concentrações distintas

para checar se os perfis apresentavam dependência da concentração: a amostra de hop/STI1

livre foi medida a 4.5 mg/ml e 2.5 mg/ml, e a amostra PrP:hop/STI1 foi medida na proporção

molar 1:1 nas concentrações totais de 4 mg/ml e 2.3 mg/ml.

A aproximação de Guinier é uma expressão matemática para a intensidade de

espalhamento, válida somente para q pequenos (ângulos pequenos) :

ln(I(q )) ≅ −Rg

2

3⋅ q2 + ln(I(0)) (11)

onde Rg é o raio de giro molecular:

62

Rg =mi ⋅ (

r r i −

r r CM )2

i∑

mii

∑ (12)

sendo mi a massa do átomo i da molécula, posicionada em r r i , e

r r CM é a posição do

centro de massa. Formalmente, esta aproximação é válida quando q < Rg-1. Desta forma, a

análise de Guinier consiste em aplicar a equação 11 para a realização de um ajuste linear aos

dados experimentais expressados como ln(I(q)) vs. q2, para q < Rg

-1. Por meio deste ajuste

obtivemos o valor de Rg das moléculas analisadas. Ainda mais, se a amostra é polidispersa (se

contém diversas espécies oligoméricas), observaríamos um desvio da linearidade destes

gráficos, pelo que esta análise demonstrou que as amostras analisadas eram monodispersas.

Além de extrapolar o valor de espalhamento direto, I(0), das amostras, o ajuste teórico

aos dados experimentais de espalhamento realizado com o programa GNOM (SVERGUN et

al., 1992) indicou diversos parâmetros estruturais das moléculas analisadas: a distribuição de

distâncias intramoleculares p(r), o Rg (obtido através de cálculos independentes da análise de

Guinier, pelo que serve como validação), e o diâmetro máximo molecular Dmax das amostras.

Como controle, através dos valores I(0) obtidos, foram feitas estimativas do peso molecular

das amostras, usando amostras de lisozima de ovo de galinha (Sigma) como padrão.

Para abordar o cálculo de modelos de baixa resolução, discutiremos brevemente o

princípio básico pelo qual é possível obter modelos a partir da análise dados de espalhamento.

A intensidade espalhada pelas partículas em solução, I(q), é máxima para q=0, e diminui com

uma taxa que depende do tamanho e forma destas. Se consideramos a amostra como um

sistema bifásico de partícula e solvente, a densidade eletrônica da molécula analisada ρ(r) está

relacionada com I(q) de acordo com:

I(q ) = n ⋅ (ρ(r ) − ρs) ⋅ e− i⋅q ⋅r

d3r

V∫ (13)

63

onde n é o número de partículas por unidade de volume, ρs é a densidade eletrônica do

solvente e r é um vetor que denota a posição de uma porção da molécula, relativa ao centro de

massa desta. Consequentemente, medindo a intensidade de espalhamento, podemos obter

informação da ρ(r), ou seja, da densidade eletrônica de cada ponto r dentro da molécula. Se

fazemos uma aproximação desta expressão para q pequenos, vamos recobrar a expressão de

Guinier, apresentada na equação 11, e iremos obter informação sobre a forma global da

molécula, através do parâmetro Rg. Não obstante, por meio de cálculos computacionais,

implementados nos programas que criam modelos de baixa resolução da molécula analisada,

também podemos extrair informação da I(q) medida para toda a faixa de q. Os programas vão

estimar uma densidade ρ(r) que apresente um espalhamento teórico que se ajuste aos dados

experimentais. De fato, ρ(r) é a grandeza que representamos quando criamos um modelo de

baixa resolução da molécula. Porém, como não existe uma relação unívoca entre ρ(r) e I(q),

modelos com distinta densidade eletrônica podem apresentar o mesmo espalhamento. Então,

quando usamos programas para calcular modelos das moléculas devemos obter o volume

consenso ocupado pelos modelos obtidos (VOLKOV et al., 2003), gerando um modelo

volumétrico final que representa o espaço ocupado pela molécula analisada.

Os modelos ab initio foram calculados através do programa GASBOR (SVERGUN et

al., 2001), que aplica algoritmos otimização baseados em técninas de simulated annealing

para encontrar distribuições espaciais de cadeias de resíduos dummy (resíduos representados

de forma simplificada por átomos de carbonos alfa) que apresentem um espalhamento teórico

que se ajuste aos dados experimentais de espalhamento. Os modelos obtidos foram

consistentes entre si, e os modelos volumétricos finais apresentados no trabalho foram obtidos

pelo programa DAMAVER (VOLKOV et al., 2003) que calculou o volume consenso de 10

modelos de cada molécula analisada.

Outra abordagem para à análise de I(q), consiste na produção de modelos do tipo rigid

64

body modeling, calculados com o programa BUNCH (PETOUKHOV et al., 2005). Este

programa implementa novamente simulated annealing, mas desta vez para encontrar a

posição e orientação ótima de modelos de alta resolução de domínios protéicos e cadeias

flexíveis que os unem, representadas por cadeias de resíduos dummy ligadas aos resíduos

terminais dos domínios. Este programa mostrou-se muito mais exigente para o ajuste aos

dados, sendo que para alcançar ajustes satisfatórios, tivemos que explorar o espaço de

parâmetros de penalidades do algoritmo de simulated annealing. Este algoritmo realiza uma

otimização do modelo calculado ao minimizar uma função de energia que considera tanto o

erro do ajuste aos dados experimentais quanto penalidades de características estruturais

indesejáveis do modelo obtido, tais como conflitos (clashes) entre domínios, extensão

excessiva das cadeias flexíveis, etc. Como foi sugerido pelos autores do programa

(PETOUKHOV et al., 2005), para realizar o ajuste aos dados e ao mesmo tempo obter

modelos satisfatórios, tivemos que calibrar os valores dos parâmetros que pesam estas

penalidades de forma tal que a contribuição das penalidades estruturais sejam 10-30% do

valor total da função energia. Os modelos que calculamos neste trabalho usam os modelos de

alta resolução dos domínios TPR1, TPR2A e PrP121-231 (códigos PDB 1elw, 1elr e 1ag2,

respectivamente), junto com modelos de homologia dos domínios TPR2B, DP1 e DP2,

calculados pelo servidor LOMETS (WU et al., 2007). Como BUNCH manipula unicamente

uma cadeia de polipeptídeos por corrida, o complexo PrP:hop/STI1 foi representado como

uma única cadeia, ao ligar o resíduo N-terminal da PrP ao resíduo C-terminal da hop/STI1

(para preservar a clareza de exposição, os primeiros 4 resíduos do N-terminal da PrP não

foram representados nas figuras). Este procedimento não pareceu introduzir uma imposição

sensível à modelagem, devido ao comprimento de 98 resíduos da cauda flexível N-terminal da

PrP. Ainda mais, durante a modelagem, foi imposto uma condição de contato (10 Å de

separação máxima) para as interfaces de ligação da PrP e da hop/STI1. Em nenhum caso

65

foram impostas condições de simetria para as partículas modeladas.

Para mais detalhes desta técnica, referir-se a Small angle X-ray Scattering (GLATTER

& KRATKY, 1982).

66

4 RESULTADOS

Ao longo deste trabalho as amostras foram analisadas em solução de tampão Tris-HCl

50 mM, contendo 100 mM de NaCl e o pH ajustado em 7.4.

4.1 AVALIAÇÃO DA INTERAÇÃO PrP:HOP/STI1

Após a purificação das proteínas recombinantes PrP23-231 (daqui em diante citada como

PrP) e hop/STI1, nosso primeiro passo foi confirmar a interação entre essas proteínas. Para

este fim a técnica escolhida foi a de anisotropia de fluorescência, que permite monitorar a

formação do complexo e, ao mesmo tempo, estimar a constante de dissociação (Kd) e a

estequiometria do complexo.

Esta técnica envolve a marcação de proteínas de interesse com um fluoróforo repórter

e o monitoramento da polarização da fluorescência das proteínas marcadas em solução. Os

fluoróforos possuem vetores de absorção e emissão alinhados em direções específicas

relativas a suas estruturas moleculares. Estes dois vetores determinam o eixo preferencial da

polarização da luz absorvida e emitida, respectivamente. Desta forma, quando um fluoróforo

é excitado com luz plano-polarizada, sua emissão resultante também é plano-polarizada,

porém não necessariamente na mesma direção da excitação. Se a molécula fluorescente se

encontra em solução e, em consequência, em rotação difusiva livre, a luz emitida pode adotar

todas as direções de polarização possíveis, já que as moléculas (e seus respectivos vetores de

emissão) estarão orientados aleatoria e dinamicamente. Consequentemente, apesar de se

67

excitar a amostra com polarização anisotrópica (com luz polarizada numa determinada

orientação), um observador medindo a polarização da luz fluorescente total iria obter a média

de um enorme número de orientações dinâmicas, ou seja, uma luz com um baixo grau de

anisotropia. Porém, variações da anisotropia de fluorescência podem indicar a interação da

molécula marcada com um ligante de interesse. Dois fenômenos vão afetar o nível de

anisotropia de fluorescência do fluoróforo. O primeiro está relacionado ao tamanho efetivo da

molécula marcada, já que a anisotropia desta é tanto menor quanto mais rápida é a velocidade

de rotação da molécula, porque esta velocidade é diretamente proporcional à quantidade de

orientações que o fluoróforo adota durante o tempo de medida. Como resultado, o grau de

anisotropia da luz emitida pelo fluoróforo é inversamente proporcional a sua velocidade de

rotação e diretamente proporcional ao seu tamanho molecular, já que moléculas maiores

possuem rotações mais lentas. Este princípio pode ser utilizado para monitorar a formação de

complexos moleculares entre moléculas marcadas com um fluoróforo e ligantes potenciais,

porque, ao formar-se a ligação, o complexo resultante terá um tamanho molecular maior, uma

rotação mais lenta e uma emissão mais anisotrópica. O segundo fenômeno envolve a

mobilidade local do fluoróforo, em uma escala temporal muito menor ao efeito anterior. A

interação da molécula marcada com o ligante de interesse pode alterar a mobilidade local do

fluoróforo com consequências para a anisotropia de emissão deste, de forma análoga ao efeito

descrito acima. Dado que a fluoresceína tem um tempo de vida de poucos ns, seus níveis de

anisotropia de fluorescência devem ser capazes de evidenciar alterações da mobilidade local

deste fluoróforo. Consequentemente, ambos os fenômenos irão contribuir para o nível de

anisotropia de fluorescência da molécula marcada. De qualquer forma, se a titulação de um

ligante hipotético em uma amostra contendo uma quantidade fixa da molécula marcada com

fluoresceína é acompanhada por uma alteração saturável da anisotropia da luz emitida,

podemos afirmar que está acontecendo a ligação entre estas duas moléculas. Para maximizar

68

este efeito, ao analisar a interação de duas proteínas, podemos marcar com o fluoróforo a

proteína de menor tamanho, pois assim, ao formar-se o complexo, a redução de sua

velocidade de rotação será maior que no caso inverso. Consequentemente, neste caso, a

proteína escolhida para a marcação foi a PrP, já que seu peso molecular é aproximadamente

1/3 do da hop/STI1. O fluoróforo selecionado foi um derivado da fluoresceína, o isotiocianato

de fluoresceína (FITC).

As medidas foram realizadas com uma amostra 2 µM de PrP, sendo que 50 nM da

proteína estava marcada com FITC, e foram adicionadas quantidades crescentes de hop/STI1

(utilizamos uma quantidade alta de PrP de forma de podermos medir vários pontos da

titulação de hop/STI1 até o platô, mas não foi marcada a totalidade da PrP com FITC para que

os valores de intensidade de fluorescência da FITC se encontrassem na faixa de detecção do

fluorímetro, evitando a saturação da medida). Na Figura 11 apresentamos os dados obtidos a

partir destes ensaios. Se consideramos que a PrP e a FITC-PrP tem a mesma afinidade pela

hop/STI1, a curva de anisotropia serve para o monitoramento do grau de ligação da totalidade

(marcada e não marcada) da PrP presente na amostra. Em conseqüência, podemos ajustar a

estes dados experimentais a curva dada pela Equação 8, presente na seção Materiais e

Método. O ajuste calculado também é apresentado na Figura 11.

O valor de Kd obtido pelo ajuste foi de 161 ± 98 nM, e o coeficiente de correlação

linear r foi de 0,99. O valor alto do erro do Kd deve-se a ausência de medidas para

concentrações mais elevadas de hop/STI1. Entretanto, o valor calculado para Kd concorda

com o valor obtido por Zanata e colaboradores que, mediante o uso de um ensaio

experimental distinto, estimaram um Kd de 140 nM para a interação PrP:hop/STI1 (ZANATA

et al., 2002). Outra informação que pode ser deduzida deste ensaio refere-se à estequiometria

da interação. A curva alcança seu platô quando a concentração da hop/STI1 chega a um valor

aproximado de 2 µM, a mesma concentração total de PrP. Este comportamento nos indica

69

que, neste ponto, não existem mais moléculas de FITC-PrP disponíveis para a ligação da

hop/STI1, uma vez que a anisotropia de fluorescência da amostra chega ao seu valor máximo

possível. Consequentemente, considerando que a marcação com FITC não altera a interação

entre as proteínas, estes dados sugerem fortemente que a estequiometria da ligação

PrP:hop/STI1 é 1:1 em razão molar, um dado que, até o momento, não havia sido confirmado.

Figura 11. Formação do complexo PrP:hop/STI1 e cálculo de Kd. Uma amostra de PrP 2 µM, contendo 50 nM FITC-PrP, foi titulada com hop/STI1. São apresentados os dados experimentais da anisotropia de fluorescência (pontos pretos) e curva de ajuste teórico de acordo à equação 8 (linha vermelha). O valor de Kd obtido foi de 161 ± 98 nM. A amostra foi excitada a 480 nm e a emissão coletada através do filtro WG3-69.

Em resumo, confirmamos a ligação das proteínas purificadas dentro de uma faixa de

afinidade que concorda com dados experimentais presentes na literatura, e ainda

demonstramos que a estequiometria molar do complexo é de 1:1.

70

4.2 ANÁLISE DO EFEITO DA INTERAÇÃO PrP:HOP/STI1 SOBRE A ESTRUTURA

DAS PROTEÍNAS

A ligação da PrP com a hop/STI1 desencadeia a ativação de múltiplas vias de

sinalização intracelular. O mecanismo molecular pelo qual esse processo é disparado não está

estabelecido e diferentes hipóteses podem ser levantadas. Dado que nenhuma destas proteínas

possui um domínio transmembrana, uma possibilidade que ganha força neste cenário envolve

a participação de outros parceiros moleculares no meio extracelular ou na membrana

plasmática. Estas moléculas seriam capazes de interagir (ou deixar de interagir) com as

proteínas hop/STI1 e/ou PrP após a formação do complexo e, de alguma forma, auxiliar no

mecanismo de ativação das vias sinalizadoras, provavelmente envolvendo a ação de um

domínio transmembrana em algum destes ligantes putativos, seja diretamente na superfície da

membrana plasmática ou durante a endocitose do complexo PrP:hop/STI1. Em qualquer caso,

mudanças conformacionais da PrP e/ou da hop/STI1 durante a formação do complexo seriam

eventos altamente significativos para estes processos, já que estas alterações poderiam

modular a capacidade de ligação a outros parceiros pela estabilização/desestabilização de

possíveis sítios de ligação. Assim, torna-se importante analisar como mudanças

conformacionais da PrP e da hop/STI1 é afetado pela formação do complexo.

4.2.1 EFEITOS SOBRE A ESTRUTURA SECUNDÁRIA

A técnica que escolhemos para monitorar o efeito da interação PrP:hop/STI1 sobre a

71

estrutura secundária destas proteínas foi a de espectroscopia de dicroísmo circular (CD, pelo

nome em inglês, circular dichroism). A partir de pequenas quantidades de amostra em

solução, esta técnica fornece informação sobre o tipo e a extensão da estrutura secundária das

proteínas, conseguindo diferenciar entre α-hélices, fitas-β e estruturas intrinsecamente

desenoveladas, pelo que constitui uma técnica extremamente útil para análises de

enovelamento/desenovelamento protéico, assim como para monitorar transições entre

diferentes tipos de estruturas secundárias.

A técnica baseia-se na absorção diferencial de uma amostra quando excitada com luz

circularmente polarizada no sentido esquerdo ou direito. Em um ensaio de CD, as amostras

são excitadas com luz linermente polarizada, que possui quantidades iguais de luz polarizada

circularmente no sentido esquerdo e direito. Como estes dois tipos de luz possuem sentidos

opostos, se a molécula analisada é quiral (ou seja, se ela tem assimetria molecular de forma

que não é possível sobrepor a estrutura da molécula sobre sua imagem especular), ela irá

absorver diferencialmente os dois componentes da luz incidente. Proteínas comportam-se

desta maneira porque são quirais, já que a ligação peptídica é assimétrica. Esta absorção

diferencial depende do comprimento de onda da excitação. Usualmente excita-se as amostras

numa faixa definida de comprimentos de onda, obtendo-se assim um espectro de CD.

Para a análise da estrutura secundária de proteínas é utilizada uma faixa de excitação

na região do ultravioleta distante da faixa visível (no presente estudo utilizamos de 200 a 250

nm). As características de um espectro de CD dependem do tipo de estrutura secundária em

questão. As α-hélices apresentam dois mínimos no espectro, situados em 208 e 222 nm. Já as

fitas-β apresentam um único mínimo entre 210 e 220 nm. Finalmente, os polipeptídeos

intrinsecamente desestruturados também apresentam um único mínimo de alta amplitude,

situado em 198 nm, aproximadamente. A amplitude dos mínimos é diretamente proporcional

ao conteúdo da estrutura secundária correspondente. Desta forma, monitorando a posição e a

72

magnitude dos mínimos de um espectro, podemos inferir qualitativamente o estado de

enovelamento de uma proteína.

Nestes ensaios realizamos medidas espectroscópicas das amostras em concentrações

de 35 µM para proteínas livres e complexos, e de 500 mM para peptídeos livres. Para facilitar

as comparações, exceto quando explicitado, todos os espectros foram normalizados de forma

a obter a elipticidade molar por resíduo, [θ] de cada amostra, já que esta magnitude independe

da quantidade e do tamanho das moléculas analisadas (ver Materiais e Métodos).

Para avaliar possíveis alterações na estrutura secundária das proteínas ao formar-se o

complexo PrP:hop/STI1, medimos os espectros de CD das proteínas PrP e hop/STI1 livres

(Fig. 12) e incubadas em uma mesma amostra, na proporção molar 1:1 (Fig. 13). Como era

esperado, as proteínas livres apresentam espectros que evidenciam um alto grau de conteúdo

de α-hélices, sendo que a hop/STI1 mostrou-se mais rica nesta estrutura. Se a formação do

complexo PrP:hop/STI1 não envolvesse alterações nas estruturas secundárias das proteínas, o

espectro da amostra contendo as proteínas co-incubadas deveria ser idêntico à predição

realizada pela Equação 10 (pág. 56), presente em Materiais e Métodos. Como pode ser

observado na Figura 13, os espectros medidos e preditos são similares qualitativamente,

porém, existe uma pequena diferença de aproximadamente 5% da intensidade do sinal no

mínimo correspondente aos 208 nm, sendo menor a amplitude do espectro medido que a do

predito. Esta diferença foi altamente reprodutível tanto no sentido como na magnitude.

Esta observação sugere que a formação do complexo PrP:hop/STI1 é acompanhada

por uma perturbação da estrutura protéica, na forma de um desenovelamento parcial da

estrutura das α-hélices. Devemos destacar que esta alteração do espectro de CD, que a

princípio pode parecer muito reduzida quantitativamente, é potencialmente relevante no

contexto biológico do mecanismo sinalizador regulado por este complexo. Este mecanismo

pode envolver a perturbação estrutural local de poucos resíduos, de forma de alterar a

73

afinidade por terceiros ligantes que possam participar na tarefa de comunicar os sinais para o

compartimento intracelular. Consequentemente, investigamos em maior profundidade este

evento.

Figura 12. Comparação dos espectros de CD da PrP e da hop/STI1. Espectro medido da PrP livre (linha preta) e da hop/STI1 livre (linha vermelha), ambas nas concentrações de 35 µM.

Figura 13. Comparação da medição e a predição do espectro de CD do complexo PrP:hop/STI1. Espectro medido da amostra equimolar PrP:hop/STI1 (linha preta), e soma, de acordo à equação 10

74

apresentada em Materiais e Métodos, dos espectros medidos da PrP e hop/STI1 livres (linha vermelha). As medidas foram realizadas na concentração 35 µM.

A princípio, os dados apresentados sugerem uma perda da estrutura secundária em

forma de α-hélices, disparada pela interação. Porém, eles não indicam se uma ou ambas

proteínas estão sofrendo a perturbação estrutural. Se quiséssemos obter esta informação,

poderíamos, por exemplo, tentar subtrair do espectro da amostra PrP:hop/STI1 o espectro da

hop/STI1 livre, e comparar o espectro resultante da subtração com o espectro da PrP livre.

Não obstante, ao realizar a subtração do espectro da hop/STI1 livre, estamos pressupondo que

a estrutura secundária da hop/STI1 não foi alterada pela interação. Consequentemente,

ensaios com as proteínas inteiras não podem nos oferecer a informação desejada.

Para superar esta limitação, fizemos uso de peptídeos sintéticos que contêm os sítios

de ligação entre estas proteínas e realizamos medidas de CD para complexos

proteína:peptídeo. O racional de substituir uma proteína inteira pelo peptídeo correspondente

consiste em que o peptídeo “x”, que possui a seqüência do sitio da proteína “X” que liga a

proteína “Y”, poderia mimetizar a ação perturbadora da proteína “X” sobre a estrutura da

proteína “Y”. Se de fato isto acontece, a vantagem desta abordagem é que poderemos realizar

ensaios de CD que permitam determinar inequivocamente quais das proteínas sofrem

alterações das estruturas secundárias ao interagir. Como veremos adiante, esta abordagem foi

possível porque os sinais brutos de CD dos peptídeos são muito baixos em comparação ao das

proteínas, já que os peptídeos são compostos por poucos resíduos.

De acordo com o estudo de Zanata e colaboradores, os sítios de ligação destas

proteínas estão contidos na PrP entre os resíduos 113 e 128, e na hop/STI1 entre os resíduos

230 e 245 (ZANATA et al., 2002), de agora em diante referidos como PrP113-128 e hop/STI1230-

245, respectivamente. Os peptídeos PrP113-128 e hop/STI1230-245 são intrinsecamente

desestruturados, como pode ser observado em seus espectros de CD normalizados,

75

apresentados na Figura 14. Ainda mais, na maior parte da faixa de emissão coletada, as

contribuições espectrais dos peptídeos são desprezíveis com respetio aos espectros das

proteínas inteiras, como pode ser observado ao comparar os espectros de PrP e hop/STI1230-

245, expressos em elipticidades brutas θ (Fig. 15).

Figura 14: Comparação dos espectros de CD dos peptídeos PrP113-132 e hop/STI1230-245. Espectro do hop/STI1230-245 (linha preta) e o PrP113-132 (linha vermelha), ambas na concentração 500 µM.

Figura 15. Comparação dos espectros de CD, expressos em elipticidade bruta, da PrP e o peptídeo hop/STI1230-245. São apresentados os espectros medidos da PrP (linha preta) e do peptídeo

76

hop/STI1230-245 (linha vermelha). Ambas as amostras foram medidas na concentração 35 µM. Os espectros são apresentados em unidades de elipticidade bruta, de forma de facilitar a comparação das contribuições espectrais relativas de cada uma destas moléculas.

Observamos que a ligação da hop/STI1 ao peptídeo PrP113-132 não produz um efeito

significativo sobre as estruturas secundárias (Fig. 16). Por outro lado, o espectro de uma

amostra equimolar de PrP e hop/STI1230-245 mostrou uma redução de aproximadamente 30%

do sinal a 208 nm em comparação à predição baseada nos espectros das moléculas livres

(Fig.17).

Este importante efeito observado indica que a interação da PrP com hop/STI1230-245

resulta em um desenovelamento parcial, mas muito robusto, das α-hélices da PrP. Podemos

afirmar que esta alteração estrutural acontece na PrP e não no peptídeo hop/STI1230-245, a

contribuição espectral do peptídeo é desprezível com respeito a contribuição da PrP (Fig. 15),

pelo que a perda da magnitude observada na Figura 17 não pode ser atribuída a uma alteração

estrutural do peptídeo hop/STI1230-235.

Figura 16. Comparação da medição e a predição do espectros de CD do complexo hop/STI1:PrP113-

132. Espectro medido da amostra equimolar hop/STI1:PrP113-132 (linha preta), e soma, de acordo à equação 10 apresentada em Materiais e Métodos, dos espectros medidos da hop/STI1 e do peptídeo

77

PrP113-132 livres (linha vermelha). As medições foram realizadas na concentração 35 µM.

Figura 17. Comparação da medição e a predição do espectros de CD do complexo PrP:hop/STI1230-

245. Espectro medido da amostra equimolar PrP:hop/STI1230-245 (linha preta), e soma, de acordo à equação 10 apresentada em Materiais e Métodos, dos espectros medidos da PrP e do peptídeo hop/STI1230-245 livres (linha vermelha). As medições foram realizadas na concentração 35 µM.

Finalmente, testamos se as alterações da estrutura secundária, que a PrP e a hop/STI1

sofrem ao interagirem entre si (Fig. 13), são mimetizadas pelas alterações que a PrP e a

hop/STI1 sofrem ao interagir com hop/STI1230-245 e PrP113-132, respectivamente (Figs. 16 e 17).

Trabalhando com elipticidades brutas, subtraímos dos espectros das amostras

PrP:hop/STI1230-245 e hop/STI1:PrP113-132 os espectros medidos dos peptídeos livres

correspondentes. Com este procedimento estamos desprezando alterações dos espectros dos

peptídeos, o que parece razoável, já que mesmo que eles ganhem ou percam estrutura, suas

contribuições espectrais serão muito baixas. Desta forma, obtemos a predição do espectro das

proteínas PrP e hop/STI1 nas conformações resultantes da interação com hop/STI1230-245 e

PrP113-132, respectivamente, conformações que denominaremos PrP* e hop/STI1*. As

predições destes espectros são apresentadas na Figura 18.

78

No nível de estruturas secundárias, se PrP* e hop/STI1* mimetizam as conformações

adotadas pela PrP e a hop/STI1 quando formam o complexo PrP:hop/STI1, a soma (de acordo

à Equação 10) dos espectros de PrP* e hop/STI1* deveria ser igual ao espectro medido de

PrP:hop/STI1. Esta comparação é apresentada na Figura 19, demonstrando uma sobreposição

quase perfeita dos espectros de “PrP*+hop/STI1*” e PrP:hop/STI1. Isto indica que os

peptídeos PrP113-132 e hop/STI1230-245 são capazes de induzir respectivamente a totalidade das

perturbações da estrutura secundária da hop/STI1 e da PrP que as proteínas inteiras induzem

quando formado o complexo PrP:hop/STI1. Desta forma, quando o uso de proteínas inteiras

era proibitivo pelas características da técnica utilizada, os peptídeos constituíram uma

ferramenta útil para o estudo das alterações estruturais induzidas pela interação PrP:hop/STI1,

e em diversas instancias deste estudo faremos uso deles.

Figura 18. Comparação dos espectros de CD da PrP, PrP*, hop/STI1 e hop/STI1*. São apresentados os espectros medidos da PrP (linha preta) e da hop/STI1 (linha vermelha) livres e o espectro predito da PrP* (linha verde) e da hop/STI1* (linha azul). A predição destes dois últimos espectros foi obtida ao subtrair respectivamente os espectros medidos de hop/STI1230-245 e PrP113-132, dos espectros medidos de PrP:hop/STI1230-245 e hop/STI1:PrP113-132, sempre trabalhando com elipticidades brutas, θ. Posteriormente, estes espectros calculados foram normalizados para elipticidade molar por resíduo, [θ]. Todas as amostras foram medidas na concentração 35 µM. Os espectros apresentados parecem-se muito aos apresentados nas Figuras 16 e 17, já que a contribuição espectral em elipticidade bruta dos peptídeos é muito baixa com respeito a contribuição espectral das proteínas inteiras, como é ilustrado

79

na Figura 15.

Estes dados também sugerem que a formação do complexo PrP:hop/STI1 está

acompanhada de uma forte perturbação da estrutura secundária da PrP, compatível com um

mecanismo molecular de desenovelamento parcial. Já no caso da hop/STI1, as técnicas

utilizadas não foram capazes de evidenciar uma alteração estrutural da estrutura secundária.

Também podemos sugerir que interações locais, dentro dos sítios de ligação, são responsáveis

por desencadear as modificações da estrutura secundária da PrP, sendo importante esclarecer

que as alterações citadas não são necessariamente restritas aos sítios de ligação ou às

vizinhanças imediatas destes sítios, mas podem se propagar pela cadeia polipeptídica até

regiões mais distantes da estrutura terciária (JAMES et al., 1997; CHRISTEN et al., 2009).

De fato, tanto o sítio de ligação da hop/STI1 na PrP, assim como suas proximidades,

apresentam uma estrutura flexível e não possuem uma estrutura secundária determinada, o

que sugere que o evento de desenovelamento parcial da estrutura secundária da PrP ocorre em

α-hélices mais distantes localizadas no domínio globular C-terminal.

Figura 19. Comparação da medição do espectro de CD do complexo PrP:hop/STI1 e as predições

80

do espectro de CD dos complexos PrP:hop/STI1 e PrP*:hop/STI1*. É apresentado o espectro medido da amostra equimolar PrP:hop/STI1 (linha preta), em conjunto com duas somas (sempre de acordo à equação 10 apresentada em Materiais e Métodos): a primeira envolvendo os espectros medidos da PrP e a hop/STI1 livres (linha vermelha), e a segunda os espectros preditos de PrP* e hop/STI1* (linha verde). Todas as medições foram realizadas na concentração 35 µM. 4.2.2 EFEITOS SOBRE A ESTRUTURA LOCAL

Para ampliar a investigação de se a formação do complexo PrP:hop/STI1 promove

mudanças no enovelamento local destas proteínas, realizamos medidas de espectroscopia de

fluorescência intrínseca e extrínseca no estado estacionário.

Para as experiências de fluorescência extrínseca utilizamos como sonda o corante

anfifílico bis-ANS (4,4'-dianilino-1,1'-binaphthyl-5,5'-sulfonate). O bis-ANS constitui uma

sonda útil para obter informação sobre o estado de enovelamento de proteínas em solução

aquosa, sendo que este corante é o suficientemente sensível para detectar estados instáveis

intermediários de enovelamento, tais como estados de molten globule (glóbulo fundido)

(GOLBIK et al., 1998). Quando livre em solução aquosa, o bis-ANS apresenta fluorescência

desprezível, porém, quando inserido em bolsos hidrofóbicos de proteínas que o protegem do

contato com o solvente, aumenta significativamente sua fluorescência em 500 nm, quando

excitado com comprimento de onda de 360 nm (ROSEN et al., 1969). Consequentemente,

através da monitoramento da intensidade de fluorescência em 500 nm de bis-ANS co-

incubado com uma proteína de interesse, é possível estudar processos de

enovelamento/desenovelamento desta última (sejam eles induzidos termicamente,

quimicamente ou pela interação com ligantes), já que a intensidade será diretamente

proporcional ao grau de enovelamento da amostra protéica analisada (GOLBIK et al., 1998;

GOMES et al., 2003). Isto se explica pelo fato de que o desenovelamento (enovelamento)

protéico é acompanhado pela exposição (ocultação) ao solvente de segmentos hidrofóbicos

das proteínas, devido a desestruturação (estruturação) das cavidades hidrofóbicas destas. A

observação de um decaimento no sinal de fluorescência do bis-ANS sugeriria a exposição ao

81

solvente destas cavidades hidrofóbicas e o desenovelamento da proteína analisada.

Foi exatamente este último tipo de comportamento que observamos quando uma

amostra de PrP foi titulada com hop/STI1230-245. A intensidade de fluorescência em 500 nm de

uma amostra bis-ANS:PrP na proporção molar 2:1 decaiu progressivamente a medida que o

peptídeo hop/STI1230-245 foi adicionado à solução (Fig. 20). Este comportamento parece

alcançar uma saturação aproximadamente na proporção molar 1:1 de PrP:hop/STI1230-245,

correspondendo a um decaimento total de 75% do sinal inicial. Neste ponto final da titulação

a fluorescência da amostra ainda foi maior que a de uma amostra contendo a mesma

concentração de bis-ANS livre ou co-incubada com hop/STI1230-245 (este último dado sugere

que o bis-ANS não interage com hop/STI1230-245).

Figura 20. Fluorescência de bis-ANS durante as titulações de hop/STI1230-245 e PrP113-132 em amostras de bis-ANS:PrP e bis-ANS:hop/STI1, respectivamente. (A) Espetros de emissão de bis-ANS da titulação de hop/STI1230-245 em uma amostra bis-ANS:PrP. Uma amostra de bis-ANS:PrP na concentração 4:2 µM (linha contínua preta) foi titulada com o peptídeo hop/STI1230-245 nas concentrações bis-ANS:PrP:hop/STI1230-245 de 4:2:0.5 (linha contínua vermelha), 4:2:1 (linha contínua verde), 4:2:1.5 (linha contínua azul) e 4:2:2 (linha contínua laranja), sempre em unidades de µM. Também são apresentados os espectros de emissão de bis-ANS livre 4 µM (linha tracejada vermelha) e de uma amostra bis-ANS:hop/STI1230-245 na concentração 4:2 µM (linha tracejada preta). A excitação foi ajustada em 360 nm. (B) A fluorescência relativa em 500 nm durante a titulação de hop/STI1230-245 em uma amostra de bis-ANS:PrP (linha contínua preta), e a titulação de PrP113-132 em uma amostra de bis-ANS:hop/STI1 (linha contínua vermelha). Como referência, são apresentados: a emissão fluorescente em 500 nm de bis-ANS livre (linha contínua cinza) e bis-ANS:hop/STI1230-245 (linha

82

tracejada preta), ambos relativos à emissão de bis-ANS:PrP; a emissão fluorescente em 500 nm de bis-ANS livre (linha contínua rosa) e bis-ANS:PrP113-132 (linha tracejada vermelha), ambos relativos à emissão de bis-ANS:hop/STI1. Os dados são apresentados em função das razões molares [hop/STI1230-

245]/[PrP] e [PrP113-132]/[hop/STI1], respectivamente.

O efeito observado poderia ser atribuído à possível competição do bis-ANS

fluorescente com hop/STI1230-245 pelo sítio de ligação PrP113-128, já que este segmento está

contido no domínio hidrofóbico da PrP. Porém, a forte queda da fluorescência do bis-ANS

não parece ser completamente explicada por esta hipótese por dois motivos. Primeiro, o

segmento PrP113-128 é parte da cauda flexível N-terminal exposta ao solvente, enquanto a

fluorescência de bis-ANS é somente aumentada quando inserido em cavidades estruturadas

hidrofóbicas; e segundo, a fluorescência de bis-ANS não é aumentada, com respeito à

emissão de bis-ANS livre, pela presença do peptídeo hidrofóbico PrP113-132 (Fig. 20B), cuja

estrutura deve se aproximar à conformação do segmento PrP113-132 da PrP. Os dados

apresentados sugerem que a interação da PrP com hop/STI1230-245 resulta em uma perturbação

estrutural dos bolsos hidrofóbicos da PrP, parcialmente expondo estas cavidades (e o corante

inserido) ao solvente, como em um evento de desenovelamento parcial. Consistente com esta

interpretação, uma amostra de bis-ANS:hop/STI1 titulada com PrP113-132 não apresentou

variações sensíveis da fluorescência de bis-ANS (Fig. 20B). Em suma, os dados de

fluorescência extrínseca se correlacionam satisfatoriamente com os resultados de CD (Figs.

16 e 17).

Também realizamos experiências de fluorescência intrínseca, que são capazes de

prover informação sobre o ambiente químico dos resíduos aromáticos de uma proteína,

permitindo a inferência da estrutura local na qual estão inseridos. A fluorescência intrínseca

das proteínas resulta da emissão fluorescente dos resíduos que contêm anéis aromáticos,

principalmente do triptofano, a tirosina e a fenilalanina. Destes três aminoácidos, o triptofano

é o que apresenta maior rendimento quântico, e dado que a emissão de tirosinas pode ser

absorvida (quenched) por triptofanos vizinhos, este último resíduo geralmente domina o

83

espectro de emissão de proteínas. Dependendo do caso, a tirosina também pode apresentar

uma contribuição espectral significativa perto de 300 nm, porém isso geralmente acontece

quando a proteína contém um grande número de tirosinas e quase nenhum triptofano.

O grupo indol do triptofano é bastante sensível às mudanças de polaridade do

ambiente químico em que se encontra inserido. Em conseqüência, o máximo de emissão

fluorescente do triptofano depende fortemente da polaridade do meio. Este máximo pode

variar de 320 nm, quando o resíduo se encontra em um meio hidrofóbico, até comprimentos

de onda de 355 nm, quando o resíduo está em contato com um ambiente mais polar. A

intensidade de emissão fluorescente dos resíduos aromáticos também pode fornecer

informações importantes sobre a estrutura protéica. Alterações da intensidade de fluorescência

de uma proteína sujeita a alguma perturbação indicam transições conformacionais locais, já

que resíduos fluorescentes que modificam sua posição na estrutura tridimensional da proteína

sofrem alterações das interações que eles mantêm, seja com outros resíduos ou moléculas de

solvente, com conseqüências para a intensidade de fluorescência destes resíduos. Dependendo

das suas características, tais mudanças nas interações podem resultar em uma diminuição ou

um aumento de intensidade de emissão fluorescente dos resíduos aromáticos. Este efeito é

um sinal inequívoco de alterações conformacionais, porém a natureza da modificação não é

de fácil interpretação, sendo usualmente necessária a complementação desta evidência com

outros tipos de medidas.

Inicialmente, quando uma amostra de PrP em solução foi excitada a 280 nm, o

espectro de fluorescência intrínseca obtido é fortemente dominado pela contribuição de

triptofanos expostos ao solvente, com uma emissão de máxima intensidade em 344 nm (Fig.

21). O espectro obtido é congruente com a seqüência e a estrutura da PrP, já que dos 8

triptofanos que ela possui, 7 estão na região N-terminal desestruturada exposta ao solvente e

só 1 no domínio C-terminal globular (Fig. 22). Já foi inclusive demonstrado que este último

84

triptofano, o Trp144, que se encontra na α-hélice 1 do domínio globular, possui um espectro

de emissão que indica que ele está substancialmente exposto ao solvente (HORNEMANN et

al., 1997).

Quando esta amostra de PrP foi titulada com hop/STI1, o espectro sofreu alterações

não monotônicas ao longo da titulação (Inset em Fig. 21), começando com um decaimento na

intensidade do espectro e continuando com uma gradual recuperação da intensidade de

fluorescência até alcançar níveis de intensidade similares aos da PrP livre quando a titulação

alcançou a proporção molar de 1:1. Entretanto, o espectro apresentou um máximo de

fluorescência fortemente deslocado para o azul (Fig. 21). A soma dos espectros da PrP e

hop/STI1 livres está longe de explicar o espectro da amostra PrP:hop/STI1 na proporção

molar 1:1, sugerindo que a interação PrP:hop/STI1 perturba o ambiente químico dos resíduos

fluorescentes de uma ou ambas proteínas. Porém, o alto conteúdo de resíduos fluorescentes

destas proteínas impede maiores esclarecimentos, já que além dos 8 triptofanos, a PrP possui

13 tirosinas e, por sua vez, hop/STI1 possui 1 triptofano nas proximidades do domínio TPR1,

e 28 tirosinas (Fig. 22).

Figura 21. Espectros de fluorescência intrínseca de uma amostra de PrP titulada com hop/STI1.

São apresentados os espectros de fluorescência intrínseca de uma amostra de PrP livre 2 µM (linha

85

contínua preta) e a titulação desta com hop/STI1 nas concentrações PrP:hop/STI1 de 2:0.5 (linha contínua azul) e de 2:2 (linha contínua vermelha), sempre em unidades de µM. O espectro de hop/STI1 2 µM também é apresentado (linha tracejada preta). Todos os espectros foram normalizados pela fluorescência máxima da PrP livre. A excitação foi ajustada em 280 nm. Inset: A fluorescência intrínseca relativa a 344 nm dos espectros da titulação é representada em função da razão molar [hop/STI1]/[PrP] ao longo da titulação (linha contínua preta). Os valores de fluorescência foram normalizados ao valor de fluorescência da amostra PrP livre.

Figura 22. Triptofanos e tirosinas do domínio globular da PrP e do domínio TPR2a da hop/STI. São apresentadas, em representações cartoon, (A) o domínio globular da proteína recombinante murina, PrP121-231; (B) o domínio TPR2a da hop/STI1. São destacados em amarelo as tirosinas, e em azul o único triptofano do domínio C-terminal da PrP. Os respectivos sítios de ligação da interação PrPC:hop/STI1 são destacados em vermelho (no caso da PrP, esta representação é parcial, já que o modelo do domínio globular é truncado no resíduo 121, enquanto a interface de ligação foi mapeada em PrP113-128).

Diante deste impedimento, voltamos a fazer uso dos peptídeos PrP113-132 e

hop/STI1230-245, que não possuem triptofanos nas suas seqüências, porém ambos possuem uma

tirosina.

O espectro de fluorescência da hop/STI1, rica em tirosinas, apresenta um máximo de

fluorescência em 303 nm, como era de esperar, e um máximo secundário que deve

corresponder a emissão do seu único triptofano (Fig. 23). A adição de PrP113-132 à amostra de

hop/STI1 aumenta a intensidade do espectro numa proporção substancialmente maior à

contribuição espectral de PrP113-132 livre (Fig. 23). Como o sítio de ligação na hop/STI1 (ou

seja, a seqüência hop/STI1230-245) e o peptídeo PrP113-132 ambos possuem uma tirosina,

86

interpretamos este dado como uma confirmação da interação destas moléculas, já que

provavelmente o aumento na fluorescência deve-se à alteração das interações que estas

tirosinas mantém, provocada pela interação proteína:peptídeo. Porém, não podemos obter

informação adicional sobre efeitos estruturais.

Figura 23. Comparação dos espectros de fluorescência intrínseca de uma amostra de hop/STI1 livre e uma amostra de hop/STI1:PrP113-132. São apresentados os espectros de fluorescência intrínseca de uma amostra de hop/STI1 livre 4 µM (linha contínua preta), uma amostra hop/STI1:PrP113-132 na concentração 4:4 µM (linha contínua vermelha) e uma amostra PrP113-132 livre 4 µM. Os espectros foram normalizados pela fluorescência máxima da hop/STI1 livre. A excitação foi ajustada em 280 nm.

Por outro lado, a situação foi distinta no caso da interação PrP:hop/STI1230-245. A

emissão fluorescente dos triptofanos da PrP decaiu drasticamente durante a titulação do

peptídeo hop/STI1230-245, observando-se uma diminuição gradual da área dos espectros, que

saturou aproximadamente na proporção molar 1:1 de PrP:hop/STI1230-245, alcançando uma

perda total aproximada de 80% da área inicial (Figs. 24A e 24B ).

87

Figura 24. Espectros de fluorescência intrínseca da PrP e a PrP95-231W98F tituladas com hop/STI1230-

245. (A) São apresentados os espectros de fluorescência intrínseca de uma amostra de PrP livre 2 µM (linha contínua preta) e a titulação desta com hop/STI1230-245 nas concentrações PrP:hop/STI1230-245 de 2:0.5 (linha contínua laranja), 2:1 (linha contínua verde), 2:2 (linha contínua vermelha, sempre em unidades de µM. O espectro de hop/STI1230-245 2 µM também é apresentado (linha tracejada preta). Para demonstrar a saturação do efeito, é apresentado o espectro obtido ao subtrair a emissão espectral de 2 µM hop/STI1230-245 livre da emissão de 2:4 µM PrP:hop/STI1230-245, de forma de subtrair a contribuição do peptídeo em excesso (linha contínua azul). Todos os espectros foram normalizados pela fluorescência máxima da PrP livre. A excitação foi ajustada em 280 nm. (B) A área relativa dos espectros obtidos durante a titulação é representada em função da razão molar [hop/STI1230-245]/[PrP] (linha contínua preta). Os valores das áreas foram normalizados ao valor da área do espectro da PrP livre. (C) e (D) mesmos gráficos que em (A) e (B), respectivamente, respeitado as mesmas proporções molares, mas substituindo PrP por PrP95-231

W98F 5 µM e excitando em 295 nm.

Como controle de possíveis eventos de agregação durante a titulação, monitoramos o

88

espalhamento elástico de Rayleigh em 320 nm, que é diretamente proporcional ao tamanho

das partículas em solução, mas não observamos variações significativas do espalhamento que

possam sugerir agregação (dados não mostrados). Consequentemente, este fenômeno só pode

ser atribuído a uma perturbação estrutural das regiões vizinhas aos triptofanos da PrP, já que a

contribuição espectral do peptídeo hop/STI1230-245 é muito pequena em comparação à da PrP

(Fig. 23A). Cabe destacar que, durante a titulação, observamos que os espectros apresentam

um pequeno mas claro deslocamento de aproximadamente 4 nm para o azul, sugerindo que,

na média, os triptofanos da PrP engajam-se em interações mais apolares como conseqüência

da ligação ao peptídeo hop/STI1230-245.

Como foi mencionado antes, a PrP possui 7 dos seus 8 triptofanos na cauda N-

terminal desestruturada. Os dados sugerem que provavelmente esta região da proteína sofre

uma reestruturação induzida pela interação. O triptofano restante, Trp144, encontra-se na

primeira α-hélice do domínio globular C-terminal (Fig. 22A). Com base nos dados de CD

apresentados anteriormente, que sugerem um evento de perturbação deste tipo de estruturas

secundárias da PrP ao interagir tanto com a hop/STI1 como com o peptídeo hop/STI1230-245,

pensamos que o Trp144 poderia servir como sonda para monitorar perturbações estruturais

locais pela técnica de fluorescência intrínseca. Para tal, construímos um mutante da PrP com

uma deleção parcial (até o resíduo 94) do N-terminal adicionando ainda a mutação pontual

W98F. Esse mutante, que denominamos PrP95-231W98F, preserva o sítio de ligação da hop/STI1

e contém um único triptofano, Trp144. Assim, ensaios de espectroscopia de fluorescência

intrínseca deste mutante nos permitem detectar possíveis perturbações estruturais da α-hélice

1 da PrP.

O espectro de fluorescência deste mutante (Fig. 24C) é sensivelmente menos intenso

que o da PrP, como esperado devido ao menor conteúdo de triptofanos. O espectro se

apresenta sobreposto a um background espectral resultante do espalhamento de luz, porém

89

apresenta um claro máximo de emissão em 340 nm, em concordância com estudos anteriores

(HORNEMANN et al., 1997) e confirmando que a hélice 1 se encontra exposta ao solvente.

Ao titular a amostra de PrP95-231W98F com o peptídeo hop/STI1230-245, observamos outra vez

um decaimento gradual do pico do espectro, que novamente saturou na proporção molar de

1:1 (Figs. 24C e 24D). Devido ao alargamento espectral, a determinação dos comprimentos de

onda correspondentes aos máximos de emissão foi ambígua, pelo que não fomos capazes de

monitorar deslocamentos espectrais. O efeito observado não é capaz de explicar

quantitativamente as alterações espectrais da PrP inteira, porém é qualitativamente similar.

Novamente, o monitoramento do espalhamento de Rayleigh descartou eventos de agregação

(dados não mostrados). Os dados apresentados sugerem, portanto, que a vizinhança da α-

hélice 1 da PrP sofre alterações estruturais disparadas pela interação com o peptídeo

hop/STI1230-245.

Em resumo, a evidência coletada de espectroscopia de fluorescência extrínseca e

intrínseca sugere que a interação da PrP com o peptídeo hop/STI1230-245 dispara uma série de

alterações da estrutura local da PrP, levando à exposição parcial de seus segmentos

hidrofóbicos, e envolvendo provavelmente tanto uma reestruturação da cauda flexível N-

terminal quanto uma perturbação estrutural do domínio globular que afeta, pelo menos, a α-

hélice PrP143-53, compatível com os dados de CD apresentados acima.

4.2.3 EFEITOS SOBRE A ESTRUTURA TERCIÁRIA

Com a finalidade de analisar o efeito da interação PrP:hop/STI1 sobre as estruturas

terciárias da PrP e da hop/STI1, realizamos medidas de espalhamento de Raios-X a baixos

ângulos (SAXS, pelo nome em inglês, small-angle X-ray scattering). Esta técnica é capaz de

90

prover informação sobre o tamanho e a forma de macromoléculas em soluções

monodispersas, ou seja, com uma única espécie oligomérica marcadamente dominante

(PETOUKHOV et al., 2007). Originalmente, o uso da técnica limitava-se à obtenção de

parâmetros estruturais que caracterizam a conformação global de macromoléculas, tais como

o raio de giro molecular, Rg, e a distribuição de distâncias intramoleculares, p(r) (GLATTER

et al., 1982). Porém, recentemente, foram desenvolvidos algoritmos computacionais,

implementados em softwares de livre acesso, que permitem o cálculo de modelos estruturais

de baixa resolução das moléculas analisadas (na ordem de 10 Å), através de diversos ajustes

teóricos aos perfis de espalhamento experimentais (SVERGUN et al., 2001; PETOUKHOV et

al., 2005).

Realizamos ensaios de SAXS com amostras de hop/STI1 livre e amostras de PrP e

hop/STI1 co-incubadas na proporção molar 1:1 (não fomos capazes de analisar amostras de

PrP livre pela presença de oligômeros que comprometem a monodispersidade das amostras).

A faixa de concentrações das amostras analisadas foi de 2.3 - 4.5 mg/ml (ver Materiais e

Métodos). Os perfis de espalhamento medidos são apresentados na Figura 25A, junto com os

ajustes teóricos aos dados experimentais realizados através de métodos de transformação de

Fourier indiretos implementados no programa GNOM (SVERGUN et al., 1992). Este ajuste

permitiu a obtenção de uma estimativa do diâmetro máximo molecular, Dmax, das moléculas

analisadas, que foram de 198 Å e 162 Å para a hop/STI1 e a PrP:hop/STI1, respectivamente.

O ajuste também calcula as distribuições p(r) (Fig. 26) e sugere um Rg de 60.24±0.2 Å para a

hop/STI1, e 52.26±0.15 Å para o complexo PrP:hop/STI1. A análise dos gráficos de Guinier

(Fig. 25B) confirma a monodispersidade das amostras (um desvio da linearidade nestes

gráficos indicaria a presença de múltiplas espécies oligoméricas), e provê valores similares de

Rg: 58.34±1.71 Å para a hop/STI1 e 53.26±1.72 Å para o complexo PrP:hop/STI1. Se a

hop/STI1 é um monômero e o complexo PrP:hop/STI1 é formado por uma molécula de cada

91

espécie, estes dados evidenciariam uma significativa compactação da estrutura terciária da

hop/STI1 quando ela interage com a PrP.

Figura 25. Espalhamento por SAXS de hop/STI1 livre e PrP:hop/STI1, ajuste teórico realizado com o programa GNOM e análise dos gráficos de Guinier das amostras. (A) As intensidades de espalhamento medidas de uma amostra de hop/STI1 livre 4.5 mg/ml (pontos vermelhos) e uma amostra PrP:hop/STI1 equimolar 4 mg/ml (pontos azuis) são apresentadas em função do vetor de espalhamento, q. Os ajustes realizados com o programa GNOM (linhas verdes) foram obtidos com os valores de Dmax de 198 Å e 162 Å para a hop/STI1 e a PrP:hop/STI1, respectivamente. Os dados (e as correspondentes curvas teóricas) foram normalizados arbitrariamente, de forma de facilitar a visualização. (B) São apresentados os gráficos de Guinier, na região q x Rg< 1, da hop/STI1 (pontos vermelhos) e da PrP:hop/STI1 (pontos azuis). A regressão linhar por mínimos quadrados destes dados (linhas verdes) sugere um Rg de 58.34±1.71 Å para a hop/STI1 e 53.26±1.72 Å para o complexo PrP:hop/STI1 (ver Materiais e Métodos). Os dados foram normalizados de forma arbitraria, novamente.

92

Figura 26. Distribuição de pares distâncias intramoleculares da hop/STI1 e o complexo PrP:hop/STI1. São apresentadas as distribuições de distâncias intramoleculares da hop/STI1 (linha vermelha) e do complexo PrP:hop/STI1 (linha azul), calculadas pelo programa GNOM, a partir do ajuste aos dados de espalhamento, apresentados na Figura 25. As curvas apresentadas foram normalizadas de forma de facilitar a comparação. As distribuições indicam um Rg de 60.24±0.2 Å para a hop/STI1 e 52.26±0.15 Å para o complexo PrP:hop/STI1.

De fato, a comparação entre os valores obtidos de espalhamento direto, I(0), das

amostras analisadas e as de amostras controle (lisozima) sugere que a hop/STI1 é um

monômero, e que o complexo PrP:hop/STI1 é formado por uma molécula de PrP e uma

molécula da hop/STI1 (Tabela 2). Considerando que existe controvérsia sobre o estado

oligomérico da hop/STI1 (PRODROMOU et al., 1999; VAN DER SPUY et al., 2001;

CARRIGAN et al., 2004; FLOM et al., 2007; ONUOHA et al., 2008), tentamos corroborar

este dado. Abordamos esta questão realizando ensaios de eletroforese em géis de

poliacrilamida não desnaturantes (native-PAGE, pelo nome em inglês, native polyacrylamide

gel electrophoresis), e ensaios de cromatografia liquida de alta eficiência de exclusão por

tamanho (SE-HPLC, pelo nome em inglês, size exclusion high-performance liquid

cromatography) usando as colunas TSK-gel 3000SW e Superdex 200 (Fig. 27 e Tabela 2).

Ambos os ensaios indicam que a hop/STI1 se apresenta em solução primordialmente como

um monômero. Native-PAGE mostrou que espécies oligoméricas são muito raras (Fig. 27A).

93

SE-HPLC sugeriu uma forma monomérica alongada e não globular, já que a hop/STI1 elui

com um raio hidrodinâmico equivalente ao de uma proteína globular de 108 kDa (Fig. 27B e

Tabela 2), enquanto ela possui 66 kDa. Este perfil de eluição não deve corresponder a um

dímero da hop/STI1, já que a eluição do dímero de albumina de soro bovina (BSA), cujo

monômero é globular e também possui 66 kDa, elui em volumes sensivelmente menores (Fig.

27B). Em linha com a observação do formato pouco globular da hop/STI1, a p(r) (Fig. 26) da

hop/STI1 (assim como a do complexo PrP:hop/STI1) é uma curva em forma de sino

assimétrica, com uma cauda de queda lenta, o que indica uma molécula alongada e pouco

globular, e o gráfico de Kratky apresenta as características de uma molécula com múltiplos

domínios conectados flexivelmente (Fig. 28).

Figura 27. Avaliação do estado oligomêrico da hop/STI1 e do complexo PrP:hop/STI1. (A) Eletroforese em gel de poliacrilamida 8% de hop/STI1 em um tampão de amostra nativo (esquerda) e em tampão de amostra desnaturante (direita). Não houve presença de agentes desnaturantes no gel, tampão de corrida ou tampão de amostra nativo; o tampão de amostra desnaturante continha 1% β-mercaptoetanol e 0.5% de dodecil sulfato de sódio (SDS). As amostras não foram fervidas. (B) SE-HPLC em coluna TSK-gel 3000SW das amostras hop/STI1 4.5 mg/ml (linha sólida preta) e PrP:hop/STI1 4 mg/ml (linha sólida cinza). As amostras eluiram com raios hidrodinâmicos equivalentes a proteínas globulares de 108 kDa e 97 kDa, respectivamente. A linha vertical tracejada indica o volume de eluição do dímero de 132 kDa formado pelas proteínas globulares de albumina de soro bovina (BSA). Resultados similares foram obtidos com uma coluna Superdex-200. Inset: Calibração da coluna TSK-gel 3000SW, destacando, com um ponto cinza, a eluição da hop/STI1.

94

Notamos que, quando comparado com hop/STI1 livre, as medidas de SE-HPLC

parecem indicar que amostras de PrP:hop/STI1 eluem como se tivessem um raio de Stokes

menor, pelo que difundem pela coluna como uma partícula com um peso molecular (P. M.)

menor (Fig. 27B e Tabela 2), fato que apóia o evento de compactação sugerido pelos

experimentos de SAXS. Porém, esta evidência não é conclusiva, já que, em pH

aproximadamente neutro, PrP livre tende a eluir em múltiplos picos de baixa

reprodutibilidade, o que poderia explicar a raridade de estudos que mostrem dados de SE-

HPLC para a PrP, usualmente realizados na presença de uréia ou em pH ácidos (MORILLAS

et al., 2001; LU et al., 2001).

Tabela 2. Resumo dos parâmetros estruturais obtidos.

Molécula P. M. equivalente por

SE-HPLC (kDa)

P. M. por

I(0) (kDa)

P. M. da

seqüência (kDa)

Rg (Å)

(Guinier)

Rg (Å)

(GNOM)

Dmax

(Å)

STI1 108 72 66 58.34±1.71 60.24±0.2 198

STI1:PrP 97* 87 89 53.26±1.72 52.26±0.1 162

*: resultado não conclusivo dado o comportamento pouco reprodutível de PrP em ensaios de SE-HPLC.

Em suma, os dados apresentados até o momento indicam que as amostras de hop/STI1

murina com as quais trabalhamos são monodispersas, compostas por moléculas monoméricas,

e ainda sugerem que a hop/STI1 tem um formato alongado com seus domínios globulares

(DP1, TPR1, TPR2a, TPR2b, DP2) conectados por enlaces flexíveis. A interação da hop/STI1

com a PrP parece manter o formato global da hop/STI1, porém dotado de uma robusta

compactação da estrutura terciária, sendo que a estrutura do complexo PrP:hop/STI1

encontra-se menos dispersa espacialmente do que a da hop/STI1 livre apesar da cauda flexível

N-terminal da PrP.

A fim de esclarecer melhor a conformação estrutural da hop/STI1 e do complexo

95

PrP:hop/STI1, reconstruímos modelos de baixa resolução destas moléculas a partir da análise

dos dados experimentais de espalhamento de SAXS, com o uso de software especializado

produzido por Svergun e colaboradores.

Figura 28. Gráfico de Kratky da hop/STI1 e o complexo PrP:hop/STI1. (A) São apresentados os gráficos de Kratky calculados a partir dos espalhamentos da hop/STI1 (pontos vermelhos) e do complexo PrP:hop/STI1 (pontos azuis). Para facilitar a comparação entre os gráficos A e B, a escala do eixo das ordenadas foi ajustado de forma similar a escala do eixo das ordenadas de B. O comportamento das curvas sugere que o complexo PrP:hop/STI1 é mais compacto que a hop/STI1 livre, e que tanto a hop/STI1 como PrP:hop/STI1 são moléculas alongadas e não globulares. (B) É apresentada uma figura esquemática que representa gráficos de Kratky típicos de proteínas globulares (linha azul), proteínas com múltiplos domínios conectados flexivelmente (linha vermelha) e proteínas intrinsecamente desestruturadas (linha rosa). Figura adaptada do site do fórum da Small Angle X-ray

Scattering Initiative for Europe (SAXIER) (www.saxier.org/forum/viewtopic.php?t=337).

Usamos dois tipos de programas que implementam diferentes algoritmos. O primeiro

programa, denominado GASBOR (SVERGUN et al., 2001), implementa métodos de

simulated annealing para encontrar distribuições de resíduos dummy conectados em cadeia

que apresentem um espalhamento teórico, calculado a partir de primeiros princípios (ab

initio), que se ajuste ao espalhamento medido por SAXS. Como podem ser obtidos diferentes

modelos deste tipo, que ajustam o espalhamento experimental com a mesma confiança

estatística, o protocolo envolve o cálculo de uma média espacial de alguns modelos

96

(usualmente dez são suficientes), obtendo-se um modelo final que representa uma espécie de

volume comum (ou consenso) aos modelos calculados, e que reproduz fielmente a forma e o

tamanho de proteínas em solução com uma resolução de aproximadamente 10 Å (SVERGUN

et al., 2001; PETOUKHOV et al., 2007). Denominaremos este tipo de modelos de “modelos

volumétricos”. O segundo programa, denominado BUNCH (PETOUKHOV et al., 2005), cria

modelos aproximadamente da mesma resolução, mas depende da existência de modelos de

alta resolução de alguns dos domínios da proteína de interesse, usualmente calculados por

técnicas como cristalografia por difração de raios-X ou RMN. BUNCH também usa simulated

annealing, mas para implementar um tipo de modelagem de corpos rígidos (rigid body

modeling), já que encontra a posição e orientação ótimas dos modelos de domínios que, por

sua vez, são conectados por segmentos flexíveis, formados por cadeias de resíduos dummy

ligados apropriadamente aos resíduos terminais dos domínios. Como aproximação neste

estudo, os modelos de alta resolução de domínios protéicos usados como input para o

programa BUNCH foram TPR1, TPR2a (SCHEUFLER et al., 2000) da hop/STI1 e PrP121-231

da PrP (RIEK et al., 1996), em conjunto com modelos de homologia do TPR2b, DP1 e DP2

da hop/STI1, calculados pelo servidor LOMETS (WU et al., 2007). Este servidor prevê

aproximadamente a estrutura de proteínas através da análise da homologia a modelos

experimentais de alta resolução já existentes, criando modelos consenso entre 9 programas

independentes. Para o modelo BUNCH do complexo PrP:hop/STI1 foi imposta uma condição

de contato entre os sítios de ligação da PrP e da hop/STI1, ao restringir a distância máxima de

10 Å entre PrP113-128 e hop/STI1230-245.

O resultado do ajuste aos dados experimentais de SAXS, realizado com ambos os

programas, é apresentado na Figura 29. Os modelos volumétricos, calculados por GASBOR,

e os modelos de corpo rígido, calculados por BUNCH, são apresentados na Figura 30, após

ambos serem alinhados pelo programa SUPCOMB (KOZIN et al., 2001). Como pode ser

97

observado, os modelos obtidos por estas duas diferentes metodologias são congruentes e se

superpõem satisfatoriamente.

Figura 29. Ajustes teóricos ao espalhamento por SAXS da hop/STI1 livre e do complexo PrP:hop/STI1, realizados com os programas GASBOR e BUNCH. (A) Ajustes realizados com o programa GASBOR (linhas verdes) e BUNCH (linhas pretas) das intensidades de espalhamento medidas da hop/STI1 livre (pontos vermelhos) e do complexo PrP:hop/STI1 (pontos azuis). No caso do programa GASBOR, são apresentados os espalhamentos de modelos representativos dentre os dez modelos calculados para cada amostra. Os dados (e as correspondentes curvas teóricas) foram normalizados arbitrariamente, de forma de facilitar a visualização.

Os resultados confirmam a forma alongada da hop/STI1 monomérica, bem como a

compactação que aquela proteína sofre quando se liga à PrP em uma estequiometria de 1:1. O

alinhamento do modelo da hop/STI1 livre ao da hop/STI1 na conformação resultante da

interação com a PrP indica que a parte C-terminal da hop/STI1 é a região que experimenta a

compactação, como resultado da aproximação mútua dos domínios TPR2a, TPR2b e DP2

(Fig. 31).

98

Figura 30. Modelos da hop/STI1 livre e do complexo PrP:hop/STI1. (A) Representação esquemática das seqüências da hop/STI1 (esquerda acima) e da PrP (esquerda abaixo). Os domínios globulares são destacados como caixas e aos segmentos flexíveis que conectam os domínios, como linhas. Os números dos resíduos inicias e finais de cada domínio são apresentados embaixo de cada domínio. Também são representadas as três orientações dos modelos apresentados em B e C, que consistem em uma primeira orientação e duas rotações sucessivas desta, de 90o ao redor do eixo z (direita). (B) e (C) Modelos por BUNCH (fileira superior) e superposição destes modelos com os modelos volumétricos obtidos por GASBOR representados com esferas cinzas (fileira inferior). As cores dos domínios e dos segmentos flexíveis que os conectam são os mesmos que os apresentados em (A). Os sítios de ligação PrP113-128 e hop/STI1230-245 são destacados em vermelho. (B) Modelos da hop/STI1. (C) Modelos do complexo PrP:hop/STI1.

99

Figura 31. Alinhamento dos modelos da hop/STI1 livre e da hop/STI1 na conformação resultante da interação com PrP. É apresentado o alinhamento dos modelos por BUNCH da hop/STI1 livre (azul) e da hop/STI1 na conformação resultante da interação com PrP (vermelho), onde a estrutura da PrP foi omitida para facilitar a comparação. As orientações dos modelos são as mesmas que as apresentadas na Figura 30.

100

5. DISCUSSÃO

A interação da PrPC com a hop/STI1 na superfície celular induz a modulação de

múltiplas vias de sinalização molecular, com diferentes impactos sobre a fisiologia celular

(ZANATA et al., 2002; CHIARINI et al., 2002; LOPES et al., 2005; ERLICH et al., 2007;

ARANTES et al., 2009). Não obstante, como estas proteínas não possuem domínios

transmembrana, o mecanismo molecular através do qual sua interação induz a transmissão de

informação para o compartimento intracelular ainda está longe de ser compreendido. A

profusão de estudos que abordaram a análise de respostas celulares ativadas por esta interação

precisa, portanto, ser complementada por uma contrapartida de trabalhos que pesquisem os

mecanismos estruturais que medeiam estes processos.

Com base na diversidade de ligantes (Fig. 6) e processos biológicos regulados pela

PrPC, foi sugerido que ela forme parte de uma plataforma dinâmica da superfície celular que

integra módulos sinalizadores através das interações seletivas com seus ligantes (LINDEN et

al., 2008). Os eventos de sinalização muito provavelmente dependem e são modulados por

alterações estruturais alostéricas, que podem ser propagadas nos distintos parceiros

moleculares envolvidos, especialmente no caso de moléculas restritas espacialmente, como

proteínas de membrana (BRAY & DUKE, 2004; WHITTY, 2008). Desta forma, alterações

estruturais ativadas pela interação entre PrPC e hop/STI1 são de relevância biológica, já que

modificações das estruturas de uma ou ambas proteínas poderiam expor ou ocultar sítios

putativos de ligação envolvidos na formação de complexos protéicos de ordem superior que,

por seu turno, podem regular eventos sinalizadores.

101

5.1 SOBRE AS EVIDÊNCIAS APRESENTADAS NESTE TRABALHO

Usando uma variedade de técnicas, avaliamos o impacto da ligação in vitro da PrP e

hop/STI1 murinas recombinantes sobre distintos níveis de suas estruturas protéicas. A análise

dos dados coletados sugere que esta interação dispara um sensível rearranjo estrutural da

cauda flexível N-terminal da PrP, acompanhada de um desenovelamento parcial do seu

domínio globular C-terminal, na forma de um afrouxamento de estruturas em α-hélice,

envolvendo pelo menos a α-hélice 1 que abrange o segmento PrP143-153. Cabe destacar, que o

efeito observado pela ligação do peptídeo hop/STI1230-245 à PrP demonstrou que estas

modificações estruturais podem ser disparadas por interações locais na interface de ligação da

PrP, localizada na junção entre a cauda flexível e a α-hélice 1 (Fig. 6). Isto sugere que tais

interações desencadeiam uma série de perturbações estruturais que se propagam ao longo do

domínio globular, sem o envolvimento de domínios adicionais da hop/STI1. Este tipo de

alterações estruturais de longo alcance, disparadas pelo acoplamento de um ligante, foram

observadas em várias moléculas sinalizadoras e constitui uma base estrutural para a regulação

alostérica (REMÉNYI et al., 2006). Consistente com esta evidência, foi recentemente

demonstrado que interações de longo alcance entre sítios distantes na sequência primária

afetam propriedades da estrutura local da PrP (CHRISTEN et al., 2009). Adicionalmente, um

estudo de RMN avaliou o impacto de um segmento da cauda N-terminal flexível da PrP sobre

a estrutura de seu domínio globular. As estruturas obtidas por RMN mostraram que uma

cauda N-terminal parcial altera a estrutura do domínio enovelado, e indicaram que a

sequência hidrofóbica rica em glicinas PrP113-125 (cobrindo quase a totalidade do sitio de

ligação da hop/STI1), apesar de flexível, parece apresentar uma estrutura polimórfica

marginalmente estável que se envolve em interações de longo alcance, as quais estabilizam

102

conformações estendidas de α-hélices do domínios globular da PrP (JAMES et al., 1997). O

truncamento deste segmento resulta em um domínio globular da PrP com α-hélices mais

curtas. Estes dados são consistentes com nossa observação de que o engajamento de PrP113-

128, tanto com hop/STI1230-245 ou hop/STI1 inteira, resulta em uma diminuição do conteúdo de

estruturas em α-hélice da PrP, já que este engajamento perturbaria interações críticas de longo

alcance necessárias para estabilizar aquelas estruturas.

Por outro lado, os dados que apresentamos indicam que a hop/STI1 murina é uma

proteína monomérica alongada. Em contraste com esta evidência, alguns estudos anteriores

indicaram que a hop/STI1 de levedura é dimérica (PRODROMOU et al., 1999; FLOM et al.,

2007), assim como o homólogo humano (CARRIGAN et al., 2004; ONUOHA et al., 2008)

para o qual foi sugerido que o domínio de dimerização é o TPR2a (ONUOHA et al., 2008).

Porém, a comparação com a hop/STI1 de levedura não é conclusiva, já que ela apresenta

somente ~40% de homologia à hop/STI1 murina. Não obstante, a homolgia de ~97% entre a

hop/STI1 murina e a humana mostra que a sequência desta última difere da primeira nos

resíduos T243K, K250R e Y269H do domínio de dimerização TPR2a, e o resíduo 269 reside

na interface de dimerização sugerida (ONUOHA et al., 2008). No outro estudo em que foi

analisado o estado oligomérico da hop/STI1 humana (CARRIGAN et al., 2004), a evidência

que apóia a dimerização desta proteína consistiu unicamente de ensaios de SE-HPLC, nos

quais hop/STI1 eluiu em um volume que corresponde a uma proteína globular de 120 kDa.

Este volume de eluição é menor do que o do dímero da proteína globular alumina de soro

bovina (BSA) (132 kDa), cujo monômero tem aproximadamente o mesmo peso molecular

que a hop/STI1 (66 kDa). De fato, 14 mutações pontuais, cobrindo todos os domínios da

hop/STI1, falharam em afetar o volume de eluição. Então, estes dados também são

consistentes com uma proteína monomérica alongada. Importantemente, o único estudo que

analisou o estado oligomérico da hop/STI1 murina, usando SE-HPLC e ligação química

103

cruzada (chemical cross-linking) de três versões da proteína (sem tag, com His-tag e GST-

tag), encontrou estados diméricos e monoméricos para uma versão (His-tag) e estados

monoméricos para as outras duas versões (VAN DER SPUY et al., 2001). Consistente com

este estudo, nossos ensaios de SE-HPLC (usando colunas Superdex-200 e TSK-del 3000SW)

e PAGE nativo, assim como a calibração dos dados de espalhamento de SAXS com padrões

de peso molecular, todos apoiam a interpretação de que a hop/STI1 murina com His-tag

apresenta-se em solução em forma monomérica, com estados oligoméricos superiores muito

menos abundantes.

Esta mesma calibração dos dados de SAXS sugere uma estequiometria de ligação

molar 1:1 para o complexo. Através da obtenção de parâmetros estruturais que caracterizam

de forma global as moléculas analisadas, os dados de SAXS, consistentes com perfis de

eluição de SE-HPLC, indicam que o complexo PrP:hop/STI1 é mais compacto que hop/STI1

livre. Este fato deve ser destacado, já que, em princípio, poderíamos esperar que a cauda

flexível da PrP, que deve explorar distintas conformações transitórias expostas ao solvente,

aumentasse substancialmente o volume ocupado pelo complexo.

A análise dos dados de espalhamento por meio de distintos programas de modelagem

molecular apoiam estas evidências e ainda forneceu maiores esclarecimentos sobre a

organização estrutural destas moléculas. Apesar dos programas utilizados serem baseados em

metodologias diferentes para a análise dos dados experimentais, os modelos de baixa

resolução obtidos foram altamente congruentes. Este modelos representam a hop/STI1 como

uma proteína estendida do tipo beads-on-a-string, e o complexo PrP:hop/STI1 como uma

molécula de conformação similar, porém mais compacta, onde a cauda N-terminal da PrP se

mostra ocupando um volume restrito. A ligação da PrP parece resultar em uma sensível

modificação da estrutura terciária da hop/STI1, na forma de um aproximação mútua entre os

104

domínios TPR2a, TPR2b e DP2 da região mais C-terminal da hop/STI1, mantendo a

organização global da parte N-terminal da molécula, incluindo os domínios TPR1 e DP1.

5.2 IMPLICAÇÕES PARA O MECANISMO SINALIZADOR

É tentador especular que as alterações conformacionais demonstradas, induzidas pela

interação PrP:hop/STI1, modifiquem as afinidades destas proteínas por outros ligantes. A

evidência de que a ligação de hop/STI1 induz um rearranjo estrutural da PrP na forma de uma

redução do conteúdo de α-hélices desta última, envolvendo, pelo menos, uma perturbação

estrutural da α-hélice do segmento PrP143-153, é de particular relevância. Como foi

mencionado, a interação da PrPC com a hop/STI1 precisa de um parceiro transmembrana que

seja capaz de acoplar os eventos moleculares que envolvem estas proteínas no meio

extracelular à sinalização intracelular demonstrada. A α-hélice do segmento PrP143-153 é uma

parte fundamental do sítio de ligação de dois dos ligantes da PrPC melhor caracterizados, o

precursor do receptor de laminina (LRP) (HUNDT et al., 2001) e a molécula de adesão

celular neural (N-CAM) (SCHMITT-ULMS et al., 2001), ambas proteínas transmembrana

envolvidas tanto no tráfego e na sinalização mediada por PrPC (GAUCZYNSKI et al., 2001;

SANTUCCIONE et al., 2005; NIKLES et al., 2008), quanto na citopatologia mediada por

PrPSc (RIEGER et al., 1997; LEUCHT et al., 2003). Desta forma, como veremos a seguir,

perturbações da estrutura desta α-hélice poderiam resultar em alterações da afinidade por

estes ligantes transmembrana, com prováveis consequências para a sinalização que eles

carreiam para o meio intracelular.

Diversos estudos realizados em culturas de neurônios PC12 demonstraram que N-

105

CAM regula eventos neuritogênicos através de dois processos diferentes: mediante a ligação

direta com o receptor do fator de crescimento de fibroblastos (FGFR) e mediante interações

indiretas com a tirosina cinase não receptora FYN (revisado por CHEKHONIN et al., 2007).

Várias vias de sinalização intracelulares são ativadas por estas duas interações, porém, elas se

integram na via das ERK, associada à regulação do citoesqueleto, da transcrição gênica, e de

eventos de neuritogênese. Interessantemente, a PrPC liga a N-CAM nos aa N-CAM645-679

(SCHMITT-ULMS et al., 2001) e o FGFR interage com o segmento adjacente N-CAM681-695

(KISELYOV et al., 2003; CHEKHONIN et al., 2007), pelo que PrPC e FGFR poderiam

competir pela N-CAM, com consequências sobre a sinalização intracelular. Consistente com

esta hipótese, experimentos realizados por nosso grupo demonstraram que tanto a estrutura da

α-hélice 1 da PrPC (este trabalho), que faz parte da interface de ligação com o N-CAM,

quanto a via da ERK (CHIARINI et al., 2002; LOPES et al., 2005; ERLICH et al., 2007) são

perturbadas e ativadas, respectivamente, pela interação PrPC:hop/STI1. Desta forma, as

alterações conformacionais que observamos na PrPC após formação do complexo

PrPC:hop/STI1 poderiam representar um substrato estrutural para uma perturbação da via N-

CAM/FGFR por meio da alteração da afinidade da PrPC pela N-CAM, o que poderia

explicaria a ativação da via da ERK e a subsequente neuritogênese.

Ao mesmo tempo, a via de sinalização da N-CAM através da cinase FYN também

poderia ser modulada pela alteração da afinidade da PrPC pela N-CAM, como conseqüência

da interação PrPC:hop/STI1. Esta via neuritogênica depende da formação de aglomerados

homofílicos de N-CAMs dentro de balsas lipídicas, resultando indiretamente em um aumento

dos níveis de fosforilação da FYN e, subsequentemente, os da ERK (CHEKHONIN et al.,

2007). A interação PrPC:N-CAM poderia afetar a formação destes aglomerados de N-CAM e,

compatível com esta hipótese, a ligação cruzada da PrPC na superfície celular por meio de

anticorpos monoclonais dispara uma série de eventos intracelulares neuritogênicos que são

106

idênticos, em vários dos processos moleculares envolvidos, aos ativados pela ligação cruzada

da N-CAM que resulta no engajamento da FYN (SANTUCCIONE et al., 2005; PANTERA et

al., 2009).

Por outro lado, foi demonstrado que a PrPC liga-se, na superfície celular, ao LRP e/ou

a putativa isoforma madura do receptor de laminina (LR) (RIEGER et al., 1997;

GAUCZYNSKI et al., 2001), e que a interface de ligação inclui a α-hélice 1 da PrPC e o

segmento de aa LRP/LR161-179 (HUNDT et al., 2001). A funcionalidade desta interação ainda

não foi esclarecida, mas foi sugerido que o LRP atue como um receptor que regula a

internalização da PrPC (GAUCZYNSKI et al., 2001). Interessantemente, o segmento PrP173-

182, que se sobrepõe parcialmente ao sítio de ligação do LRP/LR, interage com a laminina

através do C-terminal da cadeia γ desta, com consequências neuritogênicas (GRANER et al.,

2000a, 2000b), e atuando no hipocampo de ratos favorecendo a consolidação de memórias

aversivas (COITINHO et al., 2006). Ainda mais, o LRP/LR interage com a PrPC e a laminina

através do mesmo sitio (LRP/LR161-179), pelo que a dinâmica das interações entre o trio

formado pela PrPC, o LRP/LR e a lamina exibe uma rica complexidade, com interações

mutuamente exclusivas que podem ser significativas para os mecanismos moleculares de

sinalização envolvidos (LINDEN et al., 2008). Desta forma, as alterações estruturais

observadas na α-hélice 1 da PrPC, disparadas pela interação com a hop/STI1, podem ter um

importante efeito sobre esta intrincada rede de interações sinalizadoras.

De fato, a interação do LRP/LR com a laminina vai além de conferir estabilidade

estrutural durante a adesão celular e deve ser capaz de ativar transdução de sinais celulares, já

que induz outros processos dinâmicos envolvidos na diferenciação celular, como aumento de

filopódios, indução de mobilidade direcionada e modulação da expressão gênica (revisado por

NELSON et al., 2008). De fato, estudos inicias em células tumorais evidenciaram que esta

107

interação estimula a desfosforilação de MAP cinases da família ERK, JNK e p38 (GIVANT-

HORWITZ et al., 2004).

Com respetio à hop/STI1, ela é reconhecida como um proteína adaptadora que

coordena a montagem dinâmica do complexo de chaperonas HSP90:hop/STI1:HSP70. A

formação deste complexo é acompanhada por modificações conformacionais. A ligação de

HSP90 pela hop/STI1 altera o número de sítios de ligação hop/STI1:HSP70, resultando em

um aumento de 5 vezes da afinidade de hop/STI1 pela HSP70 (HERNÁDEZ et al., 2002).

Podemos especular que, em analogia ao mecanismo do complexo HSP90:hop/STI1:HSP70,

as modificações observadas da estrutura terciária da hop/STI1, disparada pela interação com

PrP, poderiam alterar a afinidade da hop/STI1 pelos seus ligantes. Ainda mais, proteínas com

múltiplos domínios TPR, tais como a hop/STI1, foram associadas com o recrutamento de

complexos multiprotéicos, servindo como plataformas estruturais capazes de múltiplas

interações e da catálise de diversos processos biológicos (BLATCH & LASSLE, 1999).

Assim a aproximação, ativada pela ligação de PrP, dos domínios TPR2a, TPR2b e DP2 da

hop/STI1 poderia aproximar seus ligantes, facilitando interações adicionais com

consequências biológicas.

Trabalhos prévios realizados em explantes de retinas murinas e em culturas de

neurônios hipocampais, demonstraram que o peptídeo hop/STI1230-245 é capaz de mimetizar o

efeito da hop/STI1 inteira, engajando a PrP na superfície celular e disparando eventos

sinalizadores tróficos (ZANATA et al., 2002; LOPES et al., 2005). Então, nossa observação

de que tanto o peptídeo hop/STI1230-245 quanto a hop/STI1 inteira perturbam de forma similar

a estrutura secundária da PrP nos leva a sugerir que esta modificação conformacional da PrP

seja o mecanismo molecular chave responsável pela ativação de sinais neurotróficos nessas

preparações. Por outro lado, enquanto a hop/STI1 inteira induz proliferação de culturas

108

celulares de glioblastomas, de forma dependente da PrPC (ERLICH et al., 2007), o peptídeo

hop/STI1230-245 não teve efeito (S. Kahn, R.B. Erlich, L.B.Chiarini, R. Linden, V.R. Martins

and V. Moura-Neto, dados não publicados), sugerindo que para a ativação destes sinais, outros

domínios da hop/STI1, aparte o segmento que liga a PrPC, são necessários. A aproximação

dos domínios TPR2a, TPR2b e DP2 da hop/STI1, disparado pela interação com PrP, levanta a

hipótese de que os domínios C-terminais da hop/STI1 poderiam estar envolvidos nestes sinais

proliferativos.

Em conclusão, as alterações estruturais recíprocas da hop/STI1 e da PrPC aqui

demonstradas constituem um mecanismo versátil que pode ajudar a explicar a variedade de

sinais intracelulares disparados por esta interação. Os dados apresentados neste trabalho são

consistentes tanto com a ideia de que PrPC serve de plataforma dinâmica para complexos

funcionais multiprotéicos compostos de várias combinações de ligantes dependentes do tipo

celular, quanto com a hipótese de que estes complexos multiprotéicos estejam envolvidos na

patogênese das doenças por príons, talvez ao conferir caraterísticas patológicas distintas,

dependendo das combinações específicas de ligantes da PrPC (LINDEN et al., 2008).

109

6. CONCLUSÕES

•••• A formação do complexo PrP:hop/STI1, constituído por uma molécula de cada proteína,

é acompanhada por uma remodelação recíproca das estruturas protéicas.

•••• A estrutura secundária da PrP sofre uma redução no conteúdo de α-hélices após a

ligação tanto da hop/STI1 inteira quanto do peptídeo hop/STI1230-245, enquanto a

estrutura secundária da hop/STI1 parece permanecer inalterada pela interação com PrP.

•••• Tanto o N-terminal da PrP, quanto a α-hélice que cobre o segmento de aa PrP143-153

sofrem perturbações estruturais disparadas pela ligação do peptídeo hop/STI1230-245.

•••• A ligação do peptídeo hop/STI1230-245 pela PrP induz a perturbação e exposição ao

solvente de cavidades hidrofóbicas desta última, enquanto a interação do peptídeo

PrP113-132 com hop/STI1 não parece afetar este tipo de cavidades na hop/STI1.

•••• A hop/STI1 murina é monomérica em solução pH 7.4, e possui uma forma pouco

globular típica de proteínas multidomínio, cujos domínios são ligados flexivelmente.

•••• O complexo PrP:hop/STI1 é mais compacto do que a hop/STI1 livre.

•••• Quando a hop/STI1 liga PrP, a primeira sofre um rearranjo da sua estrutura terciária,

que envolve a compactação do C-terminal desta última, enquanto o N-terminal

permanece globalmente inalterado.

•••• Estas alterações conformacionais provavelmente repercutem sobre a capacidade de

interação com terceiros ligantes, com possíveis efeitos sobre a sinalização celular.

110

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APÉNDICE

Artigo aceito para publicação na revista FASEB Journal

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Reciprocal remodeling upon binding of the Prion Protein to its signaling partner hop/STI1

Sebastián A. Romano*, Yraima Cordeiro†, Luis Maurício T. R. Lima†, Marilene H. Lopes#, Jerson L. Silva‡, Débora Foguel‡, and Rafael Linden*.

*Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, †Faculdade de Farmácia, ‡Instituto de Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, 21941-902, Rio de Janeiro, RJ, Brazil; # Ludwig Institute for Cancer Research, São Paulo, SP, Brazil.

Corresponding author: Rafael Linden, Instituto de Biofísica da UFRJ, CCS, Bloco G, Cidade Universitária, RJ 21941-902, Brazil; E-mail: rlinden@biof.ufrj.br.

Short title: Reciprocal remodeling of PrP and STI1 upon binding

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Abstract

The GPI-anchored prion protein (PrPC), usually associated with neurodegenerative diseases, modulates various cellular responses, and may scaffold multi-protein cell surface signaling complexes. Engagement of PrPC with the secretable co-chaperone hop/STI1 induces neurotrophic transmembrane signals through unknown molecular mechanisms. We addressed whether interaction of PrPC and hop/STI1 entails structural rearrangements relevant for signaling. Using recombinant wild type and mutant mouse proteins and binding peptides, we measured circular dichroism (CD), fluorescence spectroscopy and small angle X-ray scattering (SAXS). PrPC:hop/STI1 interaction triggers loss of PrP helical structures, involving at least a perturbation of the PrP143-153 α-helix, but no secondary structural modification of hop/STI1 was detected. Novel SAXS models revealed a significant C-terminus compaction of hop/STI1 when bound to PrP. Differing from a recent dimeric model of human hop/STI1, both size-exclusion chromatography and SAXS data support a monomeric form of free murine hop/STI1. Changes in the PrP143-153 α-helix may engage the transmembrane signaling proteins Laminin Receptor Precursor and NCAM, both of which bind that domain of PrPC, and further ligands may be engaged by the tertiary structural changes of hop/STI1. These reciprocal structural modifications indicate a versatile mechanism for signaling mediated by PrPC:hop/STI1 interaction, consistent with the hypothesis of PrPC-dependent multi-protein signaling complexes.

Key words: GPI-anchored proteins; multi-protein complexes; structural modifications; trophic signals; SAXS.

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Introduction

The prion protein (PrPC) is a cell surface glycoprotein constitutively expressed in various mammalian tissues, although most abundantly in the central nervous system (1). Conversion of PrPC to an abnormal isoform (PrPSc for prion scrapie), is associated with incurable and invariably fatal neurodegenerative diseases called transmissible spongiform encephalopathies (TSEs) (1,2). However, the physiological role of PrPC remains controversial. Although mice survive both knock out (3,4) and postnatal depletion of PrPC (5), extensive data implicate PrPC in diverse functions, such as the binding of metal ions and protection against oxidative stress, modulation of synaptic transmission and neuronal excitability, cell adhesion and differentiation, signal transduction and control of cell survival. PrPC has, therefore, been attributed a general function as a cell surface platform for the assembly of multi-protein signaling complexes, involved in widespread physiological mechanisms both within and beyond the nervous system (6).

The predominant mature form of PrPC consists of PrP23-231, i.e. residues 23-231, glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored to the extracellular face of the plasma membrane through its carboxyl end. It contains a single disulfide bridge and two sites for N-glycosylation. A flexible, intrinsically unstructured, N-terminus comprises approximately the first 100 amino acids, followed by a globular C-terminal domain rich in α-helices (PrP121-231). The structure of the latter at acidic pH was resolved by nuclear magnetic resonance for various species, including both mouse and human (7,8). A low-resolution SAXS model was also reported for the mouse full-length protein (9).

The search for functional properties of PrPC resulted in the identification of various putative ligands (6,10). Among these, the secretable 66 kDa co-chaperone hop/STI1 (hsp70-hsp90 organizing protein/stress-inducible protein 1) binds PrPC in vivo, through binding sites mapped to within PrP113-128 and hop/STI1230-245 in the mouse (11). Interestingly, mice carrying deletion mutants PrP∆105-125 and PrP∆94-134, which compromise the hop/STI1-binding site in PrPC, present severe and lethal neurodegenerative phenotypes (12,13), suggesting that critical physiological functions of the prion protein depend on this domain.

Hop/STI1 is a 543-residue co-chaperone that modulates the activities of Hsp70 and Hsp90, and may have additional functions (14-16). Despite its mainly cytoplasmic localization, it can be constitutively secreted (14,17), to bind membrane-attached PrPC. Hop/STI1 has nine tetratricopeptide repeats (TPRs), grouped in three globular domains TPR1, TPR2a (the PrPC-binding domain) and TPR2b. The first two of these domains, bound to Hsp90 and Hsc70 peptides, respectively, were crystallized and had their structure resolved (18). Models of these domains represent highly α-helical globular structures that line a canal where binding sequences can lie in an extended form. The protein also has two small domains rich in aspartate-proline repeats, known as DP domains (19) (see Fig. 4A). Recently, SAXS measurements were performed for the full-length human hop/STI1 protein (20).

Binding of PrPC to hop/STI1 produces neuroprotective, neuritogenic and proliferative effects through PKA, Erk and PI3K pathways, respectively (11,14,21,22), among which the activation of MAP kinase pathways was shown to depend on endocytosis (23,24). The molecular mechanisms by which engagement of the GPI-anchored prion protein with an extracellular ligand activates such diverse intracellular pathways remain unknown, but is expected to involve additional transmembrane partners (6). The assembly of such higher

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complexes and the signaling events triggered likely entails and depends on orchestrated cooperative allosteric structural changes that may propagate in the various partner proteins, especially in the case of spatially constrained molecules such as membrane proteins (25,26). Here, using heterologously expressed mouse recombinant proteins, we report a biophysical and structural study of the interaction between the prion protein (PrP) and hop/STI1, aiming at gaining insight into molecular processes involved in its physiological functions. The data suggest a versatile structural basis for the diverse signals activated by interaction of PrPC with its ligand STI1.

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Materials and methods

Materials

Mouse recombinant STI1 (His6-STI1), PrP (His6-PrP) and PrP95-231W98F (His6- PrP95-

231W98F) were purified as previously described (11,27). PrP95-231

W98F was constructed using PCR primers flanking the 95-231 domain. Forward primer was designed for W98F site-directed mutagenesis. cDNA fragments were amplified employing pRSET-A PrP(23-231) (27) with primers (F- 5´CATAATCAGTTTAACAAGCCCAGC3´and R-5’GAGAATTCTCAGCTGGATCTTCTCCCGTC 3’, IDT). The PCR fragments were cloned into BamHI and EcoRI restriction sites in pRSET-A (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Sequencing analysis was performed as a control. Peptides corresponding to mouse STI1 amino acid sequences STI1230-245 (230-ELGNDAYKKKDFDKAL-245) and mouse PrP amino acid sequences PrP113-132 (113-GAAAAGAVVGGLGGYMLGSA-132) were chemically synthesized by Neosystem (NeoMPS, Strasbourg, France) and further purified by reverse-phase HPLC. All reagents used were of analytical grade. All experiments were performed in 50 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7.4 buffers, at 22 oC.

Far-UV Circular Dichroism

All spectra were recorded in a Jasco J-715 spectropolarimeter (Jasco Corporation, Tokyo, Japan) with 0.2 mm path-length cells. All spectra were subtracted from the respective buffer spectra and were collected with 4 accumulations in concentrations of 30 µM for each molecular species present in the sample. Data are presented in the experiment-independent quantity molar ellipticity per residue, [θ] according to

θ[ ]=θ

l ⋅ Ci ⋅ N ii

∑ (1)

where θ is the raw measured ellipticity, ℓ is the optical path-length and Ci and Ni are the

molar concentration and number of peptide bonds in a single molecule of the ith-species present in the sample, respectively. Assuming no change in secondary structure upon complexation (or no binding), the prediction for the [θ] of the complex, [θ]pred, consists of the simple weighted sum

θ[ ]pred

=N i

NT

⋅ θ[ ]ii

∑ (2)

where [θ]i are the [θ] measured for the individual polypeptides that form the complex and NT

is the total number of peptide bonds present in a single molecule of the presumed complex,

i.e. equal to the sum of the individual Ni.

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Fluorescence spectroscopy

All measurements were performed in an ISS-PC1 spectrofluorimeter (ISS, Champaign IL, USA) in “L” geometry. For fluorescence anisotropy measurements PrP was labeled with FITC as previously described (28). Excitation was set at 480 nm, and emission was recorded through a WG3-69 filter (50% cut-off at 520 nm). Dissociation constants (Kd) were calculated according to (29), considering a simple two-state reversible equilibrium PrP + STI1 [PrP:STI1]. For the steady state fluorescence spectroscopy experiments, tryptophan fluorescence of 3-5.5 µM samples was measured by exciting samples at 280, 290 or 295 nm with an 8 nm bandwidth, and emission collected from 300 to 420 nm. As a control, protein aggregation was monitored as a function of light scattering (excitation 320 nm, emission 320 nm). Bis-ANS fluorescence was monitored to obtain information about the folding state of proteins in solution, since this dye is sensitive enough to even detect unstable folding intermediates, such as molten globule states (30). Bis-ANS-containing samples were excited at 360 nm and emission was collected from 400 to 600 nm.

Small-angle X-ray scattering measurements, data analysis and structural reconstructions

SAXS data were collected at the D11A-SAXS1 beamline of the National Synchrotron Light Laboratory, Campinas, Brazil. Scattering intensity curves were recorded using a two-dimensional, position-sensitive MARCCD detector, and samples in a 1-mm thick sample cell with mica windows were irradiated with a monochromatic beam of λ = 1.488 Å, at room temperature. Two sample-to-detector distances were used: 603.8 mm and 1406.8 mm. Following circular averaging, the scattering curves were individually normalized by incident beam intensity and sample absorption and, after merging the resulting curves, the magnitude of the momentum transfer vector q = (4π/λ) sin(θ), where 2θ is the scattering angle, covered a range from 0.012 Å-1 to 0.3 Å-1. Three successive frames of 400 s were recorded. Buffer scattering was subtracted and the obtained curves were carefully inspected to check for possible radiation-induced damage. Concentration dependence was checked by recording the sample scattering patterns at two different concentrations each: the STI1 sample was measured at 4.5 mg/ml and 2.5 mg/ml, and the PrP:STI1 complex was measured in a 1:1 molarity, adding to total concentrations of 4 mg/ml and 2.3 mg/ml. Samples were monodisperse, as evidenced by Guinier analysis (31). The scattering intensities, I(q), were well above background noise and followed Porod's law (31). As a control, molecular-weight calculations were carried out using hen egg lysozyme as standard (not shown). The scattering profiles were fitted using the program GNOM (32), yielding the p(r), Rg and Dmax of the samples. Ab initio particle models were restored using GASBOR (33), which employs simulated annealing to find chain-compatible spatial distributions of dummy residues that fit the experimental scattering patterns. Several runs of ab initio shape determination led to consistent results and the final particle shapes are an average of 10 independent models, performed by DAMAVER (34). The rigid body models were obtained using BUNCH (35), which implements simulated annealing to find the optimal position and orientation of high resolution domain models and flexible linkers, represented by dummy residue chains attached to the appropriate terminal residues. These models use the domains TPR1, TPR2a and PrP121-

231 (PDB codes 1elw, 1elr and 1ag2), along with homology models of TPR2b, DP1 and DP2 calculated by Lomets (36). Since BUNCH handles only one polypeptide chain per calculation, the PrP:STI1 complex was represented as a single chain, by attaching the PrP N-terminus to the C-terminal residue of STI1 (for clarity, the initial 4 residues of PrP N-terminus are not shown in the figures). This procedure did not seem to introduce a serious constraint to

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modeling, due to the 98-residue length of the flexible PrP tail. Furthermore, a contact constraint (maximum 10 Å separation) was imposed for the binding interface of PrP and STI1. For both GASBOR and BUNCH models no particle symmetry was imposed.

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Results

Loss of PrP secondary structure upon binding to STI1

With the use of fluorescence anisotropy, we confirmed that the purified mouse PrP and STI1 recombinant proteins interact with Kd= 161 ± 98 nM (see SI Fig. 1), in agreement with previous results obtained with a different technique, that reported Kd= 140 nM (11), and we also found that the reaction follows a 1:1 binding stoichiometry.

The far-UV circular dichroism (CD) spectrum for an equimolar PrP:STI1 sample did not match the expected residue number-weighted sum of the spectra of the individual proteins predicted by Eq. 2 in Materials and Methods (Fig. 1B). An approximate 5% reduction in CD peak deflection suggested a reduction in the α-helix content of the interacting proteins.

To further investigate this apparent structural modification, we used synthetic peptides containing the binding sites of each protein, namely PrP113-132 and STI1230-245 (11). Since STI1230-245 is capable of activating biological effects through PrPC (11,22), those peptides might be sufficient to mimic the structural effects triggered by the interaction of the native proteins. CD spectra of each molecule showed that the isolated oligopeptides are intrinsically disordered (data not shown). Interestingly, the interaction of PrP and STI1230-245 resulted in an approximate 30% decrease in CD intensity at 208 nm, indicating a significant loss of PrP secondary structure, whereas a negligible, albeit reproducible effect was found of PrP113-132 on STI1 (Fig. 1A). Furthermore, when the measured spectra of the full-length proteins in the peptide-bound conformations (Fig. 1A) were summed (Eq. 2), the result matched exactly the measured spectrum of the PrP:STI1 sample (Fig. 1B), thus confirming the structural change observed for the interaction between PrP and STI1. These data are consistent with the interpretation that the peptides containing the active sites for the PrP:STI1 interaction reproduce, on their cognate proteins, the structural effects observed for the interaction between the full-length proteins, i.e. a partial loss of helical structure, and that this structural modification is particularly strong for PrP. Importantly, these effects are not a byproduct of protein aggregation, since neither Rayleigh scattering measurements (data not shown) nor Guinier analysis of SAXS data (Inset in Fig. 3A) detected any aggregation or higher oligomeric forms in the complex samples. In addition, the lack of a significant effect of the PrP113-132 peptide upon the CD spectrum of STI1 (Fig. 1A) serves as a negative control.

Fluorescence spectroscopy confirms structural rearrangement of PrP upon binding STI1.

To further investigate this conformational change, we applied extrinsic fluorescence spectroscopy using the amphiphilic dye bis-ANS (4,4'-dianilino-1,1'-binaphthyl-5,5'-sulfonate) (37). This dye presents negligible fluorescence when free in aqueous solution; however, the dye significantly increases its fluorescence emission when inserted into structured hydrophobic pockets of proteins that shield it from contact with the solvent. Consequently, bis-ANS fluorescence intensity is a useful tool to monitor the folding state of proteins (30, 38). A bis-ANS:PrP sample presented strong bis-ANS fluorescent emission, which progressively decreased when the sample was titrated with STI1230-245 (Fig 2A). Since the STI1 binding site in PrP, i.e. PrP113-128, is contained within a hydrophobic segment of PrPC, these data could be taken as evidence that STI1230-245 displaces PrP113-128-bound dye (39). However, this is unlikely to explain our observation of an approximate 80% decrease in total fluorescence (Inset in Fig 2A) for two reasons: First, the native PrP113-128 segment is part

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of the solvent-exposed, flexible N-terminus whereas bis-ANS fluorescence is only augmented when inserted into structured hydrophobic patches; And second, because the fluorescence of bis-ANS was not enhanced with respect to the emission of free bis-ANS, by the presence of the hydrophobic peptide PrP113-132 (Inset in Fig 2A) that approaches the conformation of the 113-132 flexible segment of full-length PrP. The data strongly suggest that the interaction of PrP with STI1230-245 results in a disruption of PrP hydrophobic pockets, partially exposing these cavities (and the inserted dye) to the solvent, such as in a partial unfolding event. Consistent with this interpretation, a bis-ANS:STI1 sample titrated with PrP113-132 did not present significant variations in bis-ANS fluorescence (Inset in Fig 2A). Overall, the extrinsic fluorescence data correlate well with the results of the CD experiments above.

When a PrP sample was titrated with STI1, its intrinsic fluorescence emission spectrum excited at 280 nm initially suffered a decay in peak intensity at 344 nm, followed by a subsequent increase in fluorescence signal, and finally stabilized at a 1:1 PrP:STI1 molar ratio at an intensity similar to free PrP, albeit with a robust blue-shift (see SI Fig 2A). These data suggest that the interaction perturbs the environment of fluorescent residues on either protein. However, since both proteins contain abundant aromatic residues, i.e. 8 tryptophans (Trp) and 13 tyrosines (Tyr) in PrP and 1 Trp and 28 Tyr in STI1, it is not possible to assign these effects to any specific residue.

We therefore used the binding-site peptides, which contain only one Tyr each in their sequences. The fluorescence emission spectrum of STI1 is dominated by its numerous Tyr. Setting excitation at 280 nm and titrating the Tyr harboring peptide PrP113-132 on a STI1 sample, an increase in fluorescence emission at 303 nm was observed (see SI Fig 2B). The fact that this increase is larger than the spectrum of the added peptide confirms binding, but since both PrP113-132 and the binding site in STI1 contain one Tyr each, structural conclusions are unwarranted. On the other hand, excitation of PrP at 280 nm resulted in a Trp-dominated spectrum with peak intensity of fluorescence emission at 344 nm (Fig. 2B), indicating a strong contribution of Trp substantially exposed to the solvent, as expected. The fluorescence spectrum intensity decayed drastically as a function of the concentration of peptide STI1230-

245, reaching saturation approximately at an 80% decrease at a 1:1 molar ratio, (Fig 2B). This effect can only be attributed to a structural perturbation of PrP, since the spectral contribution of the STI1 peptide is negligible compared to PrP. An approximate 4 nm blue-shift of the peak intensity was also observed, which indicates that, overall, Trp engage in more apolar interactions as a consequence of peptide binding.

The multiplicity of Trp in PrP precludes site-specific information regarding the effect of the interaction of full-length PrP and STI1230-245. However, all but one Trp are contained within the N-terminal unstructured domain of PrP. We, therefore, constructed a PrP mutant with a partial N-terminal deletion plus a site mutation W98F. This PrP95-231

W98F mutant preserves the binding site for STI1 and contains a single Trp at position 144, within the first α-helix of PrP. In order to excite this Trp selectively, we set excitation at 295 nm, at the cost of loosing total fluorescence intenstity. The resulting spectrum had a maximum intensity at 343 nm, as expected for Trp in a solvent-exposed α-helix. Interestingly, STI1230-245 induced a significant perturbation in the first α-helix of PrP95-231

W98F, as shown by the gradual decay in the fluorescence emission of Trp144 upon peptide titration, once again reaching saturation at 1:1 molar ratio (Fig 2C). Due to spectral broadening, wavelengths of maximum emission were difficult to determine, thus we were not able to detect shifts in maximal emission. The observed effect did not seem to fully account for the changes in wild-type PrP. Still, the data show that the interaction of PrP with the peptide containing the binding site from STI1

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produces an important structural modification in PrP, which involves both the unstructured N-terminal tail and a loosening of its globular domain, affecting at least the α-helix PrP143-153. Data gathered with excitation at 290 nm produced similar results (not shown). The data are again consistent with the results of the CD experiments, which suggested a partial unwinding of PrP α-helical structures (Fig 1A). As a control, monitoring of elastic Rayleigh scattering of all the samples at 320 nm showed no evidence of aggregation (data not shown).

SAXS models uncover tertiary structural rearrangements on STI1 upon binding PrP

SAXS measurements were made to obtain information on the size and shape of both STI1 and the PrP:STI1 complex in solution (40). The scattering profiles are shown in Fig. 3A. Linear least squares fitting of Guinier plots (31) (Inset in Fig. 3A) were done in the region of small scattering vector, q, i.e. q<Rg

-1, where Rg is the molecular radius of gyration. These plots confirmed the monodispersity of the samples, and indicated a Rg of 58.34 ± 1.71 Å for STI1 and 53.26 ± 1.72 Å for PrP:STI1. Fitting the experimental data through indirect Fourier transformation methods using the program GNOM (32) (Fig. 3A) allowed an estimate of the maximum molecular diameter of the samples, Dmax, which were 198 Å and 162 Å for STI1 and the PrP:STI1 complex, respectively. This analysis also leads to the pair distance distribution functions, p(r) (Fig. 3B), which provided an Rg of 60.24±0.2 Å for STI1 and 52.26±0.15 Å for the PrP:STI1 complex, in agreement with the results obtained by Guinier plots (see Table 1 for a summary of structural parameters). Size exclusion high-performance liquid chromatography (SE-HPLC) using both TSK-gel 3000SW and Superdex 200 columns and native polyacrylamide gel electrophoresis of our STI1 samples suggest an elongated, non-globular, monomeric protein, with rare higher oligomeric forms (SI Figs 3-4). Interestingly, when compared with free STI1, SE-HPLC measurements seem to indicate that PrP:STI1 samples elute as having a smaller Stokes radius, and thus diffuse through the column as a particle with a lower molecular weight (SI Fig 2 and Table 1), which would support the compaction event suggested by SAXS experiments. However, this evidence is not conclusive, because, at near neutral pH, free PrP tends to elute in multiple peaks with poor reproducibility, which likely explains the rarity of studies showing SE-HPLC data of either wild-type or truncated PrP in native form, usually replaced by proteins either treated with urea or at an acid pH (41, 42). Notwithstanding, comparing the forward scattering values, I(0), of the obtained sample with that of lysozyme samples further supports the monomeric form of STI1 and suggests that the PrP:STI1 complex is formed by one molecule of PrP and one of STI1 (Table 1). Moreover, the calculated p(r) of both STI1 and PrP:STI1 are characteristic of elongated structures (Fig. 3B), and Kratky plots (31) suggest multi-domain extended conformations (Inset in Fig. 3B). These initial analyses indicate that both STI1 and the PrP:STI1 complex are non-globular, elongated proteins, the former monomeric and the latter formed by one molecule of each species. Interestingly, the data indicate that binding of PrP to STI1 entails significant structural compaction, despite the presence of the N-terminal flexible domain of PrP.

To gain further insight into the structural assembly of STI1 and the PrP:STI1 complex, we reconstructed low-resolution ab initio models using the GASBOR software, consisting of chain-compatible spatial distributions of dummy residues that fit the experimental scattering patterns (32). A set of these models was produced and averaged (33), resulting in volumetric models that represent the shape of the molecules. In addition, we carried out rigid body modeling of the full-length molecules using the BUNCH software (35). As an approximation, we used for the latter models the high-resolution structures of TPR1, TPR2a (18) and the C-terminal globular domain of PrP (7), along with the homology models for TPR2b, DP1 and DP2 obtained using the structure prediction server Lomets (36). The domains were linked

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with dummy residue flexible chains, and the experimental data was fitted. For the complex model, a proximity constraint was imposed between the binding sites of the proteins. Fitting results for the ab initio volumetric and full-length rigid body models are presented in Fig 3A, and the models of STI1 and PrP:STI1 in Figs 4B and 4C, respectively. Importantly, for both molecules both types of models agreed well.

The results depict mouse STI1 as a monomeric elongated protein, which undergoes compaction when binding PrP in 1:1 stoichiometry. Aligning the model of STI1 in the PrP-binding conformation to the free STI1 model (Fig 5) clearly indicates that the C-terminal part of STI1 encompassing the TPR2a, TPR2b and DP2 domains clusters together. This is the result of the approximation of DP2 and TPR2a (the PrP-binding domain) to TPR2b, which are otherwise outward oriented in the free STI1 model.

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Discussion

Structural changes in either PrPC or STI1 upon binding are likely of biological relevance, since these modifications may either expose or hide putative binding sites for the assembly of higher-order protein complexes at the cell surface (6). Using a variety of techniques, we assessed the impact of PrP:STI1 binding at both local and secondary-structure levels. Our data suggest that this interaction triggers a structural rearrangement of the N-terminal tail of PrP, plus partial unfolding of the C-terminal globular domain in the form of a loosening of PrP α-helical structures, involving at least the first α-helix PrP143-153. Importantly, the effect of the peptide containing the binding site of STI1 showed that these modifications can be triggered by local interactions at the STI1-binding domain located at the junction of the flexible tail with the first α-helix of PrP. This suggests that such interactions unleash a series of structural perturbations that propagate into the PrP globular domain, without involvement of further STI1 domains. This type of docking-triggered, long-range structural change has been observed in various signaling molecules, and constitutes a structural basis for allosteric regulation (43). Indeed, it was recently shown that long-range, sequentially distant interactions affect local structure features in PrP (44). Moreover, a previous nuclear magnetic resonance (NMR) study assessed the impact of a PrP flexible N-terminus segment in the structure of its globular domain. The NMR models obtained showed that this partial tail alters the structure of the folded domain, and concluded that the PrP113-125 glycine-enriched hydrophobic sequence (covering almost entirely the STI1 binding site), although flexible, seems to present a marginally stable polymorphic structure that is involved in long-range interactions that stabilize extended conformations of PrP α-helices at the globular domain (45). Truncation of this segment renders a PrP globular domain with shorter α-helices. These data are consistent with our observation that engagement of PrP113-128 with either STI1230-245 or full-length STI1, results in a diminished content of α-helical structures in PrP, since this engagement would disrupt critical long-range interactions needed to stabilize such structures.

Our SAXS data indicate that mouse STI1 is a monomeric, elongated protein. In contrast, STI1 dimers have been reported in previous studies using yeast STI1 (46,47) and the human homologue hop (19,20). However, the yeast protein has only ~40% homology to mouse STI1 used in the present study. Further, the human protein, despite its ~97% homology to mouse STI1, differs from the latter in residues T243K, K250R, and Y269H within the TPR2a dimerization domain, and residue 269 lies exactly at the dimerization interface suggested in (20). In one study (19) data supporting hop dimerization consisted only of an elution volume that corresponded to a globular protein of 120 kDa in SE-HPLC, that is lower than the elution volume of the dimeric globular bovine serum albumin. In fact, 14 point mutations covering all hop domains failed to affect elution volume. Those data are, thus, also consistent with a monomeric, elongated protein. Importantly, the only study addressing the oligomeric state of mouse STI1 using SE-HPLC and chemical cross-linking of various purified versions of the protein found monomeric forms for 2 out of 3 versions (48). Our results of SE-HPLC (using Superdex-200 and TSK-gel 3000SW columns), native PAGE and SAXS, all support that His-tagged mouse STI1 is present in a monomeric form, with much less abundant higher oligomeric sates, in agreement with (48).

SAXS data further showed that the PrP:STI1 complex is more compact than STI1 alone. Calibration with molecular weight standards supports a 1:1 molar binding stoichiometry for the complex. Novel, congruent SAXS volumetric and rigid-body models

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picture STI1 as an extended, beads-on-a-string-like protein, and the complex presents a similar, more compact, shape. The model of the complex is also consistent with a 1:1 binding stoichiometry, and suggests that PrP binding triggers a significant structural modification of STI1 as a result of the approximation of TPR2a, TPR2b and DP2 domains, leaving the overall organization of the N-terminal part of the molecule (including TPR1 and DP1 domains) largely unmodified.

The binding between PrPC and STI1 activates multiple and parallel signaling pathways (11,14,21,22), but the mechanisms involved are not established. Since none of these proteins possess any transmembrane domain, it is tempting to postulate that binding modifies their affinities for transmembrane ligands that can mediate the signaling events (6). Evidence that the binding of STI1 produces structural rearrangement, notably a loss of α-helical content in the first α-helix of the globular domain of PrPC, is of particular relevance. This helix contains the binding sites of two of the best-characterized PrP ligands, namely the laminin receptor precursor (49) and N-CAM (50), both of which are transmembrane proteins involved in either PrPC-mediated signaling or PrPSc-mediated cytopathology. On the other hand, hop/STI1 is known to be an adaptor protein that coordinates the dynamic assembly of the chaperone hsp90:hop:hsp70 complex. The formation of this complex is accompanied by conformational modifications, and the initial binding of hsp90 to hop results in alteration of the number of hop:hsp70 binding sites and a 5-fold enhancement of hop affinity for hsp70 (51). We speculate that, in analogy to the hsp90:hop:hsp70 mechanism, the observed changes in the tertiary structure of STI1 triggered by the interaction with PrPC may alter the affinity of STI1 for its own ligands. Moreover, proteins with multiple TPR domains, such as hop/STI1, have been associated with the assembly of multiprotein complexes, serving as structural platform capable of multiple interactions and catalyzing diverse biological processes (52). Hence, the PrPC-binding triggered approximation of TPR2a, TPR2b and DP2 domains of STI1 may bring together its ligands, therefore facilitating further interactions with biological consequences.

Previous work on murine retinal explants and cultures of hippocampal neurons showed that STI1230-45 is capable of mimicking the effect of full-length STI1, engaging PrPC at the cellular surface and triggering signaling events with trophic consequences (11,22). Then, our observation that either STI1230-245 or full-length STI1 perturb the secondary structure of PrP to the same degree leads us to suggest that this structural modification of PrP is the key molecular mechanism responsible for triggering the neurotrophic signaling events in those preparations. On the other hand, whereas full-length STI1 induces PrPC-dependent proliferation of glioblastoma cell cultures (14), STI1230-245 had no effect (S. Kahn, R.B. Erlich, L.B.Chiarini, R. Linden, V.R. Martins and V. Moura-Neto, unpublished observations), which suggests that domains of STI1 apart from the PrP-binding segment are necessary for activating the underlying signals. The clustering of TPR2a, TPR2b and DP2 domains of STI1, triggered by PrP-binding, raises the hypothesis that the STI1 C-terminal domains may be involved in the latter proliferation signals.

In summary, reciprocal structural modifications of STI1 and PrPC constitute a versatile mechanism that may help explain the variety of intracellular signals triggered upon their binding. The data shown here are consistent with both the idea that PrPC dynamically scaffolds multi-protein functional complexes composed of various, cell type-specific combinations of ligands (6), as well as with the hypothesis that such multi-protein complexes may be involved in the pathogenesis of prion diseases, perhaps by imparting distinct pathological characteristics depending on specific combinations of PrP ligands.

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Acknowledgements

We thank Dr. Tomas S. Plivelic, Dr. Fernando Q. Reis and Dr. Lucas Sanfelici for excellent technical assistance with he LNLS beamline, and Talita M. Oliveira for assistance on purification of STI1. This research was supported by Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES); Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq #472741/2007-1, #486489/2006-0, #420036/2005-9, #410554/2006-5, #151567/2004-2, #480986/2004-5, #420015/2005-1, #472174/2007-0; IMBEBB # 42.0120/2005-0); Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro Carlos Chagas Filho (FAPERJ APQ1-E-26/170.406/2006, PRONEX and CNE Programs) and Brazillian Synchrotron Light Laboratory (LNLS; D11A-SAS1 7690/08).

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Figure Legends

Fig. 1. Unfolding of PrP triggered when binding either STI1 or STI1230-245. (A) CD spectra of measured (blue line) and predicted (red line) equimolar sample of STI1:PrP113-132, shown along with the measured (green line) and predicted (black line) spectra of an equimolar sample of PrP:STI1230-245. (B) CD spectra of measured (blue line) and predicted (green line) equimolar sample of PrP:STI1, along with the spectrum predicted for an equimolar mixture of PrP and STI1 in the peptide-bound conformations (red line). The spectra for these conformations were obtained by subtracting the respective peptide contributions from the spectra measured in (A).

Fig. 2. Fluorescence spectroscopy supports structural rearrangement of PrP when binding STI1230-245. (A) Bis-ANS emission spectra of a bis-ANS:PrP:STI1230-245 at the 2:1:0 (black solid line), 2:1:0.25 (green solid line), 2:1:0.5 (blue solid line), 2:1:1 (red solid line) molar ratios. Free bis-ANS (gray solid line) and bis-ANS:STI1230-245 (dashed gray line) showed similar fluorescence emission. All spectra were normalized by the maximum emission of the bis-ANS:PrP 2:1 sample, i.e., 41863. Excitation was set as 360 nm. Inset: bis-ANS relative 500 nm fluorescence emission during titration of STI1230-245 on a bis-ANS:PrP sample (dotted black solid line), and titration of PrP113-132 on a bis-ANS:STI1 sample (dotted red solid line). As a reference, we show: the 500 nm fluorescence emission of free bis-ANS (gray solid line) and bis-ANS:STI1230-245 (dashed black line), both relative to the bis-ANS:PrP emission; the 500 nm emission of free bis-ANS (pink solid line) and bis-ANS:PrP113-132 (dashed red line), both relative to the bis-ANS:STI1 emission. Data are presented as a function of the molar ratios of STI1230-245:PrP and PrP113-132:STI1, respectively. (B) Emission spectra of 2 µM free PrP (black solid line), and PrP:STI1230-245 samples at 2:0.5 (orange solid line), 2:1 (green solid line) and 2:2 (red solid line) µM concentrations. The spectrum of 2 µM free STI1230-245 (cyan solid line) is also presented. To demonstrate the saturation of the effect, we also present the spectra obtained by subtracting the spectral emission of 2 µM free STI1230-245 from the emission of a 2:4 µM PrP:STI1230-245 sample, in order to subtract the contribution from the excess peptide (blue solid line). All spectra were normalized by the maximum intensity of the free PrP spectrum, i.e. 71230. Excitation was set at 280 nm. Inset: Relative area of the spectra obtained during this STI1230-245 titration, as a function of the STI1230-245:PrP molar ratio (dotted black solid line). (C) Same as in (B) but replacing PrP with PrP95-231

W98F at a 5.5 µM concentration, exciting at 295 nm and normalizing by the maximum intensity of the free PrP95-231

W98F spectrum, i.e. 32940.

Fig. 3. SAXS data suggests structural compaction as a consequence of STI1:PrP complex formation. (A) Measured scattered intensity for STI1 (red dots) and an equimolar sample of PrP:STI1 (blue dots), along with the corresponding GNOM fits (green lines) and BUNCH fits (black lines). Inset: linear fits to Guinier plots. STI1 and PrP:STI1 in red an blue dots, respectively. (B) Pair distance distribution, p(r), calculated by GNOM, for STI1 (red line) and the PrP:STI1 complex (blue line). Inset: Kratky plots for STI1 (red dots) and PrP:STI1 (blue dots). The scattering intensities at 0 angle of both samples were matched before calculation of the Kratky plot to allow comparisons.

Fig. 4. SAXS models of STI1 and PrP:STI1. (A) Schematic representation of the sequences of STI1 (top row) and PrP (bottom row). Globular domains are highlighted as boxes and flexible segments as lines. (B) and (C) BUNCH rigid body models (top row) and superposition of these models with GASBOR volumetric models represented as gray spheres (bottom row).

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Three model visualizations are presented in each row, where the second and third ones (from left to right) are 90o successive rotations of the first representation. Domain and flexible linker colors are as in (A). The binding sites PrP113-132 and STI1230-245 are highlighted in red. (B) Models for STI1. (C) Models for PrP:STI1.

Fig. 5. Alignment of free STI1 (blue) and STI1 in the PrP-bound conformation (red) BUNCH models (PrP omitted for clarity).

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Table 1. Summary of obtained structural parameters.

Molecule Molecular

weight by SE-

HPLC (kDa)

Molecular weight

by I(0) (kDa)

Molecular

weight by

sequence (kDa)

Rg (Å)

(Guinier)

Rg (Å)

(GNOM)

Dmax

(Å)

STI1 108 72 66 58.34±1.71 60.24±0.2 198

STI1:PrP 97? 87 89 53.26±1.72 52.26±0.1 162

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Fig. SI 1. Fluorescence anisotropy of 50 nM FITC-labeled PrP in a total pool of 2 µM PrP titrated with STI1 (black dots). Curve was fitted considering a simple two-state reversible equilibrium between PrP and STI1, PrP + STI1 [PrP:STI1], as explained in (45). The obtained dissociation constant, Kd, was 161 ± 98 nM, in agreement with previous results obtained with a distinct technique (11). The curve saturates approximately at 2 µM of STI1, indicating a 1:1 binding stoichiometry. Excitation was set at 480 nm and emission was recorded through an orange short wave cut-off filter WG3-69 (50% cut-off at 520 nm). The graph shows the results of one representative experiment. Fig. SI 2. Fluorescence spectroscopy of STI1:PrP and STI1:PrP113-132. (A) Emission fluorescence spectra of 2 µM free PrP (solid black line), STI1:PrP at 0.5:2 (dashed line) and 2:2 (dotted line) µM concentrations, and spectrum of 2 µM free STI1 (gray solid line). All spectra were normalized to peak intensity of free PrP sample. Excitation set at 280 nm. (B) Emission fluorescence spectra of 4 µM free STI1 (solid black line) and STI1:PrP113-132 at a 4:4 µM concentration (dashed line). Spectrum of free PrP113-132 at 4 µM (gray solid line). Excitation set at 280 nm. Fig. SI 3. Evaluation of the oligomerization state of STI1 and PrP:STI1. SE-HPLC with TSK-gel 3000SW column of STI1 4.5 mg/ml (black solid line) and PrP:STI1 4 mg/ml (gray solid line) samples. The molecules eluted with a hydrodynamic radius equivalent to a globular protein of 108 kDa and 97 kDa, respectively. The vertical dashed line indicates the elution volume of a globular bovine serum albumin (BSA) dimer of 132 kDa. We obtained similar results using a Superdex-200 column. Inset: Calibration of the TSK-gel 3000SW column, highlighting the elution of STI1 as a gray dot. Fig. SI 4. STI1 is populated mainly as a monomeric species. 8% polyacrylamide gel electrophoresis of STI1 in native sample buffer (left lane) and in denaturing sample buffer (right lane). The gel, running buffer and native sample buffer did not contain any denaturing agents; the denaturing sample buffer contained 1% β-mercaptoethanol and 0.5% sodium dodecyl sulfate. Samples were not boiled.

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