SEGMENTAÇÃO AUTOMÁTICA DE BACTÉRIAS PARA OMÉTODO DEFT

P. Demantova*, D. G. Sakamoto**, S. O. Ioshii**, H. R. Gamba**Centro Federal de Educação Tecnológica do Paraná – CEFET-PR

Av. 7 de setembro 3165, 80230-901 Curitiba PR Brasil demantov@daeln.cefetpr.br**Pontifícia Universidade Católica do Paraná

RESUMOEste trabalho apresenta uma nova técnica parasegmentação automática de bactérias em imagens obtidascom o método DEFT. O algoritmo desenvolvido estábaseado em predicados estabelecidos a partir de umminucioso estudo realizado em 54 imagens deepifluorescência. A partir das componentes de cores e deuma matriz de desvio padrão estabeleceram-se osparâmetros necessários para a seleção de todas as regiõesda imagem que contém as bactérias. Cada região é entãolimiarizada individualmente utilizando-se o algoritmo deKapur. Os excelentes resultados obtidos com o algoritmodemonstram a sua aplicabilidade na automatização doprocesso de enumeração de bactérias pelo método DEFT.

Palavras chaves: DEFT, leite, bactérias, processamentode imagens.

1. INTRODUÇÃO

Vários autores têm proposto diferentes métodos paraautomatização ou semi-automatização do processo deanálise de bactérias em leite [1][2][3]. Estes métodosutilizam placas de Petri como meio de cultura para odesenvolvimento das chamadas unidades formadoras decolônias (UFC). A principal vantagem desse processo é asua simplicidade em termos de equipamentos e, porconseguinte, o custo. Entretanto, trata-se de um processoque requer de 2 a 3 dias para a obtenção do resultado daanálise. Portanto, esse procedimento está mais restrito aoacompanhamento do que ao controle da qualidade do leitedisponibilizado para consumo.O uso de microscópio para contagem direta de bactérias éum técnica atraente, principalmente por permitirquantificação das bactérias em menos de 1 hora. Contudo,as principais desvantagens do método são a baixasensibilidade, a fadiga do operador após prolongado usodo microscópio e a dificuldade de diferenciação entreresíduos e bactérias [4] [5].Neste trabalho propõe-se uma nova metodologia baseadaem processamento digital de imagens para a enumeraçãodas bactérias presentes no leite. Para a visualização dasbactérias utilizou-se o método de filtragem commembrana de policarbonato combinado com microscopiade imunofluorescência (Direct epifluorescent filtertechnique-DEFT) [4]. As principais vantagens dessemétodo são a alta sensibilidade, a classificação embactérias viáveis e inviáveis e o tempo de análise (menorque 25 minutos) [5].

2. METODOLOGIA

No método DEFT os microorganismos são coletados emuma membrana filtrante de 0,8µm e então contadosvisualmente com auxílio de um microscópio deimunofluorescência com epi-iluminador. Para tornarpossível esta análise utiliza-se o corante alaranjado deacridina o qual se liga ao DNA e RNA bacteriano,produzindo fluorescência verde para bactérias inviáveisou vermelho-alaranjada para bactérias viáveis.Resumidamente, na técnica DEFT, uma amostra de 2mlde leite é tratada com 2ml de surfactante triton X-100 a0,1% e 0,5ml de enzima tripsina, a uma temperaturaconstante de 50oC, durante 10 minutos. Em seguida asolução é depositada em uma unidade filtrante a vácuo(pressão negativa contolada em 100 kPa) e filtrada comuma membrana policarbonada de 0,8µm (Millipore,USA). O surfactante e a enzima são previamenteesterilizados por meio de filtragem com membrana defiltro de 0,22µm (Millipore, USA). Após o processo defiltração, a membrana é lavada com solução tampão decitrato 0,1M e corada com alaranjado de acridina a0,025% por 2 minutos. Após lavagem com tampão citratoa membrana é fixada com álcool isopropílico e analisadaem um microscópio de imunofluorescência OlympusBHT, equipado com sistema de epi-iluminação comlâmpada de mercúrio (Olympus, Tokyo, Japan).Inicialmente as imagens microscópicas das membranasfiltrantes foram registradas em filmes fotográficos paradiapositivos coloridos (Elitechrome, ISSO 100/21o),numa magnificação de 1000 vezes. Os comprimentos deonda de excitação e fluorescência foram selecionados comfiltros BP470-490 e BA515, respectivamente. Apósrevelação dos diapositivos, as imagens foram digitalizadascom scanner de mesa HP6053C (Hawlet-Packard, USA),na resolução de 600 dpi e 256 níveis de cores.A figura 1 apresenta uma das imagens registradas com ométodo DEFT. As principais características destasimagens, as quais definem os predicados para aenumeração e classificação das bactérias, são:

• As regiões do fundo da imagem e das bactériasapresentam intensidade, cor (níveis de cinzaequivalentes) e textura homogêneas.

• As regiões contendo bactérias apresentam os maioresníveis de intensidade nos canais de cor vermelha everde, com ausência da cor azul.

Fig. 1. – Imagem obtida pelo método DEFT, digitalizada com resoluçãode 600 dpi e 256 cores níveis de cores.

• Há um predomínio da área do fundocomparativamente à área ocupada pelas bactérias.

• O tamanho mínimo das bactérias é 0,8µm (diâmetroda porosidade da membrana de filtro), e partículasmenores são consideradas ruídos inerentes aoprocesso DEFT.

• Nas transições entre o nível de fundo e as bactériasocorrem variações nos componentes de cor e/ou naintensidade dos pixels na imagem equivalente emníveis de cinza.

Com base nestas características implementou-se oalgoritmo para a enumeração e classificação das bactériasilustrado na figura 2.Conforme a figura 2 o algoritmo implementado divide-senuma fase de pré-processamento, onde selecionam-setodas regiões que possuem bactérias inscritas, e outra fasede segmentação onde processam-se as regiõesselecionadas. Durante a fase de pré-processamentoelimina-se a componente azul da imagem e, com umamatriz de convolução 11 por 11, calcula-se uma matrizdesvio padrão. Na matriz de desvio padrão as transiçõesentre fundo e bactéria apresentam elementos com maiorvalor se comparados aos que pertencem às regiões defundo.A partir do histograma da matriz de desvio padrão obtém-se o valor de maior probabilidade. Este valor, juntamentecom os maiores valores de probabilidade nos histogramados canais verde (G) e vermelho (R), é usado na pré-segmentação para selecionar os pixels pertencentes àsregiões de fundo da imagem.O resultado da pré-segmentação fornece as regiões ondeas bactérias estão inscritas. A figura 3 ilustra umaseqüência de segmentação. A figura 3(a) mostra uma área(65 linhas por 62 colunas), selecionada de uma imagem,contendo uma bactéria. A figura 3(b) é o resultado da pré-segmentação, onde tornaram-se em preto os pixels quesatisfizeram os predicados descritos no parágrafo anterior.A figura 3(c) foi obtida limiarizando-se a figura 3(b).Uma operação de abertura elimina ruídos devido aresíduos de corantes próximos à bactéria, como mostradona figura 3(d). A seguir, a bactéria tem seus pixelsagrupados e rotulados pelo processo de etiquetagem [7].

A figura 4 ilustra o processo de seleção das coordenadas,a partir da figura 3(d), que delimitam a região

(quadrilátero) que contém a bactéria. Esse procedimento énecessário para reduzir o número de pixels de fundo,facilitando o processo de limiarização automática. Estaregião é ilustrada na figura 3(e) (36 linhas por 42colunas).Finalmente, selecionadas as regiões que contém bactérias,utilizou-se o processo de limiarização automática Kapur[8], figura 3(f).

Fig. 2. Diagrama em blocos do algoritmo desenvolvido para asegmentação automática de imagens do DEFT.

Fig. 3. Ilustração de uma sequência de segmentação

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

Imagemde

epifluorescência

Canal G

Canal R

Matrizdesviopadrão

HistogramaCanal R e G

Pré-Segmentação

Histograma

Abertura

Etiquetagem Segmentação

Limiarização Etiquetagem

Levantamentode Parâmetros

ContagemFinal

Pré-segmentação

Segmentação

Fig. 4. Ilustração do processo de seleção da região que contém abactéria. (a) Figura 3(d) ampliada com a identificação das coordenadasextremas. (b) Coordenadas do quadrilátero que contém a bacteria.Legenda: dir: direita, esq: esquerda, sup: superior, inf: inferior.

3. RESULTADOS

A figura 5(a) e (b) ilustram, respectivamente, osresultados do processo de segmentação e limiarizaçãoautomática da figura 1.

Fig. 5. Resultado do processo de segmentação e limiarizaçãoautomática. (a) imagem segmentada. (b) imagem limiarizada

Foram analisadas 54 imagens obtidas pelo método DEFT.Todas as imagens foram segmentadas com o algoritmodescrito e efetuou-se uma comparação visual de cadaimagem. Deste total somente 6 imagens apresentaramresultados não satisfatórios. Em 3 imagens a bactéria nãosegmentada apresentava baixa fluorescência,caracterizando-a como inativa e portanto não interferindonos resultados do DEFT. Em uma das imagens havia umamancha, segmentada como bactéria, a qual foi causadapela presença de corante na parede da membrana depolicarbonato. Nas demais houve falha na implementaçãodo método DEFT, gerando regiões de fundo nãohomogêneas.A boa capacidade de adaptação do algoritmo a ruídos defundo, devido a ruídos causados por corantes, é mostradana figura 6.

Fig. 6. Resultado do processo de segmentação e limiarização automáticapara uma imagem com alto índice de ruído de fundo. (a) imagemoriginal. (b) imagem segmentada. (c) imagem limiarizada

(a)

(b)

(x_sup,y_esq)

(x_esq,y_esq)(x_dir,y_dir)

(x_inf,y_inf)

(x_inf,y_dir)

(x_sup,y_sup)

(b)

(c)

(a)

4. CONCLUSÃO

Os resultados obtidos demonstram que o algoritmodesenvolvido é capaz de automaticamente segmentar e,desta forma, enumerar as bactérias visualizadas pelométodo DEFT, sem a intervenção do operador.Portanto, o algoritmo apresentado pode ser parteintegrante de um sistema para automatizar a análise daqualidade do leite, evitando assim erros causados pelafadiga do operador.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem ao Prof. M.Sc. JeffersonOsowsky pelo apoio técnico na implementação dasrotinas de processamento de imagens.

Este trabalho foi financiado pela FINEP, convênio64.99.0297.00, pela Laktron Industria MetalúrgicaLtda e recebeu o apoio técnico do Laboratório Citolab– Laboratório de Citologia Clínica e HistopatologiaLtda.

REFERÊNCIA

[1] M. R. Garcia-armesto, m. Prieto, m. L. Garcia-lópez, a. Oteroand o. B. Moreno, “Modern microbiological methods forfoods: Colony count and direct count methods. A review”,Microbiologia Sem, vol. 9, pp:1-13, 1993

[2] G. Corkidi, R. Diaz-Uribe, J. L. Folch-Mallol and J. Nieto-Sotelo, “COVASIAM: na Image Analysis Method that AllowsDetection of Confluent Microbial Colonies and Colonies ofVarious Sizes for Automated Counting”, Applied andEnviromental Microbiology, vol. 64(4), pp:1400-1404, 1998.

[3] J. Osowsky and H. R. Gamba, “Sistema Automático paraContagem de Colônias em Placas de Petri”, Anais do XVIICongresso de Engenharia Biomédica, pp: 1204-1208, 2000.

[4] G. L. Pettipher, “The DEFT for the rapid enumeration ofbacteria in milk”, Dairy Industries Internacional, vol. 5(48),pp:21-26, 1983.

[5] A. Dasen, C. Piton, E. Bevvier and R. Grappin, “Numérationdes cellules somatiques du lait cru par la technique DEFTassociée à un comptage visual ou par analyse d’image”, Lait.No. 69, pp:461-477, 1989.

[6] C. P. Champagne, N. J. Gardner, J. Fontaine and J. Richard,“Determination of viable bacterial populations in raw milkwithin 20 minutes by using direct epifluorescent filtertchnique”, Journal of Food Protection, vol. 60(7), pp: 874-876, 1997.

[7] R. C. Gonzales, P. Wintz, “Digital Image Processing”, NewYork, Addison-Wesley Publishing Company, 1987.

[8] J. R. Parker, “Algorithms dor Image Processing and ComputerVision”Wiley Computer Publishing, 1997.

AUTOMATIC BACTERIA SEGMENTATIONFOR THE DEFT METHOD

ABSTRACT

A new technique to automatically segment and enumerate bacteria visualized with the DEFT method ispresented. The developed algorithm is based on a study carefully carried out on 54 epifluorescent images.From the colour components and the matrix with standard deviation values of the intensity image theparameters to select only the regions with the bacterias were established. Each selected region is processedindependently with the Kapur algorithm. The successful results obtained with the developed algorithm havedemonstrated its applicability to automatically enumerate bacteria in the DEFT method.