• Seleção de sementes das melhores plantas e de seus cruzamentos espontâneos

• 1983 - primeira planta transgênica com gene codificante para a resistência contra o antibiótico canamicina introduzido em plantas de fumo

• Inserção direta de um gene de interesse• Genes da própria espécie, de outras

espécies ou sintéticos

• Agrobacterium tumefaciens• Bombardeamento

• Conhecimento da Cultura• Bioinformática• Clonagem• Microbiologia• Definição do método de transformação• Cultura de tecidos vegetais• Biologia molecular

• Definição do gene de interesse• Estudo dos sítios de restrição• Desenho de primers

• Inserção do gene em vetores de expressão

• Adição de promotores• Inserção dos vetores

• Fácil inserção do gene

• Genes de seleção

• Crescimento bacteriano– Seleção de colônias transformadas – Replicação do DNA

• Avaliação da inserção por digestão enzimática

• Crescimento bacteriano– Seleção de colônias transformadas – Replicação do DNA

• Avaliação da inserção por digestão enzimática

• Crescimento bacteriano– Seleção de colônias transformadas – Replicação do DNA

• Avaliação da inserção por digestão enzimática

• Via eletroporação• Choque térmico

• Sequenciamento

• Escolha de explantes• Protocolo de regeneração– Uso de reguladores vegetais para

regeneração de plantas– Regenerar a célula transformada em uma

planta completa transformada

• Contato entre explante e A. tumefaciens transformada.

• Cultura conjunta por poucos dias de planta e bactéria, sem antibióticos – disco foliares

• Partículas de ouro ou tungstênio recobertas pelo vetor de transformação

• Vetor de aproximadamente 15Kb • Bombardeador de alta pressão de gás

Helio

• Cultivo em meio com antibiótico – Canamicina • Seleção de brotações adventícias transformadas

– Cefotaxima• Eliminação de A. tumefaciens

• Expressão transiente• PCR

• Southern Blot• Western Blot• qPCR• RT-PCR