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Seminários do MIM

Unidade curricular de infecciosas

Vítor Manuel Jorge Duque

Introdução

Partícula e genoma VIH-1

gp120

gp41

p17

Capsídeo p24

TI

ARN

MHC

Dupla

camada

lipídica

Matriz

Envelope

Envelopegp105

gp36

Matrix p15

Capsídeo p26

TI

ARN

MHC

Camada

lipídica

vpx

vpr

Partícula e genoma VIH-2

Infecção VIH - métodos laboratoriais

Fauci et al. Ann Intern Med 1996;124:654-663

Métodos indirectos

MÉTODOS DIRECTOS

— CULTURA VÍRICA

— DETECÇÃO DE ác. NUCLEICOS - PCR, bDNA, NASBA

— ANTIGENÉMIA p24

MÉTODOS INDIRECTOS

— MÉTODOS DE RASTREIO

— MÉTODOS DE CONFIRMAÇÃO


MÉTODOS DE RASTREIO

ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assays)

Métodos rápidos

Métodos simples

MÉTODOS DE CONFIRMAÇÃO OU SUPLEMENTARES

Western Blot

Imunofluorescência indirecta (IFA)

Line Immunoassay


MÉTODOS INDIRECTOS

RASTREIO

Detectam todos os indivíduos infectados

Alta sensibilidade (99,9%)

Falsos negativos (0,03 a 0,001%)

CONFIRMATÓRIOS

Identificam todos os não infectados com teste de rastreio positivo

Alta especificidade (99,94%)

Falsos positivos (0,0004 a 0,0007%)


FORMATO DOS TESTES

Microplaca

Esferas

Microesferas

Tiras de papel

Tiras de plástico

SISTEMAS INDICADORES

Produção de cor

Inibição da cor

Radioactividade

Fluorescência

Quimioluminescência


SISTEMAS ELISA

Indirecto

Competitivo

Sandwich de acs

Sandwich de ags

Captura de acs específicos

PLATAFORMAS

Manual

Semi-automatizado

Automatização total


CLASSIFICAÇÃO:(fonte de antigénio e formato)

1ª Geração — lisados víricos

— culturas em linhas humanas de linfócitos T

2ª Geração — ags recombinantes expressos em sistemas

— bacterianos ou fúngicos

— oligopeptídeos sintéticos (15-20 aa)

3º Geração — ags recombinantes ou sintéticos

— em formato de sandwich

4º Geração — detecção simultânea de ags e acs


ANTIGÉNIOS DE LISADO VÍRICO

sensibilidade baixa

especificidade baixa (amostras de África)

contaminantes celulares - locus HLA

falsos positivos se anticorpos anti - HLA

exposição a leucócitos

durante a gravidez

transfusões sanguíneas


ANTIGÉNIOS RECOMBINANTES

antigénios produzidos em grande quantidade

único produto vírico produzido

usados em combinação

alta sensibilidade

alta especificidade

contaminantes provenientes do veículo

alguns falsos positivos


ANTIGÉNIOS DE PEPTÍDEOS SINTÉTICOS

sequência de aa conhecida

sintetizador de peptídeos

escolha de porções (epitopos) de antigénios

cadeia de 10-40 aa

isoladamente ou em combinação

menos reacções cruzadas

maior especificidade (confirmação da infecção VIH)

maior grau de pureza

ausência de contaminantes

desvantagens - sensibilidade

- ags não glicosilados


TESTES DE RASTREIO

Detecção por ELISA

MÉTODO INDIRECTO

Ags ligados a microplaca ou esfera

Incubação com a amostra - 30’ a 37 - 40ºC

Lavagem

Incubação com o conjugado - 30’ a 37 - 40ºC

Lavagem

Incubação com substrato

Leitura em espectrofotómetro


TESTES DE RASTREIO

Detecção por ELISA

MÉTODO SANDWICH

Ags ligados a microplaca ou esfera

Sandwich de ag-ac-ag marcado

Vantagens:

Método mais sensível

Todas as classes de acs são detectadas

Detecção de acs anti VIH-1 e VIH-2

Isoladamente ou em combinação


ELISA para a detecção de anticorpos anti-VIH

Microplaca para pesquisa de anticorpos anti-VIH por ELISA:

poços coloridos indicam reactividade

Após várias etapas de incubação e de lavagem, há desenvolvimento de

reacção colorimétrica na presença de anticorpos específicos contra o VIH

Resultados

Positivo

Negativo

Enzyme ImmunoAssays (EIAs)

MÉTODOS DE CONFIRMAÇÃO

Western blotMétodo padrão para a validação dos resultados

Ags de VIH obtidos por lisado de cultura

Separação por electroforese em gel de poliacrilamida

Transferência (blot) para nitrocelulose

Tiras com bandas de antigénios

Amostra - diluída 1/50 a 1/100

Identificação de Acs - método indirecto

Padrão de bandas típico para o VIH

gp160, gp120, p66, p55, p51, gp41, p31, p24, p17, p15


Western blot para a pesquisa de

anticorpos anti-VIH-1

• Há critérios diferentes para a

interpretação dos resultados do

Western blot para HIV ex.:

CDC, WHO, American Red

Cross.

• As bandas de positividade de

anticorpos mais importantes

são contra as glicoproteínas do

envelope gp120, gp160 e gp41

• O anticorpo anti-p24 está

habitualmente presente mas

pode estar ausente nas fases

tardias da infecção VIH

FDA 3 bandas: p24, p31, e gp41

ARC 1 banda de cada gene estrutural (gag, pol e env)

CDC 2 bandas das seguintes: p24, gp41 e gp120/160

CRSS 1 banda do core (gag ou pol) e outra do env

OMS 2 bandas do envelope

CNTS/PEI 2 bandas, uma delas do envelope

ARC - American Red Cross

CRSS - Consortium for Retrovirus Serology Standardization

CNTS/PEI - Centre National de Transfusion Sanguine

Western blot

Resultado positivo:



Western blot

Resultado negativo: ausência de todas as bandas

OMS - banda p17 fraco (sem seguimento posterior)

Resultado indeterminado: não positivo – reactividade para 1 ou mais bandas

ocorre em 15% dos indivíduos não infectados

bandas fracas mais frequentes (gag) p17, p24 e/ou p55

não prediz uma infecção precoce

sugerem infecção precoce — p24, p31 e p55

banda do envelope isolada (seguimento - OMS)



Métodos de rastreio:ELISA para VIH-2

ELISA combinado VIH-1/VIH-2

Métodos de confirmação:

Western blot para VIH-2 ou Combinado VIH-1/VIH-2Resultado positivo:

OMS — reactividade para dois ags do envelope

Outros — reactividade p26 (gag), gp34 ou gp105 (env)

RIPA (Radioimmunoprecipitation assay)método de investigação (rigor técnico)

necessita de material radioactivo


Métodos directos

Células primárias

Linfócitos T varia com o dador

CD4 purificados ausência de CD8+, isolamento

Monócitos

Linhas celulares T

Jurkat presença de marcadores celulares

CEM variantes diversas

Sup-T1 expressão de CD4+ e CD8+

MOLT-4 muito citopática e fusogénica

HUT-78/H9 fusogénica

MT-4 infectada por HTLV-1. Citopática

Linhas celulares monocíticas

HL-60 susceptível à infecção, por contacto

U937 moderadamente citopática

THP-1 muito citopática


Métodos de cultura celular

Cultura qualitativa

Cultura quantitativa

PCR (Polymerase chain reaction)

1 – Recém-nascidos de mães infectadas pelo VIH-1

PCR DNA e/ou RT-PCR RNA

2 – Rastreio de dádivas de sangue

3 – Diagnóstico precoce da infecção primária VIH-1

4 – Padrão serológico indeterminado

Subtipos não-B


PCR negativa em indivíduos com teste VIH-1 positivo

Transmissão passiva (materno-fetal) Positivo verdadeiro

Mutações críticas na região analisada Problema da PCR

Presença errática da sequência estudada

Baixa sensibilidade da análise

Erro técnico Problema do laboratório

Anticorpos com reactividade cruzada:

lúpus,

fibrose quística, Positivo falso

vacina da gripe,

transfusões


2

Dias

Infecção Aguda

3 4 57

Semanas

14 24

Infecção Estabelecida

NAT (10 a 12 dias)

P24 (16 dias)

4ª geração

3ª geração (22 dias)

WB

EIA

CD4+

Acs anti-VIH

Viremia

Eliminação Genital

Estratégias e algoritmos de

diagnóstico

Algoritmo padrão

Rastreio com ELISA Resultado negativo

Resultado positivo

Repetir ELISA em duplicado

Testes confirmatórios


Infecção HIV perinatal

18 meses 18 meses

ELISA Serologia IgGNÃO É ÚTIL

+–

WB

–

+

Ind

Algoritmo de diagnóstico

Métodos rápidos de diagnóstico

Efectuados em menos de 30 minutos (CDC)/ 15 minutos (OMS)

Tão precisos, mas mais caros (ELISA e Aglutinação)

Erros são comuns (imprecisão técnica)

“dot blot” ou “immunoblot” - HIVCHEK (Ortho)

Fase sólida - nitrocelulose, com Ags absorvido (blotted)

Dispositivo plástico com almofadas

Indicador colorido (tinta) - ouro coloidal e proteína A

Métodos de captura - SUDS (Murex)

Micropartículas revestidas de antigénio

Incorporadas em membrana

Indicador colorimétrico

“Dot” de controlo positivo

Podem diferenciar HIV-1 do HIV-2 (2 “dots”)

INFECÇÃO VIH – MÉTODOS RÁPIDOS

INFECÇÃO VIH – MÉTODOS SIMPLES

Tempo de execução > 30 minutosNão necessitam de instrumentação

São testes de aglutinação de partículasPartículas revestidas de ag - hemácias, látex ou gelatinaResultado positivo - aglutinação visível

— Hemaglutinação passiva

— Aglutinação pelo látex — Teste de aglutinação particulada

controle de qualidadecondições de controle de temperatura

Reativo ou “Positivo”

• Banda teste

• Banda de controlo

Não Reativo ou “Negativo”

• Banda de controlo isolada

Inválido

• Não há banda de controlo

• Teste não válido. Repetir com novo dispositivo

Resultados possíveis


Colheita e transporte de amostras

Amostras usadas em métodos

rápidos

• Sangue total

• Soro

• Plasma

• Saliva

• Urina

Colheita de sangue – por punção

venosa


Capillus HIV-1/HIV-2

1. Preparação do material e

reagentes necessários2. Marcação do dispositivo

com a identificação do doente

3. Colocar a lâmina contra a placa de

interpretação. Verificar que a lâmina está na

posição correcta.

4. Homogeneizar o reagente contendo o latex 5. Recolher o latex até à marca de calibração.

Evitar aspirar bolhas de ar.

6. Colocar o reagente no poço de mistura,

afastado do canal capilar.

Não tocar na lâmina com a pipeta.

7. Colher 10 µl de sangue com uma ponta de pipeta

descartável usando a pipeta pré-calibrada.

9. Homogeneizar a mistura de amostra e

latex (3x). Agitação circular (5X).

10. Iniciar o fluxo capilar colocando a mistura

na abertura do canal usando a pipeta.

8. Segure a pipeta sobre o poço e coloque

a amostra directamente sobre a

solução de latex.

11. Permitir que a mistura de latex

escorra pelo canal e atinja a janela

de observação (cerca de 3-7 min.)

antes da leitura dos resultados.

12. Ler e registar os resultados na

folha de trabalho.

Reativo

Não-

reativo

1. Preparar os reagentes e

restante material necessário

2. Colocar o suporte numa superfície

plana e nivelada.

Remover o dispositivo da

embalagem e marcar o dispositivo e

a “developer vial” com o número

de identificação da amostra.

3. Cuidadosamente destape a

“developer vial” e coloque-a no

suporte.

4. Colher cerca de 5 µl da

amostra com uma ansa

descartável.

4. Usar a ponta almofadada do dispositivo

teste para colher a amostra esfregando

uma vez a superfície exterior das gengivas

inferiores e superiores.

5. Transferir a amostra colhida para o

frasco. 6. Agitar a amostra no frasco com a ansa.

OraQuick: transferência da amostra

7. Inserir a almofada do dispositivo completamente no frasco

com a janela dos resultados voltada para o observador.

OraQuick: Inserir o dispositivo teste no frasco

tampão

8. Encubar 20 minutos (não superior a

40 min.) antes da leitura dos resultados.

9. Ler e registar os resultados

na folha de trabalho.

OraQuick: Obtenção de resultados

Reativo InválidoNão-reativo

OraQuick: Interpretação

Reativo InválidoNão-reativo

Teste 1 Teste 2 Teste 3 Status VIH

Não-reativo Não-reativo Negativo

Reativo Reativo Positivo

Não-reativo Reativo Não-reativo Negativo

Reativo Não-reativo Não-reativo Negativo

Não-reativo Reativo Reativo Positivo

Reativo Não-reativo Reativo Positivo

Modelos para aconselhamento e

teste VIH

Teste e aconselhamento voluntário, de iniciativa do cliente Limitações:

• Baixa cobertura dos serviços

• Medo do estigma e descriminação

• Não percepção do risco

Teste e aconselhamento de iniciativa do fornecedor de

cuidados de saúde Objectivos:

• Aumentar o número de indivíduos testados para VIH

• Melhorar o acesso aos serviços de saúde para os indivíduos que vivem com a

infecção VIH

• Criar novas oportunidades de prevenção

Todos os indivíduos observados em unidades de saúde em locais de

epidemia generalizada (zonas onde a epidemia está estabelecida na

população: prevalência consistentemente > 1% na grávida).

Populações seleccionadas e indivíduos com indicações clínicas para VIH

em epidemias concentradas (prevalência >5% numa subpopulação

definida, mas <1% na grávida em zonas urbanas).

Populações seleccionadas e indivíduos com indicações clínicas para VIH

em epidemias de baixa prevalência (presença de infecção VIH durante

muitos anos mas que nunca disseminou para níveis substanciais em

qualquer subpopulação).

WHO. Guidance on provider-initiated HIV testing and counselling in health facilities.

http://www.who.int/hiv/pub/vct/pitc/en/index.html. Acedido em 28 de Novembro de 2010

Palfreeman A, Fisher M, Ong E on behalf of the HIV Testing Guidelines Writing Committee. Testing for HIV: concise guidance.

Clinical Medicine 2009;9 (5):471-6

Os métodos indirectos (ELISA e Western blot) são o padrão para o diagnóstico da infecção VIH quando utilizados de forma sequencial.

Os métodos moleculares têm indicação no diagnóstico precoce da infecção VIH-1 (síndroma vírica aguda e transmissão vertical) e em algumas situações particulares (alternativa aos métodos suplementares).

Vários métodos rápidos têm sido desenvolvidos com o objectivo de rastrear a infecção VIH e permitir em simultâneo o aconselhamento pré e pós-teste.

Métodos rápidos de diagnóstico podem ser utilizados no diagnóstico da infecção VIH mas ainda sem um algoritmo claramente definido.

Os objectivos são o de permitir o acesso universal à prevenção, cuidados de saúde e ao tratamento consistente com as declarações da OMS (Millenium development goal 6) e UNAIDS.

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