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Resumo

Se destacan estrategias experimentales y teóricas para la interpretación de los espectros de masas, con base en el establecimiento de relaciones entre ciertos rasgos estructurales y la fragmentación que experimentan las moléculas como resultado del proceso de ionización. Se discuten casos típicos sobre la detección de grupos funcionales y sustituyentes en las moléculas estudiadas, con base en la identificación de señales espectrales características y de pérdidas de fragmentos típicos.

Scientia Chromatographica Vol.2, N°2, 23-46, 2010Instituto Internacional de CromatografiaISSN 1984-4433

Separar, fragmentar e integrar: la rutina de un análisis por GC-MS. Patrones de fragmentación de

moléculas orgánicas

Elena E. Stashenko*, Jairo René Martínez

Universidad Industrial de Santander, Escuela de QuímicaCentro de Investigación de Excelencia, CENIVAM, Laboratorio de Cromatografía. Bucaramanga,

Colombia

Palavras-chave

GC-MS; Impacto de electrones; Fragmentación; Reordenamiento; Espectros de masas.

Abstract

Various experimental and theoretical strategies for mass spectral interpretation are presented. These are based on establishment of relationships between the presence of certain structural features and the fragmentation that molecules could experience after their ionization. Typical cases are illustrated in which functional groups and substituents are detected in the studied molecules, based on the identification of characteristic spectral signals and typical neutral mass losses.

*e-mail: [email protected]

Keywords

GC-MS; Electron impact; Fragmentation; Rearrangement; Mass spectra.

GC-MS

24 www.scientiachromatographica.com

1 Introducción

La espectrometría de masas (MS) es una de las técnicas analíticas que se usa -en conjunto con otros métodos instrumentales (UV-Vis, IR, NMR, Rayos X, etc.)1,2-, para establecer la estructura química, masa molecular y la composición elemental de moléculas, en su gran mayoría, orgánicas o bioorgánicas (biopolimeros). También existen técnicas especiales de MS para el análisis de moléculas inorgánicas3,4, pero éstas son menos empleadas que las utilizadas para analizar compuestos orgánicos (naturales o sintéticos) o biomoléculas5,6, en el quehacer diario de un químico, en la mayoría de laboratorios analíticos instrumentales. Todas las técnicas de MS modernas se pueden dividir grosso modo en dos grupos grandes, según la naturaleza química y la masa molecular de la molécula analizada, así: (1) MS de moléculas volatilizables, con masas moleculares bajas o medianas (hasta 450 Da), termoestables y moderadamente polares y (2) MS de moléculas no volátiles, polares o de alto peso molecular (e.g., proteínas, polisacáridos). Las primeras permiten analizar (ionizar) las sustancias en fase vapor, mientras que los espectros de masas de las moléculas “pesadas”, inestables térmicamente o muy polares (aminoácidos, sacáridos, ácidos nucléicos) – se obtienen en fase condensada, líquida o sólida.

Es mucho más amplio y más sofisticado técnicamente el abanico de métodos de ionización de moléculas con peso molecular alto (e.g., proteínas, nucleótidos, polisacáridos, etc.), moléculas muy polares (e.g., aminoácidos, azúcares, glucósidos, vitaminas, pesticidas polares, etc.) o sustancias termoinestables7-9. La ionización de moléculas pesadas o muy polares, por regla general, sucede paralelamente o inmediatamente después de su desorción desde la superficie, donde éstas se encuentran distribuidas “bidimensionalmente” como una especie de “solución”, en un disolvente muy poco volátil; generalmente se añaden modificadores, promotores de la polarización previa de moléculas, o simplemente se hallan como “incrustaciones” en un sólido10-12. La desorción desde la superficie e ionización de moléculas suceden prácticamente simultáneamente: se generan diversos iones primarios

y secundarios; este proceso lo pueden provocar diferentes agentes, por ejemplo, átomos acelerados (FAB, por sus siglas en inglés, bombardeo con átomos acelerados)13, iones acelerados (SIMS, por sus siglas en inglés, espectrometría de iones secundarios)14 o fotones de alta energía (una de las versiones es el método MALDI, la desorción/ionización por láser asistida por la matriz, según las siglas en inglés)15-17, que inciden sobre el portamuestra que alberga la sustancia problema en una matriz apropiadamente preparada.

Algunos métodos especiales de ionización se usan en las técnicas tándem, i.e., en el acoplamiento de cromatografía líquida (LC) con la espectrometría de masas, LC-MS18-20, donde la muestra líquida se nebuliza en diferentes interfaces, asistida por el efecto de la temperatura y el potencial eléctrico alto, por ejemplo, en los métodos de thermospray (TSI)21, electrospray (ESI)22, 23 o de ionización química a presión atmosférica (APCI)24,25; se forman especies ionizadas, moléculas con protonación múltiple, clústeres, entre otros iones generados por distintos mecanismos que conducen a su formación.

A pesar de la transcendental importancia (en la era de la genómica y la proteómica)26 que revisten hoy en día las técnicas de MS de macromoléculas, de especies moleculares muy polares o de sustancias no volátiles, se mantiene un interés constante y bien enfocado sobre las moléculas con masas moleculares relativamente bajas o medianas (de hasta ca. 400 Da), de volatilidad alta o mediana (temperaturas de ebullición menores de 300-350 °C) y termoestables, ya que éstas forman parte de los contaminantes ambientales y de sustancias de control presentes en el medio (aire, aguas, suelo)27. Son componentes de alimentos28, productos de uso frecuente por el hombre (sabores, aromatizantes, fragancias, aditivos, antioxidantes, productos de aseo, etc.), figuran entre feromonas29, aleloquímicos, plaguicidas30-32, biorreguladores, metabolitos secundarios en plantas33-35, residuos de explosivos36,37 y acelerantes de incendios38, drogas39 y productos de su metabolismo, y miles de otras moléculas de interés científico, objetos de control regulatorio, de interés comercial o técnico. Muchas de estas sustancias se encuentran en mezclas complejas (gasolina, perfume, extracto de una planta,

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vegetal o fruta, aromas de café, cacao, frituras, compuestos orgánicos volátiles en aire o agua, VOC, plaguicidas, etc.), muchas a nivel de trazas (ppb, ppt), y es imposible obtener la información sobre su identidad (in situ, directamente en la mezcla) por métodos distintos a los de la espectrometría de masas (EI, CI), o por su acoplamiento con cromatografía de gases (GC). La separación de las mezclas por GC-MS sucede en una columna capilar insertada directamente en la fuente de iones, donde las moléculas ingresan y se fragmentan después de su ionización. Las columnas GC que más frecuentemente se utilizan en GC-MS son de fases estacionarias apolar (DB-1, HP-1, Ultra 1, DB-5, HP-5, Ultra 2, otras) o polar (DB-WAX, Innowax, otras), según el tipo de la muestra a analizar; también se calculan los índices de retención que permiten complementar la información espectral sobre la identidad molecular40.

2 Ionización de moléculas en fase vapor

La ionización de las moléculas en fase vapor puede hacerse por diferentes técnicas. Entre ellas, figuran la ionización por electrones (EI), ionización química (CI) o la ionización por campo (FI); la fotoionización (PI) se utiliza cuando se necesita medir los potenciales de ionización (IP) o de aparición (AP) de moléculas o iones, debido a que PI permite hacer estas mediciones con mayor precisión (± 0.01-0.05 eV) que las logradas por la EI (± 0.1-0.2 eV). Obtener fotones, con la misma energía, i.e., monocromáticos, es técnicamente un poco más sencillo que realizar un proceso de monoenergetización de los electrones, aunque el método de fotoionización es menos sensible que la ionización con electrones. Los potenciales de ionización (IP) de moléculas orgánicas yacen en el intervalo de 7-13 eV y dependen de la estructura y del tipo de electrones (σ, π, n) que la molécula posee.

La técnica más común de ionización de moléculas “pequeñas” (más de 90% de aplicaciones) es el impacto con electrones, mientras que la ionización química de iones positivos (PICI) o de iones negativos (NICI) es su importante complemento analítico y se usa cuando en los espectros obtenidos

por la EI no se registran iones moleculares, debido a que su tiempo de vida es mucho más corto que el requerido para su detección41,42. Cuando se necesita conocer el peso molecular de la sustancia, éste se deduce de los espectros de CI con base en la masa de un ion molecular protonado, MH+ [o deprotonado (M-H)-, para NICI], junto con los iones-clúster, formados generalmente por la adición electrofílica de iones secundarios de gases reactantes (metano, amoníaco, iso-butano, etc.). Ambos métodos, la ionización por electrones y la ionización química se usan en la técnica de acoplamiento de cromatografía de gases (GC) con la espectrometría de masas (MS). Infortunadamente, el uso de CI requiere, por general, el cambio de volumen iónico (cámara de ionización), ya que las presiones residuales que se utilizan en la CI son mucho más altas (hasta 1 mm Hg) que las usadas en la EI (10-5-10-7 Torr).

En realidad, menos del 10% de todas las sustancias en el planeta pueden ser ionizadas en fase vapor, por EI o CI, ya que el proceso de ionización por estas técnicas tiene como una gran limitación la volatilidad baja o la inestabilidad térmica de muchas sustancias orgánicas. La volatilización es una etapa previa a la ionización por EI o por CI; los dos procesos son separados tanto en tiempo, como en espacio. La separación de iones en la técnica GC-MS puede ocurrir prácticamente en todos los tipos de analizadores másicos, e.g., trampas iónicas (IT)43,44, cuadrupolos (Q)45, analizadores de deflexión magnética46 y, hoy en día, para la configuración GC x GC47-49, los de tiempo de vuelo (TOF, time-of-flight, por sus siglas en inglés)50, así como se usan las configuraciones de varios analizadores en tándem (por ejemplo, QqQ, triple cuadrupolo51).

3 Formación de iones en el espectro de masas

Durante la interpretación de los resultados obtenidos por GC-MS, surge la necesidad de poder descifrar -con alto grado de confiabilidad-, y establecer las estructuras moleculares de las sustancias presentes en mezclas complejas, ya que no siempre se encuentran todas


las sustancias-patrón certificadas, necesarias para realizar la identificación por comparación de sus tiempos o índices de retención y espectros de masas. A menudo es imposible hacer el reconocimiento de las estructuras químicas solo por la comparación de sus espectros de masas con los de las bases de datos disponibles comercialmente (NIST, WILEY, bibliotecas especializadas), ya que éstas no poseen todos los compuestos que eventualmente pueden hallarse en una mezcla real. En este caso, hay que acudir a una interpretación “manual” de los espectros de masas experimentales, o sea, analizar los patrones de fragmentación o las reacciones monomoleculares de disociación de moléculas ionizadas por EI y sus iones-fragmento, con el propósito de elucidar la estructura molecular original52-55. Tanto los iones-fragmento típicos, como los patrones de fragmentación característicos, son la base experimental para la elucidación de estructuras

moleculares.El aspecto de un espectro de masas (corrientes

iónicas parciales, i.e., intensidades) de una molécula orgánica, obtenido por EI, depende de varios factores. Entre ellos, figuran los siguientes: (1) Naturaleza química de la molécula; (2) Energía de los electrones bombardeantes (Figura 1); (3) Tiempo de vuelo del ion desde la cámara de ionización -atravesando el analizador-, hacía el detector; (4) Presión residual en el instrumento; y, fundamentalmente, (5) Energía interna del ion antes de su fragmentación, fortaleza del enlace que se rompe y la energía de activación requerida para formar un ion filial (Figura 2). Obviamente, los factores intrínsecos, cualitativos o propios de una molécula orgánica, que determinan el aspecto de su espectro de masas son su estructura y la energía interna (energía de excitación) que ésta obtiene durante la ionización.

Figura 1. Cambios en los espectros de masas de la acetilacetona obtenidos por impacto de electrones con diferentes energías (10 y 70 eV).


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La energía interna (de excitación) de iones moleculares, E, se puede representar por la curva de distribución A, donde P (E) es la fracción de iones con una energía interna E determinada; la curva B corresponde a la dependencia de log K de la E, donde K es la constante de disociación del ion-padre por una de las posibles coordenadas de la reacción monomolecular de su fragmentación. Iones moleculares (Mo

+.) con el rango de energías internas I son estables, la probabilidad de su fragmentación es cero. La disociación de un ion-padre (iones moleculares M1

+.) puede iniciarse cuando su energía interna E supera a la energía de activación Ea de la reacción de descomposición (rangos II-IV). En una primera aproximación, Ea ≈ [AP – IP], donde IP es el potencial de ionización de la molécula y AP es el potencial de aparición de un ion-hijo. Los iones moleculares que se forman en la cámara de ionización perduran usualmente en ésta unos 10-6 s, mientras que alcanzan el detector -después de haber pasado el analizador-, en unos 10-4-10-5 s. Esto último sí depende de la configuración del equipo de masas (tipo de analizador). Si un ion molecular vive menos de 10-6 s, o sea, su log K es mayor de 6, solo serán detectados los productos de su disociación. A estos iones moleculares corresponde el intervalo de energías internas IV. Los iones con energías internas en el rango II, aunque poseen energías ligeramente superiores a la Ea, su velocidad de fragmentación es muy baja y éstos pueden experimentar disociación después de pasar el analizador, entrando ya al detector; por ende, formalmente, se registrarán como iones precursores. El tiempo de vida t de iones que corresponde al rango de energías III se encuentra en un intervalo 10-6 s < t < 10-4 s, o sea, éstos se fragmentan fuera de la cámara de ionización, pero antes de entrar al analizador. Son los llamados iones metaestables (Figura 2), m*, aunque históricamente así se designó a sus productos formados fuera de la fuente de iones; los iones metaestables se registran con la masa aparente (m* = m2

2/m1, donde m1 y m2 corresponden a las masas de los iones-padre e iones-hijo, respectivamente)56. Su registro en un espectro de masas es de suma importancia, ya que permiten relacionar los iones-fragmento con sus progenitores. Generalmente, los iones

metaestables más intensos acompañan los procesos de reordenamiento (transposición) y no de ruptura simple de un enlace. El estudio de iones metaestables se lleva a cabo en equipos de masas de doble enfoque; existen diferentes métodos de su registro, estudio (DADI, MIKES)57 y de cálculo de la energía liberada durante su formación (por la anchura del pico metaestable). Las configuraciones de equipos de masas tándem -en parte-, reemplazan la “necesidad” de iones metaestables, ya que permiten también estudiar las relaciones filiales (“genéticas”) entre los iones58,59.

El usuario de la espectrometría de masas, al inicio, interpretando los espectros de masas, se pregunta por qué los iones moleculares con la misma estructura pueden generar varios y muy distintos productos y pueden fragmentarse por rutas paralelas, competitivas. El tipo y la relación (abundancias) en un espectro de masas de iones-hijo, iones-padre y iones metaestables es función de los siguientes factores: (1) distribución de energías internas de iones moleculares que se forman (válido también para iones-fragmento con exceso de energías que luego también se disocian) (Figura 3A), (2) energía de activación del proceso de su fragmentación, Ea, y (3) pendiente de la curva de log K (Figura 3B). Procesos de reordenamiento (o de transposición) a menudo se acompañan de la formación de iones metaestables intensos y los iones-producto de reordenamiento a menudo alcanzan a “sobrevivir” en espectros de masas de bajo voltaje (10-15 eV), ya que las energías Ea para su formación, por lo general, son más bajas que las requeridas para los procesos de una ruptura simple. Entre más pendiente es la curva de log K, menos iones metaestables se observarán en el espectro de masas correspondientes a esta coordenada de reacción de fragmentación en particular –y, lo más probable-, este proceso será de ruptura simple (Figura 4).

En consecuencia, la estructura de la molécula, la energía en exceso que ésta adquiere durante su ionización, las energías de activación de posibles procesos de su disociación y los factores de frecuencia de enlaces involucrados en rupturas son variables que determinarán el patrón de fragmentación de una molécula y toda la gama de iones-producto que se registrarán en su espectro de masas.


Figura 2. Los iones metaestables presentes en un espectro de masas, se registran con masas aparentes m*, relacionadas con masas de iones-hijo (m2) e iones-padre (m1) por m* = m2

2/m1. La anchura de la señal del ion metaestable en el espectro refleja la energía liberada durante su formación.

Figura 3. Curvas hipotéticas de: (A) distribución por energía interna (excitación) de iones moleculares y (B) dependencia de la velocidad de fragmentación (logK) de un ion molecular de su energía interna (E). Ea - Energía de activación; IP – Potencial de ionización; AP – Potencial de aparición de un ion-fragmento.


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Figura 4. Curvas hipotéticas de la dependencia de log K de la energía interna (E) de iones moleculares, que se disocian en competencia con formación de distintos productos. Estos procesos (a, b, c) se caracterizan por diferentes energías de activación y factores de frecuencia de los enlaces que se rompen. Los iones moleculares se fragmentarán inicialmente por la ruta a, ya que la energía de activación de este proceso es más baja. Las zonas reteñidas representan rangos de energías internas de iones moleculares correspondientes a las transiciones metaestables. Entre más pendiente es la curva, menor número de iones m* se forma y el proceso, lo más probable, será una ruptura simple (curva b). La concentración de iones-fragmento que se generan por la ruta c será baja, ya que la Ea de este proceso es alta y su constante de velocidad es baja.

4 Patrones de fragmentación

El patrón de fragmentación (m/z y la cantidad, I%, de iones que se registran en un espectro de masas) refleja el modo de cómo se disocia una molécula ionizada –y, ello, no acontece al azar-, ya que se deriva de su estructura molecular (naturaleza de átomos enlazados, fortaleza de enlaces químicos), su disposición espacial, potencial de ionización y la energía interna que adquiere durante su colisión con un electrón. El patrón de fragmentación es único para cada estructura molecular y reviste diferencias claramente detectables (a menudo solo cuantitativas), inclusive para los isómeros (de posición, geométricos o estereoisómeros). En

la Figura 5 aparecen espectros de masas de los cuatro isómeros, cis-hexatrieno y trans-hexatrieno; 1,3-ciclohexadieno y 1,4-ciclohexadieno. A pesar de una notoria similitud cualitativa de sus espectros, éstos descubren diferencias cuantitativas distinguibles, en cuanto a la intensidad de sus iones moleculares e intensidades relativas de los iones-fragmento. Hay una pérdida sucesiva de átomos de hidrógeno a partir de iones moleculares de todas las moléculas y aparición de fragmentos en m/z 79, 78, 77, lo que ilustra una tendencia a la aromatización (estabilización) tanto en ciclos (Figuras 5C y 5D), como en moléculas poliinsaturadas ionizadas (Figuras 5A y 5B), que pueden reordenarse en ciclos.


Figura 5. Espectros de masas (EI, 70 eV) de los isómeros: A. cis-Hexatrieno; B. trans-Hexatrieno; C 1,3-Ciclohexadieno; D. 1,4-Ciclohexadieno. (Tomado de: P.J. Linstrom and W.G. Mallard (Eds.), NIST Chemistry WebBook, NIST Standard Reference Database, National Institute of Standards and Technology, Gaithersburg MD).


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El espectro de masas de cada compuesto es un “mundo” de detalles (iones, que se forman con diferentes m/z, y sus intensidades, I%), es característico y no repetible entre diferentes moléculas, es como su huella digital: no hay dos sustancias que tengan espectros de masas absolutamente idénticos. Además, el número de señales que se observan en un espectro de masas supera con creces al de las registradas en los espectros de UV-Vis, IR o NMR, lo que los hace muy confiables para la identificación molecular. Es posible estudiar los espectros de masas obtenidos por EI, compararlos y clasificarlos usando diferentes aproximaciones, entre ellas, las siguientes: (1) por grupos o familias de sustancias químicas y, entre éstas, por series homólogas, i.e., hidrocarburos (lineales, ramificados, cíclicos, olefinas, aromáticos, etc.), alcoholes (primarios, secundarios, terciarios, aromáticos), aldehídos, ácidos, nitrilos, esteroides, terpenos, etc., o (2) por tipo de reacción de fragmentación (e.g., ruptura alílica o bencílica, reordenamientos de esqueleto, transposiciones de hidrógeno, etc.). La misma reacción de disociación puede manifestarse en los espectros de masas de distintas familias de compuestos. Ello sucede, cuando un elemento estructural común está presente y condiciona precisamente este tipo de fragmentación. La ocurrencia de cada nuevo grupo funcional va a impartir un rasgo típico y común en los espectros de masas de sustancias que pertenecen a la misma familia, mientras que la presencia de varios grupos funcionales en una molécula dada, se manifestará no solamente a través de fragmentaciones típicas para cada grupo individual, sino también a través de procesos de disociación nuevos, únicos, generados por la combinación de diferentes funcionalidades en la molécula. El espectro de masas permite obtener información sobre: (1) Masa molecular: si no se registra un ion molecular en el espectro de EI, es necesario obtener su espectro de ionización “suave”, e.g., CI, pero, a veces, se puede acudir a la derivatización de la molécula60, para poder hallar su masa molecular y también para aumentar su volatilidad (la del derivado) y la sensibilidad con que ésta se puede detectar (Figura 6); (2) Composición elemental: se logra conocer con base en el espectro

de masas obtenido en un espectrómetro de masas de alta resolución (por ejemplo, analizadores de masas de doble enfoque, de tiempo de vuelo, TOF, o de resonancia ion-ciclotrónica); análisis de iones isotópicos o las pérdidas de fragmentos típicos (-HCN, -CO, -OH, -HS, -NH2, etc.), que también permiten hacer deducciones sobre la composición elemental de la sustancia; el caso más sencillo es la presencia de átomos de Cl o Br en la molécula (Figura 7); (3) Grupos funcionales en la molécula se pueden elucidar por el registro en el espectro de iones con masas características, que indican su presencia, e.g., de fenilo (m/z 77), bencilo (m/z 91), benzoilo, C6H5CO, (m/z 105), o por la detección de fragmentos, productos de pérdida de moléculas neutras pequeñas, e.g., de agua, CO2, CO, C2H2, HCN, de radicales alquilo (CH3, C2H5, C3H7, etc.); estos iones-fragmento están relacionados con la presencia de estos grupos estructurales en la molécula; (4) Estructura espacial: a menudo se logra con base en el espectro de masas establecer también la configuración espacial, sobre todo, cuando se pueden comparar los espectros de ambos estereoisómeros o cuando se usan espectros de masas de bajo voltaje (10-20 eV) o de ionización química, que permiten observar más nítidamente las diferencias de energías conformacionales (entalpías de formación) con base en las diferencias de intensidades de iones-fragmento característicos o potenciales de ionización. En la Figura 8 se observan espectros de masas de dos isómeros constitutivos (M+., m/z 150), cuyas estructuras se pueden distinguir fácilmente con base en sus espectros (EI, 70 eV). En el de acetato de bencilo (Figura 8 A) se registran iones típicos para los acetatos (M–CH2=C=O)+. en m/z 108 (100%) y CH3CO+ en m/z 43 (60%); mientras que el fragmento en m/z 91 (70%) confirma la presencia de un grupo bencilo en la molécula del éster. En la molécula de benzoato de etilo (Figura 8 B) aparecen iones típicos de benzoatos en m/z 105 (100%) y en m/z 77 (47%), que corroboran la presencia de grupos fenilo (C6H5) y benzoilo (C6H5CO) en la molécula, mientras que el fragmento (M–C2H4)

+. en m/z 122 (30%) es un producto de reordenamiento de McLafferty (Esquema 1) y confirma que éste es un éster etílico del ácido benzoico.


En la espectrometría de masas de impacto de electrones, la formación de iones, moleculares o iones-fragmento y sus respectivas corrientes iónicas parciales (intensidades, %) dependen de varios factores. Entre ellos -de resaltar-, figuran tanto “intrínsecos”, propios de la molécula, como “extrínsecos”, del sistema analítico, a saber: (1) Sección transversal de la molécula, su naturaleza química y potencial de ionización; (2) Energía de electrones bombardeantes (70 eV es la energía estándar); (3) Presión y temperatura de la cámara de ionización: a temperaturas muy altas algunas moléculas pueden experimentar degradación previa a su ionización o, a presiones más altas que las requeridas (10-5–10-6 torr), pueden acontecer reacciones de recarga o neutralización (“pérdida”) de iones, por choques con las moléculas atmosféricas o con las de analito(s) o impurezas; (4) Contaminación de la cámara de ionización, generada por las interferencias e impurezas presentes en la muestra, sangrado de

la fase estacionaria, fugas en el sistema, etc. La estabilidad del ion molecular, WM+ (es su intensidad expresada con respecto a la corriente iónica total producida) depende fundamentalmente de la energía interna que posee y de su capacidad para deslocalizar la carga positiva, pero también de las energías de activación de reacciones monomoleculares de disociación por las cuales los iones M+. decaen, con el rompimiento del enlace más débil en la molécula ionizada. En un espectro de masas, obtenido por EI, se registran diferentes señales, entre ellas, de iones moleculares (si su tiempo de vida es mayor de 10-6 s), iones-fragmento, iones isotópicos; a veces, se registran también las señales de iones multicargados (por ejemplo, en los MS de compuestos poliaromáticos); en equipos de masas con configuraciones específicas se detectan también los llamados iones metaestables (productos de fragmentación de iones fuera de la cámara de ionización). Para la elucidación

Figura 6. Espectros de masas obtenidos por EI (70 eV) de: A. Anfetamina y B. Su derivado –pentaflúorpropilamida. (Tomado de: P.J. Linstrom and W.G. Mallard (Eds.), NIST Chemistry WebBook, NIST Standard Reference Database, National Institute of Standards and Technology, Gaithersburg MD). El ion molecular del derivado de la anfetamina (M+., m/z 280) es de mayor intensidad que la de la amina origen (P.M. 135), además la introducción de cinco átomos de flúor en la molécula derivada permitiría su detección a nivel de trazas, i.e., mucho más sensible, por un detector de captura de electrones (ECD).


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Figura 7. Espectros de masas típicos (EI, 70 eV) de halobencenos: flúorobenceno, clorobenceno, bromobenceno e iodobenceno. (Tomado de: P.J. Linstrom and W.G. Mallard (Eds.), NIST Chemistry WebBook, NIST Standard Reference Database, National Institute of Standards and Technology, Gaithersburg MD). La facilidad de formación del ion (M-Hal)+ aumenta con el tamaño del átomo de halógeno.



Figura 8. Espectros de masas típicos (EI, 70 eV) de dos ésteres aromáticos isoméricos: A. Acetato de bencilo. Se observan iones característicos: (M-CH2=C=O)+. y CH3CO+, en m/z 108 (100%) y 43 (60%), respectivamente, que confirman la presencia del grupo CH3(C=O)O- en la molécula, mientras que los fragmentos (M-CH3COOH)+. y C7H7

+, en m/z 90 (55%) y 91 (70%), respectivamente, corroboran la presencia en la molécula del radical C6H5CH2; B. Benzoato de etilo. Aparición de fragmentos en m/z 105 (100%), 77 (47%) y 122 (30%) confirma la presencia de grupos fenilo, bencilo y etilo en esta molécula. (Tomado de: P.J. Linstrom and W.G. Mallard (Eds.), NIST Chemistry WebBook, NIST Standard Reference Database, National Institute of Standards and Technology, Gaithersburg MD).

Esquema 1. Formación del ion (M-CH2=CH2)+., producto de la transposición de McLafferty, en el espectro de masas (EI, 70

eV) del benzoato de etilo. En la foto aparece el Prof. Dr. Fred W. McLafferty. En su honor se llamó este proceso emblemático en la espectrometría de masas, de migración del átomo de hidrógeno a través un estado hexacíclico, durante la disociación de iones M+. de aldehídos, cetonas, ácidos, amidas, ésteres, nitrilos y otras moléculas orgánicas61-63.

estructural de la molécula, cada uno de estos iones aporta su información estructural de mayor o menor importancia. En la Tabla 1 aparece la información

sucinta sobre los iones que se registran en los espectros de masas obtenidos por EI y la información estructural que pueden proporcionar


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sobre la molécula. Los iones-fragmento pueden ser productos de reacciones monomoleculares tanto de ruptura simple, como de reordenamiento (transposiciones de esqueleto, de hidrógeno)64,65. Mientras que las reacciones de ruptura simple se caracterizan generalmente por sus constantes de

velocidad muy altas, los procesos de reordenamiento son más lentos, y poseen menores energías de activación; los productos de reordenamientos pueden predominar en los espectros de masas de bajo voltaje y su formación se acompaña de iones metaestables de intensidad alta.

Tipo de ion Información que aportan Ejemplos

Iones moleculares

Masa molecular y composición elemental, cuando se usan equipos MS de alta resolución. A menudo, las señales de iones moleculares no se registran (Figura 9) (e.g., hidrocarburos ramificados, alcoholes o aminas secundarias o terciarias). En este caso, se deben obtener espectros de masas usando el método de ionización “suave” (CI). Si hay iones M+. de alta intensidad significa que poseen la capacidad para estabilizar la carga positiva por deslocalización electrónica eficiente, e.g., en moléculas aromáticas.

La estabilidad (WM, %) de un ion molecular es la fracción porcentual en la corriente iónica total obtenida después de la ionización y la fragmentación de una sustancia. WM depende de la estructura de la molécula. El valor WM para hexano es de 2.8%, para hexeno – 4,6%, para 1,3-ciclodieno – 16.5%, mientras que este valor alcanza 33,2% para el benceno, o sea, casi la tercera parte de la corriente iónica total registrada durante la ionización de esta molécula aromática está representada por su ion molecular.

Iones-fragmento

Contienen la información fundamental para poder elucidar la estructura molecular. Estos iones pueden ser cationes (número par de electrones) o catión-radicales (número impar de electrones), y ser productos de ruptura simple o de reordenamiento (de esqueleto o transposición de hidrógeno). Pérdida de un fragmento con masa específica puede indicar su presencia en la molécula que se disocia después de su ionización.

Los iones moleculares de alcoholes decaen fácilmente con pérdida del grupo OH. o de la molécula H2O; se generan, respectivamente, los fragmentos (M-17)+ y (M-18)+.. Los iones-fragmento C6H5

+ y C7H7+ se disocian

con la pérdida de una molécula de acetileno, C2H2, y la generación de señales en m/z 51 y en m/z 65, respectivamente. En los espectros de masas de acetatos, se observan los iones-fragmento correspondientes a la pérdida de una molécula de ceteno a partir del ion molecular (M-CH2=C=O)+.. Estos productos son característicos en espectros de masas de acetatos (Figura 10).

Tabla 1. Tipo de iones que se forman en los espectros de masas obtenidos por EI y la información que pueden proporcionar sobre la estructura de la molécula.


Tabla 1 (Continuación)

Tipo de ion Información que aportan Ejemplos

Iones isotópicos

Contribuyen a la información sobre la composición elemental de la sustancia. Permiten fácilmente vislumbrar la presencia de halógenos Cl o Br, S o Si, calcular el número de átomos de carbono en la molécula, etc. La presencia de iones isotópicos es “obligatoria” en el espectro, ya que es uno de los criterios de calidad de un espectro de masas.

La distribución isotópica de señales en un ion molecular en los espectros de congéneres de bifenilos policlorados (PCBs), permite determinar el número de átomos de cloro en la molécula, por la pérdida sucesiva de átomos de cloro del ion molecular y de la formación de respectivos fragmentos (M-nCl)+ en el espectro de masas de uno de los congéneres de PCB (Figura 11).

Iones multicargados

Solo se forman en los espectros de masas de una determinada clase de sustancias, por ejemplo, aquellos que contienen heteroátomos (N, S, O), anillos aromáticos o heteroaromáticos, alto grado de insaturación (enlaces conjugados) o cuando se combinan varios de estos elementos en la molécula.

Poseen intensidad relativamente baja. Pueden tener valores fraccionados. Por ejemplo, la señal en m/z 64 en el espectro de masas de naftaleno (M+., m/z 128) corresponde al ion molecular dicargado, M2+. En el espectro de masas de pireno, el ion-fragmento en m/z 101 corresponde a su ion molecular dicargado (Figura 12).

Iones metaestables

Se registran frecuentemente en equipos de masas de deflexión magnética, particularmente, se estudian, en los equipos de doble enfoque (métodos DADI, MIKES). Se forman fuera de la cámara de ionización, a partir de iones que tienen tiempo de vida mayor de 10-6 s, pero menor que el tiempo necesario para llegar al detector sin disociarse; se manifiestan como picos difusos, con una masa aparente (número fraccionado), m*, relacionada con las masas de iones padre (m1) e hijo (m2) por la ecuación m* = m2

2/m1.

En un espectro del ácido benzoico aparecen transiciones metaestables (iones m*) correspondientes a los procesos de pérdida sucesiva del radical OH. y de la molécula CO, así: M+. (M-OH)+ y (M-OH)+ [(M-OH)-CO)]+, que confirman el vínculo “genético” entre estos iones, sin embargo, no se registra una transición metaestable correspondiente a un posible proceso directo M+ (M-COOH)+., que en realidad, no tiene lugar, ya que NO se registra el ion m* que lo confirmaría.

Los procesos de fragmentación tanto de ruptura simple, como de reordenamiento (transposición) son variados; sin embargo, habitualmente, resultan ser comunes (rupturas α– y β-, efecto orto, reordenamiento de McLafferty) para las moléculas que pertenecen a diferentes familias de compuestos; algunas de estas reacciones monomoleculares más frecuentes en los espectros de masas de un amplio número de compuestos orgánicos, se registran de forma lacónica en la Tabla 2.

5 Combinación de diferentes estrategias para establecer el patrón de fragmentación y estructuras de iones

El estudio de la ionización disociativa de sustancias con masas moleculares bajas o medianas está basado no solamente en las suposiciones teóricas, por ejemplo, en las teorías cualitativas sobre la estabilidad de productos de disociación (iones y partículas neutras) o en la teoría de localización de la carga positiva o del centro radical en una molécula


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Figura 9. Espectros de masas (EI, 70 eV) de dos monoterpenoles isoméricos: A. Terpinen-4-ol y B. α-Terpinol. Sólo en el espectro de masas del terpinen-4-ol se observa la señal del ion molecular (en m/z 154), que permite directamente dilucidar el peso molecular de este terpeno, mientras que en el espectro del α-terpinol éste no se registra debido a su estabilidad más baja y el tiempo de vida muy corto (<10-6 s). (Tomado de: P.J. Linstrom and W.G. Mallard (Eds.), NIST Chemistry WebBook, NIST Standard Reference Database, National Institute of Standards and Technology, Gaithersburg MD).

Ruptura simple ReordenamientosFormación de cationesEliminación de una molécula de olefina de un catiónFormación de iones aciloRupturas alílica y bencílicaRupturas α- y β-Ruptura retro-Diels-Alder (RDA)

Transposiciones de hidrógenoReordenamiento de McLaffertyEliminación de una molécula neutra (H2O, H2S, CH3OH, HHal)Apertura de un ciclo y migración de hidrógenoEfecto orto Reordenamiento de esqueleto molecular

Tabla 2. Ejemplos de algunos procesos de disociación por EI más comunes (ruptura simple y reordenamientos) en moléculas orgánicas.


ionizada, o en las reglas generales derivadas de la fisicoquímica orgánica, sino, en primer lugar, se fundamenta en los resultados de experimentos, o sea, espectros de masas. Existe un arsenal amplio de

métodos objetivos, experimentales, para establecer la ruta de fragmentación de una molécula ionizada, pero, infortunadamente, no todos éstos pueden llevarse a cabo en el mismo espectrómetro de masas, porque


Figura 10. Espectros de masas típicos (EI, 70 eV) de dos acetatos: A. Acetato de fenilo y B. Acetato de 3-etilfenilo. (Tomado de: P.J. Linstrom and W.G. Mallard (Eds.), NIST Chemistry WebBook, NIST Standard Reference Database, National Institute of Standards and Technology, Gaithersburg MD). Obsérvense los iones característicos de acetatos, productos de reordenamiento, correspondientes a la pérdida de 42 unidades de ceteno, CH2=C=O, a partir del ion molecular, M+., respectivamente, en m/z 94 (A) y en m/z 122 (B).

Figura 11. Espectro de masas de uno de los congéneres de los PCBs (decaclorobifenilo) (EI, 70 eV). (Tomado de: P.J. Linstrom and W.G. Mallard (Eds.), NIST Chemistry WebBook, NIST Standard Reference Database, National Institute of Standards and Technology, Gaithersburg MD). La pérdida sucesiva de átomos de cloro y la distribución isotópica en el ion molecular, M+., confirman la presencia de 10 átomos de cloro en la molécula.

requieren varias técnicas, ensayos y aproximaciones; entre ellas, figuran estrategias netamente químicas (derivación), instrumentales (fotoionización, colisiones activadas, reacciones bimoleculares, configuraciones tándem, etc.) y teóricas, métodos y

cálculos mecano-cuánticos. Cada molécula o ion se caracteriza por las dos propiedades fundamentales: la estructura y la reactividad. Solo en la fase gaseosa, en el vacío alto o muy alto logran ponerse de manifiesto las


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Figura 12. Espectro de masas de pireno (compuesto poliaromático, PAH) (EI, 70 eV). La corriente iónica total está representada fundamentalmente por iones moleculares, que descubren su muy alta estabilidad. El ion en m/z 101 corresponde al ion molecular dicargado, M+2, en m (=202)/z (=2). (Tomado de: P.J. Linstrom and W.G. Mallard (Eds.), NIST Chemistry WebBook, NIST Standard Reference Database, National Institute of Standards and Technology, Gaithersburg MD).

propiedades inmanentes o propias de moléculas o iones, ya que no hay influencia de otras moléculas, los efectos de asociatividad (típicos para la fase condensada) son ausentes, e.g., no hay intercambio de energía, no se logra un equilibrio termodinámico en el sistema; las especies moleculares en el vacío muestran su reactividad intrínseca, derivada netamente de su estructura y de la energía adquirida durante la ionización. Los iones que se forman en el espectrómetro de masas, se pueden dividir grosso modo en dos grupos, (1) los que no alcanzan a disociarse, son estables (viven más de 10-4-10-5 s) y (2) los que se fragmentan en la cámara de ionización (iones-fragmento) o fuera de ésta (metaestables) antes de su detección. El establecimiento de la estructura de cada uno de estos iones, los mecanismos de su formación o fragmentación no es una tarea trivial -pero tampoco es imposible-, ya que debe conjugar varios métodos, experimentales y teóricos. Entre las técnicas para establecer la estructura iónica o la ruta (patrón) de fragmentación de una molécula ionizada se pueden enumerar, entre otras, las siguientes66: (1) Marcados isotópico (D2, O18, N15) y químico (introducción de grupos, e.g., -F, -OCH3, etc.); (2) Determinación de masas exactas de iones y el estudio de su distribución isotópica; (3) Estudio de transiciones metaestables (DADI, análisis directo de iones filiales o MIKES, espectroscopia de energías cinéticas de iones analizada por masas, por sus siglas

en inglés); (4) Combinación y estudio comparativo de espectros obtenidos con electrones de diferentes energías o por diferentes métodos de ionización (por ejemplo, EI Vs CI); determinación de afinidades electrónicas o protónicas; estudio de reacciones bimoleculares; (5) Determinación de energías de ionización de moléculas y potenciales de aparición de iones-fragmento; (6) Determinación de energías de enlaces químicos, energías de activación de procesos de disociación u otros parámetros termodinámicos moleculares (energías de enlaces); estudio de espectros de fotoionización; (7) Estudio de reacciones de disociación de iones inducidas por colisiones activadas o fotodisociación; (8) Cálculos mecano-cuánticos de las energías de formación o totales y estructuras iónicas, la elucidación de estructuras de fragmentos más probables. No siempre se logran complementar los resultados de todos estos métodos, aunque la mayoría de éstos sí son imprescindibles cuando se quiere establecer correctamente la ruta y, más aún, el mecanismo de fragmentación de una molécula ionizada.

A modo de ejemplo, se muestra la aplicación de algunas aproximaciones experimentales y teóricas en la espectrometría de masas, para establecer un patrón de fragmentación de los derivados de γ-arilaminopiperidinas67,68. En la Figura 13 aparece el espectro de masas del 1,2,5-trimetil 4-fenilaminopiperidina. De acuerdo con la ruta



sintética para su obtención, se forman los dos isómeros espaciales, i.e., con configuraciones cis- y trans- (Figura 14).

Figura 13. Espectro de masas (EI, 70 eV) de uno de los estereoisómeros de la 1,2,5-trimetil 4-fenilaminopiperidina (isómero trans-).

Figura 14. Isómeros espaciales de las γ-fenilaminopiperidinas: A. 1,2e,5a-trimetil-4e-fenilaminopiperidina (isómero cis-) y B. 1,2e,5e-trimetil-4e-fenilaminopiperidina (isómero trans-)

Los espectros de masas de ambos estereoisómeros, aislados previamente en forma individual por cromatografía en columna, son cualitativamente iguales (patrón de fragmentación), pero las intensidades de sus iones característicos son visiblemente diferentes. Las moléculas de

γ-arilamino-piperidinas se distinguen por su abundante fragmentación (EI, 70 eV), que involucra tanto las escisiones simples de enlaces, como las transposiciones de hidrógeno y la apertura del ciclo; algunos de estos procesos se considerarán en la siguiente discusión.


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La ruptura β, típica para aminas, conduce a la formación de iones (M-CH3)

+, que decaen luego por ruptura tipo retro Diels-Alder (RDA), con

formación de los iones en m/z 70, tal como aparece en el Esquema 2:

Esquema 2. Formación de iones característicos en m/z 203 y 70, en los espectros de masas de los estereoisómeros de las γ-fenilaminopiperidinas A y B, productos de la ruptura β y de la reacción de RDA, respectivamente.

La composición elemental de los iones en m/z 203 y 70 (Figuras 13 y 14) en los espectros de γ-fenilaminopiperidinas se confirma por la espectrometría de masas de alta resolución (HRMS), que ratifica sus fórmulas elementales; el origen de estos iones en el espectro lo comprueba la aparición de los respectivos iones metaestables m* para las transiciones M+. m/z 203 y m/z 203 m/z 70, junto con el análisis de resultados obtenidos por el monitoreo directo de iones filiales (DADI).

La ruptura α, también característica para aminas, conduce a la formación del catión

(M-NHC6H5)+ en m/z 126, mientras que el catión-

radical (M-NH2C6H5)+. en m/z 125 es el producto

de una transposición de hidrógeno; el ion (M-CH3-NH2C6H5)

+ en m/z 110 confirma la presencia en la molécula de ambos grupos, CH3 y NHC6H5. La Tabla 3 contiene la información sobre estos iones característicos y permite vislumbrar las diferencias cuantitativas que se observan en los espectros de los estereoisómeros A y B. Nuevamente, el vínculo “genético” de todos estos iones-fragmento se estableció con base en el estudio de transiciones metaestables y espectros de DADI.


Compuesto(Figura 14)

Orientación espacial WM+, % I203/IM+. I126/IM+. I125/IM+. I110/I203

A 2e,4e,5a 7.7 0.20 0.43 0.26 1.29

B 2e,4e,5e 9.0 0.20 0.31 0.89 4.33

Tabla 3. Estabilidad de iones moleculares y relación de intensidades de iones característicos en los espectros de masas de los estereoisómeros 1,2e,5a-trimetil-4e-fenilaminopiperidina (A, isómero cis-) y 1,2e,5e-trimetil-4e-fenilaminopiperidina (B, isómero trans-)

Como se puede observar, la relación I203/IM+ para ambos isómeros es la misma, lo que

comprueba que la expulsión del grupo metilo sucede desde la posición 2 y no de la posición 5 del anillo


piperidínico, ya que la orientación similar de este grupo (2e-CH3) en ambos isómeros conduce a la igual probabilidad de su eliminación de los iones M+.. Empero, se observan notorias diferencias para las relaciones I126/IM+, I125/IM+ y I110/I203 en los espectros de masas de ambos isómeros. La pérdida del grupo NHC6H5 del ion M+. en el isómero cis- es más rápida e intensa que en el isómero trans-, lo que se puede explicar por la tensión más alta (efecto estérico) entre los grupos 5a-CH3 y 4e-NHC6H5 en la posición cis- en la γ-fenilaminopiperidina A, en comparación con su disposición trans- en el isómero B. Lo inverso se observa para la relación de intensidades de iones I125/IM+ y I110/I203, cuya formación involucra la transposición de hidrógeno.

Para explicar este hecho fue necesario, en primer lugar, establecer el origen (la posición en el anillo piperidínico) del átomo de hidrógeno que migra al grupo γ-fenilamino saliente. Para ello, se sintetizó un derivado deuterado de la γ-fenilaminopiperidina, cuyo espectro aparece en la Figura 15. El análisis de este espectro claramente demuestra que el átomo de hidrógeno involucrado en la transposición del hidrógeno y su salida del M+. en forma de la molécula

de anilina, proviene de las posiciones 3 ó 5 del ciclo, ya que el fragmento en m/z 125 (Figura 13) se desplaza dos unidades hacía las masas más pesadas en el espectro del análogo deuterado (ion en m/z 127) (Figura 15).

Cómo explicar, entonces, que en el espectro de masas del isómero trans- la intensidad de iones (M-NH2C6H5)

+. sea más alta que en el espectro del isómero cis- (Tabla 3). Para ello, es importante considerar también los factores cinéticos del proceso de la pérdida de la molécula de anilina a partir del ion molecular. Por el método de la fotoionización (PI) se midieron los potenciales de ionización de iones moleculares M+. de ambos estereoisómeros, así como los potenciales de aparición de los iones-fragmento (M-NH2C6H5)

+. en m/z 125. Los resultados de estas mediciones se resumen en la Tabla 4.

Los datos experimentales de espectros de los análogos deuterados de la γ-fenilaminopiperidina y de los potenciales de aparición de los iones (M-NH2C5H6)

+. en m/z 125 y energías de activación, Ea, del proceso M+. m/z 125, claramente confirman que la pérdida de la molécula de anilina del ion molecular no solamente involucra la migración de

Figura 15. Espectro de masas de un análogo deuterado de la γ-fenilaminopiperidina.


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Compuesto Orientación espacial

Potenciales de aparición, eV Energía de activación, Ea, M+. (M-NH2C6H5)+.M+. (M-NH2C6H5)+.

A 2e,4e,5a 7.17 9.48 ≈ 2.3 eV

B 2e,4e,5e 7.31 8.75 ≈ 1.4 eV

Tabla 4. Potenciales de aparición de iones moleculares (IP) de los estereoisómeros de la γ–fenilaminopiperidina y de los iones-fragmento característicos (M-NH2C6H5)

+. (AP), productos de la transposición de hidrógeno.

los átomos 3-H ó 5-H, sino que en el isómero trans- este proceso transcurre mucho más rápido (Ea más baja), que en el isómero cis-. Ello permite deducir, que es un proceso regioselectivo, ya que en el isómero trans- (B) existen dos átomos de hidrógeno disponibles en la posición cis- con respecto al grupo NHC6H5, mientras que en el isómero cis- (A) hay solo un hidrógeno en esta posición; luego, la probabilidad de su migración al grupo saliente es más baja. La combinación de datos cinéticos (Ea), transiciones metaestables y el estudio de espectros de los

deutero-análogos de las γ-fenilaminopiperidinas A y B, permiten concluir, que la pérdida de la anilina sucede a través del proceso de transposición del hidrógeno, concretamente, por medio de la 1,4-cis-eliminación del hidrógeno 3a-H ó 5a-H, según el Esquema 3. Con base en las relaciones de intensidades de iones (I126/IM+.) y (I125/IM+.) en los espectros de masas de las γ-arilaminopiperidinas, se puede establecer la orientación espacial (ecuatorial o axial) del grupo 5-CH3 en el heterociclo.


Esquema 3. El proceso de la 1,4-cis-eliminación del hidrógeno durante la formación de iones característicos (M-NH2C6H5)+.

en m/z 125, en los espectros de masas de los estereoisómeros (A) 1,2e,5a-trimetil-4e-fenilaminopiperidina (isómero cis-) y (B) 1,2e,5e-trimetil-4e-fenilaminopiperidina (isómero trans-)

La elucidación de las estructuras de los iones-fragmento es una tarea aún más complicada. Aunque existen métodos experimentales para establecer el origen de un ion en espectro de masas (iones metaestables, DADI, configuraciones tándem y espectros de iones-hijo e iones-padre), es más difícil

deducir cuál es su estructura, sobre todo, que pueden existir varias posibles. Por ejemplo, el ion en m/z 70, producto de la ruptura RDA del fragmento (M-CH3)

+ (Figura 13, Esquema 2), puede tener diferentes estructuras posibles (Esquema 4), a saber:


Esquema 4. Posibles estructuras del ion C4H8N+en m/z 70 (Figura 13), producto de la reacción RDA del fragmento (M-CH3)

+ en los espectros de masas (EI, 70 eV) de las γ-fenilaminopiperidinas A y B.

Cuál es la estructura del ion en m/z 70 lo podrían sugerir los resultados de cálculos mecano-cuánticos (e.g., método semi-empírico MNDO) de aquellas posibles estructuras iónicas correspondientes al fragmento con la masa exacta

de 70,0656 u.m.a., determinada por HRMS, y la composición elemental C4H8N

+. En la Tabla 5 aparecen resultados de cálculos semi-empíricos de energías de formación y energías totales de las posibles estructuras de iones isoméricos C4H8N

+.

Ion Masa exacta

Composición elemental Ruta de formación Estructuras

Energía de formación, kcal/mol

Energía total, eV

m/z 70 70.0656 C4H8N(M-CH3)

+ m/z 70(m*, DADI)

f1 203, 6 -823,6f2 192,8 -824,1f3 224,6 -822,7f4 216,6 -823,1

Tabla 5. Resultados de los cálculos semi-empíricos (MNDO) de las posibles estructuras del ion C4H8N+ con m/z 70, producto

de la reacción RDA del fragmento (M-CH3)+ en el espectro de masas (EI, 70 eV) de la γ-fenilaminopiperidina.

Según los resultados de los cálculos de energías de formación y totales de las estructuras alternativas para el ion C4H8N

+, el fragmento f2, cuadricíclico, es el más estable, lo que, hasta cierto punto, confirma el “mecanismo” de su formación por RDA, ya que la ruptura de dos enlaces en el ion (M-CH3)

+ (Esquema 2) es un proceso con alto consumo de energía cuyo “gasto” puede “compensarse” por la formación de un nuevo enlace simple en el ion f2, acompañado de los cambios mínimos en la estructura (en comparación, e.g., con los fragmentos f3 y f4).

6 Conclusiones

El enorme potencial analítico que brinda la GC y la separación de mezclas complejas en columnas

capilares, unidas directamente a un detector selectivo de masas (MSD), permite agregar a los datos de tiempos e índices de retención69,70 y áreas cromatográficas (análisis cuantitativo), la información espectral. Los espectros de masas, son “espejos” estructurales de las moléculas que se ionizan y se fragmentan acorde con su naturaleza química y la energía interna que poseen. En la mayoría de los análisis por GC-MS se utilizan sustancias-patrón (análisis ambiental, forense, etc.). Las bases de datos de espectros de masas (NIST, Wiley) ayudan sobremanera al proceso de interpretación de espectros. Sin embargo, en muchas muestras (mezclas complejas, analizadas por GC-MS) es menester establecer la estructura de moléculas in situ, con base en sus espectros de masas, ya que a menudo no se cuenta ni con las sustancias-patrón, ni con los espectros de referencia


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en las bases de datos. La disociación de moléculas orgánicas transcurre acorde con las leyes termodinámicas de las reacciones monomoleculares, y consta de procesos de fragmentación paralelos y sucesivos, en competencia, que acontecen en el vacío, cuando no hay efectos de “asociatividad” conducentes al equilibrio termodinámico. Estos procesos (formación de iones característicos en espectros de masas) permiten no solamente establecer la presencia de grupos funcionales o sustituyentes en las moléculas, sino, en muchos casos, su disposición espacial. Para el estudio de las estructuras de iones y rutas de su fragmentación se requiere combinar varias estrategias experimentales (colisiones activadas, iones metaestables, reacciones bimoleculares, medición de potenciales de ionización y aparición, marcados isotópico y químico, etc.) y métodos teóricos (cálculo de energías de formación y geometrías, simulación computacional de estados de transición, etc.).

Referencias Bibliográficas

1. S. Ahuja, N. D. Jespersen. Modern instrumental analysis. Elsevier, Amsterdam. 2006, 864 p.2. F. A. Settle. Handbook of instrumental techniques for .....analytical chemistry. Prentice Hall, New York, 1997, .....995 p.3. C. Barshick, D. Duckworth, D. H. Smith. Inorganic

mass spectrometry: Fundamentals and applications. CRC Press, Boca Raton, 2000, 512 p.

4. J. S. Becker. Inorganic mass spectrometry: principles and applications. Wiley-Interscience, New York, 2008, 496 p.

5. J. Laskin, C. Lifshitz. Principles of mass spectrometry applied to biomolecules. John Wiley and Sons, New York, 2006, 687 p.

6. A. L. Burlingame. Biological mass spectrometry. Gulf Professional Publishing, Miami, 2005, 478 p.

7. J. R. Chapman. Practical organic mass spectrometry: a guide for chemical and biochemical analysis. John Wiley and Sons, London, 1995, 338 p.

8. A. Ashcroft. Ionization methods in organic mass spectrometry. Royal Society of Chemistry, London, 1997, 176 p.

9. M. L. Gross, R. Caprioli. The encyclopedia of mass spectrometry: ionization methods. Elsevier, Amsterdam, 2007, 1007 p.

10. G. Montaudo, R. Lattimer. Mass spectrometry of polymers. CRC Press, Boca Raton, 2002, 584 p.

11. D. Lubman, Lasers and mass spectrometry. Oxford University Press, Cambridge, 1990, 545 p.

12. F. Hillenkamp, J. Peter-Katalinic. MALDI-MS: a practical guide to instrumentation, methods and applications. Wiley-VCH, New York, 2007, 345 p.

13. M. Barber, R. Bordolri, D. Sedgwick, A. Tyler. J.C.S. Chem. Comm., (1981) 325.

14. A. Benninghoven. Surf. Sci., 299-300 (1994) 246.15. R. Zenobi, R. Knochenmuss. Mass Spectrom. Rev., 17,

(1998) 337.16. L. H. Cohen,·A. I. Gusev. Anal. Bioanal. Chem. 373

(2002) 571.17. T. C. Rohner, D. Staab, M. Stoeckli. Mech. Ageing Dev.,

126 (2005) 177. 18. W. Niessen. Liquid chromatography-mass spectrometry.

CRC Press, Boca Raton, 2006, 608 p.19. W. M. A. Niessen. J. Chromatogr. A, 856 (1999) 179.20. M. A. Baldwin, F. W. McLafferty. Org. Mass Spectrom.,

7 (1973) 1111.21. C. R. Blakley, M. L. Vestal. Anal. Chem., 55, (1983)

750. 22. R.D. Smith, J.A. Loo, C.G. Edmonds, C.J. Barinaga,

H.R. Udseth . Anal Chem., 62 (1990) 882.23. M. Przybylski, M. O. Glocker. Angew. Chem. Intern.

Ed. Engl., 35 (1996) 806.24. D. B. Robb, T. R. Covey, A. P. Bruins. Anal. Chem., 72,

(2000) 3653.25. R. Aebersold, M. Mann. Nature, 422, (2003) 198.26. J. R. Yates. Trends Genetics,16, (2000) 5.27. S. D. Richardson. Anal. Chem., 72, (2000) 4477. 28. M. Careri, F. Bianchi, C. Corradini. J. Chromatogr. A,

970 (2002) 3. 29. H.-R. Buser, H. Arn. J. Chromatogr. A, 106 (1975) 83.30. J. V. Sancho, O. J. Pozo, F. Hernández. Analyst, 129

(2004) 38.31. R. D. Voyksner, J. T. Bursey, E. D. Pellizzari. Anal.

Chem., 56 (1984) 1507.32. G. Sacchetti, S. Maietti, M. Muzzoli, M. Scaglianti,

S. Manfredini, M. Radice, R. Bruni. Food Chem., 91 (2005) 621.

33. R. A. Shellie, P. J. Marriott. Analyst, 128 (2003) 879.34. F. Gong, Y.-Z. Liang, Q.-S. Xu, F.-T. Chau. J.

Chromatogr. A, 905 (2001) 193.35. E. Reverchon, F. Senatore. J. Agric. Food Chem., 42

(1994) 154. 36. A. Schreiber, J. Efer, W. Engewald. J. Chromatogr. A,

869 (2000) 411.37. Z. Takáts, J. M. Wiseman, R. G. Cooks. J. Mass

Spectrom., 40 (2005) 1261.38. B. Tan, J. K. Hardy, R. E. Snavely. Anal. Chim. Acta,

422 (2000) 37. 39. G. Hopfgartner, E. Bourgogne. Mass Spectrom. Rev.,

22 (2003) 195.40. R. Kaliszan, R. A. Hartwick. Crit. Rev. Anal. Chem., 16

(1986) 323.41. J. D. Hearn, G. D. Smith. Anal. Chem., 76 (2004) 2820. 42. K. Vekey. J. Mass Spectrom., 31, (1996) 445. 43. R. E. March, J. F. Todd. Quadrupole ion trap mass

spectrometry. John Wiley and Sons, 2005, New York, 346 p.


44. R. March, J.F.J. Todd. Practical aspects of ion trap mass spectrometry: Ion trap instrumentation. CRC Press, Boca Raton, FL, 1995, 352 p.

45. P. H. Dawson. Quadrupole mass spectrometry and its applications. Springer, Heidelberg, 1995, 349 p.

46. J. R. Perkins, K. B. Tomer. Anal. Chem., 66 (1994) 2835.

47. R. E. Mohler, K. M. Dombek, J. C. Hoggard, E. T. Young, R. E. Synovec. Anal. Chem., 78 (2006) 2700..

48. L. Mondello, P. Q. Tranchida, P. Dugo, G. Dugo. Mass Spectrom. Rev., 27 (2008) 101.

49. S. Kempa, J. Hummel, T. Schwemmer, M. Pietzke, N. Strehmel, S. Wienkoop, J. Kopka, W. Weckwerth. J. Basic Microbiol., 49 (2009) 82..

50. R. H. Bateman, M. R. Green, G. Scott, E. Clayton. Rapid Commun. Mass Spectrom., 9 (1995) 1227.

51. G. Hopfgartner, E. Varesio, V. Tschappat, C. Grivet, E. Bourgogne, L. A. Leuthold. J. Mass Spectrom., 39 (2004) 845.

52. F. W. McLafferty, F. Turecek. Interpretation of mass spectra. University Science Books, New York, 1993, 371 p.

53. O. Fiehn, J. Kopka, R. N. Trethewey, L. Willmitzer. Anal. Chem., 72 (2000) 3573.

54. M. Stobiecki. Phytochemistry, 54 (2000) 237.. 55. V. H. Wysocki, K. A. Resing, Q. Zhang, G. Cheng.

Methods, 35 (2005) 211.56. R. A. Yost, C. G. Enke. J. Amer. Chem. Soc., 100 (1978)

2274. 57. J. H. Gross. Mass spectrometry: a textbook. Springer,

Heidelberg, 2004, 518 p.

58. M. Vincenti, J. C. Schwartz, R. G. Cooks, A. P. Wade, C. G. Enke. Org. Mass Spectrom., 23 (1988) 579.

59. E. Hofmann. J. Mass Spectrom., 31 (1996) 129. 60. J. M. Halket, D. Waterman, A. M. Przyborowska, R.

K. P. Patel, P. D. Fraser, P. M. Bramley. J. Exp. Bot., 56 (2005) 219-243.

61. F. W. McLafferty, Anal. Chem., 31(1) (1959) 82.62. M. L. Gross., J. Am. Soc. Mass Spectrom., 15(7) (2004)

951.63. N. M. Nibbering. J. Am. Soc. Mass Spectrom., 15(7)

(2004) 956.64. A. Ashcroft. Ionization methods in organic mass

spectrometry. Royal Society of Chemistry, Cambridge, 1997, 176 p.

65. F. J. Brown, C. Djerassi. J. Amer. Chem. Soc., 102 (1980) 807.

66. K. Levsen. Fundamental aspects of organic mass spectrometry. Verlag Chemie, Weinheim, 1978, 152.

67. V. V. Kouznetsov, L. A. Gaivoronskaia, A. A. Fomichev, P. M. Romero, N. S. Prostakov. Chem. Heterocycl. Comp., 7 (1987) 949.

68. V. V. Kouznetsov, L. A. Gaivoronskaia, P. M. Romero, E. E. Stashenko, P. I. Zaharov, N. S. Prostakov. Chem. Heterocycl. Comp., 7 (1987) 954.

69. V. I. Babushok, I. G. Zenkevich. Chromatographia, 69 (2009) 257.

70. H.-J. Hübschmann. Handbook of GC/MS. Fundamentals and Applications. 2d Ed. Wiley-VCH, Weinheim, 2009, 719 p.


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