Serviço Público Federal Universidade Federal de …...ii ALINY PEREIRA DE LIMA Goiânia 2014 Tese...
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Serviço Público Federal
Universidade Federal de Goiás Instituto de Ciências Biológicas
Programa de Pós-Graduação em Biologia – Doutorado Área de Concentração: Biologia Celular e Molecular
ALINY PEREIRA DE LIMA
Estudo do potencial citotóxico e do mecanismo de morte celular de novos
protótipos à base de rutênio frente a diferentes células tumorais ___________________________________________________________________
Goiânia
2014
ii
ALINY PEREIRA DE LIMA
Goiânia
2014
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular da Universidade Federal de Goiás como pré-requisito para obtenção do Título de Doutora em Biologia Celular e Molecular. Orientadora: Profª. Drª. Elisângela de Paula Silveira Lacerda
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PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
BANCA EXAMINADORA DA TESE DE DOUTORADO
Aluno(a): ALINY PEREIRA DE LIMA
Orientador(a): Prof. Dr.a Elisângela de Paula Silveira Lacerda
Membros: 1. Prof. Dr.a Silvia Regina Rogato - Universidade Estadual Paulista- Botucatu
2. Prof. Dr. Wagner Gouvêa dos Santos - Universidade Federal de Goiás
3. Prof. Dra. Alane Pereira Cortez - Universidade Federal de Goiás
4. Prof. Dr. Ruy de Souza Lino Júnior - Universidade Federal de Goiás
OU
1º Suplente: Prof. Dr. Carlos Henrique Castro - Universidade Estadual Paulista
2º Suplente: Prof. Dra. Adriana Freitas Neves – Universidade Federal de Goás
Data: 14/02/2014
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"Que os vossos esforços desafiem as impossibilidades, lembrai-vos de que as
grandes coisas do homem foram conquistadas do que parecia impossível".
(Charles Chaplin)
v
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus, grande orientador da minha vida, por permitir que eu continuasse
a minha caminhada com fé e coragem, concedendo-me a capacidade de superar os
obstáculos, por tudo o que Ele fez até aqui e ainda fará.
Aos meus pais Ana e João, pelo cuidado e proteção, por todo sacrifício que
passaram para que eu pudesse chegar a este momento. Obrigada pelo incentivo à
minha formação
À minha orientadora, Profa. Elisângela, por quem tenho grande admiração e
respeito. Agradeço pelas oportunidades concedidas, confiança, ensinamentos e
orientação.
Agradeço a Flávia pela grande amizade, dedicação, ajuda e, principalmente, pelo
companheirismo.
Agradeço a Francyelli e a Wanessa, pela grande ajuda prestada durante o todo o
doutorado.
A toda equipe do Laboratório de Genétia Molecular e Citogenética, em especial a
Thallita, Lorena, Adriana, Hugo e Sônia. Obrigada pelo auxílio.
Ao CNPq, pela bolsa de doutorado.
À banca examinadora que, gentilmente, aceitou o convite para participar da defesa
desta tese.
A todas as pessoas que verdadeiramente torceram por mim, me incentivaram e hoje
comemoram comigo esta conquista.
vi
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 16
1.1 Aspectos Gerais do Câncer ................................................................................ 16
1.2 Epidemiologia do Câncer .................................................................................... 17
1.3 Tipos de Tratamento para o Câncer .................................................................... 18
1.4 Sarcomas ............................................................................................................ 19
1.5 Câncer de Pulmão ............................................................................................... 20
1.6 Atuações dos Fármacos Quimioterápicos sobre o Ciclo Celular ........................ 21
1.7 Modalidades de Morte Celular ............................................................................. 24
1.8 Apoptose ............................................................................................................. 28
1.9 Mecanismos de Morte Celular e Quimioterapia Antineoplásica .......................... 33
1.10 Complexos a Base de Metal na Quimioterapia Antineoplásica ........................ 35
1.11 Complexos de Rutênio: Aspectos Estruturais e Atividade Antitumoral .............. 37
1.12 Mecanismo de Ativação de Complexos de Rutênio (III) ................................... 40
1.13 Categorizações de Complexos Metálicos ......................................................... 44
2. JUSTIFICATIVA .................................................................................................... 47
3. OBJETIVO GERAL ............................................................................................... 48
3.1 Objetivos Específicos Artigo 1 ............................................................................. 48
3.2 Objetivos Específicos Artigo 2 ............................................................................. 48
4. MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................... 50
4.1. Síntese dos Complexos de Rutênio (II) e Complexo Rutênio (III) ...................... 50
4.2 Preparação de Complexos de Rutênio ............................................................... 51
4.3 Linhagens Celulares e Manutenção Cultivo Celular ............................................ 51
4.4 Ensaio de Viabilidade Celular pelo Método de Redução do MTT ....................... 52
4.5 Ensaio de Citotoxicidade pela Técnica Azul de Tripan ........................................ 52
4.6 Ensaio de Sobrevivência Clonogênica ................................................................ 53
4.7 Análise do Ciclo Celular por Citometria de Fluxo ................................................ 54
4.8 Ensaio Apoptose (Anexina V-FITC/Iodeto de Propídeo) ..................................... 54
4.9 Análise da Atividade de Caspases pelo Ensaio Colorimétrico ............................ 56
4.10 Ensaio Potencial de Membrana Mitocondrial pela Marcação com JC-1 ............ 56
4.11 Ensaio Western Blotting .................................................................................... 58
4.12 Análise Expressão Gênica ................................................................................ 59
vii
4.12.1 Extração RNA ................................................................................................. 59
4.12.2 Síntese cDNA ................................................................................................. 59
4.12.3 Real Time RT-PCR ......................................................................................... 60
4.12.4 Microscopia de força atômica ......................................................................... 61
4.13 Análise Estatística ............................................................................................. 62
5. PRODUÇÃO CIENTÍFICA .................................................................................... 63 ARTIGO 1(Apêndice) .............................................................................................. 111
ARTIGO 2 ................................................................................................................. 64
Abstract ..................................................................................................................... 65
1.0 Introduction ......................................................................................................... 66
2.0 Material and Methods .......................................................................................... 68
2.1 Chemicals. ........................................................................................................... 68
2.2 Cell culture. ......................................................................................................... 69
2.3 Cell Viability Assay (MTT Assay) ......................................................................... 69
2.4 Cell Cycle Analysis .............................................................................................. 70
2.5 Annexin V-FITC/PI double-staining and Analysis by Flow Cytometry ................. 70
2.6 Analysis of Mitochondrial Membrane Potential .................................................... 71
2.7 Measurement of Caspase Activity ....................................................................... 71
2.8 Total RNA Extraction and cDNA Synthesis ......................................................... 72
2.9 Real-time Quantitative PCR ................................................................................ 72
2.10 Western Blotting Analysis .................................................................................. 73
2.11 Atomic force microscopy (AFM)......................................................................... 74
2.12 Statistical Analysis ............................................................................................. 74
3.0 Results ................................................................................................................ 75
3.1 S180 cell viability .............................................................................................. 75
3.2 Induction of G0/G1 arrest in S180 cells ............................................................... 76
3.3 Induction of apoptosis in S180 cells .................................................................... 78
3.4 Disruption of the mitochondrial membrane potential............................................ 81
3.5 Induction of S180 cell apoptosis through a caspase-dependent pathway ........... 83
3.6 Induction of the expression of apoptosis-related genes....................................... 83
3.7 Expression of the apoptosis-related Bak protein in S180 cells ............................ 84
3.8 Atomic force microscopy ..................................................................................... 85
4. Discussion ............................................................................................................. 86
5. References ............................................................................................................ 92
viii
6. CONCLUSÕES ..................................................................................................... 96
7. CONSIDERAÇÕES FINAIS .................................................................................. 98
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................... 101
9. APÊNDICE .......................................................................................................... 111
ix
LISTA DE FIGURAS GERAL
Figura 1. Características das células neoplásicas. ................................................... 17
Figura 2. Atuação dos agentes antineoplásicos sobre as fases do ciclo celular. ..... 27
Figura 3. Características morfológicas de diferentes tipos de morte celular... .......... 28
Figura 4. Via de sinalização molecular necroptose. ................................................. 29
Figura 5. Vias de sinalização intrínseca e extrínseca durante a apoptose .............. 31
Figura 6. Via de sinalização de receptores de morte e receptores dependentes ..... 34
Figura 7. Via de apoptose mitocondrial dependente e independente de caspases .. 36
Figura 8. Estrutura química de fármacos a base de platina... ................................... 40
Figura 9. Estrutura química KP1019 e NAMI-A ........................................................ 42
Figura 10. Mecanismo hipotético da ativação por redução de complexos de
rutênio (III) sobre células tumorais ........................................................................... 46
Figura 11. Representação esquemática do mecanismo de ação do complexo de
rutênio (III) KP1019 ................................................................................................... 47
Figura 12. Princípio do ensaio de marcação com Anexina V/Iodeto de Propídeo .... 56
Figura 13. Princípio ensaio marcação JC-1 .............................................................. 58
Figura 14: Representação esquemática das formas CCC e OC do DNA do
plasmídeo pBR322 .................................................................................................... 62
Figura 15. Hipótese da via de sinalização apoptótica acionada pelo complexo de
rutênio (II) RuGly (A) e cloreto de cis-tetraminodiclororutênio (III) (A) .................... 100
x
LISTA DE FIGURAS – ARTIGO 2
Figure. 1 Effects of RuGly on the cell cycle distribution of S180 cells ...................... 78
Figure 2. Effect of the RuGly on mechanism of cell death early and late
apoptosis/necrosis in S180 cells. .............................................................................. 80
Figure 3. Effect of RuGly on mitochondrial membrane potential. .............................. 82
Figure 4. Effect of RuGly on caspase-3, 8 and 9 activity in S180 cells ................... 83
Figure 5. Relative expression by Real time RT-PCR analysis of genes bax,
caspase-3 and caspase 8.......................................................................................... 84
Figure 6. Western blotting assay of Bax protein expression in S180 cells ............... 85
Figure 7. (a) AFM image of free pBR322 plasmid DNA. (b) AFM image of the
pBR322 plasmid incubated with the of [RuGly] for 24 h at 37 C .............................. 86
Figure 8. Proposed apoptotic signaling pathways triggered by RuGly in S180
tumor cells ................................................................................................................. 91
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LISTA DE TABELAS GERAL
Tabela 1. Efeito de fármacos antineoplásicos sobre o ciclo celular .......................... 23
Tabela 2. Modalidades de morte celular após terapia antitumoral ............................ 35
Tabela 3. Estrutura química e tipo aminoácidos inseridos na estrutura de
complexos de rutênio (II) ........................................................................................... 51
Tabela 4. Sequências de primers utilizados para o ensaio real time RT-PCR .......... 61
LISTA DE TABELAS ARTIGO 2
Tabela 1. Primer sequences used for the real time RT-PCR assay .......................... 73
Tabela 2. Viability of the S180 tumor cell line and the L929 normal cell line in the
presence of ruthenium/amino acid complexes and cisplatin...................................... 76
xii
SIGLAS E ABREVIATURAS
A-20: Linhagem de células de Linfoma de camundongo
A549: Linhagem de células de Carcinoma alveolar de pulmão humano
AIF: Fator Indutor de Apoptose
APAF-1: Protease Apoptótica Ativadora de Fator 1
ATCC: Coleção Americana de Cultura Celular
Bad: Proteína pró-apoptótica
Bak: Proteína pró-apoptótica
Bax: Proteína X associada ao Bcl-2
Bcl-2: Proteína antiapoptótica (Linfoma células B) Bcl-x: Proteína antiapoptótica
Bid: Domínio de Morte de Interação com BH3
Bim: Proteína pró-apoptótica
Bipy: 2, 2‘- Bipiridina
CD95: Ligante de Receptor de Morte Celular
CDK: Quinases Dependentes de Ciclina
cis-[RuCl2(NH3)4]Cl: clorteto de cis-tetraaminodiclororutênio(III)
CCC: Forma Circular Covalentemente Fechada
CKIs: Inibidores de Quinase-Ciclina
CPCNP: Câncer de pulmão de Células Não Pequenas
CPCP: Câncer de Pulmão de Células Pequenas
DIABLO: Inibidor Direto de Proteínas Inibidoras de Apoptose
DISC: Complexo de Sinalização de Indução de Morte
DMEM: Meio Eagle modificado por Dulbecco
DNA: Ácido desoxirribonucleico
dppb:1,4 bis(difenilfosfina) butano
EORTC: Organização Europeia para a Investigação e Tratamento do Câncer
FADD: Domínio de Morte Associada ao CD95
FASL/CD95: Ligante de Receptor de Morte Celular
FITC: Isotiocianato de Fluoresceína
INCA: Instituto Nacional do Câncer
IC50: Concentração que Inibe 50% da Viabilidade Celular
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INK4: Inibidores Específicos de CDK4
JC-1: Iodeto de 5,5`,6,6`-tetracloro1,1`,3,3`-tetraetilbenzimidazolocarbocianina
K562: Linhagem de células de Leucemia Mieloide Crônica humana
KP1019: Indazol trans-[tetraclorobis (1H-indazol)rutenato(III)
L929: Fibroblasto de Pulmão de Camundongo
MTT: 3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)2,5-Difenil Brometo de Tetrazoilium)
NAMI-A: ImH[trans-RuCl4(DMSO)Im]
MOMP: Permeabilização Membrana Mitocondrial Externa
NCCD: Comitê de Nomenclatura Sobre Morte Celular
OC: Forma Circular Aberta
PARP-1: Polimerase 1 ADP-ribose
PBS: Solução Salina Tamponada com Fosfato
PP2A: Proteína Fosfatase 2A
PF6: Hexafluorfosfato
RIPK1: Proteína Quinase de Interação com Receptor-1
RPMI: Meio de cultura Instituto Memorial Park Roswell
RT-PCR: Transcrição Reversa – Reação em Cadeia da Polimerase
RuAc.Asp: Complexo de Rutênio (II) coordenado a Ácido aspártico
RuAla: Complexo de Rutênio (II) coordenado a Alanina
RuGly: Complexo de Rutênio (II) coordenado a Glicina
RuLeu: Complexo de Rutênio (II) coordenado a Leucina
RuMet: Complexo de Rutênio (II) coordenado a Metionina
SKBR-3: Carcinoma de mama humano
SMAC: Segundo Ativador de Caspase Derivado da Mitocôndria
TBS-T: Tampão Salina Tris com Tween
TNF: Fator de Necrose Tumoral
TNF-R: Receptor do Fator de Necrose Tumoral
TRAIL: Ligante Indutor de Apoptose Relacionado ao Fator de Necrose Tumoral
ΔΨm: Potencial de Membrana Mitocondrial
μM: Micromolar
xiv
RESUMO
Atualmente, complexos de rutênio têm demonstrado interessantes propriedades antineoplálicas, podendo representar novos e eficientes agentes terapêuticos a serem usados como fármacos alternativos a drogas de platina. Em comparação com os complexos de platina, os complexos baseados em rutênio são frequentemente identificados como menos tóxicos e capazes de contornar a resistência induzida por complexos de platina em células tumorais. Sendo assim, nos últimos 20 anos, um arsenal de complexos de rutênio (II) e (III) tem sido sintetizado e testado para potencial atividade antitumoral in vitro e in vivo. O presente trabalho teve como objetivo investigar in vitro os efeitos citotóxico e pró-apoptótico do complexo cloreto de cis-tetraaminodiclororutênio(III) frente à linhagem tumoral de carcinoma alveolar de pulmão humano (A549) e dos complexos de rutênio (II) coordenados a diferentes aminoácidos frente à linhagem tumoral S180 por meio das técnicas de ensaio de viabilidade celular, ensaio de cinética das fases do ciclo celular, ensaio de anexina V/iodeto de propídeo, ensaio de potencial de membrana mitocondrial, expressão gênica por PCR em tempo real e ensaio de western blotting. Por meio do ensaio de viabilidade celular pela técnica de redução do MTT, verificou-se que os complexos de rutênio (II) coordenados a aminoácidos apresentaram atividade citotóxica frente à linhagem tumoral S180 com valores de IC50 variando de 22,53 a 70,08 µM. Para o complexo de rutênio (III) cloreto de cis-tetraaminodiclororutênio, o valor de IC50 frente à linhagem tumoral A549 foi maior que 383 µM (IC50 > 383 µM). Adicionalmente, foi observado que complexos de rutênio (II) exibiram menor citotoxicidade sobre as células normais de fibroblasto de camundongo L929, com valores de IC50 variando de 27,39 a 106,72 µM. O ensaio clonogênico foi realizado em células tumorais A549 e, por meio dos resultados obtidos, verificou-se que em baixas concentrações do complexo cloreto de cis-tetraaminodiclororutênio (0,38 e 3,8 µM) houve diminuição na capacidade das células de formarem colônias e, em concentrações elevadas 95 e 383 µM, não houve a formação de nenhuma colônia. Na análise do ciclo celular de células tumorais S180 tratadas com o complexo de rutênio (II) RuGly, os resultados demonstraram que esse complexo aumentou o percentual de células na fase G0/G1, o que correlacionou com consequente diminuição do número de células na fase S do ciclo celular. Já em relação à atuação do complexo de rutênio (III) cloreto de cis-tetraaminodiclororutênio (III) frente à linhagem tumoral A549, verificou-se que este complexo aumentou o percentual de células na fase S. Na análise dos ensaios de apoptose, os resultados demonstraram que o complexo de rutênio (II) RuGly induziu morte celular via apoptose na linhagem tumoral S180, como evidenciado pelo aumento no número de células anexina V positivo, despolarização do potencial de membrana mitocondrial, ativação das caspase 3, 8 e 9 e aumento dos níveis de expressão de caspase-3 (mRNA) e bax (mRNA) e Bak (proteína). A expressão dos genes caspase-8, caspase-9 e p53 permaneceu inalterada no período de exposição analisado. Para o complexo rutênio (III), a indução de apoptose frente à linhagem A549 foi verificada através da presença de células Anexina positiva e picos em sub-G1 (indicativo de apoptose) e aumento dos níveis de mRNA de caspase 3. Além de morte celular via apoptose, observou-se que este complexo induziu morte por necrose, como verificado pelo aumento do número de células com marcação apenas para iodeto de propídeo. A partir dos resultados, conclui-se que ambos os complexos de rutênio (II) e (III) induzem atividade citotóxica frente aos modelos de células testadas, sendo que essa
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atividade está correlacionada com alterações nas fases do ciclo celular e indução de morte celular via apoptose, sendo promissores protótipos á fármacos frente aos modelos tumorais investigados. Palavras-chave: Apoptose; Ciclo Celular; Citotoxicidade; Complexos de Rutênio.
ABSTRACT Currently ruthenium complexes has demonstrated interesting anticancer properties and may represent new and effective therapeutic agents for use as drugs alternative to platinum drugs. Compared with drugs platinum, ruthenium-based complexes are often identified as less toxic and able to circumvent the resistance induced by platinum drugs in tumor cells. Thus, the last 20 years, an arsenal of ruthenium complexes (II) and (III) have been synthesized and tested for potential antitumor activity in vitro and in vivo. The present study aimed to investigate in vitro the cytotoxic and pro-apoptotic effect of the ruthenium complex cis-(dichloro)tetrammineruthenium(III) chloride against human lung alveolar carcinoma (A549) and complexes of ruthenium (II) coordinated to different amino acids against Sarcoma 180 tumor cells through the techniques of cell viability assay, kinetics of cell cycle phases assay, annexin V/propidium iodide assay, mitochondrial membrane potential assay, gene expression by real time PCR assay and western blotting assay. The cell viability assay by MTT reduction technique, it was found that complexes of ruthenium (II) coordinated to amino acids showed cytotoxic activity against S180 tumor cells with IC50 values ranging from 22.53 to 70.08 µM. For ruthenium complex (III) cis-(dichloro)tetrammineruthenium(III) chloride the IC50 value against A549 tumor cells was greater than 383 µM (IC50> 383 mM). Additionally, it was observed that complexes of ruthenium (II) exhibited low cytotoxicity on normal cells of mouse fibroblast L929, with IC50 values ranging from 27.39 to 106.72 µM. The clonogenic assay was performed in A549 tumor cells, and by the results obtained it was found that at low concentrations of the complex cis-(dichloro)tetrammineruthenium(III) chloride (0.38 and 3.8 µM) there was a decrease in the ability of cells to form colonies and at high concentrations 95 and 383 µM there was no colonies formation In cell cycle analysis of S180 tumor cells treated with complex of ruthenium (II) RuGly the results showed that this complex increased the percentage of cells in G0/G1, which correlated with consequent reduction in the number of cells in S phase. To complex of ruthenium (III) cis-(dichloro)tetrammineruthenium(III) chloride against A549 tumor cells, it was found that this complex increased the percentage of cells in S phase. In the analysis of apoptosis assays, the results showed that the complex ruthenium (II) RuGly induced cell death via apoptosis in S180 tumor cells as evidenced by the increase in annexin V positive cells, depolarization of the mitochondrial membrane potential, activation of caspase 3, 8 and 9 and increased expression levels of caspase-3 (mRNA) and bax (mRNA) and Bak (protein). The expression of genes caspase-8, caspase-9 and p53 remained unchanged during the period of exposure examined. For complex ruthenium (III) induction of apoptosis on A549 cells was verified by the presence of annexin V positive cells and peak in sub-G1 (indicative of apoptosis) and increased levels of mRNA of caspase 3. In addition cell death via necrosis was observed as verified by increased number of cells labeling with only propidium iodide. From the results it is concluded that both
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complexes of ruthenium (II) and (III) to induce cytotoxic activity against cell models tested and this activity correlates with alterations in cell cycle phases and induction of cell death via apoptosis and necrosis, being prototypes promising drugs against tumor models investigated. Keywords: Apoptosis; Cell Cycle; Cytotoxicity; Ruthenium Complexes.
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1. INTRODUÇÃO
1.1 Aspectos Gerais do Câncer
O câncer é uma doença genética que é designada por um conjunto de
manifestações patológicas que se caracterizam pela perda de controle da
proliferação celular e ganho de capacidade de invadir tecidos adjacentes ou de
sofrer metástases para tecidos distantes. Essa perda de controle é resultante de
alterações em genes relacionados à proliferação celular, diferenciação e morte
celular (PINTO e FELZENSZWALB, 2003; PARMIGIANI e CAMARGO, 2004).
Os genes envolvidos na perda do controle celular são divididos em duas
grandes classes: os proto-oncogenes, que estimulam o crescimento celular,
impedem a diferenciação e a morte celular, e os genes supressores de tumor, que
limitam a proliferação das células, controlando negativamente a proliferação e
sobrevivência celular. O desequilíbrio na regulação desse sistema, por meio da
ativação de proto-oncogenes ou da perda da função de genes supressores de
tumor, pode levar à proliferação descontrolada de células e ao acúmulo de
sucessivas anormalidades genéticas, características do câncer (DOUCAS e BERRY
2006).
O conjunto das alterações genéticas apresentadas conferem novas
características fenotípicas às células neoplásicas, garantindo a malignidade tumoral,
tais como: autossuficiência em sinais de crescimento (independem de fatores de
crescimento), resistência aos sinais antiproliferativos (insensíveis aos inibidores de
crescimento), resistência à morte celular, potencial replicativo ilimitado
(imortalidade), angiogênese sustentada (crescimento sustentado em células do
estroma para atrair novos vasos), evasão do sistema imunológico, invasão,
metástase, além de estresse metabólico, proteotóxico, mitótico, oxidativo e de dano
ao DNA (Figura 1) (HANAHAN e WEINBERG, 2011).
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Figura 1. Características das células neoplásicas (Modificado de HANAHAN e WEINBERG, 2011).
De acordo com Alberts (2010), os cânceres são classificados de acordo com
os tecidos e os tipos celulares dos quais eles derivam. Os cânceres derivados de
células epiteliais são denominados de carcinomas e representam,
aproximadamente, 90% dos cânceres humanos. E aqueles derivados do tecido
conjuntivo ou de células musculares são denominados de sarcomas. Os cânceres
que não se enquadram em nenhuma dessas duas grandes categorias incluem as
várias leucemias e linfomas derivados de células hematopoiéticas e representam 7%
das malignidades em humanos e os cânceres derivados de células do sistema
nervoso.
1.2 Epidemiologia do Câncer
No Brasil, as estimativas para o ano de 2014 apontam a ocorrência de
aproximadamente 580 mil casos novos de câncer, o que representa um aumento de
11% em relação à previsão nacional para 2012. Os cânceres mais incidentes na
18
população brasileira neste ano serão pele não melanoma (182 mil), próstata (69 mil),
mama (57 mil), cólon e reto (33 mil), pulmão (27 mil) e estômago (20 mil). Ao todo
estão relacionados na publicação os 19 tipos de câncer mais incidentes, sendo 14
na população masculina e 17 na feminina (INSTITUTO NACIONAL DO CÂNCER,
2014).
1.3 Tipos de tratamento para o câncer
De acordo com o Instituto Nacional do Câncer (2014), o tratamento do câncer
pode ser feito através de cirurgia, radioterapia, quimioterapia, hormonioterapia,
terapia-alvo ou transplante de medula óssea, sendo que o papel de cada um desses
tratamentos depende do tipo de tumor e de seu estágio de desenvolvimento. Em
muitos casos, é necessário combinar mais de uma modalidade.
Além dos tipos de tratamentos citados acima, outras modalidades de
tratamento, como a terapia fotodinâmica e a hipertermia (ainda em estudos clínicos),
têm sido utilizadas em combinação para o tratamento contra o câncer (DOLMANS et
al., 2003; RAO et al., 2010).
A quimioterapia é um dos métodos mais utilizados e consiste no uso de
agentes citotóxicos, que eliminam as células neoplásicas, diminuindo, assim, o
crescimento da massa tumoral e a proliferação desordenada das células. A
quimioterapia com fármacos citotóxicos é o principal método de tratamento de
alguns cânceres, mas tem tido uso crescente como adjuvante da cirurgia ou da
radioterapia em vários tipos de tumores. A introdução da quimioterapia aumentou
significativamente os índices de cura de alguns tumores, em especial das neoplasias
hematológicas (CHU e SARTORELLI, 2006; CHABNER et al., 2006). Progressos importantes na quimioterapia antineoplásica foram registrados na
área da biologia molecular e celular, o que facilitou, juntamente com o maior
entendimento do mecanismo de ação de muitas substâncias, a aplicação mais
racional dos quimioterápicos e o planejamento de novos fármacos. Muitas das
substâncias citotóxicas mais potentes atuam em fases específicas do ciclo celular e,
consequentemente, só exercem a sua atividade em células que se encontram em
processo de divisão. Sendo assim, os fármacos antineoplásicos apresentam melhor
atividade “antiproliferativa” do que antineoplásica, visto que atuam tanto em células
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normais com rápida divisão e células neoplásicas, acarretando assim diversos
efeitos colaterais (MCKNIGHT, 2003; CHABNER e ROBERTS, 2005).
Os agentes farmacológicos utilizados na quimioterapia do câncer incluem
uma grande variedade de compostos que atuam por vários mecanismos, entretanto
a maioria desses agentes atua sobre o DNA, impedindo a duplicação celular
(BOULIKAS et al., 2007).
De acordo com Rang e Dale (2007), os fármacos antineoplásicos podem ser
divididos nas seguintes categorias: os agentes alquilantes (mostarda nitrogenada,
etileniminas, alquilsulfonados, triazenos), que atuam formando ligações covalentes
com o DNA, impedindo assim sua replicação; os antimetabólitos (análogos das
purinas, análogos das pirimidinas e análogos do ácido fólico), que bloqueiam ou
subvertem uma ou mais vias metabólicas envolvidas na síntese de DNA; os
antibióticos citotóxicos (antraciclinas, mitoxantrona, dactinomicina, bleomicina e
mitomicina C) de origem microbiana, que impedem a divisão de células de
mamíferos; os antimitóticos (alcalóides da vinca, taxanos e camptotecina) que
afetam, especificamente, a função dos microtúbulos e, portanto, a formação do fuso
mitótico; os agentes diversos (dacarbazina, L-asparaginase, imatinibe) que não se
encaixam nas categorias anteriores. Este grupo inclui uma série de fármacos
desenvolvidos recentemente.
1.4 Sarcomas
Os sarcomas constituem um grupo heterogêneo de tumores sólidos raros
originados a partir de células mesenquimais, normalmente responsáveis pela
formação do músculo esquelético, músculo liso, gordura, tecido fibroso, osso e
cartilagem (TOLEDO, 2004; DEMETRI et al., 2010).
Por serem tumores de origem mesenquimal, estes apresentam diferentes
características patológicas e clínicas, sendo assim divididos em duas grandes
categorias: sarcomas de partes mole (gordura, músculo, nervos, vaso sanguíneo e
outros tecidos conectivos) e sarcoma ósseo. Sarcoma de partes moles são tumores
relativamente raros, correspondendo a apenas 1% das neoplasias malignas do
adulto. Nas crianças e adolescentes, 7% dos tumores malignos são sarcomas de
partes moles e 4,3% são tumores ósseos (TOLEDO, 2004; DEMETRI et al., 2010).
20
Existem três modalidades terapêuticas principais para o tratamento dos
sarcomas: a ressecção cirúrgica, que é a forma mais comum de tratamento para
sarcoma de partes moles, a radioterapia e a quimioterapia. Na quimioterapia, os
fármacos mais utilizados para o tratamento de sarcoma de partes moles são a
doxirrubicina, ciclofosfamida, ifosfamida, imatinibe e, além desses, vários outros
agentes antitumoras, tais como ecteinascidina, gemcitabina, paclitaxel, que têm sido
testados em pacientes (SPIRA e ETTINGER, 2002; SIEGEL et al., 2007)
A agressividade de sarcomas traduz-se pela recidiva frequente, sendo o
pulmão o alvo mais comum de metástases. Sarcomas de baixo grau, geralmente,
reincidem localmente e são tratados por meio de cirurgia e radioterapia. Já tumores
de alto grau tendem a reincidir sistematicamente e são tratados por quimioterapia,
geralmente utilizando combinações de fármacos. Apesar de diferentes protocolos
terapêuticos serem empregados para o tratamento de sarcomas, principalmente
através de combinações de fármacos, esses tumores são bastante resistentes aos
tratamentos, o que faz com que pacientes não respondam de forma adequada
(SPIRA e ETTINGER, 2002).
1.5 Câncer de pulmão
O câncer de pulmão é um dos tipos mais comuns de todos os tumores
malignos, apresentando mais de um milhão de novos casos por ano e um aumento
anual de 2% na sua incidência mundial. Estimativas demonstram que, no Brasil, em
2014 ocorreram cerca de 27.330 novos casos de câncer de pulmão, sendo 16.400
em homens e 10.930 em mulheres (INSTITUTO NACIONAL DO CÂNCER, 2014).
Evidências na literatura mostram que pessoas que têm câncer de pulmão
apresentam risco aumentado para o aparecimento de outros cânceres de pulmão.
Além disso, há outras evidências mostrando que irmãos, irmãs e filhos de pessoas
que tiveram câncer de pulmão apresentam risco levemente aumentado para o
desenvolvimento desse câncer (INSTITUTO NACIONAL DO CÂNCER, 2014).
Além da alta incidência entre os tumores malignos, o câncer de pulmão é uma
das neoplasias com menor taxa de cura, e isso está relacionado às dificuldades no
seu diagnóstico precoce e à resistência terapêutica. Em decorrência disso, o câncer
de pulmão permanece como uma doença altamente letal, uma vez que a taxa geral
21
de cura para pacientes portadores desse tipo de neoplasia é relativamente baixa
(BARROS et al., 2006).
De acordo com as características clinicopatológicas, o câncer de pulmão pode
ser classificado em dois tipos principais: (1) o Câncer de Pulmão de Células
Pequenas (CPCP) e (2) Câncer de Pulmão de Células Não Pequenas (CPCNP). O
câncer de células não pequenas corresponde a um grupo heterogêneo composto de
três tipos histológicos principais e distintos: carcinoma epidermoide, adenocarcinoma
e carcinoma de grandes células, ocorrendo em cerca de 75 a 85% dos pacientes
diagnosticados com câncer de pulmão. Dentre os tipos celulares restantes, destaca-
se o carcinoma indiferenciado de células pequenas (FERREIRA, 2004).
Do ponto de vista terapêutico, existem três métodos para o tratamento de
câncer de pulmão: cirurgia, radioterapia e quimioterapia, sendo que a quimioterapia
sistêmica é o método mais utilizado para pacientes com estágio avançado da
doença SOCINSKI, 2004).
A quimioterapia para CPCNP, que corresponde à maior parte dos cânceres de
pulmão, é baseada na utilização combinada de vários quimioterápicos à base de
platina, dentre eles a cisplatina. Além disso, a combinação de compostos de platina
com outros antitumorais, tais como placlitaxel e doxitaxel, é também utilizada no
tratamento do câncer de pulmão (LILENBAUM et al., 2005; STINCHCOMBE E
SOCINSKI, 2009).
Apesar da combinação de complexos de platina ser um dos principais métodos
para o tratamento do CPCNP, severa toxicidade e resistência terapêutica configuram
um dos principais obstáculos no tratamento de CPCNP. Diante desses problemas
apresentados na terapia para o câncer de pulmão, vários esforços têm sido
desenvolvidos na busca de novas drogas antitumorais, assim como novos alvos
terapêuticos, tais como indutores de apoptose que possam contribuir para uma
melhor resposta terapêutica (GRIDELLI et al., 2002; GIACONNE, 2002; LILENBAUM
et al., 2005).
1.6 Atuações dos fármacos quimioterápicos sobre o ciclo celular
As células dividem-se por meio de episódios bem definidos chamados na sua
coletividade de ciclo celular. O ciclo celular pode ser tipicamente dividido em quatro
22
fases (G1, S, G2 e M), sendo que a progressão de uma fase para outra é controlada
por uma maquinaria bioquímica conservada, que não apenas coordena esse
processo, mas também está ligada a sinais extracelulares de controle de
crescimento e proliferação (PINTO e FELZENSZWALB, 2003; TAJARA, 2004).
São consideradas essenciais a esse processo as quinases dependentes de
ciclina (CDK) juntamente com as proteínas ciclinas, as quais regulam a progressão
do ciclo celular positivamente e os inibidores de CDKs, os quais possuem um papel
fundamental na regulação negativa do ciclo celular. Os inibidores de CDKs,
chamados de CKIs (Inibidores de Quinase-Ciclina) podem ser classificados em dois
tipos principais: os inibidores universais e inibidores específicos. Dentre os primeiros,
podemos citar p21, p27 e p57, que atuam em diversos momentos do ciclo celular,
por meio de sua ligação a CDKs complexadas com as ciclinas. Dentre os inibidores
específicos está a família de genes INK4 (inibidores específicos da CDK4) p15, p16,
p18 e p19, que interferem na ligação das ciclinas D com as CDKs (PINTO e
FELZENSZWALB, 2003; SCHWARTZ e SHAH, 2005; TAJARA, 2004).
Outra proteína que tem papel fundamental na regulação do ciclo celular, assim
como na indução de apoptose, é a proteína p53, uma vez que, quando ocorrem
danos à molécula de DNA, essa proteína ativa a transcrição de vários genes
envolvidos no controle celular (p21, Gadd45), bem como genes envolvidos na
indução de apoptose bax (Proteína X associada ao Bcl-2) (SILVA, 2004).
Sendo assim, o controle do ciclo celular (checkpoints) representa um
mecanismo de “vigilância”, cujo papel-chave é o de evitar o acúmulo de erros
genéticos durante as divisões celulares, protegendo a integridade genômica das
células. Para garantir a fidelidade da duplicação, os checkpoints desempenham pelo
menos quatro tarefas: induzem rapidamente um retardo no ciclo celular; ajudam a
ativar o reparo do DNA; mantêm o ciclo celular bloqueado até que o reparo seja
completado e reiniciam a progressão do ciclo. Defeitos nesses mecanismos de
controle do ciclo podem resultar em instabilidades genômicas e levar à
transformação de células normais em células tumorais (BARTEK e LUKAS, 2007;
MOTOYAMA e NAKA, 2004).
Os mecanismos que regulam a progressão do ciclo celular geralmente são
interrompidos com frequência nas células tumorais, o que ressalta a importância da
sinalização dos checkpoints para manter a estabilidade do genoma (STEWART et
al., 2003).
23
A perda do controle do ciclo celular é uma das principais características dos
cânceres. Alterações nos componentes do ciclo celular e nas vias de sinalização dos
mecanismos de checkpoint ocorrem na maioria dos tumores humanos, sendo que
essas alterações genéticas são resultantes da desregulação de oncogenes e genes
supressores tumorais, os quais têm importantes implicações para a otimização dos
atuais regimes terapêuticos e para a seleção de novos alvos do ciclo celular
(STEWART et al., 2003).
Na quimioterapia antineoplásica, muitos fármacos exercem seus efeitos
citotóxicos principalmente através de sua atuação sobre o ciclo celular (Tabela 1),
sendo que a compreensão da cinética do ciclo celular é essencial para o uso
apropriado de novos fármacos antineoplásicos (CHABNER et al., 2006).
Considerando uma maior atividade em determinadas fases do ciclo celular, os
fármacos antineoplásicos são classificados em três categorias: 1) ciclo celular
específico/fase específica, 2) ciclo celular específico/fase não específica e 3) ciclo
não específico, que diz respeito a fármacos que não agem necessariamente em
fases de crescimento, mas em células em repouso (fase G0) (ALMEIDA et al.,
2005). A figura 2 demonstra a atuação dos fármacos antitumorais sobre o ciclo
celular.
Tabela 1: Efeito de fármacos antineoplásicos sobre o ciclo celular (Modificado de SHAH e SCHWARTZ, 2001).
Fármacos
Eventos do Ciclo Celular
Taxanos Bloqueio das células nas fases G1 e G2/M e induz apoptose
Cisplatina Bloqueio das células na fase G1 e induz apoptose
Campotecina Bloqueio das células nas fases G1 e G2 e induz apoptose
Fluorouracil Bloqueio das células no início da fase S
Muitos dos agentes antineoplásicos convencionais são genotóxicos e
desencadeiam respostas de ativação de checkpoints em ambos os tecidos normal e
tumoral. As células que são deficientes no controle dos checkpoints, geralmente, são
24
mais sensíveis aos danos genotóxicos ou microtubular do que células com
checkpoints ativos. No entanto, células tumorais com checkpoint funcionais são
susceptíveis a reduzir a eficácia desses medicamentos através do bloqueio da
progressão do ciclo celular e facilitar o reparo do dano induzido por fármacos
antineoplásicos (MEDEMA e MACUREK, 2012; GABRIELLI et al., 2012)
A radiação ionizante causa quebras de fita dupla no DNA, que induz ativação
dos checkpoints nas fases G1 e G2 do ciclo celular. Os antimetabólitos, como
hidroxiurea, bloqueiam a replicação, parando as células na fase S do ciclo celular. Já
os agentes alquilantes ou inibidores de Topoisomerase II ativam o checkpoint G2,
enquanto drogas antimitóticas acionam o checkpoint mitótico (GABRIELLI et al.,
2012).
Figura 2. Atuação dos agentes antineoplásicos sobre as fases do ciclo celular (ALMEIDA et al., 2005). 1.7 Modalidades de morte celular
De acordo com o Comitê de Nomenclatura sobre Morte Celular (NCCD), a
morte celular pode ser classificada de acordo com critérios morfológicos,
enzimáticos (sem envolvimento de nucleases ou com o envolvimento de distintas
25
classes de proteases como caspases, catepsinas e transglutaminase) e aspectos
funcionais (morte programada ou acidental, fisiológico ou patológico) (KROEMER et
al., 2009; GALLUZZI et al., 2012).
Considerando os vários critérios de classificação citados acima, os tipos de
morte celular, segundo Galluzzi et al. (2012), são: apoptose, necrose regulada,
autofagia e catástrofe mitótica (Figura 3). Além dessas, outras modalidades de morte
celular, tais como anóiques, entose, piroptose, têm sido citadas como novas
modalidades de morte celular.
Figura 3: Características morfológicas de diferentes tipos de morte celular (BRUIN e MEDEMA, 2008).
A autofagia é um processo catabólico altamente regulado que envolve a
degradação de componentes próprios de uma célula através da maquinaria
lisossomal. A autofagia desempenha um importante papel no crescimento celular,
desenvolvimento e homeostase, ajudando a manter um equilíbrio entre a síntese,
degradação e subsequente reciclagem dos produtos celulares. Durante a autofagia,
porções do citoplasma são englobadas por membranas, originando estruturas
denominadas autofagossomos. Estes irão se fusionar com os lisossomos, formando
os autolissomos, assim o conteúdo será degradado pelas hidrolases lisossomais.
Morfologicamente, a morte celular autofágica se caracteriza pela parcial
26
condensação da cromatina, ausência de fragmentação do DNA. Ao contrário do
processo de apoptose, as células que morrem por autofagia têm pouca ou nenhuma
associação com o processo de fagocitose (KELEKAR, 2006; KROEMER et al.,
2009).
Durante muito tempo, a morte celular por necrose tem sido considerada como
um mecanismo de morte acidental de células. No entanto, sabe-se que a necrose
pode ocorrer de maneira regulada através de um mecanismo chamado “necroptose”,
e que a morte celular necrótica tem um importante papel em processos fisiológicos e
patológicos (FULDA, 2013). Recentemente, o termo necroptose tem sido usado para
designar um determinado tipo de necrose programada que depende da atividade da
Proteína Quinase de Interação com Receptor-1 (RIPK1) (KROEMER et al., 2009).
Morfologicamente, a necrose é caracterizada por um aumento do volume
celular, acompanhado de inchaço de organelas, formação extensiva de vacúolos
intracelulares que culmina na ruptura da membrana plasmática e na perda de
conteúdo intracelular. Marcadores clássicos de apoptose, como condensação de
cromatina e fragmentação nucleossomal de DNA não são vistos em morte via
necrose (BROWN e ATTARDI, 2005). Entretanto, semelhantes à apotose, células
necróticas externalizam a fosfatidilserna antes da permeabilização da membrana
plasmática, promovendo, assim, o seu reconhecimento pelos fagócitos (GALLUZZI
et al., 2011).
Os mecanismos moleculares responsáveis pela necroptose estão sendo
identificados recentemente. É interessante observar que a necroptose pode ser
ativada pelos mesmos ligantes que ativam a apoptose, como, por exemplo, Fator de
Necrose Tumoral (TNF), Ligante de Receptor de Morte Celular (FasL) e Ligante
Indutor de Apoptose Relacionado ao Fator de Necrose Tumoral (TRAIL). Contudo,
os eventos que deflagram tais vias de morte ainda precisam ser mais esclarecidos
(GALLUZZI, 2012).
De acordo com Vandenabeele et al. (2010), a ativação da necroptose se dá
por meio de receptores de morte comuns à apoptose, como Receptor do Fator de
Necrose Tumoral-1 (TNFR1). Nessa via, o ligante TNFα se liga ao receptor TNFR1;
desse modo, essa interação aciona o recrutamento das proteínas de Dominío de
Morte Associado à TNFR (TRADD), RIP-1, (Proteínas inibidoras de Apotose) IAPs,
Fator Associado a TNFR2 (TRAF-2) e Fator Associado a TNFR5 (TRAF-5) que
constituem uma estrutura chamada de complexo I. As proteínas IAPs realizam a
27
poliubiquitinação de RIP-1, que aciona a ativação de NF-kB. No entanto, quando
RIP-1 sofre desubiquitinação, a composição do complexo se modifica e passa a ser
chamado de complexo II.
O complexo II também chamado de Complexo de Sinalização de Indução de
Morte (DISC) é constituído por RIP-1, Proteína Quinase de Interação com Receptor-
3 (RIPK-3), TRADD, Domínio de morte associada ao CD95 (FADD) e caspase-8. Na
presença de caspase 8 ativa, RIP-1 e RIP-3 são desativadas, acarretando apoptose.
No entanto, quando caspase-8 não pode ser ativada devido a condições genéticas
ou farmacológicas, RIP1 e RIP3 são fosforiladas, formando assim um complexo
molecular chamado de necrossoma (Figura 4). O necrosoma, por sua vez, estimula
para múltiplos sinais pró-necróticos, tais como: permeabilização da membrana
lisossomal e liberação citosólica de hidrolases lisossomais, ativação de
esfingomielinases (SMases) e alterações metabólicas nas mitocôndrias que resultam
na geração de espécies reativas de oxigênio (ROS), que irão danificar diretamente
macromoléculas, incluindo o DNA, proteínas, lípidos, e promover decréscimo
abrupto dos níveis de ATP (GALLUZZI et al., 2011; NIKOLETOPOULOU et al.,
2013).
Figura 4: Via de sinalização molecular da necroptose (TSUDA et al., 2012).
28
A catástrofe mitótica é uma modalidade de morte celular que ocorre durante a
mitose e é resultante de uma segregação cromossômica anormal ou de danos
induzidos à molécula de DNA, acoplada a defeitos nos checkpoints. Esses danos
normalmente levam a alterações morfológicas, como formação de células com
múltiplos micronúcleos (multinucleação) (CASTEDO et al., 2004; KROEMER et al.,
2009).
Danos que levam à catástrofe mitótica podem ser induzidos por agentes
hiperpolimerizadores (taxanos, epotilones), agentes despolimerizadores (como
alcalóides da vinca e colchicina) e por agentes que danificam o DNA. Células
tumorais são, na maioria das vezes, deficientes nos checkpoints do ciclo celular, o
que as tornam mais suscetíveis à mitose catastrófica após tratamento com fármacos
antineoplásicos (CASTEDO et al., 2004).
1.8 Apoptose
A apoptose é uma forma típica de morte celular programada que desempenha
um importante papel durante o desenvolvimento, a homeostase celular e em uma
variedade de doenças, como o câncer. As características morfológicas da apoptose
compreendem o encolhimento celular, condensação da cromatina e formação de
corpos apoptóticos. Essas alterações morfológicas podem ser acompanhadas por
alterações bioquímicas, como a externalização da fosfatidilserina na membrana
celular, ativação de proteases e fragmentação do DNA internucleossomal em
fragmentos de 180 a 200 pares de bases. No entanto, essas alterações bioquímicas
não devem ser utilizadas para definir morte celular via apoptose, uma vez que esse
tipo de morte celular pode ocorrer sem a fragmentação de DNA, assim como sem a
ativação de caspases (GALLUZZI et al., 2007; Liu et al., 2009).
A morte celular por apoptose pode ser mediada por meio de duas vias
principais: a via extrínseca, que é acionada por estímulos externos, através da
atividade de receptores específicos presentes na superfície celular, chamados
receptores de morte célular (TNF), e a via intrínseca ou mitocondrial, que ocorre por
meio de estresse intracelular. Essas vias culminam com a ativação de proteases
conhecidas como caspases executoras (GALLUZZI et al., 2012).
29
Caspases envolvidas na apoptose são geralmente divididas dentro de duas
categorias: caspases iniciadoras, que incluem caspases 2, 8, 9 e 10, e caspases
efetoras, caspases 3, 6 e 7 (SHI, 2002).
A via apoptótica extrínseca é desencadeada pela interação entre sinais de
morte celular TNFα, FASL/CD95 (Ligante de Receptor de Morte Celular), e TRAIL
(Ligante Indutor de Apoptose Relacionado ao Fator de Necrose Tumoral) e
receptores da família TNF-R (Receptor do Fator de Necrose Tumoral). Quando
ocorre essa interação, os receptores formam agregados que, na forma de trímeros,
ligam-se à proteína adaptadora FADD presente no citoplasma. Ocorre, então, a
ligação dessas moléculas à pró-caspase-8, resultando na formação de um complexo
denominado DISC, que culmina na autoclivagem e ativação da caspase 8. A
caspase 8 pode assim, diretamente ou pela via mitocondrial, ativar a caspases
efetoras 3 e 7, o que resulta na apoptose celular (Figura 5) (FULDA, 2009;
GALLUZZI et al., 2012).
Figura 5. Vias de sinalização intrínseca e extrínseca durante a apoptose (STEPHEN e GREEN, 2010).
30
Alternativamente, a ativação da via extrínseca pode ser desencadeada por
meio da via de receptores dependentes. Um exemplo diz respeito aos receptores
UNC5A-D e Deleção Carcinoma Coloretal (DCC), os quais exercem funções de
apoptose somente quando os níveis de seus ligantes (Netrina-1) estão em baixas
quantidades na célula. A indução de apoptose através do receptor DCC é ativada
quando, na ausência de seus ligantes, DCC interage com as proteínas TUCAN e
DRAL para a montagem do complexo, o qual irá ativar a pró-caspase-9. O receptor
UNC5-B, na ausência do seu ligante Netrina-1, induz a apoptose através do
recrutamento da proteína fosfatase 2A (PP2A), a qual irá realizar a
desfosforilação/ativação da proteína DAPK (Proteína Quinase serina/treonina
Associada à Morte). A proteína DAPK irá induzir a permeabilização da membrana
mitocondrial externa (MOMP) e a ativação das caspase 9 e caspase 8 (via Bid)
(Figura 6). Efectores a jusante da proteína DAPK permanecem desconhecidos, mas
DAPK é conhecida por induzir a morte celular por mecanismos dependentes e
independentes de p53 (GALLUZZI et al., 2012; DELCROS e MEHLEN, 2013).
Uma interação entre as vias extrínseca e mitocondrial ocorre em diferentes
níveis. Em alguns tipos de células, conhecidas como células de tipo I, a ativação de
caspase 8 é suficiente para ativar diretamente as caspases efetoras 3 e 7 para
completar a excecução da apopotse de uma maneira independente da via
mitocondrial. Já em células como hepatócitos e células pancreáticas β (células de
tipo II), caspase-8 medeia a clivagem proteolítica de Bid (Domínio de Morte de
Interação com BH3) que leva à geração da permeabilização da membrana
mitocondrial e, consequentemente, ativação da via intrínseca ou mitocondrial (LI e
YUAN, 2008; GALLUZZI et al., 2012).
31
Figura 6: Via de sinalização de receptores de morte e receptores dependentes (GALLUZZI et al., 2012).
Um dos mais importantes reguladores da via intrínseca é a família de
proteínas Bcl-2, a qual inclui membros pró-apoptóticos (Bax, Bak, Bad, Bid) e
antiapoptóticos (Bcl-2 e Bcl-x). Os membros antiapoptóticos agem como repressores
da apoptose, bloqueando a liberação de citocromo c, enquanto os membros pró-
apoptóticos atuam como promotores de apoptose (TSUJIMOTO, 2002; GHOBRIAL
et al., 2005).
A via intrínseca ou mitocondrial é desencadeada pela presença de sinais de
estresse intracelular, como estresse oxidativo, danos ao DNA, sobrecarga de Ca2+,
alterações metabólicas e redução de fatores de crescimento que ocasionam a
ativação de proteínas pró-apoptóticas da família Bcl-2, como Bax, Bak e Bid. A
ativação de Bid leva à ativação e migração da proteína pró-apoptótica Bax do
citoplasma para a mitocôndria, alterando sua permeabilidade e permitindo a
32
liberação de fatores apoptogênicos como o citocromo C, AIF (Fator Indutor de
Apoptose), Smac (Segundo Ativador de Caspase derivado da Mitocôndria)/DIABLO
(Inibidor Direto de Protéinas IAP), endonuclease G e Omi/HtrA2 para o citosol. Uma
vez no citosol, essas proteínas apoptogênicas acionam a morte celular através de
mecanismos independentes e dependentes de caspases (SAELENS et al., 2004).
Além da liberação de moléculas apoptogênicas, a alteração do potencial de
membrana mitocondrial interna e a transição da permeabilidade mitocondrial levam
ao colapso dessa membrana, interrompendo a síntese de ATP e aumentando,
consequentemente, a produção de espécies reativas de oxigênio (GALLUZZI et al.,
2012).
No mecanismo dependente de caspases, a liberação do citocromo c, a partir
da mitocôndria, leva à ativação de caspase-3 através da ligação do citocromo c à
proteína adaptadora Apaf-1 (Protease Apoptótica Ativadora de Fator 1) e a pró-
caspase 9, levando à formação do apoptossomo e à ativação da caspase 9, a qual
irá ativar outras caspases, como as pró-caspases 3 e 7, culminando na apoptose via
mitocondrial. As proteínas Smac/Diablo e Omi/HtrA2 facilitam a ativação das
caspases através do sequestro ou degradação de proteínas da família IAPs
(STEPHEN e GREEN, 2010; GALLUZZI et al., 2012).
Mecanismos envolvendo a participação de proteases, como Calpainas,
Catepsina B, Granenzima A e B, Omi/htra2, Endonuclease G e AIF, têm
demonstrado induzir morte celular programada por mecanismos independentes de
caspases. Essas proteases, na maioria das vezes, cooperam na via apoptótica
dependente de caspases. Entretanto, dados recentes sugerem que elas também
podem acionar mudanças morfológicas características de apoptose de maneira
independente de caspases. No mecanismo de apoptose independente de caspases,
as proteínas AIF e Endonuclease G relocam para o núcleo, onde atuarão através da
clivagem da molécula de DNA. Já a proteína Omi/htra2 atua por meio de sua
atividade serina protease e realiza a clivagem de vários substratos, dentre esses as
proteínas do citoesqueleto (JAATTELA e MATHIASEN, 2002; GALLUZZI et al.,
2012). A figura 7 demonstra a via mitocondrial independente de caspase.
33
Figura 7: Via de apoptose mitocondrial dependente e independente de caspases (GALLUZZI et al., 2012).
1.9 Mecanismos de morte celular e quimioterapia antineoplásica
A apoptose é um importante fenômeno na quimioterapia do câncer, uma vez
que a maioria das drogas anticâncer exerce seu efeito antitumoral através da
indução de apoptose. Vários trabalhos na literatura têm demonstrado que fármacos
convencionais, tais como flavopiridol, cisplatina, paclitaxel, doxorrubicina, induzem
apoptose em células tumorais in vitro (ACHENBACH et al., 2000; MIZUTANI et al.,
2005; BRENES et al., 2007). Em muitos casos, a terapia anticâncer eventualmente
resulta na ativação de caspases, sendo que essa ativação em resposta à
quimioterapia pode ser iniciada através da ativação da via extrínseca ou através da
mitocôndria pela estimulação da via intrínseca (FULDA e DEBATIN, 2006).
O processo apoptótico pela via intrínseca é regulado por diversos genes anti e
pró-apoptóticos, sendo que a indução de apoptose por fármacos quimioterápicos é
associada com a ativação de genes pró-apoptóticos (Bax e Bid) e a supressão de
genes antiapoptóticos (Bcl-2 e Bcl-x) (KIM et al., 2002; BRENES et al., 2007).
34
Em alguns tipos de tumores, como o câncer de pulmão e leucemias, uma das
maiores limitações para o potencial terapêutico dos quimioterápicos atuais é a
grande resistência aos estímulos apoptóticos induzidos pelos agentes antitumorais.
A atenuação de genes pró-apoptóticos e a alta expressão de genes antiapoptóticos,
tais como Bcl-2 e Bcl-x, contribuem para uma maior resistência desses tipos de
cânceres aos tratamentos quimioterápicos (KIM et al., 2002; GHOBRIAL et al., 2005;
VILLEDIEU et al., 2007; BRENES et al., 2007). Visto que a expressão desses genes
são fatores determinantes na sensibilidade de agentes quimioterápicos, isso faz com
que estes sejam um dos principais alvos moleculares de novos agentes terapêuticos
(SIMONIAN et al., 1997; CIARDIELLO e TORTORA, 2002; GHOBRIAL et al., 2005).
Embora as vias de apoptose e moléculas envolvidas na indução de apoptose
tenham demonstrado um papel crucial na morte de células tumorais em resposta a
agentes citotóxicos, o significado de apoptose como o principal mecanismo de morte
celular no câncer em resposta à quimioterapa antineoplásica tem sido questionado,
visto que até o momento nenhum padrão claro emergiu entre o nível de apoptose ou
de proteínas que regulam a apoptose e a resposta ao tratamento de tumores
sólidos. Apesar de significativa redução no volume do tumor, altas taxas de
apoptose nem sempre são vistas em tumores sólidos após quimoterapia, sugerindo
que outros tipos de modalidades de morte podem ocorrer como resultado do
tratamento quimioterápico (BRUIN e MEDEMA, 2008; FULDA e DEBATIN, 2006)
Além de morte celular por apoptose, as células tumorais podem também ser
eliminadas, após dano ao DNA, por necrose, catástrofe mitótica e autofagia. Assim
sendo, modalidades de morte celular independentes de apoptose têm sido levadas
em consideração após terapia citotóxica (FULDA e DEBATIN, 2006; BRUIN e
MEDEMA, 2008). Essas modalidades alternativas de morte celular podem
compensar a resistência apoptótica de alguns tumores à quimioterapia antitumoral.
A tabela 1 apresenta as vias de morte celular observadas após terapia antitumoral
(BROWN e ATTARDI, 2005).
Apesar das vias de sinalização e as moléculas envolvidas não terem sido
exatamente definidas, proteases como enzimas lisossomais e Polimerase 1 ADP-
ribose (PARP-1) podem estar envolvidas no processo de morte celular induzida por
quimitoterápicos (FULDA e DEBATIN, 2006).
35
Tabela 2: Modalidades de morte celular após terapia antitumoral (BROWN e
ATTARDI, 2005).
Tipo de Morte
Características gerais
Métodos de detecção
Apoptose
Encolhimento celular, condensação da cromatina, fragmentação DNA e formação de blebbs.
Ensaio TUNEL, Coloração Anexina-V, Ladder DNA, Citometira de fluxo para detectar células sub-G1, Alteração potencial Membrana Mitocondrial (ΔΨm).
Necrose
Aumento do volume celular, perda da integridade membrana, inchaço das organelas, formação de vacúolos intracelulares, cromatina não se condensa.
Coloração com corantes vitais (Azul tripan e Iodeto de propídeo), microscopia eletrônica.
Catástrofe Mitótica
Presença de micronúcleos, formação de células grandes ou multinucleadas.
Detecção por microscopia óptica ou eletrônica quanto à presença de micronúcleos após mitose, células multinucleadas e mitose aberrante. Acúmulo de células em G2/M e poliploidia.
Autofagia
Formação de vacúolos no citoplasma, degradação de componentes próprios da célula.
Imunoblotting com anticorpos específicos para LC3 (Proteína associada a microtúbulos), microscopia imunofluorescência (fusão GFP-LC3), microscopia eletrônica.
Senescência
Células são metabolicamente ativas, mas não se dividem, apresentam aumento no tamanho celular, células expressam β galactosidase associada à senescência.
Coloração para β galactosidase associada à senescência, Ausência de síntese DNA (Incorporação de BrdU).
1.10 Complexos à base de metal na quimioterapia antineoplásica
Sabe-se que complexos metálicos têm sido usados como agentes
36
terapêuticos desde a antiguidade, mas na maioria das vezes de forma empírica, com
poucas tentativas de projetar os compostos a serem utilizados e com pouca ou
nenhuma compreensão das bases moleculares de seu mecanismo de ação. O
grande interesse por compostos metálicos iniciou-se em 1960, com a descoberta e o
desenvolvimento da cisplatina como agente antitumoral (BAKHTIAR et al., 1999;
KELLAND, 2007; REISNER et al., 2008).
A descoberta da atividade antitumoral da cisplatina foi ao acaso, ocorreu
quando Rosemberg et al. (1965) estudavam os efeitos dos campos elétricos sobre o
crescimento celular bacteriano. Quando a corrente era fornecida através de
eletrodos de platina para o crescimento das bactérias, a divisão celular era inibida, e
elas passavam a crescer em forma de longos filamentos, que era o mesmo
fenômeno que ocorria quandos as bactérias eram tratadas com agentes alquilantes.
Verificou-se, então, que os íons de platina eram liberados a partir dos eletrodos
durante a eletrólise, e, na presença de sais de amônio e luz, a cisplatina (cis-
[Pt(NH3)2Cl4]) era formada.
A partir dessa descoberta, a pesquisa e o desenvolvimento de fármacos à
base de metais foram impulsionados e, desde então, complexos inorgânicos têm
sido alvo de inúmeras pesquisas terapêuticas, com numerosas aplicações em
diversos ramos da medicina, inclusive o câncer (DYSON e SAVA, 2006; SUSS-
FINK, 2010; SABALE et al., 2012).
Atualmente, centenas de análogos à cisplatina foram sintetizados e avaliados,
no entanto somente cinco compostos são utilizados na terapia antineoplásica (Figura
8): a carboplatina e oxaloplatina, que são utilizadas mundialmente, e a nedaplatina,
lobaplatina e heptaplatina, que são utilizados somente no Japão, China e Coreia
(HARTINGER et al., 2006).
A quimioterapia com complexos de platina é um dos principais pilares no
tratamento do câncer, visto que o uso de compostos de platina (sozinhos ou em
combinação) representam 40 a 80% dos tratamentos de pacientes com câncer. A
cisplatina é utilizada no tratamento de diversos tumores, dentre eles tumores de
ovário, testículo, bexiga, mama; a carboplatina é utilizada para tratamentos de
câncer de ovário; e, por último, a oxaliplatina, utilizada para câncer de coloretal
(KELLAND, 2007).
Embora a cisplatina seja usada já há algum tempo na quimioterapia de
diversos tipos de cânceres, o seu mecanismo de ação ainda não está
37
completamente esclarecido. No entanto, seu mecanismo de ação é comparável ao
dos agentes alquilantes. O mecanismo de ação da cisplatina baseia-se na sua
ligação covalente com o DNA, através da formação de aductos, originando ligações
intra e intercadeias, que induzem alterações estruturais no DNA. Essas alterações
inibem a transcrição e a replicação do DNA, levando à morte celular (PIZARRO e
SADLER, 2009).
Apesar da grande contribuição de fármacos à base de platina na
quimioterapia antineoplásica, sérios problemas são enfrentados durante a
administração desses fármacos, como sintomas gastrointestinais (náuseas, vômitos,
diarreia), nefro e neurotoxicidade. Outro problema enfrentado é a resistência, pois,
após 4 a 6 ciclos de tratamento, os tumores, inicialmente sensíveis ao medicamento,
tornam-se resistentes (KARTALOU e ESSIGMANN, 2001; JIRSOVA et al., 2006).
Essas limitações têm estimulado à busca de novos complexos metálicos de
transição, que apresentem reduzida toxicidade e melhor efetividade, tais como
complexos contendo rutênio, gálio, ferro, titânio, ouro (KOSTOVA, 2006; ALAMA et
al., 2009).
Figura 8: Estrutura química de fármacos à base de platina.
1.11 Complexos de Rutênio: Aspectos Estruturais e Atividade Antitumoral
As primeiras investigações sistemáticas de complexos de rutênio e suas
propriedades antitumorais foram realizadas por Clarke, em 1980, com os compostos
fac-[RuCl3(NH3)3] e cis-[RuCl2(NH3)4]Cl, precedido pela descoberta que rutênio
vermelho apresentava propriedades antitumorais. Mais adiante, estudos levaram ao
38
desenvolvimento de (H2im)[trans-RuCl4(Him)(DMSO)] (NAMI-A) e Indazolium trans-
[tetrachlorobis(1H-indazole)ruthenate(III) (KP1019) (Figura 9), sendo os primeiros
potenciais fármacos antitumorais à base de rutênio a entrarem em triagens clínicas
(RADEMAKER-LAKAHAI et al., 2004; HARTINGER et al., 2006).
Em estágios pré-clínicos, NAMI-A demonstrou marcante eficácia contra
processos de metástases de câncer de pulmão e, atualmente, está sendo estudado
para o uso como uma terapia de segunda linha contra NSCLC em combinação com
o fármaco Gemcitabina (Bergamo et al., 2012). KP1019 apresentou potencial
atividade antitumoral contra carcinoma coloretal, induzindo aumento de ROS e
morte celular via apoptose (PACOR et al., 2004; KAPITZA et al., 2005a).
Além de NAMI-A e KP1019, um grande arsenal de complexos de rutênio (II) e
(III) com diferentes ligantes (amina, polipiridil, arenos) tem sido testado em ensaios
pré-clíncios para potencial atividade antitumoral (SILVEIRA-LACERDA et al., 2009;
CORRAL et al., 2009; SUSS-FINK, 2010; MARTÍNEZ et al., 2010; CHEN et al.,
2010; LI et al., 2012).
Os complexos de rutênio em estudos têm demostrado interessantes
propriedades anticâncer, podendo representar novos e eficientes agentes
terapêuticos a serem usados como fármacos alternativos à platina. Em comparação
aos fármacos de platina, os complexos baseados em rutênio são frequentemente
identificados como menos tóxicos e capazes de contornar a resistência induzida por
farmácos baseados em platina nas células cancerosas (HARTINGER et al., 2006).
Estudos de aplicações biológicas com complexos de rutênio têm sido
facilitados pela ampla variedade de coordenação química, vários estados de
oxidação (Ru (II), Ru (III) e Ru (IIV) em condições fisiológicas e uma maior taxa de
substituição de ligante na estrutura do complexo (LEVINA et al., 2009).
Uma das principais diferenças entre complexos de rutênio e cisplatina está
relacionada à geometria, uma vez que complexos de rutênio apresentam geometria
octaédrica, enquanto que os de cisplatina possuem estrutura quadrado-planar. Essa
característica química faz com que os mecanismos de ação de agentes à base de
rutênio sejam supostamente diferentes de compostos à base de platina. Sendo
assim, o diferente modo de ação desses agentes pode ser um dos motivos por que
complexos de rutênio, como, por exemplo, KP1019, apresentam atividade em
tumores resistente à cisplatina (HARTINGER et al., 2006).
39
Figura 9: Estrutura química KP1019 e NAMI-A (JAKUPEC et al., 2008)
Recentemente, nosso grupo de pesquisa vem trabalhando com complexos de
Ru (II) e Ru (III) com diferentes ligantes coordenados ao íon rutênio. Em estudos
realizados com o complexo de rutênio (III) com ligante amina, verifcou-se que esse
composto induziu atividade citotóxica in vitro em diferentes linhagens celulares, tais
como K562 (Leucemia Mieloide Crônica), SKBR-3 (Carcinoma de mama), A-20
(Linfoma murino) e S180 (Sarcoma 180 murino). Além de apresentar atividade in
vitro, estudos prévios demonstraram que esse mesmo complexo apresentou
atividade antitumoral in vivo sobre tumor Sarcoma 180 murino (S180) e, além disso,
aumentou o tempo de vida dos animais tratados com esse complexo (MENEZES et
al., 2007; SILVEIRA-LACERDA et al., 2009; LIMA et al., 2010a).
Outros complexos de rutênio que apresentaram promissores resultados são
os complexos de rutênio (II) coordenados a aminoácidos. Em estudos prévios
realizados por Almeida (2009), esses complexos apresentaram atividade citotóxica
frente ao modelo celular de carcinoma de mama (MDA), com citotoxicidade superior
ao agente antitumoral cisplatina.
Sabe-se que complexos de rutênio (II) e (III) podem se ligar ao DNA, assim
como complexos de platina, sendo que esse pode ser um dos possíveis
mecanismos pelos quais complexos de rutênio (II) e (III) induzem citotoxicidade (LIU
et al., 2005; MORENO et al., 2011). Semelhante a fármacos à base de platina, a
40
interação de complexos de rutênio com o DNA ocorre preferencialmente através do
N7 da guanina (GALLORI et al., 2000; CHEN et al., 2003).
A formação de aductos é uma das principais formas que complexos de rutênio
(II) e (III) se ligam à molécula de DNA, o que acarreta a mudança de conformação
do DNA e, consequentemente, indução de morte celular. Em geral, complexos de
rutênio podem se ligar ao DNA por meio de ligações eletrostáticas, intercalações e
ligações covalentes (ZHANG; CHEN; LIANG, 2010; LIU et al., 2010; MORENO et
al., 2011). Além de interagir diretamente com a molécula de DNA, dados recentes
apontam que complexos de rutênio (II) podem também inibir a atividade de
topoisomerases, por meio de ligações diretas às topoisomerases I e II. Essa
atividade de complexos de rutênio sobre as topoisomerases pode levar à interrupção
da maquinaria celular envolvida na replicação e transcrição (GAO et al., 2007; DU et
al., 2011).
Ao contrário da visão que o principal alvo de complexos de rutênio é o DNA,
estudos têm demonstrado que mecanismos independentes do DNA, como inibição
de metaloproteases e interferência com processos de adesão e metabolismo do
óxido nítrico, podem ser responsáveis pelos efeitos antitumorais de alguns dos
complexos de rutênio. Os mecanismos pelos quais complexos de rutênio exercem
sua atividade de maneira independente do DNA têm sido demonstrados por meio de
estudos com o complexo de rutênio (III) NAMI-A, o qual tem demonstrado exercer
seu efeito antimetastático possivelmente pela atuação sobre moléculas de adesão
(MORBIDELLI et al., 2003; SAVA et al., 2003; PACCOR et al., 2004). Apesar de
alguns estudos demonstrarem que NAMI-A pode interagir com o DNA in vitro, a
ligação ao DNA não parece contribuir para o seu efeito antimetastático (PLUIM et al.,
2004).
Outro complexo que apresenta atividade antimetastática e cuja atividade não
está relacionada à interação com o DNA é o composto de rutênio (II) areno RAPTA-
T. Semelhante ao NAMI-A, a atividade desse complexo está relacionada a
interações com proteínas da superfície e matriz extracelular (BERGAMO et al.,
2008).
1.12 Mecanismo de ativação de complexos rutênio (III)
41
Apesar de a maioria das drogas antitumorais não possuir especificidade às
células tumorais, os compostos de rutênio têm demonstrado baixa toxicidade
sistêmica quando comparado a compostos de platina, e isso pode estar
relacionado a um novo mecanismo de ação proposto (Figura 10) (BERGAMO et
al., 1999; ALLARDYCE e DYSON, 2001).
A baixa toxicidade de complexos de rutênio (III) comparada a drogas de
platina tem sido atribuída à habilidade de compostos de rutênio se acumularem
especificamente em tecidos tumorais. Sendo assim, a alta especificidade desses
compostos a células tumorais pode estar relacionada à seletiva absorção pelo tumor
comparado ao tecido sadio e à ativação por redução para espécies citotóxicas
dentro do tumor. No entanto, complexos de rutênio (III) servem como pró-fármacos,
que precisam ser reduzidos em espécies mais reativas para desenvolver seu
potencial farmacológico. Essa “ativação por redução” é favorecida por condições de
hipóxia e pH levemente ácido encontrado nos tecidos tumorais, o que favorece a
redução do estado de oxidação do rutênio (III) para rutênio (II) nessas células
(BERGAMO et al., 1999; CLARKE, 2003).
Além da ativação por redução, algumas hipóteses referentes às propriedades
químicas de complexos de rutênio, como (1) taxa de substituição de ligante, (2)
estados de oxidação acessíveis e (3) habilidade desse elemento de mimetizar o
ferro na ligação a várias biomoléculas, incluindo a transferrina e a albumina, faz com
que complexos de rutênio sejam melhores disponíveis para aplicações biológicas
quando comparados a complexos de platina. As três propriedades dos complexos de
rutênio (III) proposta por Allardyce e Dison (2001) estão descritas abaixo:
1) Mudança de ligante
Muitos complexos de rutênio têm sido avaliados em testes pré-clínicos,
particularmente no tratamento do câncer, devido, em parte, ao fato de os complexos
Ru(II) e Ru(III) apresentarem cinéticas de mudança de ligantes similares aos
complexos de Pt(II). Mudança de ligante se mostra como um importante e
determinante fator da atividade biológica, uma vez que muitas drogas de metal
atingem o alvo biológico sem serem modificadas. Muitas resistem às interações com
macromoléculas, como as proteínas ou pequenos compostos doadores de enxofre
42
ou água. Algumas interações são essenciais para induzir as propriedades
terapêuticas desejáveis dos complexos.
2) Estados de oxidação
Rutênio é o único elemento químico entre o grupo de metais de transição em
que os estados de oxidação Ru(II), Ru(III) e Ru(IV) são todos acessíveis em
condições fisiológicas. Nesses estados, o centro de coordenação do rutênio é,
predominantemente, hexacoordenado com geometria essencialmente octaédrica. No
sistema biológico, a redução de Ru(IV) e Ru(III) é favorecida pela glutationa,
ascorbato e proteínas transportadoras de um único elétron, enquanto que o O2 e o
citocromo oxidase promovem a oxidação do Ru(II).
3) Mimetização do ferro
A baixa toxicidade dos complexos de rutênio é explicada pela habilidade que
esse elemento tem de imitar o ferro na ligação em várias biomoléculas, incluindo a
transferrina e a albumina. Em mamíferos, essas duas proteínas são responsáveis
pela solubilização e transporte de ferro, reduzindo a toxicidade desse metal. Em
condições fisiológicas, a transferrina circula no sangue com cerca de 30% de
saturação de Fe(III) e, portanto, está disponível como proteína transportadora para
outros íons metálicos trivalentes. As células tumorais apresentam um requerimento
elevado de ferro, o que faz com que essas células tenham uma maior quantidade de
receptores sobre a superfície celular, resultando no sequestro de mais transferrinas
circulantes. Atingindo o interior das células tumorais ou dos endossomos, o baixo pH
e o potencial de redução do complexo transferrina-Ru acessível em condições
fisiológicas favorecem a liberação de compostos de rutênio dos sítios de ligação da
apoproteína.
43
Figura 10. Mecanismo hipotético de ativação por redução de complexos de rutênio (III) sobre células tumorais (Modificado de ALLARDYCE e DYSON, 2001).
Estudos in vivo demonstram um aumento de 2 a 12 vezes na concentração de
rutênio em células tumorais quando comparado a células sadias, indicando uma
maior captação específica desse metal (ALLARDYCE e DYSON, 2001).
O mecanismo de ativação por redução de complexo de rutênio (III) tem sido
um tópico bastante citado e discutido em diversos trabalhos, no entanto, para
complexos de rutênio (II), que é a forma ativa que interage com o DNA, pouco se
sabe sobre a seu mecanismo de entrada na célula. A maioria dos trabalhos explora
bastante a interação desses complexos com o DNA, mas os processos que ocorrem
até essa interação ainda foram não foram esclarecidos.
O mecanismo de ação proposto para o complexo de rutênio (III) KP1019
envolve o seu transporte pela transferrina, bem como a indução de apoptose via
processos mitocondriais. Existe também a possibilidade de uma interação direta com
o DNA, induzindo a morte celular (KAPITZA et al., 2005). A figura 11 demonstra o
possível mecanismo de ação para o complexo KP1019.
44
Figura 11: Representação esquemática do mecanismo de ação do complexo de rutênio (III) KP1019 (Modificado de JAKUPEC et al., 2008).
1.13 Categorizações de complexos metálicos
O desenvolvimento de novos compostos metálicos com propriedades
antineoplásicas é um grande desafio para os químicos inorgânicos. Sendo assim,
com o objetivo de contribuir para a racionalização dessa área, Gianferrara et al.
(2009) categorizaram os compostos metálicos em cinco classes com base em seu
mecanismo de ação:
i) Compostos funcionais: metal com um papel funcional – a atividade proveniente de uma ligação direta do metal ao alvo biológico;
Em compostos funcionais, a coordenação do metal para o(s) alvo(s)
biológico(s) é a interação principal responsável pela atividade antitumoral. Os
complexos funcionais devem ser ativados por meio de reações de redução/oxidação
ou aquação. Esses compostos metálicos devem ter, pelo menos, um ligante lábil que
possa ser substituído, proporcionando uma posição de coordenação disponível para
a ligação com o alvo. Infelizmente, compostos funcionais são mais tóxicos, uma vez
45
que eles podem reagir com várias biomoléculas, não apresentando seletividade para
células do câncer.
ii) Composto estrutural, o metal com um papel estrutural – a forma do composto afeta a ligação com o alvo biológico através de interações não
covalentes;
Para os compostos metálicos estruturais, o metal não se liga diretamente ao
alvo biológico. Esses irão interagir de forma não covalente com o DNA, semelhante
à intercalação de doxorrubicina ao DNA. Geralmente, esses compostos são
organometálicos, sendo mais estáveis e menos tóxicos quando comparados aos
compostos funcionais.
iii) O metal como um transportador para os ligantes ativos que são
administrados in vivo e/ou o metal também pode proteger os ligantes antes de atingir o alvo biológico;
Na terceira classe dessa classificação, não é esperado que o metal tenha
uma atividade própria. O metal atua como um portador para ligantes ativos e
também protege os ligantes antes que eles atinjam o alvo biológico.
iv) O composto metálico comporta-se como um catalisador, in vivo, através da produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) que causam danos às células;
Na quarta classificação, os compostos de metal podem se comportar como
catalisadores in vivo, por meio da produção de espécies reativas de oxigênio (ROS),
que causam danos às células.
v) O composto metálico é fotoativo e se comporta como uma fotossensibilizador.
O último grupo dessa classificação inclui compostos de metais fotoativos que
se comportam como fotossensibilizadores. Esses complexos podem ser utilizados
em terapia fotodinâmica, em que o composto fotossensibilizador não tóxico é
exposto seletivamente para comprimentos de onda específicos, em geral por meio
de lasers, em que os complexos se tornam tóxicos para as células tumorais
específicas.
46
A classificação de complexos metálicos anticâncer baseado na ação de
metais em seu possível modo de ação pode ajudar na concepção de novos
compostos e/ou levar a estudos biológicos de compostos de metais anteriormente
negligenciados.
47
2. JUSTIFICATIVA
Mundialmente, enormes recursos estão sendo investidos em prevenção,
diagnóstico e tratamento de câncer. O câncer é uma das principais causas de morte
no mundo e, atualmente, a descoberta e o desenvolvimento de agentes
antineoplásicos é o foco principal de várias empresas farmacêuticas, bem como
entidades sem fins lucrativos governamentais e não governamentais, como o
Instituto Nacional do Câncer (NCI), nos Estados Unidos, a Organização Europeia
para a Investigação e Tratamento do Câncer (EORTC), dentre outros. Diversas
pesquisas na área oncológica têm sido realizadas, a fim de desenvolver novos
fármacos antineoplásicos inovadores que sejam mais eficazes e menos agressivos
para o paciente.
A alta especificidade de fármacos antineoplásicos para células tumorais é um
dos principais objetivos para o tratamento do câncer, no entanto os fármacos
convencionais existentes no mercado acarretam diversos efeitos colaterais aos
pacientes, visto que causam danos tanto em células tumorais quanto em células
sadias. Dentre esses danos causados por fármacos antineoplásicos estão os danos
à molécula de DNA de células normais, o que pode acarretar possíveis efeitos
danosos às células. Com o intuito de reduzir os efeitos tóxicos e melhorar a eficácia
terapêutica, uma série de complexos à base de metais tem sido desenvolvida, e,
dentre esses, um dos mais promissores são os compostos à base de rutênio, os
quais têm demonstrado grande potencial antitumoral com baixa citotoxicidade e
genotoxicidade para células normais.
Na busca por novos agentes inovadores para terapia antineoplásicos e
partindo dos conhecimentos prévios de que compostos de rutênio apresentam
propriedades antitumorais favoráveis com menor índice de toxicidade, investigações
do potencial citotóxico e mecanismos de morte celular de novos complexos de
rutênio (II) coordenados a aminoácidos e complexo de rutênio (III) se tornam
importantes para a busca de novos agentes antitumorais, a fim de que seja possível
desenvolver novos agentes anticâncer que sejam menos agressivos e mais eficazes
para os pacientes.
48
3. OBJETIVO GERAL
Avaliar a ação citotóxica do complexo de rutênio cloreto de cis-
tetraaminodiclororutênio(III) e de diferentes complexos de rutênio (II) coordenados a
aminoácidos frente a linhagens celulares tumorais e linhagem normal e selecionar o
complexo mais promissor para avaliação da interferência nas fases do ciclo celular e
de seu mecanismo de morte celular.
3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS – ARTIGO 1
- Avaliar o efeito citotóxico do complexo cloreto cis-tetraaminodiclororutênio(III) sobre
a linhagem tumoral humana A549;
- Avaliar a capacidade de células A549 de formarem colônias após tratamento com o
complexo de rutênio (III);
- Investigar o efeito do complexo de rutênio (III) sobre as diferentes fases do ciclo
celular;
- Investigar o efeito do complexo de rutênio (III) sobre a indução de morte celular
apoptótica ou necrótica;
- Investigar o efeito do complexo de rutênio (III) sobre a expressão do gene pró-
apoptótico caspase-3.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS – ARTIGO 2
- Realizar a triagem citotóxica de cinco complexos de rutênio (II) coordenados a
aminoácido frente à linhagem tumoral S180 e à linhagem normal L929, através do
ensaio colorimétrico MTT e selecionar o complexo mais promissor para os ensaios
seguintes;
- Avaliar o efeito do complexo de rutênio (II) sobre as diferentes fases do ciclo
celular;
49
- Investigar o efeito do complexo de rutênio (II) sobre a indução de morte celular
apoptótica ou necrótica;
- Investigar o efeito do complexo de rutênio (II) sobre a atividade das caspase 3,
caspase-8 e caspase-9;
- Avaliar o efeito do complexo de rutênio (II) sobre o potencial de membrana
mitocondrial, através do ensaio de marcação com o corante JC-1;
- Vericar a interação do complexo de rutênio (II) com o DNA;
- Avaliar o efeito do complexo de rutênio (II) sobre a expressão da proteína Bak
envolvida no processo de indução de apoptose;
- Investigar o efeito do complexo de rutênio (II) sobre a expressão dos genes pró-
apoptóticos caspase-3, caspase-8 e bax e do gene p53.
50
4. MATERIAL E MÉTODOS
A metodologia do trabalho foi desenvolvida de acordo com o fluxograma abaixo:
4.1. Síntese dos complexos de rutênio (II) e (III)
O complexo cloreto de cis-tetraaminodiclororutênio (III) foi sintetizado no
Laboratório de Química do Instituto de Química da Universidade Federal de
Uberlândia. Já os complexos de rutênio (II) coordenados aos aminoácidos ácidos
aspártico, alanina, glicina, metionina e leucina, representados no texto como
RuAc.Asp, RuAla, RuGly, RuMet e RuLeu, respectivamente, foram sintetizados no
51
Laboratório de Química do Instituto de Química da Universidade Federal de São
Carlos e encaminhados ao Laboratório de Genética Molecular e Citogenética da
Universidade Federal de Goiás (UFG) para realização dos ensaios de atividade
biológica. A tabela 3 apresenta a estrutura química dos complexos de rutênio (II)
sintetizados para este estudo. Tabela 3: Estrutura química e tipo de aminoácidos inseridos na estrutura dos
complexos de rutênio (II).
Estrutura Química Aminoácido
[Ru(Ac.Asp.)(bipy)(dppb)]PF6 Ácido Aspástico
[Ru(Ala)(bipy)(dppb)]PF6 Alanina
[Ru(Gly)(bipy)(dppb)]PF6 Glicina
[Ru(Leu)(bipy)(dppb)]PF6 Leucina
[Ru(Met)(bipy)(dppb)]PF6 Metionina
4.2 Preparação de complexos de rutênio
Para os ensaios biológicos, os complexos de rutênio (II/III) e o fármaco
antitumoral cisplatina (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo) foram pesados e dissolvidos em
dimetil sulfóxido (DMSO) 0,1%.
4.3 Linhagens celulares e manutenção do cultivo celular
Para os ensaios biológicos, foram utilizadas as linhagens tumorais
estabelecidas carcinoma alveolar de pulmão humano (A549) (ATCC®# CCL-185) e a
linhagem tumoral de camundongo Sarcoma 180 (S-180) (ATCC®# TIB-66) e como
célula normal (basal) foi utilizada a linhagem estabelecida de fibroblasto de pulmão
de camundongo (L929) (ATCC®# CCL-1TM). As células tumorais foram mantidas em
cultura a 37oC, 5% CO2 em meio RPMI 1640 (linhagem tumoral S180) e DMEM
52
(linhagens L929 e A549) suplementado com 10% de soro bovino fetal, 100IU mL-1
de penicilina e 100 µg mL-1 de estreptomicina segundo protocolo estabelecido pela
American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, EUA).
4.4 Ensaio de Viabilidade Celular pelo Método Redução do MTT
Para avaliar a atividade citotóxica do complexo rutênio (III) cloreto cis-
tetraaminodiclororutênio(III) e dos complexos de rutênio (II) (RuAc.Asp, RuAla,
RuGly, RuMet e RuLeu), foi utilizado o método colorimétrico do MTT (3-(4,5-
Dimetiltiazol-2-il)2,5-Difenil Brometo de Tetrazolium). O princípio desse método
descrito por Mosman (1983) consiste em medir indiretamente a viabilidade celular
pela atividade enzimática mitocondrial das células vivas. Para o teste do MTT, 1 x
105 de células S180 e 2 X 104 de células L929, foram semeadas em microplacas de
96 poços na ausência ou presença do complexo de rutênio (II) (0,2 a 200 µM ) ou
cisplatina (0,2 a 200 µM ), para a linhagem tumoral A549, 1 x 105 de células foram
semeadas na ausência ou presença do complexo de rutênio (III) cis-
tetraaminodiclororutênio (0,38 a 383 µM). Após tratamento de 48 horas, as células
foram incubadas em estufa a 37°C com atmosfera contendo 5% de CO2. Ao final do
período de incubação, foram adicionados aos poços de cultivo celular 10 μL de MTT
na concentração de 5 mg.mL-1, e após 3h de incubação com o MTT, foram
acrescentados 50 μL SDS a 10% diluído em HCL/0,01N. A quantificação da
densidade óptica (DO) foi medida em espectrofotômetro (Awareness Technology
INE/ Stat Fax 2100). A porcentagem de viabilidade celular foi determinada a partir da
seguinte fórmula: % Viabilidade = Absorbância do Tratamento/Absorbância do
controle negativo*100. O valor de IC50 (concentração em µM que inibe 50% da
viabilidade celular) foi determinada por meio da curva dose resposta utilizando o
programa estatístico GraphPad Prism 4.02 (GraphPad Software, San Diego, CA,
USA). A partir dos valores de IC50 obtidos sobre células tumorais S180 e célula
normal L929, foi selecionado o complexo de rutênio (II) mais promissor para os
ensaios de apoptose e ciclo celular.
4.5 Ensaio de Citotoxicidade pela Técnica de Azul de Tripan
53
A citotoxicidade após exposição a compostos pode ser medida pela exclusão
de corantes supravitais, como o azul de tripan. O princípio desse teste consiste em
medir indiretamente a viabilidade celular através da integridade de membrana. As
células mortas que apresentam a membrana danificada absorvem esse corante e,
consequentemente, coram-se em azul, já as células vivas permanecem intactas sem
coloração (PERES e CURI, 2005).
Para o ensaio de azul de tripan, foram realizados os mesmos procedimentos
de plaqueamento conforme item 4.3 para os complexos de rutênio (III) sobre a
linhagem A549. Ao final do período de 48 horas de incubação, alíquotas de 10 μL
de suspensão celular foram colocadas em 40 μL de azul de tripan a 0.4%, e dessa
solução foi retirada uma alíquota para contagem de células em câmara de neubauer.
Para determinar a porcentagem de citotoxicidade, foi utilizada a seguinte fórmula % Citotoxidade: (100 - n° células tratadas/n° células controle negativo*100). Ambos os
ensaios MTT e Azul de tripan foram utilizados para calcular o valor da IC50. Para os
ensaios foram realizados três experimentos independentes feitos em triplicata para
todos os ensaios.
4.6 Ensaio de Sobrevivência Clonogênica
Para analisar a capacidade proliferativa das células de formarem colônias
após exposição a um determinado agente antiproliferativo, utiliza-se o ensaio de
sobrevivência clonogênica (PLUMB, 2004). Para verificar a capacidade de células de
formarem colônias após tratamento com o composto de rutênio, foi utilizado o ensaio
de sobrevivência clonogênica, onde 3 x 102 células tumorais A549 foram
semeadas em frascos de cultura de 25 cm2 por um período de 24 horas para
aderência das células. Após esse período, foi retirado todo o meio celular e, em
seguida, as células foram tratadas com diferentes concentrações do composto cis-
tetraaminodiclororutênio(III) (0,38; 3,8; 95 e 383 µM) por 48 e 72 horas. Após os
períodos de tratamento, as células foram lavadas com solução de PBS para retirada
do complexo de rutênio e, em seguida, foi adicionado as garrafas meio de cultura
celular. Posteriormente, as células foram incubadas por 10 dias, sendo as culturas
observadas diariamente com o auxílio de microscópio invertido (Leica). Ao final do
período de incubação, o meio de cultura foi descartado e as células foram lavadas
54
com solução de PBS. Em seguida, as células foram fixadas com uma solução de
metanol/ácido acético/água na proporção de 1:1:8, respectivamente, por 30 minutos
e, após período de fixação, as células foram coradas com Giemsa (5%) por 15
minutos. Para análise densidométrica do crescimento clonogênico, os frascos de
cultura foram escaneados em impressora multifuncional e, posteriormente, foi feita a
análise do número das colônias formadas por meio do software Clono-Counter.
4.7 Análise da Cinética do Ciclo Celular por Citometria de Fluxo
As fases do ciclo celular podem ser caracterizadas por variações no seu
conteúdo de DNA, que, quando analisado por citometria de fluxo após marcação
com iodeto de propídeo, permite quantificar a percentagem de células em cada fase
do ciclo celular. Para essa análise, 5 x 105 de células A549 e S180 foram icubadas
na ausência ou presença dos complexos cloreto cis-tetraaminodiclororutênio(III)
(383µM) e complexo de rutênio (II) (RuGly 40µM), respectivamente, por períodos de
24 e 48 horas. Após exposição das células aos complexos de rutênio, essas foram
centrifugadas e, em seguida, lavadas com PBS. Ao final da lavagem, o
sobrenadante foi desprezado, e o “pellet” celular foi incubado com 1 mL de álcool
etílico gelado (70%) por 24 horas a -20°C. Ao final da incubação, as células foram
lavadas novamente com PBS e, em seguida, essas foram incubadas por 15 minutos
em uma solução contendo ribonuclease A (RNase A) 0.05% e iodeto de propídio (50
µg.mL-1). A análise da porcentagem de células em sub-G1, G0/G1, S e G2/M foi
realizada em citômetro de fluxo (FACSCalibur, BD Biosciences), através do software
ModFit.
4.8 Ensaio Apoptose (Anexina V-FITC/Iodeto de Propídio)
A externalização de fosfatidilserina na superfície externa da membrana
plasmática é um dos primeiros eventos que se passa na superfície de uma célula em
processo de apoptose ou necrose, sendo que essa perda de assimetria do
fosfolipídeo na membrana contribui para facilitar o reconhecimento por proteínas
dependente de ións cálcio, como a Anexina V (BOERSMA et al., 2005; GALLUZZI et
55
al., 2011). O procedimento de detecção de apoptose por Anexina V-FITC/Iodeto de
Propídeo consiste na ligação da anexina V-FITC à fosfatidilserina, na membrana das
células que estão iniciando o processo apoptótico ou processo necrótico, e na
ligação do iodeto de propídeo ao DNA das células no processo final da apoptose
(Figura 12).
Para detecção de apoptose ou necrose, foi utilizado o kit de detecção de
Anexina V/Iodeto de Propídio (PI) (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo) de acordo com as
instruções do próprio fabricante. Para esse ensaio 5 x 105 células A549 e S180
foram incubadas na ausência ou presença dos complexos cloreto cis-
tetraaminodiclororutênio(III) (383µM) e complexo de rutênio (II) (RuGly 40µM),
respectivamente, por períodos de 24 e 48 horas. Após tratamento com os complexos
de rutênio, as células foram centrifugadas e, posteriormente, lavadas com PBS. O
sobrenadante foi descartado e ao pellet celular foram adicionados 400 µL de tampão
de ligação e, em seguida, acrescentados 5 µL de Anexina V-FITC e 1 µL de iodeto
de propídio. As células foram, então, incubadas em temperatura ambiente por 15
minutos e, posteriormente, foi feita a aquisição dos dados em citômetro de fluxo
(FACSCanto, BD Biosciences). Para análise dos dados foi utilizado o software Diva.
Foram classificadas como células em apoptose inicial aquelas com marcação
somente para Anexina-V (AN+)/(PI-) e, como células em apoptose tardia, aquelas
com dupla marcação de Anexina V e PI (An+)/(PI+), células em necrose somente
marcação para PI (An-)/(PI+) e células viáveis não apresentam nenhuma marcação.
56
Figura 12: Princípio do ensaio de marcação com Anexina V/Iodeto de Propídeo (PI).
4.9 Análises de atividade de caspases pelo ensaio colorimétrico
Para investigação da atividade das caspase 3, 8 e 9, foi utilizado o kit de
proteases colorimétrico ApoTarget™(Invitrogen) de acordo com as instruções do
próprio fabricante. O ensaio de atividade das caspases é baseado na detecção por
espectrofotômetro do cromóforo p-nitroanilina (pNA) depois da clivagem do substrato
X-pNA, onde X é a sequência de aminoácidos reconhecida pelas caspases.
Nesse ensaio, 3 x 106 células foram semeadas em garrafas de cultura 25 cm2
e incubadas por período de 24 horas na ausência ou presença do complexo de
rutênio(II) RuGly (40 e 60µM). Após incubação, as células foram inicialmente
centrifugadas, e o pellet de células foi incubado com de tampão de lise em banho de
gelo por 10 minutos. A concentração de proteínas foi medida por meio do ensaio
BSA (BioRad). 75 µg do extrato de proteína, 50 µL de tampão de reação 2X
suplementado com 10 mM de DTT e os substratos DEVD-pNA (Caspase-3), IETD-
pNA (Caspase-8) e LEHD-pNA (Caspase-9) foram incubados por 2 horas a 37°C.
Após incubação por 2 horas, a formação de p-nitroanilide nas amostras foi medida
em espectrofotômetro (Awareness Technology INE/ Stat Fax 2100) a 405 nM. O
aumento da atividade enzimática de caspase-3, caspase-8 e caspase-9 foram
determinados por meio da comparação dos resultados com o controle de células não
tratadas.
57
4.10 Ensaio Potencial Membrana Mitocondrial pela Marcação com JC-1
A perda do potencial de membrana mitocondrial é uma característica de
apoptose, sendo que esse evento precede a externalização fostatidilserina e
coincide com a ativação de caspases. JC-1 (iodeto de 5,5`,6,6`-tetracloro1,1`,3,3`-
tetraetilbenzimidazolocarbocianina) é um marcador fluorescente que mensura o
potencial de membrana mitocondrial das células. Esse corante penetra na organela
e emite fluorescência nos comprimentos de onda de luz vermelha (pico de emissão
máximo 590 nm) ou verde (emissão 520 nm), de acordo com o potencial de
membrana mitocondrial interno. Penetrando em altas concentrações, o corante
apresenta-se na forma de J-agregado e emite coloração vermelha e, em baixas
concentrações, encontra-se na forma de monômero e emite coloração verde. Dessa
forma, em mitocôndrias funcionais, o JC-1 penetra e se acumula no interior desta
organela e emite coloração vermelha, ao passo que mitocôndrias com baixo a médio
potencial de atividade de membrana apresentam fluorescência verde (CHAZOTTE,
2011).
O efeito de RuGly sobre o potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) foi
mensurado utilizando o corante catiônico JC-1 (BD Bioscience). Para a realização do
ensaio 3 x 105 de células S180, foram tratados com complexo de rutênio (II) RuGly
40 e 60µM durante 24 horas. Após tratamento, as células foram centrifugadas por 10
minutos a 1500 rpm e lavadas com PBS. Após serem lavadas, as células foram
incubadas por 15 minutos a 37°C com o corante JC-1. Em seguida, as células foram
lavadas novamente e ressuspensas em tampão de ensaio para análise em citômetro
de fluxo. Os resultados foram obtidos utilizando um citômetro de fluxo FACS Calibur
(BD Bioscience) e a análise dos dados foi feita através do software Cell Quest (BD
Biosciences).
58
Figura 13: Princípio ensaio marcação com JC-1.
Na presença de um alto potencial de membrana mitocondrial (membrana
vermelha), o corante atravessa a membrana formando agregados que, quando
submetidos à luz ultravioleta, emitem fluorescência vermelha. Porém, na presença
de um baixo potencial de membrana mitocondrial (membrana verde), o corante
permanece em sua forma monomérica emitindo fluorescência verde (Figura 13).
4.11 Ensaio de Western blotting
Para detecção da expressão da proteína pró-apotótica Bak, foi utilizado o
ensaio de Western blotting. Para o ensaio, 3 x 106 de células S180 foram tratados
com complexo de rutênio (II) RuGly (40 e 60µM) durante 24 horas. Após tratamento,
as células foram centrifugadas por 10 minutos a 1500 rpm e lavadas com PBS. Em
seguida, as células foram lisadas com tampão de lise (Invitrogen) e o sobrenadante
foi coletado para determinação da concentração protéica. A concentração das
proteínas foi determinada utilizando o método de Bradford. Os extratos protéicos
quantificados e aliquotados com 70 µg de proteína foram desnaturados a 95°C por 5
minutos com tampão de Laemmli. Em seguida, as amostras foram separadas por
eletroforese em gel de SDS-PAGE 12% em tampão de corrida Tris-Glicina. A corrida
foi realizada a 120 V por 2 horas. Após esse período, as proteínas foram transferidas
para membrana de nitrocelulose (BioRad) por 2 horas a 100 V, utilizando-se o
sistema eletrobloting (BioRad) e tampão de transferência (48 mM Tris,39 mM
59
Glicina, 0,00375 SDS e 20% Metanol). Em seguida, as membranas foram
bloqueadas em solução de 3% de leite desnatado em TBS-T por uma hora. As
membranas foram incubadas over night a 4 °C com 1% de leite desnatado em TBS-
T contendo os anticorpos primários Bak (Santa Cruz Biotechnology Inc.) e β-Actina
(Santa Cruz Biotechnology Inc.) na diluição de 1:1000. Após incubação, as
membranas foram lavadas três vezes com TBST e incubadas por 1 (uma) hora com
o anticorpo secundário IgG conjugado a HRP (Santa Cruz Biotechnology Inc.) na
diluição de 1:1000. Em seguida, as membranas foram lavadas com TBS-T e as
bandas imunoreativas foram detectadas usando o substrato de western Bloting ECL
(SuperSignal West pico Substrate, Thermo Scientific). Os substratos foram
removidos das membranas e os sinais de ECL foram capturados pela câmera CCD
(ImageQuant LAS 4000 mini®; GE HealthcareTM). A densidade ótica da proteína-
alvo foi medida utilizando o software Image J para comparar os níveis de expressão
da proteína. A expressão da proteína Bak foi normalizada utilizando os valores de β
actina.
4.12 Análise da expressão gênica 4.12.1 Extração RNA
O RNA total de células S180 tratadas com complexos de rutênio (RuGly
40µM) e células A549 tratadas com cloreto cis-tetraaminodiclororutênio(III) (383µM)
foi isolado utilizando-se o reagent Trizol (Sigma-Aldrich) seguindo as
recomendações do fabricante. Para o isolamento 1 mL de trizol, foi adicionado ao
pellet cellular e homogeneizado até a dissolução completa do pellet. Foram
adicionados a seguir 200 µL de clorofórmio, e os tubos foram homogeneizados por
inversão e deixados à temperatura ambiente durante dois minutos, seguindo-se de
centrifugação durante 15 minutos a 12.000 g a 4°C. Esse procedimento resultou em
três fases: a fase aquosa onde está o RNA, a interface que contém as proteínas e,
por fim, a fase com fenol/clorofórmio.
Após a transferência da fase aquosa para um novo tubo, foram adicionados
500 µL de álcool isopropílico para a precipitação do RNA. Este foi incubado em
seguida por 5 minutos em temperatura ambiente. A seguir, os tubos foram
60
centrifugados a 12.000 g por 10 minutos a 4°C. O RNA foi, então, lavado com etanol
75% e, em seguida, centrifugado por 10 minutos a 7500 g a 4°C. Após
centrifugação, o álcool foi descartado e os tubos foram colocados em capela para
evaporação do álcool restante na amostra. Após evaporação completa do álcool, o
RNA foi dissolvido em 50 µL de água ultrapura. A seguir o material foi tratado com
Dnase I (Sigma Aldrich) seguindo protocolo sugerido pelo próprio fabricante. Após
tratamento com Dnase I o material foi estocado em -80°C. A concentração e o grau
de pureza do material foram estimados em espectrofotômetro NanoDrop (Thermo
Scientific, Delaware, EUA). O grau de pureza das amostras foi avaliado de acordo
com a relação 260/280. A qualidade (integridade) do RNA foi avaliada por meio de
eletroforese em gel de agarose a 1,2%.
4.12.2 Síntese cDNA
Para a síntese de cDNA, utilizou-se o kit High-Capacity cDNA Reverse
Transcription (Applied Biossystems), seguindo as instruções do fabricante. Uma
mistura contendo dNTPS, iniciadores randômicos (random primers) e transcriptase
reversa foi preparada e adicionada a um mesmo volume de RNA (2µg). A reação de
síntese de cDNA foi realizada a 25°C por 10 minutos seguida de 2 horas a 42°C.
4.12.3 Real time PCR (qPCR)
A avaliação da expressão do mRNA dos genes caspase-3, caspase-8, bax e
p53 foi realizada por real time RT-PCR utilizando o reagente Sybr Green Master Mix
(LGC Biotecnologia). Para a reação foram utilizados 10 µL de master mix, 2 µL de
cada primer (400 nM), 2 µL de cDNA e 4µL de água. As amostras foram
amplificadas no sistema Line Gene (Bioer Techology), com uma desnaturação inicial
de 95° durante 15 minutos seguidos de 40 ciclos a 95°C durante 15 segundos, 55°C
durante 15 segundos e, por último, 72°C durante 30 segundos. Em todas as reações
foi realizada a curva de dissociação (melting) para verificar a presença de produtos
inespecíficos. As sequências dos primer utilizados nesse ensaio são descritas na
tabela 4. A expressão relativa de cada gene-alvo foi normalizada utilizando a
expressão dos genes de referência β actina para linhagem de camundongo S180 e
β-globina para linhagem humana A549. A expressão relativa foi realizada pelo
61
método 2-∆∆CT. Para análise da eficiência dos primers foi realizada a curva padrão,
em que foram utilizados os primers com valores de eficiências superiores a 90 %. A
partir da curva padrão foram calculados o slope (-3,32) e o coeficiente de correlação
(R2).
Tabela 4: Sequências de primers utilizados para o ensaio real time RT-PCR.
Gene Sequência do primer β actina Mus musculus F5’CACACCCGCCACCAGTTC3’
R5’ATTCCCACCATCACACCCTG3’ (161pb) β globina Homo sapiens
F 5’GTGCTCGCGCTACTCTCTCT3’ R5’TCAATGTCGGATGGATGAAA3’ (143pb)
bax Mus musculus F5’GCTACAGGGTTTCATCCAGG3’ R5’GGAGACACTCGCTCAGCTTC3’ (113pb)
caspase 3 Mus musculus
F5’GGAGCTTGGAACGCTAAGAA3’ R5’GTCCACTGACTTGCTCCCAT3’ (112pb)
caspase 3 Homo sapiens
F5’CCTCTTCCCCCATTCTCATT3’ R5’CCAGAGTCCATTGATTCGCT3’ (122pb)
caspase 8 Mus musculus
F5’AGGTACTCGGCCACAGGTTA3’ R5’TGGGATGTAGTCCAAGCACA3’ (137pb)
caspase 9 Mus musculus
F5’TAGCTGGAACACTGGGCATTGAGT3’ R5’AACATACCCATCGGTGCATTTGGC3’(146pb)
p53 Mus musculus F5'-TGGAAGACTCCAGTGGGAAC-3' R5'-TCTTCTGTACGGCGGTCTCT-3' (87pb)
4.12.4 Microscopia de Força Atômica (AFM) A técnica de TMAFM permite visualizar imagens de DNA e, a partir delas,
estudar as modificações que cada complexo induz na sua cadeia. É possível
observar efeitos como a diminuição ou o aumento do superenrolamento ou a
compactação da estrutura e, finalmente, a agregação de várias moléculas ao DNA.
Para este estudo, utilizou-se o DNA do plasmídeo pBR322. Esse tipo de DNA
apresenta uma medida fixa (4.36 kbp) e pode ser encontrado, majoritariamente, em
duas formas: a forma circular covalentemente fechada (CCC), que se encontra em
maior percentagem, e a forma circular aberta (OC), que é a forma relaxada (figura
14) (MORAES, 2008). Para o ensaio, o plasmídeo pBR322 foi aquecido a 60° C
durante 10 minutos para se obter a forma CO. A concentração da solução estoque
foi de 1 mg/mL em tampão HEPES (HEPES 4 mM (pH 7,4) e 2 mM de MgCl2 . Cada
amostra continha 1 μL de plasmídeo pBR322, a uma concentração de 0,25 μg/μL
62
em um volume final de 40 mL. Após preparo do DNA pBR322, incubou-se o mesmo
juntamento com complexo 2 e foram colocadas as amostras preparadas em uma
mica verde durante 3 minutos. Depois de absorvidas e secas, as amostras foram
observadas por AFM. Todos os AFMs foram feitos com um Nanoscope III multimodo
AFM ( Digital Instruments, Santa Barbara, CA) .
Figura 14: Representação esquemática das formas CCC e OC do DNA do plasmídeo pBR322 (MORAES, 2008).
4.13 Análise estatística
Para comparação entre os grupos tratados e controle, foram utilizados Teste
T Student e Análise de Variância (Anova), seguido de pós-teste Bonferrone
(software GraphPad-Prism V4). Foram considerados como diferença significativa
valores de p menores que 0,05 (p<0.05).
5. PRODUÇÃO CIENTÍFICA
63
Artigo 1: Induction of Cell Cycle Arrest and Apoptosis by Ruthenium Complex cis-
(Dichloro)tetramineruthenium(III) Chloride in Human Lung Carcinoma Cells A549
(Apêndice)
64
Artigo 2: Cytoxicity and apoptotic mechanism of ruthenium(II) amino acid complexes against sarcoma-180 tumor cells
Artigo aceito para publicação com menores revisão para revista PLoS ONE Fator impacto 3,7
Cytoxicity and apoptotic mechanism of ruthenium(II) amino acid complexes in
sarcoma-180 tumor cells
Aliny Pereira de Limaa, Flávia de Castro Pereiraa, Francyelli Mariana dos Santos
Melloa, Wanessa Carvalho Piresa, Thallita Monteiro Pintoa, Marcio Aurelio Pinheiro
Almeidab, Flávia Karina Delellac, Sérgio Luis Felisbinoc, Virtudes Morenod, Alzir
Azevedo Batista*b, Elisângela de Paula Silveira Lacerdaa*
aLaboratory of Molecular Genetics and Cytogenetics, Institute of Biological Sciences,
University Federal of Goiás-UFG, Goiânia, Goiás, Brazil;
bDepartment of Chemistry, University Federal of São Carlos, São Carlos, São Paulo,
Brazil;
cDepartment of Morphology, Institute of Biosciences – University Estadual Paulista
(UNESP), Botucatu, São Paulo, Brazil
dDepartment of Inorganic Chemistry, Universitat de Barcelona, Marti y Franquès 1-
11, 08028, Barcelona, Spain
*E-mail address of the corresponding author: [email protected] (E.S.
Lacerda)
65
Abstract
Over the past several decades, much attention has been focused on ruthenium
complexes in antitumor therapy. Ruthenium is a transition metal that possesses
several advantages for rational antitumor drug design and biological applications. In
the present study, five ruthenium complexes containing amino acids were studied in
vitro to determine their biological activity against sarcoma-180 tumor cells. The
cytotoxicity of the complexes was evaluated by an MTT assay, and their mechanism
of action was investigated. The results demonstrated that the five complexes
inhibited the viability of the S180 tumor cell line, with IC50 values ranging from 22.53
µM to 50.18 µM, and showed low cytotoxicity against normal L929 fibroblast cells.
Flow cytometric analysis revealed that the [Ru(gly)(bipy)(dppb)]PF6 complex
inhibited the viability of the tumor cells by inducing apoptosis, as evidenced by an
increased number of Annexin V-positive cells and G0/G1 phase cell cycle arrest.
Further investigation showed that [Ru(gly)(bipy)(dppb)]PF6 caused a loss of
mitochondrial membrane potential; activated caspases 3, caspase-8, and caspase-9
and caused a change in the mRNA expression levels of caspase 3, caspase-9 as
well as the bax genes. The levels of the pro-apoptotic Bcl-2 family protein Bak were
increased. Thus, we demonstrated that ruthenium/amino acid complexes are
promising drugs against S180 tumor cells, and we recommend further investigations
of their role as chemotherapeutic agents for sarcomas.
Keywords: Apoptosis, Caspases, Cell Cycle, Ruthenium, Sarcoma 180.
66
1.0 Introduction
Sarcomas constitute a heterogeneous group of rare solid tumors of
mesenchymal cell origin with distinct clinical and pathological features, and they are
usually divided into 2 broad categories: sarcomas of soft tissues (including fat,
muscle, nerve, nerve sheath, blood vessels, and other connective tissues) and sar-
comas of the bone. Collectively, sarcomas account for approximately 1% of all adult
and 15% of all pediatric malignancies [1].
Anthracyclines and ifosfamide have been established as the most active drugs
for the treatment of patients with advanced soft tissue sarcomas of most histologic
subtypes, with the exception of gastrointestinal stromal tumors. However, after failure
of these drugs, patients with advanced soft tissue sarcomas have few treatment
options, and the limitation of current therapeutic options for these tumors has
prompted the development and evaluation of a very large number of new
chemotherapeutic and biological agents for their treatment [2]. Thus, the
development of new drugs to treat cancer in general and sarcoma specifically is
required. Ruthenium complexes represent a new family of promising metal-based
anticancer drugs that offer the potential for reduced toxicity compared to the
antitumor platinum(II) complexes currently used in the clinical setting. These
complexes have a novel mechanism of action, are less likely to exhibit cross-
resistance, and have a different spectrum of activity compared to the platinum drugs
[3-6].
The mechanism by which ruthenium complexes exert anticancer effects has
been widely investigated. Several mechanisms have been suggested to underlie the
anticancer activities of ruthenium complexes, including the inhibition of metastasis
[7,8], interaction with DNA [9], interaction with proteins [10], production of reactive
67
oxygen species [11], inhibition of topoisomerase activity [12] and induction of
apoptosis [13]. In addition, the mechanisms by which ruthenium complexes exert
anticancer effects have been shown to largely depend on the nature of the
complexes, the ligands involved, and the presence of uncoordinated sites in the
coordination sphere of the metal center.
In the search for selective and effective complexes that can be targeted
against cancer, our research group synthesized several ruthenium(II) complexes
with different ligands [14-16], e.g., ruthenium complexes coordinated with amino
acids, which have demonstrated cytotoxic activity against the model of murine breast
cancer, MDA-MB-231 cells. Based on these observations, the aim of the present
study was to examine the cytotoxic effects of the five ruthenium complexes
containing amino acid ligands against the S180 murine sarcoma cell line in vitro and
to elucidate the molecular mechanism by which ruthenium/amino acid complexes
cause cancer cell death and induce cell cycle perturbations. The complexes
evaluated in this study were [Ru(AA)(bipy)(dppb)]PF6, where AA = glycine (gly),
alanine (ala), leucine (leu), methionine (met), or aspartic acid (aspac); bipy = 2,2´-
bipyridine; and dppb = [1,4-bis(diphenylphosphine)butane].
In this study, the [Ru(gly)(bipy)(dppb)]PF6 complex, [RuGly], was the most
promising species tested, showing the highest activity against the S180 tumor cells
and low cytotoxicity against L929 normal cells. Thus, this complex was selected for
further investigation to determine its mechanism of action against sarcoma-180 tumor
cells.
68
2.0 Materials and Methods
2.1. Chemicals
All manipulations were carried out under purified argon using the standard
Schlenk technique. Reagent grade solvents were appropriately distilled and dried
before use. RuCl3.xH2O, NH4PF6, 1,4-bis(diphenylphosphino)butane, and 2,2’-
bipyridine were purchased from Aldrich and used as received. The precursor cis-
[RuCl2(dppb)(bipy)] was prepared as previously described [17]. The amino acids
glycine, L-alanine, L-methionine, L-leucine, and L-aspartic acid were purchased from
Stream and used without purification.
2.2. Preparation of compounds
Typically, the complexes were synthesized by reacting the precursor cis-
[RuCl2(dppb)(bipy)] (0.09 g, 0.1 mmol), which was dissolved in 25 mL of methanol,
with an excess of the amino acid (0.17 mmol). If the amino acid was not soluble in
methanol, it was first dissolved in a minimum volume of hot water and slowly added
dropwise to the methanol solution. The solution was refluxed and stirred for 3 h, and
NH4PF6 (0.025 g, 0.16 mmol) was added. After 1 h, the solvent was removed, and
dichloromethane was added to dissolve the complex. The mixture was then filtered.
The volume of the solution was reduced to approximately 2 mL, and ether was
added. The resulting orange precipitate was isolated by filtration, washed well with
H2O and diethyl ether, and dried under vacuum. The yields of these reactions were
approximately 85-90%. The complexes were characterized by elemental analyses,
31P{1H} NMR spectroscopy, IR spectroscopy, and cyclic voltammetry. Details of the
syntheses and characterization of the complexes have been submitted for publication
elsewhere (in Inorganic Chemistry).
69
2.2 Cell Culture
The murine sarcoma-180 tumor cells (S180) (ATCC®# TIB-66) and normal
murine fibroblast cells (L-929) (ATCC®# CCL-1™) were cultured in suspension in
RPMI 1640 and DMEM media (Sigma Chemical Co., MO), respectively,
supplemented with 10% fetal calf serum, 100 μg/mL penicillin, and 100 μg/mL
streptomycin. The cultures were incubated in a humidified incubator (Thermo
Scientific) at 37°C with 5% CO2 according to previously described methods [18].
2.3 Cell viability assay (MTT assay)
The cytotoxic effects of the amino acid/ruthenium complexes were evaluated
using an MTT assay with S180 tumor cells and L929 normal cells as described
previously [19]. Briefly, 1.0 X 105 S180 cells and 2.0 X 104 L929 cells were plated in
96-well tissue culture plates and treated with different concentrations of amino
acid/ruthenium complexes (0.2-200 µM) for 48 h. After treatment, 10 µL of MTT (5
mg mL-1) was added to each well, and the plates were incubated at 37°C for an
additional 3 h. The purple formazan crystals were dissolved in 50 µL of SDS, and the
absorbance was determined at 545 nm using a Stat Fax 2100 microplate reader
(Awareness Technology, Palm City, FL, USA). The cell viability was calculated as
follows: viability (%) = (absorbance of the treated wells)/(absorbance of the control
wells)×100. The IC50 (complex concentration (µM) that results in a 50% reduction in
cellular viability) was obtained from dose-response curves using GraphPad Prism
4.02 for Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).
The IC50 values obtained from the MTT assay were used as a reference for the
selection of the most promising amino acid/ruthenium complex for further testing.
70
2.4 Cell Cycle analysis
The S180 cells were treated with RuGly (40 µM and 60 µM) for 24 h and 48 h.
Briefly, 5.0 × 105 cells were harvested by centrifugation, washed with phosphate-
buffered saline (PBS), fixed with 70% (v/v) cold ethanol and stored overnight at -
20°C. The fixed cells were washed with PBS and incubated with propidium iodide (PI;
Sigma-Aldrich) containing 0.05% RNase. The samples were incubated at 4°C in the
dark and analyzed by flow cytometry (FACS Calibur, BD Biosciences). The
percentage of cells in the G0/G1, S, G2/M and sub-G1 phases was analyzed using
ModFit software.
2.5 Annexin V-FITC/PI double staining and analysis by flow cytometry
The cell death of S180 tumor cells was examined using the Annexin V-FITC
Apoptosis Detection Kit (BD Biosciences) according to the manufacturer’s
instructions. S180 cells were treated with RuGly (40 µM and 60 µM) for 24 h and 48
h. Briefly, 5.0 x 105 cells were harvested and washed with PBS. The cells were re-
suspended in 400 µL of binding buffer. Next, 5 µL of Annexin V-FITC and 1 µL of PI
were added. Flow cytometric analysis was performed immediately after supravital
staining. Data acquisition and analysis were performed on a flow cytometer
(FACSCalibur, BD Biosciences) using Cell Quest software. The criteria for positivity
in cells in early stages of apoptosis were Annexin V-positive and PI-negative,
whereas the criteria for cells in the late stages of apoptosis were both Annexin V-
positive and PI-positive.
71
2.6 Analysis of mitochondrial membrane potential
The effect of RuGly on the mitochondrial membrane potential (ΔΨm) was
measured using JC-1 dye (BD Biosciences) by flow cytometry according to the
manufacturer’s instructions. Briefly, 3.0 x 105 S180 cells were treated with RuGly (40
µM and 60 µM) for 24 h. After incubation, the cells were harvested and washed with
PBS. The cells were then incubated with JC-1 dye (BD Biosciences) for 15 min at
37°C in the dark. The stained cells were washed, resuspended in assay buffer, and
immediately analyzed by flow cytometry. The data were analyzed using the Cell
Quest software.
2.7 Measurement of caspase activity
Direct measurement of the activity of caspases 3, 8, and 9 were performed
using the ApoTarget™ Caspase 3, 8, and 9 Protease Assay (Invitrogen) according to
the manufacturer’s recommendations. After treatment with RuGly (40 M and 60 M)
for 24 h, the cells were lysed with chilled cell lysis buffer. The protein concentration
was then measured using the BSA Protein Assay Kit (BioRad). An aliquot of the
protein extract (75 µg) was mixed with 50 µL of 2X reaction buffer supplemented with
10 mM DTT and the substrates of DEVD-pNA (caspase-3), IETD-pNA (caspase-8),
or LEHD-pNA (caspase-9). The mixtures were then incubated for 2 h at 37°C.
Subsequently, the formation of p-nitroanilide in the samples was measured using an
ELISA microplate reader at 405 nm. The increases in the activities of caspase-3,
caspase-8, and caspase-9 were determined by comparing the results with the
control.
72
2.8 Total RNA extraction and cDNA synthesis
The S180 cells were treated with 40 μM RuGly for 6 h. Total RNA was
extracted with Trizol reagent (Sigma-Aldrich, USA) following the manufacturer’s
protocol. Total RNA (2.0 μg) was used to produce complementary DNA (cDNA) with
random primers (Applied Biosystems, USA) in a 20 μL reaction mixture according to
the manufacturer’s protocol.
2.9 Real-time quantitative PCR
Real-time PCR was carried out using a Line Gene K (Bioer Technology)
instrument. Real-time PCR reactions were carried out in a 20 μL reaction mixture,
including 2 μL of cDNA, 10 μL of SYBR Green PCR Master Mix (LGC Biotechnology,
UK), and 2.0 μL of 400 nM forward and reverse primers. The PCR program was
initiated at 95°C for 15 min followed by 40 cycles of 95°C for 15 s, 55°C for 15 s, and
72°C for 30 s. The data were analyzed according to the comparative Ct method and
were normalized to the β-actin reference gene expression in each sample. The
primer sequences are shown in Table 1.
73
Table 1: Primer sequences used for the real time RT-PCR assay.
2.10 Western blot analysis
The S180 cells were treated with 40 μM and 60 μM RuGly for 24 h. Untreated
cells maintained in media only were used as the control. After treatment, the cells
were washed with PBS and lysed with lysis buffer (Invitrogen). The samples were
stored at -20°C until further analysis. The protein concentrations of the resulting
lysates were determined using the Bradford assay [20]. A total of 70 µg of protein
extract was mixed with Laemmli loading buffer and subjected to 12% SDS-PAGE at
100 V for 2 h, followed by electroblotting to nitrocellulose membranes (0.45 μm) (Bio-
Rad Laboratories, Inc.) at 400 mA for 1.5 h. The membranes were blocked with 3%
non-fat dry milk in Tris-buffered saline with Tween (TBS-T) for 1 h and subsequently
incubated overnight at 4ºC with 1% non-fat dry milk in TBS-T containing a 1:500
dilution of primary antibodies specific to Bak (sc-832, Santa Cruz Biotechnology Inc.)
and β-actin (sc-1615, Santa Cruz Biotechnology Inc.). The membranes were washed
in TBS-T, incubated with an HRP-conjugated IgG secondary antibody (Santa Cruz
Biotechnology Inc., 1:1000 dilution) for 1 h, and washed with TBS-T. The
immunoreactive bands were detected using an ECL western blotting substrate
Gene Primer sequences β-actin F5’CACACCCGCCACCAGTTC3’
R5’ATTCCCACCATCACACCCTG3’(161 bp) bax F5’GCTACAGGGTTTCATCCAGG3’
R5’GGAGACACTCGCTCAGCTTC3’(113 bp) caspase 3 F5’GGAGCTTGGAACGCTAAGAA3’
R5’GTCCACTGACTTGCTCCCAT3’ (112 bp) caspase 8 F5’AGGTACTCGGCCACAGGTTA3’
R5’TGGGATGTAGTCCAAGCACA3’(137 bp) caspase 9 F5’TAGCTGGAACACTGGGCATTGAGT3’
R5’AACATACCCATCGGTGCATTTGGC3’(146pb) p53 F5'TGGAAGACTCCAGTGGGAAC-3'
R5'TCTTCTGTACGGCGGTCTCT-3'(87pb)
74
(Super Signal West Pico Substrate, Thermo Scientific), and the ECL signals were
captured using a CCD camera (ImageQuant LAS 4000 mini®; GE HealthcareTM). The
optical density of the target protein bands was measured using IMAGE J software
downloaded from the NIH website (http://rsb.info.nih.gov.ij/) to compare the protein
levels. Bak expression was normalized to the β-actin levels.
2.11 Atomic force microscopy (AFM)
For the atomic force microscopy (TMAFM) experiment, the pBR322 plasmid
was heated at 60°C for 10 minutes to obtain the OC form. The concentration of the
stock solution was 1 mg/mL in HEPES buffer (4 mM HEPES (pH 7.4) and 2 mM
MgCl2. Each sample contained 1 μL of pBR322 plasmid at a concentration of 0.25 μ
g/μL in a final volume of 40 μL. The amount of RuGly added is expressed as ri. AFM
samples were prepared by casting a 3 μL drop of test solution onto freshly cleaved
muscovite green mica disks as the support. The drop was allowed to stand
undisturbed for 3 minutes to favor the adsorbate-substrate interaction. Each DNA-
laden disk was rinsed with Milli-Q water and was blown dry with clean compressed
argon gas directed normal to the disk surface. The samples were stored over silica
prior to AFM imaging. All AFM observations were made with a Nanoscope III
Multimode AFM (Digital Instruments, Santa Barbara, CA). Nanocrystalline Si
cantilevers (125 nm in length) with an average spring constant of 50 N/m terminating
in conical-shaped Si probe tips (10 nm apical radius and cone angle of 35°) were
utilized. High-resolution topographic AFM images of 2 x 2 μm areas of different
specimens were obtained in air at room temperature (relative humidity <40%). The
AFM was operated in intermittent contact mode at a rate of 1–3 Hz.
75
2.12 Statistical analysis
Statistical analysis of the results was performed using an unpaired t test or
one-way ANOVA followed by Dunnett’s post hoc test or the Bonferroni post hoc test
for multiple comparisons with a control. All statistical analyses were performed using
the statistical software GraphPad Prism (version 4). A probability of 0.05 or less was
deemed statistically significant. The following notation is used throughout the
manuscript: *, p <0.05 and **, p<0.01 relative to the control.
3.0 Results
3.1 S180 cell viability
The amino acid/ruthenium complexes were tested in vitro for their cytotoxic
effects on the S180 tumor cell line and the L929 normal cell line using the MTT
assay. As shown in Table 2, the five complexes inhibited the viability of the S180
tumor cell line, with IC50 values ranging from 22.53 µM to 50.18 µM. The complexes
containing methionine and glycine were more active against S180 cells, with IC50
values of 22.53 µM and 31.15 µM, respectively. The complex containing glycine
showed lower toxicity against the L929 cells (51.65 µM) compared with the complex
containing methionine (27.39 µM). As shown in Table 2, under the same conditions,
cisplatin showed cytoxicity at concentrations as low as 29.05 µM, while its IC50
against S180 cells was 64.83 µM.
76
Table 2: Viability of the S180 tumor cell line and the L929 normal cell line in the presence of ruthenium/amino acid complexes and cisplatin.
Complexes IC50 (µM) L929 S180
[Ru(met)(bipy)(dppb)]PF6 27.39 ± 3.32 22.53 ± 3.40
[Ru(gly)(bipy)(dppb)]PF6 51.65 ± 1.22 31.15 ± 4.19 [Ru(leu)(bipy)(dppb)]PF6 47.15 ± 5.94 38.19 ± 7.00 [Ru(aspac)(bipy)(dppb)](PF6)2 106.72 ± 8.98 42.22 ± 3.98
[Ru(ala)(bipy)(dppb)]PF6 97.75 ± 8.99 50.18 ± 1.03
Cisplatin 29.05 ± 1.88 64.83 ± 0.17
3.2 Induction of G0/G1 arrest in S180 cells
The cell cycle distribution of the S180 cells treated with RuGly (40 µM and 60
µM) was examined by flow cytometry and revealed G0/G1 phase arrest (Fig. 1). As
shown by the histograms of cell cycle distributions (Fig. 1 a, b), treatment with the
complex caused a statistically significant increase in the proportion of cells in the
G0/G1 phase, correlating with a decreased number of cells in the S phase (p<0.001).
The fraction of G0/G1 cells increased from 23.6% (24 h) and 41.55% (48 h) in the
control to 61.07% (24 h) and 59.94% (48 h) after treatment with 40 µM RuGly and to
56.09% (24 h) and 59.86% (48 h) in cells treated with 60 µM RuGly.
77
(a)
78
(b)
Fig. 1 ab. Effects of RuGly on the cell cycle distribution of S180 cells after 24 h (a) and 48 h (b) of exposure. The data are the means ± SD of three experiments. Significant differences from the untreated control are indicated by ***p<0.001.
3.3 Induction of apoptosis in S180 cells
To evaluate the mechanism of S180 cell death, the FITC-Annexin V/PI assay
was used. A total of 19.76% and 22.48% of the cells treated with 40 µM and 60 µM
RuGly, respectively, were in early apoptosis (Annexin V+ and PI-) at 24 h, and
42.59% and 47.48% of the cells, respectively, were in early apoptosis at 48 h
(p<0.001 compared to the control). Additionally, a total of 22.76% and 31.67% of the
79
cells treated with 40 µM and 60 µM RuGly, respectively, were in late apoptosis
(Annexin V+ and PI+) at 24 h, while 25.16% and 30.24% of the cells, respectively,
were in late apoptosis at 48 h (Fig. 2 a, b) (p<0.001 compared to the control).
(a)
80
81
(b) (b)
Fig. 2 ab. Effect of RuGly on the mechanism of S180 cell death (early and late apoptosis/necrosis) evaluated by flow cytometry after 24 h (a) and 48 h (b) of incubation. The data are the means ± SD of three experiments. Significant differences from the untreated control are indicated by **p<0.01 and ***p<0.001.
82
3.4 Disruption of the mitochondrial membrane potential
To evaluate the possible effect of the RuGly on the mitochondrial membrane
potential (ΔΨm), JC-1 staining was performed. We observed that after treatment with
RuGly for 24 h, significant loss of ΔΨm was induced in the S180 cells. The
percentage of cells with depolarized mitochondria increased from 11.5% (control) to
45.2% (40 µM) and 52.6% (60 µM). Fig. 3 shows typical FL-1 (green fluorescence)
and FL-2 (red fluorescence) dot plots for JC-1-stained S180 cells treated with RuGly
(40 and 60 µM) and untreated control cells. Representative dot plots of the effect of
RuGly on the mitochondrial membrane potential are shown in Fig. 3. It was found
that JC-1 aggregates accumulated in the control cells and displayed a high red signal
(top right quadrant). Treatment of the cells with RuGly for 24 h resulted in a shift to
higher green fluorescence intensity, with a concomitant decrease in the percentage
of cells showing red fluorescence to 54.3% (40 µM) and 47.1% (60 µM) of cells
(upper-right quadrant).
83
Fig. 3. Effect of RuGly on the mitochondrial membrane potential. The percentages of cells with depolarized mitochondrial membrane potential. The mitochondrial membrane potentials of cells treated with 40 µM and 60 µM RuGly as well as control cells were assessed by flow cytometry after staining with JC-1.
3.5 Induction of S180 cell apoptosis through a caspase-dependent pathway
After treatment with the RuGly for 24 h, the activity of caspases 3, 8, and 9
was increased in the S180 cells compared to the control. Treatment of cells with
RuGly (60 μM, 24 h) significantly (p<0.05) increased caspase-3 activity. The activity
of caspase-3, increased from 100% in the control to 136.05% and 170.24% in cells
treated with 40 µM and 60 µM, respectively (Fig. 4). The activities of caspase -8 and
84
caspase-9, after treatment with RuGly (40 μM, 24 h), increased from 100% in the
control to 127.22% and 176.43%, respectively.
Fig. 4. Effect of RuGly on the activity of caspase -3, -8 and -9 in S180 cells. S180 cells were treated with the complex at the indicated concentrations for 24 h. The data are expressed as the means ± SD of two individual experiments; *p<0.05 and **p<0.01 compared with the control.
3.6 Induction of the expression of apoptosis-related genes
The effect of RuGly on the expression of apoptosis-related genes was
evaluated by real time RT-PCR analysis. Fig. 5 shows the gene expression levels of
bax, caspase 3, caspase -8, caspase 9, and p53 after incubation with 40 µM complex
2 for 6 h. Treatment of S180 cells with the complex significantly increased bax,
caspase 3, and caspase 9 gene expression. The expression level of the bax gene
increased 2.75-fold compared to its level in untreated control cells. The expression
levels of caspase 3 and caspase 9 increased significantly by 2.55- and 1.83-fold,
respectively, compared to the control (p<0.05). The expression levels of caspase 8
85
and p53 remained unchanged after treatment with the RuGly compared with the
control (p>0.05).
Fig. 5. Relative expression of bax, caspase 3, caspase 8, caspase 9, and p53 in S180 cells treated with 40 µM of RuGly for 6 h as determined by real-time RT-PCR analysis. The fold change is expressed relative to the respective untreated control using β-actin as a reference gene. The data are expressed as the means ± SD; * p<0.05, **p<0.01, and ***p<0.001 compared with the control.
3.7 Expression of the apoptosis-related Bak protein in S180 cells
The expression of the Bak protein was detected by western blot analysis.
When S180 cells were treated with 40 µM and 60 µM RuGly for 24 h, a
concentration-dependent increase in Bak expression was observed. As shown in Fig.
6, the expression level of the Bak protein increased from 5.08- (control) to 6.81- and
9.40-fold after incubation with 40 µM and 60 µM RuGly, respectively.
86
Fig. 6. Western blot analysis of Bak protein expression in S180 cells after incubation with 40 and 60 µM RuGly for 24 h. β-actin was used as a control.
3.8 Atomic force microscopy
AFM images of free pBR322 plasmid DNA and pBR322 plasmid DNA
incubated with RuGly are shown in Fig. 7 a and b, respectively. The images show
that the RuGly did not covalently bind to DNA bases or intercalate between bases;
however, there was a weak interaction that caused increased coiling of the DNA
compared to the free pBR322 plasmid DNA.
(a)
87
(b)
Fig. 7. (a) AFM image of free pBR322 plasmid DNA. (b) AFM image of the pBR322 plasmid incubated with the of RuGly for 24 h at 37C
4.0 Discussion
In this study, we investigated the cytotoxic activity of ruthenium/amino acid
complexes against the S180 tumor cell line and the L929 normal cell line using the
MTT assay. The IC50 values of the five amino acid complexes and cisplatin (positive
control) are shown in Table 2. Based on the IC50 values, the in vitro cytotoxic
activities of the complexes were ordered as follows: RuMet>RuGly>
RuLeu>RuAspac>RuAla. Additionally, all the complexes were more cytotoxic than
cisplatin. The complexes containing aspartic acid, alanine, glycine, and leucine were
less cytotoxic toward the L929 murine fibroblast cells, with IC50 values ranging from
106.72 µM to 47.15 µM; these values were significantly higher than the IC50 for
cisplatin (29.05 µM) (Table 2). These results suggest that the complexes studied in
this work are generally more selective for cancer cells compared with fibroblast cells.
In this study, the RuGly was shown to be the most promising compound in the series,
showing the highest activity against the S180 tumor cells and lower cytotoxicity
against the L929 normal cells.
88
The inhibition of cell viability by cytotoxic drugs can result from cycle cell
arrest, induction of apoptosis, or a combination of these two mechanisms [13,20].
Flow cytometric analysis was performed to determine the possible mechanisms of
cell growth inhibition by RuGly in S180 cells. As shown in the cell cycle analysis,
exposure of the S180 cells to RuGly led to a significant increase in the percentage of
cells in the G0/G1 phase, which was accompanied by a corresponding reduction in
the percentage of cells in the S and G2/M phases. During chemotherapy, the
accumulation of cells in the G0/G1 phase is often the result of cell cycle checkpoint
activation as a consequence of DNA damage. Previous studies have showed that
some ruthenium compounds induce the arrest of cells in the G0/G1 phase through
p53 activation and an increase in the protein levels of p21, an inhibitor of the cell
cycle that blocks CDK activity [22-24]. Molecularly, this process is often mediated by
the activation of p53, which results in cell cycle arrest predominantly in the G1 phase
and induction of apoptosis. To confirm whether the RuGly caused p53 activation, we
analyzed the expression of the p53 gene by real time RT-PCR. Our results showed
that the treatment of the S180 cells with the RuGly did not increase the expression
level of p53 after 6 h of incubation, indicating that the complex can act on these
checkpoints through p53-independent mechanisms, preventing cell division and
subsequently initiating apoptosis.
To determine whether the growth inhibitory activity of the RuGly was related to
the induction of apoptosis, we carried out a cell death assay using Annexin V
staining. This assay showed that treatment with complex induced apoptosis in S180
cells as shown by a significant increase in Annexin V-positive cells. Consistent with
our results, previous studies have demonstrated that the cis-[RuCl2(NH3)4]Cl
89
ruthenium compound also increased the numbers of Annexin V-positive S180 cells
[17].
The caspases, a family of cysteine proteases, have been shown to act as
central executioners of the apoptotic pathway [25]. To study the involvement of
caspases in the signaling pathways involved in RuGly-induced apoptosis, the
activities of the effector caspase-3 and two initiator caspases, caspase-8 and
caspase-9, were investigated using a colorimetric assay, and the level of mRNA
expression of these caspases was investigated by real time RT-PCR analysis. In the
caspase activity assay, treatment with the RuGly resulted in a significant increase in
the activity of caspase-3 and caspase-9 in S180 cells, indicating the involvement of
caspase-dependent mechanisms in RuGly-induced apoptosis. The mRNA
expression analysis revealed that the complex caused a rapid and significant
increase in the expression of caspase-3 and caspase-9, which corroborated the
caspase activity results.
Previous reports have shown that Ru(II) and Ru(III) complexes trigger intrinsic
and extrinsic apoptosis pathways [13,25,26], and it has recently been shown that
ruthenium complexes containing 2,6-bis(benzimidazolyl) pyridine induce apoptosis
through caspase -3-, caspase -8-, and caspase -9-dependent pathways in A375
human melanoma cancer cells [24].
Mitochondrial dysfunction can induce the release of apoptogenic factors, such
as cytochrome c, from the mitochondrial inner space into the cytosol, triggering
apoptotic pathways. The loss of mitochondrial membrane potential, an early event in
apoptosis, represents mitochondrial dysfunction, which is an irreversible checkpoint
in apoptosis. Loss of ∆Ψm is associated with the activation of caspases and the
initiation of apoptotic cascades [28,29]. Thus, in this study, to determine the role of
90
the mitochondria in RuGly-induced apoptosis, we examined the loss of mitochondrial
membrane potential using the JC-1 assay. As indicated in Fig. 3, treatment of S180
cells with complex induced a significant loss of ΔΨm, suggesting that mitochondria
play an important role in RuGly-induced apoptosis. Ruthenium complexes exhibit
cytotoxic activity against various types of tumor cell lines, affecting mitochondria and
inducing caspase activation [30]. Taken together, our data indicate that the loss of
mitochondrial potential and the activation of caspases are crucial for RuGly-induced
apoptosis in S180 cells.
Bcl-2 family members are important regulators of mitochondria-mediated
apoptosis. These proteins can be targeted to the mitochondria and regulate
mitochondrial membrane permeabilization during apoptotic events. Among the Bcl-2
family members, Bcl-2 and Bcl-xL are anti-apoptotic members, whereas Bax and Bak
are pro-apoptotic members. Bax and Bak serve as a necessary gateway for the
release of apoptotic proteins such as cytochrome c and Smac [30,31]. Interestingly,
in the present study, our results showed that the levels of Bak (protein) and Bax
(mRNA) were increased after treatment with complex, further confirming the that the
intrinsic mitochondrial pathway triggers RuGly-induced S180 cell apoptosis. Based
on these results, the increases in the levels of Bax and Bak may trigger the
depolarization of the mitochondrial membrane potential, as evidenced by the JC-1
assay, and consequently induce apoptosis. These results are consistent with
previous reports, which have shown that ruthenium complexes increase Bax levels,
with consequent alterations in the mitochondrial membrane potential [23,33].
In a previous study [34], we reported that treatment with the
[Ru(pic)(dppb(bipy)]PF6 (pic = 2-pyridinecarboxylic acid anion) complex resulted in
the strong aggregation of plasmid DNA, as shown by AFM images. No nuclease
91
activity was observed, and the modifications observed confirmed that the complex
did not destroy the structure of the pBR322 plasmid DNA but rather yielded more
coiled and/or more associated plasmids. Thus, a similar AFM image was obtained for
the RuGly (Figure 7), which revealed that this complex does not allow either covalent
binding to DNA bases or intercalation between the bases; however, there was a
weak interaction that caused greater coiling of the DNA compared to the free
pBR322 plasmid DNA. Thus, these AFM data suggest that the RuGly can also signal
apoptosis through DNA pathways.
In summary, our results showed that amino acid/ruthenium complexes are
potent inhibitors of S180 tumor cell viability. The RuGly complex inhibits cell viability
through G0/G1 phase arrest and induction of apoptosis. Further investigation showed
that the RuGly caused a loss of mitochondrial membrane potential; induced the
activation of caspases 3, 8, and 9; and caused changes in the expression levels of
the pro-apoptotic Bcl-2 family, Bax (mRNA) and Bak (protein). However, the mRNA
expression level of p53 remained unchanged.
In Figure 8, we propose a model for the apoptotic signaling pathway that is
triggered by the RuGly in S180 tumor cells.
92
Fig. 8. Proposed apoptotic signaling pathways triggered by RuGly in S180 tumor cells.
Acknowledgments
The authors gratefully acknowledge the financial support of Research and Projects
Financing (FINEP) (Grant No. 01.06.0941.00/CT-Saúde to Elisângela de Paula
Silveira-Lacerda). Flavia de Castro Pereira received a Coordination for the
Advancement of Higher Education Staff (CAPES) fellowship, and Aliny Pereira de
Lima received a Brazilian National Counsel of Technological and Scientific
Development (CNPq) fellowship.
93
Conflict of interest
The authors declare that they have no conflict of interest.
Ethical approval
No studies involving humans or experimental animals were conducted in this work.
The sarcoma-180 tumor (S180) and normal fibroblast (L929) cells were purchased
from Rio de Janeiro Cell Bank/RJ, Brazil and cultured in vitro.
5.0 References
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97
6. CONCLUSÕES
A partir dos resultados obtidos neste trabalho, foi possível concluir que:
Artigo 1:
- O complexo de rutênio (III) cloreto cis-tetraaminodiclororutênio induziu
citotoxicidade na linhagem tumoral A549, como evidenciado pelo ensaio de exclusão
azul tripan e ensaio MTT; - O complexo (III) cloreto cis-tetraaminodiclororutênio, em baixas
concentrações (0,38 e 3,8 µM), diminui a capacidade de células A549 de formarem
colônias; e, em altas concentrações (19 e 383 µM), não ocorreu a formação de
nenhuma colônia;
- O complexo cloreto cis-tetraaminodiclororutênio alterou a distribuição das
fases do ciclo celular de células A549, visto que aumentou o percentual de células
na fase S, indicando que esse complexo é um agente ciclo celular específico;
- O complexo cloreto cis-tetraaminodiclororutênio induziu morte celular via
apoptose e necrose, como foi demonstrado pelo aumento do número de células
anexina V positivo e aumento de pico sub-G1 (morte via apoptose) e presença de
células com marcação apenas para iodeto de propídeo (morte via necrose);
- O mecanismo de indução de apoptose induzida por cloreto cis-
tetraaminodiclororutênio envolveu o aumento da expressão do gene pró-apoptótico
caspase 3.
Artigo 2:
- Os complexos de rutênio (II) RuAc.Asp, RuAla, RuGly, RuLeu e RuMet
induziram citotoxicidade sobre a linhagem tumoral S180, apresentando valores de
IC50 de 42,22; 70,08; 31,15; 38,19 e 22,53 µM, respectivamente, e menor atividade
citotóxica sobre linhagem normal L929, apresentando valores de IC50 de 106,72;
97,75; 51,65; 47,15 e 27,39 µM, respectivamente, valores esses superiores aos
verificados para a linhagem tumoral;
- Diante dos resultados de MTT sobre a linhagem tumoral S180 e linhagem
normal L929, verificou-se que o complexo de Ru(II) mais promissor foi o complexo
98
RuGly;
- O complexo RuGly alterou a cinética do ciclo celular da linhagem tumoral
S180, visto que aumentou a porcentagem de células na fase G0/G1 com
consequente diminuição da fase S, indicando que esse complexo pode ser
classificado como um agente ciclo celular específico;
- O complexo RuGly induziu morte celular via apoptose como evidenciado
pelo aumentou de células Anexina V positiva;
- A apoptose induzida pelo complexo RuGly em células S180 envolveu o
aumento da atividade das caspases 3, 8 e 9, demonstrando, assim, a participação
de ambas as vias intrínseca e extrínseca no mecanismo de indução de apoptose
induzida pelo complexo RuGly;
- Os mecanismos envolvidos no processo de apoptose após tratamento com
RuGly foram também demonstrados pela despolarização do potencial de membrana
mitocondrial, aumento da expressão dos genes pró-apotóticos Bax e caspase 3 e
aumento dos níveis de expressão da proteína pró-apoptótica Bak. A expressão dos
genes caspase-8, caspase-9 e p53 permaneceu inalterada no período de exposição
analisado.
99
7. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Os complexos de rutênio (Ru) formam uma classe de compostos cujos
mecanismos de potencial terapêutico ainda não foram totalmente esclarecidos. No
entanto, são complexos que podem ser sintetizados a partir de uma escolha
apropriada do ligante ao metal de transição, podendo este conferir-lhes potencial
para várias aplicações biológicas.
A atividade biológica de complexos de Ru(II)/aminoácidos e Ru(III) frente a
células tumorais S180 e A549 foram investigados neste trabalho. Por meio dos
ensaios realizados com esses dois complexos, verificou-se que ambos os complexos
induziram citotoxicidade nas linhagens testadas. Os complexos de rutênio
(II)/aminoácidos apresentaram-se bastante ativos frente ao modelo celular utilizado.
Já o complexo de Ru(III), frente à linhagem tumoral A549, demonstrou-se ativo
somente nas concentrações mais elevadas, monstrando uma maior resistência
dessa linhagem frente ao tratamento com complexo rutênio (III).
Estudos têm demonstrado que a atividade citotóxica de complexos de rutênio
sobre células tumorais não é dependente somente do estado de oxidação, mas
depende fortemente sobre a estrutura química do composto, o qual lhe confere uma
melhor interação com o DNA. Partindo desse pressuposto, verifica-se que os
ligantes de aminoácidos e a pirimidina presente no complexo rutênio (II)
desempenham um importante papel na atividade desses complexos frente à
linhagem tumoral em estudo. De acordo com a estrutura química dos complexos de
rutênio (II)/aminoácidos, pode-se sugerir que esses complexos entram na célula de
forma inalterada, ou seja, não sofrem hidrólise, e esta entrada é promovida através
de transportadores de aminoácidos depententes e independentes de Na2+ presentes
na membrana das células. Uma vez dentro da célula, complexos rutênio
(II)/aminoácidos podem se ligar ao DNA, ativando uma cascata de sinalização para
morte celular, tais como alteração do potencial de membrana mitocondrial,
externalização de fostafidilserina, liberação e ativação de moléculas apoptogências
como bax, bak, caspases 3, 8 e 9, fragmentação do DNA e, por fim, a indução de
morte da célula via apoptose.
De acordo com a classificação de compostos metálicos descrita por
Gianferrara et al. (2009), verifica-se que complexos de rutênio (II)/aminoácidos
100
podem ser classificados como compostos estruturais, no qual o metal tem um
importante papel estrutural, permitindo que o composto se ligue à molécula-alvo
(DNA) através de interações não covalentes.
Em relação ao complexo de rutênio (III), devido à presença de ligantes cloros
em sua estrutura, sugere-se que o mesmo sofra alterações através de processo de
hidrólise, uma vez que os ligantes cloros, por serem bastante lábeis, são
substituídos por moléculas de água, semelhante ao mecanismo que ocorre com a
cisplatina.
Partindo-se das hipóteses do mecanismo de ativação de complexos de
rutênio (III) e dos resultados encontrados neste trabalho, infere-se que o complexo
de rutênio (III) sofra ativação por redução na célula formando Ru(II), que é a forma
ativa do complexo que irá se ligar ao DNA. A ligação à molécula de DNA leva a
ativação de uma cascata de sinalização como externalização fosfatidilserina,
ativação de proteases (caspase-3), fragmentação do DNA e indução de morte
celular via apoptose e necrose. De acordo com a classificção de Gianferrara et al
(2009), ao contrário de complexos rutênio (II), o complexo cloreto de
cistretraaminodiclororutênio (III) pode ser classificado dentro do grupo de complexo
funcional, uma vez que a coordenação do metal ao alvo biológico é o principal
responsável pela atividade citotóxica. Os complexos funcionais devem ser ativados
por meio de reações de redução/oxidação ou aquação. Esses compostos metálicos
devem ter, pelo menos, um ligante lábil que possa ser substituído, proporcionando
uma posição de coordenação disponível para a ligação com o alvo.
Além dos estudos de mecanismos de morte celular realizados neste trabalho,
estudos de interação com biomoléculas, a transferrina e abumina, são também de
grande relevância para a investigação do mecanismo de ação desses complexos,
visto que existem vários resultados na literatura demonstrando a capacidade de
complexos de rutênio de interagirem com essas biomoléculas.
Diante dos resultados obtidos neste estudo com complexos de Ru(II) e Ru(III),
sugere-se uma hipótese para o possível mecanismo de ação de ambos os
complexos, conforme esquema demonstrado abaixo:
101
a)
b)
Figura 15: Hipótese da via de sinalização apoptótica acionada pelo complexo de rutênio (II) RuGly (a) e complexo de rutênio (III) cloreto de cis-tetraaminodiclororutênio (b).
102
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