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SNPse
APLICAÇÕES
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
CENTRO DE DESENVOLVIMENTO TECNOLÓGICO
CURSO DE BIOTECNOLOGIA
DISCIPLINA DE GENÔMICA II
NÃO É ESTÁTICO
constantemente sujeito a mudanças
MUTAÇÕES
MUTAÇÕES
germinativas somáticas
Alterações no DNA
Mutações espontâneas
Mutações induzidas
agentes mutagênicos
Mutações cromossômicas: mudanças na estrutura ou no número de cromossomos
Mutações gênicas: mudanças em um ou poucos nucleotídeos
MUTAÇÕES GÊNICAS
Inserções e Deleções
Substituições de bases
envolvem a substituição de, normalmente, uma única base
casos raros: várias bases são substituídas
SNPs
Polimorfismos de base única
Frequência de mais de 1% na população
Single Nucleotide Polymorphism
Sequenciamento do Genoma Humano
2 milhões de SNPs
comum
G para C
variante
DNA SNP T para A
Códon no RNAGAU para GUU
AminoácidoAspartato
para Valina
Mudança na proteína
Aspartato Valina
mRNA
C T
G A U G U U
GAU GUU
C AA A
MUTAÇÃO SINÔNIMASubstituição resulta em um novo códon que codifica o
MESMO aminoácido
MUTAÇÃO NÃO SINÔNIMASubstituição resulta em um novo códon que codifica um
aminoácido DIFERENTE
MUTAÇÃO SILENCIOSACódon que especifica um aminoácido é substituído por um
códon de terminação
IMPORTÂNCIA
“Combustível” que dirige a evolução
Causas de anormalidades
Suscetibilidade a doenças
MESTRADO
Variantes polimórficas 2029C>T e 2258G>A no gene que codifica para o TLR2 humano:
avaliação de uma população brasileira e revisão sistematizada
Mestranda HELENA STRELOW THUROW
Orientadora Profa. Dra. Clarice Alho
PPG EM BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR
SEPSE
Problema de saúde pública
Infecção Generalizada
InfecçãoSIRS
Sepse
Buras et al., 2005
sucesso Recuperação
agravamento Danos Irreversíveis/Morte
- febre ou hipotermia
- taquipnéia
- taquicardia
- leucocitose ou
leucopenia
+
18 milhões de casos de sepse por ano
Marcadores Moleculares
Condição frequente
Alto índice de mortalidade
Elevado custo do tratamento
SEPSE
Carpenter et al., 2007
Receptores PRR Toll-like Receptors
Papel chave no início da imunidade inata
Reconhecimento de PAMPs – bactérias, vírus, fungos
Família de pelo menos 12 receptores
Receptores com elevada especificidade
Texereau et al., 2005
cromossomo 4
locus 4q31.3-32
Texe
reau
et
al.,
20
05
Dois SNPs têm sido relacionados ao aumento do risco de infecção. Modelos animais sugerem que uma sinalização defeituosa do TLR2 é um fator para o aumento na susceptibilidade a doenças bacterianas.
2029C>T (Arg677Trp)
Citosina para Timina no nucleotídeo 2029
Arginina para Triptofano no aminoácido 677
Lepra Lepromatosa
[Kang et al., 2001; Kang et al., 2004]
Tuberculose
[Bem-Ali et al., 2004]
Texe
reau
et
al.,
20
05
Dois SNPs têm sido relacionados ao aumento do risco de infecção. Modelos animais sugerem que uma sinalização defeituosa do TLR2 é um fator para o aumento na susceptibilidade a doenças bacterianas.
2258G>A (Arg753Gln)
Guanina para Adenina no nucleotídeo 2258
Arginina para Glutamina no aminoácido 753
Risco para sepse após infecção por bactérias Gram-positivas
[Lorenz, et al., 2000].
Tuberculose [Ogus, et al., 2004];
Restenose [Hamann, et al., 2005];
Doença de Lyme [Schröder, et al., 2005];
Febre Reumática Aguda [Berdeli, et al., 2005];
Transplante de fígado [Eid et al., 2007]
Infecções bacterianas [Kutukculer et al., 2007]
Infecção do trato urinário [Tabel et al., 2007]
• Realizar uma análise da possibilidade de aplicação
clínica da genotipagem dos polimorfismos 2029C>T e
2258G>A do gene do TLR2 como marcadores da sepse
OBJETIVOS
• Realizar um estudo associativo entre os SNPs 2029C>T e 2258G>A do gene do
TLR2 e a suscetibilidade à sepse e/ou aos desfechos críticos a partir da sepse
ESTUDOS DOS PACIENTES
• Pacientes da UTI do Hospital São Lucas da PUCRS (2004 a 2006)
• Extração de DNA a partir de sangue
• 422 pacientes críticos admitidos na UTI
• Máximo de internação: 242 dias
• Comitê de Ética da PUCRS
ESTUDOS DOS PACIENTES
Qual segmento do DNA será amplificado e sequenciado?
2041 ctgtgccacc gtttccatgg cctgtggtat atgaaaatga tgtgggcctg gctccaggcc
2101 aaaaggaagc ccaggaaagc tcccagcagg aacatctgct atgatgcatt tgtttcttac
2161 agtgagcggg atgcctactg ggtggagaac cttatggtcc aggagctgga gaacttcaat
2221 ccccccttca agttgtgtct tcataagcgg gacttcattc ctggcaagtg gatcattgac
2281 aatatcattg actccattga aaagagccac aaaactgtct ttgtgctttc tgaaaacttt
2341 gtgaagagtg agtggtgcaa gtatgaactg gacttctccc atttccgtct ttttgatgag
2401 aacaatgatg ctgccattct cattcttctg gagcccattg agaaaaaagc cattccccag
2461 cgcttctgca agctgcggaa gataatgaac accaagacct acctggagtg gcccatggac
2521 gaggctcagc gggaaggatt ttgggtaaat ctgagagctg cgataaagtc ctaggttccc
2581 atatttaaga ccagtctttg tctagttggg atctttatgt cactagttat agttaagttc
2641 attcagacat aattatataa aaactacgtg gatgtaccgt catttgagga cttgcttact
Gene TLR2 - cromossomo 4 locus 4q31.3-32
2029 C (Arg677): cgg 2258 G (Arg753): cgg
2029 T (Trp677): tgg 2258 A (Gln753): cag
vermelho: primer FORWARD
azul: primer REVERSE
verde: códon da Arg677Trp
amarelo: códon da Arg753Gln
roxo: fragmento de 340pb
Realizar um estudo associativo entre os alelos
2029T e 2258A do gene do TLR2 e a
suscetibilidade à sepse e/ou aos desfechos
críticos a partir da sepse
Realizar uma análise da possibilidade de
aplicação clínica da genotipagem dos
polimorfismos 2029C>T e 2258G>A do gene do
TLR2 como marcadores da sepse
2029C>T (Arg677Trp)
2258G>A (Arg753Gln)
ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer, Perkin-Elmer, USA
MegaBase 1000 capillary DNA sequencer, Amersham Biosciences, UK
Fo
rw
ard
Reverse
Fo
rw
ard
Reverse
A
B
Análise do genótipo do SNP 2029C>T por sequenciamento
2029C>T (Arg677Trp)
2029CC = 0.998 (421/422) 2029C = 0.99 (843/844)
2029CT = 0.002 (1/422) 2029T = 0.01 (1/844)
2029TT = 0
2258G>A (Arg753Gln)
2258GG = 1 (422/422) 2258G = 1 (844/844)
2258GA = 0 2258A = 0
2258AA = 0
Não foi possível realizar análise da possibilidade de aplicação clínica da
genotipagem dos polimorfismos como marcadores da sepse
Os resultados da genotipagem não suportam uma
aplicação clínica dos alelos dos SNPs do TLR2
SNPs 2029C>T e 2258G>A não são bons marcadores
genéticos no estudo da sepse na nossa população.
DOUTORADO
Prevalência dos polimorfismos oncogênicos dos éxons 4 a 8 do gene
da p53 no banco de DNA da coorte de 1982, Pelotas – RS e fatores de risco
Doutoranda HELENA STRELOW THUROW
Orientadora FABIANA KÖMMLING SEIXAS
COORTE
Grupo de indivíduos que têm algo em comum ao serem reunidos e que são observados por um determinado período para que se possa avaliar o que ocorre com eles.
Estudos raros Elevado custo
Estudo da Coorte dos indivíduos nascidos na cidade
de Pelotas no ano de 1982
Maior e mais longo estudo de coorte de nascimentos
Acompanhamento desde o nascimento
Informações sobre desenvolvimento e exposições
CÂNCER
Crescimento desordenado de células que invadem os tecidos e órgãos
Células agressivas e incontroláveis
Tumores
ORIGEMEquilíbrio entre a origem e a morte da
célula é direcionado para uma proliferação incontrolada
MALIGNOS
BENIGNOS
Crescimento com invasão de tecidos próximos e espalhamento de metástases
Crescimento localizado e sem invasão a tecidos adjacentes
CÂNCER MORTE
2007 7.9 milhões de mortes
13% de todos os óbitos70% em países de
média ou baixa renda
Estimativa de 12 milhões de mortes
no ano de 2030
principal causa
ESTATÍSTICAS
OMS
PulmãoEstômago
FígadoColorretalEsôfagoPróstata
MamaPulmão
EstômagoColorretalCervical
CAUSAS
Fatores internos e externos ao organismo
Fatores genéticos
Fatores ambientais: radiação, dieta, tabaco
Mutações na p53
GENE TP53
11 éxons e 10 íntrons
20 Kb
cromossomo 17p13.1
P53
393 aminoácidos
53kD
GUARDIÃO DO GENOMA
p53
P53
CÂNCER
Mutações no gene TP53
Mutações em mediadores da P53
Desencadeado por mecanismos
Proliferação incontrolada
Marca universal de tumores
MUTAÇÕES NA P53
IARC
24.785 mutações somáticas
423 mutações germinativas
2300 proteínas mutantes
International Agency for Research on Cancer
95% DAS MUTAÇÕES
5% DAS MUTAÇÕES
CÓDON 72
CCC PROLINA
CGC ARGININA
MUDANÇA NÃO CONSERVATIVA
Éxon 4
80% das mutações
Éxons 5 a 8
30% destas mutações
Códons hot spots
70% destas mutações
Mais de 200 códons
Mutações na p53
Metade de todos os cânceres
Frequência de 5 a 50 %
Eventos iniciais em tecidos premalinos
CÂNCER E P53
Câncer Colorretal Câncer Gástrico
Câncer de Ovário Câncer de Mama
Câncer de Bexiga Câncer de Pulmão
OBJETIVOS
Identificar a freqüência de polimorfismos genéticos da p53, através de técnicasavançadas de Biologia Molecular, na Coorte de 1982 em uma população de adultos jovensque vem sendo estudada desde o nascimento em Pelotas, RS.
GERAL
OBJETIVOS
ESPECÍFICOS
Verificar a freqüência e o perfil dos genótipos do polimorfismo do códon 72 do gene dap53 no banco de DNA de indivíduos nascidos em 1982 incluídos na coorte
Analisar os polimorfismos presentes nos éxons 4 a 8 do gene da p53 no banco de DNAde indivíduos nascidos em 1982 incluídos na coorte
Relacionar os polimorfismos oncogênicos com fatores de riscos ambientais (tabagismomaterno, crescimento uterino, amamentação, ganho de peso, tabagismo, álcool, drogas edieta) durante exposições fetais, infância e aos 23 anos
METODOLOGIA
ORIGEM DOS INDIVÍDUOS
Coorte de 1982
Indivíduos nascidos nas maternidades de Pelotas entre Janeiro e
Dezembro de 1982, incluídos no banco de DNA do Centro de Pesquisas
Epidemiológicas da UFPel
Genotipagem do polimorfismo do códon 72 do gene da p53
digestão – AciI ou SfcI
sangue DNA PCR eletroforese análise em gel
eletroforese
360C
2hClivagem ezimática
BstU I
sangue DNA PCR eletroforese análise em gel
eletroforese
de agarose
análise em gelanálise em gel de agarose
Tabela 1 – Seqüências dos primers para a detecção do polimorfismo do códon 72 no éxon 4
Primer Seqüência* (5’-3’) Tamanho (bp) Referência
72S TTGCCGTCCCAAGCAATGGATGA 199 Anschau et al., 2005
72A TCTGGGAAGGGACAGAAGATGAC
Tabela 2 – Fragmentos do polimorfismo do códon 72 obtidos com a RFLP e seus respectivos
genótipos
Fragmentos
(pb)
Genótipos
Pro/Pro Pro/Arg Arg/Arg
199 Sim Sim Não
113 Não Sim Sim
86 Não Sim Sim
Análise dos éxons 4-8 do gene da p53
sangue DNA PCR eletroforese análise em gelsangue DNA PCR eletroforese análise em gel
anáanálisessequenciamento
de agarose
Tabela 3 – Sequências dos primers gerais dos éxons 4 a 8 do gene da p53.
Tabela 3 – Sequências dos primers gerais dos éxons 4 a 8 do gene da p53.
Primer Seqüência* (5’-3’) Referência
P53_4leftextPCR_F TGAGGACCTGGTCCTCTGAC Lehman et al., 1991
P53_4rightextPCR_R AGAGGAATCCCAAAGTTCCA Lehman et al., 1991
P53_4leftintSEQ_F TGCTCTTTTCACCCATCTAC Lehman et al., 1991
p53_4rghtintSEQ_R ATACGGCCAGGCATTGAAGT Lehman et al., 1991
P53_5/6PCR_F GCCGTGTTCCAGTTGCTTTA Verselis et al., 2000
P53_5/6PCR_R TAAGCAGCAGGAGAA AGCCC Verselis et al., 2000
P53_5/6SEQ_F TGTTCACTTGTGCCCTGACT Lehman et al., 1991
P53_5/6SEQ_R TTAACCCCTCCTCCCAGAGA Lehman et al., 1991
P53_7/8PCR_F CTTGCCACAGGTCTCCCCAA Lehman et al., 1991
P53_7/8PCR_R AGGCATAAC TGCACCCTTGGT Lehman et al., 1991
P53_7/8SEQ_F AGGCGCACTGGCCTCATCTT Lehman et al., 1991
P53_7/8SEQ_R TCCACCGCT TCT TGTCCTGC Bumroongkit et al., 2008
ANÁLISE DOS DADOS
FATORES DE RISCO
Exposições Fetais
Infância
Aos 23 Anos
tabagismo materno na gestação e crescimento intra-uterino
amamentação e ganho de peso
tabagismo, álcool, drogas e dieta
RESULTADOS ESPERADOS
Obtenção das freqüências do polimorfismo do códon 72 do gene da p53
Análise dos polimorfismos presentes nos éxons 4 a 8 do gene da
p53 de DNA de indivíduos da coorte de 1982
Verificação da relação entre os polimorfismos dos éxons 4 a 8 do gene
da p53 e fatores de riscos
BIOTECNOLOGIA
O monitoramento das prevalências de mutações e perfis genéticos das populações promovido através da biotecnologia médica, oferece ferramentas no desenvolvimento de programas avançados de prevenção de riscos e na atenção à saúde baseados nos genomas
e estudos de Coortes.
RESULTADOS
PCR 11PCR 5PCR
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Controle
Negativo
PCR 11PCR 5CLIVAGEM ENZIMÁTICA
Marc
1Kb1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Arg
Arg
Pro
Arg
Pro
Arg
Arg
Arg
Pro
Arg
Pro
Arg
Pro
Arg
Pro
Arg
Arg
Arg
Pro
ProGENÓTIPOS
PCR 11PCR 5SEQUENCIAMENTO
1
Arginina
Arginina
PCR 11PCR 5Amostra 1 – Arginina/Arginina
PCR 11PCR 5Amostra 2 – Prolina/Arginina
2
Prolina
Arginina
PCR 11PCR 5Amostra 9 – Prolina/Prolina
9
Prolina
Prolina