Streptococcus pneumoniae isolados em Porto Alegre, Rio Grande...

Universidade Federal do Rio de Janeiro

Evolução da resistência a antimicrobianos

e caracterização molecular de Streptococcus pneumoniae isolados em

Porto Alegre, Rio Grande do Sul

CÍCERO ARMÍDIO GOMES DIAS

Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes

Rio de Janeiro 2007

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Evolução da resistência a antimicrobianos e caracterização molecular de

Streptococcus pneumoniae isolados em Porto Alegre, Rio Grande do Sul

CÍCERO ARMÍDIO GOMES DIAS

Rio de Janeiro Setembro 2007

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Microbiologia), Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes (IMPPG), da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em Ciências (Microbiologia). Orientador: Profa. Dra. Lúcia Martins Teixeira

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Evolução da resistência a antimicrobianos e caracterização molecular de Streptococcus pneumoniae isolados em Porto Alegre,

Rio Grande do Sul Autor: Cicero Armidio Gomes Dias Orientador: Lúcia Martins Teixeira

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências

Biológicas (Microbiologia), Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes (IMPPG), da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em Ciências (Microbiologia).

Aprovada por: ------------------------------------------------------------------------- Presidente, Prof.Sérgio Eduardo Longo Fracalanzza -------------------------------------------------------- Prof. Vânia Lucia Carreira Merquior -------------------------------------------------------- Prof. Marise Dutra Asensi

-------------------------------------------------------- Prof. João Ramos Costa Andrade -------------------------------------------------------- Prof. Angela Christina Dias de Castro


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FICHA CATALOGRÁFICA

Dias, Cicero Armidio Gomes Evolução da resistência a antimicrobianos e caracterização molecular de Streptococcus pneumoniae isolados em Porto Alegre, Rio Grande do Sul / Cicero Armidio Gomes Dias. - Rio de Janeiro: UFRJ/ IMPPG, 2007. xiv, 166 f.: il. ; 31 cm. Orientador: Lúcia Martins Teixeira Tese (doutorado) – UFRJ/ Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes/ Programa de Pos-graduação em Ciências Biológicas (Microbiologia), 2007 Referências Bibliográficas: f. 81 - 109

1. Streptococcus pneumoniae. 2. Caracterização fenotípica. 3. Caracterização genotípica. 4. Susceptibilidade a antimicrobianos. 5. Sorotipagem. 6. Epidemiologia molecular. I. Teixeira, Lúcia Martins. II. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes, Programa de Pos-Graduação em Ciências Biológicas (Microbiologia). III. Título

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O presente trabalho foi desenvolvido junto ao Laboratório de

Apoio Biotecnológico do Departamento de Microbiologia Médica,

Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes (IMPPG), Centro de

Ciências da Saúde (CCS), Universidade Federal do Rio de

Janeiro (UFRJ), sob a orientação da Profa. Dra. Lúcia Martins

Teixeira.

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Dedicatória

Este trabalho é dedicado a Isabel, Olívia e Cecília,

que fazem com que a vida tenha sentido.

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Agradecimentos

O autor agradece às seguintes pessoas e instituições:

À Prof. Lúcia Martins Teixeira, orientadora desta tese. Pelo elevado espírito

científico, pela generosidade em propiciar oportunidades para crescimento e

ampliação de horizontes. Um exemplo marcante e um agradecimento especial.

Ao Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes, da Universidade Federal do

Rio de Janeiro. À coordenadora de Pós-Graduação, Prof. Thaís Souto-Padrón e aos

demais professores comprometidos com a excelência desta instituição.

À Fundação Faculdade Federal de Ciências Médicas de Porto Alegre. Esta

instituição permitiu a realização de grande parte deste trabalho. Diversos

funcionários e professores contribuíram, em especial ao professor Pedro d’Azevedo.

Vale também mencionar Grasiela Agnes e Ana Paula Guedes Frazzon.

Ao Hospital Mãe de Deus, Porto Alegre, nas pessoas de Úrsula Silva e Galton

Albuquerque. Também, aos colegas Fabiana Zettler, Leandro Perez e Silvana

Superti.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq),

à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), à

Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP), à Fundação Carlos Chagas Filho de

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Amparo e Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), ao Ministério da Ciência

e Tecnologia (MCT/PRONEX), pelo apoio financeiro.

Ao Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Maria da Glória

Siqueira Carvalho deve aqui ser mencionada com destaque. Sua inteligência e

empenho à ciência e à saúde pública trouxeram uma imensa colaboração a este

estudo. Também agradeço a Bernard Beall e Richard Facklam, diretores do

Streptococcus Laboratory do CDC.

À Maria Beatriz Cirne Lima Guedes (FFFCMPA) e Filomena Soares Pereira

da Rocha (IMPPG-UFRJ) pelo apoio técnico.

Aos colegas do laboratório 27 do Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de

Góes. Destaco aqui a colega Fabíola Cristina Kegele que compartilhou uma parcela

importante desta tese.

À minha família.

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Resumo Evolução da resistência a antimicrobianos e caracterização molecular de

Streptococcus pneumoniae isolados em Porto Alegre, Rio Grande do Sul

Autor: Cícero Armídio Gomes Dias

Orientador: Lúcia Martins Teixeira

Resumo da Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação

em Ciências Biológicas (Microbiologia), Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de

Góes (IMPPG), da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), como parte dos

requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em Ciências (Microbiologia).

Streptococcus pneumoniae é um importante patógeno que causa doenças graves como meningite, pneumonia e bacteremia. O presente estudo teve o objetivo de avaliar a evolução da resistência aos antimicrobianos entre amostras de S. pneumoniae isoladas em Porto Alegre, RS, durante um período de dez anos (1995-2004). Foram estudadas 829 amostras. A resistência à penicilina foi verificada em 25,1% das amostras (17,7% de resistência intermediária e 7,4% de resistência plena). A resistência à ceftriaxona, ao cloranfenicol, à eritromicina e à tetracicllina foi de 0,8% (6,2% em casos de meningite), 1,3%, 4,0%, e 10,1%, respectivamente. Um aumento da resistência plena à penicilina foi evidente (1,46% no período 1995-1999 e 15,4% em 2000-2004). Os sorotipos 14, 6B, 19F, 23F, 3, 6A, 11A e 9V foram os mais freqüentes e 75,5% e 49,0% dos isolados apresentaram tipos sorológicos incluídos nas vacinas 23 e 7-valente, respectivamente. Amostras pertencentes a seis sorotipos (6B, 9V, 14, 19F, 23B e 23F) constituiram 86,1% dos isolados não suscetíveis à penicilina. Os sorotipos 9V e 14 predominaram entre isolados com resistência plena à penicilina e, de acordo com a análise dos perfis de fragmentação do DNA cromossômico através de eletroforese em campo pulsado após macro restrição, a maioria destas amostras foi incluída em um único complexo clonal relacionado ao clone internacional Spain9V-3. Em amostras do sorotipo 6B, um complexo clonal principal, com dois subclones altamente relacionados, foi identificado entre amostras suscetíveis à penicilina e em amostras com resistência intermediária. Os resultados demonstraram as características da disseminação de amostras resistentes de S.pneumoniae na região investigada, reforçando a necessidade de vigilância, em especial para os sorotipos 6B, 9V e 14. Foram também caracterizadas 4 amostras de S. pneumoniae com fenótipo de resistência à optoquina (OptR), que constitui uma atipia importante e pouco freqüente. Em todas foram observadas mutações na seqüência de nucleotídeos que codifica a

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subunidade c da F0F1 ATPase: duas apresentaram mutações nos códons 23 (levando a uma substituição do amino ácido isoleucina ao invés de alanina) e 49 (serina ao invés de fenilalanina, uma substituição ainda não descrita neste códon). Duas novas mutações foram observadas nas duas amostras restantes, ambas no códon 45 (leucina ou valina na posição correspondente à fenilalanina). Os resultados revelaram três alterações descritas pela primeira vez em pneumococos com fenótipo OptR , não sendo observada relação dessa característica com um sorotipo específico, perfil de resistência aos antimicrobianos ou grupo clonal. Por fim, considerando que a definição dos sorotipos de S. pneumoniae é essencial para a vigilância das infecções causadas por este microrganismo, foi avaliado e adaptado um dos métodos moleculares que estão sendo introduzidos com a intenção de contornar os problemas da tipagem convencional. Para tal, um procedimento de PCR multiplex seqüencial foi testado em uma amostragem de pneumococos isolados de crianças, resultando na proposta de um sistema alternativo para aumentar o rendimento na dedução de sorotipos mais freqüentes na América Latina. O sistema alternativo proposto é composto por seis reações de PCR multiplex, abrangendo 30 sorotipos/sorogrupos e permitiu a determinação do tipo capsular de 94,6% das amostras testadas.

Palavras-chave: Streptococcus pneumoniae, resistência aos antimicrobianos, distribuição de sorotipos, caracterização molecular, sorotipo 14, clone Spain9V-3, resistência à optoquina, F0F1 ATPase, PCR multiplex seqüencial.


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Abstract

Evolution of antimicrobial resistance and molecular characterization of Streptococcus

pneumoniae isolated in Porto Alegre, Rio Grande do Sul

Author: Cicero Armidio Gomes Dias

Advisor: Lúcia Martins Teixeira

Abstract of the Dissertation presented to the Programa de Pos-graduação em

Ciências Biológicas (Microbiologia), Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes

(IMPPG), Univesidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), as part of the requirements

to receive the degree of Doctor in Sciences (Microbiology).

Streptococcus pneumoniae is an important pathogen that causes severe life-threatening illness such as meningitis, pneumonia, and bacteremia. In the present study, we evaluated trends on antimicrobial resistance and molecular characteristics of 829 S. pneumoniae isolates from patients living in Porto Alegre, RS, Brazil, obtained over a ten-year period (1995-2004). Penicillin resistance was present in 25.1% of the strains (17.7% intermediate and 7.36% full resistant). Resistance to ceftriaxone, chloramphenicol, erythromycin, and tetracycline was verified in 0.8% (6.2% in case of meningitis), 1.3%, 4.0%, and 10.1% of the strains, respectively. An increase in full resistance to penicillin was evident (1.46% in the period 1995-1999 and 15.4% in 2000-2004). Serotypes 14, 6B, 19F, 23F, 3, 6A, 11A, and 9V were the most frequent and 75.5% and 49.0% of the isolates belonged to serotypes included in the 23-valent and 7-valent pneumococcal vaccines, respectively. Pneumococci of six serotypes (6B, 9V, 14, 19F, 23B, and 23F) comprised 86.1% of the penicillin non-susceptible isolates. Serotypes 9V and 14 predominated among isolates exhibiting full resistance to penicillin and, according to PFGE analysis, most of these isolates were included in a single clonal complex related to the international clone Spain9V-3. On the other hand, among serotype 6B isolates, a major clonal complex was observed, with two highly related subclusters including penicillin susceptible and intermediate resistant pneumococci. The results indicate the dissemination of resistance among strains of S. pneumoniae in the Southern region of Brazil, reinforcing the need of surveillance and control of antimicrobial resistance, with especial emphasis in serotypes 6B, 9V and 14.

We have also identified and characterized 4 S. pneumoniae isolates presenting optochin resistance (OptR), a rare but important atypical phenotype. All 4 OptR isolates presented mutations in the nucleotide sequence coding for the c subunit of F0F1 ATPase: two had mutations in codons 23 (leading to the deduced amino acid substitution isoleucine instead of alanine) and 49 (serine instead of

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alanine, a novel type of mutation detected at this position), respectively. Two additional novel mutations, both located in codon 45, were detected in the two additional isolates, corresponding to leucine or valine (instead of phenylalanine). The data indicate that three previously unrecognized alterations were detected in the atpC gene of S. pneumoniae and that OptR among Brazilian pneumococcal isolates is not related to a specific pneumococcal serotype, antimicrobial resistance profile, or clonal group.

Considering that definition of S. pneumoniae serotypes is essential for surveillance we have evaluated and adapted one of the molecular methods that have recently been introduced for this purpose and to circumvent eventual problems related to conventional serotyping. We have applied a multiplex PCR procedure to determine the serotypes in a collection of Brazilian pneumococcal isolates from children and have designed a modified scheme to improve the test performance in the deduction of the most frequent serotypes of S. pneumoniae isolated in Latin America. The so-called six reactions Latin America scheme comprises 30 serotypes/serogroups and covered 94.6% of the pneumococcal isolates tested. Key words: Streptococcus pneumoniae, antimicrobial resistance, serotype distribution, molecular characterization, serotype 14, Spain9V-3 clone, optochin resistance, F0F1 ATPase, sequential multiplex PCR.

Rio de Janeiro

September 2007

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Sumário

Resumo ix

Abstract xi

Introdução 01

• Importância das infecções pneumocócicas 01

• Patogenicidade e fatores de virulência 02

• Imunoprofilaxia 06

• Sorotipagem e métodos alternativos 09

• Resistência aos antimicrobianos 10

• Resistência aos antimicrobianos no Brasil 15

• Rastreamento de cepas com resistência aos antimicrobianos 18

• Identificação 21

Objetivos 26

Materiais e métodos 27

• Amostras bacterianas 27

• Caracterização fenotípica das amostras 28

• Tipagem sorológica 29

• Detecção de genes associados a fatores de virulência de

Streptococcus pnemoniae

30

• Testes de hibridização com sonda de DNA para a subunidade

16S do rRNA de Streptococcus pneumoniae

33

• Testes de suscetibilidade aos antimicrobianos 33

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• Detecção e caracterização de genes associados à resistência

aos antimicrobianos

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• Análise do polimorfismo dos perfis de fragmentação do DNA

cromossômico através eletroforese em campo pulsado (PFGE)

38

• “Multilocus Sequence Typing” (MLST) 40

• PCR multiplex seqüencial para determinação de tipos capsulares 41

Resultados 46

Discussão e conclusões 72

Referências bibliográficas 81

Anexos 110

• Manuscrito 1 115




Introdução

Importância das infecções pneumocócicas

A espécie Streptococcus pneumoniae, comumente denominada de

pneumococo, encontra-se entre as principais causas de doença e morte em seres

humanos. Constitui um dos principais agentes bacterianos de pneumonias

adquiridas na comunidade, sendo uma das causas mais importantes de meningite,

bacteremia, otite média aguda e sinusite (Butler, Dowell & Breiman, 1998). Estima-

se que, nos Estados Unidos da América (EUA), cerca de 3.000 casos de

meningite e de 60.000 casos de bacteremia, a cada ano, sejam devidos a este

microrganismo (CDC, 1997), sendo este a principal causa de meningite de

etiologia bacteriana (1,1 casos/100.000 a cada ano) (Schuchat et al., 1997). A taxa

de mortalidade nas bacteremias pneumocócicas é de aproximadamente 25-30%

(Pallares et al., 1995), sendo estimada entre 30 e 40% em idosos (CDC, 1997).

Aproximadamente 500.000 casos de pneumonia pneumocócica ocorrem

anualmente nos EUA, sendo que o pneumococo é responsável por 25-35% das

pneumonias bacterianas comunitárias em pacientes que necessitam

hospitalização (Jernigan, Cetron & Breimann, 1996). Avalia-se, ainda, a

associação deste microrganismo com a ocorrência anual de aproximadamente 1

milhão de mortes entre crianças com menos de cinco anos, a maioria em países

em desenvolvimento (Hausdorff et al., 2000a).

As meningites pneumocócicas apresentam alto índice de mortalidade,

variando de 20% a 50%, sendo que, entre os sobreviventes, 30% a 60%

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desenvolvem seqüelas neurológicas e perda de audição (Koedel, Scheld & Pfister,

2002).

À parte infecções invasivas, os pneumococos encontram-se envolvidos em

infecções mais freqüentes, como otites e sinusites. Do total de 24 milhões de

consultas pediátricas devidas a otite média aguda que ocorrem anualmente nos

EUA, 20-50% são causadas pelos pneumococos (CDC, 1997).

Estudos realizados no Brasil apontam os pneumococos entre os principais

agentes de meningites (Bryan et al., 1990; Taunay et al., 1990; Brandileone et al.,

1995; Ko et al., 2000), bem como de infecções respiratórias agudas (Sutmoller et

al., 1995).

Patogenicidade e fatores de virulência

O risco para aquisição de infecções pneumocócicas é nitidamente

relacionada com a idade, sendo maior em crianças menores que dois anos de

idade e em idosos acima de 65 anos (García-Leoni et al., 1993). Há ainda grupos

de indivíduos que, independente da idade, apresentam maior risco para infecção

invasiva pelo pneumococo, particularmente os asplênicos, os portadores de

doenças de base crônicas (cardiovasculares, pulmonares, diabetes, alcoolismo,

cirrose) e os imunocomprometidos. A incidência de bacteremia em indivíduos

infectados pelo vírus da imunodeficiência humana é cerca de 100 a 200 vezes

maior do que a observada na população geral (Redd, Rutherford & Sande, 1990;

García-Leoni et al., 1992).

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Considerada a importância das infecções pneumocócicas, é necessário que

sejam ressaltados os atributos de virulência do microrganismo. Entre os fatores de

virulência dos pneumococos, destaca-se, por sua ação anti-fagocitária, a cápsula

polissacarídica, sendo conhecidos mais de 90 sorotipos com base nas diferenças

antigênicas (Henrichsen, 1995). Anticorpos dirigidos para os polissacarídeos

capsulares protegem o hospedeiro de infecções pelo sorotipo homólogo com

indução de opsonofagocitose (Bruyn, Zegers & van Furth, 1992).

A distribuição dos sorotipos nas diferentes populações varia com idade,

região e período de tempo. Contudo, dez sorotipos são responsáveis pela maioria

das doenças pediátricas invasivas, sendo que os sorogrupos 1, 6, 14, 19 e 23

estão entre os mais proeminentes (Hausdorff et al., 2000a). Amostras

pertencentes aos sorogrupos 6, 10, e 23 são mais freqüentes como causadoras de

meningites do que de bacteremia, ao passo que o inverso acontece para aquelas

pertencentes aos sorotipos 1, 4 e 14 (Hausdorff et al., 2000b). Em dois estudos

populacionais, a capacidade invasiva dos diferentes sorotipos foi definida pela

freqüência relativa com que cada sorotipo foi encontrado na nasofaringe de

portadores versus a freqüência de isolados em sítios anatômicos normalmente

estéreis. Em ambos os estudos, os sorotipos 1, 4 e 7F foram identificados como

aqueles com mais alto grau de invasividade (Brueggemann et al., 2003; Sandgren

et al., 2004). Existem, por outro lado, sorotipos mais relacionados com o estado de

portador nasofaríngeo (Bogaert, Groot & Hermans, 2004).

4

Estudos realizados com amostras isoladas de infecções pneumocócicas

invasivas no Brasil revelam que alguns sorotipos são encontrados com maior

freqüência, embora possam ser observadas diferenças em suas distribuições.

Todavia, os sorotipos 14, 6B, 1, 5 e 18C aparecem com maior destaque (Mantese

et al., 2003; Di Fabio et al., 2001; Laval et al., 2006; Brandileone et al., 2003).

O papel da cápsula é notório na etapa de colonização da nasofaringe pelo

pneumococo. Porém, outros componentes do microrganismo também atuam nesta

etapa essencial da infecção pneumocócica. A colonização requer aderência ao

epitélio que recobre o trato respiratório, sendo que o pneumococo liga-se

especificamente a carbohidratos (N-acetil-glicosamina) da superfície celular.

Proteínas de superfície do pneumococo, como a adesina de superfície

pneumocócica (PsaA), são responsáveis pela mediação da aderência a estes

açúcares (Swiatlo et al., 2002). A conversão da colonização assintomática para

doença invasiva requer a geração local de fatores inflamatórios (como interleucina

1 e fator de necrose tumoral), como costuma ocorrer nas infecções virais

(Tuonamen, 1997). Uma decorrência destas modificações inflamatórias é a

alteração na quantidade e qualidade dos receptores das células epiteliais alvo e

de células endoteliais. A colina presente na parede celular pneumocócica

apresenta afinidade pelos receptores então gerados, tais como o fator ativador de

plaquetas. A ligação a estes receptores induz a internalização e promove a

migração transcelular pelo epitélio respiratório e pelo endotélio, resultando em

invasão (Cundell et al., 1995).

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Outros componentes atuam como fatores de virulência, podendo ser

destacados a pneumolisina, a autolisina, o antígeno A de superfície, a proteína A

de superfície pneumocócica, a pululanase e as neuraminidases. (Boulnois, 1992;

Hollingshead & Briles, 2001; Jedrzejas, 2001, 2004).

A pneumolisina atua ligando-se a moléculas de colesterol encontradas na

célula do hospedeiro, o que resulta em seu ingresso nas membranas alvo e

formação de poros. Com a formação de poros o processo lítico das células é

desencadeado (Jedrzejas, 2001). A ação citotóxica ocorre sobre as células

epiteliais brônquicas, o que leva à diminuição dos batimentos ciliares (Rayner,

Jackson & Rutman, 1995). Os efeitos citotóxicos da pneumolisina podem também

inibir diretamente a fagocitose e a ação das células do sistema imune (Berry,

Yother & Briles, 1989).

A autolisina é degradadora do peptideoglicano de parede celular. A ação da

autolisina na patogênese da infecção pneumocócica se dá direta (atividade

inflamatória) e indiretamente (liberação extracelular de proteínas citoplasmáticas,

incluindo a pneumolisina) (Tuomanen, 1997).

Além do já mencionado papel de adesina do antígeno A de superfície

pneumocócica (PsaA), é também reconhecida sua atividade como proteína

transportadora de íons manganês e zinco, sendo a presença destes íons

necessária para o crescimento de S. pneumoniae (Paton, 1998).

6

A proteína SpuA (pululanase A) parece ter um papel na colonização, por

sua capacidade de solubilizar muco ou promover a exposição de glicoconjugados

do hospedeiro para a aderência do pneumococo. O gene responsável por esta

proteína foi designado como spuA (Bogaerts et al., 2000)

As neuraminidases auxiliam no processo de aderência por exercerem uma

ação de clivagem do ácido siálico das glicoproteínas e oligossacarídeos da

membrana celular das células epiteliais do hospedeiro, expondo receptores

específicos. A proteína A de superfície pneumocócica (PspA), que apresenta uma

ampla variabilidade antigênica entre diferentes amostras de pneumococos, ainda

não tem a sua função esclarecida. Já a produção de IgA1 protease, presente em

vários patógenos respiratórios importantes, parece interferir com os mecanismos

de defesa do hospedeiro ao nível das superfícies mucosas da orofaringe (Velasco

et al., 1995).

Imunoprofilaxia

A natureza complexa e multifatorial da fisiopatogenia das infecções

pneumocócicas faz com que diversos dos fatores de virulência relacionados

venham sendo empregados como alvo de imunoprofilaxia, com a intenção de

diminuir o impacto das infecções causadas por este microrganismo (Michon et al.,

1998; Briles et al., 2000). O papel central da cápsula na patogenia do

microrganismo fez desta estrutura o alvo principal para intervenção por

imunoprofilaxia. Já na década de 30 do século passado, os primeiros resultados

foram alcançados, juntamente com a demonstração da imunogenicidade dos

7

polissacarídeos capsulares (Butler et al., 1993). A bem sucedida instituição do

tratamento antimicrobiano com a penicilina na década de 40 provocou uma

diminuição do interesse por vacinas mais eficientes para prevenção de infecções

pneumocócicas. Entretanto, ainda que a diminuição da mortalidade fosse bastante

expressiva com o uso de antimicrobianos, era evidente que permanecia em níveis

muito altos (Austrian & Gold, 1964). Em 1977, uma vacina polissacarídica 14-

valente (ou seja, contendo antígenos de 14 sorotipos polissacarídicos) foi

licenciada e, em 1983, a inclusão de outros sorotipos permitiu a elaboração de

uma vacina que incluía 23 dos sorotipos mais freqüentes em doenças invasivas

nos EUA e na Europa (Fedson, 1998). Vacinas baseadas nos polissacarídeos

capsulares desencadeam a resposta imune aos polissacarídeos da cápsula, com

conseqüente estímulo de células B para a produção de anticorpos protetores.

Contudo, apresentam baixa atividade imunogênica, especialmente em indivíduos

pertencentes a grupos de alto risco em relação às infecções pneumocócicas,

incluindo crianças com menos de dois anos de idade (pela relativa imaturidade

das células B), pessoas apresentando doenças crônicas como alcoolismo e

cirrose, e pacientes imunodeprimidos (Musher, 1992). A vacina polissacarídica 23-

valente não atua sobre portadores e não tem impacto sobre a prevenção de uma

das manifestações mais freqüentes da doença pneumocócica, a otite média

aguda.

Esforços para obtenção de vacinas mais imunogênicas para prevenção de

doenças pneumocócicas têm sido dirigidos para produtos conjugados com

proteínas. A vacina 7-valente, conjugada com uma proteína (CRM197, uma variante

8

não tóxica da toxina diftérica), foi licenciada mais recentemente e contém 7

polissacarídeos (correspondendo aos sorotipos 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F e 23F),

sendo indicada para uso em crianças com menos de 2 anos de idade (Zielen et

al., 2000). Outras formulações, abrangendo até 11 sorotipos estão também sendo

consideradas. Os resultados preliminares de ensaios clínicos foram promissores

para a utilização de vacinas conjugadas 7-valente em crianças de baixo peso e

prematuros (Shinefield et al., 2002), na prevenção da otite média (Eskola et al.,

2001), na redução dos índices de portadores entre crianças freqüentadoras de

creches (Dagan et al., 2002) e na diminuição da ocorrência de infecções

respiratórias e do uso de antimicrobianos em creches (Dagan et al., 2001).

Após a licença para utilização da vacina conjugada 7-valente nos EUA, um

declínio significativo nas doenças pneumocócicas invasivas foi constatado em

estudos populacionais (Whitney et al., 2003; Kaplan et al., 2004). Mais

recentemente, em um estudo envolvendo 782 casos de doença pneumocócica

invasiva e 2512 controles, a efetividade para sorotipos incluídos na vacina foi de

96% para crianças sadias e de 81% entre crianças com agravos co-existentes

(Whitney et al., 2006). Um outro benefício observado após o uso da vacina

conjugada 7-valente foi a diminuição de índices de infecções invasivas causadas

por amostras resistentes aos antimicrobianos em crianças e idosos (Kyaw et al.,

2006). Em um estudo multicêntrico espanhol, foi observado um decréscimo (de

60,4% para 41,2%) na resistência à penicilina em amostras isoladas de crianças

entre 2001 e 2003 (Oteo et al., 2004). A diminuição na resistência foi

9

supostamente atribuída à redução no consumo de antimicrobianos, sendo esta

relacionada ao uso da vacina.

No Brasil, a vacina conjugada 7-valente não é integrante do esquema oficial

de vacinação. O impacto potencial das vacinas 7- e 9-valente para crianças com

infecções invasivas foi estimado em 58,2% e 73%, respectivamente (Brandileone

et al., 2003).

Sorotipagem e métodos alternativos para a determinação dos tipos

capsulares

A determinação sorológica dos diferentes tipos antigênicos de cápsulas

pneumocócicas é essencial para a vigilância das doenças causadas pelo

microrganismo. Da mesma forma, a implantação e a vigilância de programas de

vacinação é dependente do conhecimento dos sorotipos predominantes, sendo o

método de Quellung tradicionalmente usado para este propósito. Neste método, a

presença do antígeno capsular é constatada por reação com anti-soro específico

de cada sorotipo (Henrichsen, 1995). Ainda que seja este o padrão

internacionalmente aceito para sorotipagem de S. pneumoniae, algumas

limitações são conhecidas e incluem o alto custo dos anti-soros, a subjetividade da

interpretação e a necessidade de profissionais bem treinados. Estas limitações,

em conjunto, fazem com que poucos laboratórios reúnam condições para executar

a tipagem sorológica de pneumococos. Mais recentemente, alguns métodos

moleculares foram propostos para a definição dos tipos capsulares

pneumocócicos. A produção da cápsula é controlada por genes que comandam a

10

síntese de polissacarídeos, sendo localizados no locus cps. Este locus,

flanqueado pelos genes dexB e aliA, apresenta regiões bem conservadas em

quase todos os sorotipos, ao passo que a região central dos loci contém os genes

sorotipo-específicos, servindo de base para a tipagem por métodos moleculares

(Pai, Gertz, Beall, 2006). A abordagem molecular, baseada em reação em cadeia

da polimerase (PCR), tem sido empregada em diferentes estudos e pode servir

como ferramenta para que laboratórios com menos recursos especializados

possam realizar a determinação dos tipos sorológicos de pneumococos (Brito,

Ramirez & Lencastre, 2003; Lawrence et al., 2000; 2003; Pai, Gertz & Beall,

2006). Destaca-se aqui, pela abrangência, um estudo que utiliza PCR multiplex

sequencial com a detecção de 28 sorotipos/sorogrupos de pneumococos (Pai,

Gertz & Beall, 2006).

Resistência aos antimicrobianos

O tratamento de infecções pneumocócicas é tradicionalmente feito com

penicilina ou outros β-lactâmicos. Contudo, muitas vezes o tratamento é

estabelecido em bases empíricas, ou seja, sem que se tenha comprovação

etiológica. Deste modo, considerando-se a possibilidade do envolvimento de

outros agentes, outros antimicrobianos são empregados para tratamento de

infecções pneumocócicas (Bartlett et al., 2000).

A emergência de amostras de pneumococos resistentes à penicilina tem

abalado os conceitos para tratamento de infecções pneumocócicas. Os

pneumococos foram universalmente suscetíveis à penicilina até a década de 60,

11

quando, pela primeira vez, foram descritas amostras de pneumococos com

sensibilidade reduzida à penicilina, apresentando concentrações inibitórias

mínimas (CIMs) entre 0,1 e 0,6 µg/ml (Kislak et al., 1965; Hansmann & Bullen,

1967). A preocupação com esta questão aumentou no final da década de 70,

quando foram descritas, na África do Sul, amostras com CIMs > 2,0 µg/ml e que

também apresentavam multirresistência (Appelbaum et al., 1977; Jacobs et al.,

1978). Este fenômeno localizado foi, gradualmente, evoluindo para uma escala

global durante as décadas de 80 e 90 (Klugman, 1990; Crook & Spratt, 1998).

A resistência dos pneumococos aos β−lactâmicos se estabelece por

intermédio de alterações nas proteínas fixadoras de penicilina (PBPs, “Penicilin

Binding Protein”), as quais passam a exibir uma afinidade reduzida para este

grupo de antimicrobianos. Dentre as cinco PBPs dos pneumococos, três delas

(1a, 2b e 2x) estão, quando modificadas, associadas à resistência à penicilina

(Hakenbeck, Tarpay & Tomasz, 1980; Zighelboim & Tomasz, 1980; Smith &

Klugman, 1995), enquanto que, em relação às cefalosporinas, as alterações

significativas são observadas nas PBPs 1a, 1b e 2x (Figueiredo et al., 1992;

Sifaqui, Kitzis & Gutmann, 1996). As alterações nas PBPs se devem,

originalmente, a eventos de recombinações genéticas inter-espécies envolvendo

amostras de S. pneumoniae e S. mitis e/ou S. oralis, resultando em genes em

mosaico. Diferenças de pelo menos 25% são observadas em comparações das

seqüências dos genes das PBPs de amostras resistentes em relação às

suscetíveis (Claverys et al., 2000). Amostras de pneumococos que apresentam

resistência plena à penicilina (CIM ≥2,0 µg/ml) são geralmente resistentes a outros

12

β-lactâmicos, além de freqüentemente apresentarem resistência a antimicrobianos

pertencentes a outras classes (cloranfenicol, eritromicina, sulfametoxazol-

trimetoprima e tetraciclinas) (Tomasz, 1997; Crook & Spratt, 1998; Hsueh et al.,

1999).

A prevalência de resistência dos pneumococos aos macrolídeos é variável,

sendo bastante elevada entre amostras isoladas na Hungria (52%), Tailândia

(82%) e Taiwan (76%) (Marton et al., 1991; Hsueh et al., 1999; Hsueh & Luh,

2002). Dois mecanismos de resistência aos macrolídeos já foram descritos em

pneumococos: modificação do sítio alvo (rRNA 23S, da subunidade 50S) e por

bomba de efluxo (Sutcliffe et al., 1996). A modificação do sítio alvo ocorre pela

ação da rRNA metilase, codificada pelo gene ermB (ou ermAM), ocorrendo

resistência cruzada aos macrolídeos (14, 15 e 16 elementos), aos lincosamídeos e

à estreptogramina B (fenótipo MLSb, de caráter principalmente constitutivo). A

resistência devida à bomba de efluxo é comandada pelo gene mef(E). Quando a

resistência ocorre por este último mecanismo, não ocorre resistência cruzada aos

lincosamídeos e à estreptogramina B, e sim apenas aos macrolídeos de 14 e 15

elementos, o que constitui o fenótipo denominado de “M”. O fenótipo M é

predominante em amostras de pneumococos resistentes aos macrolídeos nos

EUA e no Canadá (Shortridge et al., 1999), ao passo que na Europa predomina o

fenótipo MLSb (Descheemaeker et al., 2000).

A resistência à sulfametoxazol-trimetoprima em pneumococos, tem crescido

significativamente (Widdowson & Klugman, 1999). A resistência a esta

13

combinação de antimicrobianos abrangeu aproximadamente a metade das

amostras procedentes da América Latina, em estudo realizado pelo SENTRY –

Antimicrobial Surveillance Program, em 1998 (Gúsman-Blanco, Casellas & Sader,

2000). Em outro estudo, mais de 90% das amostras resistentes ao co-trimoxazol

também se mostrou resistente à penicilina e ao cloranfenicol (Widdowson &

Klugman, 1999).

Em relação ao cloranfenicol, a resistência ocorre devido a produção de uma

enzima, a cloranfenicol acetiltransferase (CAT), responsável pela conversão do

antimicrobiano em um composto incapaz de ligar-se à sub-unidade 50S do

ribossomo. A enzima CAT é codificada pelo gene cat (Matthews, Baker &

Thornsberry, 1988). Em pneumococos, o gene cat está localizado no transposon

conjugativo, Tn5253. Este transposon também está relacionado à resistência dos

pneumococos à tetraciclina (Ayoubi, Kilic & Vijayakumar, 1991). Os pneumococos

apresentam resistência à tetraciclina por mecanismo de proteção ribossômica,

sendo codificada geralmente pelo gene tetM com localização em transposons

(Tn1545 e Tn5251), e ocasionalmente pelo gene tetO. É possível que ocorra o

desligamento da tetraciclina do seu sítio alvo, pela proteína TetM, o que

provocaria a resistência (Taylor & Chau, 1996).

A resistência de pneumococos às fluorquinolonas já foi constatada e é

motivo de crescente preocupação. A ação das fluorquinolonas ocorre na DNA

girase e na topoisomerase IV, enzimas essenciais no processo de duplicação do

DNA. Cada uma das enzimas é um tetrâmero composto por sub-unidades, no

14

caso da DNA girase, GyrA e GyrB, codificadas pelos genes gyrA e gyrB; na

topoisomerase IV, ParC e ParE, codificadas pelos genes parC e parE. GyrA é

homóloga a ParC, enquanto que GyrB é homóloga a ParE (Wang, 1996). As

quinolonas interagem com o complexo DNA girase, o que resulta em um complexo

estabilizado, que forma uma barreira para a replicação do DNA. A resistência do

pneumococo às fluorquinolonas tem sido descrita como resultado de mutações

pontuais, especialmente em gyrA e parC. Ainda que mutações pontuais não levem

a resistência clínica, as CIMs apresentam-se gradualmente elevadas, o que pode

ser considerada uma forma “silenciosa” de resistência. Bombas de efluxo podem

também estar envolvidas, contudo o papel exato deste mecanismo na resistência

de pneumococos às fluorquinolonas ainda não está bem elucidado (Piddock et al.,

2002).

A resistência de pneumococos à vancomicina ainda não foi descrita, no

entanto, amostras clínicas apresentando tolerância a este antimicrobiano já foram

observadas (Novak et al., 1999), devido à alterações no gene vncS, o qual codifica

uma histidina quinase.

A prevalência da resistência aos antimicrobianos por parte de pneumococos

varia significativamente (Fenoll et al., 1998). A resistência à penicilina é mais

elevada (em torno de ou superior a 50%) na Espanha, França, África do Sul,

Hungria e no Sudeste Asiático (Crook & Spratt, 1998; Hsueh & Luh, 2002).

Contrastando com as prevalências de resistência mais elevadas, em outros

países, como a Alemanha, Bélgica, Dinamarca, Finlândia, Inglaterra, Itália e

15

Suécia, a prevalência de cepas resistentes à penicilina permanece baixa (em torno

de 5%) (Fenoll et al., 1998). Estas diferenças podem ser, ao menos parcialmente,

explicadas por diferenças no padrão de uso de antimicrobianos entre diferentes

países (Bronzwaer et al., 2002). Porém, a disseminação da resistência é um

fenômeno dinâmico e em países nos quais a resistência permaneceu baixa

durante anos, foi observado um aumento na década de 90. A comparação entre

estudos multicêntricos realizados nos EUA pode aqui ser utilizada como exemplo

disto, uma vez que, na década de 80, a prevalência de resistência era de apenas

3,8% (Jorgensen et al., 1990), enquanto que, estudos realizados durante a década

de 90 indicaram uma prevalência de resistência à penicilina de 23,6% (período

1994-1995) (Doern et al., 1996) e de 29,5% (período 1997-1998) (Doern et al.,

1999). Em levantamento compreendendo os anos de 1999-2000, com 1531

amostras de pneumococos, a prevalência de resistência à penicilina foi de 34,2%,

sendo de 21,5% para amostras com CIMs ≥2,0 µg/ml. No referido estudo, as

prevalências de resistência para os macrolídeos, clindamicina, tetraciclina,

cloranfenicol, e sulfametoxazol-trimetoprima foram de 25,2%, 8,9%, 16,3%, 8,3% e

30,3%, respectivamente (Doern et al., 2001).

Resistência aos antimicrobianos no Brasil

Convivemos no Brasil com pneumococos resistentes à penicilina há quase

20 anos. Em 1988 foi publicado o primeiro caso (uma criança com meningite) de

pneumococo com resistência intermediária à penicilina, na cidade de São Paulo

(De Souza Marques et al., 1988). Durante a década de 90 foi observada a

disseminação de pneumococos com resistência aos antimicrobianos no Brasil.

16

Diversos estudos com enfoque de vigilância realizados durante aquele período

mostraram um perfil homogêneo de resistência à penicilina. Em geral, a

resistência intermediária esteve entre 10-15% das amostras, ao passo que a

resistência plena à penicilina (CIM ≥ 2,0 µg/ml) apresentou uma prevalência

inferior a 5% (Sessegolo et al., 1994; Brandileone et al., 1997; Teixeira et al.,

1997a; Ko et al., 2000; Critchley et al., 2001). Estes estudos apresentam uma

padronização metodológica adequada, um número consistente de amostras

analisadas e são, em sua maioria, provenientes de pacientes da região sudeste.

Em conjunto, constituem a base do conhecimento que dispomos sobre esta

questão em nosso país. Resistência aos macrolídeos e às tetraciclinas foi

também observada em alguns destes estudos, com prevalências inferiores a 10%,

não havendo relato de resistência às fluorquinolonas ou à vancomicina.

Especificamente em relação à eritromicina, a resistência verificada em um

abrangente estudo que contou com 931 amostras originárias dos estados do Rio

de Janeiro, São Paulo e Rio Grande do Sul (período 1990-1999) foi de 4,3%,

havendo predomínio de amostras que apresentaram o fenótipo MLSb (92,5% das

amostras resistentes) (Mendonça-Souza et al., 2004). Em relação a amostras

isoladas de portadores, um único estudo realizado neste período enfocou

amostras de crianças sadias, portadoras de pneumococos em Fortaleza, CE,

sendo que a resistência plena à penicilina foi de 3,6%, e a resistência

intermediária foi de 44,9% (Rey et al., 2002).

A resistência de pneumococos aos antimicrobianos permanece sob

investigação no país. Estudos regionais e multicêntricos têm permitido uma visão

17

mais atualizada sobre este problema. Dois estudos regionais, envolvendo

amostras encontradas em infecções pneumocócicas invasivas foram

recentemente publicados: em Salvador, BA, a resistência plena observada entre

70 amostras isoladas de crianças e adolescentes foi de 1,43%, enquanto que

18,6% das amostras apresentaram resistência intermediária (Carvalho et al.,

2003); em Uberlândia, MG, 2,7% das amostras foram caracterizadas com

resistentes e 12,8% com resistência intermediária entre 148 amostras isoladas de

pacientes de diferentes faixas etárias (Mantese et al., 2003).

Estudos multicêntricos permitem uma visão mais ampla sobre a questão da

resistência a antimicrobianos. Foi constado que, entre 497 amostras obtidas entre

1997 e 2001, a resistência à penicilina foi de 3,9% (resistência plena) e 18,0%

(resistência intermediária), sendo inferior à observada em outros países da

América Latina (Castanheira et al., 2004). Neste estudo, resistência à cefuroxima,

ceftriaxona, eritromicina e sulfametoxazol-trimetoprima foi de 6,5%, 1,4%, 11,5% e

50,3%, respectivamente. Contudo, resultados de estudos mais recentes que

apresentam comparações com os obtidos em anos anteriores revelam uma

inequívoca tendência de alta na prevalência de resistência aos beta-lactâmicos.

Foi o que se verificou em estudo que incluiu 315 amostras isoladas entre 2001 e

2002, com predomínio daquelas obtidas de pacientes com infecção respiratória,

residentes em cidades das regiões sul e sudeste, onde se observou o índice de

7,9% de resistência plena (e de 22,2% de resistência intermediária), o qual foi

superior aos índices de 4,2%, no período 1997-1998, e de 2,9% no período 1999-

2000 (Mendes et al., 2004). Esta tendência de aumento da resistência é mais

18

evidente em uma investigação abrangente, conduzida como parte do programa

nacional de vigilância epidemiológica, com um total de 6470 amostras coletadas

de infecções invasivas durante o período 1993-2004. A proporção de resistência

plena e intermediária foi de 1,1% e 9,1%, respectivamente, em 1993, atingindo

5,9% e 22,0% no ano de 2004. A resistência ao sulfametoxazol-trimetoprima,

tetraciclina, cloranfenicol e rifampicina foi de, respectivamente, 65,0%, 14,6%,

6,2%, 1,3% e 0,7%; não sendo observada resistência à vancomicina e à

levofloxacina (Brandileone et al., 2006). Em 2003, a chance de obter-se um

pneumococo resistente à penicilina no Brasil era aproximadamente 4 vezes maior

do que em 1999 (razão de chances=3,99) (Brandileone et al., 2005).

Rastreamento de cepas com resistência aos antimicrobianos

A nasofaringe é o local provável para que ocorra a seleção de cepas de S.

pneumoniae resistentes aos antimicrobianos. Amostras pertencentes aos

sorotipos mais freqüentes na nasofaringe ficariam mais tempo expostas aos

antimicrobianos e, portanto, apresentariam uma maior tendência a desenvolver

resistência. Ainda que não seja absoluta, há uma correlação entre os sorotipos

mais freqüentes na nasofaringe e os de maior prevalência de resistência (6B, 9V,

14, 19F, 23F) (Whitney et al., 2000).

A sorotipagem é o passo inicial para o rastreamento de amostras de S.

pneumoniae que apresentem resistência aos antimicrobianos. Métodos

moleculares contribuem para uma visão mais avançada e permitem um melhor

entendimento sobre a complexa diversidade dos pneumococos. Dentre estes

métodos, encontram-se a análise do perfil eletroforético de isoenzimas envolvidas

19

em vias metabólicas essenciais (MLEE, “Multilocus Enzyme Electrophoresis”), a

eletroforese em gel em campo pulsado (PFGE, “Pulsed-Field Gel

Electrophoresis”), variantes da técnica de PCR (Box-PCR, pbpPCR-RFLP) e a

tipagem por sequenciamento dos genes que codificam isoenzimas envolvidas em

vias metabólicas essenciais (MLST, “Multilocus Sequence Typing”) (McDougal et

al., 1992; Hall et al., 1996; van Belkum et al., 1996; Moissenet et al., 1997; Enright

& Spratt, 1998). Por intermédio destas técnicas moleculares é possível investigar a

relação clonal entre amostras com fenótipo de resistência aos antimicrobianos. A

epidemiologia molecular permite, portanto, o rastreamento da disseminação da

resistência. Em 1997 foi estabelecido o “Pneumococcal Molecular Epidemiology

Network” (PMEN), sob os auspícios da “International Union of Microbiological

Societies”, com o propósito de caracterizar, padronizar, nomear e classificar

clones de pneumococos resistentes aos agentes antimicrobianos. Mediante

protocolos padronizados para PFGE, BOX-PCR e MLST, atualmente são

reconhecidos pelo PMEN 26 clones internacionais que contribuíram para um

aumento global da resistência (McGee et al., 2001; www.pneumo.com). Os 16

primeiros foram denominados como Spain23F-1, Spain6B-2, Spain9V-3,

Tennessee23F-4, Spain14-5, Hungary19A-6, South Africa19A-7, South Africa6B-8,

England14-9, CSR14-10, CSR19A-11, Finland6B-12, South Africa19A-13, Taiwan19F-

14, Taiwan23F-15 e Poland23F-16 (McGee et al., 2001). A disseminação de 5

destes clones (Spain23F-1, Spain6B-2, Spain9V-3, Tennessee23F-4 e Taiwan19F-14)

foi constatada em estudo de âmbito nacional realizado nos EUA com

pneumococos isolados entre 1994 e 2000. Foi também observado que três outros

clones, não relacionados aos 16 primeiros clones internacionais, aumentaram sua

20

prevalência ao longo do tempo (Richter et al., 2002). A vigilância de genótipos de

S. pneumoniae tem também sido empregada para basear estratégias de controle

da emergência e a expansão de clones pertencentes a sorotipos não integrantes

da vacina conjugada 7-valente (Gertz et al., 2003; Beall et al., 2006).

O rastreamento de clones de S. pneumoniae com resistência aos

antimicrobianos no Brasil está ainda em uma fase preliminar, especialmente se

considerada as dimensões do país. É necessário, no entanto, mencionar alguns

estudos que abordaram esta questão.

Amostras de pneumococos isoladas a partir de pacientes com doenças

invasivas em cinco regiões geográficas brasileiras foram analisadas utilizando-se

PFGE. Foi observada a disseminação de amostras resistentes distribuídas em

quatro grupos clonais predominantes, distintos dos clones internacionais

(Brandileone et al., 1998). É importante ressaltar que, no referido estudo, duas

amostras pertencentes ao sorotipo 14 foram identificadas como variantes do clone

internacional Spain9V-3, sendo que este clone é freqüente entre amostras de

pneumococos resistentes isoladas no Uruguai (Camou, Hortal & Tomasz, 1998) e

Argentina (Rossi et al., 1998). É interessante constatar que representantes do

clone Spain9V-3 têm circulado no Uruguai na forma de uma variante que apresenta

o sorotipo 14, devido a ocorrência de eventos de recombinação em uma extensa

região do genoma que se estende do início do gene cps até o gene pbp1a (Coffey

et al., 1999). Amostras pertencentes a este clone e exibindo resistência à

cefotaxima foram encontradas no Brasil, Argentina, Chile e Uruguai (Castanheira

21

et al., 2003). A diversidade genética de amostras do sorotipo 14 foi também

investigada em outro estudo realizado no Brasil, em que foram obtidas evidências

de que a resistência à penicilina entre amostras deste sorotipo está relacionada

com poucos clones, de acordo com análise de perfis de PFGE (Teixeira et al.,

1999). Em outra investigação com pneumococos isolados de pacientes com

meningite em Salvador, Bahia, foi verificado um predomínio do sorotipo 14 entre

as amostras resistentes à penicilina (CIMs entre 0,12 a 1,0 µg/ml), apresentando

perfis de BOX-PCR bastante relacionados, sem que tenha sido possível relacioná-

las com amostras pertencentes a clones internacionais (Ko et al., 2000).

A circulação de representantes dos clones internacionais Spain23F-1 e

Spain6B-2, com resistência à penicilina, foi constatada entre amostras de crianças

procedentes de Fortaleza, CE (Wolf et al., 2000).

Identificação

O gênero Streptococcus é constituído por cocos gram-positivos, catalase

negativos, anaeróbios facultativos (Ruoff, Whiley & Beighton, 1999). O gênero tem

passado por sucessivas modificações taxonômicas, como resultado de aplicação

de técnicas moleculares, tais como reassociação DNA-DNA, seqüenciamento de

genes do rRNA 16S (Facklam, 2002). Tais alterações abrangem até mesmo os

grupos de espécies anteriormente consideradas como de fácil reconhecimento,

tais como S. pneumoniae. Um exemplo é constituído pela descrição recente de

Streptococcus pseudopneumoniae sp. nov., uma nova espécie relacionada com S.

pneumoniae, e da qual é difícil de distinguir (Arbique et al., 2004).

22

A morfologia celular e a colonial representam o primeiro passo para a

identificação de pneumococos nos laboratórios clínicos. Tipicamente, estes

microrganismos apresentam-se como células ovaladas, dispostas em pares ou

cadeias curtas formando colônias que podem ser mucóides, alfa hemolíticas, com

tendência a apresentarem um achatamento central (Ruoff, Whiley & Breighton,

1999).

Os pneumococos são suscetíveis ao cloridratro de etil-hidrocupreína

(optoquina), uma característica que permite diferenciá-los dos outros

estreptococos integrantes do grupo viridans. O teste de suscetibilidade à

optoquina, adaptado ao formato de difusão em ágar, é amplamente utilizado em

laboratórios clínicos. A base de ágar empregada parece influenciar no resultado

do teste, sendo recomendado o ágar Soja Tripticaseína (Gardam & Miller, 1998).

Contudo, a resistência à optoquina já foi descrita entre pneumococos o que pode

levar a problemas na identificação destes microrganismos quando este teste

laboratorial é usado exclusivamente (Borek et al., 1997; Cogné et al., 2000; Tsai et

al., 2000; Pikis et al., 2001). A optoquina inibe especificamente a F0F1H+-ATPase

associada à membrana de S. pneumoniae. Mutantes da espécie S. pneumoniae

com o fenótipo de resitência a optoquina (OptR) apresentam mutações pontuais no

gene atpC, que codifica para a subunidade transmembrana c do complexo F0

(Muñoz, Garcia & de la Campa, 1996). O gene responsável pela característica de

resistência-suscetibilidade à optoquina foi clonado, seqüenciado e caracterizado

por um grupo de investigadores na Espanha (Fenoll et al., 1994; 1995). Mais

23

recentemente, foram também descritas mutações pontuais no gene que codifica a

subunidade a do complexo F0F1H+-ATPase, levando à resistência à optoquina

(Pikis et al., 2001).

A bile solubilidade é outra característica que permite diferenciar S.

pneumoniae de outras espécies do grupo viridans. O teste laboratorial que explora

esta característica pode ser realizado em tubo ou diretamente sobre colônias

cultivadas em ágar sangue (Ruoff, Whiley & Breighton, 1999). Variantes em que

esta característica não é observada já foram detectadas, havendo associação

entre cepas bile-insolúveis e peculiaridades moleculares no gene lytA (Obregón et

al., 2002). Estudo comparativo entre diferentes métodos para identificação de S.

pneumoniae revelou que o teste de bile-solubilidade não é 100% sensível e

específico (Chandler et al., 2000). Em outro estudo, contudo, o teste da bile

solubilidade foi mais específico do que o da optoquina para a identificação de S.

pneumoniae (Messmer et al., 2004).

Testes baseados em biologia molecular vêm ocupando um maior espaço na

identificação de S. pneumoniae. Uma sonda de DNA, dirigida para a subunidade

16S do rRNA, é empregada para distinção entre amostras de pneumococos e os

demais integrantes do grupo “viridans”. Este produto encontra-se comercialmente

disponível (Accuprobe Streptococcus pneumoniae Culture Identification Test; Gen-

Probe, Inc.) e apresentou 100% de sensibilidade e especificidade na diferenciação

de 172 amostras de pneumococos e 204 amostras de outros microrganismos

(Denys & Carey, 1992). Alguns investigadores utilizam esta sonda de DNA como

24

método de referência em estudos que avaliam métodos fenotípicos de

diferenciação entre S. pneumoniae e integrantes do grupo viridans (Chandler et

al., 2000; Kaijalainem et al., 2002). A sonda de DNA revelou-se ainda

discriminatória na confirmação de variantes atípicas de S. pneumoniae

(resistentes à optoquina e/ou não encapsuladas) (Whatmore et al., 2000).

Contudo, outras espécies de estreptococos orais, tais como Streptococcus oralis

e, especialmente, Streptococcus mitis apresentam relacionamento filogenético

muito próximo com S. pneumoniae (Facklam, 2002), sendo que amostras

pertencentes a estas espécies vêm sendo encontradas em materiais clinicamente

significativos (Whatmore et al., 2000).

Além da sonda de DNA acima mencionada, genes associados a fatores de

virulência também vêm sendo objeto de investigação por intermédio da técnica de

reações de polimerase em cadeia (“Polymerase Chain Reaction”, PCR). Dentre

este genes, destacam-se os da pneumolisina (ply), da autolisina (lytA) e da

adesina de superfície pneumocócica A (psaA). A presença do gene psaA foi

demonstrada por PCR em amostras de 90 diferentes sorotipos do microrganismo,

enquanto que não foi verificada amplificação em 30 espécies e 14 gêneros

heterólogos, indicando um bom potencial diagnóstico para este teste (Morrison et

al., 2000). A presença deste gene, contudo, foi recentemente verificada em

espécies heterólogas (S. mitis, S. oralis e S. anginosus) o que pode comprometer

o potencial uso deste teste na identificação e diagnóstico de doenças

pneumocócicas (Jado et al., 2001). Os genes ply e lytA foram também

encontrados em um grupo de estreptococcos orais atípicos, fenotipicamente e

25

geneticamente associados a S. mitis, isolados de infecções respiratórias

clinicamente relevantes (Whatmore et al., 2000). É, portanto, possível especular

se a presença destes genes pode aumentar o potencial patogêncio destes

microrganismos. Por outro lado, foi demonstrado que amostras de S. pneumoniae

de origem bovina, com potencial patogênico restrito, quando comparado ao que

ocorre com aquelas obtidas de seres humanos, podem não conter os genes ply e

lytA (Whatmore et al., 2000).

Os testes moleculares baseados na detecção de genes de virulência para

identificação de S. pneumoniae são promissores, mas a sua relevância exata

ainda encontra-se por ser definida. Em estudo comparativo que incluiu amostras

típicas e atípicas de S. pneumoniae, bem como amostras de estreptococos do

grupo “viridans”, a acurácia da técnica de PCR para a detecção do gene lytA foi

superior (100%) à observada para as técnicas de PCR para detecção dos genes

psaA e a duas diferentes seqüências iniciadoras para o gene ply (Messmer et al.,

2004). Por outro lado, a técnica de PCR específica para o gene psaA foi

considerada mais adequada para identificar S. pneumoniae (incluindo amostras

resistentes à optoquina) em outro estudo envolvendo quatro técnicas genotípicas

(amplificação dos genes psaA, ply, e lytA e a sonda de DNA) (Verhelst et al.,

2003).

26

Objetivos

Dando continuidade aos estudos realizados em nosso laboratório sobre a

diversidade fenotípica e genética de amostras de S. pneumoniae isoladas no

Brasil, este trabalho teve como objetivo geral o estudo de amostras isoladas em

Porto Alegre, RS, num período de 10 anos, sobretudo em relação a:

1) Determinação dos perfis de susceptibilidade aos antimicrobianos e

avaliação da evolução da resistência no período de estudo.

2) Distribuição dos sorotipos prevalentes.

3) Avaliação da diversidade clonal entre amostras com fenótipos de

resistência mais relevantes.

4) Caracterização de amostras atípicas apresentando resistência à optquina.

5) Validação da técnica de PCR multiplex seqüencial para determinação dos

tipos capsulares e otimização para uso entre amostras isoladas em países

da América Latina.

27

Materiais e Métodos

1. Amostras Bacterianas

Foram estudadas 829 amostras de Streptococcus pneumoniae isoladas a

partir de diversos materiais clínicos coletados de pacientes atendidos em hospitais

localizados na cidade de Porto Alegre, no estado do Rio Grande do Sul, num

período de dez anos (1995 a 2004). Tais amostras foram incorporadas à Coleção

de Amostras do Laboratório de Apoio Biotecnológico do Departamento de

Microbiologia Médica do Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes da UFRJ.

A amostra de Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 foi utilizada como controle

para os testes de susceptibilidade a antimicrobianos. Amostras representativas

dos principais clones internacionais de S. pneumoniae resistentes a

antimicrobianos (McGee et al., 2001), assim como amostras isoladas em outras

localidades do Brasil, foram incluidas em experimentos de PFGE, para fins

comparativos e estão referidas onde apropriado.

A preservação das amostras foi feita sob a forma de suspensões bacterianas

espessas, em solução contendo 10% de leite em pó desnatado (Skim Milk; Difco

Laboratories, Detroit, Michigan, EUA) e 10% de glicerol (Reagen, Rio de Janeiro,

RJ), as quais foram mantidas em tanques contendo nitrogênio líquido a –

180ºC. As amostras foram recuperadas pela remoção de alíquotas destas

suspensões que foram semeadas em placas contendo o meio TSA (“Trypitic Soy

Ágar”, Difco), acrescido de 5% de sangue desfibrinado de carneiro (TSA-SC) e

incubadas a 35oC, durante 18 a 24 h, em atmosfera de CO2.

28

2. Caracterização Fenotípica das Amostras

As características morfológicas celulares e coloniais, determinação do tipo

de hemólise, suscetibilidade à optoquina e bile solubilidade serviram de base para

a identificação presuntiva.

2.1. Morfologia colonial e hemólise

Para a verificação da morfologia colonial, as amostras foram semeadas, pela

técnica de esgotamento, em placas contendo o meio TSA-SC e incubadas a 35ºC

durante 24h, em atmosfera de CO2.

2.2. Morfologia celular

Para observação da morfologia celular, as amostras foram cultivadas em

placas contendo TSA-SC ou em 2,5 ml de caldo BHI (“Brain Heart Infusion,”

Difco), acrescido de 3 gotas de sangue desfibrinado de carneiro (BHI-SC). A partir

da cultura obtida foram feitos esfregaços, os quais foram corados pelo método de

Gram.

2.3. Identificação fisiológica

A caracterização fisiológica convencional das amostras foi baseada nos

resultados de testes de susceptibilidade à optoquina e da bile solubilidade.

2.3.1. Susceptibilidade à optoquina

29

Para a execução dos testes de susceptibilidade à optoquina, discos de 6

mm contendo 5 µg de cloridrato de etil-hidrocupreína (BBL Microbiology Systems,

Cockeysville, Maryland, EUA) foram aplicados sobre a superfície do meio TSA-SC

previamente inoculado com a amostra a ser testada. As placas foram incubadas

durante 24h a 35ºC em atmosfera de CO2. Amostras que apresentaram halos de

inibição >14 mm foram presuntivamente consideradas como S. pneumoniae

(Ruoff, Whiley & Beighton, 1999).

2.3.2. Bile solubilidade

Alíquotas contendo 0,5 ml de uma suspensão em NaCl a 0,9%,

correspondendo a escala 0,5 de McFarland, de cada amostra a ser testada, foram

distribuídas em dois tubos de ensaio (13x100mm). A um dos tubos foi adicionado

um volume de 0,5 ml de uma solução de desoxicolato de sódio a 2% (Sigma

Chemical Corporation, St. Louis, Missouri, EUA), enquanto que ao segundo tubo

foi adicionado igual volume de solução de NaCl a 0,9%. Após incubação a 37ºC,

por duas horas, foi feita a leitura. O clareamento da suspensão presente no tubo

contendo desoxicolato de sódio foi considerado como indicativo de solubilidade na

presença de bile.

3. Tipagem Sorológica

A tipagem sorológica foi efetuada por intermédio das técnicas de aglutinação

pelo látex e de reação de Quellung, utilizando-se anti-soros específicos fornecidos

pelo “Centers for Disease Control and Prevention”, Atlanta, GA, EUA, conforme as

instruções de Facklam & Washington II (1991). O sistema de nomenclatura

30

utilizado para a denominação dos sorotipos foi o dinamarquês. Para tal, as

amostras foram semeadas em TSA-SC e incubadas a 350C, durante 18 a 24 horas

em atmosfera contendo CO2 a 5%. A partir do crescimento obtido, foram

preparadas suspensões densas em 300 a 500µl de salina tampão fosfato (PBS)

0,01M, pH 7,2. Inicialmente, foram colocados, em lâmina de vidro, 10µl da

suspensão a ser testada e 10µl do reagente contendo anticorpos específicos

adsorvidos a partículas de látex. Após homogeneização dos reagentes, a lâmina

foi mantida em movimentos rotatórios manuais, observando-se a ocorrência ou

não de aglutinação. Para as reações de Quellung, 10µl da suspensão bacteriana

foram depositados sobre uma lâmina de vidro, acrescidos de 5 µl de azul de

metileno a 0,3% e 5 µl de anti-soro específico. Após a homogeneização, a

preparação foi coberta com uma lamínula e observada ao microscópio ótico, com

auxílio de objetiva de imersão. Cada amostra foi testada, inicialmente, frente a um

conjunto de “pools” de anti-soros e, posteriormente, com os respectivos anti-soros

individuais de tipo e, quando aplicável, com os anti-soros para os diferentes

fatores.

4. Detecção de Genes Associados a Fatores de Virulência de S. pneumoniae

Amostras apresentando comportamento atípico em relação ao teste da

optoquina foram avaliadas em relação à presença de genes de virulência ply, lytA

e psaA, através da técnica de PCR.

4.1. Preparo das amostras, incluindo extração de DNA

31

As amostras foram semeadas em TSA-SC e incubadas por 24 horas, a

370C em atmosfera contendo CO2 a 5%. A partir de cada cultura foi preparada

uma suspensão em 300µl de salina a 0,85% esterilizada. A suspensão foi

centrifugada a 3000 rpm por 5 minutos, sendo o sobrenadante desprezado e o

sedimento, contendo as células, utilizado para extração do DNA.

O procedimento de extração foi baseado naquele proposto por Beall et al.

(1998) com modificações. Em resumo, o sedimento foi ressuspenso em 50µl de

tampão TE [Tris 10 mM (pH 8,0) e EDTA 1 mM ] contendo 9U de mutanolisina, e

as amostras foram incubadas por 10 minutos a 37oC. A seguir, foram aquecidas à

100oC por 3 minutos e centrifugadas a 3000 rpm por 30 segundos.

4.2. Detecção do gene que codifica a pneumolisina (gene ply)

A pesquisa do gene ply foi realizada através de PCR, de acordo com o

procedimento descrito por Toikka et al. (1999), utilizando-se os iniciadores Ia (ATT

TCT GTA ACA GCT ACC AAC GA) e Ib (GAA TTC CCT GTC TTT TCA AAG TC).

A mistura da reação, num total de 30 µl, foi constituída de 100 ng de cada

um dos iniciadores, 2,0 µl dos deoxiribonucleotídeos trifosfatados (10mM), 10 µl

de MgCl2 (10mM), 0,5 µl da Taq polimerase (5U/µl) e 10 µl do respectivo tampão

(10x). Um volume de 1µl de DNA molde foi adicionado à reação. A reação de

amplificação foi executada em um termociclador (GeneAmp PCR System 2400,

Perkin Elmer, Branchburg, New Jersey, EUA), obedecendo a seguinte

programação: desnaturação inicial (94ºC, por 5 minutos); 30 ciclos de

desnaturação (94ºC, 1 minuto), anelamento (55ºC, 1 minuto) e extensão (72ºC, 1

minuto); seguindo-se uma extensão final (72ºC, 10 minutos).

32

4.3. Detecção do gene que codifica a autolisina (gene lytA)

A presença do gene lytA foi avaliada por PCR, de acordo com ensaio

previamente publicado por Cherian et al. (1998), com a utilização das seqüências

iniciadoras relacionadas a seguir: Lyt A1 (GTC GGC GTG CAA CCA TAT AGG

CAA) e Lyt A2 (GGA TAA GGG TCA ACG TGG TCT GAG).

A mistura de reação, em um volume total de 30 µl, foi constituída de 0,5 mM

de cada seqüência iniciadora, 0,2 mM de cada deoxinucleotídeo trifosfatado,

tampão de PCR 1X, MgCl2 a 2,5 mM e 2,5U de Taq polimerase. Um volume de 1µl

de DNA molde foi adicionado à reação. A amplificada foi realizada em

termociclador (GeneAmp PCR System 2400), utilizando-se 30 ciclos de 94oC,

55oC e 72oC por 1 min em cada temperatura, para as etapas de desnaturação,

anelamento e extensão, respectivamente.

4.4. Detecção do gene que codifica o antígeno A de superfície (gene psaA)

Para a pesquisa do gene psaA foi empregado o procedimento descrito por

Morrison et al. (2000). As seqüências iniciadoras utilizadas foram: P1 (CTT TCT

GCA ATC ATT CTT G) e P2 (GCC TTC TTT ACC TTG TTC TGC).

A mistura de PCR (100 µl) continha 100ng de cada seqüência iniciadora (P1

e P2), 2,0 µl de desoxinucleotídeo trifosfatado a 10mM, 10 µl de MgCl2 a 10mM,

0,5µl de Taq polimerase e 10µl de tampão (10x). Foi acrescentado 1µl de DNA

molde à reação. A mistura foi submetida à amplificação, utilizando as seguintes

condições: 35 ciclos (95oC por 30 segundos, 52oC por 30 segundos e 72oC por 2

33

minutos para desnaturação, anelamento e extensão, respectivamente), com uma

extensão final de 72oC por 8 min.

4.5. Detecção dos produtos de amplificação

Os produtos de PCR para os genes associados à virulência foram

observados após eletroforese em gel de agarose (GibcoBRL) a 1,2%, em tampão

TBE (Tris-Borato-EDTA) 0,5X, tendo os géis sido corados com brometo de etídio.

A visualização foi feita em transiluminador UV. Os tamanhos dos produtos de

amplificação esperados para os genes ply, lytA e psaA foram de, respectivamente,

348 pb, 413 pb e 838 pb.

5. Testes de Hibridização com Sonda de DNA para a Subunidade 16S do

rRNA de S. pneumoniae

Amostras atípicas, resistentes à opptoquina, foram submetidas a testes de

hibridização com uma sonda de DNA para a subunidade 16S do rRNA de S.

pneumoniae. Para tal, culturas obtidas em TSA-SC foram testadas com a sonda

“Accuprobe S. pneumoniae Culture Identification Test” (Gen-Probe Inc.; San

Diego, California, EUA), seguindo-se as recomendações do fabricante, os

resultados foram determinados usando-se um luminômetro modelo 2900 (Gen-

Probe, Inc.). Leituras ≤ 1199 PLU (phometric light units) foram consideradas

negativas enquanto que amostras com leituras ≥1500 PLU foram consideradas

positivas. Leituras entre 1200 e 1499 PLU foram consideradas indeterminadas.

6. Testes de Suscetibilidade aos Antimicrobianos

34

6.1.1. Testes de difusão em agar

Foram empregados discos de papel de filtro (Cecon, São Paulo, SP, Brasil)

impregnados com os seguintes antimicrobianos: cloranfenicol, eritromicina,

oxacilina (para avaliar a susceptibilidade à penicilina), tetraciclina e vancomicina.

Os testes foram realizados conforme as recomendações do “Clinical and

Laboratory Standards Institute" (CLSI, 2005). Para tal, as amostras foram

semeadas em placas de TSA-SC e incubadas a 370C, por 18-24 horas em

atmosfera de CO2. A partir do crescimento obtido, suspensões com turvação

equivalente a escala 0,5 de McFarland foram preparadas em solução salina 0,85%

esterilizada. Com auxílio de “swabs” esterilizados, as suspensões foram

semeadas em placas contendo àgar Mueller-Hinton (Difco) acrescido de 5% de

sangue desfibrinado de carneiro (MH-SC), de maneira a obter um crescimento

confluente e uniforme. Sobre a superfície dos meios inoculados foram aplicados

os discos contendo os antimicrobianos e as placas foram incubadas a 370C, por

18-24 horas em atmosfera de CO2. A leitura e interpretação dos resultados foram

feitas de acordo com as recomendações do CLSI (2005).

6.2. Testes para a determinação das Concentrações Inibitórias Mínimas

(CIMs)

Após a realização dos testes de difusão em agar, as amostras que

apresentavam resistência aos antimicrobianos foram submetidas a testes de

diluição em agar. O procedimento básico foi o recomendado pelo CLSI (2005),

tendo sido acrescentado 5% de sangue de sangue desfibrinado de carneiro para

possibilitar o crescimento de S. pneumoniae. Para o preparo das soluções de

35

antimicrobianos (obtidos da Sigma) foram empregados os solventes e diluentes

preconizados pelo CLSI (2005). Em resumo, para o preparo de cada placa, 17 ml

do meio (ágar Mueller Hinton) foram acrescidos de 2,0 ml de uma determinada

concentração de antimicrobiano e de 1,0 ml de sangue desfibrinado de carneiro.

Foram preparadas placas contendo concentrações duplas seriadas dos seguintes

antimicrobianos: ceftriaxona (0,12 µg/ml a 4,0 µg/ml), cloranfenicol (1,0 µg/ml a 32

µg/ml), eritromicina (0,25 µg/ml a 32,0 µg/ml), penicilina (0,03 µg/ml a 8,0 µg/ml),

tetraciclina (0,5 µg/ml a 16 µg/ml) e vancomicina (0,12 a 0,5 µg/ml). Placas

contendo meio sem antimicrobianos foram utilizadas para controle.

As placas contendo as diferentes concentrações dos antimicrobianos foram

semeadas com auxílio de um replicador do tipo Steers. O inóculo final, depositado

sobre a superfície das placas contendo meio de ágar Mueller Hinton suplementado

com 5% de sangue de carneiro (MH-SC), foi de aproximadamente 104 UFC/ml. As

placas foram incubadas por 24 h, a 35oC, em atmosfera de CO2. Os resultados

foram interpretados segundo o CLSI (2005).

6.2. Teste para determinação de fenótipos de resistência à eritromicina

As amostras identificadas como resistentes à eritromicina foram

caracterizadas quanto ao seu fenótipo de resistência, através de testes de duplo-

disco, utilizando-se discos contendo 15 µg de eritromicina e 2 µg de clindamicina,

dispostos com uma distância de 15-20 mm entre si, sobre uma placa contendo

agar MH-SC, semeado com uma suspensão da amostra bacteriana a ser testada,

correspondente à escala 0,5 de McFarland, (Sepalla et al., 1993; Trallero et al.,

36

1998). O fenótipo MLSb foi considerado quando da constatação de resistência aos

antimicrobianos testados, podendo ser de caráter constitutivo (caracterizado por

halos de inibição ao redor dos dois discos utilizados) ou indutivo (caracterizado por

halo de inibição ao redor do disco de eritromicina e um halo de sensibilidade ao

redor do disco de clindamicina, apresentando uma redução no seu diâmetro na

proximidade do disco de eritromicina). O fénotipo M foi considerado quando da

observação de resistência apenas à eritromicina.

7. Detecção e Caracterização de Genes Associados à Resistência aos

Antimicrobianos

7.1. Detecção de genes de resistência à eritromicina

As amostras que apresentaram resistência à eritromicina foram submetidas

a técnica da PCR, para detecção dos genes erm(B) e mef(A/E). Para a obtenção

do DNA das amostras foi empregada a metodologia descrita no item 4.1.

Os sobrenadantes contendo o DNA das amostras foram submetidos a

reações de amplificação, em misturas de componentes num volume final de 50µl

para cada uma das reações. A mistura das reações continham 200µM de cada

deoxinucleotídeo trifosfatado, 1,4µM dos iniciadores, 0,5 U de Taq polimerase,

10mM de Tris-HCl (pH 8,3), 1µl de DNA molde e 2mM (para detecção do gene

ermB) ou 4mM (para detecção do gene mef(A/E) de cloreto de magnésio. As

amplificações foram realizadas em termociclador (GeneAmp PCR System 2400)

em um ciclo de 3 min, a 93ºC para desnaturação, seguidos de 35 ciclos a 93ºC por

1min, 1min a 52ºC para anelamento dos iniciadores e 1 min a 72ºC para extensão.

37

Para extensão final foi utilizado um ciclo de 5 min a 72oC. Os amplicons obtidos

foram submetidos à eletroforese em gel de agarose a 1%, conforme em 4.5. Os

tamanhos dos produtos previstos para erm(B) e mef(A/E), foram de 640 pb e 348

pb, respectivamente. Foram utilizados os seguintes pares de iniciadores (Sutcliffe

et al., 1996): GAAAAGGTACTCAACCAAATA e

AGTAACGGTACTTAAATTGTTTAC [para detecção de erm(B)];

AGTATCATTAATCACTAGTGC e TTCTTCTGGTACTAAAAGTGG [para detecção

de mef(A/E)].

7.2. Caracterização do gene atpC, associado ao fenótipo de resistência à

optoquina

As amostras que apresentaram resistência à optoquina foram submetidas a

procedimento de seqüenciamento do gene atpC, determinante genético desta

característica.

7.2.1. Amplificação do gene atpC

O gene atpC foi amplificado, utilizando-se os iniciadores 663 (TCG AAA

AGT GGA TCA ACA ACT ATC C) e 1016 (TGG GAA AGA AGA AGT AAC AAA

CTC G), com base nas recomendações de Fenoll et al. (1994).

A extração de DNA foi realizada conforme descrito no item 4.1. As misturas

para as reações de amplificação, num volume final de 100µl, foram compostas de:

5U de DNA polimerase Pfu (Stratagene), tampão de reação 1x, 20 µM de cada um

dos quatro dNTPs e 250 ng de cada iniciador. A amplificação foi realizada em

termociclador (GeneAmp PCR System 2400), empregando-se um período de

38

desnaturação inicial de 2 min (95ºC), seguido de 30 ciclos de 95ºC, 1min; 58ºC, 1

min; 72ºC, 2 min e uma extensão final de 10 min a 72ºC.

7.2.2. Seqüenciamento do gene atpC

Após as reações de amplificação para o gene atpC, os amplicons (6,0 µl)

foram purificados mediante tratamento com as enzimas SAP (1,0 µl) e EXO I (0,5

µl) (Amersham Pharmacia Biotech) durante 30 min a 37ºC e 15 min a 80ºC. A

seguir, as amostras foram submetidas às reações de seqüenciamento

acrescentando-se 12,5 µl do MIX (4µl de Big Dye Terminator, 1 µl do iniciador e

7,5 µl de água purificada) às misturas contidas em tubos, preparadas na etapa

anterior. Foram realizados 30 ciclos da reação de seqüenciamento (96ºC, 30 s;

50ºC, 15 s e 60ºC, 4 min). Após a reação de seqüenciamento, foi realizado

procedimento de purificação acrescentando-se 80 µl de isopropanolol a 20 µl da

reação de seqüenciamento, seguindo-se um período de incubação de 15 min à

temperatura ambiente. A seguir, foi realizada centrifugação por 20 min a 14.000

rpm, obtendo-se um sedimento que foi tratado com 250 µl de etanol 70%. Após 5

min de centrifugação a 1400 rpm, o sobrenadante foi desprezado e o sedimento

submetido a processo de secagem por 3 min a 95ºC. A cada tubo contendo o

sedimento, foram adicionados 5 µl de formamida e 1 µl do “Loading Buffer”

(Applied Biosystems). Os tubos contendo as misturas foram, então, submetidos a

agitação em vortex e incubados por 3 minutos a 95ºC. Após esta etapa, foi

procedida a eletroforese em gel de poliacrilamida.

39

8. Análise do Polimorfismo dos Perfis de Fragmentação do DNA

Cromossômico através de Eletroforese em Campo Pulsado (PFGE)

A diversidade genética entre amostras resistentes a penicilina e/ou

resistentes à eritromicina, pertencentes a sorotipos selecionados, foi analisada

através da técnica de PFGE. Tal procedimento também foi aplicado às amostras

com resistência à optoquina. Para estudos comparativos, amostras padrão

pertencentes aos clones aprovados pelo PMEN (McGee et al., 2001;

www.sph.emory.edu/PMEN) foram utilizadas. A metodologia utilizada foi baseada

naquela descrita por Teixeira et al. (1997b).

Na etapa de extração, cada amostra foi cultivada em placa contendo TSA-

SC, e incubada a 35ºC durante 18 a 24h em atmosfera de CO2. As células foram

suspensas em 0,6 ml de tampão PIV [NaCl 1 M, Tris HCl 10 mM (pH 7,6)] até a

obtenção de uma suspensão equivalente a da escala 8 de McFarland. A

suspensão celular foi misturada a um volume igual de agarose de baixo ponto de

fusão [NuSieve GTG Agarose; BioWhittaker Molecular Applications (BMA),

Cambrex Corporation, Rockland, Maine, EUA] a 2%, em tampão PIV e distribuída

em moldes para a obtenção de blocos, que foram então resfriados a 4ºC.

Para a lise celular, os blocos foram colocados em 4 ml de solução EC [Tris-

HCl 6 mM (pH 7,6), NaCl 1,0 M, EDTA 100 mM (pH 7,5), 0,5% (p/v) de Brij 58,

desoxicolato de Na a 0,2%, lauril sarcosinato de sódio a 0,5%, 1,0 mg de lisozima

por ml, 5 U de mutanolisina por ml] e incubados durante 18 a 24h a 37ºC, sob

agitação suave. Esta solução foi então substituída por 4 ml de solução ESP [EDTA

0,5 M (pH 8,0), 1% (p/v) de lauril sarcosinato de sódio, 0,1 mg de proteinase K por

ml] e a seguir incubada durante 24h a 50ºC. Antes do tratamento com a enzima de

40

restrição, os blocos foram lavados com tampão TE [Tris-HCL 10 mM (pH 7,6),

EDTA 0,1 mM] por 4 vezes (sendo as duas primeiras vezes durante 1 hora cada e

as duas últimas, 2 h cada) a 37ºC. Os blocos foram então tratados com o tampão

específico da enzima de restrição, durante 1h a 25ºC. A seguir, foi realizado o

tratamento com a enzima de restrição SmaI (Roche Diagnostics Corporation,

Indianapolis, Indiana, EUA), preparada em seu respectivo tampão, durante 24h a

25ºC. Os blocos de agarose foram então fundidos a 72ºC e aplicados em

reservatórios do gel de corrida preparado com agarose a 1,2% (SeaKem GTG

Agarose; BMA) em tampão TBE 0,5X (Tris 0,89 M, EDTA 0,025 M e ácido bórico

0,89 M).

Os fragmentos de restrição foram separados por eletroforese em campo

pulsado empregando-se o equipamento CHEF DR III (Bio-Rad), seguindo os

seguintes parâmetros: tempo de corrida 20h, temperatura 11ºC, gradiente de

voltagem 6 V/cm, pulso inicial de 1s e pulso final de 30s. Os géis foram corados

com brometo de etídio e fotografados sob luz UV. Padrões de peso molecular

(Pulse Marker, 50-1000 Kb; Sigma) foram utilizados para estimar o tamanho dos

fragmentos de DNA. Os perfis eletroforéticos obtidos foram interpretados segundo

critérios previamente publicados (Tenover et al., 1995) e posteriormente

analisados por um sistema computadorizado de análise de imagens (“Image

Analysis System” através do programa “Molecular Analyst Fingerprinting Plus”,

versão 1.6, Bio-Rad), empregando o método UPGMA (Unweighted Pair Group

Method using Arithmetic Averages) para o cálculo dos coeficientes de similaridade.

9. “Multilocus Sequence Typing” (MLST)

41

A técnica de MLST foi utilizada para a caracterização de um conjunto

selecionado de amostras de S. pneumoniae do sorotipo 14. Os aspectos gerais da

técnica, incluindo extração de DNA, condições de amplificação do DNA e análise

comparativa de seqüências, foram realizados de acordo com as recomendações

de Enright & Spratt (1998) e do PMEN (www.sph.emory.edu/PMEN).

Os fragmentos internos dos genes aroE, gdh, gki, recP, spi, xpt e ddl, os

quais codificam para as enzimas shiquimato desidrogenase, glicose-6-fosfato

desidrogenase, glicose quinase, transcetolase, sinal peptidase I, xantina

fosforibosiltransferase e D-alanina-D-alanina ligase, respectivamente, foram

amplificados por PCR utilizando os pares de iniciadores propostos por Enright &

Spratt (1998). Os fragmentos amplificados foram seqüenciados utilizando-se os

mesmos iniciadores usados para a amplificação inicial. As seqüências idênticas

foram alinhadas em uma mesma denominação alélica, enquanto que as

seqüências que diferiram em algum alelo conhecido receberam uma nova

denominação. A comparação das seqüências, determinação dos perfis alélicos e

obtenção do dendrograma foram realizados segundo as recomendações do banco

de dados de MLST (www.mlst.net). Os alelos de cada um dos sete loci gênicos

permitiram definir um perfil alélico para cada amostra e sua respectiva seqüência

tipo (ST).

10. PCR Multiplex Seqüencial para a Determinação de Tipos Capsulares

10.1. Seqüências iniciadoras

Um conjunto de 29 pares de seqüências iniciadoras previamente descrito

para detectar os sorotipos ou sorogrupos (1, 3, 4, 5, 6A/B, 7F, 7C, 8, 9V, 10A,

42

11A, 12F, 14, 15A, 15B/C, 16F, 17F, 18, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 31, 33, 34, 35B,

35F e 38), bem como seqüências iniciadoras para o gene cpsA, foram utilizados,

conforme as recomendações de Pai, Gertz & Beall (2006). Todas as seqüências

iniciadoras, com seus respectivos números de acesso ao GenBank e o tamanho

do produto formado encontram-se na referência original (Pai, Gertz & Beall, 2006).

Durante a execução deste trabalho, foi detectada a necessidade de modificações

do esquema de tipagem por PCR seqüencial. Estas incluíram a adição de novas

seqüências iniciadoras para o sorotipo 14, com a intenção de evitar reações com

amostras dos sorotipos 15B e 15C. O novo par de seqüências iniciadoras para o

sorotipo 14 (número de acesso ao GenBank CR931662.1) foi o seguinte: 14-F2

(GAA ATG TTA CTT GGC GCA GGT GTC AGA ATT) e 14-R2 (GCC AAT ACT

TCT TAG TCT CTC AGA TGA AT). O produto de amplificação esperado é de 189

pb.

Considerando que o sorotipo 9N tem uma frequência significativa na

América Latina, seqüências iniciadoras para este sorotipo foram incluídas no

esquema de tipagem. As seqüências iniciadoras para o sorotipo 9N (número de

acesso ao GenBank CR931647), as quais também amplificam o sorotipo 9L (de

ocorrência rara), foram as seguintes: 9N/L-F (GAA CTG AAT AAG TCA GAT TTA

ATC AGC) e 9N/L-R (ACC AAG ATC TGA CGG GCT AAT CAA T). O produto de

amplificação esperado é de 516 pb.

As concentrações das seqüências iniciadoras para os sorotipos 14 e 9N/L

foram 1,0 e 0,5 µM, respectivamente.

43

10.2. Esquema da técnica de PCR multiplex

Para o estudo inicial de validação, as seqüências iniciadoras,

correspondendo a 28 sorotipos/sorogrupos, foram agrupadas em sete reações

multiplex, de acordo com o esquema originalmente proposto por Pai, Gertz & Beall

(2006).

Em uma segunda etapa, as seqüências iniciadoras foram agrupadas em um

esquema direcionado aos sorotipos prevalentes em países da América Latina (Di

Fabio et al., 2001; Laval et al., 2006; Brandileone et al., 2003). Nesta etapa,

seqüências iniciadoras correspondentes a 30 sorotipos/sorogrupos foram incluídos

(os sorotipos 5 e 9N foram incluídos nesta fase do estudo) e distribuídos em seis

grupos de PCR multiplex.

Foram incluídos controles para os diferentes sorotipos/sorogrupos

constituídos por amostras de S. pneumoniae pertencentes à coleção do CDC e

um par de seqüências inicadoras para o operon cps (comum a todos os tipos

capsulares conhecidos de pneumococos), como um controle interno positivo.

10.3. Extração de DNA

As amostras foram cultivadas em placas contendo TSA-SC. Suspensões de

células bacterianas foram preparadas em alíquotas de 300 µl de solução salina

estéril (NaCl a 0,85%). As suspensões foram aquecidas a 70ºC por 15 minutos. A

seguir, as amostras foram centrifugadas por dois min e o sobrenadante retirado.

Cada sedimento foi acrescentado de 50 µl de tampão Tris EDTA, 10 µl de solução

44

de mutanolisina (3000U/ml) e 8 µl de hialuronidase (30mg/ml). Após um período

de incubação de 30 min a 37ºC, as suspensões foram aquecidas a 100ºC por 10

min. Os extratos foram armazenados a –20ºC até o uso.

10. 4. PCR

As reações foram realizadas em volumes de 25 µl. Cada reação continha:

tampão 1X [20mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 1M dithiothreitol,

0,5% Tween 20, 0.5% Nonidet P-40 (Promega Inc., Madison, Wisconsin, EUA],

200 µM de cada dinucleotídeo trifosfatado (New England Biolabs, Beverly, MA,

EUA), 2,5 mM de MgCl2, 2,0 U of Taq DNA polimerase (Promega Inc.), e as

seqüências iniciadoras previamente especificadas (Pai, Gertz & Beall, 2006). Para

o par de seqüências iniciadoras usadas para reconhecimento do sorotipo 9N, a

concentração foi de 0,5 µM. Um volume de 2,5 µl do extrato de DNA de cada

amostra foi usado como molde para a amplificação. Alguns ajustes foram

necessários para o procedimento adaptado aos sorotipos mais freqüentes na

América Latina. Para todas as reações do esquema, que passou a ser

denominado de esquema da América Latina, a concentração de MgCl2 foi de 3,5

mM. A amplificação foi realizada em equipamento Perkin-Elmer GeneAmp PCR

system 2700 (Applied Biosystems) nas seguintes condições: 94ºC por 4 minutos,

seguido de 30 ciclos de amplificação de 94ºC por 45s, 54ºC por 45s, e 65ºC por 2

min e 30s.

10.5. Detecção dos produtos de PCR

45

Os produtos de PCR foram, analisados por eletroforese em gel a 2% (para

as reações do esquema original e reações 1, 2, 3, 4 e 6 do esquema da América

Latina) e a 3% (para a reação 5 do esquema da América Latina) (NuSieve

agarose, Cambrex Bio Science, Inc., Rockland, ME) em tampão TAE1X (40

mMTris, 20mM de ácido acético glacial, 1mM de EDTA, pH=8,0) a 120V, por 1hora

e 20 minutos. Os géis foram corados com brometo de etídio (0,5 µg/ml) e os

tamanhos dos produtos de amplificação foram determinados por comparação com

padrão de peso molecular (50-bp Ladder; Novagen, Inc.).

46

Resultados

Resistência aos antimicrobianos, distribuição de sorotipos e diversidade

genética

Este estudo compreendeu a análise comparativa de dados relativos a 829

amostras de pneumococos isoladas em Porto Alegre num período de 10 anos

(1995 a 2004). Os resultados obtidos para um total de 351 amostras isoladas no

período de 2000 a 2004 foram comparados àqueles obtidos para 478 amostras

isoladas no período de 1995 a 1999.

Os espécimes clínicos incluíram: fluídos normalmente estéreis (411

amostras), tais como sangue (255 amostras), líquor (85 amostras), líquido pleural

(58 amostras), líquido de ascite (12 amostras) e secreção de osteomielite (1

amostra); e outros materiais (418 amostras) em que foram incluídos espécimes

como secreções respiratórias (342 amostras, comprendendo amostras de escarro,

aspirado traqueal, lavado brônquico e lavado bronco-alveolar), oculares (33

amostras), auriculares (9 amostras) e outras secreções (34 amostras).

A resistência à penicilina foi o marcador de resistência mais freqüente entre

as encontradas no presente estudo, sendo detectado em 25,1% das amostras,

seguido de resistência à tetraciclina (10,1%), eritromicina (4,0%), cloranfenicol

(1,3%) e ceftriaxona (0,8% em casos de infecções outras que não meningite e

6,2% em casos de meningite). Não foi observada resistência à vancomicina. A

47

maioria (17,7%) das amostras não suscetíveis à penicilina foi incluída na categoria

de resistência intermediária (CIM ≥0,12 µg/ml e ≤1,0 µg/ml), enquanto que 7,36%

apresentaram resistência plena (CIM ≥2,0µg/ml). Quando a prevalência de

resistência à penicilina foi comparada considerando-se os dois períodos de

isolamento das amostras, foi observada uma tendência ao aumento. Esta

tendência foi mais evidente entre amostras com resistência plena à penicilina, uma

vez que esta característica foi detectada em 1,46% das amostras obtidas no

período 1995-1999 e em 15,4% daquelas compreendidas no período 2000-2004.

Os resultados de susceptibilidade aos diferentes antimicrobianos testados neste

estudo encontram-se na Tabela 1.

Em amostras provenientes de fluídos normalmente estéreis (invasivas) a

resistência plena à penicilina foi observada em 46/411 amostras (11,2%),

enquanto que entre as amostras provenientes de outros materiais a resistência

plena à penicilina foi constatada em 15/418 amostras (3,59%). A resistência

intermediária à penicilina foi verificada em 69/411 (16,8%) e 78/418 (18,7%) das

amostras originárias de fluídos normalmente estéreis e de outros materiais,

respectivamente.

A distribuição dos sorotipos entre 612 amostras (261 do período 1995-1999

e 351 do período 2000-2004) é apresentada na Tabela 2. Um total de 51

diferentes sorotipos foi encontrado, sendo que os sorotipos 14, 6B, 19F, 23F, 3,

6A, 11A e 9V foram os mais freqüentes nos dois períodos, embora uma tendência

de aumento dos sorotipos 14 e 9V e de diminuição de 6B possa ser verificada. O

48

predomínio do sorotipo 14 foi mais pronunciado entre amostras invasivas, com 77

(18,7%) das amostras, seguido dos sorotipos 6B (7,30%), 19F (5,84%), 3, 23F, 9V

(4,38%, cada), 1 (3,89%), 18C (3,65%) e 6A (2,67%). Entre os demais materiais,

distribuição dos mais freqüentes sorotipos foi: 14 (6,94%), 19F (5,98%), 23F

(5,50%), 6B (5,26%), 11A (4,54%), 6A (3,82%), 3 (3,35%), 13 (3,11%), 23B e 15B

(2,39%, cada).

Uma proporção equivalente a 89,6% das amostras apresentou antígenos

polissacarídicos idênticos (75,7%) ou relacionados (13,9%) aos da vacina

pneumocócica 23-valente. Para a vacina conjugada 7-valente, 49,0% e 8,7% das

amostras pertenciam a antígenos idênticos ou relacionados, respectivamente

(Tabela 2). Considerando-se exclusivamente as 147 amostras procedentes de

crianças de menos de 5 anos, a proporção de amostras com sorotipos idênticos

aos da vacina conjugada 7-valente foi de 66,0% (97 amostras, com 23, 6, 45, 8, 9

e 6 amostras para os sorotipos 6B, 9V, 14, 18C, 19F e 23F, respectivamente.

Nenhuma amostra do sorotipo 4 foi encontrada neste grupo) e a de sorotipos

relacionados foi de 9,52%, correspondendo a 14 amostras dos sorotipos 6A (4),

9N (1), 18A (1), 19A (4) e 23B (4).

Como representado na Figura 1, a resistência à penicilina foi detectada em

uma variedade de sorotipos, com predomínio dos sorotipos 6B, 9V, 14, 19F, 23B e

23F. O sorotipo 14 foi o mais freqüente entre amostras com CIM à penicilina

≥2,0µg/ml. Esta característica foi também observada em amostras dos sorotipos

9V e 19F no período 2000-2004 e 19A entre 1995-1999. Suscetibilidade diminuída

49

à penicilina foi detectada entre poucas amostras de diversos outros sorotipos,

incluindo 1, 3, 4, 8, 11A, 13, 18F, 19A, 19C, 21, 28A e 34.

A resistência à penicilina foi relacionada com pneumococos pertencentes

aos sorotipos 14 (38,0% de todas as amostras não suscetíveis à penicilina e

74,0% de todas as amostras do sorotipo 14), 6B (38,0% dos não suscetíveis à

penicilina e 75,0% das amostras do sorotipo 6B), 23F (10,1% das não suscetíveis

e 51,2% das amostras deste sorotipo), 9V (6,25% das amostras não suscetíveis e

52,0% de todas as amostras deste sorotipo), 23B (5,8% dos pneumococos não

suscetíveis à penicilina e 92,3% do total de amostras deste sorotipo) e 19F (4,3%

das amostras não suscetíveis à penicilina e 18,4% das amostras pertencentes a

este sorotipo). Estes seis sorotipos em conjunto constituíram 86,1% de todos os

pneumococos não suscetíveis à penicilina e, a exceção do sorotipo 23B, são

componentes da vacina conjugada 7-valente.

Amostras do sorotipo 14 representaram 80,3% do total das amostras com

CIM de penicilina ≥2,0 µg/ml. A emergência de amostras pertencentes ao sorotipo

9V e CIM de penicilina ≥2,0 µg/ml foi evidente durante o segundo período (2000-

2004). Os sorotipos 9V e 14 englobaram 95,1% de todas as amostras com CIM de

penicilina ≥2.0 µg/ml e foram também associados à resistência à ceftriaxona,

sendo encontrados em todas as amostras com resistência a este antimicrobiano

(duas amostras do sorotipo 9V e cinco do 14). Em contraste, amostras de outros

sorotipos relevantes, tais como 1, 3 e 18C tiveram pouca ou nenhuma resistência

à penicilina e a outros agentes.

50

Amostras apresentando resistência ao cloranfenicol foram distribuídas em

diferentes sorotipos, incluindo 6A, 9N, 11A, 13, 14, 15C, 18A, 19F e 34. Entre as

amostras com resistência à eritromicina, a distribuição dos sorotipos foi também

bastante variável: os sorotipos 14 e 23F estiveram entre os de mais frequentes,

seguidos dos sorotipos 6B e 23B (Tabela 3). Contudo, pneumococos pertencentes

aos sorotipos 10A, 11A, 13, 19A, 19C, 19F, 22F e 23A foram também encontrados

entre os que apresentaram resistência à eritromicina. A resistência à tetraciclina

foi mais freqüentemente encontrada em amostras do sorotipo 23F, seguida dos

sorotipos 19F, 14, 6B, 9N, 19A e 6A. Amostras dos sorotipos 5, 7C, 8, 10A, 11A,

12B, 12F, 13, 15C, 23B, 28A, 28F, 34, 35A, 35B e 40 também apresentaram

resistência à tetraciclina.

Levando-se em conta a associação com resistência à penicilina, amostras

dos sorotipos 6B, 9V e 14 foram selecionadas para análise dos perfis de

macrorestrição de DNA cromossômico após eletroforese em campo pulsado

(PFGE).

Amostras do sorotipo 6B com diferentes CIMs de penicilina (≤0,03 µg/ml,

0,06 µg/ml, 0,12 µg/ml e 0,25 µg/ml) foram incluídas na análise por PFGE. A maior

parte delas ficou restrita a um complexo clonal (CC) principal, arbitrariamente

denominado Pen6B-B, aparentemente composto de dois subgrupos, como

representado na Figura 2). Perfis de PFGE representativos do complexo clonal

Pen6B-B estão ilustrados na Figura 3.

51

Os resultados foram indicativos de pouca diversidade genética entre as

amostras do sorotipo 6B circulantes em Porto Alegre. Não foi observada relação

entre as amostras do CC Pen6B-B quando comparadas a cepas-referência de

clones internacionais com resistência à penicilina (Spain6B-2, South Africa6B-8 e

Finland6B-12).

Em relação às amostras do sorotipo 14 com resistência à penicilina, um CC

principal, designado Pen14-H, foi encontrado e caracterizado. Amostras

procedentes de outros estados brasileiros foram incluídas na comparação e

ficaram alocadas neste mesmo CC, tendo sido também observada marcante

proximidade genética entre o CC Pen14-H e a amostras de referência do clone

internacional Spain9V-3 (Figura 4). Um conjunto de 9 amostras do sorotipo 14 ,

integrantes do complexo clonal Pen14-H, sendo cinco isoladas em Porto Alegre e

quatro procedentes de outros estados brasileiros apresentaram um único perfil de

MLST (7, 11, 10, 1, 6, 8 e 1), correspondendo ao ST 156, compatível com o clone

internacional Spain9V-3. Uma minoria de amostras do sorotipo 14 com resistência

à penicilina foi incluída em CCs distintos, de baixa freqüência (denominados

Pen14-A e Pen14-I), enquanto que amostras suscetíveis à penicilina apresentaram

considerável diversidade genética (Figura 4).

Devido à emergência do sorotipo 9V entre amostras com CIMs≥2,0 µg/ml à

penicilina no período 2000-2004, amostras deste sorotipo foram submetidas à

52

análise por PFGE. Os perfis obtidos apresentaram alta semelhança genética com

o CC Pen14-H e com o clone internacional Spain9V-3 (Figura 5).

Um grupo de amostras com resistência à eritromicina e pertencentes aos

sorotipos mais freqüentes com esta característica (6B, 14 e 23F) foi selecionado

para análise genotípica. Dentre as amostras do sorotipo 23F, houve predomínio do

complexo clonal denominado Ery23F-B, sendo todas as amostras possuidoras do

gene erm(B). As amostras do sorotipo 14 apresentaram um perfil genotípico mais

diverso, com predomínio de amostras apresentando o gene mef (A/E) (Tabela 4).

53

Caracterização de amostras resistentes à optoquina

A resistência à optoquina foi detectada em quatro amostras (Sp 910, Sp

913, Sp 917 e Sp 1008), sendo duas provenientes de amostras do trato

respiratório (Sp 910 e Sp 913), uma (Sp 917) de sangue e uma de secreção ocular

(Sp 1008). As amostras com fenótipo de resistência à optoquina foram detectadas

entre 478 amostras de pneumococos obtidos no período 1995-1999 de pacientes

residentes em Porto Alegre, RS. As amostras Sp 910, Sp 913 e Sp 917 foram

isoladas em 1995 e a amostra Sp 1008 em 1996.

Nenhuma das quatro amostras com fenótipo de resistência à optoquina

apresentou formação de alguma zona de inibição ao redor do disco. Esta

observação foi consistente quando os testes foram incubados tanto em atmosfera

convencional quanto na presença de tensão aumentada de CO2. Exceto pela

resistência à optoquina, as demais características fenotípicas e genotípicas foram

compatíveis com um padrão típico de S. pneumoniae. Todas as amostras foram

solúveis em presença de bile, apresentaram antígeno polissacarídico capsular,

possuíam os genes ply, lytA e psaA e hibridizaram frente à sonda de DNA

empregada.

A comparação com a cepa R6 (suscetível à optoquina) revelou que as

quatro amostras resistentes à optoquina apresentaram mutações pontuais

localizadas no gene atpC que codifica a subunidade c da F0F1 ATPase (Figura 6).

As mutações, no entanto, foram diferentes entre as quatro amostras. As amostras

54

Sp 910 e Sp 913 apresentaram modificações nos códons 23 e 49,

respectivamente. Nas demais amostras (Sp 917 e Sp 1008) foram observadas

mutações no códon 45. As trocas de nucleotídeos corresponderam a duas

diferentes substituições dos aminoácidos deduzidos: ao invés de fenilalanina,

leucina (amostra Sp 917) e valina (amostra Sp 1008) (Tabela 5, Figura 6).

As quatro amostras resistentes à optoquina pertenceram a diferentes

sorotipos (6A, 6B, 10A e 23F) (Tabela 5) e a análise dos perfis de macro restrição

por eletroforese em campo pulsado indicou que as amostras não eram

geneticamente relacionadas. Duas amostras (Sp 913 e Sp 917) apresentaram-se

suscetíveis a todos os antimicrobianos testados, enquanto que a amostra Sp 910

foi resistente ao cloranfenicol e sulfametoxazol-trimetoprim e a amostra Sp 1008

foi resistente à tetraciclina.

As seqüências do gene atpC obtidas para essas quatro amostras foram

depositadas no GenBank sob os seguintes números de acesso: EF464066

(amostra Sp 910), EF464067 (amostra Sp 913), EF464068 (amostra Sp 917) e

EF464069 (amostra Sp 1008).

Na Tabela 5 são apresentadas algumas características gerais das amostras

de pneumococos resistentes à optoquina analisadas neste estudo, tais como os

sorotipos (ou sorogrupos) e os tipos de mutações identificadas no gene atpC. Para

fins de comparação, foram também incluídas as características de amostras

resistentes à optoquina descritas em outros estudos.

55

PCR multiplex seqüencial para a detecção de tipos capsulares

O sistema PCR multiplex seqüencial foi avaliado frente a uma coleção

contendo 147 amostras de Streptococcus pneumoniae obtidas de crianças com

idade inferior a 5 anos, residentes em Porto Alegre, RS. A maior parte (115/147,

78,2%) das amostras foi proveniente de fluídos ou secreções normalmente

estéreis, incluindo sangue (74 amostras), líquor (19 amostras) e líquido pleural (22

amostras). A coleção de 147 amostras foi constituída de representantes de 27

diferentes sorotipos: 14 (45 amostras); 6B (23 amostras); 19F (9 amostras); 18C (8

amostras); 1 e 3 (7 amostras cada), 9V e 23F (6 amostras cada); 5 (5 amostras);

6A, 19A, e 23B (4 amostras cada); 11A (3 amostras); 8 e 16F (2 amostras cada) e

7C, 7F, 9N, 10A, 13, 15B, 18A, 24B, 28A, 29, 31 e 34 (1 amostra cada).

Quando foi empregado o esquema de PCR multiplex seqüencial proposto

por Pai, Gertz e Beall (2006) houve completa concordância com os resultados da

sorologia convencional. O sorotipo ou sorogrupo de 133/147 (90,5%) amostras foi

corretamente reconhecido e as primeiras 4 reações detectaram 81,6% das

amostras. As 14 amostras remanescentes compuseram um grupo em que foram

observados sorotipos não incluídos no esquema: sorotipo 5 (5 amostras), sorotipo

23B (4 amostras) e sorotipos 9N, 13, 24B, 28A e 29 (1 amostra cada).

Ao aplicarmos o esquema de PCR multiplex seqüencial dirigido para os

sorotipos prevalentes na América Latina, observamos que o sorotipo ou sorogrupo

foi corretamente deduzido para 131 amostras (89,1%) com as três primeiras

56

reações. Empregando-se as três reações adicionais, 139 (94,6%) amostras

tiveram cobertura pelo esquema de PCR multiplex seqüencial modificado neste

estudo. As 8 amostras que não foram reconhecidas pelo esquema pertenciam aos

sorotipos 23B (4 amostras) e 13, 24B, 28A e 29 (uma amostra cada). Dentre as

115 amostras obtidas de fluídos normalmente estéreis, 111 (96,5%) tiveram seu

sorotipo corretamente deduzido pelo esquema de PCR multiplex seqüencial

adaptado aos sorotipos prevalentes na América Latina. Para assegurar a

especificidade da PCR para o sorotipo 9N, todas as seis amostras pertencentes

ao sorotipo 9V foram testadas e não produziram amplificação. Os resultados

encontram-se na Tabela 6 e os produtos de amplificação das seis reações do

esquema adaptado à América Latina nas Figuras 7 e 8.

Tabela 1. Suscetibilidade aos antimicrobianos entre 829 amostras de Streptococcus pneumoniae obtidas em Porto Alegre,

RS (1995-2004)

Porcentagem de amostras/período de tempo Agente antimicrobiano

1995-1999

(478 amostras)

2000-2004

(351 amostras)

Total (1995-2004)

(829 amostras)

S I R S I R S I R Ceftriaxona SPSP 1

SPNSP 2 Total

100 100 100

0 0 0

0 0 0

100 94,0 98,0

0

4,3 1,4

0

1,7 0,6

99,2

0,6

0,2 Ceftriaxona (meningite) SPSP SPNSP Total

100 93,5 98,7

0

6,5 1,3

0 0 0

100 60,7 86,9

0

33,3 11,1

0

6,0 2,0

93,8

5,4

0,8 Cloranfenicol SPSP SPNSP Total

99,5 97,8 99,2

- - 0

0,5 2,2 0,8

97,4 99,1 98,0

- - 0

2,6 0,9 2,00

98,7

-

1,3 Eritromicina SPSP SPNSP Total

97,2 87,0 95,8

0 0 0

2,8 13,0 4,2

98,3 92,3 96,3

0,4 1,7 0,9

1,3 6,0 2,8

96,0

0,4

3,6 Penicilina Total

81,0

17,5

1,5

66,7

17,9

15,4

74,9

17,7

7,4

Tetraciclina SPSP SPNSP Total

92,7 92,4 92,7

0,8 0

0,6

6,5 7,6 6,7

85,0 88,0 86,1

0,9 1,7 1,1

14,1 10,3 12,8

89,9

0,8

9,3

Tabela 1 (continuação)

Vancomicina SPSP SPNSP Total

100 100 100

0 0 0

0 0 0

100 100 100

0 0 0

0 0 0

100 100 100

0

0

1 SPSP, Streptococcus pneumoniae suscetível à penicilina 2 SPNSP, Streptococcus pneumoniae não suscetível à penicilina

.

Tabela 2. Distribuição de sorotipos entre 612 amostras de

Streptococcus pneumoniae de Porto Alegre, RS (1995-2004)

Porcentagem de amostras/Periodo de tempo

Sorotipo

1995-1999

(n=261)

2000-2004

(n=351)

Total (1995-2004)

(n=612) Tipos incluídos nas vacinas

1 a 2,68 3,13 2,94 3 a 6,13 4,56 5,23 4 a b 0,77 1,42 1,14 5 a 2,30 0,28 1,14 6B a b 12,6 5,41 8,50 7F a 0 1,99 1,14 8 a 0.38 1.71 1.14 9N a 0.38 2.85 1.80 9V a b 1.15 6.27 4.08 10A a 1.91 0.85 1.31 11A a 4.21 4.27 4.25 12F a 0 0.57 0.33 14 a b 14.6 19.4 17.3 15B a 3.83 0.57 1.96 17F a 1.53 0 0.65 18C a b 2.68 3.70 3.27 19A a 2.68 1.99 2.29 19F a b 6.90 8.83 8.01 20 a 0.77 0.57 0.65 22F a 2.68 1.14 1.80 23F a b 7.28 6.27 6.70 Total 75.5 75.8 75.7

Tipos relacionados às vacinas

6A a b 4.21 4.56 4.41 7C a 1.15 1.14 1.14 15A a 0.77 1.71 1.31 15C a 2.70 0.85 1.63 15F a 0 0.57 0.33 18F a b 0 1.99 1.14 19C a b 0.38 0.57 0.49 23B a b 3.45 1.14 2.12 Outrosc 0.38 1.99 1.31 Total 13.0 14.5 13.9

60

Tabela 2 (continuação)

Tipos não relacionados às vacinas

13 2.30 2.56 2.45 16F 1.53 1.99 1.80 21 0.77 0 0.33 24F 0 0.85 0.49 28A 2.58 0 1.14 29 0.38 0.28 0.33 31 0 0.57 0.33 34 1.91 0.57 1.14 35B 0.77 0.28 0.49 35F 0 1.13 0.65 Outrosd 0.77 0.57 0.65 Total 11.1 8.83 9.80 Não tipável 0.38 0.85 0.65

Total

100.0

100.0

100.0

a Sorotipos incluídos (ou relacionados) na vacina 23-valente. b Sorotipos incluídos (ou relacionados) na vacina conjugada 7-valente. C Incluídos sorotipos 7A, 7B, 10C, 11D, 12B, 18A, 18B e 23A. d Incluídos sorotipos 24B, 28F, 35A, e 40.

61

Tabela 3. Distribuiçãio de sorotipos entre amostras de Streptococcus pneumoniae

resistentes à eritromicina, isoladas em Porto Alegre, RS (1995-2004)

Período Sorotipo

1995-1999 2000-2004

Total

6B 2 2 4

10A 1 0 1

11A 1 0 1

13 1 0 1

14 3 4 7

19A 1 0 1

19C 1 0 1

19F 2 0 2

22F 1 0 1

23A 1 0 1

23B 2 1 3

23F 4 2 6

35A 0 1 1

Total 20 10 30

62

Tabela 4. Características de amostras de Streptococcus pneumoniae resistentes à

eritromicina e pertencentes aos sorotipos 6B, 14 e 23F, isoladas em Porto Alegre

Amostra Sorotipo CIMa

(µg/ml)

Genótipo de

resistência

Complexo clonal Perfil de

resistênciab

Sp 929 6B >8 erm(B) Pen6B-B eri, pen

Sp 1119 6B >8 erm(B) Ery6B-F eri

Sp 2049 6B 8 mef(A/E) NDc eri, tet

Sp 2086 6B >8 erm(B) ND eri, tet

Sp 1025 14 2 mef(A/E) Pen-H eri, PEN

Sp 1292 14 4 mef(A/E) * eri, pen

Sp 1293 14 4 mef(A/E) * eri, pen


Sp 1721 14 >8 erm(B) ND eri, tet


Sp 2158 14 4 mef(A/E) Pen-H eri, tet

Sp 957 23F >8 erm(B) Ery23F-E eri, tet

Sp 992 23F >8 erm(B) Ery23F-B eri, pen, tet

Sp 1107 23F >8 erm(B) Ery23F-B eri, tet

Sp 1278 23F >8 erm(B) Ery23F-B eri, tet

Sp 1601 23F >8 erm(B) ND eri, pen, tet

Sp 2005 23F >8 erm(B) ND eri, tet

aCIM: Concentração inibitória mínima. *Genótipos menos freqüentes, não relacionados a Pen-H. b eri,eritromicina; pen, resistência intermediária à penicilina; PEN, resistência plena à penicilina; tet, tetraciclina. c ND, não determinado

63

Tabela 5. Sorotipos (ou sorogrupos) e mutações no gene atpC que codifica a

subunidade c da F0 F1 ATPase em amostras de Streptococcus pneumoniae

resistentes à optoquina

Referência Amostra Sorotipo ou

sorogrupo

Local da mutação: número

do códon (AA R6 AA

amostra)a

MJ9559 19 49 (Ala Thr)

MJ455 6 48 (Val Phe)

MJ1966 14 50 (Phe Leu)

de La Campa et al., 1997

MJ4133 NTb 48 (Val Phe)

Cognè et al., 2000 P21 23 14 (Gly Ser)

310 9V 23 (Met Ile)

660 14 49 ( Ala Thr)

Pikis et al., 2001

654 19F 20 (Gly Ser)

Sp 910 6A 23 (Met Ile)

Sp 913 23F 49 (Ala Ser)

Sp 917 6B 45 (Phe Leu)

Este estudo

Sp 1008 10A 45 (Phe Val)

aAminoácido encontrado na amostra de referência S. pneumoniae R6 (suscetível à

optoquina) Substituição deduzida de aminoácido. Ala, alanina; Gly, glicina; Ile,

isoleucina; Leu, leucina; Met, metionina; Phe, fenilalanina; Ser, serina; Thr, treonina; Val,

valina. bNT, não tipável.

64

Tabela 6. Dedução de sorotipos de Streptococcus pneumoniae utilizando dois diferentes esquemas de PCR multiplex seqüencial (Estados Unidos e América Latina)

Estados Unidos (Pai, Gertz & Beall, 2006)

América Latina (este estudo)

Reação Sorotipos em cada reaçãoa

N. Cumulativo (%)

Sorotipos em cada reação*

N. Cumulativo (%)

1 3, 6A/6B, 19A,

22F/(22A)

38 38 (25,8) 6A/6B, 9V/(9A), 14, 19F, 23F,

93 93 (63,3)

2 4, 9V/(9A),

12F/(12A), 14

52 90 (61,2) 1, 4, 5, 18C/(18A, 18B, 18F),

19A

25 118 (80,3)

3 7F/(7A),

11A/(11D), 23F,

33F/(33A,37)

10 100 (68,0) 3, 7F/(7A), 9N/9L, 10A, 11A/(11D),

13 131 (89,1)

4 16F,

18C/(18A, 18B, 18F), 19F, 35B

20 120 (81,6) 7C/(7B,40), 12F/(12A), 15B/15C, 17F, 38

2 133 (90,1)

5 8, 15B/15C,

31, 38/(25F) 3 123 (83,7) 8, 20,

22F/(22A), 31, 34,

4 137 (93,2)

6 1, 10A, 34,

35F/(47) 9 132 (89,8) 15A, 16F,

33F/(33A,37), 35F/(47),

35B,

2 139 (94,6)

7 7C/(7B,40),

15A, 17F, 20 1 133 (90,5) NAb

a Combinação de sorotipos são indicadas por barras. Sorotipos raros aparecem

em parênteses. b NA, Não se aplica

65

Figura 1. Resistência à penicilina entre os 15 sorotipos mais freqüentes de Streptococcus pneumoniae isolados em Porto Alegre, RS, em dois períodos (1995-1999, 261 amostras e 2000-2004, 351 amostras)

0

5

10

15

20

1 3 6A 6B 9N 9V 11A 13 14 18C 19A 19F 22F 23B 23F

Suscetível Intermediário Resistente

0

5

10

15

20

1 3 6A 6B 9N 9V 11A 13 14 18C 19A 19F 22F 23B 23F

Suscetível Intermediário Resistente

1995-1999

2000-2004

%

%

66

Figura 2. Perfis de fragmentação do DNA cromossômico de amostras de

Streptococcus pneumoniae do sorotipo 6B, isoladas em Porto Alegre, RS, obtidos

por PFGE após digestão com SmaI

Pen6B-B

Sp936Sp966Sp1036Sp986Sp1029Sp924Sp928Sp929Sp953Sp1037Sp942Sp1026Sp927Sp932Sp1002Sp930Sp955Sp917

1009080706050

67

Figura 3. Perfis de PFGE representativos do complexo clonal Pen6B-B, encontrado

entre amostras de Streptococcus pneumoniae isoladas em Porto Alegre, RS

Pen6B-B

MM 1 2 3 4 5 6 Kb

242.5

145.5

48.5

MM: Padrão de massa molecular ; 1-6: Amostras representativas do complexo clonal Pen6B-B

68

Figura 4. Perfis de fragmentação do DNA cromossômico representativos de

amostras de Streptococcus pneumoniae do sorotipo 14, isoladas em Porto Alegre,

RS, obtidos por PFGE após digestão com SmaI

Pen14-H

• Amostras resistentes à penicilina (CIM≥2 µg/ml)

Amostras com CIM=1,0 µg/ml à penicilina

Sp995Sp996Sp979Sp 1101Sp775Sp1025Sp886Sp933Sp1022Sp1010Sp1001Sp985Sp1040Sp947Sp997Sp948Sp967Sp1003

•

•

•

•

•

•

•

•

69

Figura 5. A. Perfis de fragmentação de DNA cromossômico (obtidos por PFGE

após digestão com SmaI) de amostras de Streptococcus pneumoniae dos

sorotipos 9N, 9V, e 14, isoladas em Porto Alegre, RS, e comparação com o perfil

de PFGE do clone international Spain9V-3. B. Dendrograma resultante da análise

computadorizada dos perfis do painel A

A B

Linhas 1 e 15, Padrão de massa molecular; 2, Sp 1570 (Sorotipo 14, PenR); 3, Sp 1575 (Sorotipo 14, PenS); 4, Sp 1726 (Sorotipo 9N, PenS); 5, Sp 1767 (Sorotipo 9N, PenS); 6, Sp 60 (Sorotipo 9N, PenR); 7, CDC 195 (clone Spain9V-3); 8, Sp 1654 (Sorotipo 14, PenR, clone PenH); 9, Sp 1922 (Sorotipo 14, PenR, clone PenH); 10, Sp 1608 (Sorotipo 14, PenR, clone PenH); 11, Sp 858 (Sorotipo 9V, PenR); 12, Sp 1735 (Sorotipo 9V, PenR); 13, Sp 1596 (Sorotipo 9V, PenR); 14, Sp 1883 (Sorotipo 9V, PenS). Abreviações: PenS (suscetível a penicilina); PenR (resistente a penicilina)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Sp 1654Sp 1922CDC 195Sp 1596Sp 1883Sp 1608Sp 858Sp 1735Sp 1570Sp 1575Sp 1726Sp 1767Sp 60

100908070605040

Figura 6. Comparação das seqüências de nucleotídeos do gene atpC e os respectivos amino ácidos deduzidos (em itálico) de amostras de Streptococcus pneumoniae resistentes à optoquina (Sp910, Sp913, Sp917 e Sp1008), isoladas em Porto Alegre, RS, e a amostra de referência R6 (optoquina suscetível) 5’ Primer 663 → R6 Sp 910 Sp 913 Sp 917 Sp 1008

ATG AAT TTA ACA TTT TTA GGC TTA TGT ATT GCC TGT ATG GGC GTA TCT GTC GGT GAA GGT TTA TTG ATG AAT GGA Met Asn Leu The Phe Leu Gly Leu Cys Ile Ala Cys Met Gly Val Ser Val Gly Glu Gly Leu Leu Met Asn Gly - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -T - - - - - - . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Ile . . - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

R6 Sp 910 Sp 913 Sp 917 Sp 1008

CTG TTT AAA TCA GTA GCA CGC CAA CCA GAT ATG CTT TCT GAG TTT CGT AGT TTG ATG TTT TTA GGT GTT GCC TTT Leu Phe Lys Ser Val Ala Arg Gln Pro Asp Met Leu Ser Glu Phe Arg Ser Leu Met Phe Leu Gly Val Ala Phe - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - T - - - - - . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Ser . - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - G - - - - - - - - - - - - - - - . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Leu . . . . . - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - G - - - - - - - - - - - - - - - - - . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Val . . . . .

← Primer 1016 3’

71

Figura 7. Abordagem esquemática baseada em PCR Multiplex para tipagem capsular, dirigida para a distribuição de sorotipos de Streptococcus pneumoniae prevalentes na América Latina

Reação 1 Positivo para o locus cps e um dos sorotipos 6A/B, 9V, 14,

19F, 23F

Positivo apenas para o locus cps

Reação 2 Positivo para o

locus cps e um dos sorotipos 1, 4,

5, 19A e sorogrupo 18



locus cps e um dos sorotipos 3,

7F, 9N, 10A, 11A



locus cps e um dos sorotipos 7C, 12F, 15B/C, 17D,

38



locus cps e um dos sorotipos 8, 20, 22F, 31, 34



locus cps e um dos sorotipos 15A,

16F, 33F, 35F, 35B


Sorotipagem convencional

Figura 8. Conjunto de reações para dedução de sorotipos de Streptococcus

pneumoniae pelo esquema PCR multiplex adaptado aos sorotipos prevalentes na

América Latina

8 34 20 22F 31

Reação 5

6050

15

250

90bp

35

14 6 19F 23F 9V

Reação 1 Reação 2

1 5 4 19A 18C

33F 15A 35F 35B 16F

Reação 6

7C 12F 15B/C 38 17F

6050

15

250

90

bp

35

Reação 4

Reação 3

3 11A 9N 10A 7F

cpsA

cpsA

73

Discussão e Conclusões

Streptococcus pneumoniae é um dos principais agentes de otite média

aguda, pneumonia, bacteremia, e meningite. As incidências mais elevadas de

doença pneumocócica acontecem nos primeiros anos de vida e na velhice e a

pneumonia pneumocócica é uma das causas mais relevantes de mortalidade

infantil em países em desenvolvimento (Hausdorff, 2000a). O campo de

investigação sobre pneumococos é amplo e diversificado, incluindo estudos

voltados para a bactéria (genoma, fatores de virulência), interações parasita-

hospedeiro e para a comunidade (portadores, epidemiologia da doença

pneumocócica, patogênese) e o diagnóstico, tratamento e prevenção (métodos de

diagnóstico, estratégias terapêuticas, resistência aos antimicrobianos e relevância

clínica, mecanismos de resistência, resposta imune humoral e vacinas).

Esta tese abordou alguns dos componentes acima mencionados, com

relação a amostras isoladas durante um período de 10 anos e provenientes de um

estado localizado no extremo sul do Brasil, o Rio Grande do Sul. No desenrolar

dos trabalhos, os resultados mais importantes foram organizados no formato de

quatro publicações independentes, ainda que vinculadas entre elas.

A resistência dos pneumococos aos antimicrobianos apresenta

disseminação global, sendo considerado um problema de saúde pública. O

Pneumococcal Molecular Epidemiology Network (PMEN)

74

(www.sph.emory.edu/PMEN/) reconhece os mais importantes clones responsáveis

pela resistência, uma etapa necessária para basear estratégias de controle da

disseminação. Para que a resistência seja detectada e rastreada, um conjunto de

medidas de vigilância é necessário, tanto local quanto globalmente. Basicamente,

a vigilância inclui testes de suscetibilidade para avaliação da resistência, definição

dos tipos capsulares envolvidos e utilização de métodos moleculares de tipagem

para caracterização de clones.

No presente estudo, 829 amostras de pneumococos isoladas de pacientes

na cidade de Porto Alegre, Rio Grande do Sul, foram avaliadas, gerando o

manuscrito “Antimicrobial susceptibility, serotype distribution and genetic diversity

of predominant serotypes among Streptococcus pneumoniae isolated in Porto

Alegre city, Brazil, from 1995 to 2004”, que condensa os dados gerais mais

relevantes. Foi possível acompanhar a evolução da resistência a antimicrobianos

durante o período de uma década, destacando-se o aumento da resistência à

penicilina. Quanto a alguns dos demais antimicrobianos testados (eritromicina,

cloranfenicol e tetraciclina) a prevalência de resistência não apresentou alterações

relevantes durante o período.

A resistência plena (CIM ≥2,0µg/ml) à penicilina aumentou

significativamente entre os pneumococos isolados de pacientes de Porto Alegre

durante o período do estudo, passando de 1,46% no período 1995-1999 para

15,4% entre 2000-2004. A sorotipagem das amostras resistentes possibilitou o

reconhecimento de um nítido predomínio do sorotipo 14 entre elas e tornou

75

evidente a emergência do sorotipo 9V durante a segunda etapa do estudo. Ao

aplicarmos a técnica da eletroforese em campo pulsado nas amostras dos

sorotipos 9V e 14 verificamos que o aumento na resistência dos pneumococos à

penicilina devia-se principalmente à disseminação de um único complexo clonal,

relacionado ao clone internacional Spain9V-3, o que não havia antes sido descrito

em nosso país. Estudos anteriores já haviam reconhecido a presença deste

complexo clonal, porém em número limitado de amostras (Brandileone et al.,

1998). Por outro lado, a importância do clone Spain9V-3 já havia sido reconhecida

em dois países limítrofes ao estado do Rio Grande do Sul: Uruguai (Camou, Hortal

& Tomasz, 1998) e Argentina (Rossi et al., 1998).

O sorotipo 6B também esteve entre os mais freqüentes neste estudo,

apresentando correlação com resistência intermediária à penicilina. Amostras

suscetíveis e intermediárias à penicilina foram incluídas na análise por PFGE, o

que tornou evidente o predomínio de um complexo clonal composto de dois

subclones, independente do comportamento frente à penicilina. Foi, possível,

portanto, constatar a baixa diversidade genética entre amostras pertencentes ao

sorotipo 6B durante extenso período de tempo. Este complexo clonal encontra-se

bem adaptado na região e não parece ser relacionado com os clones

internacionais já descritos. Estudos futuros poderão contribuir para a

caracterização precisa desse complexo clonal e para avaliar a sua possível

ocorrência em outras regiões do Brasil.

76

A distribuição dos sorotipos entre as amostras incluídas neste trabalho foi

também explorada e, dentre as 612 amostras submetidas a sorotipagem, 51

diferentes tipos capsulares foram encontrados. Os sorotipos 14, 6B, 19F, 23F, 3,

6A, 11A e 9V foram os mais freqüentes e, de modo geral, a distribuição dos

sorotipos foi semelhante à observada em estudos brasileiros, tanto em estudos

mais recentes (Mantese et al., 2003; Laval et al., 2006), quanto em estudos que

incluíram amostras isoladas há mais tempo (Brandileone et al., 1997; 1998; 2003;

Sessegolo et al., 1994; Teixeira et al., 1997a). Foi observado um aumento relativo

entre amostras dos sorotipos 9V e 14, ao passo que um decréscimo de amostras

do sorotipo 6B foi constatado, o que é representativo da dinâmica da distribuição

dos sorotipos ao longo do tempo.

De acordo com os dados obtidos em relação aos sorotipos foi possível

constatar que 89,6% dos isolados apresentaram antígenos capsulares idênticos

(75,7%) ou relacionados aos contidos na vacina pneumocócica 23-valente. Em

relação à vacina pneumocócica 7-valente, 49,0% dos isolados apresentaram

antígenos idênticos aos da vacina e 8,56% antígenos relacionados, para um total

de 57,7%. O potencial impacto da vacina conjugada no Brasil foi previamente

avaliado, sendo considerado que a vacina7-valente atingiria 58,2% das amostras

isoladas de crianças com menos de cinco anos de idade (Brandileone et al.,

2003). É necessário ressaltar que nosso estudo utilizou amostras de pacientes de

diferentes faixas etárias, o que diminui a representação das amostras pediátricas.

Uma outra questão paralela a essa, é o impacto que a vacina conjugada 7-valente

teria sobre as amostras resistentes à penicilina. Constatamos que, dentre as

77

amostras com resistência à penicilina, 86,1% foram representadas por apenas

seis sorotipos capsulares (14, 6B, 23F, 9V, 23B e 19F). Exceto pelo sorotipo 23B,

os demais são componentes da vacina conjugada 7-valente. Estes dados

permitem uma visão preliminar do efeito desta vacina sobre amostras de

pneumococos resistentes a penicilina. A experiência prévia em estudo

populacional realizado nos EUA, em que foi avaliado o efeito desta vacina sobre a

resistência de pneumococos, indica uma significativa diminuição da ocorrência de

amostras resistentes (Kyaw et al., 2006). Ressalte-se ainda que a resistência

plena à penicilina, no presente estudo, foi, em grande parte, proveniente de

amostras incluídas em um único complexo clonal que expressa sorotipos 9V ou

14, ambos integrantes da vacina 7-valente.

Conforme demonstrado, a sorotipagem é uma etapa crucial na vigilância da

doença pneumocócica e em particular no rastreamento da resistência aos

antimicrobianos. A definição acurada dos sorotipos é também uma necessidade

para desenvolvimento a avaliação do uso de vacinas. A reação de Quellung é o

método padrão para definição dos tipos capsulares, mas apresenta dificuldades

operacionais que limitam seu uso a poucos laboratórios altamente especializados.

Métodos moleculares, baseados em PCR, têm surgido como alternativa à

sorotipagem convencional e apresentam potencial para tornar mais acessível a

vigilância da doença pneumocócica. Com base nestas considerações e em um

estudo que descreveu um novo método de PCR seqüencial multiplex (Pai, Gertz &

Beall, 2006), desenvolvemos uma avaliação deste sistema frente a amostras

isoladas de crianças no Rio Grande do Sul. Este estudo foi realizado em parceria

78

com o “Centers for Diseases Control and Prevention”, em Atlanta, EUA, resultando

na proposta de um esquema modificado, adaptado para uso em países da

América Latina, conforme apresentado no manuscrito “Sequential Multiplex PCR

Scheme for Determining Capsular Serotypes of Pneumococci Recovered from

Brazilian Children”, recentemente publicado.

Este estudo foi dividido em duas etapas. Na primeira delas, as amostras de

pneumococos foram submetidas ao esquema proposto previamente (Pai, Gertz &

Beall, 2006), com o propósito de validar o método. Os resultados obtidos com o

procedimento de PCR seqüencial multiplex foram de completa concordância com

a tipagem convencional para as 147 amostras avaliadas. Em 133/147 (90,5%), o

sorotipo foi corretamente deduzido, enquanto que as amostras restantes eram de

sorotipos não incluídos no esquema original da técnica.

Na segunda etapa desse estudo, incluímos seqüências iniciadoras para

dois sorotipos, 5 e 9N, que estão entre os prevalentes na América Latina,

ampliando a abrangência do esquema de tipagem para um total de 30 sorotipos.

Além disso, a combinação de seqüências iniciadoras foi modificada para que se

obtivesse resultados conclusivos com o menor número possível de reações. Esta

combinação permitiu que 89,1% (131/147) das amostras tivesse seu sorotipo

deduzido nas primeiras três reações de PCR multiplex, que continham seqüências

iniciadoras referentes a 15 diferentes sorotipos. Com o total das seis reações,

compreendendo 30 sorotipos, 139/147 (94,6%) das amostras tiveram seu sorotipo

deduzido. Ficou, portanto, constatada não apenas a acurácia do sistema, mas

79

também sua versatilidade para ajustes na combinação de seqüências iniciadoras

para a distribuição de sorotipos provenientes de uma região específica.

Os resultados deste estudo apontam o sistema de PCR seqüencial multipex

como de grande potencial como método alternativo para a sorotipagem

convencional de pneumococos, em laboratórios que disponham de recursos

básicos para realização de PCR e eletroforese. O uso deste sistema, na versão

por nós proposta, permitirá que se identifique, com acurácia, os sorotipos

capsulares de mais de 90% das amostras.

Um outro importante componente deste conjunto de estudos, foi aquele que

originou o manuscrito “Diversity of Mutations in the atpC Gene Coding for the c

Subunit of F0F1 ATPase in Clinical Isolates of Optochin-Resistant Streptococcus

pneumoniae from Brazil”, o qual aborda uma questão crucial relacionada a

identificação rotineira do microrganismo. Cepas com fenótipo de resistência à

optoquina, uma substância utilizada na diferenciação de pneumococo em relação

a integrantes do grupo “viridans”, têm recebido atenção no meio científico pelo

potencial de erros de identificação que representam (Borek et al., 1997; Tsai et al.,

2000; Cogné et al., 2000; Pikis et al., 2001), cabendo ressaltar que novas espécies

relacionadas ao pneumococo têm sido descritas (Arbique et al., 2004). Em nosso

estudo descrevemos quatro amostras com fenótipo de resistência à optoquina.

Como a resistência à optoquina é associada ao gene atpC, buscamos, por

intermédio de seqüenciamento, mutações neste gene, considerando os poucos

estudos publicados até o momento que se valeram desta abordagem (de La

80

Campa et al., 1997; Cogné et al., 2000; Pikis et al., 2001). Foi possível detectar

mutações localizadas no gene que codifica a subunidade c da ATPase F0F1 nas

quatro amostras com fenótipo de resistência à optoquina estudadas. Em três das

amostras, as alterações observadas não haviam ainda sido descritas, o que, em

conjunto com os outros estudos antes mencionados, demonstra a natureza

diversa dos mecanismos moleculares que estão associados ao fenótipo de

resistência à optoquina em pneumococos.

Não há estudos sistemáticos para detecção de resistência à optoquina em

pneumococos, o que faz com que a prevalência de resistência seja desconhecida.

Pneumococos resistentes à optoquina podem ser erroneamente identificados

como estreptococos do grupo viridans o que tem implicações significativas na

abordagem clínica. A inclusão de um teste adicional, como o da bile solubilidade,

deve ser adotada por laboratórios clínicos para a identificação acurada de S.

pneumoniae. Por outro lado, testes moleculares, tais como aqueles que detectam

genes relacionados à virulência (ply, lytA e psaA), por nós empregados, podem

ser de auxílio para a identificação precisa de pneumococos resistentes à

optoquina.

Várias observações feitas durante este trabalho de tese expuseram

questões a serem esclarecidas. Uma melhor definição sobre a origem das

amostras de S. pneumoniae com fenótipo de resistência à optoquina, por exemplo,

é algo que poderá ser futuramente desenvolvido. Da mesma forma, a emergência

e a evolução do sorotipo 9V entre as amostras pertencentes ao clone Spain9V-3

81

pode ser objeto de um acompanhamento ao longo de mais tempo e de estudos

comparativos com amostras isoladas em outras áreas. Por outro lado,

caracterizamos, detalhadamente, amostras de pneumococos com uma

característica rara, a resistência à optoquina, incluindo a definição de mutações no

gene da subunidade c da F0F1 ATPase, a maioria das quais não havia sido

anteriromente identificada. Com relação à resistência aos antimicrobianos,

definimos o papel preponderante de amostras dos sorotipos 9V e 14, pertencentes

ao clone internacional Spain9V-3, na resistência a níveis elevados à penicilina. Foi

também constatada a ocorrência de um complexo clonal de amostras do sorotipo

23F (Ery23F-B) com resistência à eritromicina.

Tivemos também oportunidade de adaptar um procedimento de PCR

multiplex seqüencial para melhor utilização entre amostras brasileiras e latino

americanas. Em seu conjunto, esta tese contribuiu para ampliar os conhecimentos

regionais e globais relacionados a S. pneumoniae, envolvendo questões sobre

caracterização de amostras atípicas, resistência aos antimicrobianos e vigilância

laboratorial das infecções pneumocócicas.

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111

AAnneexxooss

Os resultados obtidos durante o programa de Doutorado deram origem a

trabalhos, assim como a comunicações em congressos ou encontros científicos,

conforme listado a seguir:

• Trabalhos cientificos (cópias em anexo):

1. Dias, C.A.G.; Carvalho, M.G.S.; Mendonca-Souza, C.R.V; Kegele, F.C.O.;

d’Azevedo, P.A.; Barros, R.R.; Jackson, D.; McGee, L.; Facklam, R. & Teixeira,

L.M. Antimicrobial susceptibility, serotype distribution and genetic diversity of

predominant serotypes among Streptococcus pneumoniae isolated in Porto Alegre

city, Brazil, from 1995 to 2004. Em fase de revisão.

2. Mendonça-Souza, C.R.V.; Carvalho, M.G.S.; Barros, R.R.; Dias, C.A.; Sampaio,


characteristics of erythromycin-resistant Streptococcus pneumoniae strains

isolated in three major Brazilian states. Microbial Drug Resist. 10: 313-320.

3. Dias, C.A.G.; Agnes, G.; Frazzon, A.P.G.; Kruger, F.D.; d'Azevedo, P.A.;

Carvalho, M.G.; Facklam, R.R.; & Teixeira, L.M. 2007. Diversity of mutations in the

atpC gene coding for the c subunit of F0F1 ATPase in clinical isolates of optochin-

resistant Streptococcus pneumoniae from Brazil. J. Clin. Microbiol. 45: 3065-3067.

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4. Dias, C.A.G.; Teixeira, L.M.; Carvalho, M.G. & Beall, B. 2007. Sequential

multiplex PCR scheme for determining capsular serotypes of pneumococci

recovered from Brazilian children. J. Med. Microbiol. 56: 1185-1188.

• Outras publicações relacionadas: Zettler, E.W.; Scheibe, R.M.; Dias, C.A.G.; Santafé, P.; Santos, D.S.; Moreira, J.S.

& Fritscher, C.C. 2006. Determination of penicillin resistance in Streptococcus

pneumoniae isolates from southern Brazil by PCR. Intern. J. Infect. Dis. 10:110-

115.

• Outros manuscritos em preparo: Mendonça-Souza, C.R.V. et al. Molecular characterization of penicillin-resistant

Streptococcus pneumoniae Strains Isolated in Brazil

Kegele, F et al. Molecular characterization of Brazilian isolates of Streptococcus

pneumoniae serotype 14

• Comunicações em congressos ou eventos científicos: 1. DIAS, C. A. G.; AGNES, G.; FRAZZON, A. P.; KRUGER, F.; DAZEVEDO,

P. A.; TEIXEIRA, L. M. 2006. Diversity of mutations in the c subunit of F1/F0

ATPase in clinical isolates of optochin-resistant Streptococcus pneumoniae

from Brazil. In: 106th General Meeting American Society for Microbiology,

2006, Orlando, Florida, EUA. Abstracts of the 106th General Meeting.

113

2. KEGELE, F.; DIAS, C. A. G.; BARROS, R.; DAZEVEDO, P. A.;

MENDONCA-SOUZA, C.; CARVALHO, M. G. S.; FACKLAM, R.; TEIXEIRA,

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Streptococcus pneumoniae Serotype 14. In: 105th General Meeting

American Society for Microbiology, 2005, Atlanta, GA. Abstract Book, p.

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3. BARROS, R.; KEGELE, F.; ABREU, T. P.; JESSOUROUN, E.; DIAS, C. A.

G.; CARVALHO, M. G. S.; FACKLAM, R. R.; TEIXEIRA, L. M. 2005.

Relação genética entre cepas de Streptococcus pneumoniae pertencentes

aos sorotipos 9N, 9V e 14. In: XXIII Congresso Brasileiro de Microbiologia,

2005, Santos, SP. Anais do XXIII Congresso Brasileiro de Microbiologia,

4. KEGELE, F.; DIAS, C. A. G.; BARROS, R.; MENDONCA-SOUZA, C.;

CARVALHO, M. G. S.; FACKLAM, R. R. ; TEIXEIRA, L. M. 2005.

Diversidade fenotípica e genotípica entre amostras de Streptococcus

pneumoniae sorotipo 14 resistentes à penicilina isoladas no Brasil. In: XXIII

Congresso Brasileiro de Microbiologia, 2005, Santos, SP. Anais do XXIII

Congresso Brasileiro de Microbiologia.

5. ABREU, T. P.; BARROS, R.; KEGELE, F.; DIAS, C. A. G.; CARVALHO, M.

G. S.; FACKLAM, R. R.; TEIXEIRA, L.M. 2005. Caracterização molecular de

Streptococcus pneumoniae dos sorotipos 9N, e 9V isolados no Brasil. In:

114

XXIII Congresso Brasileiro de Microbiologia, 2005, Santos, SP. Anais do

XXIII Congresso Brasileiro de Microbiologia.

6. DIAS, C. A. G.; CARVALHO, M. G. S.; BUFFON, R.; KADER, I.;

D'AZEVEDO, P. A.; FACKLAM, R.; TEIXEIRA, L. M. 2003. Occurrence and

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7. MENDONÇA, C. R. V.; BARROS, R.; CARVALHO, M. G.; DIAS, C. A. G.;

D'AVEVEDO, P. A.; SAMPAIO, J. L. M.; MENDES, C.; FACKLAM, R.;

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American Society for Microbiology, p. 141-141.

8. RAMOS, C. G.; DIAS, C. A. G. 2003. Suscetibilidade de levofloxacina e

gatifloxacina em amostras de Streptococcus pneumoniae com perfil de

resistência a outros antimicrobianos. In: XXII Congresso Brasileiro de

115

Microbiologia, Florianópolis, SC. Anais do XXII Congresso Brasileiro de

Microiologia.

9. MENDONÇA, C. R. V.; BARROS, R.; DIAS, C. A. G.; D'AVEVEDO, P. A.;

SAMPAIO, J.; MENDES, C.; FACKLAM, R.; CARVALHO, M. G. S.;

CASTRO, A.; TEIXEIRA, L. M. 2003. Caracterização molecular de amostras

de Streptococcus pneumoniae resistentes à penicilina isoladas no Brasil. In:

XXII Congreso Brasileiro de Microbiologia, Florianópolis, SC. Anais do XXII

Congresso Brasileiro de Microbiologia.

116

Manuscrito 1

Antimicrobial susceptibility, serotype distribution and genetic

diversity of predominant serotypes among Streptococcus

pneumoniae isolated in Porto Alegre city, Brazil, from 1995 to

2004

Cícero Armídio Gomes Dias,1,2 Maria da Glória Siqueira de Carvalho, Claudia R. V.

Mendonca-Souza,1,3 Fabiola Cristina de Oliveira Kegele ,1 Pedro Alves d’Azevedo,2

Rosana Rocha Barros,1,3 Delois Jackson,5 Lesley McGee,4 Richard Facklam, 5 and

Lúcia Martins Teixeira1

Instituto de Microbiologia, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro,

RJ, Brazil,1 Fundação Faculdade Federal de Ciências Médicas de Porto Alegre,

Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Brazil,2 Universidade Federal Fluminense,3 Emory

University,4 Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, Georgia, USA5

Running title: Phenotypic and genetic diversity of pneumococci

Corresponding author: Cícero Armídio Gomes Dias. Departmento de

Microbiologia e Parasitologia, Fundação Faculdade Federal de Ciências Médicas

de Porto Alegre. Rua Sarmento Leite, 245, CEP 90050-170, Porto Alegre, RS,

Brazil. Phone 55 051 3224 8822. E mail: [email protected]

117

Abstract

Streptococcus pneumoniae is a major cause of disease and antimicrobial

resistance is spreading. In the present work, 829 S. pneumoniae isolates obtained

from patients living in Porto Alegre, Brazil, during a ten-year period (1995-2004),

were studied. Penicillin resistance was observed in 25.1% of the strains (17.7%

intermediate and 7.4% fully resistant). Resistance to ceftriaxone, chloramphenicol,

erythromycin, and tetracycline was verified in 0.8%, 1.3%, 4.0%, and 10.1% of the

strains, respectively. An increase in full resistance to penicillin was evident (1.46%

in the period 1995-1999 to 15.4% in 2000-2004). Serotypes 14, 6B, 19F, 23F, 3,

6A, 11A, and 9V were the most frequent and 75.5% and 49.0% of the isolates

belonged to serotypes included in the 23-valent and 7-valent pneumococcal

vaccines, respectively. Pneumococci belonging to six serotypes (6B, 9V, 14, 19F,

23B, and 23F) comprised 86.1% of penicillin non-susceptible isolates. Serotypes

9V and 14 predominated among isolates exhibiting full resistance to penicillin and,

according to PFGE analysis, most of these isolates were included in a single clone

related to the international clone Spain9V-3. On the other hand, among isolates of

serotype 6B, a major clonal complex was observed with two highly related

subclusters including susceptible and intermediate resistant pneumococci. The

results indicate the dissemination of resistance among strains of S. pneumoniae in

the Southern region of Brazil, reinforcing the need of surveillance and control of

antimicrobial resistance, with especial emphasis in serotypes 6B, 9V and 14.

118

INTRODUCTION

Streptococcus pneumoniae remains as an important human pathogen, and

a leading cause of community-acquired pneumonia, bacteremia, meningitis and

otitis media (Centers for Disease Control and Prevention, 1997), despite the

development and application of treatment and prevention strategies. Although the

introduction of penicillin therapy significantly decreased the usually high morbidity

and mortality rates due to pneumococcal infections, the emergence and

dissemination of resistance to penicillin and to other antimicrobial agents is now a

global problem involving both developed and developing countries (Klugman,

1990; Okeke et al., 2005). In Brazil, the largest country in Latin America, the

occurrence of resistance to penicillin and other antimicrobial agents has been

documented in strains obtained from the Southeast and Northeast regions of the

country. Penicillin resistance rates may vary from 12.9% up to 20.0%, and

serotypes 6B, 14 and 23F were shown to be the most frequent among resistant

isolates in some Brazilian areas investigated (Sessegolo et al., 1994; Brandileone

et al., 1997; Teixeira et al., 1997a; Brandileone et al., 1998; Kertesz et al., 1998;

Ko et al., 2000, Critchley et al., 2001, Reis et al., 2002, Castanheira et al., 2004). A

trend towards increase in penicillin resistance rates (particularly in strains

exhibiting minimal inhibitory concentrations ≥2.0 µg/ml) was recently documented

in Brazil (Mendes et al., 2004; Brandileone et al., 2006).

The use of molecular typing systems has provided a better understanding

about the transmission of resistant clones of S. pneumoniae. About 10 years ago,

the Pneumococcal Molecular Epidemiology Network was established with the aim

119

of characterizing, standardizing, naming, and classifying antimicrobial-resistant

pneumococcal clones, and several international clones have been recognized to

date (McGee et al., 2001; www.sph.emory.edu/PMEN/). Antimicrobial resistant

pneumococcal isolates belonging to a widely disseminated international clone,

named Spain9V-3, carrying capsular antigens of serotypes 9 or 14 were already

detected in Latin America countries (Camou et al., 1998; Rossi et al., 1998;

Brandileone et al., 1998), including Brazil. Strains belonging to this clone and

exhibiting resistance to cefotaxime were observed in Brazil and other Latin

America countries (Castanheira et al., 2003). Considering the burden of

pneumococcal infections and the large area and population of the country,

however, studies focusing on the genetic diversity of Brazilian isolates are still very

limited (Brandileone et al., 1998; Ko et al., 2000) and the knowledge on the

transmission of antimicrobial-resistant clones of S. pneumoniae is quite restricted.

The aim of the present study was to investigate the occurrence of

antimicrobial resistance, serotype distribution and predominant genetic profiles

among pneumococcal isolates from Porto Alegre, the capital city of the state of Rio

Grande do Sul, located at the South region of Brazil, over a period of 10 years.

120

MATERIAL AND METHODS

Bacterial strains and identification. Clinical isolates of Streptococcus

pneumoniae (total of 829) obtained from patients living in Porto Alegre city, the

capital of Rio Grande do Sul state, Brazil, during the period between 1995 and

2004 were included in the study. The city of Porto Alegre (approximately 1,200,000

inhabitants) is located in the extreme South of Brazil at a distance of about 400km

from the borders of both Uruguay and Argentina (Figure 1). Identification of the

isolates was based on the observation of colony characteristics on blood agar

plates, Gram staining cellular characteristics, optochin susceptibility, and bile

solubility testing, according to previously described methods (Ruoff at al., 1999).

Pneumococcal isolates from other Brazilian states (referred when appropriate)

belonging to major serotypes (6B, 9V and 14) identified among Penicillin Non-

Susceptible Streptococcus pneumoniae (PNSSP) isolates, as well as reference

strains of several antimicrobial-resistant internationally disseminated clones [ATCC

700670 (Spain6B-2), ATCC 700671 (Spain9V-3), ATCC 700676 (England14-9),

ATCC 700902 (Spain14-5), ATCC 700675 (S.Africa6B-8), ATCC 700677 (CSR14-

10), ATCC (Finland6B-12)], were also included in PFGE experiments for

comparative purposes.

Serotyping. Isolates were serotyped on the basis of reactivity with type-

specific pneumococcal antisera (Centers for Disease Control and Prevention,

Atlanta, Ga), expressed by latex agglutination reactions and/or capsular swelling

(Quellung reaction). The Danish system of nomenclature was employed.

121

Antimicrobial susceptibility testing. The isolates obtaines in the period of

1995-1998 were initially screened for antimicrobial resistance by agar diffusion

tests, according to the Clinical Laboratory Standards Institutes (CLSI, 2005)

guidelines. The following antimicrobial agents were tested: chloramphenicol,

erythromycin, oxacillin (for predicting susceptibility to penicillin), tetracycline, and

vancomycin. When resistance to at least one of the agents was observed in the

disk testing, an agar dilution procedure was performed in order to determine

minimal inhibitory concentrations (MICs) for ceftriaxone, chloramphenicol,

erythromycin, penicillin, and tetracycline (CLSI, 2005). Isolates obtained between

1999 and 2004 were all tested by agar dilution to the antimicrobials listed above

and to vancomycin. S. pneumoniae ATCC 49619 was used for quality control of

both agar diffusion and agar dilution assays.,

Analysis of chromosomal DNA restriction patterns by pulsed-field gel

electrophoresis (PFGE). PFGE was used to compare chromosomal DNA

restriction profiles of isolates belonging to the most relevant serotypes according to

a previously described procedure (Mendonça-Souza, 2004) with a few

modifications. Briefly, isolates were grown on plates containing Trypticase Soy

Agar with 5% sheep blood during 14 hours at 35ºC, in CO2 atmosphere. Cells were

harvested and suspended on 0.6 ml aliquots of PIV buffer (1.0 M NaCl, 10 mM tris-

HCl [pH7.6]) in order to obtain turbidity corresponding to that of an 8 McFarland

standard. Each suspension was mixed with an equal volume of 2.0% low-melting-

temperature agarose (NuSieve GTG Agarose; BioWhittaker Molecular Applications

(BMA), Cambrex Corporation, Rockland, ME) in PIV buffer at 58ºC. The mixtures

122

were then distributed into plug molds. Cell lysis was obtained by placing plugs in

4.0 ml of fresh lysis solution (6 mM Tris hydrochloride [pH7.6], 1.0 NaCl, 100mM

EDTA [pH7.5], 0.5% Brij 58, 0,2% sodium deoxycholate, 0.5% sodium lauroyl

sarcosine, 1mg of lysozyme per ml, 5U of mutanolysin per ml) and incubation for

24 hours at 35ºC, with gentle shaking. After incubation, the solution was replaced

by 4 ml of ESP (0.5 M EDTA [pH8.0], 1% sodium lauroyl sarcosine, 0.1 mg of

proteinase K per ml), and the preparations were incubated overnight at 50ºC with

gentle shaking. Plugs containing DNA were stored in ES (0.5 M EDTA [pH8.0], 1%

sodium lauroyl sarcosine) at 4ºC. Prior to treatment with the restriction enzyme, the

plugs were washed four times (two periods of 1h each and two periods of 2h each)

with TE (10 mM Tris-HCl [pH7.6], 0.1% mM EDTA) at 37ºC, followed by overnight

incubation with the respective restriction enzyme buffer. The DNA was then

restricted with SmaI according to manufacturer’s instructions (Roche Diagnostics

Corporation, Indianapolis, Ind.). The fragments obtained were resolved by PFGE

using 1.2% agarose (SeaKem GTG, BMA) in TBE buffer (0.89M Tris, 0.025 M

EDTA, 0.89M boric acid) in a CHEF DR III system (Bio-Rad). The following

parameters were employed initial pulse time, 1s; final pulse, 30s: running time,

20h; temperature, 11ºC; voltage gradient, 6 V/cm; included angle, 120º. The gels

were stained with ethidium bromide and photographed under UV light. Analysis of

the DNA restriction profiles was done by visual inspection, and interpretation was

based on the criteria suggested by Tenover et al. (1995). Computer-assisted

analysis was also performed by using the Molecular Analyst Fingerprinting Plus

software, version 1.12 of the Image Analyst System (BioRad). The Unweighted

123

Pair Group Method Using Arithmetic Averages (UPGMA) method was applied for

comparison of the banding profiles, using the Dice coefficient of similarity.

Multilocus Sequencing Typing. MLST was carried out as described

previously (Enright & Spratt, 1998). Briefly, internal fragments of the aroE, gdh, gki,

recP, spi, xpt, and ddl genes were amplified by PCR from chromosomal DNA using

the primer pairs described by Enright and Spratt (1998). The amplified fragments

were directly sequenced in each direction using the primers that were used for the

initial amplification. The sequences at each of the seven loci were then compared

with the sequences of all of the known alleles at those loci. Sequences that were

identical to the sequence of a known allele were assigned the same allele number,

whereas those that differed from the sequence of any known allele, even at a

single nucleotide site, were assigned new allele numbers. The assignment of

alleles at each locus was carried out using the software available at the

pneumococcal MLST website (http://www.mlst.net). The alleles at each of the

seven loci define the allelic profile of each isolate as well as their sequence type.

Allelic profiles were shown as a series of seven integers which corresponded to the

alleles at each of the loci, in the order aroE, gdh, gki, recP, spi, xpt, and ddl. The

relatedness between the isolates was represented as a dendrogram, constructed

by the unweighted pair-group method with arithmetic averages, from the matrix of

pairwise differences in the allelic profiles.

124

RESULTS AND DISCUSSION

The 829 pneumococcal isolates included in the present study, comprised

478 isolates obtained in the period of 1995 to 1999, and 351 Isolates recovered in

the period of 2000-2004. The clinical sources included: normally sterile fluids (410

isolates), such as blood (255 isolates), spinal fluid (85 isolates), pleural fluid (58

isolates), ascitis fluid (12 isolates); as well as non-sterile fluid or secretions (419

isolates), consisting of respiratory tract secretions (342 isolates), eye (33 isolates),

ear (9 isolates) and other secretions (35 isolates).

Resistance to penicillin was the most frequent antimicrobial resistance

marker among the isolates included in the present study, being detected in 25.1%

of them, followed by resistance to tetracycline (10.1%), erythromycin (3.98%),

chloramphenicol (1.33%), ceftriaxone (0.84%). All isolates were susceptible to

vancomycin (Table 1). Most (17.7%) of the penicillin non-susceptible isolates were

included in the intermediate category (MIC≥0.12 µg/ml and ≤1.0 µg/ml), while

7.36% were fully resistant (MIC≥2.0µg/ml). When rates of antimicrobial resistance

among isolates from the 2 periods of time were compared, a trend toward

increasing incidence of penicillin resistance was noted. This was particularly

noticeable among fully resistant isolates that composed 1.46% of the isolates

obtained in the period of 1995 to 1999 and 15.4% of those recovered in the period

of 2000 to 2004. Such observation is in accordance with reports indicating the

increasing occurrence of penicillin non-susceptible pneumococci among isolates

recovered in other Brazilian locations (Mendes et al., 2004; Brandileone et al.,

2006).

125

The prevalence of resistance to other antimicrobial agents tested in this

study was also comparable to previous observations with Brazilian isolates, except

for tetracycline, which was lower (10.6%) compared to rates of 44.6% and 31.0%

reported for isolates recovered in the Southeast region. (Sessegolo et al., 1994;

Teixeira et al., 1997a) and a rate of 30.2% recently observed for isolates from

different regions in Brazil (Castanheira et al., 2006).

The occurrence of significant rates of decreased susceptibility to penicillin

among pneumococcal isolates in Brazil was documented in previous studies

(Sessegolo et al., 1994; Brandileone et al., 1997; Teixeira et al., 1997a;

Brandileone et al., 1998; Kertesz et al., 1998; Ko et al., 2000; Critchley et al., 2001;

Reis et al., 2002, Mendes et al., 2004; Brandileone et al., 2006). However, Brazil is

a large country and some regions are still underrepresented or not represented at

all in the existing reports. The present study was conducted to obtain information

on antimicrobial susceptibility, especially in relation to penicillin, and serotype

distribution among S. pneumoniae isolates obtained in Porto Alegre, a large city

located in the South of Brazil, a region that has not been submitted to extensive

surveillance. Porto Alegre is one of the major cities in the Southern area of Brazil,

having important trading and cultural connections with other South America

countries, especially Argentina and Uruguay. Isolates obtained over a period of 10

years were compared and the predominant serotypes associated with resistance to

penicillin were evaluated for their genetic diversity by PFGE.

The distribution of serotypes among a total of 612 isolates (261 isolates

recovered in the period of 1995 to 1999, and 351 in the period of 2000 to 2004) is

shown in Table 2. Fifty-one different serotypes were identified. Serotypes 14, 6B,

126

19F, 23F, 3, 6A, 11A, and 9V were the most frequent. They predominated among

isolates obtained in both periods of time, although differences in the prevalence

rates suggest a trend toward increasing occurrence of serotypes 14 and 9V, and

decreasing incidence of serotype 6B. A large proportion (89.6%) of isolates had

polysaccharide-type antigens identical (75.7%) or related (13.9%) to those included

in the 23-valent pneumococcal vaccine and 57.7% had antigens identical (49.0%)

or related (8.66%) to those in the 7-valent pneumococcal vaccine.

As represented in Fig. 2, resistance to penicillin was detected in a variety of

serotypes, with the predominance of serotypes 6B, 9V, 14, 19F, 23B and 23F.

Serotype 14 was the most frequent among isolates with penicillin MICs ≥2.0ug/ml.

High resistance to penicillin was also found among isolates expressing capsular

antigens of serotypes 9V and 19F isolated in the period of 2000 to 2004, and

among serotype 19A isolated in 1997 and 1998. Decreased susceptibility to

penicillin was also detected among a few isolates belonging to several other

serotypes, including 1, 3, 4, 8, 11A, 13, 18F, 19A, 19C, 21, 28A and 34.

Isolates showing resistance to chloramphenicol were distributed in different

serotypes, including 6A, 9N, 11A, 13, 14, 15C, 18A, 19F, and 34. Serotype

distribution among erythromycin-resistant isolates was also highly variable:

serotypes 14 and 23F were the most prevalent, followed by 6B and 23B. Isolates

belonging to serotypes 10A, 11A, 13, 19A, 19C, 19F, 22F and 23A were also

represented among those with erythromycin resistance. Resistance to tetracycline

was most frequently associated with serotype 23F, followed by serotypes 19F, 14,

6B, 9N, 19A and 6A. A few isolates of serotypes 5, 7C, 8, 10A, 11A, 12B, 12F, 13,

15C, 23B, 28A, 28F, 34, 35A, 35B and 40 also presented tetracycline resistance.

127

Geographic and temporal differences have been reported in the distribution

of capsular serotypes of S. pneumoniae. According to a study involving

pneumococcal isolates collected from invasive infections in children from 6 Latin

America countries, serotype 14 was the most prevalent, accounting for 24.4% of

the isolates, although differences in distribution of serotypes were seen among

countries (Kertesz et al., 1998). In Brazil, serotypes 6B, 14, 19A, 19F and 23F

have been found to predominate in different studies, among both penicillin

susceptible (PSSP) and penicillin non-susceptible (PNSSP) S. pneumoniae

isolates (Sessegolo et al., 1994; Brandileone et al., 1997; Teixeira et al,. 1997a;

Brandileone et al., 1998; Kertesz et al., 1998; Ko et al., 2000, Reis et al., 2002).

In the present study, decreased susceptibility to penicillin was closely

related to S. pneumoniae belonging to serotypes 14 (38.0% of PNSSP isolates and

74.3 % of all serotype 14 isolates) 6B (18.8% of PNSSP isolates and 75.0% of all

serotype 6B isolates), 23F (10.1% of PNSSP isolates and 51.2 % of all serotype

23F isolates), 9V (6.25% of PNSSP isolates and 52.0% of all serotype 9V isolates),

23B (5.77% of PNSSP isolates and 92.3% of all serotype 9V isolates), and 19F

(4.32% of PNSSP isolates and 18.4% of all serotype 19F isolates). These 6

serotypes together represented 86.1% of all the PNSSP isolates and, except for

serotype 23B, they are components of the 7-valent vaccine currently available for

children under two years of age. It is predictable that such vaccine would have an

impact in pneumococcal resistance in our population, in agreement with what was

verified by other authors that evaluated the effect of the conjugate vaccine on drug-

resistant pneumococci (Kyaw et al., 2006). Serotype 14 alone represented 80.3%

of the isolates presenting penicillin MICs ≥2.0 µg/ml. The emergence of resistant

128

isolates belonging to serotype 9V and exhibiting MICs ≥2.0 µg/ml to penicillin

during the second period of this study was noteworthy. Isolates of these two

serotypes were responsible by 95.1% of all isolates with penicillin MICs ≥2.0 µg/ml.

Serotype 14 and 9V were also strongly associated with resistance to ceftriaxone,

since these serotypes were detected in all isolates with ceftriaxone MICs ≥2ug/ml

(two and five isolates of serotypes 9V and 14, respectively). In contrast, isolates of

other relevant serotypes, such as 1, 3, and 18C were rarely resistant to penicillin or

other antimicrobial agents.

Considering the overall predominance of serotypes 6B and 14, and their

frequent association with resistance to penicillin, isolates of these two serotypes

were selected for studies of their genetic diversity by analysis of their chromosomal

DNA restriction profiles by PFGE. Also, as serotype 9V isolates expressing high

levels of resistance were found among isolates recovered in a more recent period,

and also taken into account the evidence of clonal relationship among isolates

expressing serotype 14 or serotype 9V (Coffey et al., 1999) isolates of serotype 9V

were also selected for PFGE experiments.

Serotype 6B isolates with different penicillin MICs (0.25 ug/ml , 0.12 ug/ml,

0.06, and <0.03ug/ml) were included in PFGE analysis. Most of them were

included in a major clonal complex (CC), arbitrarily named as Pen6B-B, apparently

composed by two subclusters, as represented in Fig 3. Although primarily

composed by penicillin-nonsusceptible isolates (about 86% of the serotype 6B

isolates included in this CC), this clonal complex also contained penicillin-

susceptible isolates. The results indicated the low genetic diversity among serotype

6B pneumococci circulating in Porto Alegre, for a considerable period of time,

129

regardless of penicillin susceptibility. Furthermore, the PFGE profiles found among

isolates composing the CC Pen6B-B were not related to the PFGE profiles of the

reference strains of three penicillin-resistant serotype 6B international clones

(Spain6B-2, South Africa6B-8 and Filand6B-12), included for comparative purposes.

Our observations suggest that clonal complex Pen6B-B may be endemic in Porto

Alegre city. Additionally, comparative studies with serotype 6B isolates from the

states of Rio de Janeiro and Sao Paulo are currently being performed in our

laboratories, and indicate the frequent occurrence of CC Pen6B-B in these other

Brazilian areas. Therefore, Pen6B-B may be a highly adapted clonal complex,

disseminated in different Brazilian areas. Brandileone et al.2 (1998) also described

a CC observed in different Brazilian states, which was characterized by comprising

serotype 6B isolates presenting intermediate resistance to penicillin, recovered

from 1993 to 1996. This clonal group was also considered unique among isolates

from Brazil 2 and may correspond to the CC found in the present work. Studies are

currently in progress for further detailed characterization of CC Pen6B-B.

Another major CC, arbitrarily named as Pen14-H, was also found among the

serotype 14 isolates studied (Figure 5), being composed by PNSSP isolates.

Penicillin-resistant serotype 14 isolates from other Brazilian states, included for

comparative purposes, were also included in CC Pen14-H. PFGE profiles of

isolates composing this CC were also closely related to the PFGE profile of the

international clone Spain9V-3 reference strain. A few penicillin-resistant isolates

were included in other distinct CCs of lower frequencies (named as Pen14-A and

Pen14-I), while penicillin-susceptible serotype 14 isolates showed considerable

genetic diversity.

130

The genetic diversity of PNSSP belonging to serotype 14 isolated in Brazil

has been previously investigated. However, in contrast with our findings, serotype

14 isolates were found to present considerable genetic diversity in a nationwide

study and only 2 isolates with penicillin MIC ≥2.0 ug/ml, both from São Paulo city,

were recognized as belonging to the Spain9V-3 international clone (Brandileone et

al., 1998). In another study involving isolates from patients with meningitis in

Salvador, Northeast Brazil, serotype 14 isolates with intermediate resistance to

penicillin were shown to have similar profiles by BOX-PCR (Ko et al., 2000), but

recognition of international clones was not performed.

Our observations have several points in common with those resulting from

studies done with pneumococcal isolates from Argentina (Rossi et al., 1998) and

Uruguay (Camou et al. 1998), two countries located in the neighborhoods of Rio

Grande do Sul state. In both of these studies, isolates showing penicillin resistance

(MICs≥2.0 ug/ml) were included in a single major clone, which was found to be

identical to the Spain9V-3 clone. Additionally, in accordance with our results, an

inverse relationship between penicillin resistance and genetic diversity among

serotype 14 pneumococcal isolates was detected.

The occurrence of the Spain9V-3 clone, as the originally reported serotype

9V variant or as the serotype 14 variant, has already been documented in several

countries in Europe, Asia, North America and South America

(www.sph.emory.edu/PMEN/). Considering this and our results indicating a rise in the

occurrence of penicillin-resistant serotype 9V, and especially the emergence of

high level resistance, in the period of 2000-2004, we have also included serotype

9V isolates in PFGE experiments. PFGE profiles of the serotype 9V PNSSP

131

isolates tested were highly related to those of serotype 14 isolates included in CC

Pen14-H, indicating that they also belong to the international clone Spain9V-3 (Fig.

6). These observations suggest that the Spain9V-3 clone was initially introduced in

the Porto Alegre area as a serotype 14 variant, and more recently both variants

(serotype 14 and serotype 9V) are circulating in that area. It is probable that

isolates expressing capsular type 9V have been introduced latter and became well

adapted in the region. Cefotaxime resistant isolates belonging to this clone and

expressing serotype 14, were previously described in Brazil (Castanheira et al.,

2003) and we observed that isolates of both serotypes 9V and 14, related to the

Spain9V-3 clone, showed resistance to another third generation cephalosporin,

ceftriaxone.

In order to confirm the identity of CC Pen14-H as belonging to the Spain9V-3

international clone, MLST experiments were performed with 9 representative

isolates. They all belonged to a single MLST profile (7, 11, 10, 1, 6, 8 e 1),

corresponding to ST 156, confirming the evidence of those isolates as being

related to the internationally spread Spain9V-3 clone.

In summary, the emerging and spread of antimicrobial resistance among S.

pneumoniae is a global problem and a matter of major concern, due to the high

morbidity and mortality still attributed to pneumococcal infections. Periodic

surveillance in different regions is important to base more adequate treatment and

prevention measures. In the present report we present data on antimicrobial

susceptibility and serotype distribution among pneumococcal isolates recovered

over a period of 10 years in a large metropolitan area in the South of Brazil. We

have documented the prevalence of 2 major clonal complexes among the

132

predominant serotypes that may be associated with the increasing occurrence of

penicillin resistance among S. pneumoniae in that area. One of these clonal

complexes was detected among serotype 14, and, more recently, also among

serotype 9V PNSSP isolates, and was identified as corresponding to the

international clone Spain9V-3. The other was a unique clonal complex, yet to be

further characterized, comprising a large proportion of serotype 6B isolates.

133

ACKNOWLEDGMENTS

This study was supported in part by Conselho Nacional de Desenvolvimento

Científico e Tecnológico (CNPq), Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do

Rio de Janeiro (FAPERJ), and Ministério da Ciência e Tecnologia

(MCT/PRONEX), Brazil. We thank Carlos Ausberto B. de Souza, and Filomena

Soares Pereira da Rocha of the Instituto de Microbiologia, Universidade Federal do

Rio de Janeiro, for technical assistance. We also thank Alma Ruth Franklin, and

Terry Thompson of the Centers for Disease Control and Prevention for assistance

with serotyping.

134

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Table 1. Antimicrobial susceptibility among Streptococcus pneumoniae isolated in Porto Alegre city, South region of Brazil

(1995-2004).

Percentage of isolates/ Period of time Antimicrobial agent

1995-1999

2000-2004

Total (1995-2004)

S I R S I R S I R Ceftriaxone PSSP1

PNSSP2 Total

100 100 100

0 0 0

0 0 0

100 94.0 98.0

0

4.3 1.4

0

1.7 0.6

99.2

0.6

0.2 Ceftriaxone (meningitis) PSSP PNSSP Total

100 93.5 98.7

0

6.5 1.3

0 0 0

100 60.7 86.9

0

33.3 11.1

0

6.0 2.0

93.8

5.4

0.8 Chloramphenicol PSSP PNSP Total

99.5 97.8 99.2

- - 0

0.5 2.2 0.8

97.4 99.1 98.0

- - 0

2.6 0.9 2.00

98.7

-

1.3 Erythromycin PSSP PNSSP Total

97.2 87.0 95.8

0 0 0

2.8 13.0 4.2

98.3 92.3 96.3

0.4 1.7 0.9

1.3 6.0 2.8

96.0

0.4

3.6 Penicillin Total

81.0

17.5

1.5

66.7

17.9

15.4

74.9

17.7

7.4

Tetracycline PSSP

92.7

0.8

6.5

85.0

0.9

14.1

141

PNSSP Total

92.4 92.7

0 0.6

7.6 6.7

88.0 86.1

1.7 1.1

10.3 12.8

89.9

0.8

9.3

Vancomycin PSSP PNSSP Total

100 100 100

0 0 0

0 0 0

100 100 100

0 0 0

0 0 0

100 100 100

0

0

1 PSSP, penicillin-susceptible Streptococcus pneumoniae. 2 PNSSP, penicillin-nonsusceptible Streptococcus pneumoniae.

142

142

Table 2. Distribution of serotypes among Streptococcus pneumoniae isolates

from Porto Alegre city, South region of Brazil (1995-2004)

Percentage of isolates/Period of time

Serotype

1995-1999

2000-2004

Total (1995-2004)

Vaccine types 1 a 2.68 3.13 2.94 3 a 6.13 4.56 5.23 4 a b 0.77 1.42 1.14 5 a 2.30 0.28 1.14 6B a b 12.6 5.41 8.50 7F a 0 1.99 1.14 8 a 0.38 1.71 1.14 9N a 0.38 2.85 1.80 9V a b 1.15 6.27 4.08 10A a 1.91 0.85 1.31 11A a 4.21 4.27 4.25 12F a 0 0.57 0.33 14 a b 14.6 19.4 17.3 15B a 3.83 0.57 1.96 17F a 1.53 0 0.65 18C a b 2.68 3.70 3.27 19A a 2.68 1.99 2.29 19F a b 6.90 8.83 8.01 20 a 0.77 0.57 0.65 22F a 2.68 1.14 1.80 23F a b 7.28 6.27 6.70 Total 75.5 75.8 75.7

Vaccine-related types 6A a b 4.21 4.56 4.41 7C a 1.15 1.14 1.14 15A a 0.77 1.71 1.31 15C a 2.70 0.85 1.63 15F a 0 0.57 0.33 18F a b 0 1.99 1.14 19C a b 0.38 0.57 0.49 23B a b 3.45 1.14 2.12 Othersc 0.38 1.99 1.31 Total 13.0 14.5 13.9

143

143

Vaccine-unrelated types 13 2.30 2.56 2.45 16F 1.53 1.99 1.80 21 0.77 0 0.33 24F 0 0.85 0.49 28A 2.58 0 1.14 29 0.38 0.28 0.33 31 0 0.57 0.33 34 1.91 0.57 1.14 35B 0.77 0.28 0.49 35F 0 1.13 0.65 Othersd 0.77 0.57 0.65 Total 11.1 8.83 9.80 Nontypeable 0.38 0.85 0.65

Total

100.0

100.0

100.0

a Serotypes included in (or related to) the 23- valent vaccine. b Serotypes included in (or related to) the 7- valent vaccine. C Includes one each of serotypes 7A, 7B, 10C, 11D, 12B, 18A, 18B, and 23A. d Includes one of each serotypes 24B, 28F, 35A, and 40.

144

144

Figure 1. Probable events related to the introduction and dissemination of international clone Spain9V-3 in Porto Alegre, RS, Brazil.

Brazil

Argentina

Uruguay

Porto Alegre

Brazil

Argentina

Uruguay

Porto Alegre

1. Introduction of penicillin resistant Spain9V-3 clone (as serotype 14 variant) to Uruguay and Argentina

2. Dissemination of the clone Spain9V-3 to the Southern region of Brazil and increase in penicillin resistance

3. Emergence of 9V variant of the same clone

145

145

Figure 2. Penicillin resistance among the 15 most frequent serotypes of Streptococcus pneumoniae from Porto Alegre, Brazil, in two periods of time (1995-1999 and 2000-2004).

0

5

10

15

20

1 3 6A 6B 9N 9V 11A 13 14 18C 19A 19F 22F 23B 23F

Susceptible Intermediate Resistant

0

5

10

15

20

1 3 6A 6B 9N 9V 11A 13 14 18C 19A 19F 22F 23B 23F

Susceptible Intermediate Resistant

1995-1999

2000-2004

146

146

Figure 3. PFGE fragmentation profiles obtained after SmaI digestion of chromosomal DNA

of serotype 6B Streptococcus pneumoniae isolates from Porto Alegre, RS, Brazil

Sp936Sp966Sp1036Sp986Sp1029Sp924Sp928Sp929Sp953Sp1037Sp942Sp1026Sp927Sp932Sp1002Sp930Sp955Sp917

1009080706050

147

147

Figure 4. PFGE profiles representative of clonal complex Pen6B-B, obtained after SmaI

digestion of chromosomal DNA of penicillin-resistant serotype 6B Streptococcus

pneumoniae isolates from Porto Alegre, RS, Brazil.

MM: molecular mass; 1-6: Pen6B- B

48.5

145.5 242.5

Kb MM 1 2 3 4 5 6

Pen6B-B

148

148

Figure 5. PFGE fragmentation profiles obtained after SmaI digestion of chromosomal DNA

of serotype 14 Streptococcus pneumoniae isolates from Porto Alegre, RS, Brazil.

Sp995Sp996Sp979Sp 1101Sp775Sp1025Sp886Sp933Sp1022Sp1010Sp1001Sp985Sp1040Sp947Sp997Sp948Sp967Sp1003

149

149

Figure 6. A. PFGE fragmentation profiles most frequently found among serotypes 9N, 9V,

and 14 Streptococcus pneumoniae isolates from Porto Alegre, Brazil, and comparison with

PFGE profile of the internationally spread clone Spain 9V -3.

B. Dendrogram resulting from computer assisted analysis of profiles in panel A.

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Sp 1654Sp 1922CDC 195Sp 1596Sp 1883Sp 1608Sp 858Sp 1735Sp 1570Sp 1575Sp 1726Sp 1767Sp 60

100908070605040

Lines 1 and 15, Molecular Mass 100kb; 2, Sp 1570 (St 14, PnR); 3, Sp 1575 (St 14, PnS); 4, Sp 1726 (St 9N, PnS); 5, Sp 1767 (St 9N, PnS); 6, Sp 60 (St 9N, PnR); 7, CDC 195 (Spain9V-3); 8, Sp 1654 (St 14, PnR, clone PenH); 9, Sp 1922 (St 14, PnR, clone PenH); 10, Sp 1608 (St 14, PnR, clone PenH); 11, Sp 858 (St 9V, PnR); 12, Sp 1735 (St 9V, PnR); 13, Sp 1596 (St 9V, PnR); 14, Sp 1883 (St 9V, PnS). Abbreviations: St (serotype); PnS (penicillin susceptible); PnR (penicillin resistant)

48.5

145.5 242.5

Kb

150

150

Manuscrito 2

Mendonça-Souza, C.R.V.; Carvalho, M.G.S.; Barros, R.R.; Dias, C.A.; Sampaio,


characteristics of erythromycin-resistant Streptococcus pneumoniae strains isolated in

three major Brazilian states. Microbial Drug Resist. 10: 313-320.

151

151

152

152

153

153

154

154

155

155

156

156

157

157

158

158

159

159

Manuscrito 3

Dias, C.A.G.; Agnes, G.; Frazzon, A.P.G.; Kruger, F.D.; d'Azevedo, P.A.; Carvalho,

M.G.; Facklam, R.R.; & Teixeira, L.M. 2007. Diversity of mutations in the atpC gene

coding for the c subunit of F0F1 ATPase in clinical isolates of optochin-resistant

Streptococcus pneumoniae from Brazil. J. Clin. Microbiol. 45: 3065-3067.

160

160

161

161

162

162

163

163

Manuscrito 4

Dias, C.A.G.; Teixeira, L.M.; Carvalho, M.G. & Beall, B. 2007. Sequential multiplex PCR

scheme for determining capsular serotypes of pneumococci recovered from Brazilian

children. J. Med. Microbiol. 56: 1185-1188.

164

164

165

165

166

166

167

167

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