Instruções de Uso XGEN MULTI SEPSE CHIP HS24 · Enterococcus spp. Acinetobacter ... 2....

Instrução de Uso_XG-MULTI-SEPSE_HS24_Rv.00_OUT.2016

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Instruções de Uso

XGEN MULTI SEPSE CHIP HS24

Kit MULTIPLEX para detecção de patógenos causadores de SEPSE e genes de

resistência através de PCR e hibridização reversa

1. USO PRETENDIDO

O Kit MULTIPLEX SEPSE CHIP é um teste qualitativo in vitro que detecta

simultaneamente a presença de ácido nucleico bacteriano e fúngico, além dos

principais genes de resistência a antibióticos em amostras de hemoculturas

positivas e swabs retais, sem a necessidade da extração de DNA. Atua como

auxílio para a avaliação de infecções de mais de 36 espécies que levam a

quadros de SEPSE como: Staphylococcus Coagulase Negativa, Staphylococcus

aureus, Streptococcus spp., Streptococcus pneumoniae, Streptococcus

agalactiae, Listeria monocytogenes, Enterococcus spp., Pseudomonas

aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Neisseria meningitidis,

Stenotrophomonas maltophilia, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Serratia

marcescens, espécies de Enterobacteriaceae e Proteus spp, Candida albicans,

Candida spp., e 20 marcadores de genes de resistência a antibióticos: meticilina

(mecA), dois genes para resistência à vancomicina (vanA e vanB), dois para a

resistência aos antibióticos β-lactamase (blaSHV, blaCTX-M) e quinze genes

para a resistência ao carbapenemase (kpc, sme, nmc/imi, ges, vim, gim, spm,

ndm, sim, imp, oxa23, oxa24, oxa48, oxa51 e oxa58).

Patógenos Alvo

Staphylococcus Coagulase-Negativa Streptococcus spp.

Streptococcus agalactiae Listeria monocytogenes

16S rDNA

Enterococcus spp. Acinetobacter baumannii

Neisseria meningitidis Stenotrophomonas maltophilia

Escherichia coli Serratia marcescens Enterobacteriaceae

Proteus spp.

Staphylococcus aureus nuc

Streptococcus pneumoniae cpsA

Pseudomonas aeruginosa ecfX

Klebsiella pneumoniae khe

Candida spp. Candida albicans

18S-5.8S ITS rDNA

O kit foi otimizado para uso nos aparelhos HybriSpot 12 (HS12) e HybriSpot

24 (HS24) Vitro Group®.

PRODUTO PARA DIAGNÓSTICO DE USO IN VITRO.

ATENÇÃO: Esta Instrução de Uso é destinada para orientar o uso com o

HybriSpot 24. Para utilização do protocolo com o equipamento HybriSpot 12,

verificar a Instrução de Uso “KIT XGEN MULTI SEPSE CHIP HS12”.

2. INTRODUÇÃO

A SEPSE é uma disfunção orgânica potencialmente fatal causada por

uma resposta imune desregulada a uma infecção. Normalmente causada por

bactérias, fungos, vírus ou protozoários. Pode estar relacionada a qualquer foco

infeccioso, como pneumonia, infecção intra-abdominal e urinária.

Importante causa de morbidade e mortalidade, principalmente em hospitais

e Unidades de Terapia Intensiva (UTI), pacientes pediátricos e particularmente


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em pacientes debilitados. Além do aumento de incidência de infecções

nosocomiais, a proporção de patógenos multirresistentes também vem

crescendo. As taxas de resistência antimicrobiana entre patógenos estão

aumentando principalmente entre organismos gram-negativos (Pseudomonas

aeruginosa, Acinetobacter baumannii e Klebsiella pneumoniae).

Devido à alta morbimortalidade da SEPSE, é imprescindível sua rápida

identificação. Suas manifestações podem ser confundidas com as de outros

processos não infecciosos ou podem, em muitos casos, passar despercebidas.

Estudos mostram que a rápida identificação da SEPSE associada à terapêutica

adequada, pode trazer resultados favoráveis para o paciente. Para identificação

da SEPSE, deve-se levar em conta um fator de extrema importância: o tempo. O

uso de antimicrobianos específicos na primeira hora, logo após o diagnóstico,

contribui para a sobrevivência do paciente.

3. PRINCÍPIO DO TESTE

O princípio do ensaio é baseado em uma metodologia que envolve

simultaneamente a amplificação multiplex de diferentes bactérias, fungos e

marcadores de genes de resistência a antibióticos por Reação em Cadeia da

Polimerase (PCR) seguido de hibridização reversa (Dot Blot) com sondas

específicas imobilizadas em um chip composto por membrana de nylon

(tecnologia Flow Chip). O processo de hibridização permite a ligação dos

produtos de PCR biotinilados às sondas complementares presentes no chip e o

sinal de hibridização é desenvolvido por uma reação colorimétrica

imunoenzimática (estreptavidina-fosfatase alcalina e cromógeno NBT-BCIP).

A reação substrato-cromógeno gera um precipitado de coloração roxo

escuro na posição em que o fragmento amplificado hibridiza com a sonda

específica e este sinal é automaticamente capturado e analisado pelo software

do equipamento.

4. COMPONENTES PCR

O formato padrão do kit contém reagente e chip para 24 ou 48 testes.

COMPONENTES CONTEÚDO Volume

24 Testes Volume

48 Testes

Primers 1 SPS

Solução de Primers biotinilados para

detecção de Staphylococcus Coagulase Negativo,

Staphylococcus aureus, Streptococcus spp., Streptococcus

pneumoniae, Streptococcus agalactiae, Listeria monocytogenes,

Enterococcus spp., Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter

baumannii, Neisseria meningitidis, Stenotrophomonas maltophilia,

Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens, espécies de Enterobacteriaceae e

Proteus spp, Candida albicans, Candida spp, e os genes mecA,

vanA, vanB, blaSHV, blaCTX-M e Controle Interno (CI).

950 µL 2 x 950 µL

Primers 2 SPS

Solução de Primers biotinilados para

detecção de genes de resistência para carbapenemicos como kpc,

sme, nmc/imi, ges, vim, gim, spm, ndm, sim, imp, oxa23, oxa24,

oxa48, oxa51, oxa58 e Controle exógeno.

950 µL 2 x 950 µL

EZ SPS Enzima DNA Polimerase Hot Start 24 µL 2 x 24 µL

UDG SPS Enzima Uracila DNA Glicosilase 34 µL 2 x 34 µL

* Cada frasco contém um volume adicional para imprecisão de pipetagem.


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5. COMPONENTES DE HIBRIDIZAÇÃO

COMPONENTES CONTEÚDO Volume

24 Testes Volume

48 Testes

Reagente A Solução de Hibridização 60 mL 115 mL

Reagente B Solução de Parada de Reação 10 mL 18 mL

Reagente C Estreptavidina-Fosfatase

Alcalina 10 mL 18 mL

Reagente D Tampão de lavagem I 35 mL 70 mL

Reagente E1 Substrato 14 mL 20 mL

Reagente E2 Cromógeno 14 mL 20 mL

Reagente E Frasco vazio para preparo do

Reagente E (E1 + E2) - -

Reagente F Tampão de Lavagem II 18 mL 35 mL

Chip SPS Chip SEPSE 24 unidades 2 x 24

unidades

6. ARMAZENAMENTO E ESTABILIDADE

Reagentes de PCR: Os componentes do kit devem ser armazenados na

embalagem original. Armazenar a temperatura de -20°C. Decongelar os

componentes em gelo antes do uso. Os reagentes são estáveis até a data de

vencimento indicada no rótulo. Evitar o congelamento e o descongelamento

dos reagentes por mais de cinco vezes, pois pode reduzir a sensibilidade do

ensaio. Para evitar o congelamento e descongelamento repetidas vezes é

recomendado adicionar a cada Primers (1 e 2) a EZ e a UDG, e

subsequentemente aliquotar as misturas (36 µL/alíquota) em microtubos de

PCR 0,2 mL e armazenar a -20°C em período máximo 3 de meses.

Reagentes de Hibridização: Os componentes do kit devem ser armazenados

entre 2°C a 8°C. Não congelar. Os reagentes e o chip são estáveis até a data de

vencimento indicada no rótulo. A solução de desenvolvimento (Reagente E)

deve ser preparada somente antes do uso. A Solução de Hibridização (Reagente

A) deve ser levada a 51°C antes do uso e os outros reagentes devem ser

utilizados a temperatura ambiente (20°C a 25°C).

7. MATERIAIS NECESSÁRIOS, MAS NÃO FORNECIDOS

Reagentes para purificação de DNA (se necessário);

Micropipetas calibradas (0,5 µL < volume < 1000 µL);

Microcentrífuga;

Banho Maria (51°C);

Equipamento para Hibridização HybriSpot 24 e software HybriSoft;

Racks para microtubos;

Rack termostável (4°C) para tubos/placas de PCR;

Ponteiras estéreis com e sem filtro;

Microtubos 1,5 - 2,0 mL livres de nucleases;

Strips/Microtubos/Microplacas de PCR HS24;

Luvas descartáveis sem talco;

Termociclador;

Agitador tipo vortex ou similar.

8. AVISOS E PRECAUÇÕES

1. O kit deve ser utilizado somente por pessoal técnico qualificado e

devidamente treinado.

2. O pessoal técnico deve ser profundamente treinado na manipulação

de reagentes de biologia molecular e qualificados em protocolos de

amplificação de PCR.


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3. Todo o pessoal envolvido na execução do teste deve utilizar

equipamentos de proteção individual. O uso de objetos perfuro-cortantes deve

ser evitado. Além disso, todos devem ser treinados em procedimentos de

biossegurança, como recomendado pela legislação em vigor.

4. Os responsáveis pelo manuseio de amostras devem ser vacinados

contra tétano, difteria, hepatite B e os estabelecidos no PCMSO, de acordo com

a Norma Regulamentadora 32.

5. O ambiente do laboratório deve ser controlado, a fim de evitar

contaminantes como poeira ou agentes microbianos transportados pelo ar.

6. Evitar vibração na superfície da bancada onde o teste é realizado.

7. Após o recebimento, armazenar o kit de PCR a -20°C, em um freezer ou

câmara fria com temperatura controlada e o kit de hibridização em geladeira de

2 a 8°C.

8. Não trocar os componentes entre diferentes lotes dos kits.

Recomenda-se que os componentes entre dois kits do mesmo lote também não

sejam trocados.

9. Verificar se os reagentes estão limpos e não contém partículas visíveis

pesadas ou grumos. Caso contrário, comunicar o supervisor do laboratório para

iniciar os procedimentos necessários para reposição do kit.

10. Evitar contaminação cruzada das amostras utilizando ponteiras

descartáveis e trocando-as após cada amostra.

11. Evitar contaminação cruzada entre os reagentes do kit utilizando

ponteiras descartáveis e trocando-as entre o uso de cada uma.

12. Não utilizar o kit após a data de validade apresentada na etiqueta

externa.

13. Tratar todas as amostras como potencialmente infectantes. Todas as

amostras de soro humano, sangue, plasma devem ser manuseadas em Nível de

Biossegurança 2, como recomendado pela legislação em vigor.

14. Armazenar e extrair as amostras separadamente de outros reagentes e

utilizar sala dedicada para o manuseio.

15. Realizar os procedimentos o mais rápido possível, mantendo os

componentes de PCR no gelo ou em reservatório refrigerado.

16. O fluxo de trabalho no laboratório deve proceder de maneira

unidirecional, começando na área de extração (quando aplicável) e passando

para a amplificação e área de análises de dados. Não retornar as amostras,

equipamentos e reagentes para a área onde as primeiras etapas foram

realizadas.

17. O uso de plásticos descartáveis é recomendado na preparação dos

componentes líquidos ou na transferência dos componentes para sistemas

automatizados, a fim de evitar contaminação cruzada.

18. Os resíduos gerados durante a utilização do kit devem ser descartados,

de acordo com as diretrizes e regras de descarte de resíduos químicos e

substâncias biológicas do laboratório, conforme legislação em vigor.

19. Outros resíduos gerados (exemplo: ponteiras usadas para amostras)

devem ser manuseados como potencialmente infectantes e descartados, de

acordo com as diretrizes e regras relativas a resíduos laboratoriais.

20. Os respingos provocados acidentalmente durante o manuseio das

amostras devem ser absorvidos por lenços de papel umedecidos com

hipoclorito, e em seguida, com água.

9. AMOSTRAS: PREPARAÇÃO E RECOMENDAÇÕES

O ensaio deve ser utilizado com amostras diluídas de hemocultura positiva e

swabs retais de origem humana. Recomenda-se que as amostras de

hemocultura fiquem armazenadas a -20°C por até uma semana.


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OBSERVAÇÃO IMPORTANTE: Para utilização do kit com outras amostras

deverá ser realizada a validação para confirmar que os requisitos necessários

para a finalidade pretendida são atendidos.

10. PREPARAÇÃO DOS COMPONENTES E AVISOS

Reagentes de PCR

Soluções prontas para uso. Antes de utilizar, homogeneizar em agitador tipo

vortex e centrifugar brevemente (pulso) para concentrar o componente no

fundo do tubo.

A fim de evitar repetidos descongelamentos, recomenda-se aliquotar os

Primers 1 e 2 SPS com as enzimas EZ SPS e UDG SPS, de acordo com a tabela do

item 13. Fracionar em 36 µL/alíquota e armazenar por no máximo 3 meses.

Nota: O descongelamento de todos os componentes deve ser realizado no

gelo.

Reagentes A, B, C, D e F (Hibridização)

Reagentes prontos para uso.

Reagente E (Hibridização)

A solução é fornecida em dois reagentes (Reagente E1 e E2) que devem ser

misturados numa proporção de 1:1. Preparar a solução de acordo com a

quantidade de amostras que serão processadas, antes da sua utilização, no

frasco “E”. Após cada uso, limpar o frasco “E” com água destilada para evitar

acúmulo de precipitados em utilizações consecutivas.

Seguir a tabela de acordo com o item – Reação de Hibridização/

Hibridização – tópico 2.

Chip (Hibridização)

Os chips são de uso único e devem ser manuseados com luvas.

Nunca tocar a membrana do chip. Para o manuseio, tocar somente na

lateral do chip.

11. EQUIPAMENTOS E FERRAMENTAS USADOS EM COMBINAÇÃO COM O

KIT

1. Micropipetas

As micropipetas devem ser calibradas para distribuir o volume correto

necessário para o teste e devem ser submetidas a regulares descontaminações

das partes que podem acidentalmente entrarem em contato com a amostra.

Elas devem ser certificadas e devem estar com seus certificados válidos a fim de

mostrar precisão de 1% e uma exatidão de +/- 5%.

2. Termociclador

O Kit MULTIPLEX SEPSE CHIP é direcionado para uso em combinação para

qualquer termociclador convencional.

3. HybriSpot 24

O Kit MULTIPLEX SEPSE CHIP foi otimizado para uso nos aparelhos

HybriSpot 12 (HS12) e Hybrispot 24 (HS24) Vitro Group®.

ATENÇÃO: Esta Instrução de Uso é destinada para orientar o uso com o

HybriSpot 24. Para utilização do protocolo com o equipamento HybriSpot 12,

verificar a Instrução de Uso “KIT XGEN MULTI SEPSE CHIP HS12”.

12. CONTROLE PRÉ-ENSAIO E OPERAÇÕES

1. Verificar a data de validade do kit impresso na etiqueta externa da

caixa.


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2. Verificar se os componentes líquidos não estão contaminados por

partículas visíveis a olho nu ou grumos. Observar se há ruptura na caixa de

transporte e se não há derramamento de líquido dentro da caixa.

3. Ligar os equipamentos (termociclador e HybriSpot) e verificar as

configurações. Ter cuidado para usar o protocolo de ensaio correto.

4. Seguir estritamente o manual de equipamentos fornecidos pelo

fabricante para a correta configuração dos termocicladores e HybriSpot.

5. Verificar se as micropipetas estão configuradas para o volume

necessário.

6. Verificar se todos os outros equipamentos estão prontos para uso.

7. Em caso de problemas, não continuar o teste e comunicar ao

supervisor.

13. PROTOCOLO PARA O EQUIPAMENTO HS24

PREPARO DA AMOSTRA

O Kit MULTIPLEX SEPSE CHIP foi otimizado para o uso com amostras

diretas de hemoculturas positivas e swabs retais.

Hemocultura

1. Diluir a hemocultura no formato 1:10 ou 1:100 em água estéril ou soro

fisiológico. A diluição irá depender da taxa de crescimento bacteriano

no sangue de cultura. Para amostras pediátricas é recomendada a

diluição da hemocultura em 1:200 a 1:500.

2. Caso a amostra de hemocultura não seja usada no momento, poderá

ser congelada em uma temperatura de -20°C por até 1 semana.

3. Utilizar 4 µL desta solução para a PCR.

Swab Retal

1. Cortar/quebrar a ponta do swab que contém a amostra coletada em

um microtubo de 1,5 mL;

2. Adicionar 0,5 mL de água estéril ou soro fisiológico;

3. Agitar por alguns segundos em vortex;

4. Realizar diluição da suspenção em 1:10 com água estéril ou soro

fisiológico para reduzir a quantidade de possíveis inibidores;

5. Utilizar 4 µL desta solução para a PCR.

Nota: Caso seja identificada a presença de inibidores, recomendamos

a purificação da suspenção inicial pelo método de extração.

A extração de swab retal foi validada para as seguintes marcas:

NucliSENS®easyMag® (bioMérieux S.A.);

MagNa Pure (Roche);

Chelex® (Bio-rad).

OBSERVAÇÃO IMPORTANTE: Para utilização do kit com amostras de swab

em outros kits de extração, deverá ser realizada a validação para confirmar

que os requisitos necessários para a finalidade pretendida são atendidos.

REAÇÃO MULTIPLEX PCR

O preparo das Mix de PCR podem ser realizadas uma única vez ao abrir

o kit ou em cada uso do produto.


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Para preparo da Mix no primeiro uso:

1. Descongelar no gelo os reagentes para a reação: Primers 1 SPS,

Primers 2 SPS, EZ SPS e UDG SPS;

2. Aliquotar os Primers 1 SPS com EZ SPS e a UDG SPS (Mix 1), de acordo

com a tabela abaixo. Realizar o mesmo procedimento para a Mix 2

(Primers 2 SPS + EZ SPS + UDG SPS).

Componente Preparo da Mix 1 Preparo da Mix 2

Primers 1 SPS 950 µl -

Primers 2 SPS - 950 µl

EZ SPS 10,8 µl 10,8 µl

UDG SPS 16,2 µl 16,2 µl

3. Homogeneizar por inversão e centrifugar brevemente;

4. Fracionar as misturas em 36 µL/alíquota em 24 microtubos para PCR

de 0,2 mL e congelar a -20°C.

AVISO: O protocolo descrito neste manual é indicado para utilização em

conjunto com o equipamento HybriSpot 24 da VitroGroup®, por isso,

recomenda-se utilizar Microplacas de PCR com código de barras, Microtubos de

PCR em Strip, tampa para Microtubo em Strip e filme adesivo para Strip (Ref.

MAD-003900P-HS24) do próprio fabricante do equipamento.

Utilização de Mix aliquotada

1. Descongelar uma alíquota do preparo da Mix 1 e outra de Mix 2 por

amostra que for ser testada;

2. Adicionar 4 µL do preparo da amostra em cada microtubo 0,2 mL;

3. Prosseguir com o protocolo de PCR.

Para preparo da Mix no momento do uso

1. Caso os dois Mix sejam preparadas para uso imediato, realizar o

preparo de acordo com a tabela abaixo:

Componente Preparo de Mix 1

(Volume por

amostra)

Preparo de Mix 2

(Volume por

amostra)

Primers 1 SPS 35 µl -

Primers 2 SPS - 35 µl

EZ SPS 0,4 µl 0,4 µl

UDG SPS 0,6 µl 0,6 µl

Amostra 4 µl 4 µl

IMPORTANTE: Todo o processo deve ser realizado em gelo ou rack

termostável para evitar a degradação das Enzimas.

2. Distribuir 36 µL do Mix 1 e do Mix 2 em microplaca PCR ou

strips/microtubos de PCR 0,2 mL por amostra testada;

3. Adicionar 4 µL de preparo da amostra em cada Mix;

4. Colocar todos os microtubos/microplaca de PCR em um termociclador

para a reação de amplificação. O termociclador deve ser programado

conforme abaixo:


8

1 ciclo 25°C 10 min.


40 ciclos

94°C 30 s

55°C 45 s

72°C 1 min.


8°C ∞

Nota: manter os produtos de PCR entre 8 a 10°C assim que a reação

estiver finalizada. As amostras poderão ser hibridizadas

imediatamente ou armazenadas em um freezer de Pós-PCR entre 8°C e

10°C por 1 ou 2 dias. Caso haja necessidade de manter o produto de

PCR por intervalo de tempo maior, armazenar em temperatura de -

20°C.

REAÇÃO DE HIBRIDIZAÇÃO

Nota: todo processo de hibridização, captura de imagens e relatório dos resultados ocorrerá no equipamento HS24 e software HybriSpot.

1. Desnaturar o produto de PCR em termocicador a 95°C por 10 minutos;

2. Preparar o Reagente “E” misturando os Reagentes E1 e E2 de acordo

com a tabela abaixo:

Vol (µL)/1 teste

Vol (µL)/4 testes

Vol (µL)/8 testes

Vol (µL)/12 testes

Vol (µL)/16 testes

Vol (µL)/20 testes

Vol (µL)/24 testes

E1 1.200 1.800 2.300 3.000 3.800 4.200 5.000

E2 1.200 1.800 2.300 3.000 3.800 4.200 5.000

3. Posicionar os chips no HS24.

Nota: utilizar um chip por amostra e posicioná-los de maneira que a primeira fileira inicialmente seja preenchida; só após estar completa, preencher a segunda fileira e posteriormente a terceira; dessa forma, otimiza-se a utilização dos canais de vácuo.

4. Após a desnaturação no termociclador, deixar as amostras no gelo/rack termostável ou no termociclador a 4°C por, pelo menos, 2 minutos;

5. Programar o equipamento seguindo as instruções incluídas no manual do usuário fornecido com o equipamento.

Controles

O chip do Kit XGEN MULTI SEPSE CHIP possui diversos controles para

monitorar os resultados e todas as sondas são duplicadas para garantir a

confiabilidade nos resultados. O controle de hibridização (B) possui cinco

repetições em ordem que permite a orientação adequada para interpretação

do software.


9

14.INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS

14.1. Identificação dos Alvos no Chip

Sonda Controle Sinal Positivo

5 x B Controle de

Hibridização

Indica que o processo de hibridização

funcionou corretamente.

2 x CI

Controle de

Amplificação Exógeno

Indica que a reação de PCR funcionou

corretamente.

Caso um dos sinais de CI seja negativo,

pode indicar a presença de inibidores

de PCR. Neste caso, verificar a

qualidade do processo e das amostras

utilizadas.

2 x BG

Controle de

Amplificação Interno

(β-globina)

Indica que a amplificação funcionou

corretamente e a amostra clínica

contém DNA humano.

1 2 3 4 5 6 7 8

A

B

C

D

E

F

G

H

Instrução de Uso_XG-MULTI-SEPSE_HS24_Rv.01_JUL.2017

10

.

Patógeno/Gene de

Resistência

Sonda Posição no Chip

Streptococcus pneumoniae SPNEU 1F-6J

Stenotrophomonas maltophilia SMALTO 1H – 6D

Candida spp. CAND 1I – 6E

Acinetobacter baumannii ABAU 2B – 7F

Serratia marcescens SMAR/KLEB 2C – 7 G

Klebsiella pneumoniae SMAR/KLEB 2C – 7G -3D – 8I

Klebsiella pneumoniae KLEB 3D – 8I

Streptococcus agalactiae SAGAL 2D – 7H

Staphilococcus Coagulase

Negativo STAPHYL 2E – 7I

Staphylococcus aureus SA 2F – 7J

Escherichia coli* ECOLI 2G-7A

Enterobacteria ENTEROB 2H – 7B

Candida albicans CALB 2J – 7D

Listeria monocytogenes LIS 3A-8F

Enterococcus ENTEROC 3B-8G

Pseudomonas aeruginosa PAER 3C-8H

Streptococcus spp. STREP 3E- 8J

Neisseria meningitidis NEIS 3F-8K

Proteus spp. PROT/MOR 3G-8E

Morganella morganii PROT/MOR 3G-8E-2H-7B

Meticilina resistente - Gene mecA mecA 3I-8C

Vancomicina resistente – Gene

vanA vanA 3J-8B

Vancomicina resistente – Gene

vanB vanB 3K-8A

Carbapenemase Classe A KPC kpc 4A-9E

Carbapenemase Classe A SME sme 4B-9G

Carbapenemase Classe A NMC/IMI nmc/imi 4C-9H

Β-LACTAMASE SHV blaSHV 4E-9J

Β-LACTAMASE de Amplo espectro

CTX-M blaCTX 4F-9K

B CI BG

Posição no Chip 1A – 1B – 2K –

6F- 10A 1C- 6G 1D – 6H

Resultados

Negativos

1A – 1B – 2K –

6F- 10A 1C- 6G 1D – 6H

Resultados Não

Validos

(Inibidores de

PCR)

1A – 1B – 2K –

6F- 10A -- --

Resultados

Negativos

(Ausência de Controles do ensaio

DNA)

1A – 1B – 2K –

6F- 10A 1C- 6G --

Falha de

Hibridização -- -- --


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Carbapenemase Classe A GES ges 4G-9B

Carbapenemase Classe B VIM vim 4H-9C

Carbapenemase Classe B GIM gim 4I-9D

Carbapenemase Classe B SPM spm 5A-9E

Carbapenemase Classe B NDM ndm 5B-10G

Carbapenemase Classe B SIM sim 5C-10H

Carbapenemase Classe B IMP3 imp 5D-10I

Carbapenemase Classe D OXA23 oxa23 5G-10B

Carbapenemase Classe D OXA24 oxa24 5H-10C

Carbapenemase Classe D OXA48 oxa48 5I-10D

Carbapenemase Classe D OXA51 oxa51 5J-10E

Carbapenemase Classe D OXA58 oxa58 5K-10F

Nota: O Kit MULTIPLEX SEPSE CHIP não é capaz de distinguir Escherichia coli de

Shigella spp. Quando o paciente estiver sob suspeita clínica de sepse e o

resultado for positivo para Escherichia coli, a possível infecção por Shigella spp

deve ser considerada.

14.2 Análise dos Resultados

1. Quando uma amostra é positiva para S.pneumoniae, duas sondas

diferentes podem ser positivas, SPNEU: específica para S.pneumoniae e

STREP: genérica para o gênero Streptococcus. Porém, não se pode

descartar a possibilidade de co-infecção com Streptococcus spp. de

diferentes espécies.

2. Quando uma amostra é positiva para S.agalactiae, duas sondas podem

ser positivas, SGAL: específica para S.agalactiae e STREP: genérica para

o gênero Streptococcus. Porém, não se pode descartar a possibilidade

de co-infecção com Streptococcus spp. de diferentes espécies.

3. Quando uma amostra é positiva para S.aureus, duas sondas diferentes

podem ser detectadas na membrana SA: específica para S.aureus e

STHAPHYL: genérica para o gênero Staphylococcus. Porém, não se pode

descartar a possibilidade de co-infecção com o Staphylococcus

Coagulase Negativo.

4. Quando uma amostra for positiva apenas para a sonda STAPHYL,

somente mecA, ou para as duas sondas a interpretação deve ser

Staphylococcus Coagulase Negativo.

5. O gene de resistência Oxa51 tem sido detectado até agora no

A.baumannii, E.coli e P.aeruginosa. O Acinetobacter baumannii contém

o gene de resistência Oxa51 cromossomicamente, enquanto na E.coli e

P.aeruginosa está presente como DNA plasmidial. Quando uma

amostra é positiva para A.baumannii, duas sondas devem ser positivas

no Chip, ABAU e Oxa51. No entanto, algumas mutações na região 16S

do A.baumannii foram descritas, que correspondem à região onde a

sonda ABAU está localizada. Portanto, se for observado apenas o sinal

positivo para Oxa51, sem qualquer sinal de sondas específicas para

A.baumannii, E.coli ou P.aeruginosa pode corresponder a uma mutação

da região 16S da A.acinetobacter. Neste caso é recomendado identificar

o patógeno por um método secundário.

6. Quando a amostra for positiva para K.pneumoniae, E.coli, S.marcescens

ou Morganella morganii duas sondas diferentes serão positivadas no

Chip:

a) A sonda específica para cada bactéria (KLEB, ECOLI, SMAR/KLEB,

PROT/MOR);

b) Sonda genérica pra Enterobacteriaceae (ENTEROB);


12

Uma vez que a sonda Enterobacteriaceae foi validada para detectar

outras Enterobactérias como Citrobacter, Salmonella, K.oxytoca e

Enterobacter, uma possível co-infecção com diferentes Enterobactérias

diferentes de K.pneumoniae, E.coli, S.marcescens ou Morganella

morganii não pode ser excluído.

7. A sonda PROT/MOR pode detectar Proteus mirabilis e Morganella

morganii. Em uma amostra com infecção única com qualquer um

destes dois patógenos, a distinção pode ser feita porque a Morganella

morganii também é detectada pela sonda ENTEROB, enquanto a

Proteus mirabillis não é. No entanto, não há como distinguir Morganella

morganii de amostras que apresentam co-infecção com Proteus e outra

Enterobactéria.

8. A sonda SMAR/KLEB pode detectar K.pneumoniae e S.marcescens. Em

uma amostra com infecção única com qualquer um destes dois

patógenos, a distinção pode ser realizada porque o K.pneumoniae

também terá sinal positivado para a sonda específica KLEB, enquanto a

S.marcescens terá sinal positivado apenas para a sonda SMAR/KLEB. No

entanto, não se pode distinguir K.pneumoniae a partir de uma amostra

que apresenta uma co-infecção com K.pneumoniae e S.marcescens.

9. SHV-1 é uma β-lactamase de baixo espectro encontrado com maior

frequência (até 80 a 90%) em Klebsiella pneumoniae. Por esta razão,

quando a amostra for positiva para K.pneumoniae, normalmente o

gene SHV também será detectado. Neste caso a presença do gene não

corresponde necessariamente a uma evidência fenotípica de produção

de β-lactamase.

10. Devido à elevada sensibilidade do método, um sinal fraco das sondas

para Enterobactéria e P.aeruginosa pode ser observada devido aos

vestígios de DNA microbiano da Taq DNA Polimerase. Outros sinais

fracos das sondas para Staphylococcus spp. e Streptococcus spp. podem

aparecer devido a contaminações durante a manipulação da amostra.

Bacteremias normalmente são ocasionadas por um único patógeno. As

vezes é possível detectar dois ou três microrganismos em culturas de sangue,

nestes casos um destes organismos deve ser considerado como o agente

causador da infecção e os outros microrganismos devem ser associados com

possíveis contaminações durante a manipulação da amostra.

14. SENSIBILIDADE ANALÍTICA

O limite de detecção para cada patógeno foi calculado. A sensibilidade

analítica foi realizada utilizando diluições em série de DNA genômico de cada

cepa para os patógenos incluídos no painel contendo 10 ng de DNA genômico

humano. Cada amostra foi repetida entre 5 e 14 vezes para calcular a

sensibilidade, especificidade e intervalo de confiança. Todos os produtos de

PCR foram hibridizados com a plataforma hybriSpot. Os resultados foram

analisados com o software hybriSoft e um cut-off de 4 (intensidade cinza) foi

estabelecido para a positividade.

Patógeno Sonda GE/

reação

Positivo/

Testados

Sensibilida

de

Intervalo

de

Confiança

95%

Especif

icidade

Intervalo

de

Confiança

95%

S.

epidermidis

mecA 10 14/14 100% 78,5%-

100%

100% 98,1%-

99,9%

mecA 100 14/14 100% 78,5%-

100%

100% 98,1%-

99,9%

STAPHYL 10 10/14 71% 45,4%-

88,3%

100% 98,7%-

100%

STAPHYL 100 14/14 100% 78,5%- 100% 98,7%-


13

100% 100%

S. aureus

SA 10 14/14 100% 78,5%-

100%

100% 98,8%-

100%

SA 100 6/6 100% 61%-

100%

100% 98,8%-

100%

STAPHYL 10 2/14 14% 4%-39,9% 100% 98,7%-

100%

STAPHYL 100 6/6 100% 61%-

100%

100% 98,7%-

100%

S.

pneumoniae

SPNE 10 14/14 100% 78,5%-

100%

100% 98,8%-

100%

SPNE 100 6/6 100% 61%-

100%

100% 98,8%-

100%

STREP 10 13/14 93% 68,5%-

98,7%

96%* 93,1%-

97,7%

STREP 100 6/6 100% 61%-

100%

96%* 93,1%-

97,7%

S. agalactiae

SAGAL 50 14/14 100% 78,5%-

100%

100% 98,8%-

100%

SAGAL 100 6/6 100% 61%-

100%

100% 98,8%-

100%

L.

monocytoge

nes

LIS 10 14/14 100% 78,5%-

100%

100% 98,6%-

100%

LIS 100 6/6 100% 61%- 100% 98,6%-

100% 100%

E. faecalis ENTEROC 10 2/14 14% 4%-39,9% 100% 98,6%-

100%

ENTEROC 100 14/14 100% 78,5%-

100%

100% 98,6%-

100%

E. faecium

ENTEROC 50 4/6 67% 30%-

90,4%

100% 98,6%-

100%

ENTEROC 100 14/14 100% 78,5%-

100%

100% 98,6%-

100%

P.

aeruginosa

PAER 10 14/14 100% 78,5%-

100%

97%** 94,3%-

98,3%

PAER 100 6/6 100% 61%-

100%

97%** 94,3%-

98,3%

A. baumannii ABAU 10 14/14 100% 78,5%-

100%

100% 98,9%-

100%

ABAU 100 6/6 100% 61%-

100%

100% 98,9%-

100%

N.

meningitidis

NEIS 100 8/10 80% 49%-

94,3%

100% 98,8%-

100%

NEIS 500 10/10 100% 74,2%-

100%

100% 98,8%-

100%

S.

maltophilia

SMALTO 10 14/14 100% 78,5%-

100%

100% 98,8%-

100%

SMALTO 100 5/5 100% 56,5%- 100% 98,8%-


14

100% 100%

E. coli ECOLI 10 14/14 100% 78,5%-

100%

100% 98,6%-

100%

ECOLI 100 6/6 100% 61%-

100%

100% 98,6%-

100%

K.

pneumoniae

KLEB 10 12/14 86% 60,1%-

96%

100% 98,6%-

100%

KLEB 100 6/6 100% 61%-

100%

100% 98,6%-

100%

S.

marcescens

SMAR/KL

EB

10 8/8 100% 67,6%-

100%

100% 98,8%-

100%

SMAR/KL

EB

100 14/14 100% 78,5%-

100%

100% 98,8%-

100%

E. cloacae ENTEROB 10 14/14 100% 78,5%-

100%

97%** 94,3%-

98,5%

ENTEROB 100 6/6 100% 61%-

100%

97%** 94,3%-

98,5%

P. mirabilis PROT/M

OR

10 17/17 100% 81,6%-

100%

100% 98,8%-

100%

PROT/M

OR

100 6/6 100% 61%-

100%

100% 98,8%-

100%

C. albicans CALB 10 14/14 100% 78,5%-

100%

100% 98,9%-

100%

CALB 100 6/6 100% 61%- 100% 98,9%-

100% 100%

CAND 10 14/14 100% 78,5%-

100%

100% 98,9%-

100%

CAND 100 6/6 100% 61%-

100%

100% 98,9%-

100%

* Os 96% de especificidade da sonda STREP podem ser devidos a

contaminação por vestígios de DNA de Streptococcus spp. durante a

manipulação de amostras de sangue ou reagentes e plásticos.

** Os 97% de especificidade para as sondas PAER e ENTEROB decorrem da

presença de DNA microbiano contaminante em preparações comerciais de

DNA-polimeresas termostáticas. Em geral, pensa-se que algum passo (s) na

purificação, ou reagente adicionado à enzima, são as fontes dessa

contaminação bacteriana. Os alinhamentos de sequências de DNA de três

polimerases Taq mostram DNA bacteriano contaminante: espécies de

Pseudomonas, Serratia marcescens e outras "fitobactérias", Escherichia coli,

Salmonella e Shigella.

15. SOLUÇÕES DE PROBLEMAS

PROBLEMA CAUSA SOLUÇÃO

Ausência de Sinal no

Controle de

Hibridização

1-Falha no protocolo de

hibridização;

2-Reagentes fora do

prazo de validade ou

que não foram

devidamente

armazenados;

3- Sondas no Chip,

destruídas por restos

1-Verificar se todos os

reagentes foram

adicionados

corretamente durante o

processo de

hibridização.

Verificar a performance

do equipamento

HybriSpot 24 e repetir o


15

de reagentes

contaminantes nos

poços.

ensaio.

2-Verificar a data de

validade e condições de

armazenamento dos

reagentes e do Chip, e

repetir o ensaio.

3-Caso a

descontaminação da

área de trabalho tenha

sido realizada com água

sanitária, o DNA pode

ter sido degradado.

Limpar a bancada com

água destilada e repetir

o ensaio.

Detecção de Sinal em

Controles Negativos Contaminação na fase

de pré-PCR ou pós-PCR.

Limpar as áreas de

trabalho e repetir o

ensaio.

Ausência de Sinal do

Controle Interno

1-Problemas na

amplificação de PCR;

2-Presença de

inibidores de PCR na

amostra.

1-Verificar se o

termociclador está

programado

corretamente. Verificar

se a reação de PCR foi

preparada

corretamente e repetir

o ensaio;

Ausência de sinal do

Controle Endógeno

1-Quantidade

insuficiente de DNA na

1-Repetir o ensaio

utilizado uma

amostra clínica;

2-Presença de

inibidores de PCR na

amostra.

quantidade maior de

amostra ou diminuindo

a diluição inicial. No

entanto, não utilizar

diluições menores que

1:10 para culturas de

sangue.

Presença de

precipitados

cromogênicos no Chip

após o protocolo de

hibridização

1- O Reagente E (E1 +

E2) não ter sido

preparado próximo de

sua utilização;

2-O frasco do reagente

E pode conter resíduos

de protocolos

anteriores.

1-Preparar o Reagente

E pouco antes de seu

uso e repetir o ensaio.

2-Limpar o frasco do

Reagente E após cada

uso com água destilada

para evitar o acúmulo

de reagente. Repetir o

ensaio.

Sinal fraco de

Hibridização

1-Reagentes de PCR

e/ou Hibridização fora

do prazo de validade ou

que não foram

devidamente

armazenados. Repetir o

ensaio;

2-O produto de PCR

não foi devidamente

desnaturado antes da

hibridização;

3-Baixa concentração

ou qualidade do DNA

1- Verificar se todos os

reagentes foram

adicionados

corretamente durante o

processo de

hibridização e repetir o

ensaio;

2-Verificar o processo

de hibridização e a

performance do

equipamento HybriSoft

12. Repetir o ensaio;

3-Aumentar a


16

da amostra. quantidade de amostra

ou DNA para a PCR.

16. GARANTIA DA QUALIDADE

A Mobius Life Science fornece garantia de todos os produtos por ela

revendidos dentro dos termos abaixo.

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O produto Kit MULTIPLEX SEPSE CHIP é garantido pela Mobius contra

defeitos de produção pelo período de validade do produto, salvo especificações

em contrário a constar da proposta.

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Todos os produtos com defeitos oriundos de mau uso, imperícia,

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17. INFORMAÇÕES DO FABRICANTE

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18. REGISTRO ANVISA

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19. RESPONSÁVEL TÉCNICA

Flávia Rosenstein Schiel

CRBio-07 34.360/07-D

mailto:[email protected]

Instruções de Uso XGEN MULTI SEPSE CHIP HS24 · Enterococcus spp. Acinetobacter ... 2....

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