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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS ESCOLA DE VETERINÁRIA E ZOOTECNIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL Disciplina: SEMINÁRIOS APLICADOS TÉCNICA DE ELETROFISIOLOGIA EM CARRAPATOS Lorena Lopes Ferreira Orientadora: Profª Drª Lígia Miranda Ferreira Borges GOIÂNIA 2011

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

ESCOLA DE VETERINÁRIA E ZOOTECNIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL

Disciplina: SEMINÁRIOS APLICADOS

TÉCNICA DE ELETROFISIOLOGIA EM CARRAPATOS

Lorena Lopes Ferreira

Orientadora: Profª Drª Lígia Miranda Ferreira Borges

GOIÂNIA 2011

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LORENA LOPES FERREIRA

TÉCNICA DE ELETROFISIOLOGIA EM CARRAPATOS

Seminário apresentado junto à

Disciplina Seminários Aplicados do Programa de Pós-Graduação em

Ciência Animal da Escola de Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal de Goiás.

Nível: Mestrado

Área de concentração: Sanidade Animal, Higiene e Tecnologia de Alimentos

Linha de Pesquisa: Parasitos e doenças parasitárias dos animais

Orientadora: Profª Drª Lígia Miranda Ferreira Borges – IPTSP/UFG Comitê de orientação: Profª Drª Andréa Caetano da Silva – IPTSP/UFG Drª Carla Cristina Braz Louly – PNPD/EVZ/UFG

GOIÂNIA 2011

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SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO .................................................................................................... 1

2 REVISÃO DA LITERATURA ............................................................................... 2

2.1 Sistema nervoso, sensilas e órgãos sensoriais dos carrapatos ....................... 2

2.1.1 Sistema nervoso ............................................................................................ 2

2.1.2 Sensilas e órgãos sensoriais ......................................................................... 3

2.2 Eletrofisiologia .................................................................................................. 8

2.2.1 Eletroantenograma (EAG) x Registro de sensila única................................11

2.2.2 Percepção do estímulo e disparo do potencial de ação .............................. 11

2.2.3 Eletrofisiologia gustativa e olfativa em carrapatos ....................................... 13

2.2.4 Resultados da técnica de RSU .................................................................... 18

3 CONSIDERAÇÕES FINAIS .............................................................................. 20

REFERÊNCIAS .................................................................................................... 21

1 INTRODUÇÃO

Assim como os demais animais, os carrapatos utilizam seus órgãos

sensoriais para a busca de hospedeiros, exploração do ambiente e encontro de

parceiros. Os primeiros estímulos emitidos pelo hospedeiro são sentidos por

receptores (sensilas) mecânicos, térmicos e olfativos localizados principalmente

no primeiro par de patas do carrapato. Para selecionar o hospedeiro e o sítio de

fixação, o odor, a temperatura e os estímulos gustativos são fatores decisivos, e

os receptores que captam estes sentidos estão localizados no tarso e peças

bucais, especialmente nos palpos e quelíceras.

A eletrofisiologia consiste no estudo das propriedades elétricas em

células e tecidos que envolvem o disparo de potenciais de ação quando

estimulados. Nos artrópodes a eletrofisiologia tem uma grande contribuição na

detecção de feromônios e demais substâncias capazes de atuar no

comportamento dos mesmos. Para o registro de sensilas dos carrapatos adota-se

a eletrofisiologia em sensila única (ESU), no qual as sensilas presentes nos

órgãos sensoriais são expostas a estímulos voláteis ou a compostos gustativos.

Os carrapatos causam inúmeros prejuízos aos seus hospedeiros,

desde a espoliação sanguínea e irritabilidade até transmissão de doenças. A

busca por métodos alternativos de controle é constante e desejável, já que o uso

indiscriminado de acaricidas ocasionou o surgimento de cepas cada vez mais

resistentes as bases químicas disponíveis no mercado. A técnica de

eletrofisiologia pode permitir o encontro de substâncias que participam da

ecologia química dos carrapatos. Tais conhecimentos poderiam embasar novas

alternativas viáveis para o controle destes.

O objetivo deste seminário é comentar sobre as quimiossensilas

presentes nos órgãos sensoriais dos carrapatos e descrever os aspectos da

técnica de eletrofisiologia olfativa e gustativa em carrapatos.

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2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 Sistema nervoso, sensilas e órgãos sensoriais dos carrapatos

Os carrapatos, assim como os insetos, se comunicam através de

estímulos químicos e físicos. Compostos que carregam informações químicas

são conhecidos como semioquímicos. Em carrapatos os principais semioquímicos

que participam da sua ecologia são os feromônios (reunião; sexual; agregação;

atração/agregação e fixação) e os cairomônios. Os feromônios são substâncias

que servem para guiar o comportamento de organismos facilitando atividades

vitais e o desenvolvimento fisiológico, secretadas por um indivíduo para o exterior

e recebido por um segundo indivíduo da mesma espécie. Os cairomônios são

substâncias produzidas pelos hospedeiros e percebidas pelos carrapatos para

sua localização (VILELA & DELLA LUCIA, 2001; SONENSHINE, 2006). Sendo

assim, os ectoparasitas desenvolveram quimiossensores no corpo e adaptações

comportamentais essenciais para a busca de seu hospedeiro, alimentação e

encontro de parceiros para a cópula (GUERIN et al., 2000).

2.1.1 Sistema nervoso

O sistema nervoso é o aparelho que regula as relações entre os

organismos e o ambiente e que coordena as ações dos demais órgãos (IVANOV,

1983). Assim como nos demais aracnídeos, os gânglios que compõem o sistema

nervoso central (SNC) do carrapato estão condensados em uma massa

denominada singânglio (BINNINGTON & OBENCHAIN, 1982). Do singânglio

partem nervos que inervam órgãos alvos como, por exemplo, as quelíceras,

palpos e glândulas salivares (SONENSHINE, 1991).

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2.1.2 Sensilas

Carrapatos possuem uma variedade de órgãos sensoriais (Figura 1)

que monitoram o ambiente externo e interno. Os órgãos possuem receptores

celulares, mais conhecidos como sensilas, que estão distribuídos por todo corpo e

apêndices e são classificados de acordo com suas funções (quimiossensila,

mecanossensila, fotossensila e termossensila), sendo que na maioria das vezes

são multifuncionais. Das várias sensilas existentes que detectam uma diversidade

de sinais químicos vindos do ambiente, as mais importantes são as sensilas do

órgão de Haller, as sensilas palpais e as sensilas do dígito da quelícera.

(SONENSHINE, 1991).

FIGURA 1: Localização do órgão de Haller, palpos e quelíceras em um ixodídeo.

Fonte: http://www.nhm.ac.uk/nature-online/species-of-the-day/scientific-

advances/disease/ixodes-ricinus/index.html

As células receptoras correspondem a neurônios bipolares, com dois

processos que se estendem a partir do corpo celular: axônio (processo central)

que se estende para as regiões correspondentes do SNC e o dendrito (processo

periférico) que se estende para a superfície do corpo. Sendo que dendrito possui

um cílio que constitui o aparato perceptivo propriamente dito da célula (SLIFER,

1970; MCIVER, 1975).

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As quimiossensilas estão envolvidas com a percepção do cheiro

(olfação) e gosto (gustação), são determinantes nos comportamentos de busca

pelo hospedeiro e de encontro para a cópula, uma vez que permitem que o

carrapato identifique substâncias que sinalizem a presença do hospedeiro ou do

parceiro sexual. Os estímulos olfativos são mais específicos, enquanto a gustação

é de fundamental importância no comportamento de exploração do hospedeiro,

alimentação e fixação, ou seja, nas etapas que precedem o ingurgitamento e

também na identificação de substâncias tóxicas que poderão interferir no

desenvolvimento do carrapato (WALADDE, 1982).

O sistema gustativo atua com a finalidade de dar o aval para a aceitação

ou rejeição do alimento (SCOTT, 2005). O suor e sebo dos hospedeiros

vertebrados afetam o comportamento de fixação do ectoparasita, e os receptores

que identificam estes produtos situam nas patas e peça bucal (GUERIN et al.,

2000). Cada espécie animal possui uma composição individual dos fluidos

corpóreos. A partir do momento que os carrapatos introduzem as peças bucais no

tegumento de seus hospedeiros, estes quimiorreceptores conseguem identificar

se a composição dos fluidos corresponde à de seu hospedeiro adequado. Deste

modo, as sensilas das quelíceras estão envolvidas especialmente nas fases de

fixação e ingurgitamento do carrapato (WALADDE & RICE, 1982; SONENSHINE,

1991).

As sensilas dos carrapatos seguem o modelo geral dos artrópodes e

podem ser divididas em quatro categorias de acordo com suas características

estruturais: sensila multiporosa com parede simples (SM-PS) e sensila

multiporosa com parede dupla (SM-PD), sensila com poro terminal (SPT) e

sensila sem poros (SSP) (HESS & VLIMANT, 1982, 1986).

As SM-PS apresentam cutícula delgada perfurada por inúmeros poros,

são olfativas mono ou multifuncionais com funções adicionais de termo e

higrossensibilidade. As SM-PD possuem cutícula dupla, função olfativa e podem

ser mono ou multifuncionais. As SPT possuem um único poro terminal ou

subterminal, são receptores mecanogustativos e podem ser sensíveis a

temperatura e água. As SSP não possuem poros ou fendas, são sensilas mono

ou multifuncionais, com possíveis funções mecano, termo e higrossensibilidade

(HESS & VLIMANT, 1982, 1986).

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A principal diferença entre sensilas gustativas e olfativas é quanto a

estrutura e o modo de percepção. As sensilas gustativas usualmente possuem um

único poro em sua ponta, respondem a soluções e requerem grandes

concentrações para detectar a substância. Já as sensilas olfativas possuem

vários poros que facilitam a entrada dos odores e respondem a concentrações

pequenas, diferentemente das sensilas gustativas (WALADDE & RICE, 1982;

SONENSHINE 1991).

2.1.2 Órgãos sensoriais dos carrapatos

O órgão de Haller (Figura 2) está localizado no dorso do tarso no

primeiro par de patas e é englobado por uma cápsula. As principais regiões

sensoriais deste órgão são a cápsula posterior que é exposta através de uma

fenda e uma depressão distal. Possui um pequeno grupo de sensilas olfativas

(Figura 3), cujo número varia entre espécies. A função principal desse órgão

complexo é a olfação, apresenta também mecanossensilas, termossensilas e

sensilas gustativas (SONENSHINE, 1991).

FIGURA 2: órgão de Haller de Ixodes ricinus. Fonte:

http://www.flickr.com/photos/28088928@N07/2668482530/

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FIGURA 3: Diagrama esquemático da morfologia e estrutura do órgão de Haller

de um ixodídeo. Adaptado de: IVANOV & LEONOVICH (1983)

. Os palpos são encontrados na porção anterolateral do capítulo e

consiste em quatro segmentos, sendo que o segmento terminal do palpo tem um

campo sensorial (Figura 4) que fornece informações sobre reconhecimento do

hospedeiro e do parceiro sexual, e melhor local de fixação, ou seja, possui

receptores multifuncionais mecanossensilas/gustativa (SONENSHINE, 1991). As

sensilas palpais estão relacionadas principalmente à escolha de sítios adequados

para a fixação no hospedeiro (IVANOV & LEONOVICH, 1983).

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FIGURA 4: Microscopia eletrônica das sensilas palpais de Amblyomma

cajennense. Fonte: SOARES (não publicado)

Os carrapatos possuem um par de quelíceras que se localizam

medialmente aos palpos, são órgãos cortantes usados para penetrar na pele e ter

acesso ao sangue. Este par de órgãos é constituído de três partes: 1) base

muscular bulbosa que fornece força para retirar a quelícera de dentro da sua

bainha, 2) eixo alongado que são tubos que possuem tendões que movimentam

os dígitos e 3) dígitos cortantes que são homólogos as pinças de outros

aracnídeos, que servem para cortar a pele (SONENSHINE, 1991).

Os receptores presentes nas quelíceras (Figura 5) de carrapatos são

geralmente gustativos e mecanorreceptivos e não possuem uma estrutura

cuticular de fio de cabelo (WALADDE & RICE, 1977; WALADDE & RICE, 1982;

SONENSHINE, 1991). A porossensila da quelícera está estrategicamente

localizada de forma que durante a fixação e alimentação ela fica imersa na ferida

e em contato com os fluidos do hospedeiro (WALADDE & RICE, 1977).

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FIGURA 5: Diagrama do dígito da quelícera do carrapato Rhipicephalus

(Boophilus) microplus. Adaptado de WALADDE & RICE (1977)

2.2 Eletrofisiologia

O desenvolvimento da eletrofisiologia começou no século XVII com o

trabalho do cientista Jan Swammerdam a partir de uma preparação

neuromuscular com pernas de rã. No século XVIII, Luigi Galvani identificou e

publicou seu fundamento sobre a excitação elétrica nervo-músculo com a mesma

preparação de Swammerdam e descreveu o fenômeno de refração no qual

estímulos repetidos levam ao desaparecimento das contrações, que podem ser

restabelecidas após um período de descanso. A invenção final aconteceu no

século XX, Erwin Neher e Bert Sakmman desenvolveram a técnica de Patch-

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Clamp que mensura o potencial de células excitáveis, ou seja, analisa a

desempenho de um simples canal de íon utilizando um eletrodo de prata e uma

micropipeta de vidro (VERKHRATSKY et al., 2006)

Eletrofisiologia é o estudo das propriedades elétricas de células e

tecidos (bioeletricidade) que envolve variação da voltagem ou da corrente elétrica

em uma ampla variedade de escalas, que pode ser de um único canal iônico até

de tecidos como o cardíaco e inclui a avaliação da atividade elétrica dos

neurônios (atividade dos potenciais de ação) (KANDEL et al., 2000). Ou seja, é a

ciência e a técnica que estuda o fenômeno elétrico de plantas e animais, envolve

o potencial de ação das células que podem sofrer variações lentas ou rápidas

devido a uma mudança de concentração de uma substância química e estas

mudanças geram picos que podem ser chamados de “potenciais de ação” ou

“spikes” (BRETSCHNEIDER & DE WEILLE, 2006).

A eletrofisiologia em artrópodes é eficaz em identificar a fisiologia

sensitiva dos mesmos, tem importância na descoberta de feromônios (sexual e

agregação), sítios atrativos de oviposição, compostos naturalmente repelentes ou

estimulantes (HOLSCHER et al., 1982). É uma técnica de triagem que tem como

objetivo determinar com mais precisão as respostas das sensilas olfativas e

gustativas dos artrópodes, detectando substâncias possivelmente repelentes ou

atrativas. Essas substâncias posteriormente são submetidas a testes

comportamentais para a determinação de sua identidade e dependendo dos

resultados podem ser usadas no controle dos artrópodes (BJOSTAD, 1998;

BORGES, 2001).

A eletrofisiologia em artrópodes iniciou-se com o eletroantenograma

(EAG) (Figura 6) em insetos para a detecção de feromônios, o princípio do EAG

baseia-se no registro da voltagem entre a ponta e a base da antena de um inseto

durante um estímulo volátil (WIBE, 2004). Desde então, outras técnicas têm sido

desenvolvidas, como a técnica de eletrofisiologia em sensila única que envolve o

registro do potencial elétrico característico de cada célula através da implantação

de eletrodos na base da sensila, seguida de sua estimulação com substâncias

específicas (SONENSHINE, 1991).

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FIGURA 6: Esquema de um EAG. Fonte: BJOSTAD (1998)

A técnica de registro de sensila única ou de ponta (RSU) para contato

em sensilas quimiorreceptoras foi introduzida por HODGSTON et al. em 1955

(Figura 7). Compostos solúveis em água (açúcar, sal, ácidos, álcoois) foram

dissolvidos em uma solução salina no eletrodo de registro, e quando este eletrodo

entrou em contato com a sensila do labelo do inseto causou uma resposta de

duas séries de spikes (BJOSTAD, 1998).

FIGURA 7: Diagrama da preparação para a técnica de RSU. Adaptado de

HODGSON et al. (1955)

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2.2.1 Eletroantenograma (EAG) vs Registro de sensila única (RSU)

Os receptores olfativos de insetos e carrapatos localizados na antena e

no primeiro par de patas, respectivamente, permitem que estes artrópodes

encontrem hospedeiros à distância (GUERIN et al., 2000). O primeiro par de

patas dos carrapatos seria análogo as antenas dos insetos na parte de busca de

hospedeiros (IVANOV & LEONOVICH, 1983).

As sensilas dos insetos estão distribuídas por todo o corpo, estão

concentradas nas patas, abdome, palpos e especialmente nas antenas onde há

inúmeras sensilas que respondem para um mesmo composto. Estas sensilas

possuem receptores para CO2, umidade, temperatura, estímulos gustativos e

olfativos (KAISSLING, 1995). Os carrapatos possuem um número bem menor de

sensilas e não possuem antenas, porém possuem um órgão similar, que é o

órgão de Haller. Há cerca de 20 quimiossensilas no órgão de Haller, enquanto na

antena de insetos há inúmeras (HESS & VLIMANT, 1983; IVANOV &

LEONOVICH, 1983; STEULLET, 1993). Sendo assim, o EAG por ser uma técnica

menos sensível não pode ser usado para carrapatos (WIBE, 2004).

No EAG uma única grande despolarização é observada após a

estimulação, devido á soma de baixos potenciais de ação de milhares de

neurônios. Já no ESU a principal característica é a „explosão‟ de potenciais de

ação após a estimulação, ou seja, os compostos químicos geram spikes mais

rápidos e com alta freqüência sem alteração da amplitude por englobar apenas

uma sensila (BJOSTAD, 1998).

2.2.2 Percepção do estímulo e disparo do potencial de ação

O sistema nervoso periférico dos carrapatos detecta uma variedade de

sinais químicos do ambiente que transmitem informações para sua sobrevivência

e o SNC recebe e integra estas informações. As sensilas mais importantes para

tal ação são as sensilas do órgão de Haller, do dígito das quelíceras e palpais,

lembrando que sensilas com estruturas diferentes são sensibilizadas por

estímulos diferentes (SONENSHINE, 1991).

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O objetivo de experimentos eletrofisiológicos no geral é estudar os

potenciais de membrana e suas eventuais alterações (BRETSCHNEIDER & DE

WEILLE, 2006). As células são estruturas separadas por uma membrana que

apresenta seletividade a diversos íons (principalmente sódio (Na+) e potássio (K+))

e a diferença de potencial elétrico entre o meio intra e extracelular, ou seja, a

diferença de potencial entre o exterior e interior de uma célula, é denominado

potencial de membrana. A concentração de íons K+ é maior dentro da célula,

enquanto a concentração de Na+ é maior no meio extracelular (DELATTRE,

2007).

Os sinais nervosos são transmitidos por potenciais de ação, que por

sua vez são variações rápidas do potencial de membrana que viajam da

extremidade das fibras nervosas até o SNC devido a vibrações, luminosidade,

temperatura e/ou presença de alguma substância química (RASHBASS, 1967).

O mecanismo é a bomba de sódio e potássio (Na+/ K+ / ATPase), no

qual os íons fluem pelos canais iônicos que são responsáveis pela transmissão

elétrica em todo o sistema nervoso (DELATTRE, 2007). No repouso o neurônio

encontra-se polarizado, o estímulo altera a permeabilidade dos íons. A

despolarização da membrana promove a abertura dos canais de Na+, com isso

íons de Na+ começam a entrar na célula despolarizando mais ainda a membrana,

há então mais abertura de canais de Na+. Os canais de Na+ se fecham

espontaneamente e os de K+ começam a se abrir, com isso os íons de K+ fluem

para fora da célula. O K+ tem uma maior capacidade de difusão que o Na+, então

ele leva sua carga positiva deixando o meio intracelular negativo em relação ao

meio extracelular. Causando a repolarização do neurônio de volta ao potencial de

repouso (DELATTRE, 2007).

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2.2.3 Eletrofisiologia olfativa e gustativa em carrapatos

Para a realização da técnica de eletrofisiologia olfativa e gustativa são

necessários uma variedade de equipamentos e materiais (Figura 8), como

eletrodos de vidro, micropipetas, fio de prata, micromanipuladores, amplificadores,

microscópio esterioscópio, fabricador de eletrodos, estimulador de sinais (inseto

artificial), controlador de estímulos (Stimulus Controller CS 55 – Syntech®), fitas

crepe e dupla-face, pinças, tesoura. (BJOSTAD, 1998; JORGENSEN et al., 2007;

SOARES, não publicado).

FIGURA 8: Equipamentos de uma estação de eletrofisiologia. A: TastePROBE; B:

IDAC-4; C: inseto artificial (Antennal Signal Stimulator); D: probe; E: holders; F:

micromanipuladores; G: fabricador de eletrodos (PC-10 PULLER); H: controlador

de estímulos (Stimulus Controller). Fonte: http://www.syntech.nl/; http://narishige-

group.com/. Acesso em: 25 out. 2011

A IDAC-4 é um amplificador com multicanais desenvolvido para a

gravação, armazenamento e análise de sinais fisiológicos. Durante o

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desenvolvimento da técnica de eletrofisiologia as oscilações dos sinais são

mostradas na tela de um computador em uma base de tempo ajustável, com isso

facilita um ajuste rápido e fácil dos níveis de sinais permitindo o controle de

amplificação, configurações de filtro e amostragem. O software Autospike que é

apresentado junto com a IDAC-4 grava em tempo real os potenciais de ação e

permite uma série de adaptações para a avaliação dos mesmos (SYNTECH,

2004a). O controlador de estímulos produz uma corrente de ar constante e bem

definida para aplicação em pesquisa de quimiorrecepção em uma estação de

eletrofisiologia olfativa (SYNTECH, 2004b). A TastePROBE é um pré amplificador

que grava os potenciais de ação das sensilas gustativas, permite a gravação de

baixos potenciais de ação (spikes), melhora o sinal de ruído e preserva as formas

dos spikes (MARION-POLL & VAN DER PERS, 1996).

Para que a técnica seja realizada a estação de eletrofisiologia (Figura

6) deve estar aterrada. O aterramento protege de uma eletrocussão fatal, além de

auxiliar no controle de interferências que outros aparelhos presentes no local

possam causar que prejudicam a gravação do registro e posterior interpretação.

(PURVES, 1998). Para a verificação dos sinais e o adequado funcionamento dos

equipamentos utiliza-se um inseto artificial (Antennal Signal Stimulator –

Syntech®) que simula estímulos elétricos (SYNTECH, 2002).

Os eletrodos de vidro para eletrofisiologia possuem um diâmetro

microscópico e sua estrutura é dividida em três partes: ponta, cone e eixo (Figura

9). São fabricados a partir de capilares de vidro com parede fina de 1 a 2 mm por

meio de um puxador de pipetas (PC PULLER – Narishige®) com diferentes

propriedades para suprir a necessidade de diferentes tipos de técnica/registro

(BRETSCHNEIDER & DE WEILLE, 2006).

FIGURA 9: Estrutura de um eletrodo de vidro. Fonte: BRETSCHNEIDER & DE

WEILLE (2006)

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A confecção de um eletrodo de vidro demanda tempo para se acertar a

temperatura que deve ser atingida e a forma de preenchimento. O diâmetro da

ponta deve ser capaz de englobar a sensila do carrapato. O preenchimento dos

eletrodos com soluções é dificultado devido à tensão de superfície em um

diâmetro muito pequeno (PURVES, 1998).

Os eletrodos devem ser preenchidos inicialmente por uma solução de

ensaio um pouco antes do registro para que se evite a cristalização e as

mudanças de concentração na ponta do eletrodo de vidro (JORGENSEN, 2007).

As substâncias iniciais, de registro e referência são eletrólitos, ou seja, são

substâncias que quando misturadas em um soluto (comumente água) se

dissociam em partículas ou íons transportando cargas (BRETSCHNEIDER & DE

WEILLE, 2006). Quando preenchidos por uma solução salina, a mesma será

responsável pela condução elétrica da sensila até o fio de prata (BJOSTAD,

1998).

As substâncias utilizadas para o estímulo olfativo devem ser

preparadas, impregnadas em papel filtro e colocadas na pipeta de vidro para

posteriormente serem acopladas no controlador de estímulos. Já as substâncias

gustativas são dissolvidas e colocadas no eletrodo de vidro (BJOSTAD, 1998;

SOARES, não publicado).

Para eletrofisiologia olfativa, o carrapato vivo é fixado ventralmente com fita

dupla-face, o primeiro par de patas deve ser estendido para frente com a intenção

de facilitar o acesso ao órgão de Haller e os demais pares de patas imobilizados

(Figura 10). Insere-se um eletrodo de vidro indiferente com solução salina em

alguma parte do carrapato (escudo, coxa) para fechar o circuito. A ponta de uma

sensila multiporosa é cortada e um eletrodo acoplado à abertura. O controlador de

estímulos emite um fluxo de ar constante e quando acionado por um pedal libera

o odor na concentração que se deseja testar. A umidade deve estar sempre

acima de 90%. O eletrodo de registro deve ser posicionado bem na ponta da

sensila, para que os poros fiquem livres para a percepção do estímulo volátil. Os

sinais são captados pelo amplificador e analisados pelo software (STEULLET &

GUERIN, 1994; BJOSTAD, 1998).

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FIGURA 10: Preparação do carrapato para realização da técnica de

eletrofisiologia olfativa. Fonte: SOARES, não publicado

Para a eletrofisiologia gustativa, um espécime vivo de carrapato na

fase adulta é fixado em um suporte imantado com fita dupla-face pela região

dorsal, os quatro pares de patas devem ser presos com fita crepe (Figura 11)

(WALADDE & RICE, 1977). Realiza-se a introdução do eletrodo de

referência/indiferente já preenchido com solução salina no orifício anal e o

direciona a região anterior do carrapato. Após, o eletrodo de registro deve ser

preenchido com solução que se deseja testar, coloca-se no holder da

TASTEprobe, já com o fio de prata no seu interior, que por sua vez é apoiada por

um micromanipulador. O eletrodo de registro deve entrar em contato com a

sensila, para realizar um novo contato deve aguardar dois minutos para que se

restabeleça o potencial de ação. Os sinais são captados pelo pré amplificador e

vai para o amplificador e é analisado pelo software (JORGENSEN, 2007;

SOARES, não publicado). Em ambos os tipos, olfativa e gustativa, o eletrodo de

registro pode ser inserido na base da sensila, mas neste caso usa-se eletrodo de

tungstênio com a ponta afinada.

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FIGURA 11: A: Preparação do carrapato. B: Estação de eletrofisiologia gustativa.

Adaptado de: SOARES, não publicado; SYNTECH (2002)

Os registros eletrofisiológicos devem ser processados e analisados. A

forma mais usada é verificação da forma, tamanho e frequência dos potenciais de

ação ou spikes (BRETSCHNEIDER & DE WEILLE, 2006). A contagem dos spikes

pode ser feita automaticamente por um software (Autospike – Syntech®), no qual

as ondas são convertidas em spikes e suas frequências conservadas. As

respostas são quantificadas pela contagem do número de spikes durante o tempo

de estímulo (Figura 12) (SYNTECH, 2004a). Os registros eletrofisiológicos

lembram registros eletrocardiográficos, ou seja, são vizualizados na forma de

gráficos (BJOSTAD, 1998).

FIGURA 12: A: registro da onda convertida em spikes; B: análise do Spike

Fonte: SYNTECH (2004a)

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Circuitos eletrônicos são afetados por diversos fatores que causam a

diminuição do desempenho dos equipamentos, estes fatores podem ser

controlados, mas não eliminados por inteiro (WHITAKER, 2005). A presença de

ruídos (flutuações espontâneas imprevisíveis resultantes da física das

substâncias que fazem parte do circuito elétrico) no registro prejudica a técnica de

eletrofisiologia, porém são facilmente detectáveis (BRETSCHNEIDER & DE

WEILLE, 2006).

Falhas no equipamento de eletrofisiologia são bastante comuns, o

sucesso de um diagnóstico da falha requer conhecimento sobre o funcionamento

normal de cada item da estação de eletrofisiologia, reposição/modificação das

fontes de sinais e de alguns dispositivos (eletrodo de prata, eletrodo de vidro,

aterramento) e o uso da lógica (PURVES, 1998).

2.2.4 Resultados da técnica de ESU em carrapatos

Receptores fora da cápsula do órgão de Haller de Amblyomma

variegatum respondem a quatro compostos ativos de odores de bovinos, sendo

dois altamente estimulantes e identificados como 2-nitrofenol e 4-metil-2-nitrofenol

(STEULLET & GUERIN, 1994). As sensilas de Ixodes ricinus também possuem

receptores para fenol e lactona (LEONOVICH, 2004). Compostos normalmente

presentes no ambiente, como amônia e CO2, também são detectados pelos

carrapatos dependendo da concentração indica a proximidade do hospedeiro

(HAGGART et al., 1980; HOLSCHER et al., 1980). Outros sinalizadores de

hospedeiros detectados por carrapatos (A. variegatum, A. hebraeum, I. ricinus, I.

persulcatus, I. scapulares) são substâncias presentes no hálito e pele humana e

substâncias da eructação dos bovinos (STEULLET & GUERIN, 1992; DONZÉ,

2004),

Algumas espécies de carrapatos, como Rhipicephalus (Boophilus)

microplus, R. sanguineus e Ornithodorus tholozani respondem a

hematofagoestimulantes (compostos que estimulam a alimentação à medida que

são ingeridos) tais como cloreto de sódio (NaCl), adenosina trifosfato (ATP) e

glutationa (GT), que são componentes normais do plasma sanguíneo. Também

respondem ao plasma bovino quando estimulados (GALUN & KINDLER, 1965;

19

GALUN & KINDLER, 1968; WALADDE & RICE, 1977). R. sanguineus responde a

glicose, ATP, GT e alta concentração de sais (SOARES et al., 2011). Sensilas

palpais de machos de R. microplus são ativas para feromônios sexuais (BRUYNE

& GUERIN, 1998).

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3 CONSIDERAÇÕES FINAIS

O estudo das estruturas dos órgãos sensoriais dos carrapatos,

principalmente do órgão de Haller, palpos e quelíceras, permite a identificação

dos receptores presentes em cada um deles, assim como suas funções. Funções

estas importantes na sobrevivência e perpetuação do ectoparasita (identificação e

localização do hospedeiro, fixação, alimentação, busca de parceiros para a

cópula).

A técnica de eletrofisiologia em artrópodes é uma técnica de triagem

minuciosa, laboriosa e demanda treino, porém bastante aplicável, uma vez que a

partir disso é possível identificar compostos potencialmente repelentes ou não aos

artrópodes, que serão confirmados a partir da realização de um teste

comportamental. O manuseio dos equipamentos, a preparação do carrapato,

realização dos testes e a análise dos registros devem ser executados da maneira

mais correta de modo que falhas sejam evitadas.

Atualmente, o uso de acaricidas para o combate de carrapatos é

bastante preocupante devido ao impacto causado na saúde humana, no meio

ambiente e até mesmo nos animais. Apesar das técnicas olfativa e gustativa em

carrapatos serem iniciantes, com poucos estudos e a estação de eletrofisiologia

do CPV/EVZ/UFG ser a única no Brasil os registros eletrofisiológicos podem ser o

início para o desenvolvimento de uma forma alternativa de controle de carrapatos,

pois a partir da identificação de uma substância, seja ela capaz de inibir ou

estimular o parasitismo, pode-se criar um produto que promova a repelência ou o

destacamento do carrapato do hospedeiro.

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