Tecnologia do DNA recombinante

•A deficiência de hormônio do crescimento faz com que a pessoa fique com uma estatura baixa. Nesses casos, é necessário o uso hormônio do crescimento para que o crescimento dessas crianças melhore.

•O hormônio do crescimento foi um dos primeiros produtos da engenharia genética.

•Ele foi produzido em E. coli a partir de um gene humano fusionado com elementos reguladores bacterianos.

•Esse foi o segundo produto farmacêutico aprovado pelo FDA, em 1985.

•O primeiro foi a insulina humana, em 1982.

Como amplificar um gene de interesse

Tipo de DNA doador

• DNA genômico

• cDNA – DNA complementar

cDNA – contém apenas os éxons

Formação de uma molécula de DNA recombinantevetor

DNA de interesse

Enzimas de Restrição

Como funciona a amplificação

VETORES

Plasmídeos: são moléculas de DNA circulares, extracromossômicas, presentes em microrganismos, sendo que muitos se replicam autonomamente.

Estrutura de dois plasmídeos

Vetores de bacteriófagos

• A maioria fago labda

• Genoma do fago: 48.502pb

• 15kb são necessários para a lisogenia e podem ser removidos.

Clonagem usando o fago como vetor

Vetores cosmidiais

• É um híbrido entre plasmídeos e o fago labda

• Vantagens: capacidade do plasmídeo de replicação autônoma

• Capacidade do fago de embalagem do cromossomo

• Capacidade de 35 a 45kb

Estrutura de um cromossomo artificial bacteriano (BAC) usado para clonar grandes fragmentos de DNA (150 a 300kb)

Construção de bibliotecas de DNA

• Conjunto de clones de DNA, contendo coletivamente todo o genoma.

• DNA total digestão com enzimas de restrição inserção em vetores

• Uma boa biblioteca tem todas as sequencias de DNA do genoma.

• Para genomas grandes são necessários milhares de clones

• O número de clones pode ser calculado:

• N=(ln(1-P)/(ln(1-f)

• P: probabilidade, f: fração do genoma em um clone de tamanho médio

Exemplo

• Drosophila genoma 100.000kb

• Inserto 40kb

• Probabilidade de 99% de certeza de uma seqüência estar na biblioteca:

• N=(ln(1-0,99)/(ln(1-(40/100000)

• N=11.513 clones

Exercício

• O genoma humano tem 3 bilhões de nucletídeos

• Utilizando BACs: insertos de 200kb

• Quantos clones são necessários para ter uma certeza de 95% de ter uma seqüência específica na biblioteca?

• N=44.979

Microsatélites

Teste de paternidade