TEMA 5.8. Técnicas de la Biología Molecular 1. ENZIMAS DE RESTRICCIÓN 2. CLONAJE. VECTORES -Plásmidos -Fagos -YAC, PAC y BAC 3. HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS -Southern y Northern blot -Hibridación “in situ” -Microarray de DNA 4. LIBRERIAS DE DNA -Genotecas -Librerías de cDNA 5. POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) y RT-PCR 6. EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS -Producción de animales genéticamente modificados 7. MUTAGÉNESIS DIRIGIDA 8. SECUENCIACIÓN DEL DNA -Método de Sanger -Secuenciación automática 9. INTERACCIONES PROTEÍNA-PROTEÍNA -Doble híbrido en levadura

El flujo de la información genética y las técnicas del DNA recombinante

Década 1970: Paul Berg, Herbert Boyer, Stanley Cohen… Técnicas para la localización, aislamiento, preparación y estudio de pequeños fragmentos de DNA procedentes de cromosomas. También gracias a estudio virus y plásmidos.

Técnicas basadas en la enzimología de los Ac Nucleicos y el lenguaje de apareamiento entre bases que permite reconocimiento y unión de secuencias complementarias

Estas técnicas han hecho posibles la genómica y proteómica modernas, el estudio de los genes y las proteínas a nivel de células y organismo entero (importantes avances en el campo Biomedicina)

Metodología del DNA recombinante permite Aislar genes, Analizar genes, Modificar genes

Clases de enzimas de restricción Caracterizados + de 100 Nomenclatura: 3 letras (hospedador) +indicación cepa +número romano

Los enzimas de restricción cortan el DNA en fragmentos específicos Endonucleasas de restricción que cortan, en lugares concretos, ambas hebras de DNA dúplex que contiene las secuencias reconocidas. Se han encontrado en gran variedad de procariotas (Sistema de modificación-restricción para destruir moléculas DNA ajeno). Reconocen secuencias 4-8 pb e hidrolizan un enlace fosfodiester en cada hebra (generan extremos romos o cohesivos). Sitios de corte que casi siempre poseen simetría rotacional binaria

El conjunto de fragmentos puede servir como huella digital de una molécula de DNA

En el laboratorio Enzimas retricción se usan para hidrolizar moléculas DNA en fragmentos específicos que se pueden analizar y manipular con más facilidad

Separación y visualización fragmentos de restricción Por electroforesis en gel Poliacrilamida: hasta pocos miles pb Agarosa: hasta ~20kb

Los enzimas de restricción y DNA ligasa: recombinación DNA

DNA ligasa cataliza la formación de nuevos enlaces fosfodiester Extremos cohesivos complementarios (extremos romos también pero con menor eficiencia) **Se pueden ‘generar’ extremos cohesivos mediante un adaptador o linker de DNA sintetizado químicamente y susceptible de ruptura por determinado enzima de restricción

Un fragmento de DNA se une covalentemente a un DNA vector (introduce en un vector)

Dos moléculas de DNA hidrolizadas por mismo enzima de restricción pueden soldarse (LIGASAS) dando lugar a moléculas recombinantes

Vector: molécula de DNA que se replica autónomamente en una cel huésped a la que se puede cortar y empalmar un segmento de DNA para permitir su replicación por ej. plásmido

Clonaje de un fragmento de DNA en un plásmido

Los vectores de clonación permiten la amplificación de fragmentos de DNA insertados

Plásmidos: moléculas de DNA circulares (bacterianos) que se replican con independencia del cromosoma huesped.

Tamaño 5.000-400.000 pb Se introducen mediante transformación o electroporación Sólo unas pocas cél captan el DNA plasmídico: se necesita un marcador (= gen) de selección tal como resistencia a antibiótico. Muchos también gen marcador adicional, inserto en mitad gen de selección para ≠ entre transformadas con y sin inserto (ej. Selcc blanco/azul gen lac Z)

Bacteriófagos: Como el λ. Podemos sustituir parte de su genoma por DNA foráneo (40.000-50.00 pb) Cósmido: plásmido al cual se han adicionado segmentos del genoma de un bacteriófago, como el fago λ.

Cromosomas bacterianos artificiales (BAC): diseñados para clonación fragmentos DNA muy largos (100.000-300.000 pb)

Cromosomas artificiales de levaduras (YAC): como Saccharomyces cerevisiae, fáciles de mantener y cultivar a gran escala en el lab (vectores de gran tamaño)

Gen eucar +promotor bacteriano

Ej.: plásmido pBR322 Con origen replicación (ori), genes resistencia a antibióticos, secuencias corte enzimas restricción

HIBRIDACIÓN: La transferencia (blot) de Southern

Un fragmento de DNA que contiene determinada secuencia puede identificarse si se separan por electroforesis (ácidos nucleicos tienen carga negativa) una mezcla de fragmentos, se transfieren a nitrocelulosa y se hibridan con una sonda marcada (ej. con 32P) complementaria de la que se busca. Edward M. Southern, 1975 Luego se utilizó el mismo sistema para detectar RNA y se lo denominó Northern Blot

Hibridación “in situ”

La hibridación in situ es la hibridación de fragmentos marcados de DNA de una hebra o de RNA con secuencias complementarias (sondas) a DNA/RNA celular, en cortes de tejido o preparaciones celulares (in situ).

Microarray (Chip) de DNA Un chip de DNA (del inglés DNA microarrays) es una superficie sólida a la cual se unen una serie de fragmentos de DNA. Las superficies empleadas son muy variables y pueden ser vidrio, plástico e incluso chips de silicio.

En los últimos años, los biochips o microarrays de DNA se han convertido en las herramientas que más universalmente se utilizan para el análisis comparado de la expresión génica.

Con esta tecnología podemos observar de forma casi instantánea la expresión de todos los genes del genoma de un organismo. De tal forma que suelen ser utilizados para identificar genes que producen ciertas enfermedades mediante la comparación de los niveles de expresión entre células sanas y células que están desarrollando ciertos tipos de enfermedades.

Librerías de DNA: Construcción de una genoteca genómica

Una genoteca es un banco de genes que almacena una colección de genes clasificados y preparados para su utilización en experimentación. Las genotecas permiten disponer en cualquier momento de secuencias de DNA de posible interés biomédico.

Para hacer una genoteca el DNA a estudiar se divide en fragmentos utilizando enzimas de restricción. Los virus son a menudo utilizados como vehículo de transporte de los fragmentos obtenidos, insertando en el genoma del virus los fragmentos del DNA del organismo de interés. Diferentes partículas del virus portarán fragmentos ≠ de DNA pero la población viral contendrá en su conjunto todo el genoma del organismo. Cada clon procedente de la división de una bacteria contendrá el mismo fragmento de DNA, que será a su vez distinto del fragmento incorporado en otros clones.

Además de genotecas de DNA genómico, se pueden construir genotecas con cDNA (obtenido del mRNA por acción de la trascriptasa inversa) Así se pueden estudiar las secuencias que se expresan selectivamente en un estado concreto, ya que se seleccionan las secuencias que se en ese momento se están transcribiendo.

Construcción de una genoteca de cDNA a partir de mRNA

El mRNA molde se hibrida con un oilgonucleótido (oligodT) sintético (cebador)

La transcriptasa inversa y los dNTP generan una cadena de DNA complementaria (cDNA)

El mRNA se degrada con alcali

La DNApol I y los dNTP generan DNA de doble cadena

PCR (Polymerase Chain Reaction Reacción en Cadena de la Polimerasa)

Con la técnica de la PCR es posible obtener millones de copias de un fragmento del DNA (por ej., un gen de interés). El uso de esta técnica es muy amplio en el campo de la medicina

Requiere dos oligonucleótidos complementarios de los extremos opuestos de ambas hebras de DNA de una región de interés. -Estos dos "oligos" hacen las veces de "Cebadores o primers", a partir de los cuales la DNApolimerasa extiende la cadena. -La DNApol procede de un organismo "Termófilo", una de las más usadas es la Taq (de Thermus aquaticus que trabaja a Tª > 70ºC, resistiendo Tª >100ºC). La muestra de DNA a amplificar , junto con los “2 oligos", la DNApolim, y los 4 dNTPs precursores se introduce en un "Termociclador" (aparato de PCR) que permite programar el procedimiento

RT-PCR (reverse transcriptase PCR) El molde inicial es RNA (mRNA) y se requiere de una transcriptasa inversa, para la conversión del RNA a cDNA

Fases PCR en Termociclador: I.Desnaturalización Inicial: separación de las dos hebras del DNA bicatenario. 5 minutos Tª 95ºC . II.Ciclos de PCR: se realizan entre 20-30 ciclos, Cada ciclo consta de 3 fases esenciales: II.1. Desnaturalización: separación de las dos hebras del DNA doble cadena a amplificar. 1 minuto Tª~ 95ºC. Tras esta fase, un enfriamiento lento a razón de 1ºC/seg. II.2. Hibridación "Anhealing" de cebadores: es la fase más crítica del proceso, ya que en ella se produce la interacción entre los oligonucleótidos cebadores y el DNA molde a amplificar. Las condiciones óptimas dependen de los Oligos usados. 1 min Tª 45-a 55ºC. Tras esta fase,calentamiento rápido a una razón de 0,3ºC/seg. II.3. Elongación: es la fase en que actúa la polimerasa replicando el DNA molde a partir del oligonucleótido cebador. Suele emplearse para la Taq 2 min, 72ºC. Tras esta fase, nuevo calentamiento rápido (0,3ºC/seg), excepto en el último ciclo en que se mantiene la temperatura. III.Terminación: terminación de las síntesis de las cadenas de DNA iniciadas durante los ciclos. 15 min, 72ºC

PCR en tiempo real (PCR cuantitativa)

Surgió para resolver el problema de la cuantificación de la técnica de la (RT)PCR. Se emplean sondas marcadas con fluorocromos. Las sondas de hidrólisis, frecuentemente empleadas en esta técnica, son oligonucleótidos que presentan fluorocromos en ambos extremos y tienen una secuencia complementaria a parte del fragmento de DNA que se quiere amplificar.

Expresión de proteínas eucariotas en cels procariotas y eucariotas

Se pueden introducir genes de eucariotas (y procariotas) en bacterias y se pueden usar estas como ‘fábricas’ para producir una proteína determinada Para conseguir un máximo de transcripción, el cDNA se inserta en el vector en el orden correcto de lectura y cerca de un promotor bacteriano muy activo

Las bacteria NO pueden llevar a cabo modificaciones post-traduccionales como la hidrólisis de polipéptidos específicos, adición de carbohidratos, etc. Se requiere expresión en cels hospedadoras eucariotas

Silenciamiento de expresión de proteínas por interferencia del RNA (siRNA)

Derivados sintéticos basados en el descubrimiento de los micro-RNA o miRNA: tipo de RNA interferente con una longitud de 20 -25 nucleótidos altamente específico para la secuencia de nucleótidos de su RNAm diana, interfiriendo por ello con la expresión del gen respectivo En células en cultivo se transfectan (plásmido o vector viral) o inyectar moléculas de siRNA sintéticos. Cuando se transfectan se habla más propiamente de expresión de "shRNAs" (siglas en inglés de short hairpin RNA “RNA de horquilla corta”),que son procesados para generar siRNAs funcionales.

Los siRNAs son moléculas de alrededor de 22 nucleótidos, con un grupo fosfato (P) en el extremo 5' y un grupo hidroxilo (-OH) en el extremo 3'.

Producción de animales genéticamente modificados

Los genes se introducen en la línea germinal Por microinyección se introducen copias de plásmido que contiene un promotor y el gen que queremos estudiar, normalmente en el pronúcleo macho de un óvulo fertilizado; después el óvulo se implanta en el útero de una hembra ‘adoptiva’

Un ratón transgénico es un ratón al que se le ha modificado su DNA y por tanto su información genética. Estas modificaciones consisten en la introducción de un gen nuevo o en la eliminación de un gen propio: ratones knockout La obtención de ratones transgénicos facilita el estudio de la función básica de un gen determinado.

Mutagénesis dirigida

La tecnología del DNA recombinante permite generar mutaciones específicas in vitro.

Se pueden generar por: *Delecciones *Sustituciones: mutagénesis dirigida con oligonucleótidos: se utiliza un cebador que contiene un nucleótido desaparejado *Inserciones: cassete de mutagénesis *Genes diseñadores: si se sueldan fragmentos de genes que codifican dominios proteicos no asociados en la naturaleza

Secuenciación del DNA. Método de Sanger Se basa en la utilización de un precursor 2’,3’didesoxi-NTP, este precursor lleva un H en vez de un OH en el C3’ de la Ribosa.

-Método enzimático que requiere: 1. Una DNApolim 2. Precisa un "Cebador o primer" Funciona mejor con DNA simple cadena.

-Proceso con 4 reacciones una por cada ddNTP añadido.

-Requiere que el DNA sintetizado se marque (radiactividad o fluorescencia)

-Cada reacción por separado, se resuelve electroforéticamente en geles de acrilamida de alta resolución, y se revela, permitiendo leer paralelamente la secuencia desde el extremo 5´ (parte inferior del gel, fragmentos pequeños), al 3´(parte superior del gel, fragmentos mayores).

Cada vez que uno de estos nucleótidos modificados se incorpore al azar en el proceso de síntesis que dirige la DNApol la elongación se interrumpirá

Secuenciación automática de DNA

Estudios de interacciones proteína-proteína mediante técnicas de biología molecular

La determinación de las interacciones de una proteína es clave para definir sus funciones

Técnicas muy variadas, incluyendo el uso de la BIOLOGÍA MOLECULAR:

Comparaciones de la composición de los genomas: NO es una prueba de asociación directa. En proteínas ya vimos el uso de la Co-inmunoprecipitación: Al inmunoprecipitar una proteína mediante anticuerpos específicos, otras proteínas que se unen a la misma pueden precipitar con ella …y otras tecnicas de bioquímica de proteínas y de imagen (confocal, FRET, etc) Por Biología Molecular usamos el Análisis del doble híbrido en levaduras

Correlaciones siempre útiles si se conoce la función de al menos una de las proteínas

Sistema del doble híbrido en levadura Escrutinio a gran escala de interacciones (encontrar las proteínas Y capaces de unirse a la proteína X)

Identificar una interacción proteína-proteína in vivo mediante la reconstitución de un activador de la actividad transcripcional (GAL4p de la levadura S. cerevisiae ) y consiste en la separación del dominio responsable de la unión al DNA y del dominio interacc prot. el de la activ. transcripcional (activación RNApol).

Se construyen 2 tipos de plásmidos codificantes: El primer tipo sólo contiene un plásmido: gen que codifica el dominio de unión al DNA de GAL4 fusionado al gen de la proteina X. (prot cebo, usada para encontrar compañeros celulares) El segundo tipo contiene un gran número de plásmidos, que contienen el dominio del activador de GAL4, fusionado a uno de los genes que codifican las proteinas Y (prot presa). Un plásmido de cada tipo se introduce al interior de la levadura. La interacción entre las dos proteínas X y Y conducen a la reconstitución de una proteína GAL4 funcional y por tanto a la activación de la transcripción del gene reportero que contiene un sitio de unión a GAL4.