TERAPIA A LASER DE BAIXA INTENSIDADE (808 nm) EM … · alegria, para que o meu coração cante...
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SILVILENA BONATTI TERAPIA A LASER DE BAIXA INTENSIDADE (808 nm) EM BAIXA E ALTA DOSAGEM NA CICATRIZAÇÃO DE FERIDA INCISIONAL EM PELE DE RATOS Dissertação apresentada à Universidade Federal de São Paulo para obtenção do Título de Mestre em Ciências SÃO PAULO 2013
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SILVILENA BONATTI
TERAPIA A LASER DE BAIXA INTENSIDADE (808 nm)
EM BAIXA E ALTA DOSAGEM NA CICATRIZAÇÃO
DE FERIDA INCISIONAL EM PELE DE RATOS
Dissertação apresentada à Universidade Federal de São
Paulo para obtenção do Título de Mestre em Ciências
SÃO PAULO
2013
SILVILENA BONATTI
TERAPIA A LASER DE BAIXA INTENSIDADE (808nm)
EM BAIXA E ALTA DOSAGEM NA CICATRIZAÇÃO
DE FERIDA INCISIONAL EM PELE DE RATOS
Dissertação apresentada à Universidade Federal de São
Paulo, para obtenção do Título de Mestre em Ciências
ORIENTADOR: Prof. BERNARDO HOCHMAN
CO-ORIENTADORES: Prof. RICHARD LIÉBANO
Prof. Dr. NIVALDO PARIZOTTO
SÃO PAULO
2013
Bonatti, Silvilena.
Terapia a LASER de baixa intensidade (808 nm) em baixa e alta dosagem na
cicatrização de ferida incisional em pele de ratos./ Silvilena Bonatti. -- São Paulo,
2013.
XXI, 102f.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de São Paulo. Programa de Pós-
Graduação em Cirurgia Translacional.
Título em inglês: Low-level laser therapy (808 nm) in incisional wound healing in
rat skin.
1.Cicatrização. 2. Terapia a Laser. 3. Lasers. 4. Pele. 5. Ratos
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIRURGIA
TRANSLACIONAL
COORDENADOR: Prof. Dr. MIGUEL SABINO NETO
IV
DEDICATÓRIA
A Deus, que em seu infinito amor, me
sustentou e guiou cada passo meu para
realização deste trabalho! Que colocou
as pessoas certas no momento certo para
colaborarem e me apoiarem durante essa
jornada!
“Mudaste o meu pranto em dança, a
minha veste de lamento em veste de
alegria, para que o meu coração cante
louvores a ti e não se cale. Senhor, meu
Deus, eu te darei graças para sempre.”
(Salmos 30:11-12)
V
DEDICATÓRIA
Aos meus pais, Guerino Bonatti e
Nilce Fantim Bonatti, presentes de Deus
em meu caminho, que me deram a vida e
me ensinaram a vivê-la com dignidade,
não bastaria um obrigada. A eles, que
iluminaram os caminhos obscuros com
afeto e dedicação para que eu os
trilhasse sem medo e cheia de
esperanças, não bastaria um muito
obrigada. A eles, que se doaram por
completo e renunciaram aos seus sonhos,
para que, muitas vezes, pudessem
realizar os meus. Pela longa espera e
compreensão durante meus períodos de
ausência, não bastaria um muitíssimo
obrigada. A eles, pais por natureza, por
opção e amor, não bastaria dizer que
não tenho palavras para lhes agradecer.
Mas é o que me ocorre agora, quando
procuro arduamente uma forma verbal
para expressar uma emoção ímpar. Uma
emoção que jamais seria traduzida em
palavras!
VI
DEDICATÓRIA
À querida e amada Sônia Flora Bonatti
muito mais que cunhada, minha “irmã
mais velha” que sempre me apoiou e
torceu por mim, mesmo de longe,
expressando todo seu carinho.
Ao meu irmão Adilson Ap. Bonatti,
exemplo de profissionalismo e
competência.
Ao meu sobrinho Jonhatah R. Bonatti
pelo carinho e alegria que sempre me
proporcionou!
VII
DEDICATÓRIA
À minha querida e amada amiga
Tatiana Varandas, que sempre esteve
ao meu lado me dando incentivo e me
distraindo nas horas de diversão; por
enxergar em mim uma pessoa muito
melhor do que sou!
À minha querida e amada amiga Ivone
Orrutia, sempre presente, mesmo que a
distância, expressando todo seu
carinho, solidariedade e otimismo!
À minha querida e amada amiga Cibele
Moraes, sempre sorrindo e me
contagiando com sua amizade, carinho,
alegria e compreensão.
À querida Geni Sousa, minha amiga e
coach, que me acompanhou em todas as
etapas deste trabalho, contribuindo
para o meu desenvolvimento
profissional e pessoal;
incentivandomeus objetivos e
acreditando em mim!
VIII
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. BERNARDO HOCHMAN, Professor Afiliado da
Disciplina de Cirurgia Plástica, Orientador do Programa de Pós-Graduação
em Cirurgia Translacional da Unifesp e orientador deste trabalho, por
transmitir seu conhecimento com tamanha motivação e desprendimento,
encantando cada aluno que passa por seu caminho. Pelas oportunidades que
proporcionou, por me ensinar o que é a pesquisa e que ser um pesquisador
vai muito além da importante busca de conhecimento, realização de
experimentos e conquista de títulos! Pela convivência durante todos esses
anos demonstrando sua preocupação com os pacientes do Ambulatório de
Cicatrizes Patológicas, pelos quais luta arduamente em busca da cura das
cicatrizes fibroproliferativas. Manifesto aqui toda minha gratidão,
admiração e carinho pelo exímio professor, pesquisador, médico e pela
pessoa especial que se expressa!
Ao Prof. Dr. RICHARD LIEBANO, Professor do Programa de
Mestrado em Fisioterapia da Universidade de São Paulo (Unicid),
Professor Coorientador do Programa de Pós-Graduação em Cirurgia
Translacional da Unifesp e coorientador deste estudo, pela disponibilidade
todas as vezes que precisei, pela paciência, compreensão e por compartilhar
o seu conhecimento, que levarei sempre comigo com muito orgulho de ter
IX
sido sua aluna!
Ao Prof. Dr. NIVALDO PARIZOTTO, Professor Titular do
Departamento de Fisioterapia da Universidade Federal de São Carlos
(UFSCar) e coorientador deste estudo, por estar sempre presente mesmo
não estando em São Paulo ou no Brasil, por aceitar fazer parte deste projeto
e transmitir o seu conhecimento e experiência de forma tão sábia e
humilde! Expresso aqui toda minha gratidão e admiração pelo professor,
pesquisador e pessoa íntegra que é!
À Prof.ª Dr.ª FABIANNE FURTADO, Professora do Curso de
Fisioterapia da Universidade Federal de Barbacena, Professora
Coorientadora do Programa de Pós-Graduação em Cirurgia Translacional
da Unifesp e amiga, que participou deste estudo desde o início e colaborou
na orientação, sempre solícita, sincera, aberta e ótima conselheira.
Agradeço por fazer parte deste estudo e pelas importantes contribuições.
Ao Prof. Dr. CARLOS EDUARDO PINFILDI, Professor Adjunto
do Curso de Fisioterapia da Unifesp Campus Baixada Santista e Professor
Coorientador do Programa de Pós-Graduação em Cirurgia Translacional da
Unifesp, pela oportunidade de conviver em outros trabalhos dos grupos de
pesquisa dele e do Prof. Bernardo Hochman, pelos ensinamentos na área de
fototerapia, pelas contribuições e críticas ao presente estudo, e ainda, pelo
exemplo que é à classe dos fisioterapeutas como excelente pesquisador e
X
professor.
À MICHELE AKEMI NISHIOKA, Mestre pelo Programa de Pós-
Graduação em Cirurgia Translacional da Unifesp, aluna do curso de
Pesquisa em Cirurgia da Unifesp e amiga que admiro muito, que me
acompanhou por horas no laboratório participando dos experimentos,
dando conselhos, revisando a tese, treinando comigo cada apresentação.
Agradeço toda amizade, paciência e solidariedade.
Ao Prof. Dr. MAURO CANZIAN, Médico Assistente do Instituto
do Coração do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da
Universidade de São Paulo (InCor-HCFMUSP) e Patologista, por toda
colaboração, empenho e aprendizado concedido na análise das lâminas.
Sou muito grata pela disponibilidade e paciência durante a fase de análise e
interpretação de resultados deste estudo.
Às secretárias da Disciplina de Cirurgia Translacional da Unifesp,
SANDRA DA SILVA, MARTA REJANE DOS REIS SILVA e
SILVANA APARECIDA COSTA DE ASSIS, pela imensa dedicação,
carinho e respeito e por toda a ajuda durante minha estada no
Aperfeiçoamento e Mestrado em Cirurgia Translacional da Unifesp.
À ARAINY SUÉLY ANTUNES e à PAOLA MONTEIRO, alunas
de mestrado do Programa de Pós-Graduação em Cirurgia Translacional e
amigas, pela ajuda nos experimentos, pelo apoio na elaboração da tese,
XI
pelo carinho e pelos momentos de alegria!
À VIVIANE NASCIMENTO, minha amiga-irmã e companheira do
dia a dia, que acompanhou cada passo da realização deste projeto, inclusive
no laboratório durante a fase de coleta de dados - sempre disposta a me
ouvir, discutir meu trabalho e assistir às inúmeras apresentações!
À ERIKA RAMPAZO e à ROBERTA FOLHA, alunas de
mestrado do Programa de Pós-Graduação em Cirurgia Translacional e
amigas, pela ajuda e companheirismo durante a fase de análise de
birrefringência de fibras colágenas.
À GRAZIELA CHACON BORBA, Mestre pelo Programa de Pós-
Graduação em Cirurgia Translacional da Unifesp e amiga, pela ajuda na
análise de imuno-histoquímica, pela prestatividade, amizade e palavras de
incentivo.
À ANGELA FERREIRA, Mestre pelo Programa de Pós-Graduação
em Cirurgia Translacional da Unifesp e amiga muito querida, pelas dicas
com relação à estrutura da dissertação, por assistir várias apresentações e
por todo apoio, amizade e carinho durante todas as etapas!
Ao MÁRCIO CHAVES, Biólogo e Técnico do Laboratório de
Genética do InCor, pelas horas pacientemente dispendidas em padronizar
as reações de imuno-histoquímica e fazê-las de modo tão competente.
Ao MARCO AURÉLIO NEVES, Mestre pelo Programa de Pós-
XII
Graduação em Cirurgia Translacional da Unifesp, pela ajuda nas etapas
iniciais do projeto e no aprendizado dos procedimentos com os animais
utilizados neste estudo.
A todos os AMIGOS e AMIGAS do Programa de Pós-Graduação
em Cirurgia Translacional da Unifesp, pela colaboração e críticas sobre o
conteúdo e formatação da tese.
A todos os PROFESSORES ORIENTADORES e
COLABORADORES do Programa de Pós-Graduação em Cirurgia
Translacional da Unifesp, pelas críticas sempre construtivas que ajudaram
na melhora e finalização deste estudo, tendo sido fundamentais para
realização desta etapa.
XIII
Dificuldades preparam pessoas comuns para destinos extraordinários.
Clive Staples Lewis (1898 – 1963)
XIV
SUMÁRIO
DEDICATÓRIA ............................................................................. IV
AGRADECIMENTOS ................................................................... VIII
LISTA DE FIGURAS...................................................................... XV
LISTA DE TABELAS .................................................................... XVII
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS.............................. XVIII
RESUMO.......................................................................................... XXI
1.INTRODUÇÃO............................................................................. 2
2.OBJETIVO ................................................................................... 5
3.LITERATURA.............................................................................. 7
4.MÉTODOS.................................................................................... 21
5.RESULTADOS............................................................................. 37
6.DISCUSSÃO................................................................................. 46
7.CONCLUSÃO............................................................................... 63
8.REFERÊNCIAS............................................................................ 65
NORMAS ADOTADAS.................................................................. 74
ABSTRACT...................................................................................... 75
APÊNDICES.................................................................................... 76
ANEXOS........................................................................................... 100
FONTES CONSULTADAS ........................................................... 102
XV
Lista de Figuras
Figura 1 – Esquema da distribuição dos grupos e subgrupos
simulados e experimentais. GS: Grupo Simulado; GB: Grupo
Experimental Baixa Energia (1,5 J); GA: Grupo Experimental Alta
Energia (60 J)
23
Figura 2 – Epilação 24
Figura 2A – Demarcação com gabarito de acetato da área a ser
epilada
24
Figura 2B – Região dorsal do animal após epilação digital 24
Figura 3 – Incisão cirúrgica e sutura 25
Figura 3A – Demarcação no dorso do animal com gabarito de
acetato e caneta dermográfica da incisão com 3 cm e dos pontos de
sutura equidistantes 1 cm entre si e a partir das extremidades
25
Figura 3B – Pele incisada 25
Figura 3C – Pontos de sutura equidistantes 1 cm 25
Figura 4 – Preparo para irradiação 26
Figura 4A – Gabarito de acetato com 3 pontos equidistantes 1 cm
para aplicação de laser
26
Figura 4B – Gabarito posicionado no dorso do animal 26
Figura 5 – Aplicação de LLLT mediante uso de gabarito de acetato
e com auxílio de suporte para apoio da caneta de laser
27
XVI
Figura 6 – Parâmetros utilizados em cada grupo para irradiação por
ponto. E: energia total; DE: densidade de energia; t: tempo; GC:
grupo controle; GB: grupo experimental baixa dose; GA: grupo
experimental alta dose
28
Figura 7 – Preparo para coleta de tecido 30
Figura 7A – Gabarito de acetato para demarcação da área de tecido
a ser coletada para análise
30
Figura 7B – Gabarito de acetato posicionado para delimitar a área
de coleta de tecido cicatricial e pele adjacente
30
Figura 8 – Amostra coletada 31
Figura 8A – Amostra fixa com alfinete colorido e mantida em
formol tamponado 10 % logo após retirada 31
Figura 8B – Cassete histológico identificado com número do
animal e dia de coleta para alojar a amostra coletada
31
Figura 8C – Frasco contendo formol tamponado a 10 % para
armazenamento das amostras
31
XVII
Lista de Tabelas
Tabela 1. Análise de fibroblastos pela coloração de hematoxilina-
eosina de cada grupo segundo dias de coleta ...................... 38
Tabela 2. Análise de vasos pela coloração de hematoxilina-eosina de
cada grupo segundo dias de coleta....................................... 38
Tabela 3. Análise de tecido de granulação pela coloração de
hematoxilina-eosina de cada grupo segundo dias de
coleta.................................................................................... 38
Tabela 4. Comparação das variáveis analisadas através da coloração
de hematoxilina-eosina entre os dias de coleta.................... 39
Tabela 5. Análise de infiltrado inflamatório pela coloração de
hematoxilina-eosina de cada grupo segundo dias de
coleta.................................................................................... 40
Tabela 6. Descrição dos percentuais de área de colágeno tipo I e tipo
III no 7º dia........................................................................... 40
Tabela 7. Descrição dos percentuais de área de colágeno tipo I e tipo
III no 14º dia........................................................................ 41
Tabela 8. Comparações das médias de colágeno tipo I e tipo II
segundo grupos e dias de coleta........................................... 41
Tabela 9. Comparações dos percentuais de área de colágeno tipo I
entre os grupos ou dias de coleta......................................... 42
Tabela 10. Comparações dos percentuais de área de colágeno tipo III
entre os grupos ou dias de coleta......................................... 43
Tabela 11. Descrição das médias de retardo óptico segundo grupos
com amostras coletadas no 7º dia......................................... 43
Tabela 12. Descrição das médias de retardo óptico segundo grupos
com amostras coletadas no 14º dia....................................... 44
Tabela 13. Resultado das comparações entre os grupos para as
médias de retardo óptico 45
XVIII
Lista de Abreviaturas e Símbolos
A1GaInP Alumínio gálio índio fósforo
Anova Análise de variância
AsGaAl Arseneto de gálio e alumínio
bFGF basic Fibroblast Growth Factor - Fator básico de Crescimento
de Fibroblastos
°C Graus Celsius
Cedeme Centro de Desenvolvimento de Modelos Experimentais
CEP Comitê de Ética em Pesquisa
cm Centímetro
cm2
Centímetro quadrado
COBEA Colégio Brasileiro de Experimentação Animal
λ Comprimento de onda
DAB Diaminobenzina
DE Densidade de energia
DP Densidade de potência
DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium - Meio de Eagle
modificado por Dulbecco
E Energia total
EPM Escola Paulista de Medicina
et al. E colaboradores
FMUSP Faculdade de Medicina da USP
GaAlAs Gálio alumínio arsenieto
G Grama
º Graus
GA Grupo alta dose
XIX
GB Grupo baixa dose
GS Grupo simulado
GA7 Subgrupo alta dose 7 dias
GA14 Subgrupo alta dose 14 dias
GB7 Subgrupo baixa dose 7 dias
GB14 Subgrupo baixa dose 14 dias
HE Hematoxilina-Eosina
HeNe Hélio-Neônio
J/cm² Joules por centímetro quadrado
J Joules
Kg Quilograma
Incor Instituto do Coração, FMUSP
LLLT Low Level Laser Therapy – Terapia a Laser de Baixa
Intensidade
Lamav Laboratório de Materiais Vítreos, UFSCar
Laser Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation -
Amplificação da Luz por Emissão Estimulada de Radiação
LED Light Emitting Diode - Diodo Emissor de Luz
MEC Matriz extracelular
m2
Metro quadrado
µm Micrômetro
mg Miligrama
mg/kg Miligrama por quilograma de massa corporal
mL Mililitro
mm Milímetro
mW Miliwatt
MII Morte induzida indolor
XX
N Número da amostra total
n Número da amostra por grupo
nm Nanômetro
% Porcentagem
P Potência útil
PBS Phosphate Buffered Saline – Salina Tamponada com Fosfato
PO Pós-operatório
R Rato
RO Retardo óptico
s Segundo
SFB Soro Fetal Bovino
UFSCar Universidade Federal de São Carlos
Unifesp Universidade Federal de São Paulo
USP Universidade de São Paulo
WALT World Association of Laser Therapy
W Watt
XXI
RESUMO
Introdução: O laser de baixa intensidade (LLLT) é um recurso utilizado
para modulação do processo de cicatrização, sobretudo nos comprimentos
de onda vermelho e infravermelho. Estudos in vitro com altas doses de
energia promovem aumento da apoptose em fibroblastos, redução da
proliferação e metabolismo celular. Há escassez de estudos in vivo com
altas dosagens de energia no processo cicatricial. Objetivo: Investigar a
ação da terapia a laser de baixa intensidade (808 nm) em alta e baixa
dosagem na cicatrização de ferida incisional em pele de ratos. Métodos:
Foram utilizados 60 ratos Wistar-EPM machos de 8 semanas, distribuídos
em 3 grupos (GS: simulado; GB: 1,5 J; GA: 60 J) e subdivididos em 2
subgrupos em função do dia de coleta das amostras (7 dias: GS7, GB7,
GA7: 14 dias: GS14, GB14, GA14). Foi realizada incisão no dorso dos
ratos, que foi irradiada com laser infravermelho (808 nm) por 5 dias
consecutivos. As amostras de tecido cicatricial foram submetidas a preparo
histológico para coloração de hematoxilina e eosina, imunohistoquímica de
colágeno I e III e birrefringência de fibras colágenas. Resultados: O
retardo óptico (RO) foi maior nos grupos GB e GA independentemente do
dia de coleta em relação ao grupo GS (p < 0,001). A quantidade de
fibroblastos (p < 0,001), vasos (p < 0,021) e tecido de granulação
(p < 0,010) foi reduzida nos grupos com amostra coletada no 14º dia em
relação aos grupos com amostra coletada no 7º dia. A quantidade de
colágeno tipo I reduziu em todos os grupos independente do dia de coleta
(p <0,001). A quantidade de colágeno tipo III reduziu no 14º dia no GA (p
< 0,05). Conclusão: A LLLT nas doses de 1,5 e 60 J reduziu fibroblastos,
vasos e tecido de granulação no 14º dia.; aumentou o RO da cicatriz e pele
adjacente; reduziu quantidade de colágeno tipo I. O colágeno tipo III
reduziu no 14º dia com a dose de 60 J.
INTRODUÇÃO
2 Introdução
1. INTRODUÇÃO
O processo de cicatrização envolve fenômenos bioquímicos e
fisiológicos que interagem entre si para que ocorra a reparação tecidual
(MANDELBAUM, SANTIS, MANDELBAUM, 2003; EMING, KRIEG,
DAVIDSON, 2007; GURTNER et al., 2008; FERREIRA et al., 2009).
Qualquer desequilíbrio nessa cascata de eventos pode acarretar tanto um
retardo da cicatrização levando, por exemplo, à formação de úlceras
(KAVROS, MILLER, HANNA, 2007; BRANDI et al., 2010) quanto sua
exacerbação, resultando em cicatrizes fibroproliferativas (HOCHMAN et
al., 2005; ROBLES & BERG, 2007; KÖSE & WASEEN, 2008;
FERREIRA et al., 2010).
Existem diversos recursos biofísicos utilizados para modular o
processo de cicatrização de forma dose-dependente. Na literatura, são bem
descritos os efeitos estimulatórios da eletroterapia, ultrassom (ENNIS et
al., 2006) e terapia a laser de baixa intensidade (LLLT, Low Level Laser
Therapy) (CORAZZA et al., 2007; REZENDE et al., 2007; BRANDI et al.,
2010). Por outro lado, há escassez de estudos em relação aos efeitos
inibitórios, o que seria de grande valia no tratamento das cicatrizes
fibroproliferativas (HOCHMAN et al., 2013). Nesse sentido, BORBA et al.
(2009) estudaram a ação da eletroterapia em cicatrização de feridas
incisionais em ratos. Estudos in vitro com fototerapia de baixa intensidade
relatam a inibição do metabolismo celular e apoptose (SHU et al., 2002;
WEBB & DYSON, 2003; HOURELD & ABRAHAMSE, 2008; LEV-
TOV et al., 2013-a; LEV-TOV et al., 2013-b).
A LLLT é uma modalidade da fototerapia que vem sendo objeto de
estudo no processo de reparo tecidual devido ao seu caráter biomodulador,
com atuação central no metabolismo mitocondrial (KARU et al., 2005). Os
3 Introdução
comprimentos de onda entre 660 nm e 950 nm são frequentemente
utilizados em pesquisas que visam avaliar os efeitos estimulatórios sobre a
cicatrização cutânea (BONATTI et al., 2011), sobretudo no que se refere à
síntese de colágeno (REZENDE et al., 2007; SILVA et al., 2007),
proliferação de fibroblastos (WEBB & DYSON, 2003; VINCK et al.,
2003; MOORE et al., 2005; LEV-TOV et al., 2013a) e angiogênese
(SCHINDL, et al., 2003; KANDOLF-SEKULOVIC, KATARANOVSKI,
PAVLOVIC, 2003; PINFILDI et al., 2005; CORAZZA et al., 2007).
Nesse sentido, a LLLT dentro do espectro vermelho (630 a 690 nm)
tem sido a mais estudada, seguida pelo infravermelho (780 a 980 nm).
Estudos in vitro e in vivo demonstraram que o espectro vermelho em doses
de energia entre 0,3 e 1,5 J, promove aumento na proliferação de
fibroblastos, angiogênese e síntese de colágeno (BEDNARSKA et al.,
1998; WEBB et al.,1998; MOORE et al., 2005; HAWKINS &
ABRHAMSE, 2006; CORAZZA et al., 2007; CHEN et al., 2009). Em
contrapartida, outros estudos in vitro demonstram a redução da proliferação
de fibroblastos com comprimento de onda vermelho quando utilizadas altas
doses de energia (SHU et al, 2002; LEV-TOV et al, 2013b).
Embora os efeitos do espectro infravermelho na diminuição da
resposta celular estejam bem elucidados com relação à proliferação de
fibroblastos, angiogênese e síntese de matriz extracelular quando utilizadas
doses de energia mais altas (entre 18 e 145 J), esses relatos provêm apenas
de estudos in vitro (WEBB et al., 2003; MOORE et al., 2005; HAWKINS
& ABRHAMSE, 2006; LEV-TOV et al., 2013).
Assim, verifica-se que a LLLT exerce um efeito dose-dependente
sobre o metabolismo celular, sendo que doses de energia mais baixas geram
um aumento da resposta, ao passo que doses mais elevadas promovem
redução ou inibição. Os estudos que relataram esses efeitos inibitórios
4 Introdução
relacionam sua aplicabilidade clínica, como no tratamento de cicatrizes
fibroproliferativas (WEBB et al., 2003; MOORE et al., 2005; LEV-TOV et
al., 2013). Contudo, não foram encontrados estudos especificamente
direcionados à verificação do efeito inibitório da LLLT com altas doses de
energia comparadas a doses menores, na cicatrização in vivo.
Também são pouco estudados o alinhamento e a disposição espacial
de fibras colágenas em feridas incisionais na pele, o que seria de grande
relevância clínica, pois quanto mais alinhadas essas fibras, melhor a
qualidade e o aspecto da cicatriz (BERRY et al., 1998; SILVA et al., 2006).
A maioria dos estudos avalia os colágenos tipo I e tipo III e o seu
alinhamento em estruturas como ligamentos e tendões (PUGLIESE et al.,
2003; WOOD et al., 2010). Entretanto SILVA et al. (2006), estudando pele
de ratos queimados, analisaram por birrefringência o alinhamento das
fibras de colágeno após irradiação com laser de He-Ne e constatou que
houve maior valor de retardo óptico, portanto um melhor alinhamento das
fibras de colágeno.
Não há estudos in vivo especificamente direcionados à comparação
do efeito do laser infravermelho em baixas ou altas doses de energia no
alinhamento ou na quantidade das fibras de colágeno da pele, no processo
de cicatrização, embora a disposição e a quantidade dessas fibras denote a
qualidade e o aspecto da cicatriz.
OBJETIVO
6
Objetivo
2. OBJETIVO
Investigar a ação da terapia a Laser de baixa intensidade (808nm) em
baixa e alta dosagem na cicatrização de ferida incisional em pele de
ratos.
LITERATURA
8
Literatura
3. LITERATURA
3.1 Laser Vermelho
3.1.1 Estudos in vitro
WEBB, DYSON, LEWIS (1998) investigaram o efeito da terapia a
laser de baixa intensidade (LLLT, Low Level laser Therapy) de 660 nm em
fibroblastos de cicatrizes hipertróficas e de pele. As amostras foram obtidas a
partir de biópsias de cicatrizes hipertróficas e pele adjacente de mulheres
chinesas de 20 anos de idade submetidas a cirurgias de correção de cicatriz
nas regiões de ombro e pescoço. As células foram cultivadas em meio DMEM
(Dulbecco's Modified Eagle Medium - Meio de Eagle modificado por
Dulbecco) e lavadas em solução salina (PBS - Phosphate Buffered Saline),
sendo armazenadas em frascos de cultura e permanecendo em estufa a 37 ºC e
5 % de CO2. Após confluência de 80 %, os fibroblastos foram caracterizados
por imuno-histoquímica para excluir outros tipos celulares e assegurar a
homogeneidade das amostras. Em seguida, as células derivadas de cicatrizes
hipertróficas e de pele foram distribuídas em grupos (de acordo com as doses
de energia): sham, 2,4 J/cm2 e 4 J/cm
2; e subgrupos (de acordo com os dias de
contagem): 1, 2, 3, 4 e 5. Os parâmetros utilizados para irradiação foram
potência (P) de 17 mW; área de secção transversa do feixe de 0,217 cm2;
densidade de potência (DP) de 0,078 W/cm2 e densidades de energia (DE) de
2,4 J/cm2 e 4 J/cm
2, correspondendo a tempos de 31 s e 54 s e energia (E) de
0,53 J e 0,92 J respectivamente. Os procedimentos foram realizados em fluxo
laminar, onde as células foram mantidas em poços e suspensas em 100 µl de
meio de cultura. Durante a irradiação, a ponteira do equipamento permaneceu
perpendicular ao poço e a 0,6 cm de distância deste. Após a irradiação, os
poços foram preenchidos com meio de cultura e levados para a estufa. A
contagem celular foi realizada 24 h após a irradiação e sucessivamente (48, 72
e 96 h) nos outros grupos. Para essa etapa, os fibroblastos foram corados com
9
Literatura
azul de metileno e a contagem celular realizada em espectrofotômetro de
650 nm. Nos dias 1 a 4, na dose de 0,53 J, o número de células de cicatriz
hipertrófica foi muito maior que nos respectivos controles, com diferenças
entre 8,2 e 12 % (p < 0,01). A contagem de fibroblastos de pele com essa
mesma dose foi muito maior nos dias 1 a 3 (diferenças entre 7,7 e 12,8 %),
em relação aos respectivos controles (p < 0,01). Com relação à energia de
0,92 J, houve uma diferença entre 8,9 e 20,8 % entre as células de cicatriz
hipertrófica irradiadas e não irradiadas, nos dias 1 a 4. A quantidade de
células de pele também aumentou nas contagens realizadas nos dias 1 a 3,
com diferenças de 7,1 a 10,2 %. Os autores concluíram que o LLLT de
660 nm teve um efeito estimulatório em fibroblastos de pele e de cicatriz
hipertrófica com ambas as doses, sendo inapropriado para o tratamento de
cicatrizes hipertróficas.
SHU et al. (2002) verificaram o efeito inibitório do laser de He-Ne
(Hélio-Neônio) de 632,8 nm em cultura de fibroblastos de cicatrizes
hipertróficas. As células foram obtidas de 5 pacientes (3 homens e 2
mulheres) com idade entre 14 e 38 anos, portadores de cicatrizes hipertróficas
com tempo de 8 a 24 meses. A cultura dos fibroblastos foi realizada em placas
de cultura, com DMEM suplementado com 10 % de soro fetal bovino (SFB).
Após 5 dias houve confluência das células (85 %), que foram então divididas
em dois grupos: controle (sem irradiação) e experimental (recebeu irradiação
com laser He-Ne, com potência de 50 mW, área de secção transversa do feixe
de 0,32 cm2, densidade de potência (DP) de 50 mW/cm
2 e tempos de 60 s,
600 s, 1800 s e 3600 s, com energia total de 3 J, 30 J, 90 J e 180 J
respectivamente; esse grupo foi subdivido de acordo com as doses de energia
referidas. A contagem foi realizada nos dias 1, 2, 3, 4, 5, 7 e 9 após a
irradiação. A contagem das células foi efetuada em triplicata (considerando-se
10
Literatura
a média), utilizando-se corante trypan blue, nos mesmos dias adotados na
primeira etapa. Também foi realizada citometria de fluxo para complementar
a contagem. Os autores constataram que aplicações repetidas (3 a 5 vezes)
com a DE de 180 J/cm2 resultaram em diminuição do número total de
fibroblastos, em comparação aos respectivos controles.
3.1.2 Estudos in vivo
GAL et al. (2006), em estudo autocontrolado e randomizado,
avaliaram a influência do laser diodo de 670 nm na cicatrização de feridas
incisionais cutâneas, abrangendo epiderme, derme e músculo estriado, em
ratos. Foram utilizados 49 ratos machos Sprague-Dawley com 450 a 550 g e
idade entre 6 e 8 meses. Os animais foram distribuídos em 7 grupos com 7
ratos cada, em função do período de coleta das amostras para análise
histológica: 24 h, 48 h, 72 h, 96 h, 120h, 144 h e 168 h. Para realização das
feridas, os animais foram anestesiados com quetamina (40 mg/kg), xilazina
(15 mg/kg) e tramadol (5 mg/kg). Em seguida, foram realizadas duas incisões
paralelas de 3 cm de comprimento no dorso dos ratos, em sentido longitudinal
e craniocaudal, com distância de 4 cm entre elas. As feridas foram suturadas
com fio chiraflon 3-0. A incisão do lado esquerdo foi eleita como
experimental e a do lado direito, como controle. Para irradiação foi utilizado
equipamento de diodo laser de 670 nm, com densidade de potência de
25 mW/cm2, potência de 10 mW, área de secção transversa de feixe de
0,4 cm2
, densidade de energia de 30 J/ cm2 e tempo de 480 s, com energia de
4,8 J por ponto. Durante o procedimento, o lado direito foi protegido para
refletir a luz do laser, enquanto a área de aplicação foi dividida em 3 partes e
irradiada pontualmente. Decorridos os intervalos de tempos adotados, foram
11
Literatura
realizadas as coletas de amostras (2 de cada animal, 14 de cada grupo). As
amostras foram devidamente fixadas em parafina e coradas para análise
histológica com hematoxilina-eosina (coloração básica), van Gieson (fibras
colágenas), ácido periódico Schiff + ácido periódico Schiff diástase (matriz
extracelular), fosfotúngstico-hematoxilina de Mallory (fibrina) e azur e eosina
(eritrócitos, visualização de vasos). Os resultados da comparação de feridas
irradiadas com as não irradiadas (controle) demonstraram que a aplicação do
laser reduziu o período da fase inflamatória assim como acelerou a fase
proliferativa e de maturação; além disso, a epitelização e a reparação da
musculatura estriada foram estimuladas. Como conclusão, a LLLT de 670 nm
influenciou positivamente todas as fases da cicatrização.
YASUKAWA et al. (2007) investigaram o efeito do laser He-Ne em
cicatrização de incisão cirúrgica em pele de ratos. Foram utilizados 55
animais (Sprague Dawley) machos, com idade de 8 semanas e massa corporal
entre 238 e 330 g. Os ratos foram anestesiados e foram realizadas 3 incisões
de 1 cm no dorso, abrangendo pele e panículo carnoso até a fáscia muscular,
em região torácica a partir do nível do ângulo inferior das escápulas em
sentido caudal. As suturas foram realizadas com fio de mononaylon 4-0,
sendo 3 por incisão e 1 a cada 5 mm. Para irradiação, foi utilizado um
equipamento de laser He-Ne com 8,5 mW e 17 mW de potência, tempo de
15 s por ferida, densidade de potência de 139 mW/cm2, densidade de energia
de 4,21 J/cm2 e energia de 0,25 J. Os animais foram distribuídos em 11
grupos (5 em cada): controle, 5 grupos receberam irradiação com 8,5 mW e 5
grupos com 17 mW. Os grupos experimentais foram subdivididos de acordo
com os dias de irradiação: um subgrupo recebeu irradiação no 1º, 3º e 5º dias
após o ato cirúrgico; os demais subgrupos foram irradiados apenas no 1º ou
no 3º ou no 5º dia após o ato cirúrgico. Os autores observaram que, dos
12
Literatura
grupos irradiados com 8,5 mW, apenas o que recebeu energia no 5º dia após o
ato cirúrgico apresentou alteração em relação ao seu controle, consistindo de
discreta redução do infiltrado inflamatório e um leve aumento na síntese de
fibras colágenas (p < 0,05). Todos os grupos irradiados com 17 mW
apresentaram diferenças em relação ao controle, porém nenhuma diferença
entre os subgrupos. Foi encontrada importante redução do infiltrado
inflamatório e aumento de síntese de fibras colágenas. Em conclusão, os
autores afirmaram que a LLLT com He-Ne pode promover a cicatrização de
feridas cirúrgicas, sendo a melhor potência a de 17 mW, com DE de 4,1
J/cm2.
3.2 Laser infravermelho
3.2.1 Estudos in vitro
WEBB & DYSON (2003) investigaram o efeito da LLLT de 880 nm
em fibroblastos de cicatrizes hipertróficas e de pele. As amostras foram
obtidas a partir de biópsias de cicatrizes hipertróficas e pele adjacente de
mulheres chinesas de 20 anos de idade submetidas a cirurgias de correção de
cicatriz nas regiões de ombro e pescoço. As células foram cultivadas em meio
de cultura DMEM e lavadas em solução salina (PBS), sendo armazenadas em
frascos de cultura e permanecendo em estufa a 37 ºC e 5 % de CO2. Após
confluência (80 %), os fibroblastos foram caracterizados por imuno-
histoquímica para excluir outros tipos celulares e assegurar a homogeneidade
das amostras. Em seguida, as células derivadas de cicatrizes hipertróficas e de
pele foram divididas em grupos (de acordo com as doses de energia): sham,
2,4 J/cm2 e 4 J/cm
2; e subgrupos (de acordo com os dias de contagem): 1, 2, 3,
4 e 5. Os parâmetros utilizados para irradiação foram: potência (P) de 16 mW;
área de secção transversa do feixe de 0,296 cm2; densidade de potência (DP)
13
Literatura
de 0,054 W/cm2 e densidades de energia (DE) de 2,4 J/cm
2 e 4 J/cm
2,
correspondendo a tempos de 44,5 s e 74 s e energias de 0,53 e 0,92 J,
respectivamente. Os procedimentos foram realizados em fluxo laminar e
durante a irradiação, a ponteira do equipamento permaneceu perpendicular ao
poço e a 0,4 cm de distância deste. Após a irradiação, os poços foram
preenchidos com meio de cultura e levados para estufa. Para a contagem
celular, os fibroblastos foram corados com azul de metileno e o procedimento,
realizado em espectrofotômetro de 650 nm. O número de fibroblastos de
cicatrizes hipertróficas que receberam energia de 5,3 J foi significativamente
menor (p < 0,05) no quinto dia, em relação ao controle, com diferença de
8,8 %. O número de fibroblastos de pele irradiados com ambas as doses foi
menor no quarto e quinto dias, com diferenças de 4,6 e 5,9 %,
respectivamente (p < 0,05). Com relação à energia de 0,92 J, houve redução
dos fibroblastos de cicatriz hipertrófica, porém não significante; as células de
pele irradiadas apresentaram redução no quinto dia, com diferença de 5,3 %
(p < 0,05). Os autores concluíram, em função das células de pele também
terem sido inibidas, que o comprimento de onda estudado não deve ser usado
para cicatrização de úlceras, mas que poderia vir a ser uma alternativa no
tratamento de cicatrizes hipertróficas com bases em mais estudos futuros.
HOURELD & ABRAHAMSE (2008) investigaram in vitro o efeito
do laser infravermelho de 830 nm em cultura de fibroblastos de feridas de
pacientes diabéticos. Como controle, foram utilizadas células não diabéticas
de pele e células de feridas diabéticas não irradiadas. Os procedimentos foram
realizados em fluxo laminar. Para irradiação foi utilizado laser diodo de
830 nm, com potência de 55 mW, com densidade de potência de 6 mW/cm2,
área de secção transversa de 9,1 cm2, densidades de energia de 5 J/cm
2 e
16 J/cm2, tempos de 825 s (E = 45,3 J) e 2640 s (E = 145,2 J)
14
Literatura
respectivamente. As células foram irradiadas duas vezes com intervalo de
72 h entre as aplicações. Após a segunda irradiação as células foram
armazenadas a 37 ºC. Para avaliação da viabilidade celular, foi utilizada a
técnica do trypan blue e caspases 3 e 7 (para verificar apoptose) por
luminescência (proporcional à atividade da caspase) em luminômetro. A
proliferação celular foi determinada em função da concentração de Fator
básico de Crescimento de Fibroblastos (bFGF - basic Fibroblast Growth
Factor) secretado no meio após as irradiações. As células foram dispostas em
microplacas às quais foram adicionados 200 µl de anticorpo anti-FGF. Após
2 h a solução foi removida superficialmente e as células foram lavadas com
PBS. Decorridos 30 min, foram adicionados 100 µl de ácido sulfúrico
(1 mol/mL) e feita a leitura em espectrofotômetro. Cada experimento foi
repetido 4 vezes, considerando-se a média. Os autores concluíram que a
resposta celular à LLLT é dose-dependente. Foi constatada proliferação dos
fibroblastos irradiados com a DE de 5 J/cm2, em relação ao seu controle; os
fibroblastos que receberam DE de 16 J/cm2 tiveram uma redução em sua
contagem, quando comparados ao controle.
LEV-TOV et al. (2013) investigaram o efeito do LED infravermelho
em fibroblastos de pele humana. As células foram cultivadas em meio DMEM
modificado, a 37 ºC, sendo que cada placa de cultura continha 2 x 104 células.
Os fibroblastos foram irradiados com LED infravermelho (830 nm) 24 h após
a confluência, a partir dos seguintes parâmetros: DP de 360 W/m2; DE: 80,
160 e 320 J/cm2. O grupo controle recebeu irradiação de fonte de luz não
incandescente. A contagem celular foi realizada em triplicata, 48 h após a
irradiação, pelo teste de azul de trypan (Trypan blue). Verificou-se inibição da
proliferação dos fibroblastos em relação ao controle para todas as densidades
de energia. O efeito foi dose-dependente: quanto maior a densidade de
15
Literatura
energia, maior a inibição da proliferação celular. Os autores ressaltaram o uso
da LLLT no comprimento de onda infravermelho como uma possível
alternativa para tratamento de cicatrizes fibroproliferativas.
3.2.2 Estudos in vivo
REZENDE et al. (2007) avaliaram a cicatrização por segunda
intenção em pele de ratos sob irradiação com laser de 830 nm. A amostra
consistiu de 48 ratos adultos machos (Ratus novergicus, albinus, Wistar), com
massa corporal entre 200 e 230 g. Após anestesia com cloroidrato 10 %
(4 mL/kg) e tricotomia na região mediana dorsal dos animais, foi utilizado
punch de 8 mm de diâmetro para obtenção das feridas. Foram formados 3
grupos com 16 animais em cada, da seguinte forma: Grupo 1 (G1): Grupo
Controle, sem irradiação das feridas. Grupo 2 (G2): os animais receberam
irradiação de laser em dose única, com DE de 1,3 J/cm2, durante 25 s, com
energia total de 1,5 J. Grupo 3 (G3): os animais receberam irradiação de laser
em dose única, com DE de 3 J/cm2, durante 56 s, e energia total de 3,36 J. O
equipamento de laser utilizado apresentava 60 mW de potência e área de
secção transversa do feixe de 0,07 cm2. A coleta das amostras foi realizada 3,
7 e 14 dias após a realização das feridas. As biópsias incluíram a pele
adjacente à ferida e o tecido lesado em toda sua profundidade. Elas foram
armazenadas em formol 10 % por 24 h e, em seguida, fixadas em parafina. As
lâminas foram confeccionadas utilizando cortes de 6 µm de espessura do
tecido e coradas pelas técnicas de hematoxilina-eosina e tricômio de Masson.
A análise histológica foi realizada de modo semiquantitativo, considerando os
parâmetros morfológicos: epitélio, infiltrado polimorfonuclear, presença de
fibroblastos e neovascularização. O arranjo e a densidade do colágeno
também foram avaliados. Os resultados mostraram que no 3º dia não houve
diferença histológica significante na epiderme, entre o grupo controle e os
16
Literatura
irradiados; entretanto foram encontradas diferenças na derme, sendo que os
grupos G2 e G3 apresentaram maior quantidade de capilares, fibroblastos e
colágeno. Sete dias após a realização das feridas, o grupo G1, ao contrário de
G2 e G3, não apresentava epitelização completa, o processo inflamatório
persistia e o tecido conectivo apresentava-se desorganizado. Foram
observados macrófagos no G3, que estavam ausentes no G2. Além disso, a
matriz extracelular do grupo que recebeu maior dose estava menos organizada
em relação ao outro. No 14º dia, todos os grupos apresentaram epitelização
completa. G1 apresentou macrófagos, fibroblastos e neovascularização. G2 e
G3 apresentaram maior quantidade de fibroblastos e fibras colágenas
alinhadas com o epitélio, sendo que G2 teve melhor arranjo entre as fibras do
que G3. Em conclusão, a DE de 1,3 J/cm2 gerou um melhor resultado no
processo de cicatrização em comparação com a DE de 3 J/cm2, demonstrando
que as respostas celulares à LLLT são dose-dependentes.
AL-WATBAN et al. (2007) investigaram o efeito da LLLT com
diferentes comprimentos de onda (532 nm, 633 nm, 810 nm e 980 nm) em
feridas de ratos diabéticos. A amostra foi constituída por 57 ratos machos
Sprague-Dawley, distribuídos aleatoriamente em: ratos diabéticos (n = 51) e
não diabéticos (n = 6). Os ratos diabéticos foram subdivididos em grupo
controle (n = 3) sem irradiação e grupos experimentais (n = 48) subdivididos
em função do comprimento de onda: 532 nm (verde); 633 nm (vermelho);
810 nm e 980 nm (infravermelhos) e das densidades de energia padronizadas
em 5, 10, 20 e 30 J/cm2, conforme os parâmetros de cada equipamento:
532 nm - potência: 143 mW; área: 7 cm2; tempo: 4,1; 8,2; 16,3 e 24,5 min.
633 nm - potência: 140 mW; área 9 cm2; tempo: 5,4;10,7; 21,4 e 32,1 min.
810 nm e 908 nm - potência: 200 mW; área: 9 cm2; tempo: 3,8; 7,5; 15 e 22,5
17
Literatura
min. Para os procedimentos, a anestesia foi realizada com 50 mg/kg de
quetamina e 20 mg/kg de xilazina nos ratos não diabéticos; os ratos diabéticos
receberam dose 30 % menor. Após depilação com tricótomo elétrico, foram
realizadas feridas excisionais de formato oval na região glútea dos animais
por meio de bisturi abrangendo epiderme e derme em toda sua profundidade,
com áreas entre 78,51 mm2 e 88,38 mm
2. Após a cirurgia, os animais
receberam irradiação 3 vezes por semana. O grupo controle, segundo o
estudo, foi manipulado da mesma forma que os grupos experimentais, mas
não recebeu irradiação. Os resultados foram avaliados em função da área da
ferida, que foi medida com compasso durante 5 dias por semana, por 3
semanas. Os autores demonstraram que todos os grupos tratados apresentaram
maior redução da área da ferida em relação aos não tratados .Verificou-se que
a cicatrização nos ratos diabéticos do grupo controle foi mais lenta que a dos
ratos não diabéticos; a LLLT, nos parâmetros aplicados, pode ser utilizada
para acelerar a cicatrização de feridas em ratos diabéticos, sendo que o melhor
comprimento de onda foi 633 nm com DE de 10 J/cm2.
GÜNGÖRMÜS & AKYOL (2009) investigaram o efeito da LLLT de
808 nm em cicatrização de pele de ratos em feridas incisionais feitas com
diodo laser de alta potência. Foram utilizados 20 ratos Wistar com massa
corpórea entre 250 e 300 g. Os animais foram anestesiados via intraperitonial
com quetamina (10 mg/kg) e xilazina (3 mg/kg) e seus dorsos foram
depilados. Duas incisões de 1,5 cm de comprimento foram realizadas no lado
direito e esquerdo do dorso, com auxílio de diodo laser de alta potência. As
incisões da direita foram eleitas como controle (grupo laser) e as da esquerda
(grupo laser + LLLT) receberam irradiação com LLLT de 808 nm, cujo
equipamento possuía densidade de potência de 0,1 W/cm2, potência de
100 mW, área de secção transversa de feixe de 1 cm2, densidade de energia de
18
Literatura
2 J/cm2, tempo de 20 s e energia de 20 J por sessão. As aplicações de LLLT
foram feitas de modo pontual por 5 dias, sendo a primeira logo após o ato
cirúrgico e as demais, a cada dois dias (2º, 4º, 6º e 8º dia). Metade dos animais
foi submetida à morte indolor assistida após 10 dias e metade, após 20 dias.
As amostras foram coletadas, fixadas em parafina e coradas com
hematoxilina-eosina, para análise de epitelização e infiltrado inflamatório. Os
resultados demonstraram que no décimo dia, o grupo laser + LLLT
apresentou redução significante do processo inflamatório em relação ao
controle; no vigésimo dia, houve melhor epitelização do grupo experimental.
Em conclusão, a incisão com diodo laser (4 W) em conjunto com LLLT de
808 nm (10 J/ cm2) foi benéfica no processo de cicatrização em pele de ratos.
AKYOL & GÜNGÖRMÜS (2010) investigaram o efeito da LLLT em
feridas incisionais por diodo laser em ratos diabéticos. Foram utilizados 18
ratos Wistar entre 250 e 300 g, induzidos à diabetes por injeção
intraperitoneal de estreptozotocina a 50 mg/kg. Após 48 h, os ratos
apresentando glicemia igual ou superior a 250 mg/dL foram incluídos no
estudo. Para realização dos procedimentos, os animais foram anestesiados
com quetamina (10 mg/kg) e xilazina (3 mg/kg) via intraperitoneal. Em
seguida, o dorso foi depilado e foram realizadas 3 incisões de 1,5 cm em cada
rato, sendo uma incisão do lado esquerdo do dorso realizada com diodo laser
de alta potência (4 W), que recebeu LLLT de 808 nm (grupo experimental,
G3) e duas incisões do lado direito, uma realizada com bisturi lâmina nº 15
(grupo controle, G1) e outra com diodo laser (grupo controle, G2). Todas as
incisões foram suturadas com fio poliglicólico 3-0. Os autores consideraram
n = 18 em cada grupo. Os parâmetros de irradiação do grupo experimental
com LLLT de 808 nm foram: densidade de potência 0,1 W/cm2; tempo: 20 s;
19
Literatura
DE: 2 J/cm2; distância de 1 cm da ferida. Foram realizadas 5 irradiações, a
primeira logo após a cirurgia e as demais a cada dois dias. Foram coletadas
amostras no 10º e 20º dias, de 9 ratos em cada. A análise histopatológica
realizada foi por hematoxilina-eosina (HE) para avaliação de epitelização e
grau de inflamação. Foram aplicados testes estatísticos de Kruskall-Wallis,
Mann-Whitney e teste-U. Quanto à reepitelização, houve diferença entre os 3
grupos, no 10º dia, sendo que G1 apresentou menor grau de reepitelização em
relação a G2 e G3. As feridas dos grupos incisionados com laser (G2 e G3)
cicatrizaram mais rápido que aquelas do grupo com bisturi (G1). No 10º dia,
as feridas de G1 e G2 encontravam-se predominantemente em fase aguda,
enquanto a de G3 apresentava mais tecido de granulação. No 20º dia não
houve diferença quanto ao grau de inflamação entre os grupos. Concluiu-se
que a incisão com diodo laser em conjunto com LLLT de 808 nm com DE de
10 J/cm2 foi benéfica para a cicatrização de feridas em ratos diabéticos.
3.3 Birrefringência em pele
SILVA et al. (2006), em estudo autocontrolado, investigaram a
organização das fibras colágenas em pele de ratos queimados após irradiação
com LLLT vermelha direcionada com vetores de radiação. Foram utilizados
20 ratos Wistar, adultos, machos, com 300 g. Após anestesia com Avertin
(0,025 mL/g), o dorso dos animais foi depilado e foram realizadas 3
queimaduras circulares com diâmetro de 6 mm a partir de haste cilíndrica de
cobre a 77 K. As lesões foram divididas em controle (C), que não recebeu
irradiação; experimentais: LII que recebeu irradiação alinhada por polarizador
de campo elétrico e paralelo à lesão e L┴ que recebeu irradiação direcionada
perpendicularmente à lesão. Foi utilizado laser He-Ne (632,8 nm) com
potência de 10 mW; DE de 1 J/cm2; tempo de 3 min. A coleta das amostras
foi realizada em 5 dias distintos, sendo 4 animais em cada um: 3, 7, 10, 14 e
20
Literatura
17 dias após a queimadura. Após coleta, os tecidos foram fixados em parafina
e foram preparadas as lâminas para análise. Os resultados demonstraram que
o vetor de campo eletromagnético interferiu no alinhamento do colágeno na
derme; as lesões irradiadas com a polarização paralela à lesão apresentaram
maior retardo óptico (RO) do que as lesões irradiadas perpendicularmente,
indicando que o colágeno ficou mais organizado no grupo LII.
MÉTODOS
22
Métodos
4. MÉTODOS
4.1 Desenho do estudo e Comitê de ética em pesquisa
O presente estudo é experimental, analítico, controlado, aleatorizado,
prospectivo, com duplo mascaramento (patologista e estatístico).
Foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP), número
1308/08 (Apêndice 1).
4.2 Amostra
Foram utilizados 60 ratos Wistar-EPM (Rattus norvegicus),
adultos jovens de 8 semanas, machos, com massa corpórea entre 250 e
300g, oriundos do Biotério Central do Centro de Desenvolvimento de
Medicina Experimental (CEDEME) da Universidade Federal de São Paulo
(UNIFESP). Os procedimentos experimentais foram realizados no
Laboratório de Cirurgia Experimental da Disciplina de Cirurgia Plástica da
UNIFESP . Os animais foram confinados no biotério deste laboratório, em
gaiolas individuais de plástico, com tampa metálica própria para dispor o
recipiente com água e ração consumidos ad libitum. O ambiente foi
mantido, por meio de dispositivos eletrônicos, à temperatura constante de
22ºC, com manutenção do grau de umidade e períodos controlados de 12
horas de luz, de acordo com os critérios do Colégio Brasileiro de
Experimentação Animal (COBEA). Houve avaliações diárias para
observação de sinais que evidenciem infecção secundária.
4.3 Delineamento do estudo
4.3.1 Distribuição da amostra
Os 60 animais foram distribuídos, aleatoriamente, através de
23
Métodos
programa disponível no site www.randomization.com (Apêndice 2), em 3
grupos (de acordo com a energia) e 6 subgrupos (de acordo com o dia de
coleta de tecido), sendo que a amostra de cada grupo foi igual a 10 (figura
1). O grupo simulado (GS) não recebeu energia; os grupos experimentais
Baixa Dose (GB) e Alta Dose (GA) receberam 1,5 J e 60 J por ponto,
respectivamente.
O GS foi distribuído em 2 subgrupos (GS7, GS14), que foram
submetidos à realização de incisão cutânea cirúrgica e à simulação de
laserterapia com a caneta de laser desligada. Os grupos experimentais (GB
e GA) foram distribuídos, cada um, em 2 subgrupos (GB7, GB14; GA7,
GA14 ), que foram submetidos à realização de incisão cutânea cirúrgica e à
aplicação de laser infravermelho.
Figura 1. Esquema da distribuição dos grupos e subgrupos simulados e
experimentais. GS: Grupo Simulado; GB: Grupo Experimental Baixa
Energia (1,5 J) ; GA: Grupo Experimental Alta Energia (60J).
A coleta de tecido para análise foi realizada no sétimo dia após a
incisão cutânea cirúrgica nos subgrupos GS7, GB7, GA7. Nos subgrupos
GS14, GB14, GA14, a coleta foi realizada no décimo quarto dia após o ato
operatório. Encerrada a coleta, os animais foram induzidos à morte induzida
indolor .
GS
GS7
n=10
GS14
n=10
GB
GB7
n=10
GB14
n=10
GA
GA7
n=10
GA14
n=10
24
Métodos
4.3.2 Anestesia
Previamente a cada procedimento: cirurgia, aplicação de laser e coleta
de tecido, foi realizada anestesia com injeção intramuscular de cloridrato de
quetamina (100mg/kg) e cloridrato de xilazina (50mg/kg) no músculo
gastrocnêmio. Foi utilizada seringa de 1 mL e agulha 13 x 3 mm (30 G ½).
4.3.3 Incisão cutânea
Para obtenção dos ferimentos cutâneos cirúrgicos no dorso dos
animais, foi demarcado um retângulo com auxílio de gabarito de acetato (3
x 6 cm) e caneta dermográfica a partir da linha transversa interescapular
superior, em sentido crânio-caudal (figura 2A). Em seguida foi realizada
epilação digital (PINFILDI et al., 2005), conforme figura 2B.
Figura 2 – Epilação digital
2A. Demarcação com gabarito de acetato da área a ser
epilada.
2B. Região dorsal do animal após epilação digital.
25
Métodos
A partir de outro gabarito de acetato (2 x 3 cm) foi demarcada a linha
de incisão e dos pontos de sutura, com caneta dermográfica (figura 3A). A
incisão com comprimento de 3 cm, na qual foram delimitados pontos
equidistantes de 1 cm a partir das extremidades e entre si, para a realização
da sutura. Com auxílio de um bisturi, com lâmina nº15 estéril, foi realizada
a incisão na linha mediana dorsal, sobre a linha traçada acima descrita,
incluindo pele e panículo carnoso até a fáscia muscular (figura 3B). A
hemostasia foi realizada com suave manobra de compressão com gaze
estéril seca. Em seguida, a incisão foi suturada por ponto simples com fio
monofilamentar de náilon 4-0, de forma previamente padronizada (figura
3C). Ao final do procedimento foi realizada em todos os ratos analgesia
com cloridrato de tramadol (5mg/kg).
Figura 3 – Incisão cirúrgica e sutura
Figura 3A. Demarcação no dorso do animal com gabarito de acetato e caneta
dermográfica da incisão com 3 cm e dos pontos de sutura equidistantes de 1
cm entre si e a partir das extremidades.
Figura 3B. Pele incisionada na região dermarcada.
Figura 3C. Pontos de sutura equidistantes de 1 cm.
26
Métodos
4.3.4 Aplicaçaõ de laser
Após a realização da incisão, cada animal foi posicionado para
receber irradiação. Foi utilizado gabarito de acetato (2 x 5 cm), em que
foram realizadas 3 aberturas com punch de 3 mm, equidistantes 1 cm
(figura 4A). O gabarito foi posicionado no dorso do animal de modo que
coincidisse com os pontos de irradiação: 1 ponto a cada 1 cm, a partir de
0,5 cm das extremidades de modo que cada um ficasse no ponto médio
entre os pontos de sutura (figura 4B).
Após os posicionamentos do animal, do gabarito e da caneta laser,
foi realizada a aplicação de LLLT de modo pontual, com contato e
perpendicular à incisão (figura 5). A ponteira foi posicionada em suporte de
modo que permanecesse imóvel durante o procedimento; foi envolvida por
filme plástico de policloreto de vinila (PVC), que era trocado após a
Figura 4 – Preparo para irradiação.
4A. Gabarito de acetato com 3 pontos equidistantes de 1 cm para
aplicação de laser.
4B. Gabarito posicionado no dorso do animal para aplicação de laser.
27
Métodos
irradiação em cada animal. A aplicação, em todos os grupos, foi efetuada
em cima da incisão em três pontos, que foram padronizados com gabarito
de acetato, sendo demarcados a cada 1cm, a partir de 0,5cm da extremidade
cranial até 0,5cm da extremidade caudal, de maneira que o local de
irradiação fosse o ponto médio entre cada ponto de sutura, conforme
descrito.
As irradiações com laser infravermelho foram realizadas a cada 24
horas, sempre no período matutino, sendo a primeira 5 minutos após o ato
cirúrgico. Todos os subgrupos simulados e experimentais foram submetidos
respectivamente à simulação ou irradiação durante 5 dias consecutivos.
Foi utilizado o equipamento de Laser de InGaAlP Flash Lase III®
(DMC Equipamentos Médico-odontológicos), com comprimento de onda
de 808 nm, potência de 100mW (carta de calibração no Anexo 1),
Figura 5. Aplicação de LLLT mediante uso de
gabarito de acetato e com auxílio de suporte para
apoio da caneta de laser.
28
Métodos
densidade de potência de 3,57 W/cm2, área de secção transversal do feixe
de 0,028 cm2. Nos subgrupos experimentais GB (GB7; GB14) as feridas
incisionais foram submetidas à irradiação com densidade de energia por
ponto de 54 J/cm2, durante 15 s por ponto. Para os subgrupos experimentais
GA (GA7; GA14), a DE do Laser infravermelho foi de 2143 J/cm2,
durante 600 s por ponto. Para os subgrupos GS (GS7 e GS14), os
procedimentos foram realizados de modo semelhante aos demais grupos e
com tempo igual ao do grupo de maior exposição à irradiação (GA), porém
o equipamento de laser permaneceu desligado. A figura 6 apresenta os
parâmetros de irradiação para cada grupo.
Grupo GC GB GA
E/ponto(J) 0 1,5 60
DE(J/cm2) 0 54 2143
t (s) 600 15 600
E total (J) 0 4,5 180
Como o equipamento possui densidade de energia máxima de 999
J/cm2, foi realizado cálculo a fim de que a ferida dos grupos GA recebesse
adequadamente a dose de energia: foram acionados 3 disparos em cada
ponto com DE de 714 J/cm2, que equivalem ao tempo de 10 minutos e
energia de 20 J. Para que o pesquisador acompanhasse a irradiação, foi
utilizado um papel para anotação, relacionando cada ponto e o número de
disparos recebidos.
Figura 6. Parâmetros utilizados em cada grupo, para irradiação por ponto.
E: energia total; DE: densidade de energia; t: tempo; GC: grupo controle;
GB: grupo experimental baixa dose; GA: grupo experimental alta dose.
29
Métodos
4.3.5 Coleta de tecido para análise
A coleta do material foi obtida no 7º PO (pós-operatório), para os
animais dos grupos GC7, GB7, GA7; no 14º PO, para os animais dos
grupos GC14, GB14, GA14. No dorso dos animais, com auxílio de gabarito
de acetato (3 x 5 cm), no qual foi feita uma abertura em forma de retângulo
com as medidas da amostra a ser retirada (1 x 2 cm) e feita uma marcação
no ponto médio do lado maior do retângulo de modo a coincidir com a
cicatriz (figura 7A). O gabarito foi posicionado no dorso do animal,
conforme figura 7B e com caneta dermográfica, foi demarcada a área de
coleta de tecido, que correspondeu ao terço médio da cicatriz abrangendo 1
cm de tecido cicatricial e 2 cm de pele adjacente (1cm de cada lado). Com
auxílio de bisturi, a área tecidual correspondente ao terço médio da cicatriz
e pele adjacente foi retirada, incluindo tecido cicatricial e dérmico em toda
sua profundidade.
30
Métodos
Após obtenção dos tecidos, os animais foram submetidos à MII com
hiperdosagem da mistura anestésica via intraperitoneal por cloridrato de
quetamina (1g/Kg) e cloridrato de xilazina (500mg/Kg), seguida de secção
dos grandes vasos cervicais.
4.4 Preparo das amostras de tecido para análises histológicas
As amostras das cicatrizes cutâneas foram fixadas por meio de
alfinetes coloridos, em que cada cor correspondia ao número do respectivo
animal (figura 8A). As amostras permaneceram imersas em formol
tamponado a 10% por 40 minutos e o controle foi feito mediante uma
Figura 7 – Preparo para coleta de tecido.
7A. Gabarito de acetato para demarcação da área de tecido a ser coletada para
análise.
7B. Gabarito posicionado para delimitar a área de coleta de tecido cicatricial e
pele adjacente, compreendidos no terço médio da cicatriz.
31
Métodos
relação em folha de papel (Apêndice 3). Em seguida, os tecidos foram
retirados da borracha e alocados separadamente em grades k-7 identificadas
(figura 8B), que permaneceram armazenadas em frascos de coleta
individuais com solução de formaldeído a 10% (figura 8C).
As amostras coletadas foram enviadas ao laboratório da Disciplina
de Anatomia Patológica do Departamento de Morfologia da UNIFESP para
confecção das lâminas histológicas. O material coletado foi processado
histologicamente conforme protocolo do Laboratório de Patologia da
UNIFESP e emblocado em parafina. De cada bloco de parafina, foram feito
cortes histológicos, montados em lâminas histológicas, previamente
Figura 8 – Amostra coletada.
8A: amostra fixa com alfinete colorido e mantida em formol tamponado
10% logo após retirada.
8B. Cassete histológico identificado com número do animal e dia de
coleta para alojar a amostra coletada.
8C. Frasco contendo formol tamponado a 10 % para armazenamento das
amostras
32
Métodos
silanizadas (Organosilano, marca Sigma®), exceto as lâminas para análise
de birrefringência. Os cortes histológicos com 5 µm de espessura foram
corados pela técnica histoquímica de hematoxilina e eosina e para
birrefringência de fibras colágenas; os cortes de 3 µm foram submetidos à
técnica de imunohistoquímica de colágeno tipo I e tipo III.
4.4.1 Histoquímica
4.4.1.1 Técnica de coloração por hematoxilina-eosina
As lâminas com cortes de 5 um encaminhadas para coloração
histoquímica foram previamente desparafinizadas com xilol em 3 banhos
de 5 minutos e hidratadas com concentrações descrescentes de álcool
100%, 95%, 80%, 70% e água.
Para a coloração, as laminas permanceram 20 minutos imersas em
Hematoxilina de Harry's; em seguida foram lavadas em água corrente por 1
vez. Após, foram lavadas 5 segundos com diferenciador para hematoxilina,
novamente em água corrente por 2 vezes. em solução amoniacal por 1
minuto e em água corrente por 1 vez.
Em seguida, as lâminas foram mergulhadas em Eosina Y 1% em
álcool 95% por 5 a 7 minutos. Foi realizada bateria de montagem: 2 vezes
em álcool 95%, 3 vezes em álcool 100% e 3 vezes em xilol. A montagem
foi efetuada em meio permanente (Ervmount- Erviegas).
4.4.2 Imunohistoquímica
4.4.2.1 Técnica imunohistoquímica para pele de rato
Para reação de imunohistoquímica de colágeno do tipo I e III, foram
utilizados anticorpos de rato.
33
Métodos
Os cortes histológicos de 3 µm de espessura foram aderidos em
lâminas tratadas com silano, que permaneceram em estufa a 60oC por 16 a
18 horas. Posteriormente, foram desparafinizadas em 3 banhos de xilol a
temperatura ambiente e hidratadas em concentrações decrescentes de etanol
(100%, 95%, 80%, 70% ) e água.
A recuperação antigênica foi realizada em banho-maria a 37º C com
as lâminas imersas em solução de ácido acético 0,5M por 90 minutos. Em
seguida foi efetuado o bloqueio da peroxidase endógena com 3 banhos de 5
minutos com peróxido de hidrogênio 10 volumes. As lâminas foram
lavadas posteriormente em água corrente por 2 vezes, em água deionizada
1 vez e em tampão fosfato de sódio (PBS) por 1 vez. Em seguida, foi
realizado o bloqueio de sítios inespecíficos com solução de caseína 2% em
PBS por 60 minutos (temperatura ambiente).
Para incubação foram utilizados anticorpos primários de rato para
colágeno tipo I (Abcam) e colágeno tipo III (Abcam), que foram diluídos
em solução de caseína 1% em PBS.(colágeno tipo I – 1:1000; colágeno tipo
III – 1:20) e mantidos a 4º C, overnight (18 horas). Após esta etapa, as
lâminas foram lavadas 3 vezes em PBS.
Como complemento da reacao de imunoperoxidase, usou-se o
Polimero Histofine da Biogen por 30 minutos em temperatura ambiente.
Novamente, as laminas foram imersas em 3 banhos de 5 minutos com PBS.
Em seguida foi realizada a revelação com diaminobenzidina (DAB)
Sigma para peroxidase, por 5 minutos em temperatura ambiente. Após, as
lâminas foram lavadas em água corrente por 2 vezes. Os cortes foram
contracorados com Hematoxilina de Harry’s por 1 minuto..
A desidratação das lâminas foi realizada em concentrações
crescentes de álcool e diafanização em xilol. A montagem foi realizada com
historesina da Erviegas.
34
Métodos
Para obtenção dos controles negativos foi realizado o processo acima
descrito, porém os anticorpos primários foram omitidos.
4.5 Análise morfométrica
4.5.1 Hematoxilina-eosina
Os cortes corados pela técnica de hematoxilina-eosina foram
analisados microscopicamente e suas características (intensidade do
infiltrado inflamatório, fibroblastos, vasos) foram anotadas de forma semi-
quantitativa.
Foi realizada a leitura das lâminas em microscópio óptico Leica™
com uma lente ocular de 10 vezes de aumento e objetiva de 40X,
totalizando um aumento de 400 vezes.
O avaliador (patologista), não tinha conhecimento sobre a qual grupo
pertencia cada lâmina. Para a avaliação, foi selecionada a região central da
cicatriz, compreendida entre epiderme e panículo carnoso (Apêndice 4). A
escala adotada foi padronizada com escores de 0 a 3, sendo 0 ausência do
evento avaliado; 1 presença do evento avaliado de modo discreto; 2:
presença do evento avaliado de modo moderado; 3: presença do evento
avaliado de modo intenso. Foi realizada a média desses campos para
obtenção dos resultados finais.
4.5.2 Imunohistoquímica de colágeno tipo I e tipo III
Para realização da quantificação de colágeno tipo I e tipo III foram
realizadas fotomicrografias com objetiva de 40X da região central da
cicatriz, conforme descrito na análise da coloração de HE. Foi utilizado
35
Métodos
microscópio Leica™
.
Para a quantificação do colágeno no tecido cicatricial, as
fotomicrografias foram recortadas no programa de imagen Microsoft
Office™
2010 de modo que toda a pele adjacente fosse excluída. A análise
quantitativa das imagens obtidas foi realizada através do programa QWin
Plus V3 Leica™
. As quantificações foram obtidas em pixels convertidos
automaticamente pelo programa em micrometros quadrados e percentual de
área marcada referente ao tipo de colágeno avaliado; sendo que 1 pixel
correspondia a 0,16 µm2. Foram realizadas 3 medidas e adotada a média. O
avaliador não tinha conhecimento a qual grupo pertencia cada lâmina. Os
dados foram tabulados e encaminhados para análise estatística.
4.6 Birrefringência de fibras colágenas
A análise das fibras de colágeno foi realizada com base em uma de
suas propriedades anisotrópicas ópticas: a birrefringência intrínseca, por
microscopia de polarização.
Previamente à análise de birrefringência, as lâminas histológicas
permaneceram imersas por 30 minutos em água destilada (VIDAL et al.,
1987). Após o período de imersão, foram cobertas por lamínulas, contendo
água destilada nas interfaces.
As medidas de retardo óptico (RO) em nm, foram obtidas pela
microscopia de luz polarizada no microscópio Leica, com uma objetiva Pol
10x/0,22, condensador 0,9, compensador de Sénarmont 1/4, luz
monocromática = 546 nm, obtidas por meio de um filtro de interferência
Leica; no Laboratório de Materiais Vítreos (LAMAV) da Universidade
Federal de São Carlos (UFSCar).
Para obtenção das medidas, o eixo longo da cicatriz foi mantida a
aproximadamente 45º em relação aos polarizadores do microscópio.
36
Métodos
A partir destes parâmetros foram realizadas 5 medidas de RO, em
duas regiões: cicatriz e pele adjacente à direita ou à esquerda da incisão. Os
lados da cicatriz a serem avaliados foram aleatorizados no programa
disponível em “www.randomization.com” (Apêndice 5). Foram
desprezados os valores extremos (maior e menor) e realizada a média dos 3
restantes e o valor multiplicado por 1,33 (valor do índice de refração da
água).
4.7 Análise Estatística
Todos os dados coletados referentes à morfometria e birrefringência
foram tabulados e submetidos à análise estatística. Foi utilizado o programa
SPSS 20.0.
Foram descritas as médias dos escores atribuídos a cada parâmetro
da histoquímica (hematoxilina-eosina), de imunohistoquímica e de retardo
óptico (birrefringência de fibras colágenas), segundo os grupos GS, GA e
GB e o dia de coleta com uso de medidas resumo (média, desvio padrão,
mediana, mínimo e máximo) (KIRKWOOD & STERNE, 2006).
Os grupos foram comparados para cada parâmetro com uso de
análises de variâncias (ANOVA) com dois fatores (NETER et. al., 1996),
sendo grupos e dias de coleta; as estimativas dos parâmetros foram
realizadas com método de mínimos quadrados para evitar problemas com a
ausência de normalidade de distribuição testada com uso do teste
Kolmogorov-Smirnov (KIRKWOOD & STERNE, 2006). Foram utilizadas
comparações múltiplas de Bongferroni (NETER et. al., 1996) quando
necessárias para comparação dos grupos e ou dias de sacrifício dois a dois.
Adotou-se p < 0,05, ou 5% o nível de rejeição da hipótese de nulidade
(nível de significância).
RESULTADOS
38
Resultados
5.RESULTADOS
Não houve diferenças estatisticamente significativas entre GS, GA
e GB, segundo teste ANOVA, na quantidade de fibroblastos (p = 0,576), de
vasos (p = 0,894) e de tecido de granulação (p = 0,364) conforme
apresentado na Tabela 1, Tabela 2 e Tabela 3, respectivamente.
Tabela 1. Análise de fibroblastos pela coloração de hematoxilina-eosina de cada grupo
segundo dias de coleta.
Teste ANOVA
Tabela 2. Análise de vasos pela coloração de hematoxilina-eosina de cada grupo segundo
dias de coleta.
Teste ANOVA
Tabela 3. Análise de tecido de granulação pela coloração de hematoxilina-eosina de cada
grupo segundo dias de coleta.
Teste ANOVA
39
Resultados
Em relação ao dia de coleta da análise de hematoxilina-eosina, foi
demonstrado que houve diferença estatisticamente significativa do 14º dia
em relação ao 7º dia, onde houve redução de fibroblastos (p < 0,001), vasos
sanguíneos (p = 0,021) e tecido de granulação (p = 0,010), de acordo com a
Tabela 4 e os gráficos apresentados nos Apêndices 6, 7 e 8.
Tabela 4. Comparação das variáveis analisadas através da coloração de hematoxilina-
eosina entre os dias de coleta.
Teste: Comparações múltiplas de Bonferroni
A intensidade do infiltrado inflamatório, também observada na
análise de hematoxilina-eosina, não demonstrou diferenças estatisticamente
significativas em relação aos grupos GS, GA e GB (p = 0,810) de acordo
com o teste ANOVA, demonstrado na Tabela 5; nem com relação aos dias
de coleta como demonstrado no gráfico do Apêndice 9.
40
Resultados
Tabela 5. Análise de infiltrado inflamatório pela coloração de hematoxilina-eosina de
cada grupo segundo dias de coleta.
Teste ANOVA
Na tabela 6 está relacionada a análise descritiva dos dados de
colágeno tipo I e tipo III em percentual de área em micrômetros quadrados
(µm2) na região da cicatriz dos grupos em que foram coletadas as amostras
de tecido no 7º dia e na tabela 10 está relacionada a análise descritiva dos
dados de colágeno tipo I e tipo III em percentual de área em micrômetros
quadrados (µm2) na região da cicatriz dos grupos em que foram coletadas
as amostras de tecido no 14º dia.
Tabela 6. Descrição dos percentuais de área de colágeno tipo I e tipo III no 7º dia.
41
Resultados
Tabela 7. Descrição dos percentuais de área de colágeno tipo I e tipo III no 14º dia
Na tabela 8, segundo o teste ANOVA com dois fatores o percentual
de área de colágeno tipo I apresentou comportamentos dos grupos entre os
dias de sacrifício estatisticamente diferentes (p = 0,007) (Apêndice 10). Já
o percentual de área de colágeno III apresentou diferença média
estatisticamente significativa apenas entre os grupos (p = 0,021)
independente do dia de sacrifício (Apêndice 11).
Tabela 8. Comparações das médias de colágeno tipo I e tipo III segundo grupos e dias de
coleta
Teste: ANOVA
42
Resultados
O percentual médio de área de colágeno I, segundo a Tabela 9, foi
estatisticamente menor nos grupos GB e GA em qualquer dia em
comparação com controle no 7º dia (p < 0,05), sendo que nas comparações:
GS7 X GB7, GS7 X GA7, GS7 X GB14, GS7 X GA14 a significância foi p
< 0,001; GB7 X GS14 a significância foi p = 0,001; GS14 X GA14 a
significância foi p = 0,013. Também foram estatisticamente menores os
percentuais de área de colágeno I dos grupos experimentais em relação ao
controle no 14º dia (p < 0,001), com exceção apenas do GB no 14º dia (p =
0,056).
Tabela 9. Comparações dos percentuais de área de colágeno tipo I entre os grupos
ou dias de coleta.
Teste: Comparações múltiplas de Bonferroni
43
Resultados
O percentual médio de área de colágeno III, segundo a tabela 10, foi
estatisticamente menor no GA em comparação ao controle (p = 0,042)
independente do dia de coleta.
Tabela 10. Comparações dos percentuais de área de colágeno tipo III entre os
grupos ou dias de coleta.
Teste: Comparações múltiplas de Bonferroni
Nos Apêndices 12 e 13 estão representadas as fotomicrografias de
imunohistoquímica de colágeno tipo I e tipo III dos grupos estudados.
Na tabela 11 está relacionada a análise descritiva dos dados de
retardo óptico em nanômetros (nm) de pele adjacente e de cicatriz dos
grupos em que foram coletadas as amostras de tecido no 7º dia. Estão
relacionados média, desvio padrão (DP) e mediana.
Tabela 11 - Descrição das médias de retardo óptico segundo grupos com amostras
coletadas no 7º dia.
7° dia
Variável Grupo Média DP Mediana n
Retardo óptico
Pele adjacente
GS 5,21 1,16 25,32 10
GB 7,14 0,45 7,20 10
GA 7,00 1,02 7,20 10
Retardo óptico
cicatriz
GS 3,88 0,74 3,66 10
GB 6,18 0,81 6,10 10
GA 6,03 1,08 6,43 10
44
Resultados
Na tabela 12 está relacionada a análise descritiva dos dados de
retardo óptico em nanômetros (nm) de pele adjacente e de cicatriz dos
grupos em que foram coletadas as amostras de tecido no 14º dia. Estão
relacionados média, desvio padrão (DP) e mediana.
Tabela 12 - Descrição das médias de retardo óptico segundo grupos com amostras
coletadas no 14º dia.
14° dia
Variável Grupo Média DP Mediana n
Retardo óptico
Pele adjacente
GS 4,99 0,89 4,88 10
GB 6,92 1,39 6,87 10
GA 7,07 0,76 7,09 10
Retardo óptico
cicatriz
GS 3,88 0,91 3,77 10
GB 6,10 1,18 5,65 10
GA 5,99 0,77 5,65 10
O teste ANOVA com dois fatores mostrou as médias de retardo
óptico de pele adjacente apresentaram diferenças estatisticamente
significativas entre os grupos GS, GA e GB (p < 0,001), mas não houve
diferença entre os dias de coleta e o comportamento dos grupos entre os
dias de coleta foram estatisticamente iguais (p > 0,05) como está
demonstrado no gráfico do Apêndice 14. O mesmo foi observado com os
valores de RO da cicatriz (Apêndice 15 ).
Ao comparar os grupos GS, GA e GB, o teste de comparações
múltiplas de Bonferroni mostrou que houve aumento do RO na pele
adjacente do grupo GA comparado ao GS (p<0,001) e do grupo GB
comparado ao GS (p<0,001); não houve diferença significativa de valores
de RO de pele adjacente entre os grupos GA e GB (p>0,999) (Tabela 3).
45
Resultados
Os valores de RO da cicatriz, segundo as comparações múltiplas de
Bonferroni mostrou que houve aumento do RO do grupo GA comparado ao
GS (p<0,001) e do grupo GB comparado ao GS (p<0,001); não houve
diferença significativa de valores de RO da cicatriz entre os grupos GA e
GB (Tabela 13).
Tabela 13. Resultado das comparações entre os grupos para as médias de retardo óptico.
Variável Grupo Média Erro Padrão p
Retardo óptico
interface
GS x GB -1,93 0,31 <0,001
GS x GA -1,94 0,31 <0,001
GB x GA -0,01 0,31 >0,999
Retardo óptico
cicatriz
GS x GB -2,26 0,29 <0,001
GS x GA -2,13 0,29 <0,001
GB x GA 0,13 0,29 >0,999
Teste: Comparações múltiplas de Bonferroni
No Apêndice 16 estão representadas as fotomicrografias de
birrefringência de fibras colágenas dos grupos estudados.
DISCUSSÃO
47
Discussão
6. DISCUSSÃO
A cicatrização é um dos principais objetos de estudo da Fisioterapia,
que utiliza diversos recursos biofísicos para modular ou acelerar esse
processo. Dentre eles destacam-se o ultrassom (ENNI et al., 2006;
TACANI et al., 2010), a eletroterapia (LIEBANO et al., 2008;
MARTINEZ et al., 2013) e a fototerapia de baixa intensidade (HOURELD
et al., 2008; SILVEIRA et al., 2011; GARCIA et al.,2012), sendo esta
última, um dos recursos mais utilizados para tratamentos de cicatrização
tecidual pela sua facilidade de manuseio, simplicidade de aplicação,
resultados satisfatórios e ausência de efeitos colaterais.
Nesse sentido, a literatura é bem ampla, sobretudo no que se refere a
estudos experimentais, que evidenciam os efeitos benéficos da LLLT no
processo de cicatrização desde a fase inflamatória até a de remodelamento,
em diferentes tecidos como pele, tendão, osso e tecido nervoso (REZENDE
et al., 2007; ROCKIND et al., 2009; NEVES et al.,2011).
6.1 Sobre os métodos
Os comprimentos de onda que abrangem o espectro vermelho e
infravermelho são os mais pesquisados (GAL et al., 2006; SILVA et al.
(2006; AL-WATBAN et al. 2007; AKYOL & GÜNGÖRMÜS, 2010). No
que concerne o espectro infravermelho, estudos in vitro têm demonstrado
que doses mais elevadas e aplicadas repetidas e seguidas vezes possuem
efeito inibitório na proliferação celular, sobretudo de fibroblastos (LEV-
TOV et al., 2013-a; HOURELD & ABRAHAMSE, 2008). Esses achados
motivaram a realização do presente estudo a fim de investigar se tal
48
Discussão
comportamento inibitório seria observado no modelo in vivo, uma vez que
não foram encontrados estudos nesse sentido nas buscas realizadas.
Assim, o presente trabalho utilizou o modelo experimental de
cicatrização de pele em ferida incisional em ratos, o que auxilia o
esclarecimento de mecanismos fisiológicos, para perspectivas de estudos
clínicos. Além disso, o uso desse animal para estudos como este, possibilita
comparações com resultados obtidos na literatura, facilitando o
desenvolvimento da investigação (PINFILDI et al., 2005; PRADO et al.,
2009).
Na literatura verifica-se que o rato é muito utilizado como modelo
animal de estudo para cicatrização de pele e de retalhos (LUCAS et al.,
2002; LIEBANO et al., 2008; BORBA et al., 2010), uma vantagem para
fins comparativos. Os modelos em ratos são comumente empregados no
Programa de Pós-Graduação em Cirurgia Translacional da Unifesp, tendo
sido empregados em diversos estudos experimentais (PINFILDI et al.,
2009; BORBA et al., 2010; WOOD et al., 2010; NISHIOKA et al., 2012).
Além disso, trata-se de animal de pequeno porte e de simples manuseio
quando comparado a outros modelos com animais de porte maior.
O modelo experimental ideal para o estudo da cicatrização de pele é
o porcino, sobretudo com relação a cicatrizes fibroproliferativas (ZHU et
al., 2007; RAMOS, GRAGNANI, FERREIRA, 2008) pela semelhança do
seu tecido cutâneo com o humano. Entretanto, é um animal que exige
maior disponibilidade de espaço e recursos. A pesquisa experimental prévia
com ratos pode abrir perspectivas para realização de estudos com porcos
com delineamento mais específico, permitindo assim avaliar parâmetros
histológicos do processo de cicatrização que não poderiam ser avaliados da
mesma forma no humano.
49
Discussão
Para a realização da ferida incisional, foram adotados alguns
paramentos como escolha da região, tipo de depilação, modelo de ferida e
uso de gabaritos. A escolha da região dorsal do rato para realização do
estudo foi baseada em estudos prévios como o de PINFILDI et al. (2005),
REZENDE et al. (2007), BORBA et al. (2010), por se tratar de uma região
de fácil acesso para os pesquisadores, além de evitar que o animal o
alcance ou que faça autofagia na região da ferida.
A depilação digital foi o método adotado para remoção dos pelos da
região dorsal dos ratos com base em diversos estudos, inclusive realizados
no presente Programa de Pós-Graduação, como os de PINFILDI et al.
(2005), LIEBANO et al. (2008), BORBA et al. (2010), NISHIOKA et al.
(2012), entre outros. Embora essa técnica desencadeie um processo
inflamatório maior, esse viés se aplica a todos os animais, não interferindo
na obtenção e comparação dos resultados.
No que se refere ao modelo de ferida, o excisional é o mais utilizado
para análise de infiltrado inflamatório pela técnica de coloração
Hematoxilina-Eosina (HE), além da contração da ferida (CORAZZA et al.,
2007; REZENDE et al., 2008; ADAMSKAYA et al., 2010; HEGDE et al.,
2011). Entretanto, no presente estudo foi estudada a ferida incisional, que é
utilizada na prática clínica durante procedimentos cirúrgicos
(YAZUKAWA et al., 2007; AKYOL et al., 2010; BORBA et al., 2010),
sobretudo na área de Cirurgia Plástica, o que motivou a escolha desse
modelo de ferida. A ferida incisional utilizada talvez justifique o fato de
que, na análise por HE, não tenha ocorrido variação dos níveis de infiltrado
celular a despeito das doses de energia e dias de coleta, o que seria
desejável clinicamente.
Com relação ao uso de gabaritos de acetato em diversas etapas da
fase experimental, eles permitem realizar os procedimentos de modo
50
Discussão
uniforme e reprodutível, minimizando o risco de erros de posicionamentos
e medidas. A utilização de gabaritos em estudos experimentais como este é
padrão das pesquisas realizadas no Programa de Pós-Graduação em
Cirurgia Translacional da Unifesp (PINLFILDI et al., 2005; PINLFILDI et
al., 2008; COSTA et al., 2010; NISHIOKA et al., 2012).
Outro aspecto importante a ser observado no delineamento da
pesquisa é o fato de que a literatura apresenta diversos estudos
autocontrolados com fototerapia em cicatrização em pele de ratos, com
duas ou mais feridas no mesmo animal, sendo uma(s) irradiada e outra(s)
não (SILVA et al., 2006; YASUKAWA, 2007; GÜNGÖRMÜS &
AKYOL, 2009; AKYOL & GÜNGÖRMÜS, 2010). Isso vai de encontro ao
possível efeito sistêmico da LLLT relatado por RODRIGO et al. (2009).
Para evitar esse viés, neste trabalho foi utilizado grupo controle, no qual foi
provocada a mesma ferida incisional dos grupos experimentais (descrita no
delineamento), mas tendo sido exposto à simulação da LLLT, com a caneta
desligada.
Seguindo a padronização dos procedimentos realizados, para
aplicação de laser nos animais, foi utilizada a técnica pontual com contato
e perpendicular à região irradiada, conforme observado nos estudos mais
recentes com LLLT (PILFILDI et al., 2008; WOOD et al., 2010;
SILVEIRA et al., 2011; PECCIN et al., 2012). Para assegurar que a caneta
permanecesse nessas condições durante todo o período de irradiação, foi
utilizado um suporte para apoio da caneta do laser. Importante notar que na
prática clínica o fisioterapeuta segura a caneta, entretanto isso pode
implicar em variação de posição do feixe de luz por conta da fadiga
muscular que pode ocorrer quando o tempo de terapia é longo, como no
caso do presente estudo.
51
Discussão
Após a fase de irradiação dos animais, foi realizada a etapa de coleta
de tecido para análise histoquímica por HE, imuno-histoquímica e de
birrefringência (BORBA et al., 2010; VIDAL et al.,1987). Para esta última
também foi utilizado gabarito e adotada técnica para fixação do tecido em
borracha por meio de alfinetes. O tecido ficou imerso em formol
tamponado por tempo determinado a fim de que a amostra (contendo pele e
tecido cicatricial) não retraísse e permanecesse em boas condições para ser
emblocada em parafina e cortada no micrótomo.
A histoquímica por HE é muito empregada nos estudos de
cicatrização de pele, inclusive com LLLT (REZENDE et al., 2007;
GÜNGÖRMÜS & AKYOL 2009; AKYOL & GÜNGÖRMÜS 2010) por
se tratar de técnica simples que permite avaliar diversos parâmetros do
processo inflamatório nos tecidos estudados. Isso facilita a busca de
pesquisas semelhantes e comparação de resultados.
Outras técnicas também são aplicadas para avaliação de colágeno
tipo I e tipo III, como o Picro Sirius (WOOD et al., 2010; NEVES et al.,
2011 ) ou o Tricômio de Masson utilizado por REZENDE et al., (2007).
Esta última, entretanto, permite apenas uma avaliação do tecido cicatricial
como um todo e não diferencia os tipos de colágeno. Por outro lado, o
Picro Sirius possibilita a quantificação de colágeno tipo I e tipo III, tendo
sido empregado no piloto. Entretanto, optou-se pela imuno-histoquímica
por se tratar de uma técnica que avalia separadamente os tipos de fibras
colágenas destacando-as em tom castanho, o que descarta a possiblidade de
sobreposição de cores durante a análise de imagem - diferente da técnica
histoquímica de luz polarizada onde o colágeno tipo I é corado em
vermelho e o tipo III em verde, possibilitando mistura dessas cores, o que
compromete a quantificação por imagem. Outro obstáculo com relação à
imuno-histoquímica foi a escassez de estudos que a tivessem empregado da
52
Discussão
mesma forma que neste trabalho. Isso dificultou a realização de
comparações na análise e discussão dos resultados.
A birrefringência é uma técnica que se utiliza das propriedades
anisotrópicas do colágeno para avaliar seu alinhamento, sendo seu valor
representado pelo retardo óptico (RO), em nm. Quanto maior o RO, melhor
o alinhamento das fibras colágenas naquele tecido. Esse método de
avaliação é muito empregado em tecidos abundantes em colágeno, como
ligamentos e tendões (OLIVEIRA et al., 2009; WOOD et al., 2010;
GOBBATO et al., 2011), que possuem as fibras colágenas dispostas de
modo paralelo, ao passo que na pele o colágeno é reticulado; entretanto
essa diferença não inviabiliza a análise do RO na pele, uma vez que se trata
do mesmo componente da matriz extracelular (MEC).
Os comprimentos de onda acima de 500 nm são amplamente
utilizados para estimular a cicatrização, sobretudo nas faixas do vermelho
do infravermelho (SILVA et al., 2009). Sabe-se que o mecanismo de ação
da fototerapia depende do comprimento de onda utilizado e da energia total
ofertada (FAROUK et al., 2007; HOURELD & ABRAHAMSE, 2008;
GONÇALVES et al., 2013), que influenciam diretamente o metabolismo
mitocondrial, agindo em cromóforos da membrana e da cadeia respiratória
(KARU, 2005; BONATTI et al., 2011) e modulando diversos mecanismos
biológicos como proliferação celular (fibroblastos, células endoteliais),
síntese de colágeno e matriz extracelular (REZENDE et al., 2008;
GÜRGÖRMUS et al., 2009; HEGDE et al., 2011; AKYOL et al., 2010).
Nesse sentido, há relatos na literatura, de estudos in vitro, de que o
comprimento de onda infravermelho, além do efeito estimulatório no
processo cicatricial, pode ainda exercer efeito inibitório (WEBB &
DYSON, 2003; LEV-TOV et al., 2013-a). Entretanto, não foram
encontrados na literatura estudos que descrevessem a inibição celular in
53
Discussão
vivo ou clinicamente, o que poderia ter relevância clínica no tratamento e
prevenção de cicatrizes fibroproliferativas, caracterizadas pelo aumento da
quantidade e expressão dos fibroblastos (HOCHMAN et al., 2005). Esse
fato motivou a escolha do comprimento de onda infravermelho no presente
estudo.
Além do comprimento de onda, a quantidade de energia também é
um fator preponderante na resposta celular. Um dos fatores que contribui
para convergência e entendimento da quantidade de energia empregada no
tecido é o parâmetro energia total (E), atualmente discutido e analisado em
estudos com LLLT. Quando se discute energia total ou energia, considera-
se que E = P (potência de saída em mW) x Tempo de aplicação (s), o que
determina toda a energia entregue ao tecido, ou seja, representa a
quantidade total de excitação que uma biomolécula pode efetivamente
alcançar - no caso, a quantidade total de energia ofertada ao tecido (KARU,
2005; TUMILTY et al., 2010). Em meio a tantos outros parâmetros a serem
aplicados para que ocorra a resposta tecidual esperada, como densidade de
energia (DE), densidade de potência (DP) e área de feixe, somados à
diversidade de equipamentos e de descrição de metodologia dos estudos
com fototerapia, foi preconizado neste trabalho o uso da energia total para
fins comparativos com outras pesquisas.
Com relação aos parâmetros citados, é descrita a janela terapêutica,
uma faixa de dose de energia considerada ideal para cicatrização com fins
estimulatórios que, segundo Mc LEOAD et al. (2004), varia entre 0,3 e
1,5 J. A tabela de energia da WALT (World Association of Laser Therapy)
é muito utilizada na padronização dos parâmetros de dosimetria de
fototerapia na reparação tecidual. Ela não foi empregada no presente estudo
por se tratar de doses empregadas em humanos. Além disso, essa
organização não tem divulgado valores de referência para cicatrização de
54
Discussão
feridas. As doses utilizadas foram baseadas nos estudos de Mc LEOAD et
al. (2004), que realizaram uma revisão das doses de laser infravermelho
aplicadas em cicatrização de tecidos, dentre eles, feridas cutâneas, cuja
janela varia entre 0,3 a 1,5 J. Para o grupo baixa dose (GB) foi adotada,
então, a dose mais alta da janela terapêutica (1,5 J) conforme empregado
por REZENDE et al.(2007). Para o grupo alta dose (GA) empregou-se, por
ponto, o dobro da maior dose encontrada na literatura, de 30 J (AL-
WATBAN et al., 2007), acima da maior dose encontrada em estudos in
vitro até o início da fase experimental deste estudo, aplicada por
HOURELD & ABRAHAMSE (2008).
6.2 Sobre os resultados
A partir dos resultados in vitro de HOURELD & ABRAHAMSE
(2008) que verificaram inibição da proliferação de fibroblastos in vitro
após irradiarem com 145 J, por duas vezes e com intervalo de 72h; o
presente estudo preconizou o uso de uma energia maior por se tratar de um
estudo in vivo, sendo 180J de energia total ofertada ao tecido por irradiação
e durante 5 dias consecutivos. Ainda assim, não foi atingido o ponto de
inibição com relação aos fibroblastos. Acreditava-se que a alta dosagem
pudesse atingir o efeito inibitório descrito na curva de Arndt-Schutz
(Anexo 2), principalmente com relação aos fibroblastos. Essa curva
descreve que a resposta biológica necessita de uma energia mínima para
ocorrer, aumentando proporcionalmente a partir daí (onde se enquadra a
janela terapêutica) até atingir um pico e começar a declinar, desenhando
uma parábola, reduzindo a resposta até atingir um efeito inibitório. É
possível que o presente estudo tenha atingido o ponto da curva de declínio,
correspondente ao ponto oposto da parábola em que não há resposta
55
Discussão
celular. Isso justificaria os eventos inalterados do processo de cicatrização,
com relação à proliferação de fibroblastos, angiogênese e tecido de
granulação, que apresentaram valores reduzidos entre o 7º e 14º dias, o que
ocorre normalmente nas etapas da cicatrização. São necessárias novas
pesquisas com doses de energia maiores e/ou mais dias de aplicação, a fim
de investigar o efeito inibitório in vivo observado com o mesmo
comprimento de onda em estudos in vitro.
Essa redução da resposta entre os dias observados no presente estudo
também foi relatada por GONÇALVES et al. (2010), que aplicaram laser
infravermelho (830 nm) em feridas em pele de ratos em doses semelhante
ao grupo GB deste estudo, com avaliações nos dias 4, 8, 16 e 20 após a
realização da ferida. Houve aumento da resposta no 8º dia em relação ao 4º
dia, mas não houve diferença entre os dias 16 e 20 em relação ao 8º. Essas
diferenças talvez pudessem ter sido observadas no presente estudo se
fossem realizadas coletas em um período mais curto.
Em contrapartida, REZENDE et al. (2007) utilizaram laser
infravermelho (830 nm) em dose idêntica ao grupo GB (1,5 J) e de 3,36 J
em cicatrização de pele de rato. As avaliações foram conduzidas nos dias 3,
7 e 14 com a técnica de coloração por HE. No 3º dia, houve aumento de
capilares, fibroblastos e tecido de granulação, parâmetros que
permaneceram aumentados no 7º e 14º dias em relação ao controle,
diferentemente do presente estudo em que houve diminuição da quantidade
de fibroblastos, vasos e tecido de granulação no 14º dia em relação ao 7º
dia, independentemente da dose aplicada.
Entretanto, esses mesmos autores (REZENDE et al., 2007)
realizaram aplicação em dose única, ao passo que o presente estudo
realizou 5 aplicações de laser durante 5 dias consecutivos. É descrito na
literatura que a LLLT apresenta efeito cumulativo (HOURELD &
56
Discussão
ABRAHAMSE, 2008; GONÇALVES et al., 2013). Sendo assim, mesmo
na dose terapêutica (1,5 J) a LLLT foi aplicada por dias consecutivos e, por
ser a mais alta dose da janela terapêutica, pode ter levado à saturação,
fazendo com que a resposta biológica não ocorresse, tal como se não
tivesse havido aplicação de LLLT. Curiosamente, o fato de a alta dosagem
(60 J) não ter apresentado efeito inibitório nos leva a considerar a
existência de uma janela (ampla, por sinal) de “não resposta”, ou janela
“refratária”, que precederia a inibição.
AKYOL & GÜNGÖRMÜS (2010) realizaram irradiação com laser
infravermelho (808 nm) em ferida incisional durante 5 dias, de forma
semelhante ao empregado neste estudo, entretanto os autores só forneceram
dados de DE (2 J/cm2) e tempo, inviabilizando o cálculo da energia total.
Foi realizada análise histológica pela técnica de HE no 10º e 20º dias, tendo
sido constatada redução do infiltrado inflamatório no 10º dia nas feridas
irradiadas em relação ao controle. No presente estudo, essa variável
permaneceu inalterada indiferentemente dos dias de coleta e das doses
aplicadas.
A birrefringência de fibras colágenas é comumente avaliada em
tendão (WOOD et al., 2010; NEVES et al., 2011), um tecido rico em
colágeno e com valores de RO bem superiores aos encontrados na pele
(SILVA et al., 2006). Sabe-se que quanto maior o valor de RO, maior a
birrefringência do colágeno e maior a sua organização no tecido conjuntivo
(VIDAL, 1986).
A literatura é escassa em estudos que avaliem birrefringência de
fibras colágenas em pele de ratos. SILVA et al. (2006) realizaram essa
análise em cicatrização de queimadura em pele de rato após irradiarem as
lesões com laser He-Ne. Foram coletadas amostras nos dias 3, 7, 10, 14 e
17 após a queimadura. Até o 14º dia os autores não observaram diferença
57
Discussão
nos valores de RO nas lesões, diferentemente do presente estudo que
observou diferenças nos valores de RO tanto no 7º como no 14º dias. Isso
poderia decorrer do fato de que, no referido estudo, o modelo utilizado foi
de queimadura, que, por gerar um dano tecidual maior do que a ferida
incisional, demoraria mais tempo para atingir a fase de remodelamento. No
17º dia, SILVA et al. (2006) observaram valores mais elevados de RO nos
grupos irradiados, o que corrobora com o presente estudo, que também
obteve melhora na birrefringência das fibras colágenas independentemente
da energia aplicada. Com base nos resultados do estudo citado, que utilizou
LLLT vermelha, e nos do presente estudo, que utilizou a infravermelha, e
considerando-se que ambos verificaram aumento do RO, pode-se inferir
que a LLLT tem efeito positivo no alinhamento das fibras de colágeno e
parece antecipar a fase de remodelamento.
Esse achado pode ser clinicamente interessante no que diz respeito à
qualidade e aspecto da cicatriz, que são de suma importância em Cirurgia
Plástica. Assim, tendo em vista que a LLLT aplicada no presente estudo
não alterou a proliferação de fibroblastos, mas aumentou o RO, ela poderia
ser objeto de futuros estudos clínicos para tratamento e prevenção de
cicatrizes fibroproliferativas, como queloide e cicatriz hipertrófica, que
apresentam tecido cicatricial totalmente desorganizado (HOCHMAN et al.,
2005).
SILVA et al.(2006) também avaliaram os valores de RO na pele, que
apresenta valores mais elevados em relação ao tecido cicatricial, o que vai
de encontro com o presente estudo que avaliou o RO da pele adjacente à
cicatriz. Entretanto, espera-se que a pele apresente melhor alinhamento das
fibras de colágeno do que o tecido lesado. O presente estudo também
avaliou a birrefringência do colágeno da pele adjacente em todos os grupos,
tendo sido observado o mesmo comportamento da cicatriz: RO mais
58
Discussão
elevado nos grupos irradiados, independentemente da dose e do dia de
coleta de tecido.
Assim, o achado com relação ao RO, mais elevado nos grupos
irradiados, denota um aspecto clínico importante, uma vez que quanto
melhor o alinhamento das fibras de colágeno, melhor o aspecto e a
qualidade da cicatriz. Esse fato tem ampla aplicabilidade clínica não só em
Cirurgia Plástica, mas em qualquer procedimento cirúrgico que implique
em incisões na pele. Acrescente-se a isso a influência do aspecto da cicatriz
sobre a qualidade de vida do paciente, como descrito por FURTADO et al.
(2009). Abre-se, aqui, uma perspectiva para estudos clínicos de aplicação
de laser infravermelho no pós-operatório de incisões cirúrgicas com intuito
de avaliar o aspecto da cicatriz. Além disso, o fato de o RO ter sido maior
também na pele adjacente abre margem para que se considere uma
aplicação pré-operatória da LLLT infravermelha seguida por avaliação do
tecido irradiado e excisado durante a cirurgia, e acompanhamento do
processo de cicatrização.
A partir da análise de imuno-histoquímica de fibras colágenas,
verificou-se uma redução muito significativa da quantidade de colágeno,
sobretudo do tipo I. Esse tipo de avaliação é pouco empregado para pele, o
que dificulta comparações. BORBA et al. (2010) utilizaram essa mesma
técnica de imuno-histoquímica de fibras colágenas para avaliar a
cicatrização de ferida após aplicação de corrente elétrica pré-incisional em
pele de ratos. Os autores observaram um aumento de colágeno tipo III no 7º
dia, diferentemente do que foi encontrado no presente estudo, onde se
observou diminuição do colágeno III apenas no GA e no 14º dia. A
comparação de ambos os resultados demonstra que os recursos biofísicos,
embora exerçam influência na MEC, podem apresentar peculiaridades
próprias nos efeitos durante o processo de cicatrização. Clinicamente essas
59
Discussão
informações são muito importantes na elaboração de protocolos de
tratamentos de feridas.
GONÇALVES et al. (2013) avaliaram o efeito da LLLT de 830 na
cicatrização de ferida excional em pele de ratos. Os autores aplicaram uma
energia total de 36,9 J em um grupo e 110,7 J e analisaram fibras colágenas
tipo I e tipo III por microscopia de polarização (Picro sirius). Verificou-se
que houve aumento colágeno tipo III em todos os tempos observados,
sobretudo com a dose menor. Esses dados diferem do presente estudo, que
constatou redução do colágeno tipo III na dose total de energia do GA (180
J) no 14º dia. Com relação ao colágeno tipo I, o autores observaram que a
quantidade foi maior no 7º e no 14º dia, o que diverge desta pesquisa em
que a quantidade de colágeno tipo I foi significativamente menor em ambos
dias de coleta. Estes resultados corroboram com o efeito cumulativo que a
LLLT pode exercer nos tecidos quando aplicada não só em altas doses, mas
também em dias consecutivos (HAWKINS & ABRAHAMSE, 2006;
ROCKIND et al., 2009; GONÇALVES et al., 2010).
Na literatura é relatado que a síntese de matriz extracelular é
inversamente proporcional ao comprimento de onda e energia ofertada
(MENDEZ et al., 2004; NASCIMENTO et al., 2004) o que corrobora com
os resultados deste trabalho que investigou o efeito da LLLT no espectro
infravermelho (comprimento de onda maior) no principal componente da
matriz extracelular e verificou a redução da quantidade de colágeno tipo I e
tipo III.
Sendo assim, a relevante redução do colágeno constatada nesta
pesquisa corrobora com os estudos que relatam o efeito dose-dependente e
cumulativo da LLLT (HAWKINS & ABRAHAMSE; HOURELD &
ABRAHAMSE, 2008; GONÇALVES et al., 2010), em que não foram
observadas diferenças em nível celular, mas na síntese de colágeno, inibida
60
Discussão
diante da alta dosagem e dias consecutivos de aplicação da irradiação. Esse
achado pode ser relevante para tratamento de cicatrizes hipertróficas e
queloide, entretanto quando se pretende estimular a síntese de MEC, é
conveniente considerar não só a dose aplicada, mas também os intervalos
entre cada sessão de laserterapia.
Observa-se no presente estudo que os resultados obtidos foram mais
expressivos com relação ao colágeno, tanto na birrefringência como na
análise imuno-histoquímica. O aumento do RO frente à redução de fibras
colágenas, sobretudo do tipo I, poderia levantar a hipótese de um resultado
falso positivo para a birrefringência. Entretanto, estudos realizados com
fototerapia de baixa intensidade em tendões tanto no espectro vermelho
como infravermelho revelaram um aumento do RO (WOOD et al., 2010;
NEVES et al., 2011; NEVES et al., 2011). Assim, nesta pesquisa,
observou-se redução da quantidade do colágeno, além de melhor
alinhamento, reforçando a perspectiva de estudos que envolvam prevenção
e tratamento de cicatrizes fibroproliferativas.
Com base nos resultados aqui observados, é possível afirmar que a
LLLT no espectro infravermelho exerce forte influência nos mecanismos
de síntese ou talvez de degradação de colágeno, uma vez que não é possível
esclarecer se houve inibição de síntese ou aumento de degradação. Assim, a
realização de estudos com o comprimento de onda aqui adotado torna-se
muito relevante em outras células e organelas celulares envolvidas nesses
processos, como neutrófilos, que também sintetizam colagenase, ou
retículo endoplasmático rugoso, abundante em fibroblastos e responsável
pela síntese de MEC. A avaliação de macrófagos seria interessante, pois,
além de serem importantes células do processo de cicatrização, também
modulam fibroblastos pela liberação de citocinas como TGF-β, PDGF,
IL-1β induzindo a síntese de colágeno (BARRON & WYNN, 2011;
61
Discussão
WYNN & RAMALINGAM, 2012), participando, ainda, da degradação do
excesso de MEC. Assim, seria de grande valia o estudo da LLLT na
possível ativação de macrófagos no tratamento e prevenção de fibroses,
inclusive cicatriciais.
6.3 Perspectivas
Realização de estudos experimentais com delineamento semelhante
em porcos;
Estudos experimentais com outras variações de parâmetros como
doses, tempo, dias, aplicação única e aplicação múltipla;
Estudos experimentais com avaliação de outros elementos da
cicatrização como macrófagos, neutrófilos, miofibroblastos, matriz
extracelular e mecanismos de sinalização;
Estudos com LLLT que avaliem organelas celulares como retículo
endoplasmático rugoso e mecanismos de síntese de MEC e
colagenase;
Estudos experimentais com outros comprimentos de onda em alta
dosagem (superiores a 60 J) para avaliação de birrefringência e
quantificação de colágeno tipo I e tipo III;
Estudos clínicos com LLLT no espectro infravermelho com
avaliação pré e pós-operatória;
Estudos clínicos em pacientes portadores de cicatrizes
fibroproliferativas no pré-operatório: realização de LLLT
infravermelha para avaliação histológica da pele e da cicatriz a serem
excisadas.
62
Discussão
Estudos clínicos com aplicação de LLLT infravermelha em cicatrizes
fibroproliferativas.
CONCLUSÃO
64
Conclusão
7. CONCLUSÃO
A LLLT nas doses alta (60 J) e baixa (1,5 J):
1. Foi eficiente no aumento do RO das fibras colágenas da
cicatriz e da pele adjacente na cicatrização em pele de ratos.
2. Não alterou a intensidade do infiltrado inflamatório entre
o 7º e 14º dia.
3. Apresentou redução do número de fibroblastos, vasos e
tecido de granulação no 14º dia em relação ao 7º dia.
4. Apresentou redução do colágeno tipo I no 7º e 14º dia
5. Na dose de 60 J apresentou redução de colágeno tipo III
no 14ºdia
REFERÊNCIAS
66
Referências
8. REFERÊNCIAS
Akyol U, Güngörmüş M. The effect of low-level laser therapy on
healing of skin incisions made using a diode laser in diabetic rats.
Photomed Laser Surg. 2010 Feb;28(1):51-5.
Al-Attar A, Mess S, Thomassen JM, Kauffman CL, Davison SP. Keloid
pathoghenesis and treatment. Plast Reconstr Surg. 2006 Jan;117(1):286-
300.
Alster TS. Improvement of erythematoous ans hypertrophic scars by the
585nm flashlamp-pumped pulsed dye laser. Ann Plast Surg. 1994
Feb;32(2):186-90.
Al-Watban FAH, Zhang XY, Andres BL. Low-Level Laser Therapy
enhances wound healing in diabetic rats: a comparison of different
Lasers. Photomed Laser Surg. 2007;25(2):72-7.
Barron L, Wynn TA. Fibrosis is regulated by Th2 and Th17 responses
and by dynamic interactions between fibroblasts and macrophages. Am
J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2011 May;300(5):G723-8.
Bednarska K, Rózga B, Kolodziejczyk K, Szosland D, Leyko W,
Bryszewska S. Effect of low-power red light laser irradiation on the
viability on the human skin fibroblast. Radiot Envir Biophys. 1998
Oct;37(3):215-7.
Berry DP, Harding KG, Stanton MR, Jasani B, and Ehrlich HP. Human
wound contraction: collagen organization, fibroblasts, and
myofibroblasts. Plast Reconstr Surg. 1998 Jul;102(1):124–31.
Bock O, Schmid-Ott G, Malewski P, Mrowietz U. Quality of life of
patients with keloid and hypertrophic scarring. Arch Dermatol Res.
2006 Apr; 297(10):433-8.
Bonatti S, Hochman B, Tucci-Viegas VM, Furtado F, CE Pinfildi, Pedro
AC, Ferreira LM. In vitro effect LED (Light Emitting Diode) of 470 nm
in keloid fibroblasts. Acta Cir Bras. 2011 Feb;26(1):25-30.
Borba GC, Hochman B, Liebano RE, Enokihara MM, Ferreira LM.
Does preoperative electrical stimulation of the skin alter the healing
67
Referências
process? J Surg Res. 2011 Apr;166(2):324-9.
Bouzari N, Davis SC, Nouri K. Laser treatment of keloids and
hypertrophic scars. Intern J Dermatol. 2007 Jan; 46(1):80-8.
Brandi C, Grimaldi L, Nisi G, Brafa A, Campa A, Calabrò M, Campana
M, D'Aniello C. The role of carbon dioxide therapy in the treatment of
chronic wounds. In Vivo. 2010 Mar-Apr;24(2):223-6.
Chen CH, Tsai JL, Wang YH, Lee CL, Chen JK, Huang MH. Low-level
laser irradiation promotes cell proliferation and mRNA expression of
type I collagen and decorin in porcine Achilles tendon fibroblasts in
vitro. J Orthop Res. 2009 May;27(5):646-50.
Corazza AV, Jorge J, Kurachi C, Bagnato VS. Photobiomodulation on
the angiogenesis of skin wounds in rats using different light sources.
Photomed Laser Surg. 2007 Apr;25(2):102-6.
Costa MS, Pinfildi CE, Gomes HC, Liebano RE, Arias VE, Silveira TS,
Ferreira LM. Effect of low-level laser therapy with output power of 30
mW and 60 mW in the viability of a random skin flap. Photomed Laser
Surg. 2010 Feb;28(1):57-61.
Eming SA, Krieg T, Davidson JM. Inflammation in wound repair:
molecular and cellular mechanisms. J Invest Dermatol. 2007
Mar;127(3):514-25.
Ennis WJ, Valdes W, Gainer M, Meneses P. Evaluation of clinical
effectiveness of MIST ultrasound therapy for the healing of chronic
wounds. Adv Skin Wound Care. 2006 Oct;19(8):437-46.
Ferreira ACB, Hochman B, Furtado F, Bonatti S, Ferreira LM. Keloids:
a new challenge for nutrition. Nut Rev. 2010 Jul;68(7):409-17.
Ferreira LM, Gragnani A, Furtado F, Hochman B. Control of the skin
scarring response. An Acad Bras Cienc. 2009 Sep;81(3):623-9.
Furtado F, Hochman B, Ferrara SF, Dini GM, Nunes JM, Juliano Y,
Ferreira LM. What factors affect the quality of life of patients with
keloids? Rev Assoc Med Bras. 2009 Nov-Dec;55(6):700-4.
Gál P, Vidinsky B, Toporcer T, Mokry M, Mozes T, Longauer F, Sabo J.
Histological assessment of the effect of Laser irradiation on skin wound
healing in rats. Photomed Laser Surg. 2006 Aug;24(4):480-8.
68
Referências
Garcia VG, Macarini VC, de Almeida JM, Bosco AF, Nagata MJ,
Okamoto T, Longo M, Theodoro LH. Influence of low-level laser
therapy on wound healing in nicotine-treated animals. Lasers Med Sci.
2012 Mar;27(2):437-4.
Gonçalves RV, Mezêncio JM, Benevides GP, Matta SL, Neves CA,
Sarandy MM, Vilela EF. Effect of gallium-arsenide laser, gallium-
aluminum-arsenide laser and healing ointment on cutaneous wound
healing in Wistar rats. Braz J Med Biol Res. 2010 Apr;43(4):350-5.
Gonçalves RV, Novaes RD, Cupertino Mdo C, Moraes B, Leite JP,
Peluzio Mdo C, Pinto MV, da Matta SL. Time-dependent effects of low-
level laser therapy on the morphology and oxidative response in the skin
wound healing in rats. Lasers Med Sci. 2013 Feb;28(2):383-90.
Güngörmüş M, Akyol U. The effect of gallium-aluminum-arsenide 808-
nm low-level laser therapy on healing of skin incisions made using a
diode laser. Photomed Laser Surg. 2009 Dec;27(6):895-9.
Gurtner GC, Werner S, Barrandon Y, Longaker MT. Wound repair and
regeneration. Nature. 2008 May;453:314-21.
Hawkins D, Abrahamse H. Effect of multiple exposures of low-level
laser therapy on the cellular responses of wounded human skin
fibroblasts. Photomed Laser Surg. 2006 Dec;24(6):705-14.
Hegde VN, Prabhu V, Rao SB, Chandra S, Kumar P, Satyamoorthy K,
Mahato KK. Effect of laser dose and treatment schedule on excision
wound healing in diabetic mice. Photochem Photobiol. 2011 Nov-
Dec;87(6):1433-41.
Hochman B, Pilfildi CE, Nishioka MA, Furtado F, Bonatti S, Monteiro
PKP, Antunes AS, Quieregatto PR, Liebano RE, Chadi G, Ferrerira LM.
Low level laser therapy and light emitting diode in neuropeptides Sp
and cgrp secretion in healthy skin in rats. Laser Med Sci. 2013 [in
press].
Hochman B, Vilas Boas FC, Mariano M, Ferreira LM. Keloid
heterograft in the hamster (Mesocricetus auratus) cheek pouch, Brazil.
Acta Cir Bras. 2005 May-Jun; 20(3):200-12.
Houreld NN, Abrahamse H. Laser light influences cellular viability and
proliferation in diabetic-wounded fibroblast cells in a dose- and
wavelength-dependent manner. Lasers Med Sci. 2008 Jan;23(1):11-8.
69
Referências
Kandolf-Sekulovic L, Kataranovski M, Pavlovic MD.
Immunomodulatory effects of low-intensity near-infrared laser
irradiation on contact hypersensitivity reaction. Photodermatol
Photoimmunol Photomed. 2003 Aug;19(4):203–12.
Karu TI, Pyatibrat LV, Kolyakov SF, Afanasyeva NI. Absorption
measurements of a cell monolayer relevant to phototherapy: reduction
of cytochrome c oxidase under near IR radiation. J Photochem
Photobiol B. 2005 Nov 1;81(2):98-106
Kavros SJ, Miller JL, Hanna SW. Treatment of ischemic wounds with
noncontact, low-frequency ultrasound: the Mayo clinic experience,
2004-2006. Adv Skin Wound Care. 2007 Apr;20(4):221-6.
Kirkwood BR, Sterne JA. Essential medical statistics. 2 ed. Oxford:
Blackwell Science: Massachusetts, USA. 2006. 502p.
Köse O, Waseen A. Keloids and hypertrophic scars: are they two
different sides of the same coin? Dermatol Surg. 2008 Mar; 34(3):336-
46.
Lev-Tov H, Brody N, Siegel D, Jagdeo J. Inhibition of fibroblast
proliferation in vitro using low-level infrared light-emitting diodes.
Dermatol Surg. 2013-a Mar;39(3Pt1):422-5.
Lev-Tov H, Mamalis A, Brody N, Siegel D, Jagdeo J. Inhibition of
fibroblast proliferation in vitro using red light-emitting diodes. Dermatol
Surg. 2013-b; Aug;39(8):1167-70
Liebano RE, Abla LE, Ferreira LM. Effect of low-frequency
transcutaneous electrical nerve stimulation (TENS) on the viability of
ischemic skin flaps in the rat: an amplitude study. Wound Repair Regen.
2008 Jan-Feb;16(1):65-9.
Lucas C, Criens-Poublon LJ, Cockrell CT, de Haan RJ. Wound healing
in cell studies and animal model experiments by Low Level Laser
Therapy; were clinical studies justified? a systematic review. Lasers
Med Sci. 2002;17(2):110-34.
Mandelbaum SH, Santis EP, Mandelbaum M. Cicatrization: current
concepts and auxiliary resources Part I. An bras Dermatol.
2003;78(4):393-410.
Martínez-Rodríguez A, Bello O, Fraiz M, Martinez-Bustelo S. The
effect of alternating and biphasic currents on humans' wound healing: a
70
Referências
literature review. Int J Dermatol. 2013 Jun 20 [Epub ahead of print].
McLeoad IA. Low level laser therapy in athletic training. Athl Ther
Today. 2004:17-21.
Mendez TMTV, Pinheiro ALB, Pacheco MTT, Nascimento
PM,Ramalho LMP. Dose and wavelength of laser light have influence
on the repair of cutaneous wounds. J Clin Laser Med
Surg, 2004;22:19–25.
Moore P, Ridgway TD, Rgbee RG, Howard EW, Lucroy MD. Effect
wavelenght on low-intensity laser irradiation-stimulated cell
proliferation in vitro. Laser Surg Med. 2005 Jan;36(1):8-12.
Nascimento PM, Pinheiro ALB, Salgado MAC, Ramalho LMP. A
preliminary report on the effect of laser therapy on the healing of
cutaneous surgical wounds as a consequence of an inversely
proportional relationship between wavelength and intensity: histological
study in rats. 2004;Photomed Laser Surg 22:513–518
Neter J, Kutner MH, Nachtsheim CJ, Wasserman W. Applied Linear
Statistical Models. 4nd ed. Ilinois: Richard D. Irwing. (1996). 1408p.
Neves MA, Pinfildi CE, Wood VT, Gobbato RC, da Silva FM, Parizotto
NA, Hochman B, Ferreira LM. Different power settings of LLLT on the
repair of the calcaneal tendon. Photomed Laser Surg. 2011
Oct;29(10):663-8.
Nishioka MA, Pinfildi CE, Sheliga TR, Arias VE, Gomes HC, Ferreira
LM. LED (660 nm) and laser (670 nm) use on skin flap viability:
angiogenesis and mast cells on transition line. Lasers Med Sci. 2012
Sep;27(5):1045-50.
Oliveira FS, Pinfildi CE, Parizoto NA, Liebano RE, Bossini PS, Garcia
EB, Ferreira LM. Effect of low level laser therapy (830 nm) with
different therapy regimes on the process of tissue repair in partial lesion
calcaneous tendon.Lasers Surg Med. 2009 Apr;41(4):271-6.
Peccin MS, Renno AC, de Oliveira F, Giusti PR, Ribeiro DA. Helium-
neon laser improves skin repair in rabbits. J Cosmet Laser Ther. 2012
Dec;14(6):286-9.
Pinfildi CE, Liebano RE, Hochman BS, Ferreira LM. Helium–Neon
laser in viability of random skin flap in rats. Laser Surg Med. 2005
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Parizotto%20NA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21668375
71
Referências
Jul;37(1):74–7.
Pinfildi CE, Liebano RE, Hochman BS, Enokihara MM, Lippert R,
Gobbato RC, Ferreira LM.Effect of low-level laser therapy on mast cells
in viability of the transverse rectus abdominis musculocutaneous flap.
Photomed Laser Surg. 2009 Apr;27(2):337-43
Prado RP, Pinfildi CE, Liebano RE, Hochman BS, Ferreira LM. Effect
of application site of low-level laser therapy in random cutaneous flap
viability in rats. Photomed Laser Surg. 2009 Jun;27(3):411-6
Pugliese LS, Medrado AP, Reis SRA, Andrade ZA. The influence of
low-level therapy on biomodulation of collagen and elastic fibers.
Pesqui Ondontol Bras. 2003 Oct-Dec;17(4):307-13.
Ramos ML, Gragnani A, Ferreira LM. Is there an ideal animal model to
study hypertrophic scarring? J Burn Care Res. 2008 Mar-Apr;29(2):363-
8.
Rezende SB, Ribeiro MS, NÚnez Sc, Garcia VG. Maldonado EP.
Effects of a single near-infrared laser treatment on cutaneous wound
healing: biometrical and histological study in rats. J Photochem
Photobiol B: Biol. 2007 Jun;87(3):145-53.
Robles DT, Berg D. Abnormal wound healing: keloids. Clin Dermatol
2007 Jan-Fev;25(1):26-32.
Rochkind S, El-Ani D, Nevo Z, Shahar A. Increase of neuronal
sprouting and migration using 780 nm laser phototherapy as procedure
for cell therapy. Lasers Surg Med. 2009 Apr;41(4):277-81.
Rodrigo SM, Cunha A, Pozza DH, Blaya DS, Moraes JF, Weber JB, de
Oliveira MG. Analysis of the systemic effect of red and infrared laser
therapy on wound repair. Photomed Laser Surg. 2009 Dec;27(6):929-35
Schindl A, Merwald LS, Kaun C, Wojta J. Direct stimulatory effect of
low-intensity 670 nm laser irradiation on human endothelial cell
proliferation. Br J Dermatol. 2003 Fev;148(2):334-6.
Shaffer JJ, Taylor SC, Cook-Bolden F. Keloidal scars: a review with a
critical look at therapeutic options. J Am Acad Dermatol. 2002
Feb;46:S63-97.
Shi-Yau Y, Jen-Hwey C, Shiaw-Der Y, Yu-Chen H, Wing-Yiu L, Chew-
72
Referências
Wun W. Biological effect of far-infrared therapy on increasing skin
microcirculation in rats. J Photodermatol Photoimmunol Photomed.
2006 Apr; 22(2):78-86.
Shu B, Wu Z, Hao L, Zeng D, Feng G, Lin Y. Experimental study on
He-Ne laser irradiation to inhibit scar fibroblast growth in culture. Chin
J Traumatol. 2002 Aug;5(4):246-9.
Silva DFT, Vidal BC, Zezell DM, Zorn TM, Núñez SC, Ribeiro MS.
Collagen birefringence in skin repair in response to red polarized-laser
therapy. J Biomed Opt. 2006 Mar-Apr;11(2):024002.
Silveira PC, Silva LA, Freitas TP, Latini A, Pinho RA. Effects of low-
power laser irradiation (LPLI) at different wavelengths and doses on
oxidative stress and fibrogenesis parameters in an animal model of
wound healing. Lasers Med Sci. 2011 Jan;26(1):125-31.
Tacani PM, Liebano RE, Pinfildi CE, Gomes HC, Arias VE, Ferreira
LM. Mechanical stimulation improves survival in random-pattern skin
flaps in rats. Ultrasound Med Biol. 2010 Dec;36(12):2048-56.
Tumilty S, Munn J, McDonough S, Hurley DA, Basford JR, Baxter GD.
Low level laser treatment of tendinopathy: a systematic review with
meta-analysis. Photomed Laser Surg. 2010 Feb;28(1):3-16.
Vidal BC. Evaluation of the carbohydrate role in the molecular order of
collagen bundles: Microphotometric measurements of textural
birefringence. Cell Mol Biol. 1986;5:527-35
Vinck EM; Cagnie BJ, Cornelissen MJ, Declercq HA, Cambier DC.
Increased fibroblast proliferation induced emitting diode and low power
laser irradiation. Laser Med Sci. 2003;18(2):95-9.
Webb C, Dyson M, Lewis WHP. Stimulatory effect of 660nm of low
level laser energy on hypertrophic scars: possible mechanism for
increase cells counts. Laser Surg Med. 1998;22(5):294-301.
Webb C, Dyson M. The effect 880 nm of low level laser energy on
human fibroblasts: a possible role in hypertrofic wound healing. J
Photoch Photobiol Biol. 2003 Apr;70(1):39-44.
Wood V, Pinfild C, Neves M, Parizotto N, Hochman B, Ferreira L.
Collagen changes and realignment induced by low-level laser therapy
and low intensity ultrasound in the calcaneal tendon. Laser Surg Med.
73
Referências
2010 Aug;42(6):559-65.
Wynn TA, Ramalingam TR. Mechanisms of fibrosis: therapeutic
translation for fibrotic disease. Nat Med. 2012 Jul 6;18(7):1028-40.
Yasukawa A, Hrui H, Koyama Y, Nagai M, Takakuda K. The effect of
low reactive-level laser therapy (LLLT) with helium-neon laser on
operative wound healing in a rat model. J Vet Med Sci. 2007
Aug;69(8):799-806.
Zhu KQ, Carrougher GJ, Gibran NS, Isik FF, Engrav LH. Review of the
female Duroc/Yorkshire pig model of human fibroproliferative scarring.
Wound Repair Regen. 2007 Sep-Oct;15 Suppl 1:S32-9.
76
Apêndices
Apêndice 1
Aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa:
77
Apêndices
78
Apêndices
Apêndice 2
Randomização dos animais:
79
Apêndices
80
Apêndices
81
Apêndices
82
Apêndices
Apêndice 3
Exemplo da identificação das amostras por meio dos alfinetes
coloridos enquanto permaneceram imersas em formol, antes de ser alojada
nas grades K-7.
83
Apêndices
Apêndice 4
Apêndice 5
Fotomicrografia de lâmina corada com HE.
Aumento de 400X em que foi realizada a
avaliação, na região central entre epiderme e
panículo carnoso.
Fotomicrografia de lâmina corada com HE.
Aumento de 50X.
1. Epiderme
2. Derme
3.Panículo carnoso
1
2
1
2
3
84
Apêndices
Apêndice 5
Randomização da pele adjacente a ser submetida à avaliação de
birrefringência de fibras colágenas. Lado direito ou esquerdo da cicatriz.
85
Apêndices
86
Apêndices
Apêndice 6
Gráfico para representação da avaliação de fibroblastos, com valores
médios e erros padrões, segundo grupos e dias de coleta.
* p<0,05
Teste: Comparações múltiplas de Bonferroni
87
Apêndices
Apêndice 7
Gráfico para representação da avaliação de vasos sanguíneos, com valores
médios e erros padrões, segundo grupos e dias de coleta.
* p<0,05
Teste: Comparações múltiplas de Bonferroni
88
Apêndices
Apêndice 8
Gráfico para representação da avaliação de tecido de granulação, com
valores médios e erros padrões, segundo grupos e dias de coleta.
* p<0,05
Teste: Comparações múltiplas de Bonferroni
89
Apêndices
Apêndice 9
Gráfico para representação da avaliação de infiltrado inflamatório, com
valores médios e erros padrões, segundo grupos e dias de coleta.
* p>0,05
Teste: Comparações múltiplas de Bonferroni
90
Apêndices
Apêndice 10
Gráfico para representação da avaliação de colágeno tipo I, com valores
médios e erros padrões, segundo grupos e dias de coleta.
* p < 0,001
Teste: Comparações múltiplas de Bonferroni
91
Apêndices
Apêndice 11
Gráfico para representação da avaliação de colágeno tipo III, com valores
médios e erros padrões, segundo grupos e dias de coleta.
* p = 0,042
Teste: Comparações múltiplas de Bonferroni
92
Apêndices
Apêndice 12
Fotomicrografias de imunohistoquímica de colágeno tipo I nos grupos com
amostras coletadas no 7º dia (GS7, GB7, GA7). Aumento de 400 X.
1: Colágeno tipo I em região de tecido cicatricial; 2: Colágeno tipo I em
região de pele adjacente. Há maior presença de infiltrado inflamatório
corado pela Hematoxilina de Harrys em tecido cicatricial e uma menor
quantidade de colágeno tipo I na região cicatricial em relação à pele
adjacente e quando se compara GB7 e GA7 com GS7.
GS7 GB7 GA7
Fotomicrografias de imunohistoquímica de colágeno tipo I nos grupos com
amostras coletadas no 14º dia (GS14, GB14, GA14). ). Aumento de 400 X.
1: Colágeno tipo I em região de tecido cicatricial; 2: Colágeno tipo I em
região de pele adjacente. Há maior presença de infiltrado inflamatório
corado pela Hematoxilina de Harrys em tecido cicatricial e uma menor
quantidade de colágeno tipo I na região cicatricial em relação à pele
adjacente e quando se compara GB14 e GA14 com GS14.
GS14 GB14 GA14
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
93
Apêndices
Apêndice 13
Fotomicrografias de imunohistoquímica de colágeno tipo III nos grupos
amostras coletadas no 7º dia (GS7, GB7, GA7). Aumento de 400 X.
1: Colágeno tipo III em região de tecido cicatricial. 2: Colágeno tipo III em
região de pele adjacente. Há uma maior presença de infiltrado inflamatório
corado pela Hematoxilina de Harrys em tecido cicatricial e uma menor
quantidade de colágeno tipo III na região cicatricial em relação à pele
adjacente.
Fotomicrografias de imunohistoquímica de colágeno tipo III nos grupos com
amostras coletadas no 14º dia (GS14, GB14, GA14). Aumento de 400 X.
1: Colágeno tipo III em região de tecido cicatricial; 2: Colágeno tipo III em
região de pele adjacente. Há uma maior presença de infiltrado inflamatório
corado pela Hematoxilina de Harrys em tecido cicatricial e uma menor
quantidade de colágeno tipo III na região cicatricial em relação à pele
adjacente.
GS7 GB7 GA7
GS14 GB14 GA14
2 2
2
1
1 1
1 1 1
2 2
2
94
Apêndices
Apêndice 14
Gráfico para representação das médias de RO (em nm) na pele adjacente
segundo grupos e dias de coleta.
* p<0,05
Teste: Comparações múltiplas de Bonferroni
95
Apêndices
Apêndice 15
Gráfico para representação das médias de RO (em nm) na cicatriz segundo
grupos e dias de coleta.
* p<0,05
Teste: Comparações múltiplas de Bonferroni
96
Apêndices
Apêndice 16
GS7 GB7 GA7
7
Fotomicrografias birrefringência de fibras colágenas nos grupos com amostras
coletadas no 7º dia (GS7, GB7, GA7). Aumento de 200 X. 1: Tecido cicatricial; 2: Pele
adjacente.
Observa-se que a pele adjacente apresenta maior brilho que o tecido cicatricial. É
possível verificar maior brilho na região de tecido cicatricial de GB7 e GA7 em relação
a GS7.
1 1
1 2
2
2
GS14 GB14 GA14
Fotomicrografias de birrefringência de fibras colágenas nos grupos com amostras
coletadas no 7º dia (GS14, GB14, GA14). Aumento de 200 X. 1: Tecido cicatricial; 2:
Pele adjacente.
Observa-se que a pele adjacente apresenta maior brilho que o tecido cicatricial. É
possível verificar maior brilho na região de tecido cicatricial de GB14 e GA14 em
relação a GS14.
1
1 1
1
2
2 2
97
Apêndices
Apêndice 17
Estudo Piloto
Foi realizado um estudo piloto com delineamento semelhante ao
presente trabalho, com amostra de 27 animais distribuídos em 3 grupos em
função da energia (GS: simulação; GB: 1,5 J; GA: 60 J) e 3 subgrupos em
função do dia de coleta de tecido: 7, 14 e 21 dias (n = 3). Foram realizadas
análises de hematoxilina-eosina (HE) e Picro sirius red.
Em função da amostra estar distribuída em 9 grupos e o n ser baixo,
somado ao fato de que houve perda de 3 animais e muitas lâminas de HE
não permitirem avaliação precisa dos parâmetros, não foi possível
estabelecer conclusões.
Nos Apêndices 17 e 18 estão relacionadas as tabelas e figuras das
imagens obtidas de colágeno por microscopia de polarização.
98
Apêndices
Apêndice 18
Tabela 1 – Descrição dos parâmetros de hematoxilina-eosina em cada grupo
segundo dias de coleta no estudo piloto.
GS: Grupo Simulado; GB: Grupo Baixa Dose; GA: Grupo Alta Dose.
DP: desvio padrão
99
Apêndices
Apêndice 19
Tabela 2 – Descrição das áreas percentuais de colágeno tipo I e tipo III no estudo
piloto
GS: Grupo Simulado; GB: Grupo Baixa Dose; GA: Grupo Alta Dose.
DP: desvio padrão
100
Anexos
Anexo 1
101
Anexos
Anexo 2
Retirado de KITCHEN (2003)
102
Fontes Consultadas
FONTES CONSULTADAS
Ferreira ABH. Miniaurélio século XXI escolar. 4a ed. Rio de Janeiro: Nova
Fronteira; 2001.
Hochman B, Nahas FX, Oliveira Filho RS, Ferreira LM. Desenhos de
pesquisa. Acta Cir Bras. 2005;20 (Suppl. 2):02-9.
Kirkwood BR, Sterne JAC. Essential medical statistics. 2nd ed.
Massachusetts: Blackwell Science; 2006.
Neter J, Kutner MH, Nachtsheim CJ, Wasserman W. Applied Linear
Statistical Models. 4th ed. Ilinois: Richard D. Irwing; 1996.
Kitchen S. Eletroterapia baseada em evidências 11a ed. São Paulo: Manole;
2003.
Academia Brasileira de Letras. Vocabulário Ortográfico da Língua
Portuguesa. 5a. ed. São Paulo: Global 2009. 976p. Disponível no endereço
eletrônico:
http://www.academia.org.br/abl/cgi/cgilua.exe/sys/start.htm?sid=23
