Terapia fotodinâmica em combinação com ácido acetilsalicílico

Nuno Almeida1, Mafalda Laranjo2, Arménio Serra3, Margarida Abrantes2, Marta Piñeiro3, Maria Filomena Botelho2

1Departamento de Bioquímica, Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra; 2Unidade de Biofísica/CIMAGO Faculdade de Medicina de Coimbra; 3Departamento de Química, Faculdade de Ciências e Tecnologia

da Universidade de Coimbra

Resumo: A terapia fotodinâmica é uma terapêutica promissora, pouco invasiva e sem efeitos secundários, que tem vindo a ser cada vez mais utilizada, estando aprovada em vários países para tratar difentes neoplasias. Neste estudo o objectivo é aferir se existe alguma sinergia na combinação do ácido acetilsalicílico com a terapia fotodinâmica de forma a aumentar a eficácia do tratamento. Observando-se os resultados obtidos conclui-se que de alguma forma esta terapia combinada possui potencialidades que deverão ser exploradas para futura utilização em modelos de estudo mais complexos.

Palavras-chave:Terapia Fotodinâmica, Fotossensibilizador, Ácido acetilsalicílico, WiDr, OE19, IC50

IntroduçãoAo longo da história a luz foi utilizada diversas vezes como método terapêutico, mas apenas a partir do final do século XIX, Niels Finsen usou o termo “fototerapia” para denominar o tratamento de tuberculose cutânea com o recurso a luz ultravioleta (Ackroyd et al. 2001). Após este evento surgiram os princípios da terapia fotodinâmica (PDT) há cerca de 100 anos quando investigadores descobriram que a combinação de luz e certos químicos poderia induzir danos tecidulares, sendo que mais tarde Von Tappeiner e Jesionek trataram tumores na pele com eosina e luz branca, demonstrando que esta combinação provocava a morte celular das células tumorais (Huettner et al. 2000).O primeiro registo relativo a um fotossenbilizador surge através de Lipson e Baldes, com a descoberta de um derivado de

hematoporfirina não-tóxica (HPD), que tinha a particularidade de acumular nos tecidos neoplasicos. O primeiro ensaio clínico de PDT foi levado a cabo por Thomas Dougherty e os seus colaboradores na década de 70, ensaio esse que consistiu na aplicação tópica de HPD em conjunto com luz vermelha, tendo este tratamento erradicado completamente cancros mamários e da bexiga em ratos (Dolmans et al. 2003).A PDT é uma terapêutica pouco invasiva e está aprovada para o tratamento de inúmeras patologias, nomeadamente a degeneração macular, doenças dermatológicas e certos tipos de cancro. Além disso, as áreas de aplicação desta terapia tendem a aumentar, sendo também usada por exemplo na medicina dentária (Konopka et al. 2007). Tendo em conta estas características a PDT representa uma modalidade de tratamento de cancro

atractiva em combinação com outras terapias frequentemente utilizadas como a quimioterapia, a radioterapia ou mesmo a imunoterapia, já que a PDT possui algumas limitações quando usada sozinha, como o facto de a luz necessária para activar o fotossensibilizador apenas penetrar até cerca de 1 cm de espessura da pele, não ser muito eficaz no tratamento de tumores de grandes dimensões e por ser uma terapia localizada que não permite o tratamento de cancros metastizados. Quando usada em combinação com outras terapias tem o potencial de possibilitar a redução das doses das substâncias usadas nestas terapias, bem como a redução dos efeitos secundários, sem se prejudicar a eficácia global do tratamento (Vrouenraets et al. 2003).O princípio de acção da PDT consiste na administração sistémica ou local, por injecção ou via tópica, de um agente fotossenbilizador que é acumulado selectivamente ou retido no tecido neoplasico, seguido da irradiação de luz visível, de um determinado comprimento de onda, sendo esse correspondente ao espectro de absorção do agente fotossensibilizador (Dolmans et al. 2003). Com a absorção de fotões o agente fotossensibilizador passa do estado fundamental ao estado excitado de singuleto, que por sua vez decai novamente para o estado fundamental, o que quer dizer que com activação do agente fotossensilizador por parte da luz há a transferência da energia excedente para diferentes substratos (Triesscheijn et al. 2006). Tais eventos têm como consequência o dano oxidativo nas

vizinhanças onde ocorre a acumulação do fotossenbilizador, sendo que uma fracção de moléculas no estado excitado de singuleto é transformada em moléculas no estado excitado de tripleto, que possuem um tempo de vida relativamente longo e têm a capacidade de formar radicais livres ou radicais associados a iões por extracção de átomos de hidrogénio ou pela transferência de electrões para substratos biológicos (como por exemplo a membrana lípidica), moléculas solventes ou oxigénio. Os radicais formados interaccionam com o oxigénio molecular no estado fundamental produzindo iões radicais superóxido, peróxidos de hidrogénio e radicais hidroxilo, sendo esta reacção do tipo I. No caso das reacções de tipo II, não é necessária a intervenção de intermediários para a formação de espécies reactivas de oxigénio (ROS), porque as moléculas do estado excitado de tripleto transferem directamente a energia para o oxigénio molecular, produzindo ROS altamente reactivas, como se pode verificar na figura 1.O espectro de acção da PDT está limitado apenas às células proximais onde as ROS são produzidas, que consequentemente são aquelas onde o agente fotossenbilizador se acumulou, sendo que na vizinhança destas células os tecidos não sofrem danos de particular relevo. Tal fenómeno é explicado pelo facto de que nos sistemas biológicos o tempo de meia-vida do oxigénio no estado de singuleto é muito curto, limitando o raio de acção das ROS e evitando assim danos colaterais na vizinhança.

Figura 1.Princípio de acção dos dois tipos reaccionais existentes na PDT. Retirado de Dolmans et al. 2003. Descrição dos dois tipos de mecanismos reaccionais existentes na formação de espécies reactivas de oxigénio, onde na reacção do tipo I verifica-se a reacção do fotossensibilizador com intermediários, enquanto na reacção do tipo II verifica-se a reacção directa com o oxigénio.

A PDT induz a morte celular das células neoplasicas por três mecanismos principais que são: a morte celular directa das células tumorais, destruição da vascularização tumoral e activação de uma resposta imunitária. No caso da morte celular directa das células tumorais esta ocorre por apoptose, necrose ou autofagia mediadas pelas ROS produzidas durante a acção da PDT, verificando-se que o rácio de células mortas por apoptose ou necrose dependem da localização intracelular do fotossensibilizador e da fluência da luz, que é uma propriedade dosimétrica que refere à quantidade de luz absorvida pelo agente fotossensibilizador (Oleinick et al. 2002).As drogas anti-inflamatórias não esteroídes (NSAID’s) têm uma grande utilidade clínica, que é resultante da capacidade que estas têm para inibir a actividade da cicloxigenase (COX). Dentro das NSAID’s encontra-se o ácido acetilsalicílico, vulgarmente conhecido como aspirina, que é um inibidor não especifico da

COX, inibindo a COX-1 e a COX-2. As duas isoformas da COX estão envolvidas na transformação de ácido araquidónico em protaglandinas, leucotrienos e tromboxanos, que são responsáveis pela mediação da resposta inflamatória, sendo que em células tumorais as isoformas da COX encontram-se sobreexpressas. Tendo em conta essa capacidade, verifica-se que a aspirina, sendo um inibidor das COX leva à morte celular das células tumorais por mecanismos apoptóticos resultantes de uma interferência das vias de transdução de sinal de factores pro-inflamatórios (Dikshit et al. 2006). Logo, como o ácido acetilsalicílico tem todas estas propriedades poderá existir uma possível sinergia em combinação com a PDT na contribuição para a morte celular tumoral, sendo que esta possibilidade será o tema central de estudo deste trabalho.

Então, para se avaliar a associação da PDT com a aspirina, foram realizados estudos in vitro em duas linhas celulares, WiDr e OE19.

Material e Métodos

Estudos in vitroOs estudos in vitro constituem a primeira fase de avaliação do potencial terapêutico de um composto em ambiente controlado. São de extrema importância, uma vez que é vital conhecerem-se os mecanismos de acção das substâncias ao nível molecular, para posteriormente serem testadas em modelos cada vez mais complexos. Para este estudo recorreu-se às metodologias descritas ao longo da secção.

Culturas CelularesAs culturas celulares são efectuadas com o propósito de cultivar e propagar células dispersas para a sua posterior utilização nos estudos in vitro, sendo que a manutenção exige cuidados especiais ao nível da assepsia e esterilidade, de modo a garantir-se a viabilidade das mesmas.Para a realização dos estudos in vitro, foram usadas duas linhas celulares humanas, WiDR (linha de adenocarcinoma colo-rectal) e OE19 (linha de adenocarcinoma do esófago). Estas linhas celulares foram propagadas em cultura aderente, tendo em conta as especificações dos seus respectivos fornecedores, American Type Culture Collection (ATCC) para a linha WiDr e European Collection of Cell Cultures (ECACC) para linha OE19, sendo mantidas a 37°C numa atmosfera com humidade relativa a 95% e 5% de CO₂ numa incubadora Heracell 150.

A linha celular WiDR foi propagada em meio de cultura Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, DMEM (Sigma D-5648,EUA), enquanto a linha celular OE19 foi propagada em meio de cultura Roswell Park Memorial Institute Medium, RPMI-1640 (R-4130, Sigma AldrichR, EUA), sendo ambos os meios de cultura suplementados com soro bovino fetal a 5%, (FBS;Sigma F-7524, EUA), 1% de antibiótico (GIBCO 15240, UK) e piruvato de sódio (DMEM: 100mM,RPMI: 400mM; GIBCO 11360, UK).Uma vez que estas linhas celulares são mantidas em cultura aderente foi necessário destacar as células dos frascos e preparar suspensões celulares, de modo a ser possível a realização dos estudos in vitro. Para tal, aspiraram-se os meios de cultura dos frascos e fez-se uma lavagem das culturas celulares com solução salina de tampão fosfato, PBS, constituído por 137mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 10 mM de Na2HPO4 e 1,8 mM de KH2PO4

[pH 7,4], incubando as de seguida com uma solução de tripsina-EDTA a 0,25% (Gibco 25200, UK) até estas se destacarem dos frascos. De seguida adicionou-se o triplo do volume de tripsina em meio de cultura, de modo a inactiva-la. Para a contagem do número de células existentes nos frascos, diluiu-se um volume conhecido de suspensão celular num volume igual de azul de tripano e fez-se a contagem num microscópio invertido (Nikon, Eclipse TS 100) numa ampliação de 10 vezes com recurso a um hemocitómetro. De modo a obter-se a concentração celular desejada para cada estudo, adicionou-se o volume necessário meio de cultura às suspensões celulares obtidas anteriormente.

Preparação das soluções de ácido acetilsalicílico e fotossensibilizador Uma solução stock de 1M ácido acetilsalicílico foi preparada dissolvendo ácido acetilsalicílico (Sigma A6810, EUA) em tampão Tris 0,1M pH 8.8, sendo que as concentrações de 1mM e 2,5mM de aspirina são obtidas através desta solução inicial.As soluções de fotossensibilizador foram preparadas através de uma solução stock a 1,53mM de ACS881F1 diluída para as concentrações pretendidas com um solvente composto poruma mistura ternária de água, polietilenoglicol400 (PEG400) e etanol (50:30:20, v/v/v).

Terapia combinadaPara a realização dos estudos foram plaqueadas cerca de 80.000 células por poço, em placas de 48 poços, sendo as substâncias utilizadas adicionadas como demonstra a figura 2, na qual se verifica a presença de poços de controlo, poços com solvente, poços só com aspirina de 1mM ou 2,5mM, poços só com PS de concentração variável entre os 5pM e os 10µM e ainda poços com aspirina+PS.Neste estudo foram utilizadas 3 condições distintas: (a) incubação de ácido acetilsalicílico durante 3h seguida de incubação com ACS881F1 durante 24h; (b) a incubação de ácido acetilsalicílico durante 6h seguida de incubação com ACS881F1 durante 24h; e, finalmente, (c) a incubação com ACS881F1 durante 24h, seguida da adição da aspirina antes da irradiação com a luz.Posteriormente as placas com as culturas celulares nas condições acima descritas, estas são irradiadas com um fluxo de 7,5mW/cm2até se atingir os 10J, durante 27 min, sendo a proliferação celular avaliada 24h depois.

Avaliação da proliferação celular pelo ensaio de MTTDe modo a avaliar-se a proliferação celular das placas preparadas anteriormente fez-se o ensaio de MTT (3- (4,5-dimethylthiazolyl-2)2,5-diphenyltetrazolium bromide). O princípio deste ensaio consiste no facto de células metabolicamente activas, internalizarem o MTT por endocitose (Datki et al., 2003), tendo a capacidade de o reduzir a cristais de formazan. A redução do formazan ocorre principalmente na mitocondria devido à acção do complexo II da cadeia respiratória mitocondrial (Oliveira et al., 2001). Os anéis de tetrazolio do MTT são clivados pelas desidrogenases provenientes deste complexo ocorrendo a formação dos cristais de formazan que podem ser solubilizados e quantificados por espectrofotometria. Como a quantidade de cristais formados é proporcional à quantidade de células que possuem actividade mitocondrial, este ensaio é considerado um método indirecto na determinação da proliferação celular (Oliveira et al., 2001).Para a realização deste ensaio, removeu-se o meio de cultura das placas e lavaram-se os poços com PBS.De seguida adicionou-se 100 µL de uma solução de MTT em PBS pH 7.4 (0,5 mg/ μl; Sigma M2128) a cada poço das placas e incubaram-se as placas no escuro a 37°C durante cerca de 2 horas. Após a incubação, de modo a solubilizar-se os cristais de formazan adicionou-se aos poços das placas 100 µL de uma solução de 0,04M de ácido clorídrico em isopropanol e deixaram-se as placas em agitação. O conteúdo de cada poço foi homogeneizado e transferido para placas de 96 poços e a absorvância foi quantificada a 570 nm com um filtro de referência de 620 nm, usando o espectrofotometro ELISA (Biotek® Synergy HT). A citotoxicidade foi expressa

como a percentagem da inibição nas culturas celulares submetidas em relação às culturas controlo. Através destes dados foram construídas curvas de dose-resposta no software Origin Pro 8.5, que permitiram determinar a concentração de substância que inibe à proliferação celular em 50% (IC50). A análise estatística foi realizada com recurso ao programa IBM SPSS® v.19, onde a normalidade da distribuição das variáveis foi avaliada com recurso ao teste de Shapiro-Wilk, em que caso existisse normalidade nas distribuições subjacentes seria feito um teste paramétrico para se comparar os resultados obtidos ou um não paramétrico se verificasse o oposto. A comparação de variáveis quantitativas entre dois grupos fez-se com recurso ao teste t-Student (paramétrico) e de Mann-Whitney (não paramétrico). A comparação de variáveis quantitativas entre três ou mais grupos foi obtida com recurso ao teste de Kruskal-Wallis, com comparações múltiplas realizadas com recurso ao teste de Mann-Whitney com correcção de Bonferroni. A comparação dos valores de IC50 obtidos foi efectuada com base no teste ANOVA de um factor com comparações múltiplas utilizando a correcção de Bonferroni, com um nível de significância de 5%.

Avaliação da proteína total pelo ensaio de SRBO ensaio de SRB é baseado na ligação do corante sulforodamina b a aminoácidos básicos de proteínas celulares, sendo um método de avaliação colorimétrica que permite uma estimativa da massa total de proteína, que é directamente proporcional ao número de células presentes. (Papazisis et al. 1997) Este ensaio tem sido muito utilizado in vitropara a determinação do conteúdo proteico

intracelular tanto de culturas de células aderentes como de células em suspensão. As vantagens deste ensaio comparativamente aos outros incluem uma melhor linearidade, sensibilidade e um baixo custo (Papazisis et al. 1997).Para a realização deste ensaio preparam-se de placas de 24 poços com 80.000 células/mL da linha celular WiDR e a combinação foi avaliada tendo em conta o esquema de tratamento (a), anteriormente descrito, e o esquema da figura 3, onde temos poços de controlo, poços com solvente, poços só com aspirina, poços só com PS e poços com aspirina+PS Posteriormente os poços foram lavados com PBS a 4°C e de com água ultra-pura. Após estes passos adicionaram-se 200 µL de ácido acético em metanol, com a finalidade de fixar as células na placa, durante 30 min. No final dos 30 min, adicionaram-se 200 µL de SRB e deixaram-se as placas a incubar no escuro durante cerca de duas horas. Após a incubação do reagente lavaram-se as placas com água de uma forma cuidadosa, para não se destacarem cristais da placa, sendo que de seguida adicionaram-se 200 µL de Tris-NaOH para dissolver os cristais formados. Finalmente agitaram-se as placas, homogeneizou-se o seu conteúdo, que foi transferido para uma placa de 96 poços e a absorvância foi quantificada a 540 nm com um filtro de referência de 690 nm, usando o espectrofotometro ELISA (Biotek® Synergy HT). A análise estatística dos dados obtidos foi efectuada do mesmo modo anteriormente descrito no ensaio de MTT.

Avaliação da sobrevivência celular por ensaio clonogénicoO ensaio clonogénico é um método que determina a sobrevivência celular, tendo por base a capacidade de uma única célula crescer

e formar uma colónia, após a intervenção de um tratamento. Para estudar este processo foram preparadas placas de seis poços com 500.000 células por poço num volume final de 3. Procedeu-se à incubação das placas de acordo com o esquema de tratamento (a), demonstrado na figura 4., com a existência de poços de controlo, poços só com aspirina, poços só com PS e poços com aspirina+PS. Após 24h da irradiação cada condição foi semeada em novos poços com 500 células por poço.Doze dias após o tratamento, as células foram lavadas com PBS, fixadas durante 10 min com 2 mL de metanol por poço e procedeu-se à coloração com o corante violeta de cristal (0,5% em metanol; Sigma M12128) durante 10 min. Após remoção do excesso de corante, o número de colónias foi contado, permitindo o cálculo da Plate Efficiencye do Factor de Sobrevivência, pelas seguintes equações:

Plate Efficiency= númerode colóniascontadasnúmerode colónias semeadas

×100

Factor de Sobrevivência= PlateEfficiency das amostrasPlate Efficiencydos controlos

×100

Resultados

Avaliação da proliferação celular pelo ensaio de MTT

Os resultados obtidos pelo ensaio de MTT na linha celular WiDR permitiram obter curvas de dose-resposta que foram ajustadas a um modelo sigmoidal e que estão representadas na figura 2. A partir destas curvas calcularam-se os valores de IC50, representados, juntamente com os respectivos intervalos de confiança, na tabela 1. De um modo geral verifica-se que a actividade metabólica é inversamente proporcional à concentração de PS a que as culturas celulares são submetidas. Do mesmo modo, na generalidade, o tratamento com 2,5mM de aspirina induz maior diminuição da actividade metabólica que os estudos realizados com 1mM.

1 2 3 4 5 6 70

20

40

60

80

100

120 (a) (b) (c)

Prol

ifera

çao

(%)

Concentraçao (log(pM))

1 2 3 4 5 6 70

20

40

60

80

100

120 (a) (b) (c)

Prol

ifera

çao

(%)

Concentraçao (log(pM))

Figura 2. Curvas dose resposta em adenocarcinoma colo-rectal Avaliação da proliferação celular pelo ensaio de MTT da linha celular WiDR submetida aos esquemas de tratamento a, b e c, descritos na secção de material e métodos.

A B

Incubação com 1mM de aspirina: (A); Incubação com 2,5mM de aspirina: (B). Os resultados expressam a média e o desvio-padrão de n≥4obtido em pelo menos 4 experiências independentes.

Analisando os resultados obtidos, verifica-se que de uma forma geral uma maior concentração de ácido acetilsalicílico tem maior influência na proliferação celular, nomeadamente WiDR 3H 1mM AA+PS possui um IC50 de 44,01nM, enquanto WIDR 3H 2,5mM AA+PS possui um IC50 de 33,53nM (p=0,027). No caso das condições de 24H de incubação, o mesmo volta a registar-se com as

WiDR 24H PS+1mM AA a possuírem um IC50 de 28,79nM, enquanto as WiDR 24H PS+2,5mM AA tiveram um IC50 de 24,24nM (p <0,001). Em WiDR 6H 1mM AA+PS e WiDR 6H 2,5mM AA+PS, por outro lado, o mesmo não se verificou com as WiDR 6H 1mM AA+PS a terem um valor de IC50 de 10,18nM e as WiDR 6H 2,5mM AA+PS em 51,41nM (p <0,001).

Tabela 1. Valores de IC50 obtidos para o tratamento em adenocarcinoma colo-rectal.Os resultados do IC50 e intervalos de confiança estão expressos em nM. Para o cálculo dos IC50 foram utilizados n≥4 obtido em pelo menos 4 experiencias independentes. O r² das curvas de dose-resposta ajustada aos pontos experimentais com assimptotas fixas em 0 e 100, a partir das quais se calcularam os IC50, sãoiguais ou superiores a 0,92, com excepção de WiDr 3H AA+PS com 0,88.

WiDRIC50 IC R²

3H AA+PS1mM

2,5mM44,01nM33,53nM

[36,04; 53,74][28,51; 39,43]

0,8790,9200

6H AA+PS1mM

2,5mM10,18nM51,41nM

[7,04;14,72][48,29;54,73]

0,96200,9963

24H PS+AA1mM

2,5mM28,79nM24,24nM

[26,83;30,90][23,65;24,85]

0,98820,9936

Analisando a figura 3, que compara o efeito da aspirina sozinha na linha celular WiDr, verifica-se que o tratamento com 2,5mM AA têm maior efeito de redução da proliferação celular que 1mM AA (p<0,05). Assim, comparando os resultados obtidos para 2,5mM AA: WiDR 3H 2,5mM AA+PS vs WiDR 6H 2,5mM AA+PS (p <0,001), WiDR 3H 2,5mM AA+PS vs WiDR 24H

PS+2,5mM (p=0,002) e WiDR 6H 2,5mM AA+PS vs WiDR 24H PS+2,5mM (p <0,001), pode-se afirmar que o tratamento WiDR 24H PS+2,5mM é o que regista uma descida mais acentuada na proliferação celular. No entanto o tratamento em que se verificou um IC50 mais reduzido foi WiDR 6H 1mM AA+PS.

Figura 3. Proliferação celular de células de adenocarcinoma colo-rectal submetidas a aspirina em diferentes concentrações. Os resultados expressam a média e o desvio-padrão de n≥4 obtido em pelo menos 4 experiências independentes.

Tal como se verificou anteriormente para a linha WiDR, os resultados obtidos pelo ensaio de MTT na linha celular OE19 permitiram obter curvas de dose-resposta que foram ajustadas a um modelo sigmoidal, estando representadas na figura 4. A partir destas curvas calcularam-se os valores de IC50, representados juntamente com os respectivos intervalos de confiança, na tabela 2. Verifica-se também que

a actividade metabólica é inversamente proporcional à concentração de PS a que as culturas celulares são submetidas, como na linha celular WiDR. Do mesmo modo, na generalidade, o tratamento com 2,5mM de aspirina induz maior diminuição da actividade metabólica que os estudos realizados com 1mM, tal como se pode confirmar na figura 5.

1 2 3 4 5 6 70

20

40

60

80

100

120 (a) (b) (c)

Prol

ifera

çao

(%)

Concentraçao (log(pM))

1 2 3 4 5 6 70

20

40

60

80

100

120 (a) (b) (c)

Prol

ifera

çao

(%)

Concentraçao (log(pM))

Figura 4. Curvas dose resposta em adenocarcinoma do esófago. Avaliação da proliferação celular pelo ensaio de MTT da linha celular OE19submetida aos esquemas de tratamento a, b e c, descritos na secção de material e métodos. Incubação com 1mM de aspirina: (A); Incubação com 2,5mM de aspirina: (B). Os resultados expressam a média e o desvio-padrão de n≥4 obtido em pelo menos 4 experiências independentes.

A B

****** ***

***

No caso das OE19, avaliando-se os resultados obtidos, também se pode afirmar que tal como nas WiDR, uma maior concentração de aspirina é directamente proporcional a uma diminuição da actividade metabólica celular, o que se verifica em OE19 6H 1mM AA+PS com um IC50 de 7,23nM comparando com OE19 6H 2,5mM AA+PS com um IC50 de 6,37nM, sendo neste a caso a diferença não significativa. No caso das OE19 24H PS+1mM AA e OE19 24H PS+2,5mM AA, regista-se também esse facto na sua

comparação, com OE19 24H PS+1mM AA a possuir um valor de IC50 de 7,23nM e OE19 24H PS+2,5mM AA com um valor de IC50 de 1,90nM (p <0,001). Em OE19 3H 1mM AA+PS e OE19 3H 2,5mM AA+PS, a crescente concentração de aspirina não tem maior efeito na redução da proliferação celular, tendo-se obtido um IC50 de 6,47nM em OE19 3H 1mM AA+PS e um IC50 de 8,05nM em OE19 3H 2,5mM AA+PS (p=0,070).

Tabela 2. Valores de IC50 obtidos para o tratamento em carcinoma do esófago. Os resultados do IC50 e intervalos de confiança estão expressos em nM. Para o cálculo dos IC50 foram utilizados n≥4 obtido em pelo menos 4 experiências independentes. Os r² das curvas de dose-resposta ajustada aos pontos experimentais com assimptotas fixas em 0 e 100, a partir das quais se calcularam os IC50, são iguais ou superiores a 0,98, com excepção de OE19 3H AA+PS com 0,97.

OE19IC50 IC R²

3H AA+PS1mM

2,5mM6,47nM8,05nM

[5,25;7,98][7,21;8,99]

0,96970,9935

6H AA+PS1mM

2,5mM7,23nM6,37nM

[5,63; 9,33][5,64; 7,20]

0,99060,9776

24H PS+AA1mM

2,5mM7,26nM1,90nM

[6,37; 8,27][1,42; 2,54]

0,99440,9977

Comparando os valores obtidos para a concentração de 2,5mM AA: OE19 3H 2,5mM AA+PS vs OE19 6H 2,5mM (p=0,005), OE19 3H 2,5mM vs OE19 24H PS+2,5mM (p <0,001) e OE19 6H 2,5mM vs OE19 24H PS+2,5mM (p <0,001), pode-se afirmar que o tratamento OE19 24H PS+2,5mM AA é aquele que tem

uma maior influência na redução da proliferação celular.Finalmente comparando as linhas celulares WiDR e OE19 pode observar-se que a terapia combinada tem mais efeito em OE19, devido aos seus IC50 mais reduzidos em relação a WiDR.

Figura 5. Proliferação celular dos controlos com aspirina a diferentes concentrações em adenocarcinoma do esófago. Avaliação da proliferação celular pelo ensaio de MTT da linha celular OE19 submetida aos esquemas de tratamento a, b e c, apenas na presença de aspirina, descritos na secção de material e métodos. Os resultados expressam a média e o desvio-padrão de n≥4obtido em pelo menos 4 experiências independentes.

Avaliação da proteína total pelo ensaio de SRBO PS apresentou a concentração de IC50 (44nM) obtida anteriormente na avaliação da citotoxicidade pelo MTT na linha WiDR com incubação de 3H de aspirina 1mM+PS

(tratamento a), e a avaliação da produção de proteína total mostrou um grande abaixamento em relação ao controlo como se pode observar no gráfico da figura 6 e confirmar na tabela 3.

Figura 6.Avaliação da percentagem de proteína da linha celular de adenocarcinoma colo-rectal total submetida a 3H AA 1mM+PS 44nM, obtida pelo ensaio de SRB. Avaliação da percentagem de proteína total pelo ensaio de SRB na linha celular WiDR com incubação de AA durante 3H com 1mM de aspirina+ PS 44nM.Os resultados expressam a média e o desvio-padrão de n≥4 obtido em 2 experiências independentes.

Tendo em conta os resultados obtidos no ensaio de SRB, em AA 1mM sozinho não se verificam diferenças em relação ao controlo.

No caso do PS 44nM sozinho verifica-se uma diminuição significativa da percentagem de proteínas totais em relação ao controlo

******

********

******

(controlo vs PS 44nM: p <0,001). Na terapia combinada regista-se também uma diminuição significativa da percentagem de proteínas totais em relação ao controlo (controlo vs PS 44nM+AA 1mM: p <0,001), sendo essa redução maior comparativamente com a redução efectuada por PS 44nM sozinho.

Finalmente comparando AA 1mM vs PS 44nM (p <0,001), AA 1mM vs PS 44nM+1AAmM (p <0,001) e PS 44nM vs PS 44nM+1mM AA (p=0,021), confirmando as diferenças entre tratamentos, o efeito citotoxico do PS e que, o mesmo em combinação com a Aspirina, tem efeito superior.

Tabela 3. Proteínas totais em relação ao controlo em WiDR 3H 1mM AA+PS. Os resultados do factor de sobrevivência e intervalos de confiança estão expressos em %. Para a determinação destes foram utilizados n≥4 obtido em pelo menos 2 experiencias independentes.

Proteína Total (media %)

SD IC

AA 1mM 107,0 3,10 [102,1; 111,9]

PS 44nM 7,86 1,54 [5,95; 9,77]

PS 44nM+AA 1mM 3,81 1,32 [2,59;5,03]

Avaliação da sobrevivência celular por ensaio clonogénico

Tendo-se obtido a concentração de IC50 (44nM) anteriormente na avaliação da citotoxicidade pelo MTT na linha WiDR com incubação de 3H de aspirina 1mM+PS

(tratamento a), verificou-se na avaliação da sobrevivência celular por ensaio clonogénico que, tal como nos ensaios anteriores, tanto o PS 44nM como a terapia combinada reduziram o factor de sobrevivência celular conduzindo a uma diminuição da proliferação celular.

Figura 7. Factor de sobrevivência das colónias em WiDR 3H AA 1mM+PS 44nM. Avaliação da sobrevivência celular por ensaio clonogénico da linha celular WiDR com incubação de AA durante 3H com 1mM de aspirina+ PS 44nM. Os resultados expressam a média e o desvio-padrão de n≥4 obtido em 2 experiências independentes.

No entanto, em relação à avaliação da sobrevivencia, não se verificam diferenças estatisticamente significativas entre condições.

Os resultados estão representados gráficamemte na figura 7 e podem ser confirmados na tabela 4.

Tabela 4. Factor de sobrevivência em relação ao controlo em WiDR 3H 1mM AA+PS. Os resultados do factor de sobrevivência e intervalos de confiança estão expressos em %. Para a determinação destes foram utilizados n≥2 obtido em pelo menos 2 experiencias independentes.

Factor de Sobrevivência(media, %)

SD IC

AA 1mM 47,9 4,33 [8,97; 86,8]

PS 44nM 40,6 10,0 [49,25; 130,4]

PS 44nM+AA 1mM 39,4 30,2 [35,7; 114,4]

DiscussãoA PDT é uma modalidade terapêutica que ao longo do tempo começa cada vez mais a ter um maior relevo em oncológia. Este interessepoderá estar relacionado com o facto de se tratar de uma terapia que é não invasiva, com uma baixa toxicidade sistémica, acção específica no tecido tumoral, sem efeitos secundários graves no tecido saudável e com a possibilidade de ser utilizada em combinação com outras modalidades terapêuticas. Assim, torna-se evidente que seja uma aposta de futuro em relação aos tratamentos já existentes.A PDT tem sido alvo de estudo, de modo a perceber-se com exactidão quais os mecanismos envolvidos na indução de morte celular, sabendo-se actualmente, que existem vários factores que influenciam esses mesmos mecanismos, nomeadamente, a natureza química do PS, a concentração de PS, o modo

de irradiação usado, bem como o conteúdo genético da célula (Robertson et al., 2009). A localização do PS no interior da célula determina quais os alvos de acção da PDT, o que por sua vez determina o tipo de morte celular (Zhu et al., 2008). Tal facto deve-se ao principal produto citotóxico originado pela PDT o anião superóxido(1O₂), ter uma capacidade de difusão na ordem dos 10nm após a sua produção (Dougherty et al., 1998).A avaliação da proliferação celular por ensaio de MTT permitiu a determinação de curvas dose resposta na combinação entre a PDT e o ácido acetilsalicílico, de modo a poder-se avaliar as diferentes respostas obtidas. O valor de IC50 obtidos para a linha celular WiDR 3H 1mM AA+PS mostram que a concentração necessária para obter inibição da proliferação celular em 50% é de 44nM, enquanto que em WiDR 3H 2,5mM AA+PS a concentração necessária para obter o mesmo efeito é de

33,5nM. Tal resultado indica que o aumento da concentração de aspirina diminui a concentração necessária para ocorrer inibição da proliferação celular. No entanto, esta permissa nem sempre se verificou nomeamente nos estudos de WiDR 6H. Outra hipótese que se pode levantar na análise destes resultados é o facto de o período de incubação das células com AA levar à alteração do IC50, sendo que quando maior for o tempo de incubação, menor será o IC50, o que realmente se verifica para as WiDR 3H e WiDR 24H, verificando-se então uma discrepância nas WiDR 6H. Finalmente, também há que ter em conta a ordem em que se faz a adição da aspirina poderá influenciar o IC50, uma vez que nas WiDR 24H a aspirina só foi adicionada após a incubação com PS durante 24H e a troca dos meios de cultura momentos antes da irradiação, sendo que se verificou a ocorrência de um IC50 menor do que na ordem inversa.O valor de IC50 obtido para a linha celular OE19 3H 1mM AA+PS mostra que a concentração necessária para se obter inibição em 50% da proliferação celular é inferior ao de E19 3H 2,5mM AA+PS, o que também não está de encontro com a hipótese levantada anteriormentede que o aumento na concentração de aspirina diminui o IC50. Para as OE19 6H 1mM AA+PS tem-se um valor de IC50 de 7,25 nM, já para as OE19 6H 2,5mM AA+PS esse valor é de 6,37 nM, sendo que neste caso já se pode afirmar que o aumento da concentração de aspirina contribuiu para a diminuição do IC50. Nas OE19 24H PS+1mM AA o valor de IC50 obtido foi de 7,26 nM, enquanto nas OE19 24H PS+2,5mM AA esse valor foi de 1,90 nM, o que mais uma vez está de acordo com a hipótese de que o aumento da concentração de aspirina diminui o IC50. Destes dados, também é possível referir que o

tempo de incubação a que as linhas celulares estiveram sujeitas à aspirina também influencia o IC50, causando maior diminuição da proliferação, apenas não se verificando totalmente isso nas OE19 6H.Comparando as linhas celulares WiDR e OE19 verifica-se que os valores de IC50 obtidos para ambas, são bastantes inferiores para a linha celular OE19, o que nos revela que esta terapia combinada tem um maior potencial nesta linha celular em comparação com a linha WiDR, pois não é necessária uma concentração elevada de AA+PS para se obter a inibição em 50% da proliferação celular. Além disto estes resultados confirmam ainda, o que foi anteriormente descrito na literatura, nomeadamente que a fisiologia e o tipo celular influênciam a resposta à PDT (Robertson et al., 2009). Finalmente comparando os valores de IC50 obtidos da terapia combinada para ambas as linhas celulares verifica-se que estes valores são inferiores aos valores obtidos de IC50 para o fotossensibilizador sozinho com o valor de IC50 de 58,5nM para a linha WiDR e o valor de IC50 de 35,0nM para a linha OE19 (resultados não publicados, anteriormente obtidos na Unidade de Biofísica), o que revela muito das potencialidades deste tratamento. Foi possivel fazer mais estudos a cerca do efeito da PDT na linha celular WiDr, nomeadamente a avaliação do conteudo proteico total e a avaliação da sobrevivencia celular. Após analise dos resultados obtidos para a avaliação da proliferação celular verificou-se que o tratamento mais promissor foi: 6H 1mM AA+PS, no entanto, e por uma questão temporal de obtenção dos resultados, optou-se por prosseguir os estudos com a condição 3H 1mM AA+PS. Apesar desta

limitação no desenho experimental, foi possivel tirar várias conclusões.Assim, a avaliação da proteína total pelo ensaio de SRB teve como objectivo obter uma estimativa do número de células existentes através da quantidade de proteína total. Para a linha celular WiDR 3H 1mM+PS 44nM, observando-se o gráfico obtido, representado na figura 6, pode comprovar-se que o ácido acetilsalicílico sozinho não influencia grandemente a percentagem total de proteína em relação ao controlo, apesar de se ter verificado que este sozinho tem uma pequena influencia na proliferação celular. No caso do PS 44nM, que corresponde ao valor de IC50 obtido em WiDR 3H 1mM+PS, verifica-se que a percentagem total de proteína presente teve uma diminuição muito acentuada em relação ao controlo, o que era espectável tendo em conta os resultados já obtidos de avaliação da proliferação. Finalmente na combinação de 1mM AA+PS 44nM temos também uma diminuição ainda mais acentuada da percentagem de proteína total em relação ao controlo a ao PS sozinho.No caso da avaliação da sobrevivência celular por ensaio clonogénico verifica-se que o AA 1mM, o PS 44nM e a combinação de ambos diminuem a capacidade de formação de colónias, no entanto, as diferenças registadas não são significativas. Também analisando detalhamente os resultados obtidos, verifica-se que o desvio padrão associado à mediachega a atingir 70% deste valor. E é ainda de ter em conta o numero reduzido de experiências que foi possivel realizar. Assim expecula-se que, aumentando o numero de experiencias realizadas seria possivel encontrar diferenças com significado que confirmassem o efeito promissor da associação da PDT com a aspirina.

Conclusão

Tendo em conta tudo aquilo que foi abordado ao longo do trabalho pode-se concluir que a PDT é uma modalidade terapêutica com futuro, sendo necessário continuar a investigar os mecanismos que estão envolvidos na sua acção ao nível das células cancerígenas. Quanto à utilização desta terapia em combinação com drogas anti-inflamatórias não esteroidais, pode se afirmar que pelos resultados obtidos parece haver alguma forma de sinergia, uma vez que a adição de ácido acetilsalicílico parece incrementar a eficácia da terapêutica na diminuição da proliferação celular das células neoplasicas.Como perspectivas de continuação deste trabalho experimental in vitro propõe-se: 1) realizar o ensaio SRB e ensaios clonogénicos na linha celular WiDr tendo em conta a condição 6H 1mM AA+PS; 2) realizar os mesmos estudos na linha celular OE19, em que os resultados de proliferação são ainda mais promissores, tendo em conta a condição 24H PS + 2,5mM AA; 3) realizar estudos de citometria de fluxo para avaliar a viabilidade celular e tipos de morte; as espécies reativas de oxigénio e as defesas antioxidantes da célula; e, 4) realizar estudos de microscopia de fluorescência para avaliar se o AA influencia a distribuição do PS na celula.

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Agradecimentos

Gostaria de agradecer a todos os membros constituintes da unidade de Biofísica da FMUC por me ter acolhido, dando-me a possibilidade de realizar este projecto e pela partilha de conhecimentos que serão imprescindíveis para a continuação da minha carreira académica. Também gostaria de agradecer ao departamento de Química da Universidade de Ciências e Tecnologia por fornecer o fotossensibilizador, que foi essencial neste projecto.

ANEXO I

Anexo 1, Figura 1. Representação esquemática de uma placa de 48poços usada nos estudos in vitro. Na figura acima apresentada os poços com cor branca são os controlos, os com cor castanha são os poços com solvente, os vermelhos são os poços com PS (fotossensibilizador) apenas, os amarelos são os poços com PS + 1mM de aspirina, os azuis-escuros são os poços com PS + 2,5mM de aspirina, os azuis-claros são os poços 1mM de aspirina e finalmente os verdes são os poços com 2,5mM de aspirina. Os volumes adicionados não ultrapassaram 1% do volume total dos poços .As concentrações de PS administradas variaram 50pM e 10µM.

Anexo 1, Figura 2. Esquema representativo da placa de 24 poços usada no ensaio de SRB. Na figura acima apresentada os poços com cor branca são os controlos, os com cor castanha são os poços com solvente, os amarelos são os poços com concentração de PS igual ao IC50 de PS + aspirina a 1mM, os verdes são os poços com 1mM de aspirina, os azuis são os poços com concentração de PS igual ao IC50 + 1mM de aspirina.

Anexo 1, Figura 3. Esquema representativo da placa de 6 poços usada no ensaio clonogénico. Na figura acima apresentada os poços com cor branca são os controlos, o com cor laranja possui concentração de PS igual ao IC50 de PS + 1mM apenas, o verde contém 1mM de aspirina e os azuis são os poços com concentração de PS igual ao IC50 + 1mM de aspirina.