TERAPIAGÊNICA

Profa. Dra. Ana Elizabete SilvaDepartamento de Biologia

IBILCE - UNESP

TRATAMENTO DE DOENÇAS GENÉTICAS

Na maioria das vezes o tratamento das doenças genéticas é somente paliativo

amenizando os sintomas ao invés de agir na causa primária: o gene

ESTRATÉGIAS TERAPÊUTICAS

Terapia Gênica

Envolve diversas tecnologias que têm em comum, um novo conceito terapêuticoa introdução de material genético para atuar na causa fundamental da doença : o gene, fragmento gênico ou oligonucleotídeos

Descreve qualquer processo destinado a tratar ou aliviar doenças pela modificação

genética das células do paciente.

Terapia gênica germinativa

Terapia gênica somática

FORMAS POTENCIAIS DE TERAPIA GÊNICA

Terapia gênica para a mutação little(lit): hormônio do crescimento

Regulador-Promotor da Metalotioneína: remover metais pesados

TERAPIA GÊNICA GERMINATIVA

TERAPIA GÊNICA DE CÉLULAS SOMÁTICAS

Terapia ex vivo: as células do paciente são retiradas e manipuladas fora do corpo

Terapia in vivo: as células são tratadas dentro do corpo

http://www.smartplanet.es/articulos.php?pageNum_ctapag=6&totalRows_ctapag=11&id=9-4-3

TERAPIA GÊNICA IN VIVO

TERAPIA GÊNICA EX VIVO

1. Inserção de um gene em um vetor 2. Contato Vetor / Célula 3. Entrada e transporte do gene até o núcleo da célula 4. Transcrição do RNAm a partir do gene 5. Tradução do RNAm em proteína 6. Secreção, fixação na membrana ou expressão citoplasmática da proteína

PROCEDIMENTO BÁSICO PARA TERAPIA GÊNICA

Doença apropriada

Células alvo

Estratégia de transferência:

ex vivo ou in vivo

Vetor

www.edu365.com/aulanet/comsoc/Lab_bio/simulacions/GeneTherapy/GeneTherapy.htm (Animação)

CÉLULAS ALVOCaracterísticas: acessíveis, tempo de vida

longo no corpo, alta taxa de proliferaçãoTipos de células alvo:Células tronco (medula óssea- cordão umbilical)linfócitosfibroblastos de pelecélulas musculares (mioblastos)células vasculares endoteliaishepatócitos

A- Técnicas que utilizam métodos físicos ou químicos: baixa eficácia e transitório

microinjeção de DNA eletroporação (choque elétrico) biobalística (gene gun) precipitado de fosfato de cálcio lipossomos

Técnicas de introdução de genes em células de mamíferos:

Sistemas Não-Virais: Microinjeções de DNA

Microinjeção: núcleo da célula (terapia ex vivo ou in vivo- embrião)utilizada principalmente no desenvolvimento de vacinas de DNA.

http://www.bioloja.com/info/info.asp?id=96

Sistemas Não-Virais: Eletroporação

- Pulsos elétricos curtos de alta voltagem; - Permeabilização da membrana celular; - Entrada na célula de diferentes tipos de

moléculas, entre as quais os DNA. Eletroporação: choque elétrico→poros (morte celular)

Fonte: http://aragoneria.com/boreas/articulos/terapiagenica1.htm

Sistemas Não-Virais: Microesferas – Biobalística ou

Gene-Gun

Bombardeio partículas de ouro/ tungstênio conjugada ao DNA: bomba de hélio (morte celular)

Sistemas Não-Virais: Transfecção com Fosfato de Cálcio

- Método utilizado com sucesso para introduzir transgenes em células in vitro;

- Não apropriado para aplicação in vivo.

Precipitado c/DNA- endocitose (cultura celular – ex vivo)

Sistemas Não-Virais: Lipossomos

Desvantagens: - Não possuem

capacidade intrínseca de atravessar a membrana nuclear:1 em 1000 plasmídeos atinge o núcleo;

- Grande maioria são levados ao sistema lisossômico.

dupla camada lipídica englobando uma fração aquosa -complexo de DNA e lipídeos.

Fonte:http://www.ufv.br/dbg/trab2002/TERAPIAG/TRG002.htm

Técnicas de introdução de genes em células de mamíferos:

B- Técnicas que utilizam vetores biológicos: retrovírus (RNA)Adenovírus (DNA)Adenovírus associado-AAV (parvovírus)Lentivírus (retrovírus → cels. não dividem)Herpes vírus (invadir neurônios)Cromossomo artificial

RETROVÍRUSRetrovírus (vírus de RNA) são os vetores ideais para a transferência de genes em células humanas: são capazes de infectar quase 100% das células-alvo em divisão→ integra no genoma hospedeirocarregam fragmentos relativamente grandes de DNA (8kb)

Desvatagem: infectam somente células em divisão

Fonte:http://www.ufv.br/dbg/trab2002/TERAPIAG/TRG002.htm

Genes retrovírus:Gag: proteína cápsula internaEnv: transcriptase reversa e integrasePol: envelope glicoproteína

RETROVÍRUS

INSERÇÃO RETROVIRALA inserção casual do DNA no genoma das células hospedeiras pode :inativar um gene importante: morte celular ativar um oncogene: alterar o padrão normal de controle e divisão celular câncercausar mutação

AdenovírusVantagens:

- Infectam grande variedade de tecidos;

- Não possuem envelope, sua partícula é muito estável, sendo obtidos em grande quantidade;

- DNA dupla fita;- Não se integram no DNA

das células hospedeiras;- Aceitam inserções de

30Kb; - Penetram em células que

não se multiplicam;- Não ativam proto-

oncogene ;

Desvantagens - Não é integrado ao

genoma celular; - Resposta imune contra o

tecido transduzido com o vetor.

- Baixa taxa de entrega in vivo expressão transitória

Vetor mais utilizado em terapia gênica

contra o câncer

http://bio.leo.sites.uol.com.br/terapiagenica.htm

Pré-Requisitos : Terapia Gênica

escolher a doença apropriada a ser tratadaidentificar e clonar o gene e suas regiões reguladoras assegurar que o gene inserido não tenha efeitos prejudiciaisdeterminar as células-alvo certas que tenham duração de vida adequadaverificar se a técnica é segura e eficiente para a introdução do gene nas célulasrestringir a transferência do gene às células alvo somáticasdocumentar e divulgar os resultados obtidos

Classes de Doenças Passíveis de Terapia Gênica

Doenças Hereditárias (monogênicas - AR)NeoplasiasDoenças infecciosas (AIDS)Outras Doenças: doença arterial coronária; artrite; doença renal, etcMais de 1650 protocolos aprovados

Algumas tentativas de terapia gênica :Deficiência da enzima desaminase de adenosina (ADA)Imunodeficiência combinada severa ligada ao X (XSCID)Fibrose CísticaHemofília DMDHipercolesterolemia Familial: LDLR (receptor de lipoproteína de baixa densidade)Doença de Parkinson e artriteCâncerAIDS

Deficiência da Desaminase de Adenosina - (ADA)

Doença imunológica rara: debilitação do sistema imune (imunodeficiência) Enzima ADA: via purinas (tóxica)linfócitos T (células-alvo) são muito acessíveisgrande variação no nível de expressão do gene ADA entre indivíduos normaiso primeiro protocolo aprovado para terapia gênica foi para a correção da deficiência da ADA.1990: Drs. Anderson e Blease(Ashanti De Silva)

ADA

o linfócitos T foram coletados e expandidos em cultura ex vivo infectadas com retrovírus recombinanteos linfócitos foram injetados nos pacientesexpressão do gene ADA detectada por 12 anos nos linfócitos periféricostransferência do gene não foi eficiente: receberam PEG-ADA (enzima exógena)

DEFICIÊNCIA DA DESAMINASE DE ADENOSINA -

ADANOVA TÉCNICA: gene ADA transferido para células tronco: sangue do cordão umbilical10% dos linfócitos T circulantes carregavam o gene normaltratamento com enzima ADA exógena (PEG-ADA) foi removida progressivamenteCélulas T expressando ADA significantemente

IMUNODEFICIÊNCIA COMBINADA SEVERA LIGADA AO X - XSCIDDevido mutação do gene IL2RG: codifica a cadeia do receptor IL-2Pacientes faltam células T e células B prejudicadasFrança: 10 crianças selecionadas para terapia gênica: células da medula óssea retrovírus9/10 crianças apresentaram células T com o gene transduzidoDuas crianças desenvolveram leucêmia de células T ~ 3 anos após a terapia inserção do retrovírus próximo ao promotor do oncogene LMO2 (fator de crescimento)

FIBROSE CÍSTICA

gene mutante: CFTR - 7q31-32 (AR)proteína reguladora de condutância transmembrana: transporte de Cl- diminuído e do Na+ aumentado afeta as glândulas exócrinas: problemas respiratórios, digestivos e pancreáticos

http://www.blackbookdopina.net/2009/07/fibrose-cistica.html

Fibrose Císticavetor adenoviral: infecta os pulmões,

penetra em células que não estão em divisão sem integrar no seu DNA, permitindo que estas expressem o DNA viral, introduzido pelo nariz com um spray (terapia in vivo)

desvantagem: inflamação com ataque imune que neutraliza as células contendo gene adenoviral; efeito da terapia de vida curta, cerca de 6 semanas

TERAPIA GÊNICA DA HEMOFILIA

Mutação no gene do fator VIII de coagulação

afeta 1:5000 homens (recessiva ligada ao X)

Sintomas: sangramento espontâneo nas juntas, nos tecidos moles e órgãos vitais

Tratamento: injeções regulares de fator VIII

TERAPIA GÊNICA DA HEMOFILIA

6 pacientes submetidos à terapia gênica

Procedimento:extração de células da pele (fibroblastos)inserção do gene normal em plasmídeo (não provocam rejeição pelo organismo) inseridos nos fibroblastos por choque elétricoclonagem dos fibroblastospacientes receberam implantes dos fibroblastos no abdomem, após pequenas incisõesaumento de 1 a 4% do fator VIII (melhora qualidade de vida dos pacientes)benefícios foram temporários: apenas 10 meses

Terapia Gênica - Cegueira

Abril/2008: Universidade da Pennsylvania e Hospital da Philadelphia (USA) e Universidade de Londres: trataram pacientes adultos jovens com neuropatia óptica de Leber (LCA2) defeito no pigmento do epitélio da retina

Inserção do gene RPE65 (injeção com vetor viral direto na retina): codifica a enzima que auxilia na conversão da vitamina A para rodopsina A (pigmento das células fotorreceptoras que absorvem luz)

Terapia Gênica - Cegueira

Terapia Gênica - Cegueira

Após a terapia mostraram melhora na visão: maior sensibilidade a luz, detectaram movimentos manuais e leitura de linhas de um cartaz de exame oftalmológicoPerspectiva: terapia em crianças c/LCA2 e retinoblastoma

Exemplo de Terapia Somática

Lewis, R., 2004.

VÍTIMA DE TERAPIA GÊNICA

Universidade de Pensilvania:rapaz de 18 anos faleceu durante triagem de TERAPIA GÊNICA faleceu 4 dias após a terapia falência múltipla de órgãos

Doença: deficiência de ornitina transcarbamilase (OTC): doença ligada ao X distúrbio do ciclo da uréia (fígado) causa níveis impróprios de amônia no sangue

Vetor adenoviral (alta dose- 38 trilhões de adenovírus) injeção no fígado altos níveis de IL-6 consequências sistêmicas síndrome de resposta inflamatória sistêmica letal

VÍTIMA DE TERAPIA GÊNICA

Julho/2007: mulher de 36 anos com artrite reumatóide faleceu 22 dias após receber a segunda dose de um gene terapêutico para artrite. Após investigação pela FDA não foi possível atribuir a morte da paciente a terapia

TERAPIA GÊNICA DO CÂNCERIntrodução de genes supressores de tumor para

restaurar a função perdida.

Ex.: inserção do gene TP53 normal em tumores de pulmão bloquear a progressãotumoral e apoptose

Terapia Gênica do Câncer – Imunoterapia ou Vacinas de

câncer

Paciente

Células de melanoma do paciente cancerosas são removidas, recebem genes de interleucinas

Genes de interleucinas expressam

Resposta Imune

Tumores diminuíram

Imunoterapia: introdução de lipossomos com DNA para HLA-B27 em melanoma: expressão de HLA-B27 na superfície das células e destruição pelas células T citotóxicas regressão do melanoma em alguns casos

TERAPIA GÊNICA DO CÂNCER

Terapia pró-droga ou gene suicida: transferência de um gene (HSV-tk) → tirosina quinase → que ativam pró-drogas → tornam as células em divisão sensíveis a drogas selecionadasGlioma é um tipo de tumor cerebral que afeta as células da glia que suportam e interagem com os neurônios;Célula da glia pode se dividir e cancerosa se divide muito rápido;Um gene suicida na presença de um droga é ativado e mata as células que o contêm.

TERAPIA PRÓ-DROGA – GENE SUICIDA

http://www.scielo.br/pdf/ea/v24n70/a04v2470.pdf

Terapia Gênica no Brasil

- Em 2004 foi criada a Rede de Terapia Gênica

- 27 institutos ou Departamentos de 6 estados (Rio de Janeiro, São Paulo e Rio Grande do Sul), financiados pelo Institutos do Milênio do CNPq/MCT.

- Pesquisas: introdução de genes com efeito terapêutico

Qual o alvo do Brasil?- terapia gênica em câncer- doenças graves do metabolismo- doenças degenerativas e cardiovasculares- vacinas de DNA profiláticas para doenças infecciosas e vacinas de DNA terapêuticas para HPV

Terapia Gênica no BrasilRede é composta por:Rio de Janeiro: o Instituto de Biofísica da UFRJ, o Instituto Oswaldo Cruz e o Instituto Nacional do Câncer (INCA);

São Paulo: os Departamentos de Microbiologia e Biologia Celular e Desenvolvimento da USP, o CINTERGEN da UNIFESP, o InCor e o Instituto Butantã;

Rio Grande do Sul: os Departamentos de Genética e de Biofísica e o Hospital de Clínicas da UFRGS, bem como o Instituto de Cardiologia do Rio Grande do Sul.

Terapia Gênica no Brasil

1o. Estudo Clínico em pacientes cardíacos (isquemia) – fases 1 e 2 (segurança e eficácia)Coordenado pelo Dr. Renato Karan Kalil – Inst. Cardiologia do Rio Grande do Sul

Grupo de 10 pacientes tratados com injeção de DNA (plasmídeo c/gene VEGF-165) diretamente no coração estimula angiogênese

8 pacientes apresentaram bons resultados:-aumento na capacidade de bombear sangue-desempenho em testes de esforço físico

                        

NANOTECNOLOGIA

NANOTECNOLOGIA

-Tamanho: 10-100nm (um bilionésimo de metro)

- minúsculas partículas: variadas formas tubos, conchas, espirais

-Composição: moléculas funcionais como: drogas, peptídeos, proteínas, ácidos nucléicos

-materiais: polímeros, dendrímeros, lipossomos, nanotubos de carbono, e metais (ouro e óxido de ferro)

-Polímeros: avaliar a toxicidade (ativação do complemento, imunogenicidade, carcinogenicidade, teratogenicidade) devem ser não tóxicos e biodegradáveis evitar acúmulo no organismo (fígado, baço e medula óssea)

NANOTECNOLOGIA•minúsculas partículas: variadas formas tubos, conchas, espirais •nano: um bilionésimo de metro.

Nanoconchas: cheias de partículas de ouro destroem células tumorais quando aquecidas com a luz de um raio laser interagem com a luz de forma específica "configuradas" para destruir sob a ação de comprimentos de onda específicos

Nanotubo: combinado com anticorpos monoclonais, detecta células cancerosas alternativa rápida para diagnosticar células cancerosas.

http://www.inovacaotecnologica.com.br/noticias/noticia.php?artigo=010165051205

NANOTECNOLOGIANanoconchas - esferas microscópicas núcleo de sílica, recoberto com uma finíssima camada de ouro e, em segundo lugar, luz com comprimento de onda na faixa do infravermelho.

•injetaram nanoconchas na corrente sangüínea de camundongos com câncer de cólon as nanoconchas se acumulam preferencialmente nos tumores (vasos mal formados e permeáveis) irradiação dos tumores com fonte de laser 82% dos camundongos sobreviveram

NANOTECNOLOGIA”Imunonanoconchas”: nanoconcha direcionável possa encontrar um tipo específico de câncer, onde quer que ele possa estar escondido

•conectaram anticorpos anti-HER2 em nanoconchas aplicaram essas

imunonanoconchas sobre células de câncer de mama (em laboratório) utilizaram raios laser para aquecer o agente. -Coraram as células somente morreram as células de expressão do HER2 que tinham sido ligadas a nanoconchas•Células que não foram expostas ao câncer também sobreviveram, sugerindo que o tratamento anticorpo-nanoconcha efetivamente destrói as células cancerosas HER2+.

NANOTECNOLOGIA

”Nanocomplexo”: liposomo + anticorpo, junto com terapia genética irá tanto detectar quanto alvejar células metastatizadas de câncer, destruindo-as.

•liposomo encapsula o gene p53 ativa apoptose nas células com danos genéticos. •O complexo liposomo-anticorpo encontra a célula cancerosa ligando-se ao

receptor transferrina (presente em grande número na superfície das células cancerosas).

• Terapia : melhorou o tratamento do câncer por quimioterapia e radiação morte das células danificadas nanocomplexo atinge somente as células cancerosas

Adv Mater . Author manuscript; available in PMC 2012 September 22.

NONOEMULSÃO MULTIFUNCIOANAL - NONOTERANÓSTICO

Nanopartícula de óxido de ferro em emulsão água-óleo carregando um fluoróforo (imagem guiada) e droga terapêutica, após injeção intravenosa para alvejar câncer de cólon em ratos.

Nanopartículas alvo-dirigidas em estudos pré-clínicos e clínicos

SGT-53: lipossomo contendo plasmídeo com o gene TP53 tem como alvo receptor de transferrina alta expressão em células cancerosas.

•Apesar do uso de nanopartículas até mesmo para consumo há poucas informações sobre os possíveis efeitos tóxicos para a saúde humana e o meio ambiente

- Efeitos já observados:

- Catalisar danos oxidativos ao DNA

- Nanopartículas de ouro: têm a capacidade de mover-se através da placenta da mãe para o feto quando injetadas em ratas grávidas

- Nanopartículas de prata: Granulomas em ratos e camundongos após a exposição aguda

Nanotubos de carbono:

-causam acelerado estresse oxidativo na pele

Pouca atenção tem sido dada aos efeitos ambientais

Nanopartículas e toxicidade