TESE DE DOUTORADO - Livros Grátislivros01.livrosgratis.com.br/cp073280.pdfPagnoncelli. – Natal,...

Universidade Federal do Rio Grande do NorteCentro de Tecnologia

Departamento de Engenharia QuímicaPrograma de Pós-Graduação em Engenharia Química

TESE DE DOUTORADO

ESTUDO DO MECANISMO DE PRODUÇÃO DE

OLIGOSSACARÍDEOS COM ATIVIDADES

NUTRACÊUTICAS A PARTIR DA QUITOSANA POR

HIDRÓLISE ENZIMÁTICA COM PROCESSO

FERMENTATIVO SIMULTÂNEO

Maria Giovana Binder Pagnoncelli

Orientadora: Profª Dra. Gorete Ribeiro de Macedo

Co-Orientadora: Profª Dra. Sueli Rodrigues

Natal/RN

Outubro/2008

Livros Grátis

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Maria Giovana Binder Pagnoncelli

ESTUDO DO MECANISMO DE PRODUÇÃO DE

OLIGOSSACARÍDEOS COM ATIVIDADES NUTRACÊUTICAS A

PARTIR DA QUITOSANA POR HIDRÓLISE ENZIMÁTICA COM

PROCESSO FERMENTATIVO SIMULTÂNEO

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química - PPGEQ, da Universidade Federal do Rio Grande do Norte – UFRN, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Engenharia Química.

Natal/RN

Outubro/2008

Divisão de Serviços Técnicos

Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Central Zila Mamede

Pagnoncelli, Maria Giovana Binder. Estudo do mecanismo de produção de oligossacarídeos com atividades nutracêuticas a partir da quitosana por hidrólise enzimática com processo fermentativo simultâneo / Maria Giovana Binder Pagnoncelli. – Natal, RN, 2008.

118 f.

Orientadora: Gorete Ribeiro de Macedo.Co-orientadora: Sueli Rodrigues.

Tese (Doutorado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Tecnologia. Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química

1. Quitosana – Tese. 2. Quito - oligossacarídeos – Tese. 3. Quitosanase – Tese. 4. Paenibacillus ehimensis – Tese. 5. Paenibacillus chitonolyticus – Tese. I. Macedo, Gorete Ribeiro de. II. Rodrigues, Sueli. III. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Título.

RN/UF/BCZM CDU547.458(043.2).

PAGNONCELLI, Maria Giovana Binder - Estudo do mecanismo de produção de oligossacarídeos com atividades nutracêuticas a partir da quitosana por hidrólise enzimática com processo fermentativo simultâneo. Tese de Doutorado. UFRN - Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química – Área de Concentração: Pesquisa e Desenvolvimento de Tecnologias Regionais – Sub-área: Engenharia de Processos – Alimentos e Biotecnologia.

Orientadora: Profª Dra. Gorete Ribeiro de MacedoCo-Orientadora: Profª Dra. Sueli Rodrigues

Resumo: A obtenção de oligossacarídeos, a partir da quitosana, tem despertado interesse da área farmacêutica nos últimos anos devido as suas inúmeras propriedades funcionais. Porém, o grande desafio encontrado é manter uma produção constante e eficiente. A alternativa proposta por este trabalho foi estudar a viabilidade de desenvolver uma tecnologia integrada e de baixo custo. A estratégia utilizada foi a obtenção dos oligômeros por meio de hidrólise enzimática utilizando enzimas quitosanolíticas obtidas diretamente do caldo fermentado, eliminando dessa forma as etapas envolvidas na purificação de enzimas. As duas cepas produtoras de quitosanases selecionadas para o trabalho, Paenibacillus chitinolyticus e Paenibacillus ehimensis, foram avaliadas quanto ao comportamento em meio de cultivo contendo açúcares simples e em relação as variações de pH do meio. O meio de cultivo para a indução e produção das quitosanases foi desenvolvido através da adição de quitosana solúvel como fonte de carbono. A quitosana solúvel foi obtida utilizando solução de ácido clorídrico 0,1 M e posterior neutralização com NaOH 10 M. Os complexos enzimáticos foram obtidos a partir de processos de indução em meio de cultivo contendo 0,2% de quitosana solúvel. A produção das enzimas foi observado logo após o término do consumo dos açúcares simples pelos microrganismos e a máxima atividade quitosanolítica obtida no caldo fermentado pelo Paenibacillus chitinolyticus foi de 249 U.L-1 e pelo Paenibacillus ehimensis foi de 495 U.L-1. Esses dois complexos enzimáticos apresentaram estabilidade quando armazenadas a -20°C por até 91 dias. As enzimas presentes no caldo fermentado pelo Paenibacillus chitinolyticus, quando expostas à temperatura de 55°C e pH 6,0, onde a atividade é máxima, apresentaram perda de 50% da atividade após 3 horas. Enquanto que, para o complexo produzido pelo Paenibacillus ehimensis, após 6 dias de exposição, 100% da atividade foi detectada. Os quito-oligossacarídeos obtidos a partir da hidrólise de uma solução de 1% de quitosana, utilizando o complexo enzimático produzido pelo Paenibacillus chitinolyticus, apresentaram-se em maior quantidade após 9 horas de hidrólise e utilizando o complexo produzido pelo Paenibacillus ehimensis, após 20 minutos pode-se observar os quito-oligossacarídeos com grau de polimerização entre 3 e 6 unidades. Avaliando esses resultados, foi verificado que é possível a produção de quito-oligossacarídeos utilizando um processo simultâneo.

Palavras-chaves: quitosana, quito-oligossacarídeos, quitosanase, Paenibacillus ehimensis,

Paenibacillus chitinolyticus.

iv

ABSTRACT

The obtaining of the oligosaccharides from chitosanase, has showed interest of the

pharmaceutical area in the last years due their countless functional properties. Although, the

great challenge founded out is how to keep a constant and efficient production. The

alternative proposed by this present work was to study the viability to develop an integrated

technology, with reduced costs. The strategy used was the obtaining of the oligomers through

enzymatic hydrolysis using chitosanolitic enzymes obtained straight from the fermented

broth, eliminating this way the phases involved in the enzymes purification. The two

chitosanases producing strains chosen for the work, Paenibacillus chitinolyticus and

Paenibacillus ehimensis, were evaluated according to the behavior in the culture medium with

simple sugar and in relation to the pH medium variations. The culture medium for the

chitosanases induction and production was developed through addition of soluble chitosan as

carbon source. The soluble chitosan was obtained using hydrochloric acid solution 0.1 M and

afterwards neutralization with NaOH 10 M. The enzymatic complexes were obtained from

induction process in culture medium with 0.2% of soluble chitosan. The enzymes production

was verified soon after the consumption of the simple sugars by the microorganisms and the

maximum chitosanolitic activity obtained in the fermented broth by Paenibacillus

chitinolyticus was 249 U.L-1 and by Paenibacillus ehimensis was 495 U.L-1. These two

enzymatic complexes showed stability when stored at 20°C for about 91 days. The enzymes

in the fermented broth by Paenibacillus chitinolyticus, when exposed at temperature of 55°C

and pH 6.0, where the activity is maximum, showed 50% lost of activity after 3 hours.

Meanwhile, for the complex produced by Paenibacillus ehimensis, after 6 days of exposure, it

was detected 100% of the activity. The chito-oligosaccharides obtained by the hydrolysis of a

1% chitosan solution, using the enzymatic complex produced by Paenibacillus chitinolyticus

showed larger quantity after 9 hours hydrolysis and using the complex produced by

Paenibacillus ehimensis after 20 minutes was observed the chito-oligosacharides with

polymerization degree between 3 and 6 units. Evaluating these results, it was verified that the

production of chitosan-oligosaccharides is possible, using a simultaneous process.

Key words: chitosan, chito-oligosaccharides, quitosanase, Paenibacillus ehimensis, Paeniba-

cillus chitinolyticus.

vi

Ao meu esposo Fernando que nunca me deixa

desistir de realizar os meus sonhos e à minha

filha Fernanda que participou junto de todas

as minhas conquistas, a vocês dedico essa

tese.

vii

AGRADECIMENTOS

À Professora Dra. Gorete Ribeiro de Macedo, orientadora e também uma grande

conselheira, que desde o início acreditou que seria possível trabalharmos juntas e me apoiou

em todos os momentos.

À Professora Dra. Sueli Rodrigues, que sempre enviava através de mails as valiosas

soluções para os diversos problemas que surgiram nesses anos de trabalho, mostrando que a

distância não é obstáculo para uma comunicação eficaz.

À Universidade Federal do Rio Grande do Norte e ao Programa de Pós-Graduação

em Engenharia Química. Aos professores e funcionários responsáveis pelo funcionamento

deste curso e, em especial, ao Prof. Dr. Everaldo Silvino dos Santos que sempre participa de

todos os projetos desenvolvidos no Laboratório de Engenharia Bioquímica através de sua

valiosas sugestões.

Ao Laboratório de Toxicologia da Faculdade de Farmácia pelo apoio técnico

fornecido, especialmente ao Alexandro Oliveira da Silva e Maria Aparecida Nascimento por

compartilharem comigo as suas experiências.

Ao CNPq pelo apoio financeiro fornecido nesse período.

Aos Professores Doutores Ana Lúcia Figueiredo Porto, Carlos Ricardo Soccol,

Everaldo Silvino dos Santos e Fernanda Nervo Raffin pelas contribuições e julgamento deste

trabalho.

Gostaria de agradecer com muito carinho o apoio que recebi de quatro pessoas

maravilhosas que o destino colocou em meu caminho, Aldo Batista Soares Júnior, Nayane

Macedo Portela da Silva, Nathália Kelly de Araújo e Priscila Pontes Cruz, e que dividiram

comigo os fracassos e sucessos nos experimentos.

Um agradecimento especial às minhas amigas, Cristiane Fernandes de Assis e

Michelle Rossana Ferreira Vaz, que em diversas vezes marcaram experimentos noturnos

juntos com os meus para que pudéssemos passar mais tempo juntas e tornar algo que seria

cansativo em uma grande alegria. À Valderez Pontes Rocha que sempre participou ativamente

de todos os momentos do LEB.

E a todos os colegas do LEB que, ao longo desse período, dividiram experiências e

conhecimentos, contribuindo de forma mútua para a execução dos trabalhos.

Todas as minhas realizações são frutos da formação pessoal que obtive da minha

família, por isso sempre serei grata à vocês.

viii

SUMÁRIO

1. Introdução Geral.............................................................................................2

2. Aspectos Teóricos.............................................................................................62.1. Quitina e quitosana..........................................................................................................6

2.1.1. Biodegradação da quitina e quitosana.....................................................................7

2.1.2. Aplicações da quitosana...........................................................................................8

2.2. Oligossacarídeos..............................................................................................................9

2.2.1. Aplicações dos quito-oligossacarídeos..................................................................10

2.3. Transformação da quitosana em oligossacarídeos.........................................................11

2.3.1. Hidrólise ácida da quitosana..................................................................................12

2.3.2. Hidrólise enzimática da quitosana.........................................................................12

2.3.2.1. Quitosanases..................................................................................................12

2.4. Processos fermentativos................................................................................................16

2.4.1. Cinética em processos fermentativos.....................................................................16

2.4.2. Biorreatores em processos fermentativos..............................................................20

2.4.2.1. Fermentação descontínua...............................................................................20

2.4.2.2. Fermentação descontínua alimentada............................................................20

2.4.2.3. Fermentação semicontínua.............................................................................21

2.4.2.4. Fermentação contínua....................................................................................21

2.5. Cinética enzimática.......................................................................................................21

2.5.1. Métodos utilizados para avaliar a hidrólise da quitosana......................................22

2.5.1.1. Quantificação de açúcares redutores..............................................................23

2.5.1.2. Cromatografia em camada delgada................................................................24

2.5.1.3. Cromatografia de exclusão molecular...........................................................24

2.5.1.4. Espectrometria de massa................................................................................25

2.5.1.5. Cromatografia líquida de alta eficiência........................................................25

2.6. Produção de quitosanases..............................................................................................26

2.6.1. Isolamento de microrganismos produtores de quitosanases..................................26

2.6.1.1. Isolamento do Paenibacillus ehimensis e Paenibacillus chitinolyticus.........27

2.6.2. Mecanismos de indução e repressão metabólica...................................................27

2.6.3. Efeito do pH e temperatura na atividade das quitosanases microbianas...............28

ix

2.7. Produção de quito-oligossacarídeos..............................................................................31

2.7.1. Hidrólise da quitosana com enzimas não-específicas............................................32

2.7.2. Hidrólise da quitosana com quitosanases..............................................................33

2.7.3. Reatores utilizados na hidrólise da quitosana........................................................35

3. Material e Métodos........................................................................................383.1. Microrganismos.............................................................................................................38

3.1.1. Manutenção das cepas...........................................................................................39

3.2. Meios de cultivo utilizados para o estudo dos microrganismos....................................39

3.3. Preparo dos inóculos.....................................................................................................40

3.4. Condições de cultivo no estudo do comportamento dos microrganismos....................41

3.4.1. Ensaios em incubador rotativo..............................................................................41

3.4.2. Ensaios em biorreator de bancada.........................................................................42

3.5. Métodos de análises.......................................................................................................42

3.5.1. Concentração celular.............................................................................................42

3.6. Preparo da quitosana solúvel.........................................................................................43

3.7. Meios de cultivo utilizados para a produção de quitosanases.......................................43

3.8. Condições de cultivo na produção de quitosanases.......................................................45

3.8.1. Determinação da atividade enzimática..................................................................45

3.9. Determinação das condições ótimas de atividade das enzimas.....................................46

3.9.1. Efeito da temperatura na atividade das quitosanases.............................................47

3.9.2. Efeito do pH na atividade das quitosanases...........................................................47

3.9.3. Efeito da concentração de substrato na atividade das quitosanases......................47

3.10. Produção dos quito-oligossacarídeos..........................................................................48

3.10.1. Identificação dos oligossacarídeos produzidos a partir da quitosana..................48

4. Resultados e Discussão..................................................................................504.1. Padronização do meio de cultivo...................................................................................51

4.2. Estratégias de preparo do pré-inóculo e inóculo dos Paenibacillus chitinolyticus e

Paenibacillus ehimensis.......................................................................................................53

4.3. Avaliação do consumo de glicose pelo Paenibacillus chitinolyticus e Paenibacillus

ehimensis..............................................................................................................................56

4.4. Influência do pH nos cultivos do Paenibacillus chitinolyticus e Paenibacillus

ehimensis..............................................................................................................................59

4.5. Solubilização da quitosana............................................................................................70

x

4.6. Comportamento do Paenibacillus chitinolyticus e Paenibacillus ehimensis em meio

contendo quitosana solúvel..................................................................................................72

4.7.Produção de quitosanases por Paenibacillus chitinolyticus e Paenibacillus ehimensis 75

4.7.1 Efeito da fonte de nitrogênio na produção de quitosanases....................................78

4.8. Estudo das condições ótimas de atividade dos complexos enzimáticos.......................82

4.8.1. Planejamento experimental....................................................................................82

4.8.2. Efeito da temperatura na atividade das quitosanases.............................................87

4.8.3. Efeito do pH na atividade das quitosanases...........................................................89

4.8.4. Estabilidade térmica das quitosanases...................................................................91

4.8.5. Estabilidade das quitosanases durante estocagem.................................................93

4.9. Análise da hidrólise da quitosana solúvel......................................................................94

4.9.1. Influência da concentração de quitosana na hidrólise enzimática.........................94

4.9.2. Cinética de hidrólise enzimática de soluções de quitosana a 1%..........................97

4.10. Processo simultâneo..................................................................................................101

5. Conclusões....................................................................................................105

Referências Bibliográficas..............................................................................108

xi

LISTA DE FIGURAS

Figura 2.1. Estrutura da quitina e quitosana................................................................................. ...........7

Figura 2.2. Comparação entre a estrutura molecular de duas quitosanases. A molécula da direita

corresponde a uma quitosanase extraída de um Streptomyces sp e da esquerda do Bacillus

circulans.................................................................................................... ........................13

Figura 2.3. Comparação entre a configuração espacial de duas quitosanases visualizadas em dois

ângulos com rotação de 90°, em amarelo o sítio catalítico. Quitosanases produzidas por

Bacillus circulans (a, c) e Streptomyces sp (b, d).................................................. .............14

Figura 2.4. Mecanismo de hidrólise de uma molécula de quitosana 80% desacetilada, sob ação das

enzimas da subclasse I, II e III............................................................................... ............14

Figura 2.5. Curva de crescimento microbiano em cultivo descontínuo, representada em ordenadas

lineares (A) e semilogarítmica (B)......................................................................... ............19

Figura 4.1. Curva de crescimento celular do Paenibacillus chitinolyticus (a) e Paenibacillus ehimensis

(b) no cultivo do pré-inóculo no meio de cultivo B............................... ............................54

Figura 4.2. Curva de crescimento celular do Paenibacillus chitinolyticus (a) e Paenibacillus ehimensis

(b) no cultivo do inóculo no meio de cultivo B......................................................... .........55

Figura 4.3. Curvas do consumo de glicose (●) pelos microrganismos Paenibacillus chitinolyticus (a) e

Paenibacillus ehimensis (b) cultivados em incubador rotativo e variação do pH (□) do

meio B....................................................................................................... ........................58

Figura 4.4. Comportamento do crescimento celular do Paenibacillus chitinolyticus em função do pH

inicial do meio de cultivo B................................................................................ ...............60

Figura 4.5. Comportamento do crescimento celular do Paenibacillus ehimensis em função do pH

inicial do meio de cultivo B............................................................................... ................60

Figura 4.6. Glicose residual no meio de cultivo B cultivado com Paenibacillus chitinolyticus em

função do pH inicial do meio de cultivo B................................................................... ......61

Figura 4.7. Glicose residual no meio de cultivo B cultivado com Paenibacillus ehimensis em função

do pH inicial do meio de cultivo B........................................................... .........................62

Figura 4.8. Curvas do consumo de glicose (●), produção de biomassa (○) e variação do pH (□) do

meio B durante o cultivo do Paenibacillus ehimensis em incubador rotativo....................64

Figura 4.9. Curvas do consumo de glicose (●), produção de biomassa (○) e variação do pH (□) do

meio B durante o cultivo do Paenibacillus chitinolyticus em incubador rotativo..............65

Figura 4.10. Curvas do crescimento celular do Paenibacillus chitinolyticus (○) e do consumo da

glicose (●) do meio B em cultivo em biorreator com pH constante em 6,0.....................67

Figura 4.11. Curvas do crescimento celular do Paenibacillus ehimensis (○) e do consumo da glicose

(●) do meio B em cultivo em biorreator com pH constante em 7,0.................................. 68

xii

Figura 4.12. Perfil do consumo da glicose (●) e pH (□) durante o cultivo do Paenibacillus

chitinolyticus (a) e do Paenibacillus ehimensis (b) no meio de produção 2.....................74

Figura 4.13. Produção de quitosanase (♦), consumo de glicose (●) e variação do pH (□) em função do

tempo de cultivo do Paenibacillus chitinolyticus (a) e do Paenibacillus ehimensis (b) no

meio de produção 2.................................................................................................... ......77

Figura 4.14. Comparação entre a estabilidade das quitosanases obtidas pelo Paenibacillus

chitinolyticus (a) e Paenibacillus ehimensis (b) em função do tempo em meio de

produção 2 (◊) e meio de produção 3 (♦)................................................... ......................79

Figura 4.15. Produção de quitosanase (♦), consumo de glicose (●) e variação do pH (□) em função do

tempo de cultivo do Paenibacillus chitinolyticus (a) e do Paenibacillus ehimensis (b) no

meio de produção 3.................................................................................................... ......81

Figura 4.16. Gráfico de pareto expondo a influência da temperatura e pH nas atividades

quitosanolíticas dos complexos enzimáticos produzidas pelo Paenibacillus chitinolyticus

(a) e Paenibacillus ehimensis (b)..................................................................... ................84

Figura 4.17. Superfície de resposta da atividade quitosanolítica do complexo enzimático produzido

pelo Paenibacillus chitinolyticus (Equação 11) em função do pH e temperatura.............85

Figura 4.18. Superfície de resposta da atividade quitosanolítica do complexo enzimático produzido

pelo Paenibacillus ehimensis (Equação 12) em função do pH e temperatura..................86

Figura 4.19. Efeito da temperatura na atividade quitosanolítica dos complexos enzimáticos obtidos

pelo Paenibacillus chitinolyticus (a) e Paenibacillus ehimensis (b)............................... ..88

Figura 4.20. Efeito do pH na atividade quitosanolítica dos complexos enzimáticos obtidos pelo

Paenibacillus chitinolyticus (a) e Paenibacillus ehimensis (b)................. .......................89

Figura 4.21. Efeito da temperatura na estabilidade do complexo enzimático obtido pelo Paenibacillus

chitinolyticus e exposto a 55°C no pH 6.0 (♦), 7.5 (▲) e 9.0 (■).....................................91

Figura 4.22. Efeito da temperatura na estabilidade do complexo enzimático obtido pelo Paenibacillus

ehimensis e exposto a 55°C no pH 6.0 (♦), 7.5 (▲) e 9.0 (■).......................... .................92

Figura 4.23. Atividade quitosanolítica residual detectada durante o armazenamento a -20°C dos

complexos enzimáticos obtidos pelo Paenibacillus ehimensis (▲) e Paenibacillus

chitinolyticus (▼)................................................................................................... ..........93

Figura 4.24. Atividade enzimática dos complexos enzimáticos obtidos pelo Paenibacillus ehimensis

(a) Paenibacillus chitinolyticus (b) na hidrólise de soluções de quitosana nas

concentrações de 0,25% a 2% durante 10 (♦), 20 (▲), 30 (■) e 60 (Δ) minutos de reação.

................................................................................................................................. ........95

Figura 4.25. Atividade enzimática dos complexos enzimáticos obtidos pelo Paenibacillus ehimensis

(▲) e Paenibacillus chitinolyticus (▼) na hidrólise de solução de quitosana 1% durante

12 horas de reação................................................................................ ...........................97

xiii

Figura 4.26. Açúcares redutores gerados no período de 12 horas de hidrólise de uma solução de

quitosana 1% pelo Paenibacillus ehimensis (▲) e Paenibacillus chitinolyticus (▼)........98

Figura 4.27. CCD dos QOS produzidos durante a hidrólise de quitosana solúvel através dos complexos

enzimáticos obtidos do Paenibacillus ehimensis. Os hidrolisados obtidos após a reação

enzimática em 10, 20, 30 minutos, 1, 2, 3, 6 e 9 horas e na coluna P os padrões de QOS

(GlcN)2 - (GlcN)6............................................................................................... ..............99


enzimáticos obtidos do Paenibacillus chitinolyticus. Os hidrolisados obtidos após a

reação enzimática em 20, 30 minutos, 1, 2, 3, 6, 9 e 12 horas e na coluna P os padrões de

QOS (GlcN)2 - (GlcN)6............................................................................... ...................100


enzimáticos obtidos do Paenibacillus chitinolyticus (Pc) e Paenibacillus ehimensis (Pe).

Os hidrolisados obtidos após a reação enzimática em 30 minutos, 6 e 9 horas e na coluna

P os padrões de QOS (GlcN)2 - (GlcN)6................................................................. ........101

Figura 4.30. Fluxograma da tecnologia integrada para produção dos quito-oligossacarídeos por

hidrólise enzimática............................................................................................ ...........103

xiv

LISTA DE QUADROS

Quadro 2.1. Enzimas envolvidas na degradação da quitina e quitosana............................................. .....8

Quadro 2.2. Exemplos de hidrólises com quitosanases produzidas por diferentes microrganismos e

classificação das enzimas.......................................................................................... ........15

Quadro 2.3. Possíveis oligômeros obtidos após a ação das diferentes subclasses de quitosanases........15

xv

LISTA DE TABELAS

Tabela 3.1. Composição do meio de cultivo I, A e B........................................................................... ..40

Tabela 3.2. Ensaios realizados em meio B com pH inicial ajustado em diferentes valores...................42

Tabela 3.3. Composição dos meios de cultivo utilizados na produção de quitosanase..........................45

Tabela 3.4. Planejamento experimental com ponto central (22) utilizado para determinação das

condições ótimas de atividade enzimática.................................................................. ........46

Tabela 4.1. Fatores de conversão obtidos nos ensaios 1, 2 e 3 após as 24 horas de incubação do

Paenibacillus chitinolyticus nos meios de cultivo I (ensaio 1), A (ensaio 2) e B (ensaio3) 52

Tabela 4.2. Consumo de glicose pelos microrganismos Paenibacillus chitinolyticus e Paenibacillus

ehimensis cultivados no meio B em incubador rotativo............................ .........................57

Tabela 4.3. Variação do pH do meio B a partir de diferentes valores inicias de pH após 24 e 48 horas

de cultivo do Paenibacillus chitinolyticus e do Paenibacillus ehimensis em incubador

rotativo...................................................................................................................... .........62

Tabela 4.4. Comparação entre a produtividade em biomassa (ΔX), o consumo de substrato (ΔS) e o fator

de conversão de substrato em biomassa (YX/S), nos cultivos do Paenibacillus chitinolyticus

e do Paenibacillus ehimensis em incubador rotativo no meio de cultivo B.................. ......66

Tabela 4.5. Comparação entre a produtividade em biomassa (ΔX), o consumo de substrato (ΔS) e o fator

de conversão de substrato em biomassa (YX/S), durante as fases exponencial e estacionária

nos cultivos do Paenibacillus ehimensis em incubador rotativo no meio de cultivo B.......67

Tabela 4.6. Comparação entre a produtividade em biomassa (ΔX), o consumo de substrato (ΔS) e o

fator de conversão de substrato em biomassa (YX/S), nos cultivos do Paenibacillus

chitinolyticus e do Paenibacillus ehimensis em biorreator no meio de cultivo B...............69


fator de conversão de substrato em biomassa (YX/S), durante as fases exponencial e

estacionária nos cultivos do Paenibacillus chitinolyticus em biorreator no meio de cultivo

B.............................................................................................................. ..........................69


fator de conversão de substrato em biomassa (YX/S), durante as fases exponencial e

estacionária nos cultivos do Paenibacillus ehimensis em biorreator no meio de cultivo B.

............................................................................................................................ ...............70

Tabela 4.9. Consumo de glicose e pH final dos meios de produção 1 e 2 e controle pelo Paenibacillus

chitinolyticus e Paenibacillus ehimensis após 24 horas de cultivo.......................... ...........72

Tabela 4.10. Atividade enzimática das quitosanases expressas pelo Paenibacillus chitinolyticus e

glicose residual obtidas após 48 horas de cultivo nos meios de produção 2 e controle.. . .75

Tabela 4.11. Atividade enzimática das quitosanases expressas pelo Paenibacillus ehimensis e glicose

xvi

residual obtidas após 48 horas de cultivo nos meios de produção 2 e controle................76

Tabela 4.12. Atividade enzimática das quitosanases obtidas no meio de produção 2 e meio de produção

3, submetidas a 55°C, pH 6,0.............................................................................. .............80

Tabela 4.13. Atividades quitosanolíticas obtidas nos ensaios do planejamento experimental com ponto

central 22..................................................................................................... .....................83

Tabela 4.14. Tabela da Anova para o modelo ajustado (Equação 11)......................................... ...........85

Tabela 4.15. Tabela da Anova para o modelo ajustado (Equação 12)............................................. .......86

Tabela 4.16. Atividades quitosanolíticas dos complexos enzimáticos propostas pelos modelos...........87

Tabela 4.17. Açúcares redutores obtidos no final do processo do reator biológico e após ajuste do pH

em 6,0 (reator enzimático).................................................................... .........................103

xvii

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

GlcNAc - 2-aceto-amino-2-deoxi-D-glicoseGlcN - 2-amino-2-deoxi-D-glicoseKDa - Quilo daltons (1000 daltons)QOS - Quito-oligossacarídeosGP - Grau de polimerizaçãoX - Biomassa (g.L-1)P - Produto (g.L-1)S - Substrato (g.L-1)t - TemporX - Velocidade de crescimento dos microrganismos (g.L-1.h-1)rS - Velocidade de consumo de substrato (g.L-1.h-1)rP - Velocidade de formação do produto (g.L-1.h-1)µX - Velocidade específica de crescimento (h-1)µS - Velocidade específica de consumo de substrato (h-1)µP - Velocidade específica de formação de produto (h-1)YX/S - Fator de conversão de substrato em biomassaYP/X - Fator de conversão de biomassa em produtoYP/S - Fator de conversão de substrato em produtoX0 - Biomassa inicial (g.L-1)Xmáx - Biomassa no valor máximo (g.L-1)µmáx - Velocidade específica de crescimento máxima (h-1)Vmáx - Velocidade máximaKm - Constante de MichaelisES - Enzima-substratoE - EnzimaU.L-1 - Atividade enzimática (µmol glicosamina.min-1.L-1)DNS - Dinitro-salicílicoCCD - Cromatografia em camada delgadaMALDI - Matrix Assisted Laser DesorptionTOF - Time-Of-FlightMS - Mass SpectrometerCLAE - Cromatografia líquida de alta eficiênciarpm - Rotações por minuto

xviii

ΔX - Produtividade em biomassa (g.L-1.h-1)ΔS - Consumo de substrato (g.L-1.h-1)T - TemperaturaSQ - Soma quadráticaυ - Grau de liberdadeMQ - Média quadráticaR - Regressãor - ResíduoR2 - Coeficiente de correlação

xix

Capítulo 1

Introdução Geral

1. Introdução Geral


A quitosana é um biopolímero composto de unidades de glicosamina com com grau de

acetilação variado, obtida a partir da desacetilação da quitina. A quitina é o segundo

polissacarídeo mais abundante na natureza, com uma produção anual de 1010 a 1011 toneladas,

sendo obtida, principalmente, das cascas de camarão e carangueijo (Kumar, 2000; Kurita,

2001). Nas indústrias de processamento de crustáceos a geração de grandes quantidades de

resíduos é um dos principais problemas, sendo um desafio encontrar alternativas para o

reaproveitamento deste material. Entretanto, a utilização de resíduos para elaboração de

produtos de alto valor agregado tem sido amplamente difundida e estudada.

Devido a sua composição química, a quitosana apresenta determinadas propriedades

funcionais, podendo ser utilizada na área farmacêutica, médica, cosmética e alimentícia (Kim

& Rajapakse, 2005; Shahidi; Arachchi; Jeon, 1999). Porém, a baixa solubilidade deste

polissacarídeo em água torna restrita a sua utilização “in vivo”. Por outro lado, os

oligossacarídeos obtidos a partir da hidrólise da quitosana são solúveis devido ao menor

tamanho da cadeia polimérica (Li et al., 2005). Esses oligossacarídeos, compostos de 2 a 10

unidades de glicosamina, quando ingeridos são facilmente absorvidos no intestino e, atingindo

a corrente sangüínea, os efeitos sistemáticos são observados, tais como: ação antitumoral,

prebiótica e atividade antimicrobiana (Kim & Rajapakse, 2005). As propriedades biológicas

dos quito-oligossacarídeos dependem do grau de polimerização. As melhores características

funcionais são obtidas com oligômeros com grau de polimerização entre cinco e sete unidades

de monossacarídeos (Shahidi; Arachchi; Jeon, 1999).

A conversão da quitosana em oligossacarídeos pode ser realizada através da hidrólise

ácida ou enzimática. A hidrólise química é realizada a partir da exposição deste polímero a

altas temperaturas e em meio ácido, porém, devido à dificuldade do controle desse processo

grandes quantidades de glicosamina (monômero) são geradas e, conseqüentemente, baixo

rendimento em pentâmeros e hexâmeros são obtidos. Por outro lado, a utilização de enzimas

para hidrolisar a quitosana, ocorre em condições mais brandas e permite maior controle da

produção (Ming et al., 2006; Kuo; Chen; Chiang, 2004).

Por apresentarem maior especificidade, as quitosanases são as enzimas mais utilizadas

Maria Giovana Binder Pagnoncelli - outubro/2008 2


no processo enzimático e podem ser obtidas a partir de uma grande variedade de

microrganismos, incluindo diversas espécies de bactérias (Kurakake et al., 2000; Aktuganov;

Shirokov; Melent’ev, 2003; Jo et al., 2003; Choi et al., 2004; Kim et al., 2004; Su et al., 2006;

Sun et al., 2007; Zhu; Zhou; Feng, 2007; Gao et al., 2008; Wang & Yeh, 2008; Wang; Peng;

Liang; Liu, 2008; Wang et al., 2008), fungos (Cheng & Li, 2000; Chen; Xia; Yu, 2005; Ike et

al., 2007) e actinomicetos (Boucher et al., 1992).

As enzimas microbianas podem ser de expressão constitutiva ou indutiva. No caso de

enzimas indutivas, como é o caso da maioria das enzimas hidrolíticas, sua produção é

controlada através da indução e repressão metabólica (Goto et al., 1998; Gupta et al., 2003). A

maioria das quitosanases são induzidas (Somashekar & Joseph, 1996) e sintetizadas na

presença de seu substrato, ou compostos estruturalmente similares, no meio de produção

(Goto et al., 1998; Suto & Tomita, 2001). Os mecanismos de hidrólise da quitosana pela

enzima podem variar de acordo com tipo de quitosanase obtida, pois diferentes

microrganismos produzem enzimas com determinadas diferenças na estrutura tridimensional

da molécula enzimática. Essa forma de reconhecimento do substrato pela quitosanase permite

a quebra da quitosana em determinadas posições (Peter, 2005; Saito et al., 1999).

A hidrólise enzimática é considerada o método mais efetivo para a hidrólise da

quitosana. Porém, as etapas envolvidas durante o preparo e purificação das enzimas elevam os

custos do processo, tornando-o inviável para produção em escala industrial (Hai et al., 2003).

A síntese e aplicação de quitosanases de forma mais econômica tem sido alvo de diversas

pesquisas, pois a grande desvantagem em utilizar o sistema de reatores enzimáticos em

batelada para a produção desses oligossacarídeos é o alto custo, pois há a necessidade de se

utilizar elevadas concentrações de enzima de alto valor e que não podem ser reutilizadas.

Entretanto, o desenvolvimento de novas estratégias para a produção desses oligossacarídeos

com massa molar desejada e viável do ponto de vista econômico é o grande desafio (Kim &

Rajapakse, 2005).

A ampliação de um experimento envolvendo microrganismos da escala de bancada

para a escala industrial, requer estudos detalhados do comportamento destes durante o

processo do cultivo. Os parâmetros obtidos a partir desse estudo permitem definir meios de

cultivo adequados e estratégias de processo a serem empregadas para reduzir os custos de

produção (Hiss, 2001).



O presente trabalho teve como objetivo estudar a viabilidade da produção de

oligossacarídeos a partir da quitosana utilizando um método enzimático através de um

processo fermentativo simultâneo. Para isso, foram utilizados cultivos de microrganismos

produtores de enzimas quitosanolíticas, onde estudou-se o mecanismo de indução metabólica.

Esta estratégia visa a expressão de enzimas indutivas extracelulares e a hidrólise simultânea

da quitosana. Tal estratégia permite a eliminação das etapas de separação e purificação de

enzimas, diminuindo assim o custo do processo total, tornado-o economicamente viável.

Para atingir o objetivo proposto foram utilizadas duas cepas de bactérias isoladas de

solos ricos em quitina e classificadas como bactérias produtoras de quitosanases,

denominadas como Paenibacillus chitinolyticus NRRL B-23119 e Paenibacillus ehimensis

NRRL B-23118, obtidas do banco de microrganismos “Agricultural Research Service Culture

Collection”. Inicialmente o comportamento cinético dessas bactérias foi avaliado em meio de

cultivo contendo apenas açúcares simples e, na seqüência, os microrganismos foram

submetidos aos mecanismos de indução, com avaliação da produção da enzima através de

estudos cinéticos. Com o objetivo de realizar hidrólise simultânea para a obtenção dos quito-

oligossacarídeos as quitosanases foram utilizadas na sua forma bruta, ou seja, o caldo

fermentado.


Capítulo 2

Aspectos Teóricos

2. Aspectos Teóricos


Neste capítulo estão apresentados tópicos sobre quitina e quitosana, oligossacarídeos

obtidos a partir da quitosana, técnicas utilizadas para transformar a quitosana em

oligossacarídeos, processos fermentativos, cinética enzimática e as etapas envolvidas na

produção de quitosanases e de quito-oligossacarídeos a partir da quitosana. Os itens aqui

contemplados estão relacionados ao tema da tese e servirão de base para explicar os

fenômenos observados durante a produção de quito-oligossacarídeos a partir das enzimas

produzidas.

2.1. Quitina e quitosana

A quitina, maior componente estrutural dos exoesqueletos dos invertebrados e da

parede celular de fungos, é o segundo biopolímero mais abundante na natureza, perdendo em

quantidade apenas para a celulose. A quitina é extraída com abundância de fontes tais como,

camarão e caranguejo, atingindo uma produção de 1010 a 1011 por ano (Kumar, 2000; Kurita,

2001). Esse polímero é encontrado na forma de uma matriz biopolimérica impregnada de

componentes minerais associada a proteínas e pigmentos (Kurita, 2001).

Por ser a biodegradação da quitina um processo muito lento, o acúmulo dos produtos

de descarte do processamento de crustáceos tornou-se um problema para as indústrias que

processam produtos marinhos. Para a maioria dos países produtores o principal desafio é

encontrar uma forma de descartar esse resíduo sem danos ao meio ambiente. A melhor

alternativa proposta para a quitina gerada é agregar valor a ela ou aos seus derivados, como a

quitosana (Shahidi; Arachchi; Jeon, 1999). No Brasil, o Rio Grande do Norte é um dos

principais produtores de camarão, portanto, toneladas de quitina são geradas com o seu

processamento.

A quitina é composta de unidades de 2-aceto-amino-2-deoxi-D-glicose (GlcNAc). A

partir da desacetilação da mesma obtêm-se a quitosana. A quitosana é um amino

polissacarídeo composto principalmente de unidades de 2-amino-2-deoxi-D-glicose (GlcN)

ligadas linearmente por ligações glicosídicas β-1,4 com grau de acetilação variado,



geralmente acima de 80% são as unidades desacetiladas (Kurita, 2001; Peter, 2005). A Figura

2.1 apresenta as estruturas da quitina e da quitosana.

Figura 2.1. Estrutura da quitina e quitosana.

A quitina e a quitosana são polímeros que possuem massa molar próxima de 1000

KDa, que representa em torno de 5000 unidades de GlcNAc e GlcN ligadas, respectivamente

(Kumar & Tharanathan, 2004; Maeda & Kimura, 2004).

A quitosana é insolúvel em água, mas dissolve-se em soluções aquosas de ácidos

orgânicos, como acético, fórmico, cítrico, além de ácidos inorgânicos, como o ácido clorídrico

diluído. A solubilidade da quitosana está relacionada com a quantidade de grupos amino

protonados (-NH3+) na cadeia polimérica. Quanto maior a quantidade desses grupos, maior a

repulsão eletrostática entre as cadeias e também maior a solvatação em água. Portanto, o grau

de acetilação da quitosana tem efeito marcante na sua solubilidade (Santos et al., 2003;

Janegitz et al., 2007).

2.1.1. Biodegradação da quitina e quitosana

Embora a síntese de quitina seja superior a 2,3x109 toneladas / ano, esse não é o



biopolímero mais abundante na natureza. Esse metabolismo dinâmico é influenciado pela

ação dos microrganismos que utilizam quitina como fonte de energia (Peter, 2005).

Uma grande variedade de enzimas são envolvidas na degradação da quitina e da

quitosana, incluindo endo e exo-quitinase, quitosanases, quitodextrinases, quitotriosidases,

quitobiosidases, quitobiases, N-acetil-hexosaminidases, glucosaminidases e, finalmente,

enzimas utilizadas para metabolizar as unidades de GlcNAc e GlcN (Peter, 2005). O Quadro

2.1 apresenta as enzimas envolvidas na degradação da quitina.

Quadro 2.1. Enzimas envolvidas na degradação da quitina e quitosana.

Enzima Número EC* Família Substrato Ocorrência

Quitinase 3.2.1.14 18 Quitina Amplo

Quitinase 3.2.1.14 19 Quitina Vegetais, Streptomyces

Quitodextrinase 3.2.1.- 18 (GlcNAc)n Vibrio furnissii

Lisozima 3.2.1.17 22-25 Amplo

Di-N-acetilquitobiase 3.2.1.52 20 (GlcNAc)2 Amplo

Di-N-Acetilglicosaminidase 3.2.1.52 20 (GlcNAc)n Amplo

Quitina desacetilase 3.5.1.41 - Quitina Fungo

Quitosanase 3.2.1.132 46 Quitosana Bactéria, fungo

β-glicosaminidase - - 4´-terminal GlcN Fungo

GlcNAc-6-P-deacetilase 3.5.1.25 - Bactéria, vírus* EC: Enzyme Commisson

Fonte: Peter, 2005.

2.1.2. Aplicações da quitosana

Desde que a quitosana foi descoberta, em torno de 1850, inúmeras pesquisas foram

realizadas com o objetivo de desvendar suas propriedades físico-químicas, porém, poucos

avanços ocorreram até 1970. Nos últimos anos o interesse em torno deste biopolímero tem

aumentado com o intuito de identificar novas aplicações (Kim & Rajapakse, 2005).

As primeiras utilizações da quitosana foram em tratamento de água como coagulante,

aditivos em cosméticos, materiais médicos (pele artificial) e fibras alimentares. Devido as

propriedades físico-química e biológica a quitosana e seus derivados podem atuar como

agente antimicrobiano, conservante alimentício, material médico e biomédico, promotor do



crescimento das plantas, membranas de separação, adsorventes em cromatografia de afinidade

e adsorventes de metais (Kurita, 1998; Kumar, 2000; Tsigos et al., 2000).

Uma imensa variedade de aplicações da quitosana na medicina têm sido relatadas,

devido às suas propriedades funcionais, as quais são influenciadas pelo grau de desacetilação

e de polimerização da molécula de quitosana. Embora existam relatos das propriedades

funcionais da quitosana, a atividade biológica “in vivo” é comprometida devido à sua baixa

absorção pelos organismos. A maioria dos intestinos de animais, principalmente o trato

gastrointestinal humano, não produzem enzimas capazes de hidrolisar a quitina e quitosana.

Dessa forma, a alta massa molar e viscosidade da quitosana restringem o uso, particularmente

na medicina e na indústria de alimentos (Kumar & Tharanathan, 2004; Li et al., 2005).

Atualmente, evidências têm mostrado que quitosanas de baixa massa molar possuem

significantes atividades biológicas (Kumar & Tharanathan, 2004; Li et al, 2005). Para uma

utilização eficiente da quitosana “in vivo” faz-se necessário a despolimerização para a

obtenção de produtos com baixos pesos moleculares, esse procedimento origina oligômeros

de baixa massa molar, sendo então classificados como quito-oligossacarídeos (QOS)

(Stoyachenko & Varlamov, 1994).

2.2. Oligossacarídeos

Oligossacarídeos são polímeros contendo de 2 a 10 unidades de monossacarídeos

unidos por ligações hemiacetálicas, denominadas ligações glicosídicas. Na polimerização de

n moléculas de monossacarídeos ocorre a liberação de n-1 moléculas de água, obtidas a partir

da condensação do grupo hidroxila anomérico de um monossacarídeo com uma das hidroxilas

da unidade adjacente. É essa hidroxila anomérica que confere propriedades redutoras ao

monossacarídeo e reduz, principalmente, íons metálicos como cobre e prata e se oxida a ácido

carboxílico. Esses carboidratos são denominados redutores devido essa propriedade (Ribeiro

& Seravalli, 2007).

Os oligossacarídeos pertencem a um importante grupo de carboidratos poliméricos que

podem ser encontrados livres ou em forma combinada em todos os organismos vivos. Vários

tipos de oligossacarídeos podem ser encontrados naturalmente em diversos alimentos,

incluindo frutas, vegetais, leite e mel. Eles são componentes que, quando presentes nos



alimentos, melhoraram a qualidade do produto. Além de influenciar as qualidades físico-

químicas dos alimentos, os oligossacarídeos promovem diversos efeitos benéficos no

organismo e, por isso, eles são classificados como alimento nutracêutico (Nakakuki, 2002).

2.2.1. Aplicações dos quito-oligossacarídeos

Os oligossacarídeos derivados de glicosamina, obtidos a partir da hidrólise da

quitosana, têm despertado muito interesse na área farmacêutica, alimentícia e médica, devido

às suas propriedades biológicas. Diversas pesquisas relacionadas com a avaliação das

atividades fisiológicas e formas de obtenção desses oligômeros vêm sendo desenvolvidas nos

últimos anos (Shahidi; Arachchi; Jeon, 1999; Kim & Rajapakse, 2005).

Os quito-oligossacarídeos (QOS), por apresentarem tamanho molecular menor que a

quitosana, não apresentam dificuldades quanto à solubilização em água, tornando possível a

obtenção de soluções de baixa viscosidade e em pH neutro. Essa propriedade têm atraído o

interesse de muitos pesquisadores em utilizar os oligossacarídeos derivados da quitosana,

especialmente as pesquisas com QOS na área médica e nutricional, onde observa-se a

possibilidade destes em melhorar a qualidade dos alimentos e saúde humana (Nakakuki, 2002;

Kim & Rajapakse, 2005). Dentre essas propriedades destacam-se atividade antitumoral

(Suzuki et al., 1986; Maeda & Kimura, 2004; Prashanth & Tharanathan, 2005),

antimicrobiana (Jeon; Park; Kim, 2001; Zheng & Zhu, 2003) e prebiótica (Lee et al., 2002).

As propriedades biológicas dos QOS dependem do grau de polimerização. Os

oligômeros de quitosana apresentam maior atividade biológica quando comparados a

quitosana, e as melhores características funcionais são obtidas com oligômeros com grau de

polimerização entre pentâmero e heptâmero em comparação aos oligômeros com grau de

polimerização relativamente baixo (Shahidi; Arachchi; Jeon, 1999).

Na avaliação da atividade dos QOS, particularmente o hexâmero e o heptâmero, em

células tumorais foi observado atividade anti-tumoral (Prashanth & Tharanathan, 2005). Em

outro estudo foi observado que QOS com massa molar entre 21 e 46 KDa apresentaram

atividade anti-tumoral e quitosana solúvel, com massa molar de 130 KDa, não apresentou

nenhum efeito no desenvolvimento do tumor, em experimentos realizados com sarcoma 180

em ratos (Maeda & Kimura, 2004).



Em estudo realizado sobre o efeito antimicrobiano foi observada inibição do

crescimento de diversas bactérias devido a ação dos QOS de massa molar acima de 10 KDa,

produzidos através de um biorreator enzimático acoplado com membranas de ultrafiltração. O

efeito antimicrobiano foi mais eficaz sobre patógenos quando comparado com

microrganismos não patogênicos (Jeon; Park; Kim, 2001).

Foi avaliado o efeito inibitório no crescimento de E. coli e Staphylococcus aureus em

meio contendo QOS de diferentes tamanhos. Apenas os QOS com massa molar inferior a 300

KDa apresentam atividade antimicrobiana (Zheng & Zhu, 2003).

A partir de hidrólise enzimática e separação através de exclusão molecular, foi

possível obter QOS com grau de polimerização entre 2 e 8 unidades de glicosamina. Essa

mistura de oligossacarídeos não inibiu o crescimento de bifidobactérias e bactérias ácido

lácticas e sim favoreceu o estímulo, podendo ser potencialmente utilizados como prebiótico

em alimentos nutracêuticos (Lee et al., 2002). O prebiótico favorece o desenvolvimento das

bactérias probióticas, inibindo dessa forma as bactérias patogênicas (Chung & Day, 2002).

Devido a esse potencial, a conversão da quitosana em oligossacarídeos tem sido alvo

de diversos estudos sendo o principal desafio nesse processo a conversão da quitosana em

oligossacarídeos com grau de polimerização (GP) em torno de 4 a 8 unidades de

monossacarídeos (Nakakuki, 2002).

2.3. Transformação da quitosana em oligossacarídeos

A hidrólise da quitosana é um processo similar ao que ocorre com outros

polissacarídeos, onde a presença de determinados agentes rompem as ligações glicosídicas.

Essa degradação das ligações glicosídicas pode ser obtida utilizando diferentes metodologias,

nas quais os produtos gerados (QOS) variam o GP tanto quanto ao número, como a seqüência

das unidades de GlcN e GlcNAc no oligômero gerado. Dentre os métodos já descritos

encontram-se hidrólise ácida utilizando ácidos concentrados, hidrólise enzimática, degradação

oxidativa com peróxido de hidrogênio, degradação ultra-sônica, químico-enzimático (Kim &

Rajapakse, 2005) e radiação (Hai et al., 2003).



2.3.1. Hidrólise ácida da quitosana

Para a produção em grande escala de QOS a hidrólise ácida pode ser utilizada para

romper as ligações glicosídicas da quitosana, esta pode ser realizada através do uso de HCl

(Domard & Caartier, 1989) ou HNO2 (Tømmeraas et al., 2001).

Esses métodos são de fácil execução porém, esse mecanismo resulta em um baixo

rendimento de oligômeros e grande quantidades de monômeros (D-glicosamina), além de não

poderem ser utilizados como material bioativo devido a possível presença de contaminação

por compostos químicos tóxicos, principalmente, nas hidrólises com HNO2 podem ocorrer

modificações estruturais no produto final (Cabrera & Cutsem, 2005). Outro inconveniente

desse método é a necessidade de utilizar altas temperaturas e grandes concentrações de

reagentes, podendo causar problemas ambientais (Roncal et al., 2007).

2.3.2. Hidrólise enzimática da quitosana

Ao invés do agressivo método de hidrólise ácida, a quitosana pode ser hidrolisada em

condições brandas utilizando enzimas. As enzimas catalisam a sua hidrólise de forma mais

específica e permitem controle no decorrer do processo e, conseqüentemente, do GP dos

oligômeros gerados (Kim & Rajapakse, 2005; Ming et al., 2006; Roncal et al., 2007; Kuo;

Chen; Chiang, 2004). A quitosanase, por apresentar maior especificidade, é a principal enzima

utilizada para a hidrólise da quitosana.

2.3.2.1. Quitosanases

A enzima quitosanase é um membro da família 46 do grupo glicosil hidrolase, sendo

encontrada em uma grande variedade de microrganismos, incluindo bactérias, actinomicetos e

fungos e, em pequena quantidade, em plantas (Chen; Xia; Yu, 2005).

Os mecanismos de hidrólise da quitosana podem variar de acordo com o tipo de

quitosanase obtida, pois diferentes microrganismos produzem enzimas com determinadas

diferenças na conformação da molécula. As quitosanases podem ser divididas em duas

categorias, endoquitosanases e exoquitosanases. Endoquitosanases catalisam a hidrólise de



maneira aleatória no interior da molécula de quitosana, gerando oligossacarídeos de diversos

tamanhos. Exoquitosanases hidrolisam as terminações não redutoras, resultando em produtos

finais com unidades redutoras (Peter, 2005).

É importante entender que o reconhecimento específico do substrato e os mecanismos

catalíticos da quitosanase são devido à estrutura tridimensional das enzimas. A Figura 2.2

representa a estrutura de duas quitosanases obtidas a partir de diferentes microrganismos,

apenas algumas partes apresentam similaridade (Saito et al., 1999).

Figura 2.2. Comparação entre a estrutura molecular de duas quitosanases. A molécula da direita

corresponde a uma quitosanase extraída de um Streptomyces sp e da esquerda do Bacillus circulans.

(Fonte: Saito et al., 1999)

A diferença na especificidade é explicada pelas diferenças no arranjo espacial na

ligação com o substrato, pois moléculas com diferenças na conformação podem apresentar

sítios catalíticos em locais diferentes. Na Figura 2.3 a parte em amarelo representa o sítio

catalítico das enzimas em locais diferentes para a enzima A e B (Saito et al., 1999).



Figura 2.3. Comparação entre a configuração espacial de duas quitosanases visualizadas em dois

ângulos com rotação de 90°, em amarelo o sítio catalítico. Quitosanases produzidas por Bacillus

circulans (a, c) e Streptomyces sp (b, d). (Fonte: Saito et al., 1999)

O reconhecimento do substrato pelas quitosanases permite a quebra em determinadas

posições. De acordo com essa especificidade, as quitosanases são classificadas em 3

subclasses. Na classe I as enzimas quebram as ligações GlcN-GlcN ou GlcNAc-GlcN.

Quitosanases classe II quebram somente as ligações GlcN-GlcN, reconhecendo

especificamente a seqüência –(GlcN)3. As enzimas da classe III quebram as ligações das

unidades GlcN-GlcN e GlcN-GlcNAc (Peter, 2005; Saito et al., 1999). Na Figura 2.4 é

possível visualizar como acontece a hidrólise de uma molécula de quitosana.

Figura 2.4. Mecanismo de hidrólise de uma molécula de quitosana 80% desacetilada, sob ação das

enzimas da subclasse I, II e III.



O Quadro 2.2 mostra alguns exemplos de quitosanases produzidas por diferentes

microrganismos e, de acordo com o local de hidrólise, os produtos gerados.

Quadro 2.2. Exemplos de hidrólises com quitosanases produzidas por diferentes microrganismos e

classificação das enzimas.

Microrganismo GP Terminação não redutora Terminação redutora Classe

Penicillium islandicum 2-3 GlcN GlcN/GlcNAc -

Bacillus pumilus BN-262 2-4 GlcN GlcN/GlcNAc I

Streptomyces N174 2-4 GlcN GlcN/GlcNAc I

Bacillus sp. 7-M 2-6 GlcN GlcN II

S. griseus HUT 6037 2-6 GlcN/ GlcNAc GlcN III

B. circulans MH-K1 2-5 GlcN/ GlcNAc GlcN III

B. circulans WL-12 2-5 GlcN/ GlcNAc GlcN IIIFonte: Peter, 2005.

Após conhecer os mecanismos de hidrólise da quitosana utilizando essas subclasses de

quitosanases, é possível estabelecer os possíveis produtos obtidos após o processo de

hidrólise. Levando em consideração a classe da enzima utilizada e a distribuição das unidades

de GlcNAc na quitosana, o Quadro 2.3 apresenta os prováveis oligômeros.

Quadro 2.3. Possíveis oligômeros obtidos após a ação das diferentes subclasses de quitosanases.

Subclasse I

(Streptomyces sp. Nº 174)

Subclasse II

(Bacillus sp. Nº 7-M)

Subclasse II

(B. circulans MH-K1)

Produtos da degradação

Pontos de quebra GlcN-GlcN GlcN-GlcN GlcN-GlcN

GlcNAc-GlcN GlcN-GlcNAcGlcN (●), GlcNAc (○), unidades redutoras (○- e ●-)

Fonte: Saito et al., 1999.



A presença de grupamentos acetil na molécula de quitosana é importante para

aumentar o grau de hidrólise da molécula e permitir a formação dos QOS com GP acima de 3.

A caracterização das quitosanases extraídas de diversos microrganismos, assim como os

produtos obtidos após a hidrólise da quitosana, são critérios utilizados para avaliar o potencial

dessas enzimas (Saito et al., 1999).

Nos tópicos seguintes serão apresentados alguns fatores envolvidos nos processos

fermentativos e enzimáticos e, na seqüência, discute-se os processos atualmente utilizados

para a produção de quitosanases e de QOS utilizando o processo enzimático.

2.4. Processos fermentativos

Para a execução de um processo fermentativo é necessário o preparo de um meio de

cultura que seja adequado à nutrição e desenvolvimento do microrganismo, bem como o

acúmulo do produto desejado. O meio de cultivo deve ser adicionado em um biorreator

(fermentador), no qual é adicionado o microrganismo responsável pelo processo biológico

(inóculo) e aguarda-se que o processo ocorra (Schmidell & Facciotti, 2001).

2.4.1. Cinética em processos fermentativos

O estudo cinético de um processo fermentativo consiste inicialmente na análise da

evolução dos valores de concentração de um ou mais componentes do sistema de cultivo, em

função do tempo de fermentação. Entende-se por componentes o microrganismo ou biomassa

(X), os produtos do metabolismo ou metabólitos (P) e os nutrientes ou substratos (S) que

compõem o meio de cultura, tais valores experimentais de concentração quando representados

em função do tempo, permitirão os traçados das curvas de ajuste e são indicados por X=X(t),

P=P(t) e S=S(t) (Hiss, 2001).

Esses valores representam parte de um conjunto de dados, necessários ao

dimensionamento de uma instalação produtiva. Evidentemente que, sem o conhecimento da

cinética, torna-se inviável a transposição de um experimento de laboratório para a escala

industrial. A cinética possibilita também uma comparação quantitativa entre as diferentes

condições de cultivo, por intermédio de variáveis como: as velocidades de transformação e os



fatores de conversão. Quando o tempo de duração da fermentação for de primordial

importância por razões econômicas, as produtividades devem ser empregadas como

referências numéricas, em vez de algum fator de conversão (Hiss, 2001).

Nas Equações (1) (2) (3) são definidas as velocidades de crescimento do

microrganismo (rX), de consumo de substrato (rS) e de formação de produto (rP),

respectivamente.

r X=dXdt

(1)

dtdSrS −=

(2)

dtdPrP =

(3)

A velocidade de crescimento celular, quando avaliada no momento de crescimento

máximo, passa a ser denominada de produtividade em biomassa. No caso de se considerar o

produto em crescimento máximo denomina-se produtividade do produto (Hiss, 2001).

Em cultivo descontínuo à medida que a concentração celular aumenta, a

transformação do substrato em produto também sofre aumento. Analisando as velocidades

instantâneas de cada parâmetro com relação à concentração microbiana em determinado

momento, obtém-se as velocidades específicas de crescimento (µX), de consumo de substrato

(µS) e de formação de produto (µP), conformem descrito nas Equações (4) (5) (6),

respectivamente.

µX=1X

. dXdt

(4)

µS=1X

.−dSdt (5)



µP=1X

. dPdt

(6)

Considerando um determinado tempo t de fermentação, os correspondentes valores de

X, S e P podem ser relacionados entre si, através dos fatores de conversão, definidos nas

Equações (7) (8) (9), os fatores de conversão de substrato em biomassa (YX/S), biomassa em

produto (YP/X) e substrato em produto (YP/S), respectivamente.

SSXX

Y SX −−

=0

0/

(7)

0

0/ XX

PPY XP −

−=

(8)

SSPP

Y SP −−

=0

0/

(9)

O microrganismo, ou agente ativo, promove a transformação dos componentes do

meio em produtos graças às atividades de diversas enzimas que, por sua vez, são sintetizadas

pelo próprio microrganismo, sendo essas sínteses controladas pelo meio externo (fenômenos

de indução e repressão) (Hiss, 2001).

Durante o crescimento celular são observadas diferentes fases no crescimento, o qual é

dividido em 7 fases, conforme se observa na Figura 2.5.



Figura 2.5. Curva de crescimento microbiano em cultivo descontínuo, representada em ordenadas

lineares (A) e semilogarítmica (B).

• (1) Fase “lag” ou de latência: é um período de adaptação durante o qual a célula

sintetiza as enzimas necessárias ao metabolismo dos componentes presentes no meio.

Não ocorre reprodução celular e, assim, X = X0 = constante. A duração dessa fase

varia principalmente com a concentração do inóculo, com a idade do microrganismo

(tempo pré-cultivo) e com seu estado fisiológico. Se as células forem pré-cultivadas

em meio de composição idêntica é possível que tal fase não exista.

• (2) Fase de transição: é o início da reprodução propriamente dito. Ocorre um aumento

gradual da velocidade de reprodução (Equação 1) e da velocidade específica de

crescimento (Equação 4).

• (3) Fase logarítmica ou exponencial: nessa fase a velocidade específica de crescimento

é constante e máxima (µX = µmáx). A velocidade de crescimento é diretamente

proporcional a concentração celular.

• (4) Fase linear de crescimento: é a fase que apresenta velocidade de reprodução

constante.

• (5) Fase de desaceleração: devido ao esgotamento de um ou mais componentes do

meio de cultura, necessários ao crescimento e, também, devido ao acúmulo de



metabólitos inibidores, as velocidades de crescimento e específica diminuem até se

anularem.

• (6) Fase estacionária: nessa fase a concentração celular atinge o valor máximo e

constante Xmáx, há um balanço entre a velocidade de crescimento e a velocidade de

morte do microrganismo.

• (7) Fase declínio ou lise: o valor da concentração celular diminui a uma velocidade

que excede a velocidade de produção de células novas. Durante o declínio ocorre uma

“lise” celular, autólise ou rompimento dos microrganismos, provocado pela ação de

enzimas intracelulares (Hiss, 2001).

2.4.2. Biorreatores em processos fermentativos

A baixa produtividade de um processo descontínuo motivou a partir da década de 50

um maior desenvolvimento na área de reatores. Grandes avanços nessa área favoreceram o

sucesso de muitos processos fermentativos. A condução de processos fermentativos em

biorreatores pode ser realizada de várias formas: processos descontínuos, semicontínuos,

descontínuos alimentados (fed-batch) e contínuos (Schmidell & Facciotti, 2001).

2.4.2.1. Fermentação descontínua

São também conhecidas por fermentações em batelada ou processo descontínuo de

fermentação. Esse processo pode levar a baixos rendimentos e / ou produtividade, quando o

substrato, adicionado de uma só vez no início da fermentação, exerce efeitos de inibição,

repressão, ou desvia o metabolismo celular a produtos que não interessam. Além disso, o

fermentador permanece em tempos ociosos (Carvalho & Sato, 2001a).

2.4.2.2. Fermentação descontínua alimentada

Principalmente no caso de reatores biológicos, a forma de operação descontínua

alimentada é bastante empregada, a qual foi desenvolvida praticamente para os processos

fermentativos. Essa forma de condução do processo fermentativo permite exercer um controle



da concentração de nutrientes no reator e da velocidade específica de crescimento em um

valor desejado (Carvalho & Sato, 2001b; Pamboukian, 2003).

2.4.2.3. Fermentação semicontínua

O processo semicontínuo, diferencia-se do descontínuo alimentado, pelo fato de se

retirar o líquido fermentado e se proceder o preenchimento do reator empregando-se uma

vazão muito elevada, de forma a se imaginar que o reator esteja sendo preenchido

instantaneamente. Ao final do novo período de fermentação, procede-se novamente à retirada

de uma dada fração do volume e se preenche o reator instantaneamente. Trata-se de uma

técnica distinta, na qual ocorrem choques de carga de substrato, o que pode ser interessante

em algumas situações, como na produção de enzimas sujeitas ao controle por indução

(Schmidell & Facciotti, 2001).

2.4.2.4. Fermentação contínua

O processo contínuo é realizado por meio de uma alimentação contínua de meio de

cultura ao reator a uma determinada vazão constante e por uma retirada contínua de caldo

fermentado de forma a se ter o volume de reação constante, a fim de que o sistema atinja a

condição de estado estacionário. O estado estacionário é a situação na qual todas as condições

no interior do reator permanecem constantes ao longo do tempo (Pamboukian, 2003).

2.5. Cinética enzimática

Quando se trabalha com a produção de enzimas é importante estudar o mecanismo

cinético das enzimas. A atividade de uma enzima depende da concentração da enzima,

concentração do substrato, concentração e tipo de ativadores e inibidores, pH, temperatura,

força iônica e atividade de água (Macedo et al., 2005).

À medida que a concentração do substrato aumenta, a atividade catalítica de uma

concentração fixa de uma enzima aumenta de forma hiperbólica, aproximando-se de uma

velocidade máxima (Vmáx), na qual praticamente toda enzima está na forma do complexo



enzima-substrato (ES). A concentração de substrato em que ocorre metade da velocidade

máxima, constante de Michaelis (Km), é característica para cada enzima agindo sobre um

determinado substrato (Nelson & Cox, 2002).

A determinação de uma atividade enzimática pode ser monitorada através da avaliação

do substrato consumido ou do produto formado, conforme a seguinte Equação 10 (Peter,

2005).

E + S ↔ ES ↔ E + P (10)

No caso da determinação da atividade enzimática da quitosanase, a insolubilidade da

quitosana em água dificulta a avaliação do processo de hidrólise. Outros problemas na

determinação desse processo é a grande diversidade ou variedade de substratos existentes e a

origem da quitosanase, tornando difícil a comparação da atividade de diferentes preparações.

Os valores de Km e Vmáx para quitosanases diferem de acordo com o substrato utilizado e de

acordo com a origem da quitosanase (Peter, 2005; Somashekar & Joseph, 1996).

O pH e a temperatura a que a enzima é exposta interferem na sua atividade enzimática,

o efeito do pH atua nos grupos ionizáveis envolvidos no sítio ativo da enzima, enquanto que o

aumento da temperatura resulta em aumento da velocidade de reação até uma determinada

temperatura, denominada temperatura ótima de atividade, em que ocorre atividade máxima.

Aumento posterior resulta em diminuição da atividade devido à desnaturação da enzima

(Macedo et al., 2005).

Quando se deseja maior formação de produto deve-se utilizar a temperatura ótima de

atividade da enzima, porém deve-se considerar a estabilidade térmica da mesma (Macedo et

al., 2005).

2.5.1. Métodos utilizados para avaliar a hidrólise da quitosana

A determinação da atividade enzimática pode ser monitorada através da avaliação do

substrato consumido ou do produto formado. No caso da hidrólise da quitosana o substrato

gradativamente é transformado em produto, portanto, as medidas do consumo de substrato e

formação de produto são determinadas de forma indireta e muitas vezes de forma empírica.



Para determinar a hidrólise da quitosana determinadas análises de execução simples

fornecem informações importantes sobre a evolução da reação e podem ser utilizadas como

controle rápido do processo. A viscosidade de soluções de quitosana é diretamente

proporcional ao tamanho da cadeia do polímero e a redução de viscosidade indica que o

polímero está sendo hidrolisado. Da mesma forma essa hidrólise pode ser acompanhada a

partir da quantificação de açúcares redutores liberados após a quebra das ligações glicosídicas

(Somashekar & Joseph, 1996).

Os métodos mais específicos para avaliar a formação dos QOS estão baseados em

processos de separação, como técnicas cromatográficas ou espectrometria de massa

(Somashekar & Joseph, 1996).

2.5.1.1. Quantificação de açúcares redutores

A molécula de quitosana é um polissacarídeo composto principalmente de unidades de

GlcN ligadas por ligações glicosídicas β-1,4 (Kurita, 2001). A hidrólise ocorre na ligação dos

monômeros e libera unidades redutoras, as quais podem ser facilmente determinadas através

de inúmeros métodos colorimétricos (Horn & Eijsink, 2004).

Os métodos químicos clássicos conhecidos para a análise de açúcares redutores são, na

sua maioria, fundamentados na redução de íons cobre em soluções alcalinas; mas também

existem aqueles fundamentados na desidratação dos açúcares, por uso de ácidos concentrados,

que além da simples redução de compostos orgânicos formam outros compostos de coloração

mensurável na região do visível. Os métodos podem ser agrupados tanto em titulométricos

(EDTA e Lane-Enyon, Luff-Schoorl), gravimétricos (Musson-Walker) e espectrofotométricos

(ácido 3,4-dinitrosalicílico (DNS), Antrona, Fenol-Sulfúrico e Somogyi-Nelson) (Silva et al.,

2003).

Os métodos de Somogyi-Nelson (Somogyi, 1945; Nelson, 1944) e DNS (Miller, 1959)

não detectam concentrações de glicose abaixo de 100 e 1000 µM, respectivamente. Além

disso, a dosagem dos açúcares redutores é em função do tamanho dos oligossacarídeos em

ambos os métodos, não sendo possível a determinação quantitativa em uma mistura contendo

diferentes oligossacarídeos (Horn & Eijsink, 2004).



2.5.1.2. Cromatografia em camada delgada

A cromatografia em camada delgada (CCD) consiste na separação dos componentes

de uma mistura através da migração diferencial sobre uma camada delgada de adsorvente

retido sobre uma superfície plana. É uma técnica muito utilizada e é praticamente

indispensável em qualquer laboratório que envolva análise de substâncias orgânicas e

organometálicas. O grande desenvolvimento desta técnica é conseqüência natural das

múltiplas vantagens que ela oferece, tais como: fácil compreensão e execução, separações em

curto espaço de tempo, versatilidade, grande reprodutibilidade e baixo custo. Pode ser de

aplicação analítica ou preparativa, cuja escala está na dependência da espessura da camada

adsorvente e da amostra em análise (Lopes, 1997).

O processo de separação está fundamentado, principalmente, no fenômeno da

adsorção. Entretanto, usando fases estacionárias tratadas pode ocorrer também por partição ou

troca iônica, o que permite seu emprego tanto na separação de substâncias hidrofóbicas como

hidrófilas. Uma série de adsorventes se encontram disponíveis no mercado, sendo os mais

utilizados em CCD a sílica, alumina, celulose e poliamida (Lopes, 1997).

A CCD é utilizada quando há a necessidade de identificar os açúcares presentes em

uma amostra, essa técnica permite boas separações entre as diferentes classes de açúcares, tais

como monossacarídeos contra dissacarídeos e pentoses contra hexoses. Enquanto que, para

separar formas isoméricas de aldoexoses a cromatografia mais indicada é a cromatografia

líquida de alta eficiência, devido o alto poder de resolução e sensibilidade (Coultate, 2004).

2.5.1.3. Cromatografia de exclusão molecular

A cromatografia de exclusão molecular é uma técnica que teve início na década de 60,

e caracteriza-se por ter propriedades bem distintas das demais cromatografias em coluna

aberta. Os componentes da amostra não têm afinidade nem com a fase móvel nem com a fase

estacionária. Eles são separados por seleção de tamanho das moléculas do soluto, que

passarão através da fase estacionária, fazendo o papel de uma peneira molecular. A fase móvel

tem o papel de apenas dissolver os componentes da amostra para carregá-los através da

coluna (Rothschild, 1997).



As vantagens dessa técnica em relação às outras cromatografias são: simplicidade,

insensibilidade a solventes e temperatura, condições amenas e versatilidade (Mantovani et al.,

1998; Vaccari et al., 2001).

2.5.1.4. Espectrometria de massa

MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization ou Ionização/Dessorção de

Matriz Assistida por Laser), se trata de um método que torna possível a ionização de

macromoléculas biológicas, tais como as proteínas, que são difíceis de serem ionizadas por

não serem facilmente decompostas (o material alvo se dispersa durante a ionização). Uma

amostra MALDI está em um estado onde é misturado uniformemente com uma matriz de

massa. A matriz absorve o laser de nitrogênio (luz ultra-violeta, comprimento de onda =

337nm) convertendo-o em energia térmica. Ao mesmo tempo, uma pequena matriz é aquecida

rapidamente (frações de nanosegundos) sendo vaporizada com a amostra (Liu et al., 2005).

Combinado com o método acima, o sistema TOF/MS (Time-Of-Flight/Mass

Spectrometer ou Tempo-de-Vôo/Espectrômetro de Massa) forma um detector de

espectrômetro de massa, o qual utiliza a diferença de tempo-de-vôo graças às diferenças de

tamanho das substâncias ionizadas (proteínas, etc). Diferentes tamanhos de íons positivos e

negativos são extraídos da amostra devido à existência de diferença de potencial entre o

suporte da amostra e o eletrodo. A velocidade de cada íon após a sua extração é determinada

pela Lei da Conservação de Energia. Aqui, a diferença de potencial é constante para todos os

íons, sendo que, quanto mais leve o íon, mais rápido este "voa" através do espaço entre a

amostra e o detector. Desta forma, a variação das massas dos íons, indicada através da

diferença de tempo de vôo dos mesmos, é utilizada na espectrometria de massa, sendo

conhecida como TOF/MS (Liu et al., 2005).

2.5.1.5. Cromatografia líquida de alta eficiência

A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) é uma otimização da coluna

clássica, em que o solvente passa pela coluna a alta pressão, tornando a separação entre os

compostos da amostra muito mais rápida e eficiente. Nessa técnica existe um líquido como



fase móvel e fases estacionárias que podem ser líquidas ou sólidas, sendo estas mais

comumente utilizadas (Guimarães, 1997).

2.6. Produção de quitosanases

Quitosanases podem ser encontradas em uma grande variedade de microrganismos,

incluindo várias espécies de bactérias (Kurakake et al., 2000; Aktuganov; Shirokov;

Melent’ev, 2003; Jo et al., 2003; Choi et al., 2004; Kim et al., 2004; Su et al., 2006; Sun et al.,

2007; Zhu; Zhou; Feng, 2007; Gao et al., 2008; Wang & Yeh, 2008; Wang; Chen; Wang,

2008; Wang et al., 2008), fungos (Cheng & Li, 2000; Chen; Xia; Yu, 2005; Ike et al., 2007) e

actinomicetos (Boucher et al., 1992).

As enzimas microbianas podem ser de expressão constitutiva ou indutiva. Na maioria

das enzimas hidrolíticas sua produção é controlada através da indução e repressão metabólica

(Goto et al., 1998; Gupta et al., 2003), entre elas as quitosanases (Somashekar & Joseph,

1996).

2.6.1. Isolamento de microrganismos produtores de quitosanases

A maioria dos microrganismos produtores de quitosanase são obtidos de solos de

diferentes regiões e, principalmente, ricos em quitina. O principal critério utilizado para

selecionar esses microrganismos é avaliar a sua capacidade em utilizar apenas a quitosana

como fonte de carbono.

Para que o microrganismo se desenvolva em um meio de cultivo é necessário a

presença de fontes de nitrogênio, carbono e sais minerais, sendo os compostos mais simples

os primeiros nutrientes a serem consumidos, enquanto que os mais complexos, para serem

absorvidos pelas células, precisam ser previamente degradados por enzimas extracelulares. A

quitosana para ser utilizada como fonte de carbono pelos microrganismos precisa ser

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