Tese Doutorado Jacqueline Ferreira
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Transcript of Tese Doutorado Jacqueline Ferreira
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ
CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
Sensor de pH baseado em filmes de polímero conjugado e Sensor
biológico baseado em filmes de ouro nanoestruturado
Tese apresentada por Jacqueline Ferreira ao Programa de Pós-Graduação em Química do Departamento de Química do Centro de Ciências Exatas da Universidade Estadual de Maringá como parte dos requisitos para a obtenção do título de Doutor em Ciências.
MARINGÁ, JUNHO/2009
Universidade Estadual de Maringá
Centro de Ciências Exatas
Departamento de Química
Maringá - 2009
Sensor de pH baseado em filmes de
polímero conjugado e Sensor
biológico baseado em filmes de
ouro nanoestruturado
Tese de Doutorado
Jacqueline Ferreira
Orientador: Emerson Marcelo Girotto
Grupo de Materiais Poliméricos e Compósitos
Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP) (Biblioteca Central - UEM, Maringá – PR., Brasil)
Ferreira, Jacqueline F383s Sensor de pH baseado em filmes de polímero
conjugado e sensor biológico baseado em filmes de ouro nanoestruturado / Jacqueline Ferreira. -- Maringá : [s.n.], 2009.
xxiii, 169 f. : figs. color Bibliografia : f. 152-169. Orientador : Prof. Dr. Emerson Marcelo Girotto. Tese (doutorado) - Universidade Estadual de
Maringá, Programa de Pós-Graduação em Química, 2009. 1. Sensor óptico - Detecção de pH. 2. Sensor de
pH. 3. Polímeros condutores - Caracterização por Raman e espectroeletroquímica in situ. 4. Polipirrol. 5. Biosensor - Detecção de marcadores tumorais. 6. Plasmon de superfície (SPR) - Nanoestrutura. I. Girotto, Emerson Marcelo, orient. II. Universidade Estadual de Maringá. Programa de Pós-Graduação em Química. III. Título.
CDD 21.ed. 681.25
Aos meus pais, Cícero e Nair,
irmãs Janicler e Karina e ao Marcos
pelo incentivo, carinho, compreensão e
amor incondicional.
i
“You can be the most brilliant scientist in all the
world; put you on a desert island with the very best
scientific equipment and the very best library and
you'll do uninteresting research. You must have
interaction. You must have discussion.”
A. J. MacDiarmid
Agradecimentos
ii
À Deus pela vida, carinho e proteção
Ao Prof. Emerson, pela orientação.
Aos Professores do GMPC: Adley Forti Rubira, Eduardo Radovanovic, Gizilene M.
de Carvalho e Edvani C. Muniz e também ao Prof. Gentil J. Vidotti pela amizade e
ensinamentos.
Ao Prof. Alexandre G. Brolo, pela acolhida em Victoria, BC, Canadá, durante o
estágio em seu laboratório.
À equipe de trabalho do Prof. Brolo: David Sinton, Reuven Gordon e Duan Xiabo e
aos alunos do grupo: Fatemeh, Carlos, Christy, John, Paul, Asif, Andrew e Michael
pela colaboração e amizade.
Aos amigos do laboratório: Marcos Kunita, Thelma, Guilherme, Rafael, Marcos R.
Maurício, Chico, Tiago, Gedalias, Aline, Rafão, Shirani, Adriano e, também aos
amigos que passaram pelo laboratório: Aline, Ana Paula, Juliana, Rafaelle, Janaína,
Luiz Henrique, Andrélson, Roberto, Rafael, Raíssa, pelo agradável convívio e
amizade.
Ao Marcos Kunita, novamente por manter o laboratório sempre funcionando, pela
sua amizade e pela constante disposição em ajudar.
Ao Roberto e Andrélson por me guiarem durantes os primeiros passos no
laboratório.
Aos amigos do Canadá, os quais têm feito muita falta: Meikun, Yuchun, Celly,
Gustavo, Simon, Jason, Laura, Milton e Mohammad pela amizade, companheirismo
e por terem feito do meu estágio uma fase especial da minha vida.
À todos os professores que participaram da minha formação.
À Rafaelle, pelas medidas de EDS.
Ao Prof. Eduardo, pelas medidas de AFM.
À Prof. Liliana, pelas medidas de espessura.
Ao Prof. Fernando Josepetti Fonseca, pelos microeletrodos de ouro digitalizado.
Ao Prof. Reuven pelos cálculos teóricos por FDTD.
Ao Mohammad e Fatemeh, pelas amostras fabricadas utilizando o FIB.
Ao Carlos, Paul e Michael pela contribuição na área de microfluídos.
Às pessoas que mesmo distantes sempre estiveram muito perto: meus pais, irmãs,
sobrinhos, Ewandro, Adhiely, Paulinha, Cris e Duda.
Ao Seu Zé, D. Maria e Eliane, pela paciência e compreensão.
Aos órgãos de financiamento: CAPES, CNPq, GSEP e NSERC.
Ao Claudemir e à Cristina da secretaria de Pós-Graduação.
Ao meu Marcos, principalmente pela paciência durante os momentos de estresse.
E a todos aqueles que contribuíram de alguma forma para este trabalho.
Resumo
iii
Título: Sensor de pH baseado em filmes de polímero conjugado e Sensor biológico
baseado em filmes de ouro nanoestruturado
Autora: Jacqueline Ferreira
Orientador: Emerson M. Girotto
Palavras-chave: Sensor óptico, polipirrol, pH, biosensor, EOT, SPR
Este trabalho está dividido em duas partes: i) o estudo de filmes de polipirrol
dopado com azul de bromofenol (Ppi-AB) para aplicação em sensor de pH e ii) o
estudo de filmes de ouro nanoestruturado para aplicação em biosensor baseado em
emissão extraordinária de luz (EOT) induzido por ressonância de plasmón de
superfície (SPR). Na primeira parte, filmes de Ppi-AB foram sintetizados
eletroquimicamente e então foram opticamente, eletroquimicamente e
estruturalmente caracterizados por espectroeletroquímica UV-Vis e Raman in situ,
IV, EDS-MEV e AFM. A interação entre dopante e polímero mostrou-se dependente
tanto do pH quanto do nível de oxidação do polímero. Durante a oxidação da cadeia
do Ppi, o equilíbrio de dissociação do AB se desloca para neutralizar as cargas
positivas geradas na matriz polimérica. Como as propriedades ópticas e ôhmicas do
filme de Ppi são afetadas pela presença do indicador AB, fez-se em seguida o
estudo destas propriedades frente a variações de pH. O Ppi-AB apresentou pKa em
7,4; o que o viabiliza para análise de amostras fisiológicas. Além disso, o Ppi-AB
apresentou características importantes de um sensor eficiente como estabilidade,
reversibilidade, reprodutibilidade e curto tempo de resposta. Durante a segunda
parte deste trabalho, desenvolvemos um novo esquema para a detecção de
moléculas biológicas utilizando um substrato contendo nanoburacos perfurados
através de um filme de Au, o qual exibe EOT devido à SPR. Esta amostra foi
utilizada para a detecção de marcadores de câncer de ovário através do método de
aquisição de imagens, permitindo a detecção de diferentes concentrações do
marcador biológico em medidas de tempo real. Este dispositivo pode ser futuramente
utilizado para avaliar a eficiência de tratamentos de câncer, já que pode detectar a
variação da concentração dos marcadores tumorais durante o tratamento. Para
melhorar as propriedades analíticas do sensor, recobriu-se o filme de ouro com SiOx,
sendo ambos perfurados posteriormente para a fabricação de nanoburacos. Desta
forma, há ouro exposto somente na parte interna do nanoburaco, consequentemente
os plasmóns de superfície se confinam no interior do buraco, onde é feita a detecção
das moléculas. Este dispositivo foi aplicado com sucesso na detecção de
quantidades attomolares de proteínas, apresentando sensibilidade de 650 nm/UIR.
Abstract
iv
Title: pH Sensors based on conjugated polymer films and Biosensor based on
nanostructured gold films
Author: Jacqueline Ferreira
Supervisor: Emerson M. Girotto
Keywords: Optic sensor, polypyrrole, pH, biosensor, EOT, SPR
The present work is divided in two parts: i) the investigation of Ppi-AB films for
application as pH sensor and ii) the investigation of nanostructured gold films for
application as biosensor based on extraordinary optical transmission (EOT) through
surface plasmon resonance (SPR). In the first part, bromophenol blue doped
polypyrrole (Ppi-AB) films were electrochemically synthesized and then optically,
electrochemically and structurally characterized by in situ UV-Vis and Raman
spectroelectrochemistry, IR, EDS-MEV, and AFM. The interaction between dopant
and polymer was found both pH and oxidation level dependent. During the oxidation
of the ppy chains, the dissociation equilibrium of AB is shifted in order to neutralize
the positive charges created in the polymer matrix. As both optical and ohmic
properties of the ppy film are affected by the presence of AB, an investigation of
these properties at different pH was also perfomed. Ppi-AB presented pKa 7.4,
making possible for this system to be applied in the analysis of physiological
samples. In addition, Ppi-AB presents important characteristics of an efficient sensor
such as stability, reversibility, reproducibility and short response time. During the
second part of this work, a new approach for the detection of biomolecules based on
nanoholes milled through gold films was developed, which presents EOT due to SPR.
This sample was used to detect biomarkers of ovarian cancer by acquiring images,
allowing the detection of different concentrations of the biomarker during real-time
measurements. According to the results, this device can be applied to track the
efficiency of a cancer treatment. Aiming to improve the analytical properties of the
sensor, nanoholes were milled all the way through gold films covered with a SiOx
layer. Therefore, the only gold surface exposed is inside the nanoholes. As result the
surface plasmon is also confined in the nanoholes where the biomolecules detection
occurs. This approach was successfully applied to detect attomolar amounts of
protein, presenting sensitivity of 650 nm/RIU.
Informações Curriculares
v
Formação acadêmica
Bacharelado e Licenciatura plena em Química (2000 – 2003).
Universidade Estadual de Maringá, PR.
Iniciação científica com bolsa CNPQ (2000 – 2003).
Início do mestrado em março de 2004 com passagem direta para o doutorado em
agosto de 2005 (bolsa CAPES).
Estágio sanduíche (setembro 2007 – outubro 2008) realizado na University of
Victoria (Canada).
Produção Científica
Artigos:
1) J. Ferreira, A. G. Brolo, E. M. Girotto, In situ investigation of a chemical process
inside polypyrrole matrix by Raman spectroelectrochemistry, ACS Applied
Materials & Interfaces, 2009, submetido.
2) J. Ferreira, E. M. Girotto, pH ohmic sensor based on bromophenol blue-doped
polypyrrole, Journal of the Brazilian Chemical Society, 2009, aceito.
3) F. Eftekhari, C. Escobedo, J. Ferreira, X. Duan, E. M. Girotto, A. G. Brolo, R.
Gordon, D. Sinton, Nanoholes as nanochannels: flow-through plasmonic
sensing, Analytical Chemistry, 2009, 81, 4308.
4) J. Ferreira, M. J. L. Santos, M. M. Rahman, A. G. Brolo, R. Gordon, D. Sinton,
E. M. Girotto, Attomolar Protein Detection Using in-Hole Surface Plasmon
Resonance, Journal of the American Chemical Society, 2009, 131, 436.
5) M. J. L. Santos, J. Ferreira, E. Radovanovic, R. Romano, O. L. Alves, E. M.
Girotto, Enhancement of the Photoelectrochemical Response of
Poly(terthiophenes) by CdS(ZnS) Core-Shell Nanoparticles, Thin Solid Films,
2009, 517, 5523.
6) J. Ferreira, E. M. Girotto, Optical pH sensitive material based on bromophenol
blue-doped polypyrrole, Sensors and Actuators, B Chem, 2009, 137, 426.
Informações Curriculares
vi
7) A. G. Brolo, J. Ferreira, M. J. L. Santos, C. Escobedo, D. Sinton, E. M. Girotto,
F. Eftekhari, R. Gordon, Development of plasmonic substrates for biosensing,
Proceedings of SPIE, 2008, 7035, 703503.
8) J. Ferreira, M. J. L. Santos, R. Matos, O. Ferreira, A. F. Rubira, E. M. Girotto,
Structural and electrochromic study of polypyrrole synthesized with azo and
anthraquinone dyes, Journal of Electroanalytical Chemistry, 2006, 591, 27.
Participações em Congressos:
1) J. Ferreira, E. M. Girotto, O. N. de Oliveira Jr., “Biosensor Based on Surface
Plasmon for Earlier Diagnostic of Cancer”, INEO – 1st Workshop of the National
Institute for Organic Electronics, Atibaia, SP, Brasil, 2009.
2) C. Escobedo, J. Ferreira, F. Eftekhari, R. Gordon, A. G. Brolo, D. Sinton,
“Plasmonic Nanohole array sensors integrated in ELISA-type anf flow-through
array platforms”, MicroTAS – The 13th International Conference on Miniaturized
Systems for Chemistry and Life Sciences, Jeju, South Korea, 2009.
3) J. Ferreira, M. J. L. Santos, M. M. Rahman, A. G. Brolo, R. Gordon, D. Sinton,
E. M. Girotto, “Attomolar Protein Detection Using in-Hole surface Plasmon
Resonance”, BiopSys Network for Bioplasmonic Systems – 1st All Network
Meeting of BiopSys, Toronto, ON, Canada, 2008.
4) J. Ferreira, M. J. L. Santos, M. M. Rahman, A. G. Brolo, R. Gordon, D. Sinton,
E. M. Girotto, “Attomolar Protein Detection Using in-Hole surface Plasmon
Resonance”, PCCAM – Pacific Centre for Advanced Materials and
Microstructures, Victoria, BC, Canada, 2008.
5) C. Escobedo, J. Ferreira, F. Eftekhari, R. Gordon, A. G. Brolo, D. Sinton, “Solid
and Fluid Mechanics of Flow-through nanohole array based sensing”,
PCCAM - Pacific Centre for Advanced Materials and Microstructures, Victoria,
BC, Canada, 2008.
6) F. Eftekhari, C. Escobedo, J. Ferreira, P. Wood, R. Gordon, A. G. Brolo, D.
Sinton, “Biaxial Nanohole Array Sensing and Optofluidic Integration”,
IEEE/LEOS Summer Topicals – Optofluidics, Acapulco, Guerrero, Mexico,
2008.
Informações Curriculares
vii
7) F. Eftekhari, C. Escobedo, J. Ferreira, P. Wood, R. Gordon, A. G. Brolo, D.
Sinton, “Nanohole Arrays as Optical and Fluidic Elements for Sensing”,
ASME-IMECE – International Mechanical Engineering Congress & Exposition,
Boston, MA, United States of America, 2008.
8) J. Ferreira, A. G. Brolo, E. M. Girotto, “Ppy/BPB Characterization by in situ
Raman spectroelectrochemistry”, CSC – 91st Canadian Chemistry Conference
and Exibition, Edmonton, AB, Canada, 2008.
9) J. Ferreira, M. J. L. Santos, E. M. Girotto, “Estudo de interferentes na resposta
óptica frente ao pH do polipirrol dopado com corantes”, SIBEE – XVI Simpósio
Brasileiro de Eletroquímica e Eletroanalítica, Águas de Lindóia, SP, Brasil,
2007.
10) M. J. L. Santos, J. Ferreira, A. G. Brolo, E. M. Girotto, “Evolution of the Ppy
vibrational bands resulting from polaron and bipolaron states determined by in
situ Raman spectroelectrochemistry”, SIBEE – XVI Simpósio Brasileiro de
Eletroquímica e Eletroanalítica, Águas de Lindóia, SP, Brasil, 2007.
11) R. F. M. S. Marcondes, P. S. D. Agostini, E. M. Girotto, A. F. Rubira, J. Ferreira,
A. Pawlicka, D. C. Dragunski, “Characterization of Amylopectin-Rich Starch
Plasticized with Glycerol”, 10th International Symposium on Polymer
Electrolytes, Foz do Iguaçú, Pr, Brasil, 2006.
12) R. F. M. S. Marcondes, P. S. D. Agostini, E. M. Girotto, J. Ferreira, A. Pawlicka,
D. C. Dragunski, “Chemically Modified Cassava Starch Plasticized with Ethylene
Glycol and Sorbitol”, 10th International Symposium on Polymer Electrolytes, Foz
do Iguaçú, Pr, Brasil, 2006.
13) J. Ferreira, E. M. Girotto, “Polipirrol Dopado com Indicadores Ácido-Base para
Aplicação de Sensores de pH”, SIBEE – XV Simpósio Brasileiro de
Eletroquímica e Eletroanalítica, Londrina, Pr, Brasil, 2005.
14) J. Ferreira, A. W. Rinaldi, E. M. Girotto, “Sensores Condutimétricos de pH
Baseados em Polipirrol Dopado com Indicadores Ácido-Base”, SBQ-Sul – XIII
Encontro de Química da Região Sul, Florianópolis, SC, Brasil, 2005.
Lista de Abreviações e Símbolos
viii
comprimento de onda
mobilidade relativa
c comprimento de onda de
corte
max comprimento de onda
para o máximo de
transmissão
3-APTES aminopropiltrietoxisilano
A absorbância
A0 absorbância do filme
imerso em solução
tampão sem interferente
Aác absorbância da forma
ácida
AB azul de bromofenol
Abás absorbância da forma
básica
AC anticorpo
AFM microscopia de força
atômica
AG antígeno
Ai absorbância da mistura
contendo as formas
ácidas e básicas
An anilina
atto prefixo do sistema
internacional de unidades
que denota um fator de
10-18
Ax absorbância do filme
imerso em solução
tampão contendo
interferente
b caminho óptico
BC banda de condução
BNHS biotina éster N-hidróxi
succinimidil
BSA albumina de soro bovino
BV banda de valência
C concentração (mol.L-1)
c velocidade da luz no
vácuo
C.I. coeficiente de
interferência
ca. do latim “circa” =
aproximadamente
CCD dispositivo de carga
acoplado
CG-MS cromatografia gasosa
acoplada a
espectrometria de massa
cols. colaboradores
DMSO dimetil sulfóxido
DNA ácido desoxirribunucleico
DSU ditiobis(succinimidil
undecanoato)
E potencial aplicado
e unidade de carga
eletrônica (1,6 x 10-19 C)
e.g. do latim “exempia gratia”
= por exemplo
E.T. eletrodo de trabalho
E0redox potencial redox padrão
Índice de Abreviações e Símbolos
ix
ECS eletrodo de calomelano
saturado
EDS energia dispersiva de
raios-X
Eelet energia dos níveis
eletrônicos
Egap valor de energia do gap
ELISA Análise-Enzima-Imuni-
Adsorvida
EMF evaporated metal films
EOT extraordinary optical
transmission
EPR ressonância
paramagnética eletrônica
Erot energia dos níveis
rotacionais
Evib energia dos níveis
vibracionais
FDTD Diferenças Finitas no
Domínio de Tempo
FIB feixe de íons focado
FTIR Infravermelho por
transformada de Fourier
FTO-vidro vidro recoberto com
óxido de flúor dopado
com índio
ATR reflexão total atenuada
He-Ne hélio-neônio
HInd forma protonada de um
indicador ácido-base
HOMO highest occupied
molecular orbital
i corrente elétrica
IAB Intensidade da banda
Raman para a forma AB
IAB- Intensidade da banda
Raman para a forma AB-
IAB2-
Intensidade da banda
Raman para a forma AB2-
Id intensidade do campo
eletromagnético
Ind- forma desprotonada de
um indicador ácido-base
IT intensidade transmitida
IR infrared
k comprimento do vetor de
onda da luz incidente
com comprimento de
onda fixo
kpara vetor de onda do fóton
paralelo ao plano de
incidência no prisma
ksp vetor de onda do fóton
que excita os elétrons
livres na superfície
LUMO lowest unoccupied
molecular orbital
MEV microscopia eletrônica de
varredura
MPTMS 3-mercaptopropil-
trimetoxisilano
n concentração de
portadores livres no
material
Índice de Abreviações e Símbolos
x
na índice de refração para
uma camada com
espessura entre 0 e d
NA abertura numérica
(numerical aperture)
nb índice de refração para
uma camada com
espessura entre d e
infinito correspondente
ao branco da medida
neff índice de refração efetivo
NHS éster
N-hidroxisuccinimida
oPD o-fenilenodiamina
ƟSPR ângulo de SPR
P periodicidade = distância
entre o centro dos
buracos
PA poliacetileno
PANI polianilina
PAX8 pared box gene 8
(anticorpo para câncer de
ovário)
STF solução tampão fosfato
PDMS poli (dimetilsiloxano)
PEG poli (etileno glicol)
PET poli (tereftalato de
etileno)
Pi pirrol
PICe polímeros
intrinsecamente
condutores eletrônicos
PiQH 3-(2,5-dihidroxibenzil)
Ppi polipirrol
Ppi-AB polipirrol dopado com
azul de bromofenol
Ppi-Cl polipirrol dopado com
cloreto
Ppi-ClO4 polipirrol dopado com
perclorato
Ppi-PVS polipirrol dopado com
ácido polivinilssulfônico
r raio do buraco
R0 resistência do filme antes
da imersão em solução
tampão
Ri resistência do filme
imerso em solução
tampão contendo
interferente
RIU refractive index unit
Rms rugosidade média
quadrada
r-PAX8 recombinant pared box
gene 8 (antígeno para
câncer de ovário)
Rx resistência do filme após
imersão em solução
tampão
S sensibilidade
S% sensibilidade ôhmica
(percentual) ao pH
SAM camada auto montada
SP plasmóns de superfície
SPR ressonância de plasmón
de superfície
Índice de Abreviações e Símbolos
xi
T temperatura
UIR unidade de índice de
refração
uni. arb. Unidade arbitrária
UV-Vis ultravioleta-visível
VC voltametria cíclica
z distância acima da
superfície do ouro
ε absortividade
εa constante dielétrica do
meio
εm constante dielétrica do
metal
ηB eficiência de transmissão
σ condutividade elétrica do
bulk
ω frequência da luz incidente
Índice de Figuras
xii
Figura 1: Aplicações tecnológicas dos polímeros condutores.1 ................................... 3
Figura 2: Estrutura da forma neutra de alguns polímeros conjugados com suas
respectivas condutividades para altos níveis de dopagem. Destaca-se o
polipirrol por ser o polímero utilizado neste trabalho. ........................................... 4
Figura 3: Diagrama de energia mostrando as propriedades intrínsecas do material
como resultado da diferença de energia na região do gap. .................................. 6
Figura 4: Modelo do soliton no poliacetileno, ilustrando o soliton negativo, neutro e
positivo, da esquerda para a direita, respectivamente.11 ...................................... 7
Figura 5: Ilustração hipotética de todos os possíveis defeitos estruturais
apresentados pelo polipirrol.1 ............................................................................. 11
Figura 6: Modelos do polaron e bipolaron no polipirrol. A espécie X- representa um
íon dopante. ........................................................................................................ 13
Figura 7: Mecanismo de polimerização eletroquímica do pirrol.42 ............................. 14
Figura 8: Esquema da evolução da estrutura de bandas para o polipirrol. ................ 14
Figura 9: Evolução do espectro de absorção do Ppi em função do nível de
dopagem.11 ......................................................................................................... 16
Figura 10: Equilíbrio de dissociação do indicador de pH azul de bromofenol (AB).... 20
Figura 11: Ilustração dos espalhamentos Rayleigh e Raman e da absorção no
infravermelho. As linhas 0 e 1 representam os níveis de energia vibracionais.
........................................................................................................................... 27
Figura 12: Típica excitação do sinal para voltametria cíclica, potencial na forma de
onda triangular. ................................................................................................... 30
Figura 13: Arranjo experimental para as medidas espectroeletroquímicas e Raman in
situ. ..................................................................................................................... 35
Índice de Figuras
xiii
Figura 14: Voltamograma cíclico durante a síntese do Ppi-AB. Velocidade de
varredura 20 mV.s-1. Segunda varredura. .......................................................... 37
Figura 15: Espessura dos filmes Ppi-ClO4 e Ppi-AB variando o número de ciclos
utilizado durante a síntese eletroquímica por voltametria cíclica vs ECS. .......... 38
Figura 16: Contraste óptico em função do pH para filmes de Ppi-AB sintetizados
eletroquimicamente com diferentes números de ciclos durante a voltametria
cíclica. Absorbâncias correspondentes a 584 nm. ............................................. 39
Figura 17: Espectros de FTIR-ATR para filmes de Ppi-ClO4, Ppi-AB e para o
indicador AB. ...................................................................................................... 40
Figura 18: a) Imagem por MEV para o filme Ppi-AB. Mapeamento por EDS da
superfície do filme Ppi-AB, sendo b) distribuição de átomos nitrogênio e
c) distribuição de átomos bromo. ........................................................................ 41
Figura 19: Intensidades dos picos de N e Br no espectro de EDS da amostra de
Ppi-AB eletropolimerizado sobre FTO-vidro. ...................................................... 42
Figura 20: Imagens de AFM na escala de 2,55 μm x 2,55 μm para o Ppi-AB e
2,81 μm x 2,81 μm para o Ppi-ClO4. Rms = rugosidade média quadrática. ......... 44
Figura 21: Imagens de AFM (diferença na dureza da superfície) na escala de
2,52 x 2,52 μm para Ppi-AB e 2,81 x 2,81 μm para Ppi-ClO4. ........................... 45
Figura 22: Voltamogramas cíclicos do a) Ppi-ClO4 e b) Ppi-AB em pH 1,5 e 7,5. Em
detalhe: voltamograma cíclico do AB em pH 1,5. Solucão tampão fosfato foi
utilizada como eletrólito. Velocidade de varredura de 20 mV.s-1. ....................... 46
Figura 23: Espectros UV-Vis do corante AB solubilizado em solução tampão fosfato
de pH 1,5; 3,0; 7,0; 7,5; 8,0 e 11,0. .................................................................... 48
Figura 24: Espectros UV-Vis para o Ppi-AB imerso em solução tampão fosfato de pH
a )1,5; b) 3,0; c) 7,5 e d) 11,0. ............................................................................ 50
Índice de Figuras
xiv
Figura 25: Espectros Raman do corante AB (Azul de Bromofenol) solubilizado em
solução tampão fosfato com diferentes pH. Fonte com emissão em 785 nm. .... 52
Figura 26: Espectros Raman in situ em pH 3,0 dos filmes de Ppi-AB e Ppi-ClO4 (em
detalhe) aplicando potenciais entre -0,4 V e +0,4 V. Fonte com emissão em
633 nm. ............................................................................................................... 53
Figura 27: Espectros Raman in situ em pH 7,0 dos filmes de Ppi-AB e Ppi-ClO4 (em
detalhe) aplicando potenciais entre -0,4 V e +0,4 V. Fonte com emissão em
633 nm. ............................................................................................................... 55
Figura 28: Espectros Raman in situ em pH 8,0 dos filmes de Ppi-AB e Ppi-ClO4 (em
detalhe) aplicando potenciais entre -0,4 V e +0,4 V. Fonte com emissão em
633 nm. ............................................................................................................... 56
Figura 29: Dependência do equilíbrio do corante com o potencial aplicado em pH 3,0
e 8,0. As intensidades analisadas correspondem às bandas em 860 cm-1 (AB2-)
e em 893 cm-1 (AB). ............................................................................................ 57
Figura 30: Dependência do pKa do Ppi-AB com o potencial aplicado para os
equilíbrios envolvendo as formas AB e AB- (curva em vermelho) e AB- e AB2-
(curva em azul). Em detalhe: intensidades relativas das bandas Raman
atribuídas às formas AB- e AB2- com potencial aplicado de -0,4 V. .................... 58
Figura 31: a) Espectros de absorção do filme Ppi-ClO4 imerso em solução tampão
fosfato com pH 1,5; 3,0; 7,0; 7,5; 8,0; e 11,0 à temperatura ambiente. b) Curva
de calibração para Ppi-ClO4 imerso em solução tampão de diferentes pH para
valores de absorbância em 680 nm. ................................................................... 69
Figura 32: a) Espectros de absorção do indicador AB solubilizado em solução
tampão fosfato com pH 1,5; 3,0; 7,0; 7,5; 8,0 e 11,0 à temperatura ambiente. Em
detalhe: imagem das soluções de pH 1,5; 3,0 e 7,0 com suas respectivas
colorações. b) Roda de cores desenhada por Newton. ...................................... 70
Índice de Figuras
xv
Figura 33: a) Espectros de absorção do filme Ppi-AB imerso em solução tampão
fosfato com pH 1,5; 3,0; 7,0; 7,5; 8,0 e 11,0 à temperatura ambiente. b) Curva
de calibração para Ppi-AB imerso em solução tampão de diferentes pH. .......... 72
Figura 34: Curva de histerese para Ppi-AB imerso em solução tampão fosfato de
pH 1,5 a 11,0 e pH 11,0 a 1,5. ............................................................................ 75
Figura 35: Tempo de resposta do filme Ppi-AB em 594 nm para diferentes pH. ....... 77
Figura 36: Estabilidade óptica dos filmes Ppi-AB imersos em solução tampão fosfato
de diferentes pH. O desvio padrão foi calculado utilizando diferentes filmes de
Ppi-AB. ............................................................................................................... 78
Figura 37: Absorbância em 584 nm para Ppi-AB imerso em soluções tampão de
diferentes pH em função do número de medidas para determinação da
reprodutibilidade e reversibilidade do filme. Os desvios padrão foram calculados
utilizando diferentes filmes de Ppi-AB. ............................................................... 80
Figura 38: (a) Espectro UV-Vis do filme Ppi-AB imerso em pH 3,0 em diferentes
temperaturas e (b) efeito da temperatura na resposta óptica do Ppi-AB em
584 nm imerso em diferentes pH. ....................................................................... 81
Figura 39: Esquema mostrando eletrodos com microarranjos interdigitados.168 ....... 88
Figura 40: a) Eletrodo digitalizado de ouro e b) com o filme de Ppi-AB depositado
eletroquimicamente. Dimensão do substrato de vidro 2,5 cm2. .......................... 91
Figura 41: Sensibilidade ôhmica (resistência relativa) ao pH dos filmes Ppi-AB. ...... 93
Figura 42: Dinâmica da resposta ôhmica do Ppi-AB entre meio alcalino (pH 8,0) e
meio ácido (pH 3,0). ........................................................................................... 94
Figura 43: Estabilidade ôhmica do filme Ppi-AB imerso em tampão fosfato de pH 3,0,
7,0 e 8,0. ............................................................................................................. 96
Figura 44: Reversibilidade e reprodutibilidade do filme Ppi-AB imerso em solução
tampão fosfato com pH 3,0; 7,0 e 8,0. ................................................................ 97
Índice de Figuras
xvi
Figura 45: Efeito da temperatura sobre a resistência elétrica do filme Ppi-AB imerso
em soluções tampão fosfato de pH 1,5; 3,0; 7,0; 7,5 e 8,0................................. 99
Figura 46: Decaimento exponencial da onda evanescente relacionada com a
distância da superfície metálica. ....................................................................... 109
Figura 47: Difração e espectro de transmissão típico de luz visível através de um
buraco com sub-comprimento de onda em um filme metálico perfeito
infinitamente fino. ............................................................................................. 111
Figura 48: Transmissão óptica através de um único buraco em um filme metálico de
prata. a) Buraco circular de 270 nm de diâmetro em um filme com 200 nm de
espessura e b) seu espectro de transmissão.278 .............................................. 111
Figura 49: Guia de ondas cilíndrico com raio r muito menor que o comprimento de
onda do campo eletromagnético incidente, perfurado em um filme metálico de
espessura h. A diminuição exponencial representa a atenuação do regime de
sub-comprimento de onda.278 ........................................................................... 112
Figura 50: Imagens (esquerda) e espectros (direita) de transmissão com incidência
normal de luz branca através de arranjos quadrados contendo buracos com
sub-comprimento de onda. Para os arranjos azul, verde e vermelho, foram
utilizadas periodicidades de 300, 450 e 550 nm, respectivamente, os diâmetros
dos buracos são 155, 180 e 225 nm e o comprimento de onda para máxima
transmissão ocorre em 436, 538 e 627 nm. Os arranjos foram fabricados em um
filme de prata de 300 nm de espessura.276....................................................... 113
Figura 51: Esquema de imobilização e detecção por bioafinidade das moléculas
biotina e estreptavidina. .................................................................................... 119
Figura 52: Micrografias obtidas por MEV de a) arranjos de nanoburacos
periodicamente ordenados, fabricados por FIB em um filme de ouro de 100 nm
de espessura. b) Imagem ampliada mostrando o tamanho do arranjo de
nanoburacos. c) Imagem ampliada mostrando a dimensão dos nanoburacos.
Índice de Figuras
xvii
Esta amostra foi utilizada durante as medidas por aquisições de imagens
(seção I.4.1). ..................................................................................................... 127
Figura 53: Esquema e descrição do método de fabricação de microestruturas por
litografia soft. .................................................................................................... 128
Figura 54: (a e b) Imagens MEV de arranjos de nanoburacos perfurados através do
filme de SiOx (50 nm de espessura) e de ouro (100 nm de espessura). Os
nanoburacos foram fabricados com 170 nm de diâmetro e periodicidade de
500 nm. ............................................................................................................. 129
Figura 55: Arranjo experimental para as medidas de transmissão de luz através dos
arranjos de nanoburacos. ................................................................................. 131
Figura 56: Esquema experimental para a aquisição de imagens por transmissão de
luz através dos arranjos de nanoburacos usando uma câmera CCD. .............. 132
Figura 57: Espectros de transmissão para um arranjo de nanoburacos ilustrando a
diminuição da intensidade da luz transmitida no comprimento de onda
equivalente a 633 nm. ...................................................................................... 134
Figura 58: a) Intensidade da luz transmitida através de arranjos de nanoburacos para
diferentes índices de refração. b) Curva de calibração obtida através do gráfico
em a) Fonte utilizada: He-Ne. ........................................................................... 135
Figura 59: Micrografias obtidas por MEV das matrizes de nanoburacos criadas em
um filme de ouro. a) Imagem dos buracos com 200 nm de diâmetro e
periodicidade de 420 nm. b) Imagem da configuração da amostra com matrizes
de nanoburacos organizadas em 7 colunas espaçadas por 150 μm, contendo 4
linhas de arranjos espaçados por 60 μm. ......................................................... 135
Figura 60: Sistema de microcanais utilizado para a determinação da concentração de
um analito através de uma curva de calibração adquiridos durante experimento
em tempo real. .................................................................................................. 136
Índice de Figuras
xviii
Figura 61: Imagem fotográfica (lente objetiva 10X) das matrizes quadradas
(15 x 15 μm2) de nanoburacos alinhadas com os microcanais de 100 μm de
largura. ............................................................................................................. 137
Figura 62: Imagem obtida por uma câmera CCD dos arranjos de nanoburacos
alinhados com os microcanais. Os arranjos de nanoburacos foram utilizados
para a detecção do anticorpo PAX8. ................................................................ 138
Figura 63: a) Intensidades normalizadas da luz transmitida para a linha B de arranjos
de nanoburacos após a detecção do anticorpo PAX8. b) Intensidade média
transmitida em função da diluição (calculada para os arranjos em cada
microcanal). ...................................................................................................... 139
Figura 64: Imagem obtida por uma câmera CCD dos arranjos de nanoburacos
alinhados com os microcanais. Os arranjos de nanoburacos foram utilizados
para a detecção do antígeno r-PAX8. .............................................................. 140
Figura 65: Intensidades normalizadas de luz transmitida para a linha B de arranjos
de nanoburacos após a detecção do antígeno r-PAX8. a) amostra diluída e
b) amostra concentrada de r-PAX8. ................................................................. 141
Figura 66: Intensidade média transmitida em função da diluição (calculada para os
arranjos de nanoburacos presentes em cada microcanal). .............................. 142
Figura 67: a) Representação de um nanoburaco, ilustrando a camada de ouro de
100 nm (amarelo) entre o substrato de vidro e uma camada de SiOx de 50 nm
de espessura. b) Esquema ilustrando a detecção das três camadas de
moléculas confinadas dentro do buraco. Os experimentos foram realizados
utilizando arranjos de 8 μm x 8 μm, contendo nanoburacos com 170 nm de
diâmetro e periodicidade de 500 nm. ............................................................... 143
Figura 68: Voltamogramas em solução aquosa de K3[Fe(CN)6] utilizando como
eletrodo de trabalho: a) eletrodo de ouro sem modificação e b) eletrodo de ouro
coberto com filme de SiOx obtido após 120 h de deposição............................. 144
Índice de Figuras
xix
Figura 69: Espectros de transmissão normalizados empregando soluções de glicose
com índices de refração conhecidos. Bandas relacionadas aos modos de
ressonância a) (1,1) e b) (1,0). ......................................................................... 145
Figura 70: Curvas de calibração resultantes dos deslocamentos dos máximos de
transmissão para a) banda (1,1) e b) banda (1,0). ........................................... 146
Figura 71: a) Espectro de transmissão para arranjos de nanoburacos periodicamente
organizados, obtidos através de um filme de 50 nm de SiOx e um filme de
100 nm de ouro, quando a superfície do ouro foi modificada sequencialmente
por uma monocamada de cisteamina, BNHS e estreptavidina. b) Medidas dos
deslocamentos do máximo de transmissão após a adição de BNHS e
estreptavidina, relativos à superfície modificada com cisteamina. ................... 148
Índice de Tabelas
xx
Tabela 1: Análise quantitativa por EDS dos átomos presentes no Ppi-AB
eletropolimerizado sobre FTO-vidro. .................................................................. 43
Tabela 2: Coeficientes de interferência (C.I.) obtidos por medidas de absorção do
Ppi-AB imerso em soluções tamponadas contendo 0,01 e 0,15 mol.L-1 de
interferentes. ....................................................................................................... 83
Tabela 3: Coeficientes de interferência (C.I.) obtidos por medida de resistência para
o Ppi-AB imerso em soluções tamponadas contendo 0,01 e 0,15 mol.L-1 de
interferentes. ..................................................................................................... 100
Tabela 4: Comprimentos de onda referentes ao máximo de transmissão obtidos
através de cálculos por FDTD, comparado a valores experimentais onde foram
utilizadas soluções de glicose com diferentes índices de refração. .................. 147
Sumário
xxi
Parte I .......................................................................................................................... 2
I. Considerações Iniciais ........................................................................................... 2
I.1. Introdução ............................................................................................................ 2
I.1.1. Polímeros Condutores .................................................................................... 2
I.1.1.1. Polipirrol .................................................................................................. 10
I.1.2. Sensores ....................................................................................................... 16
I.1.2.1. Sensores baseados em PICe ................................................................. 17
I.1.2.2. Sensores para pH baseados em PICe ................................................... 19
II. Objetivos Gerais .................................................................................................. 22
III. Caracterização do filme polimérico .................................................................. 24
III.1. Introdução ........................................................................................................ 24
III.1.1. Espectroscopia ultravioleta-visível (UV-Vis) ........................................... 25
III.1.2. Espectroscopia Infravermelho e Espectroscopia Raman ....................... 25
III.1.3. Espectroscopia de Energia Dispersiva de Raios-X (EDS) ..................... 27
III.1.4. Microscopia de Força Atômica (AFM) .................................................... 28
III.1.5. Voltametria Cíclica ................................................................................. 29
III.2. Objetivo específico .......................................................................................... 32
III.3. Parte Experimental .......................................................................................... 33
III.3.1. Materiais, Reagentes e Equipamentos ....................................................... 33
III.3.2. Modificação do eletrodo de FTO-vidro por eletrodeposição de platina ........... 35
III.3.3. Síntese dos filmes de polipirrol ................................................................... 36
III.4. Resultados e Discussão ................................................................................. 38
III.4.1. Medidas de Espessura ................................................................................ 38
III.4.2. FTIR-ATR e EDS-MEV................................................................................ 39
III.4.3. Microscopia de Força Atômica (AFM) ......................................................... 43
III.4.4. Voltametria Cíclica (VC) .............................................................................. 45
III.4.5. Caracterização in situ .................................................................................. 47
III.4.5.1. UV-Vis .................................................................................................. 47
III.4.5.2. Medidas por espectroscopia Raman .................................................... 51
III.5. Conclusões Parciais ........................................................................................ 60
IV. Caracterização óptica para aplicação em sensor de pH ................................. 62
IV.1. Introdução ........................................................................................................ 62
IV.2. Objetivo específico ......................................................................................... 66
Sumário
xxii
IV.3. Parte Experimental .......................................................................................... 67
IV.3.1. Materiais, Reagentes e Equipamentos ....................................................... 67
IV.3.2. Modificação do eletrodo de FTO-vidro por eletrodeposição de platina e
Síntese dos filmes de polipirrol ................................................................................ 67
IV.4. Resultados e Discussão ................................................................................. 68
IV.4.1. Sensibilidade Óptica ao pH ......................................................................... 68
IV.4.2. Histerese ..................................................................................................... 74
IV.4.3. Tempo de resposta ..................................................................................... 76
IV.4.4. Estabilidade Óptica ..................................................................................... 77
IV.4.5. Reprodutibilidade e Reversibilidade Óptica ................................................ 79
IV.4.6. Efeito da Temperatura ................................................................................ 81
IV.4.7. Efeito de Interferentes ................................................................................ 82
IV.5. Conclusões Parciais ....................................................................................... 84
V. Caracterização ôhmica para aplicação em sensor de pH ................................ 86
V.1. Introdução ......................................................................................................... 86
V.2. Objetivo ............................................................................................................. 89
V.3. Parte Experimental ........................................................................................... 90
V.3.1. Materiais, Reagentes e Equipamentos ........................................................ 90
V.3.2. Síntese dos filmes de polipirrol sobre eletrodos de ouro digitalizado .......... 90
V.4. Resultados e Discussão .................................................................................. 92
V.4.1. Sensibilidade Ôhmica ao pH ........................................................................ 92
V.4.2. Tempo de resposta ...................................................................................... 94
V.4.3. Estabilidade Ôhmica .................................................................................... 95
V.4.4. Reprodutibilidade e Reversibilidade Óptica ................................................. 96
V.4.5. Efeito da Temperatura ................................................................................. 98
V.4.6. Efeito de Interferentes ................................................................................. 99
V.5. Conclusões Parciais ...................................................................................... 101
VI. Conclusões Gerais ........................................................................................... 102
Parte II ..................................................................................................................... 104
I. Considerações Iniciais ....................................................................................... 104
I.1. Introdução ........................................................................................................ 104
I.1.1. Câncer ........................................................................................................ 104
I.1.1.1. Marcadores de Câncer ......................................................................... 106
Sumário
xxiii
I.1.2. Sensores biológicos .................................................................................... 106
I.1.3. Ressonância de plasmón de superfície (SPR) ............................................ 107
I.1.3.1. SPR através de filme de ouro com nanoburacos ................................. 110
I.1.3.2. Aplicação de sensores baseados em SPR ........................................... 116
I.1.3.3. Aplicação de sensores baseados em SPR para detecção de câncer .. 117
I.1.3.4. Tecnologia de sensores baseados em SPR ......................................... 118
I.1.4. Estratégias para a melhora da sensibilidade............................................... 121
I.1.4.1. Fatores Geométricos ............................................................................ 121
I.1.4.2. Métodos de imobilização ...................................................................... 122
I.1.5. Microcanais para fluxo de soluções ............................................................ 123
I.2. Objetivos .......................................................................................................... 124
I.3. Parte Experimental .......................................................................................... 125
I.3.1. Materiais, Reagentes e Equipamentos ....................................................... 125
I.3.2. Fabricação dos nanoburacos ...................................................................... 126
I.3.3. Fabricação dos microcanais........................................................................ 127
I.3.4. Deposição de SiOx ...................................................................................... 129
I.3.5. Teste de sensibilidade ................................................................................ 130
I.3.6. Prova de conceito – detecção de proteína dentro do nanoburaco .............. 130
I.3.7. Medidas Ópticas e Sistema de Fluxo .......................................................... 130
I.4. Resultados e Discussão ................................................................................. 133
I.4.1. Detecção por imagens ................................................................................ 133
I.4.2. Detecção dentro dos nanoburacos por espectrofotometria UV-Vis ............. 142
I.5. Conclusões ...................................................................................................... 151
VII. Referências Bibliográficas ............................................................................. 152
Parte I
Capítulo I
Sensor de pH baseado em
filmes de polímero
conjugado
Capítulo I - Introdução Parte I
2
Parte I
I. Considerações Iniciais
I.1. Introdução
I.1.1. Polímeros Condutores
Uma das principais conquistas industriais da química no século XX foi a
fabricação em grande escala de polímeros sintéticos, os chamados polímeros
convencionais. Com eles foram criados materiais fundamentais para o
desenvolvimento tecnológico, como o plástico, as fibras sintéticas e as resinas
artificiais. Devido ao grande interesse nas pesquisas envolvendo estes materiais
poliméricos, desencadeou-se um avanço na sua tecnologia, possibilitando o
desenvolvimento de novos produtos. Certamente, uma das propriedades mais
importantes dos polímeros convencionais está relacionada com sua capacidade de
se comportar como isolante elétrico tanto para altas frequências quanto para altas
voltagens, o que confere a eles uma grande aplicabilidade. O estudo e compreensão
das propriedades destes materiais são de grande importância no sentido de
possibilitar a proposição e desenvolvimento de novos materiais.
A partir da década de 70, polímeros com sistemas π estendidos, também
conhecidos como polímeros conjugados, ficaram conhecidos por apresentarem
propriedades semicondutoras (ou seja, capacidade de conduzir eletricidade).
Inicialmente eles não despertaram interesse científico, uma vez que muitos deles
eram opacos, insolúveis e infusíveis, fatores que dificultavam seu processamento.
Neste aspecto, apresentavam propriedades principalmente mecânicas inferiores
quando comparadas com as dos polímeros até então conhecidos.1-3 A descoberta
destes materiais ocorreu em meados dos anos 70 quando H. Shirakawa e cols.4
verificaram que o tratamento do poliacetileno com ácido ou base de Lewis
aumentava sua condutividade em até dez ordens de grandeza. Esse fato despertou
grande interesse por parte de um número significativo de grupos de pesquisa criando
a área de “Polímeros Intrinsecamente Condutores eletrônicos” (PICe)*
* A especificação “eletrônicos” deve ser feita para diferenciá-los dos “Polímeros Intrinsecamente
Condutores iônicos” (PICi).
Capítulo I - Introdução Parte I
3
proporcionando ainda o prêmio Nobel de química em 2000 a H. Shirakawa
(Universidade de Tsukuba, Japão), A. G. MacDiarmid (Universidade da Pensilvânia,
EUA) e A. J. Heeger (Universidade da Califórnia, Santa Bárbara, EUA). Estes PICe
são caracterizados por uma seqüência de ligações duplas conjugadas na cadeia
polimérica, passando de isolantes a condutores e vice-versa através de um processo
de oxidação-redução, também chamado de “dopagem e desdopagem”.
O grande interesse em se estudar polímeros condutores resulta do grande
número de possibilidades de aplicações destes materiais, incluindo o seu uso como
componente ativo em baterias, sensores, dispositivos eletrocrômicos, capacitores,
diodos emissores de luz (OLED), células solares, entre outros.1-8 A Figura 1
apresenta um diagrama esquemático de propriedades e possíveis aplicações
tecnológicas dos polímeros condutores eletrônicos.
Figura 1: Aplicações tecnológicas dos polímeros condutores.1
Os polímeros condutores, também conhecidos como “metais sintéticos”, são
característicos por possuírem longos sistemas π conjugados, com ligações duplas e
simples alternadamente ao longo da cadeia polimérica. Dentre os polímeros
condutores mais estudados estão o poliacetileno, a polianilina, o polipirrol e o
Polímeros Condutores
Estado Sólido
SuperfícieCondutoraEMI/ESO
Ferromagnetismo
Eletrocromismo
Processoóptico não-linear
Super condutores
Compósitoscondutores
Condutividade
Fotocondutividade
Piezoeletricidade
Reações fotoquímicasno estado sólido
SensoresLed,
fotocopiadoras
Gravaçãomagnética
Dispositivoseletrocrômicos
GeradoresHarmônicos
Super capacitoresconectores
Junção de JosephsonComputadores lógicos
Geradores de alto campo magnético
MicromotoresTransdutores
Litografia
Baterias plásticas
Capítulo I - Introdução Parte I
4
politiofeno, cujas estruturas em sua forma neutra e suas respectivas condutividades
eletrônicas no estado altamente dopado9 estão representadas na Figura 2. Estes
materiais apresentam diferentes condutividades eletrônicas, a qual varia dependendo
do material e do seu nível de dopagem. A condutividade eletrônica de um PICe é
também dependente do método de preparação e do contra-íon usado como dopante.
Embora esteja apresentado o segmento das estruturas mais simples e suas
respectivas condutividades, derivados destes PICe podem apresentar condutividade
maior do que os valores apresentados na Figura 2.
Figura 2: Estrutura da forma neutra de alguns polímeros conjugados com suas
respectivas condutividades para altos níveis de dopagem. Destaca-se o polipirrol por
ser o polímero utilizado neste trabalho.
Os elétrons deslocalizados em sistemas π ao longo da cadeia polimérica
permitem que esta classe de polímeros tenha propriedades condutoras e
proporcionem habilidade para suportar os portadores de carga positivos e/ou
negativos com alta mobilidade ao longo da cadeia. As propriedades semicondutoras
N
N
N
N
H
H
H
H
S
S
S
S
N N N N
H
H
poli(p-fenileno)
polianilina
politiofeno
polipirrol
poli(trans-acetileno)
CONDUTIVIDADE
Scm-1
POLÍMERO INTRINSECAMENTE CONDUTOR
10-100
200
600
105
500
N
N
N
N
H
H
H
H
S
S
S
S
N N N N
H
H
poli(p-fenileno)
polianilina
politiofeno
polipirrol
poli(trans-acetileno)
CONDUTIVIDADE
Scm-1
POLÍMERO INTRINSECAMENTE CONDUTOR
10-100
200
600
105
500
N
N
N
N
H
H
H
H
S
S
S
S
N N N N
H
H
poli(p-fenileno)
polianilina
politiofeno
polipirrol
poli(trans-acetileno)
CONDUTIVIDADE
Scm-1
POLÍMERO INTRINSECAMENTE CONDUTOR
10-100
200
600
105
500
N
N
N
N
H
H
H
H
S
S
S
S
N N N N
H
H
poli(p-fenileno)
polianilina
politiofeno
polipirrol
poli(trans-acetileno)
CONDUTIVIDADE
Scm-1
POLÍMERO INTRINSECAMENTE CONDUTOR
10-100
200
600
105
500
N
N
N
N
H
H
H
H
S
S
S
S
N N N N
H
H
poli(p-fenileno)
polianilina
politiofeno
polipirrol
poli(trans-acetileno)
CONDUTIVIDADE
Scm-1
POLÍMERO INTRINSECAMENTE CONDUTOR
10-100
200
600
105
500
Polímero Intrisecamente Condutor Condutividade (S.cm-1)
poli(trans-acetileno)
polipirrol
poli(p-fenileno)
politiofeno
polianilina
100
104
Capítulo I - Introdução Parte I
5
destes materiais surgem da sobreposição de orbitais pz provenientes das ligações
insaturadas. Esta sobreposição sobre vários sítios resulta na formação de bandas de
valência (BV) π e bandas de condução (BC) π*, com um pequeno gap de energia
entre elas (condição necessária para o comportamento semicondutor).3,10-14
A condutividade destes materiais pode ser aumentada muitas vezes através
do processo de “dopagem”. Este processo pode ser obtido através de métodos
químicos de exposição direta do polímero a agentes de transferência de carga
(dopantes) em fase gasosa ou solução, ou ainda por oxidação eletroquímica. A
dopagem também pode ser realizada utilizando substituintes como agentes
oxidantes ou redutores, ou ainda radicais, íons doadores ou aceptores de elétrons. O
termo dopagem é utilizado em analogia aos semicondutores inorgânicos cristalinos,
uma vez que em ambos os casos a dopagem é aleatória e não altera a estrutura do
material, contudo, na dopagem de polímeros condutores eletrônicos os dopantes não
são considerados apenas “impurezas” do ponto de vista de “quantidade”, pois estão
presentes em maior concentração quando comparados com semicondutores
inorgânicos. A dopagem de polímeros condutores envolve a dispersão aleatória ou a
agregação de dopantes em toda a cadeia, levando à formação de defeitos e
deformações na cadeia polimérica, resultando na formação de bandas eletrônicas
desocupadas, as quais são as responsáveis pelo aumento da condutividade.3,12
A teoria de bandas não explica porque os portadores de carga, elétrons ou
buracos, possuem spin nulo no poliacetileno.2,10,11 Para explicar estes fenômenos,
alguns conceitos físicos, como polarons, bipolarons e solitons, são utilizados em
polímeros condutores desde o início dos anos 80.2
A interação de um monômero com suas vizinhanças, quando da formação do
polímero, leva à formação de vários níveis de energia muito próximos, ocorrendo a
formação de bandas eletrônicas. A banda de valência (BV) abrange os níveis
eletrônicos ocupados, sendo designado como HOMO (Highest Occupied Molecular
Orbital) o estado eletrônico no topo da BV, ou seja o de maior energia, e a banda de
condução (BC) é constituída pelos níveis não ocupados, sendo designado LUMO
(Lowest Unoccupied Molecular Orbital) o estado eletrônico no fundo da BC, ou seja o
de menor energia. A região do gap está relacionada com a diferença de energia
entre a BV e a BC e determina as propriedades elétricas intrínsecas do material,
como mostrado na Figura 3.
Capítulo I - Introdução Parte I
6
Figura 3: Diagrama de energia mostrando as propriedades intrínsecas do material
como resultado da diferença de energia na região do gap.
Polímeros condutores podem ser separados em duas classes, aqueles com
estado fundamental degenerado e aqueles com estados não-degenerados. O
poliacetileno (PA) é um exemplo para o primeiro caso, possuindo um estado
fundamental de energia duplamente degenerado (devido às ligações simples e
duplas que podem ser alternadas sem gasto de energia). Alguns polímeros como
polipirrol, polianilina, politiofeno se encaixam na segunda classe de polímeros
condutores, os quais possuem estados fundamentais não-degenerados de energia,
isso ocorre, por exemplo, no caso do polipirrol, devido à diferença de energia entre
as formas quinóide e benzóide.
Com relação ao PA, Su e cols.15 propuseram um modelo baseado na existência
de defeitos estruturais na cadeia originados durante a polimerização, resultando na
formação de radicais no estado desdopado.16 Estes defeitos deslocalizados seriam
provenientes de alguns átomos de carbono da cadeia polimérica. Na configuração
cis este defeito, por unir duas estruturas de energia ligeiramente diferentes, seria
localizado, enquanto que na configuração trans o defeito por unir estruturas
exatamente de mesma energia (híbridos de ressonância degenerados), permitiria um
rearranjo na cadeia do polímero envolvendo o radical livre e os elétrons-π da ligação
dupla mais próxima. Este defeito (Figura 4) foi chamado de soliton,17 que em termos
de estrutura eletrônica, é o responsável pelo aparecimento de um único nível de
BVBV
BV
BCBC
BC
METAL SEMICONDUTOR
ISOLANTE
GAPGAP
Energia
HOMO
LUMO
Capítulo I - Introdução Parte I
7
energia localizada exatamente no meio do gap, devido à degenerescência do
sistema no estado fundamental.
Figura 4: Modelo do soliton no poliacetileno, ilustrando o soliton negativo, neutro e
positivo, da esquerda para a direita, respectivamente.11
Através de processos de oxidação ou redução é possível remover ou adicionar
elétrons na cadeia polimérica, originando solitons carregados positiva ou
negativamente. Estas espécies podem se mover ao longo da cadeia do PA
transportando a carga, no entanto com spin zero. Quando um elétron é adicionado
ao cátion ou removido do ânion, um radical soliton neutro é outra vez estabelecido.
Este modelo baseado nos solitons não explica o comportamento exibido por outros
polímeros condutores poli-heterocíclicos, pois não possuem estado fundamental
degenerado.
O modelo polaron/bipolaron consiste em uma extensão do Modelo de Bandas,
sendo o modelo teórico mais empregado para explicar a condução elétrica nos
polímeros intrinsecamente condutores. Polaron18-20 é o nome que se dá ao cátion
- +
OxidaçãoRedução
BV
BC
BV
BC
BV
BC
Capítulo I - Introdução Parte I
8
radical (buraco). Este cátion radical, com spin ½ é associado a presença de um
estado eletrônico localizado no gap. Ele é inserido na cadeia polimérica com ligações
duplas conjugadas através de um processo de oxidação, levando então à formação de
uma carga localizada por um processo energeticamente favorecido. A presença deste
buraco na matriz polimérica, ou seja, o estado ionizado do polímero pode ser
estabilizado por uma distorção geométrica local.1 Tomando a dopagem do tipo p como
exemplo, a remoção inicial de um elétron da cadeia polimérica leva a formação do
polaron associado com a mudança da cadeia da forma aromática para a forma
quinóide. Esse processo conduz à formação de estados eletrônicos no gap (símbolo
Egap), (região de energia entre o topo da BV e o fundo da BC), causando um
deslocamento energético da BV e da BC.11 Os estados intermediários de energia
criados no gap durante o processo de oxidação permitem transições eletrônicas que
induzem notáveis mudanças na coloração devido a dopagem, este processo que é
reversível é chamado de eletrocromismo.21
Quando um segundo elétron é retirado da cadeia polimérica, podem ocorrer
duas situações: (i) em níveis baixos de oxidação o elétron pode ser retirado de um
segmento diferente na cadeia polimérica, criando um novo polaron independente ou
(ii) o elétron é retirado de um nível polarônico já existente (remoção do elétron
desemparelhado), levando à formação de um dicátion radical, que é chamado de
bipolaron.2 Bipolarons, assim como polarons, estão associados com distorções
geométricas locais na cadeia. A formação do bipolaron indica que a energia ganha
na interação com o retículo é maior que a repulsão coulômbica entre as duas cargas
confinadas no mesmo espaço.2,11 Idealmente assume-se a formação de múltiplos
estados diiônicos termodinamicamente estáveis (bipolarons) durante os processos de
ionização associados com distorções geométricas locais da cadeia. A formação de um
bipolaron leva a uma diminuição da energia de ionização do polímero, motivo pelo
qual um bipolaron é termodinamicamente mais estável do que dois polarons.11 Além
disso, assume-se que o estado bipolaron localmente distorcido compreende somente
quatro ou cinco unidades monoméricas de um segmento polimérico e que o ganho de
energia, em comparação a dois estados polarons, é de 0,45 eV. Em termos de
energias redox, isso significa que o potencial redox E0redox para a formação do
bipolaron poderia ser menor que o E0redox para a formação de dois polarons. Ambos,
Capítulo I - Introdução Parte I
9
polarons e bipolarons podem mover-se ao longo da cadeia polimérica através do
rearranjo das ligações conjugadas quando expostos a um campo elétrico.2
Os bipolarons criados na cadeia polimérica são responsáveis pela condução
elétrica. O transporte acontece via mobilidade ao longo dos segmentos da cadeia
conjugada polimérica e por saltos intercadeia (hopping). A condutividade elétrica do
bulk é equivalente ao produto da concentração dos portadores livres contidos no
material (n) e a sua mobilidade relativa (), (Equação 1), onde e é a unidade de
carga eletrônica (1,6 x 10-19 C). Como a mobilidade do íon dopante dentro do
material seco é muito baixa, estes polímeros são verdadeiramente condutores
eletrônicos e não iônicos.
Equação 1
O fator limitante da condutividade é a mobilidade do portador de carga e não a
concentração. Existem no mínimo três elementos que contribuem para a mobilidade
dos portadores: transporte intracadeia, transporte intercadeia e contato interpartícula.
Estes elementos compreendem uma complicada e resistiva rede, a qual determina
uma mobilidade efetiva dos portadores. Assim, a mobilidade e, portanto, a
condutividade é determinada em ambos os níveis microscópico (intra e intercadeia) e
macroscópico (interpartículas).22 Dados experimentais sobre a mobilidade dos
portadores em filmes de PA confirmaram que o transporte intercadeia e interpartícula
são os fatores limitantes para a condução.23 Desta forma, embora a teoria particular
da estrutura molecular possa prever uma menor condutividade baseada na
conjugação de uma cadeia simples, a condutividade observada é um reflexo da
interação interpartícula e das interações intercadeia.24,25
A condutividade em um sólido é causada por dois fatores:1 o número de
portadores de carga (elétrons/buracos) e a mobilidade destes portadores, que como
mencionando anteriormente é o fator limitante da condutividade. A condutividade
elétrica de muitos polímeros condutores está na mesma faixa de grandeza da
maioria dos semicondutores inorgânicos.26 No entanto, os semicondutores
inorgânicos possuem um baixo número de portadores (na ordem de 1016 a
1018 cm-3), mas possuem altas mobilidades (102 a 105 cm2.V-1.s-1). Esta alta
mobilidade ocorre devido ao alto grau de cristalinidade e pureza destes materiais,
bem como ao número relativamente baixo de defeitos presentes na sua estrutura.2
en..
Capítulo I - Introdução Parte I
10
Os polímeros condutores, por outro lado, possuem um grande número de portadores
(1021 a 1023 cm-3), mas uma baixíssima mobilidade (10-4 a 10-5 cm2.V-1.s-1), devido
principalmente ao grande número de defeitos estruturais (reticulação e
desordenamento das cadeias), como exemplificado para o polipirrol na Figura 5.
Desta maneira, a obtenção de polímeros condutores com maiores condutividades
está diretamente relacionada ao aumento da mobilidade dos portadores. Isto pode
ser viabilizado pela obtenção de materiais mais ordenados, ou seja, com melhor
orientação das cadeias, livre de reticulações e defeitos.2
A influência do arranjo estrutural do material, comparando condutores
orgânicos e inorgânicos, deve também ser levada em conta nos mecanismos de
transporte de carga. Em polímeros conjugados, como em todos os materiais
orgânicos, a ionização resulta em uma substancial distorção do arranjo em torno dos
sítios ionizados, o que leva a uma limitação do movimento dos portadores de carga e
portanto, a uma diminuição da mobilidade. Em semicondutores inorgânicos a
distorção é menos evidenciada e como resultado estes materiais alcançam altas
condutividades. Como a desordem representa uma regra dominante, polímeros
conjugados são provavelmente mais análogos a semicondutores amorfos do que a
semicondutores cristalinos.20
I.1.1.1. Polipirrol
O poliacetileno foi o primeiro polímero condutor a ser sintetizado.27 No
entanto, este polímero possui instabilidade térmica e ambiental. Como
consequência, outros polímeros passaram a ser intensivamente investigados com o
intuito de superar estas limitações. Dentre eles o polipirrol (Ppi) é um dos que mais
se destacam, sendo muito promissor para aplicações comerciais. Apesar de ser
conhecido há muito tempo (1916),28 ele passou por uma espécie de “redescoberta”
no final da década de 7029 quando foram descobertas suas propriedades
condutoras. Este polímero condutor é um material que apresenta alto potencial para
aplicação em dispositivos elétricos e eletrocrômicos devido principalmente à sua alta
condutividade elétrica, reatividade redox, facilidade de síntese, alta estabilidade
térmica, além de boa estabilidade química em condições ambientais normais.30-35
Desde a descoberta das propriedades condutoras do polipirrol em 1979, numerosos
estudos foram realizados sobre este material. Sua condutividade e outras
propriedades elétricas como efeito eletrocrômico atraem muito interesse,
Capítulo I - Introdução Parte I
11
principalmente devido ao possível controle das propriedades elétricas através das
condições experimentais de síntese.30,34
A síntese do polipirrol pode ser feita através de diferentes métodos, incluindo
polimerização por oxidação química, eletroquímica30 ou fotoquímica.36 Os agentes
oxidantes mais utilizados durante a polimerização por oxidação química são:
persulfato de amônio, peróxido de hidrogênio e sais de metais de transição (Fe3+,
Cu2+, Cr6+, Ce4+, Ru3+ e Mn7+).30 Durante este tipo de polimerização, ocorre a
formação do cátion radical intermediário, extremamente reativo. O acoplamento
ocorre de maneira aleatória, resultando em um grande número de defeitos e
reticulações, além da falta de orientação entre as cadeias.
Figura 5: Ilustração hipotética de todos os possíveis defeitos estruturais
apresentados pelo polipirrol.1
Idealmente, o crescimento das cadeias do polipirrol se dá através dos átomos
de carbono nas posições 2 e 5 do anel pirrólico. Desta forma, a conjugação entre as
ligações duplas e simples seria maximizada, uma vez que aumentam a mobilidade
NH
NH
NH
NH
NH
NH
NH
NH
NH
NH
NH
NH
NH
NH
O
H
H
OH
n
grupamentocarboxila
acoplamento2,3
hidrogenação
grupamentosOH
anéis subsequentes sem rotação
Capítulo I - Introdução Parte I
12
dos portadores de carga.1,2 No entanto, é verificado um grande número de
acoplamentos em outros átomos de carbono do anel, o que leva à diminuição da
mobilidade dos portadores de carga. Cerca de 30% das ligações C-C entre os anéis
pirrólicos não são ideais.2 A Figura 5 mostra alguns dos vários tipos de defeitos
possíveis de serem encontrados no Ppi.
A polimerização eletroquímica é o método de síntese mais usado,37 uma vez
que possibilita a formação de filmes sobre eletrodos. A eletropolimerização tem
estequiometria eletroquímica38 entre 2,2 e 2,6 F.mol-1. No processo de polimerização
são consumidos 2,0 F.mol-1 e a carga excedente é usada no processo de dopagem
do polímero, o qual ocorre simultaneamente à síntese. O mecanismo de
eletropolimerização para heterocíclicos considera a formação de um cátion-radical
do monômero, seguida do acoplamento de dois cátions radicais, com saída de dois
prótons e reconstituição de cátions radicais do monômero e dos oligômeros
formados.
A estabilidade do cátion radical do monômero é o fator determinante para
obtenção de um polímero com elevado grau de conjugação (ou comprimento de
conjugação). Um cátion radical muito estável pode difundir do eletrodo dando origem
a oligômeros solúveis, enquanto que um muito reativo pode sofrer reações
colaterais. As propriedades elétricas e físico-químicas do material eletrosintetizado
dependem fortemente das condições de síntese, tais como: concentração do
monômero, natureza do meio eletrolítico, temperatura, etc.37,39,40
A natureza do dopante tem um papel importante na estabilidade e
condutividade dos polímeros condutores. No polipirrol, uma alta concentração de
dopante leva à formação de espécies polarônicas paramagnéticas. Aumentando-se o
grau de dopagem, estes polarons são convertidos a bipolarons, os quais se
estendem, cada um, sobre quatro anéis pirrólicos. As estruturas esquematizadas do
polaron e bipolaron no polipirrol estão representadas na Figura 6. O fragmento
portador de carga, constituído de quatro anéis pirrólicos, pode viajar ao longo da
cadeia através de um rearranjo das ligações duplas e simples.2 Scott e cols.,41
observaram a formação de filmes de polipirrol com altos valores de condutividade
obtidos eletroquimicamente. Essa observação levou esses autores a sugerir que a
ausência de paramagnetismo observada por ressonância paramagnética eletrônica
Capítulo I - Introdução Parte I
13
(EPR), associada com uma corrente de portadores pode ser explicada atribuindo
esses portadores a espécies bipolaronicas com spin nulo.20,41
Figura 6: Modelos do polaron e bipolaron no polipirrol. A espécie X- representa um
íon dopante.
A eletropolimerização do pirrol (Figura 7) envolve uma etapa inicial, na qual
ocorre a oxidação do monômero formando um cátion radical. Este pode se ligar a
outro cátion radical ou a um monômero, seguida de uma transferência de carga.
Nesta etapa são eliminados dois prótons, formando um dímero neutro. A reação
continua levando a um aumento da massa molar desse oligômero, até a formação
das cadeias poliméricas. O polímero resultante da polimerização eletroquímica
apresenta preferencialmente acoplamento 2-5, de acordo com o esquema ilustrado
na Figura 7.42
Polaron
CH4
NH
C+
NH
NH
NH
NH
CNH
X-
n
CH4
NH
C+
NH
NH
NH
NH
C+
NH
X-
n
X-
Bipolaron
Capítulo I - Introdução Parte I
14
Figura 7: Mecanismo de polimerização eletroquímica do pirrol.42
A evolução da estrutura de bandas proposta por Bredas e cols.20 para o
polipirrol em diversos níveis de dopagem está mostrada na Figura 8. Quando uma
única carga positiva é introduzida na cadeia, ocorre a formação do polaron (energia de
ligação 0,12 eV). Sua presença na cadeia introduz dois níveis eletrônicos localizados
no gap: um estado polaron ligante, ocupado com um elétron e localizado 0,49 eV
acima da BV e um estado polaron antiligante vazio localizado 0,53 eV abaixo da BC.
Figura 8: Esquema da evolução da estrutura de bandas para o polipirrol.
NH
NH
+
CH
NH
+C
H
NH
NH
+C
H
NH
+
NH
CH
H
H
-e
NH
+
NH
+H
H NH
NH
+ 2H+
NH
NH
NH
n
-e
NH
NH
NH
+C
H
n
BV BVBV
BC BCBC
0,49 eV
0,53 eV
3,16 eV
0,75 eV
0,79 eV
0, 39 eV
0,76 eV
0,70 eV
0,45 eV
3,56 eV
POLARONbaixo nível de oxidação
BIPOLARONparcialmente oxidado BANDA BIPOLARON
altamente oxidado
Capítulo I - Introdução Parte I
15
Os estados polarônicos no gap permitem que três diferentes transições ocorram
(Figura 9) quando o polímero se encontra em baixos níveis de oxidação, (estado
parcialmente neutro, reduzido). Nestas condições, o polipirrol possui um máximo de
absorção intenso em 3,16 eV (400 nm) que ocorre devido à Egap (energia de gap)
associada com a transição π – π*. Dentro desta região de gap é possível observar 3
bandas de absorção, relacionadas às três diferentes transições mencionadas acima.
Uma destas bandas aparece em 0,7 eV (1771 nm) e pode ser atribuída à transição da
BV para o estado polaron ligante. A banda em 1,4 eV (886 nm) é associada com a
transição do estado polaron ligante para o polaron antiligante e finalmente a banda em
2,1 eV (590 nm) corresponde à transição da BV para o estado polaron antiligante. As
diferentes localizações do estado polaron antiligante e ligante comparado com a BC e
BV, respectivamente, ocorrem devido às diferentes contribuições dos orbitais do
nitrogênio para as bandas de valência e para as bandas de condução.
O aumento do nível de oxidação faz com que os estados polarônicos comecem
a interagir. Cálculos teóricos indicam que dois polarons, ao se aproximarem, se tornam
instáveis com respeito a orientação de seus spins e ocorre então a formação do
bipolaron duplamente carregado e com spin nulo. A extensão do bipolaron é sobre 4
anéis pirrólicos, mas a deformação da cadeia é muito menor do que no caso do
polaron. Com respeito aos dois processos de ionização, o ganho em energia total ao
formar o bipolaron é 0,69 eV. Isto indica que a formação de um bipolaron é favorecida
em relação a formação de 2 polarons por 0,45 (= 0,69 – 2 x 0,12) eV. Um bipolaron
introduz dois estados de transição na região do gap em 0,75 eV acima da BV e 0,79 eV
abaixo da BC. O estado bipolaron ligante, ao contrário do polaron ligante, encontra-se
vazio. Como resultado, somente duas transições serão possíveis, ocorrendo, portanto,
o desaparecimento do modo de absorção em 1,4 eV, além disso as demais transições
se deslocam para maiores valores de energia.
Em altos níveis de dopagem (por exemplo, um bipolaron para cada 6 anéis de
pirrol) a Egap é de aproximadamente 3,6 eV (344 nm), ou seja, 0,40 eV maior
comparada com a Egap do polímero desdopado. Além desta, aparecem duas bandas de
absorção intensas, centradas em 1,0 eV (1240 nm) e em 2,7 eV (459 nm),
relacionadas à existência de duas bandas bipolaron formadas na região de Egap.
Capítulo I - Introdução Parte I
16
Figura 9: Evolução do espectro de absorção do Ppi em função do nível de
dopagem.11
I.1.2. Sensores
Um sensor é um dispositivo que mede ou detecta uma condição, convertendo
a resposta em um sinal que pode ser lido ou observado por um instrumento.43 Um
exemplo simples de sensor é o termômetro de mercúrio, o qual converte a medida
de calor (temperatura) em expansão e contração do líquido, registrando a resposta
em um tubo de vidro graduado. Sensores são usados diariamente em, por exemplo,
botões de elevadores e lâmpadas, os quais são acesos ou apagados ao serem
tocados (sensíveis ao toque). Existem inúmeras aplicações para sensores, tantas
que muitas vezes as pessoas não se dão conta. Dentre estas aplicações estão
incluídos sensores em carros, computadores, naves espaciais, fábricas e robôs,
entre outros.
A técnica de utilização de sensores na área científica tem algumas vantagens
sobre outros métodos de análise visto que não utiliza reagentes e não necessita de
Den
sidade
óptic
a
Aum
enta
ndo
o n
ível
de
do
pag
em
v1,0
2,7
3,6
3,2
2,11,40,7
3,00,0 1,0 2,0 4,0 5,0 6,0
E / eV
Capítulo I - Introdução Parte I
17
qualquer tipo de pré-tratamento. Além disso, possui bons níveis de sensibilidade e
especificidade e retorna um resultado de forma rápida ao analista. Esta técnica
também pode ser utilizada em uma linha de controle de qualidade durante um
processo de fabricação, por exemplo. Entretanto, os sensores também têm algumas
desvantagens, principalmente no que diz respeito à reprodutibilidade, recuperação e
os efeitos da umidade e da temperatura na resposta.
Atualmente, muitos sensores comerciais estão disponíveis no mercado
juntamente com um grande número de protótipos de sensores que estão sendo
desenvolvidos por instituições de pesquisa. Todos estes tipos de sensores exibem
interações físicas e químicas quando expostos aos compostos químicos. Devido à
grande quantidade de sensores disponíveis, a opção de escolha é portanto, muito
ampla.
I.1.2.1. Sensores baseados em PICe
O interesse em sensores baseados em polímeros conjugados aumenta ano
após ano desde que Diaz e cols.44 desenvolveram o primeiro sensor de polipirrol. Na
forma mais simples, um filme fino de polímero é depositado num substrato condutor
formado por dois eletrodos paralelos de platina ou ouro com uma base isolante como
óxido de silício ou vidro para formar o sensor.45
Os polímeros mais usados em sensores são:46-48 polipirrol, polianilina e
politiofeno, os quais são sintetizados na presença de agentes dopantes como ácidos
ou sais.49 A cada dia, novos polímeros contendo sistemas de ligações conjugadas
estão sendo sintetizados para ampliar as aplicações em produtos microeletrônicos.50
As características desses tipos de sensores explicam o porquê de serem os mais
utilizados em conjuntos sensoriais. Eles são facilmente fabricados, seu consumo de
energia é baixo, são robustos e podem trabalhar à temperatura ambiente. Como
mencionado anteriormente, existem vários tipos de polímeros, incluindo uma grande
variedade de derivados e além disso, um grande número de polímeros novos surge
todos os anos. A possibilidade de modificar suas propriedades utilizando diferentes
dopantes,49 torna possível o desenvolvimento de sensores específicos para
compostos voláteis (e.g., cetonas, aldeídos ou álcoois), ou para alguma aplicação
particular (caracterização ou identificação). O estado de oxidação do polímero
também pode ser alterado após sua deposição, para investigar sua característica
sensível.45
Capítulo I - Introdução Parte I
18
Os PICe são resistentes ao envenenamento por compostos que inativam
sensores fabricados com óxidos semicondutores inorgânicos, mas o tempo de vida
de um sensor PICe é cerca de apenas 9 a 18 meses, ou seja, bem menor que dos
sensores à base de óxidos metálicos. Este ainda é um problema a ser resolvido.
Além disso, a natureza randômica do processo de deposição é um problema
no que diz respeito à produção de sensores reprodutíveis.45 Os sensores possuem
também outros inconvenientes como o longo tempo de resposta (de 20 a 40 s),49
tornando-os inaptos com o passar do tempo ou com mudanças na temperatura.
Entretanto, o principal problema é que eles também são extremamente sensíveis à
umidade, contudo esse aspecto pode ser positivamente aplicado para o
desenvolvimento de sensores de umidade.51
Devido ao fato dos PICe serem sensíveis a muitos tipos de voláteis, muitas
aplicações são descritas na literatura. Eles são sensíveis a álcoois, cetonas,
benzeno e outros compostos polares. Diversas pesquisas mostram aplicações dos
PICe em produtos alimentícios como cervejas e outras bebidas alcoólicas,52,53 óleo
de oliva,54 suco de laranja,55 peixe,56 leite,57 café58 e vinho.59 Além das aplicações na
área alimentícia, os sensores a base de PICe também podem ser aplicados no
monitoramento de hidrocarbonetos aromáticos60 e na identificação de odores de
materiais plásticos utilizados em automóveis,61 entre outras aplicações.
O polipirrol é especialmente promissor para aplicações comerciais devido a
sua boa estabilidade ambiental e facilidade de síntese. A polimerização
eletroquímica do pirrol em solução aquosa permite o uso de um grande número de
ânions como dopante,62-64 incluindo indicadores de pH.65,66 Desta forma, ele pode
atuar como matriz hospedeira para diferentes tipos de dopantes. Essa propriedade
tem sido explorada para fazer deste material um dispositivo sensível a diferentes
tipos de analitos.67-75
A pesquisa baseada no polipirrol tem sido motivada devido às suas
importantes aplicações como em baterias,76-78 membranas de separação de gás,79,80
sensores,81-84 dispositivos microeletrônicos,85 revestimento,86 compósitos87,88 e
sensores químicos.89-95 Todos estes dispositivos têm propriedades ópticas,
mecânicas e elétricas interessantes devido à possibilidade de aplicação onde
materiais inorgânicos não são adequados.
Capítulo I - Introdução Parte I
19
I.1.2.2. Sensores para pH baseados em PICe
Pode-se dizer que o íon hidrogênio é unipresente, já que pode ser encontrado
na maioria das reações químicas.96 Ele é quantificado como pH através do logaritmo
negativo da sua atividade.
𝑝𝐻 = − log 𝑎𝐻 Equação 2
O pH de uma solução tem um efeito significante nas reações químicas, desta
forma as medidas e controle do pH são fundamentais na química, bioquímica,
química clínica e ciência ambiental, sendo usualmente feitas utilizando eletrodos de
vidro. O método pioneiro para medidas de pH foi baseado na utilização de
indicadores, por exemplo papel tornassol, o qual muda sua cor de acordo com o pH
da solução, ficando na coloração azul em meio alcalino e vermelho em meio ácido.
Para processos químicos dependentes do pH é importante que as amostras
aquosas tenham seu pH medido ou monitorado. Além do método óptico, onde a
medida é resultante de mudanças de absorbância,97,98 refletância99,100 ou
fluorescência101,102 de um indicador sensível ao pH, que reage reversivelmente com
os prótons da amostra, existem outros sistemas comuns para medir o pH baseados
em dispositivos amperométricos ou potenciométricos. Membranas íon-seletivas,
fibras ópticas, sensores baseados em fluorescência e dispositivos condutimétricos
sensíveis a pH também foram desenvolvidos.103,104 No entanto, estes dispositivos
podem ser instáveis e, portanto, requerem constante re-calibração. Embora o
indicador tornassol e outros indicadores de pH mencionados anteriormente sejam
amplamente usados em várias áreas, um considerável interesse na pesquisa tem
sido focado no desenvolvimento de sensores químicos ou biológicos usando
polímeros conjugados. Como resultado, na literatura encontra-se revisões completas
sobre a aplicação de polímeros em vários dispositivos sensoriais105 e, mais
especificamente, revisões de vários métodos utilizados para as medidas.106
As propriedades de troca iônica dos polímeros condutores são de especial
interesse para o desenvolvimento de sensores potenciométricos.107-109 Muitos
polímeros condutores possuem grupos ácidos e/ou básicos, os quais podem ser
protonados ou desprotonados (por exemplo, polianilina e polipirrol). A desprotonação
destes PICe resulta na diminuição da concentração de portadores de carga ao longo
da cadeia polimérica, a qual é acompanhada de mudanças nas propriedades ópticas
Capítulo I - Introdução Parte I
20
e elétricas do material. Levando em consideração o polipirrol, a protonação aumenta
a sua condutividade, enquanto que a desprotonação a diminui.105 Devido à
desprotonação das cadeias de Ppi, a absorbância entre 600 e 900 nm aumenta
quando o pH é variado de 6 para 12, além disso ocorre um deslocamento da banda
para menores valores de comprimento de onda.
Como dito anteriormente, o Ppi além de ter suas propriedades ópticas e
elétricas afetadas pelo pH do meio, pode ainda ser utilizado como matriz hospedeira
para a incorporação de diferentes dopantes, como por exemplo um indicador ácido
base (e.g. Azul de Bromofenol (AB)). Este indicador (Figura 10) apresenta
grupamento sulfônico que contribui para sua solubilidade em água, e ainda quando
altamente desprotonado se torna um contra-íon diiônico para o polipirrol,
proporcionando maior organização do polímero, a nível molecular.110 Além disso,
possui pKa ácido (faixa de viragem 3,0 a 4,6),111-114 o qual difere do apresentado pelo
Ppi (8,6).115 Esta diferença de pKa apresentada pelo dopante e matriz polimérica é
particularmente interessante para a compreensão da sensibilidade ao pH do sistema
e estudo do comportamento do dopante no interior da matriz polimérica em
diferentes condições.
Figura 10: Equilíbrio de dissociação do indicador de pH azul de bromofenol (AB).
Br
BrBr
O
OH
SO3
-
Br
Br
BrBr
O
SO3
-
-O
Br
O
S
OH
Br
BrO
O
BrBr
OH
H+H+
pKa = 4,6pKa = 3,0
AB AB- AB2-
21
Capítulo II
Objetivos Gerais
Capítulo II – Objetivos Gerais Parte I
22
II. Objetivos Gerais
Na Parte I deste trabalho, objetivou-se a obtenção de um material sensível ao
pH baseado em Ppi dopado com o indicador ácido-base AB (Ppi-AB) e o estudo e
compreensão da origem da sensibilidade ao pH deste material. Além de investigar a
influência do corante sobre a resposta do Ppi ao pH, explorando suas propriedades
ópticas e elétricas, objetivamos o estudo do processo que ocorre no equilíbrio
químico de dissociação deste corante, quando no interior da matriz polimérica. A
partir destes estudos buscamos a aplicabilidade do Ppi-AB como sensor óptico e
ôhmico para pH.
Capítulo III – Caracterização do filme polimérico Parte I
23
Capítulo III
Caracterização do filme
polimérico
Capítulo III – Caracterização do filme polimérico Parte I
24
III. Caracterização do filme polimérico
III.1. Introdução
Durante o processo de dopagem de um PICe, ocorre a incorporação de íons
na matriz polimérica para que ocorra o balanceamento das cargas positivas geradas
ao longo da cadeia. Os polímeros podem ser sintetizados por processo químico ou
eletroquímico. Durante a síntese química normalmente são utilizados agentes
oxidantes, como (NH4)2(S2O7) ou FeCl3, sendo frequentemente usados para a
preparação de polímeros intrinsecamente condutores eletrônicos (PICe) em solução,
enquanto que a deposição eletroquímica é principalmente usada para a deposição
de filmes de PICe sobre substratos condutores. Algumas das vantagens deste último
método estão relacionadas ao controle da espessura do filme, o que é feito pelo
controle da carga que passa através da célula eletroquímica durante o crescimento
do filme; também é possível controlar o nível de dopagem do polímero através do
ajuste do potencial elétrico. Ao contrário, a dopagem química não proporciona a
mesma facilidade de controle do nível de dopagem e da espessura dos filmes,
resultando em filmes com pouca reprodutibilidade quantitativa.
A possibilidade de se utilizar diferentes dopantes durante a síntese de um
PICe permite o ajuste das propriedades do filme, possibilitando sua aplicação em
vários sensores químicos e biológicos. Materiais com propriedades crômicas podem
ser facilmente obtidos através da incorporação de corantes orgânicos no filme
polímerico. Muitos dos corantes têm pouca solubilidade em água devido à forte
interação intermolecular π-π e à estrutura planar. Entretanto, corantes ácidos
possuindo grupamentos sulfonato são mais solúveis e como consequência têm sido
usados como dopantes.116,117 O sistema conjugado de corantes pode interagir com o
sistema π dos polímeros condutores, como o Ppi, levando a sistemas híbridos com
novas propriedades ópticas e eletrônicas.66,118,119 Como a natureza do íon dopante
tem influência nas características estruturais, ópticas e elétricas dos PICe, estas
propriedades têm sido extensivamente estudadas120,121 por diferentes técnicas
espectroscópicas e eletroquímicas. Uma breve introdução sobre as técnicas
utilizadas neste capítulo será apresentada a seguir.
Capítulo III – Caracterização do filme polimérico Parte I
25
III.1.1. Espectroscopia ultravioleta-visível (UV-Vis)
A região do espectro eletromagnético correspondente ao ultravioleta fica entre
200 e 380 nm enquanto que o visível corresponde à faixa de comprimento de onda
() entre 380 e 780 nm, esta última é a responsável pela cor das substâncias e
objetos. A absorção da radiação ultra-violeta ou visível provoca a excitação de
elétrons da molécula, originando as transições eletrônicas, onde os elétrons de
valência são promovidos de seu estado fundamental para um estado de mais alta
energia (estado excitado). A energia total de uma molécula corresponde à soma de
sua energia eletrônica (Eelet), vibracional (Evib) e rotacional (Erot), sendo que a
magnitude destas energias diminui na seguinte ordem: Eelet > Evib > Erot. As principais
características de uma banda de absorção são: posição e intensidade. A posição
corresponde ao comprimento de onda da radiação cuja energia é igual àquela
necessária para ocorrer a transição eletrônica. Por sua vez, a intensidade da
absorção depende das regras de seleção para a transição eletrônica.122
Embora sejam os elétrons que sofram a excitação do estado fundamental
para o estado excitado, o núcleo ao qual esses elétrons são mantidos presos através
das ligações também tem sua importância na determinação do comprimento de onda
da absorção. Assim, a energia característica da transição é uma propriedade de um
grupo de átomos conhecido como cromóforo.
III.1.2. Espectroscopia Infravermelho e Espectroscopia Raman
A espectroscopia estuda a interação da onda eletromagnética com a matéria,
onde é feito o estudo dos níveis de energia de átomos ou moléculas. Geralmente, as
transições eletrônicas são situadas na região do ultravioleta ou visível, as
vibracionais na região do infravermelho e as rotacionais na região de microondas e,
em casos particulares, também na região do infravermelho longínquo (ou distante).
Em uma molécula, o número de vibrações e a descrição dos modos
vibracionais em cada tipo de espectroscopia vibracional (infravermelho e Raman)
podem ser previstas a partir da simetria da molécula e da aplicação da teoria de
grupo. Embora ambas as espectroscopias estejam relacionadas às vibrações
moleculares, os mecanismos básicos de sondagem destas vibrações são
essencialmente distintos em cada uma. Consequentemente, os espectros obtidos
apresentam diferenças significativas; quando ocorre a presença de um mesmo pico
nos espectros Raman e no infravermelho observa-se que o seu tamanho relativo nos
Capítulo III – Caracterização do filme polimérico Parte I
26
espectros é muito diferente. Em muitos casos, certo pico aparece em um espectro e
é totalmente ausente em outro. Devido a essas diferenças, a espectroscopia no
infravermelho é mais eficaz em alguns casos e em outros a espectroscopia Raman
oferece espectros mais úteis. De modo geral, pode-se dizer que as espectroscopias
Raman e infravermelho são técnicas complementares.
A condição para que ocorra absorção da radiação infravermelha é que haja
variação do momento de dipolo elétrico da molécula como resultado do seu
movimento vibracional ou rotacional (o momento de dipolo é determinado pela
magnitude da diferença de carga e a distância entre dois centros de carga). Somente
nessas circunstâncias, o campo elétrico alternante da radiação incidente interage
com a molécula, originando os espectros. De outra forma, pode-se dizer que o
espectro de absorção no infravermelho tem origem quando a radiação
eletromagnética incidente tem uma componente com freqüência correspondente a
uma transição entre dois níveis vibracionais. A vibração dos átomos no interior de
uma molécula apresenta energia coerente com a região do espectro eletromagnético
correspondente ao infravermelho (de 200 a 14290 cm-1).123 O espectro infravermelho
de um composto químico é considerado uma de suas propriedades físico-químicas
mais características e por conta disto, a espectroscopia na região do infravermelho
tem extensa aplicação na identificação dos compostos.
Em um experimento Raman, a amostra é irradiada com uma radiação laser
monocromática de alta potência, geralmente na região do visível do espectro
eletromagnético, sendo a frequência desta radiação muito maior que as frequências
das transições vibracionais. Quando uma molécula é irradiada por radiação
eletromagnética, a energia pode ser transmitida, absorvida ou espalhada. No efeito
Tyndall a radiação é espalhada por partículas enquanto que no efeito Rayleigh são
as moléculas que espalham a luz, porém em nenhum destes efeitos ocorre qualquer
alteração do comprimento de onda da luz. Diferentemente do espalhamento
Rayleigh, onde a frequência do fóton espalhado é a mesma do fóton incidente, no
espalhamento Raman ocorre alteração na energia da molécula (∆E). Se a molécula
ganha energia, a frequência do fóton espalhado é menor que a frequência do fóton
incidente, dando origem às linhas Stokes no espectro Raman. Quando a molécula
perde energia, a situação é inversa e neste caso são originadas as linhas anti-Stokes
(Figura 11).
Capítulo III – Caracterização do filme polimérico Parte I
27
Figura 11: Ilustração dos espalhamentos Rayleigh e Raman e da absorção no
infravermelho. As linhas 0 e 1 representam os níveis de energia vibracionais.
Na espectroscopia Raman convencional, a espécie analisada é transparente
ao feixe da radiação incidente, diferentemente do que ocorre na espectroscopia
Raman Ressonante, onde o fóton incidente é absorvido pela molécula, acarretando
um aumento da intensidade das bandas associadas com a espécie ressonante.
O emprego da espectroscopia Raman Ressonante tem sido muito útil em
estudos espectroeletroquímicos de polímeros conjugados,124-129 (já que o processo
redox destes leva à mudanças estruturais de segmentos da cadeia polimérica), pois
além de permitir a análise do material sobre qualquer eletrodo, os sinais do solvente
e do eletrólito suporte praticamente não interferem. Além disso, o emprego de
diferentes linhas de excitação, além de distintos potenciais, é um recurso bastante
utilizado para ressaltar diferentes segmentos da macromolécula que se têm
interesse.
III.1.3. Espectroscopia de Energia Dispersiva de Raios-X (EDS)
A utilização desta técnica permite, através do mapeamento dos raios-X
emitidos pela amostra e gerados pelo impacto do feixe de elétrons primários,
análises qualitativa e semiquantitativa sobre a distribuição dos metais na mesma.130
Quando o feixe de elétrons incide sobre um material, os elétrons mais externos dos
átomos são excitados, mudando de níveis energéticos. O decaimento destes
elétrons, liberam a energia adquirida que é emitida em comprimento de onda no
espectro de raios-X. Um detector instalado na câmara de vácuo do microscópio
eletrônico de varredura (MEV) mede a energia associada a esse fóton. Como os
elétrons de um determinado átomo possuem energias distintas, é possível, no ponto
de incidência do feixe, determinar quais elementos químicos estão presentes
vib
Anti-Stokes
h(+vib)h
Estado Virtual
Stokes
vib
h h(-vib)
Estado Virtual
Rayleigh
h
Estado Virtual
Infravermelho
h
Estado Virtual
Capítulo III – Caracterização do filme polimérico Parte I
28
naquele local e assim identificar em instantes que material está sendo observado. O
diâmetro reduzido do feixe permite a determinação da composição em amostras de
tamanhos muito reduzidos (< 2,5 µm), permitindo uma análise quase que pontual.131
III.1.4. Microscopia de Força Atômica (AFM)
AFM é uma técnica que permite a observação da topografia da superfície com
uma resolução da ordem de nanômetros. O princípio de funcionamento do AFM
baseia-se na varredura da superfície da amostra por um cantilever flexível de
comprimento entre 100 a 200 μm integrado com uma ponta piramidal (ponteira)
geralmente com menos de 20 nm de diâmetro. A sonda (ponteira + cantilever) é um
componente básico e, para alcançar a resolução atômica, a ponta tem que terminar
em um conjunto de átomos. A força de interação entre a ponta e a superfície da
amostra faz com que o cantilever se aproxime ou se afaste da superfície, e essa
deflexão é proporcional à força de interação. Quando a ponteira se aproxima da
amostra, é primeiramente atraída pela superfície, devido a uma gama de forças
atrativas existentes na região, como as forças de van der Waals. Esta atração
aumenta até que, quando a ponteira aproxima-se muito da amostra, os átomos de
ambas estão tão próximos que seus orbitais eletrônicos começam a se repelir. Esta
repulsão eletrostática predomina sobre a força atrativa e à medida que a distância
diminui, as forças se tornam mínima, correspondendo a distância entre os átomos
(na ordem de alguns ângstrons, na ordem da distância característica de uma ligação
química). Podemos dizer que os átomos da ponteira e da amostra estão em contato
quando as forças repulsivas predominam.
Um espelho presente na parte superior da haste, reflete a luz de um feixe de
laser. Após a reflexão, o feixe de laser passa por uma lente e incide sobre um
fotodetector (fotodiodo) de quatro quadrantes, que mede as variações de posição e
de intensidade da luz produzida pelas deflexões do cantilever. À medida que a ponta
varre a amostra ou a amostra é deslocada sob a ponta, os diferentes tipos de
“acidentes geográficos” encontrados sobre a superfície fazem com que a interação
mude. As variações das interações são os fatores que provocam as diferentes
deflexões. Essas diferenças, captadas no detector, são armazenadas e processadas
por um computador, que as transformam em imagens topográficas da superfície bi e
tridimensionais. A força mais comumente associada com a AFM na deflexão do
cantilever é a força de van der Waals.
Capítulo III – Caracterização do filme polimérico Parte I
29
A técnica de AFM pode ser operada em três modos diferentes: contato,
não-contato e contato intermitente (tapping). No modo contato, o cantilever é
mantido a poucos ângstrons da superfície da amostra e a força interatômica entre a
ponta e a amostra é repulsiva. Neste modo de operação, a ponta faz um leve
“contato físico” com a amostra, produzindo imagens com alta resolução, mas a
compressão e as forças geradas, entre a ponta e a superfície, podem causar danos
à amostra, o que é especialmente prejudicial às amostras biológicas, as quais são
sensíveis e nem sempre estão fortemente aderidas ao substrato. No modo de
não-contato, o cantilever é mantido entre dezenas a centenas de ângstrons da
superfície da amostra, e a força interatômica entre a ponta e a amostra é atrativa.
Neste caso, a ponta oscila em alta frequência (100 kHz a 1 MHz) acima da
superfície, e a força total entre a ponta e a amostra é muito baixa, geralmente em
torno de 10-12 N. Esta oscilação aumenta consideravelmente a sensibilidade do
microscópio, o que faz com que forças de van der Waals e forças eletrostáticas
possam ser detectadas. O modo de não contato não sofre os efeitos do atrito sobre a
amostra, causado pela ponta, conforme é observado no modo contato após diversas
varreduras. Por outro lado, este modo não tem encontrado aplicabilidade geral,
devido à instabilidade entre a ponta e as forças adesivas da superfície, e a resolução
reduzida pela distância ponta-amostra, que é relativamente grande. Esta limitação
tem sido contornada com a utilização do modo intermitente. Este modo é similar ao
de não-contato, exceto pelo fato de que a ponta vibrante fica mais próxima da
amostra, de forma que tenha um contato intermitente, e é utilizado para contornar as
limitações impostas pelo modo contato. A comparação das imagens nos modos
contato e intermitente mostra que as superfícies são menos modificadas no modo
intermitente.
III.1.5. Voltametria Cíclica
A voltametria é uma técnica eletroanalítica que se baseia nos fenômenos que
ocorrem na interface entre a superfície do eletrodo de trabalho e a camada fina de
solução adjacente a essa superfície. Essa técnica é classificada como dinâmica, pois
a célula eletroquímica é operada na presença de corrente elétrica (i > 0) que, por sua
vez, é medida em função da aplicação controlada de um potencial. Assim, nessa
técnica, as informações sobre o analito são obtidas por meio da medida da
Capítulo III – Caracterização do filme polimérico Parte I
30
magnitude da corrente elétrica que surge no eletrodo de trabalho ao se aplicar um
potencial entre um eletrodo de trabalho e um contra-eletrodo.
O experimento de voltametria cíclica (VC) consiste numa varredura cíclica de
potencial, controlada por um potenciostato, registrando-se a resposta de corrente.
Essa varredura é caracterizada por um potencial inicial (Figura 12), um potencial de
inversão e um potencial final com uma determinada velocidade de varredura. Para
conseguir isso, se aplica uma voltagem chamada onda triangular à célula eletrolítica.
A Figura 12 mostra o padrão típico da excitação do sinal para a técnica de
voltametria cíclica. A faixa de variação do potencial aplicado deve ser aquela onde a
espécie em análise é eletroativa e o solvente é estável. Dependendo do analito
pode-se fazer apenas um ciclo ou múltiplos ciclos. Um voltamograma cíclico é obtido
pela medida de corrente sobre o eletrodo de trabalho (E.T.) durante a variação de
potencial (gráfico de corrente em função do potencial). A corrente pode ser
considerada o sinal responsável pelo sinal de excitação do potencial.
Figura 12: Típica excitação do sinal para voltametria cíclica, potencial na forma de
onda triangular.
0 10 20 30 40
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
-0,2E
inversão
Ciclo 1
Efinal
E / V
(E
CS
)
Tempo / s
Einicial
Capítulo III – Caracterização do filme polimérico Parte I
31
A reação eletroquímica de interesse ocorre no eletrodo de trabalho e a
corrente elétrica devido à transferência de elétron a partir ou para o eletrodo é
controlado pelo potenciostato, contrabalanceando o processo faradaico que ocorre
no eletrodo de trabalho, com uma transferência de elétrons na direção oposta.
Finalmente, o voltamograma obtido é um gráfico de corrente em função do potencial
aplicado.
Capítulo III – Caracterização do filme polimérico Parte I
32
III.2. Objetivo específico
O objetivo do trabalho apresentado neste capítulo consistiu nas
caracterizações estrutural e morfológica do filme Ppi-AB (polipirrol dopado com o
indicador azul de bromofenol). Além disso, objetivou-se o estudo das interações
entre polipirrol e o azul de bromofenol em diferentes níveis de oxidação do polímero
e diferentes pH. Para isso, foram utilizadas medidas espectroeletroquímicas de
Raman e UV-Vis in situ. Voltametria cíclica também foi utilizada para verificar o
comportamento eletroquímico do filme Ppi-AB.
Capítulo III – Caracterização do filme polimérico Parte I
33
III.3. Parte Experimental
III.3.1. Materiais, Reagentes e Equipamentos
Materiais
Eletrodos de trabalho: vidro recoberto com filme de óxido de estanho dopado com
flúor (FTO-vidro), Flexitec Ltda. (Brasil), resistência de 20 .cm-2 com espessura
total de 175 m e área delimitada de 1 cm2 e vidro recoberto com filmes de ouro com
espessura de 100 nm e 5 nm de cromo depositado entre ouro e vidro para ajudar na
aderência do filme de ouro ao substrato, EMF (Evaporated Metal Films, Ithaca, Nova
Iorque, EUA).
Eletrodo de referência: Ag|AgClCl-(sat) Aldrich Inc., diâmetro de 0,25 mm, pureza de
99,99% e calomelano saturado (ECS).
Contra-eletrodo: fio de platina, Degussa S. A., diâmetro de 0,5 mm, pureza de
99,99% e placa de platina de 1,0 x 1,5 cm (99,99% pureza, Platilab Ltda).
Reagentes
Pirrol (Pi) (Aldrich, p.a.), destilado sob vácuo e armazenado em atmosfera de nitrogênio
a T 4C.
Azul de bromofenol (AB) (Aldrich), usado como recebido.
Hidróxido de sódio (98%, Sigma-Aldrich), usado como recebido.
Ácido fosfórico (85%, Merck), usado como recebido.
Ácido nítrico (70%, Synth), usado como recebido.
Ácido clorídrico (Synth, p.a.), usado como recebido.
Fosfato de potássio (99%, Nuclear), usado como recebido.
Fosfato monobásico de sódio (99,0%, Sigma-Aldrich), usado como recebido.
Fosfato dibásico de sódio (99,99%, Aldrich), usado como recebido.
Água deionizada (18,1 Mcm, Barnstead) foi utilizada para a preparação das
soluções.
Equipamentos
Para a síntese do Ppi-AB, deposição de Pt e investigações eletroquímicas,
utilizou-se um potenciostato/galvanostato AUTOLAB, modelo PGSTAT-30. Para
termostatização da célula durante as sínteses, foi utilizado um acessório de controle
Capítulo III – Caracterização do filme polimérico Parte I
34
de temperatura Tecnal modelo TE-184. Na calibração das soluções tampão foi
utilizado um pHmetro HANNA Instruments, modelo HI 9321.
Para medidas de espessura utilizou-se um perfilômetro Veeco, modelo
Dektak 3.
Medidas de EDS foram feitas utilizando um Sistema Noran Six, modelo
6714A-1SUS-SN (Thermo Electron Corp.) acoplado a um microscópio eletrônico de
varredura Jeol JSM 6360-LV. A espectroscopia no infravermelho foi realizada
utilizando um espectrofotômetro FTIR-ATR BOMEM, modelo MB-100. Durante as
medidas in situ foi utilizado um espectrofotômetro miniaturizado com fibra óptica
USB2000 (Ocean Optics) e um microscópio Olympus BHSM.
Para os espectros Raman utilizou-se um laser He-Ne (Melles Griot) com
emissão em 633 nm e um laser diodo (Melles Griot) com emissão em 785 nm. Uma
lente de 50X com longa distância de trabalho e abertura numérica de 0,55 foi
utilizada para focar a luz sobre a amostra. Trabalhou-se no modo reflexão, desta
forma a mesma lente objetiva foi utilizada para incidir e coletar a radiação. Um filtro
notch Kaiser foi utilizado para filtrar a luz espalhada. A radiação restante foi
direcionada através de um espectrógrafo Kaiser Holospec f/1,4 acoplado a um
detector CCD Andor (modelo DV-401-BV). Uma célula eletroquímica de 3 eletrodos
com uma janela de vidro com 0,2 mm de espessura foi utilizada durante o
experimento. A luz incidente foi focada através da janela de vidro em direção ao
filme de polipirrol para as medidas in situ. Durante as medidas de UV-Vis, uma fonte
de halogênio foi utilizada, conforme o arranjo experimental mostrado na Figura 13.
O equilíbrio do sistema foi alcançado com a estabilização da corrente
correspondente a um potencial específico antes de cada espectro (Raman ou
UV-Vis).
Capítulo III – Caracterização do filme polimérico Parte I
35
Figura 13: Arranjo experimental para as medidas espectroeletroquímicas e Raman in
situ.
III.3.2. Modificação do eletrodo de FTO-vidro por eletrodeposição de
platina
A modificação do eletrodo de FTO-vidro foi realizada após observar-se a
perda de estabilidade do filme de Ppi quando exposto a processos de
oxidação/redução sobre este substrato. De acordo com a literatura,132 essa perda de
estabilidade pode ocorrer devido à degradação do material durante os processos
redox e/ou perda de aderência do filme ao eletrodo de FTO-vidro por “estresse
mecânico”. Buscando a solução para este problema, previamente à
eletropolimerização dos filmes de Ppi-AB, realizou-se a modificação do eletrodo de
FTO-vidro por eletrodeposição de Pt, utilizando solução de H2PtCl6.6H2O (ácido
hexacloroplatínico) com a finalidade de aumentar a aderência do filme à superfície do
eletrodo, uma vez que o filme se desprendia após a aplicação de potenciais de
oxidação e redução.
O H2PtCl6.6H2O foi obtido da seguinte forma:133
Uma chapa de platina (1,0557 g) foi limpa com ácido nítrico concentrado a
quente (60°C) durante 2h. Posteriormente a platina foi enxaguada com água
deionizada e submetida à ignição usando um bico de Bunsen. A platina foi então
Fonte de halogênioLaser He-Ne
UV-VisRaman
Filtro Notch Fibra óptica
Lente objetiva
Plataforma de translação
Potenciostato
Capítulo III – Caracterização do filme polimérico Parte I
36
dissolvida, com agitação e aquecimento (60°C) em 20 mL de água-régia
(3:1 HCl:HNO3) utilizando um sistema de refluxo durante 7 dias. Após a dissolução, os
ácidos foram evaporados utilizando-se um rota-evaporador, sendo que o resíduo foi
lavado quatro vezes com porções de 20 mL de HCl concentrado. O resíduo final, um pó
marrom escuro é o ácido hexacloroplatínico. Este ácido foi então dissolvido em 100 mL
de água deionizada, guardado em frasco âmbar, fechado e vedado com parafilme.
Os eletrodos de FTO-vidro foram cortados de forma retangular (3 cm x 1 cm) e
limpos utilizando solução aquosa contendo detergente comercial em banho de
ultra-som por 25 min. Em seguida foram enxaguados com água deionizada e o banho
de ultra-som foi novamente utilizado para os eletrodos imersos em acetona.
Novamente foram enxaguados com água deionizada e finalmente secos em estufa a
80°C. Após a secagem realizou-se a eletrodeposição galvanostática de Pt com uma
corrente de -2,0 mA durante 60 s à temperatura ambiente (ca. 25°C) sobre uma área
delimitada com fita adesiva de 1,0 cm2. Posteriormente realizou-se a deposição de um
filme fino de Ppi com área delimitada de 1,0 cm2.
III.3.3. Síntese dos filmes de polipirrol
As eletropolimerizações dos filmes foram realizadas através de voltametrias
cíclicas entre -0,3 e 1,3 V (a 10°C) sobre a superfície do eletrodo de FTO-vidro e
Au-vidro de área 1,0 cm2. Para isto utilizou-se soluções aquosas contendo
0,05 mol.L-1 de pirrol (Pi) e 0,4 mmol.L-1 do corante azul de bromofenol (AB). Para
comparação, realizou-se a síntese do Ppi na presença de um eletrólito bastante
usado e conhecido, o LiClO4 (0,1 mol.L-1). A velocidade de varredura para as
sínteses foi de 20 mV.s-1 e a espessura dos filmes foi variada através do número de
ciclos de síntese. Na Figura 14 está o voltamograma cíclico de síntese do Ppi-AB,
onde uma solução aquosa contendo somente o monômero Pi e o dopante AB foi
utilizada como eletrólito.
Capítulo III – Caracterização do filme polimérico Parte I
37
Figura 14: Voltamograma cíclico durante a síntese do Ppi-AB. Velocidade de
varredura 20 mV.s-1. Segunda varredura.
-0,3 0,0 0,3 0,6 0,9 1,2
0,0
2,5
5,0
7,5
10,0
12,5
15,0
i /
A
E / V vs. ECS
B
Capítulo III – Caracterização do filme polimérico Parte I
38
III.4. Resultados e Discussão
III.4.1. Medidas de Espessura
A espessura do filme polimérico deve ser otimizada pois é um parâmetro que
afeta diretamente o tempo de resposta óptico do sensor. A Figura 15 apresenta as
espessuras medidas para os filmes de Ppi-ClO4 e Ppi-AB, as quais foram
controladas através do número de ciclos utilizados durante a eletropolimerização.
Comparando-se filmes sintetizados com o mesmo número de ciclos voltamétricos,
observa-se que os filmes Ppi-ClO4 são mais espessos que os de Ppi-AB. Esse fato
deve ser devido à maior mobilidade do dopante ClO4- comparado com o ânion AB
(Figura 10) durante o processo de síntese.
Figura 15: Espessura dos filmes Ppi-ClO4 e Ppi-AB variando o número de ciclos
utilizado durante a síntese eletroquímica por voltametria cíclica vs ECS.
Como esperado, observou-se que é possível ter um bom controle da
espessura do filme utilizando a síntese eletroquímica. Experimentos de variação de
absorbância ( = 584 nm) em função do pH do meio foram executados para os
1 2 3 4 5
0,21
0,24
0,27
0,30
0,33
5
10
15
20
Esp
essu
ra /
m
Número de Ciclos da Voltametria Cíclica
Ppi-ClO4
Ppi-AB
Capítulo III – Caracterização do filme polimérico Parte I
39
diferentes filmes (Figura 16), onde foi possível constatar que os filmes sintetizados
com 3 ciclos voltamétricos, com aproximadamente 0,23 μm de espessura
apresentam maior contraste de cor em função da mudança de pH. Por este motivo,
filmes sintetizados com 3 ciclos foram à partir deste ponto, utilizados para o
desenvolvimento do sensor.
Figura 16: Contraste óptico em função do pH para filmes de Ppi-AB sintetizados
eletroquimicamente com diferentes números de ciclos durante a voltametria cíclica.
Absorbâncias correspondentes a 584 nm.
III.4.2. FTIR-ATR e EDS-MEV
Com a finalidade de confirmar a inserção das moléculas de AB na matriz
polimérica do Ppi, foram realizadas análises de espectroscopia na região do
infravermelho com acessório de reflexão total atenuada (FTIR-ATR) dos filmes
Ppi-AB e Ppi-ClO4 depositados sobre FTO-vidro/Pt. (Obs.: para o indicador AB foram
preparadas pastilhas de KBr).
De acordo com a Figura 17, verifica-se a presença de algumas bandas
atribuídas ao polipirrol,134 dentre elas: 1700 cm-1 que ocorre devido à uma série de
2 4 6 8 10
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Ab
so
rbâ
ncia
/ u
ni. a
rb.
pH
1 ciclo
3 ciclos
5 ciclos
Capítulo III – Caracterização do filme polimérico Parte I
40
vibrações, como: deformações C-N-C no plano e deformação angular N-H do anel no
plano; 1040 cm-1 que é uma banda de natureza complexa de vibrações fora do
plano, podendo ser atribuída à deformação angular C-H do anel, deformação angular
do N-H do anel, deformação C-N-C do anel e, finalmente, em 930 cm-1 que é
relacionada ao estiramento da ligação C=C, estiramento C-C no anel, estiramento
C-N e deformação C=C-N no plano. Com relação ao indicador AB, a presença de
algumas bandas evidencia sua presença na matriz polimérica. Dentre estas bandas
estão:135 1476 e 810 cm-1, atribuídas aos benzenos vicinais substituídos e a
1290 cm-1, atribuída à ligação C-O do grupo hidróxi ligado ao anel aromático. No
espectro do filme polimérico contendo o corante AB, esta banda desloca-se para
região de maior energia, sugerindo uma interação química forte entre o polímero e o
indicador.
Figura 17: Espectros de FTIR-ATR para filmes de Ppi-ClO4, Ppi-AB e para o
indicador AB.
Visualizando os espectros, verificamos que as bandas características do
indicador não são tão intensas no espectro do Ppi-AB quanto no espectro do AB,
sugerindo que a quantidade de indicador presa na matriz polimérica é relativamente
1750 1500 1250 1000 750
O
S
OH
Br
BrO
O
BrBr
OH
H
HN
N
1040 930
8101290
1476
Tra
nsm
itância
/ u
ni.arb
.
Número de onda / cm-1
Ppi-ClO4
Ppi-AB
AB
1700
Capítulo III – Caracterização do filme polimérico Parte I
41
pequena quando comparada com a do polímero. Na tentativa de quantificar a
proporção destes materiais, foram realizadas análises de espectroscopia de energia
dispersiva por microscopia eletrônica de varredura (EDS-MEV).
A microssonda de raios-X acoplada ao microscópio eletrônico de varredura,
permitiu a análise da distribuição de átomos de nitrogênio (presente nos anéis
pirrólicos) e de átomos de bromo (presente nas moléculas de AB). Os mapeamentos
destes átomos para o filme Ppi-AB estão apresentados na Figura 18. Pode-se
observar que o polímero está distribuído uniformemente sobre o substrato e ainda
que a dopagem ocorre de forma homogênea, já que o bromo, presente no corante
(dopante), apresenta-se uniformemente distribuído.
Figura 18: a) Imagem por MEV para o filme Ppi-AB. Mapeamento por EDS da
superfície do filme Ppi-AB, sendo b) distribuição de átomos nitrogênio e
c) distribuição de átomos bromo.
Na Figura 19 estão as intensidades dos picos de cada átomo presente na
amostra Ppi-AB. Observa-se também a presença de átomos contituintes do FTO e
do vidro, como Si, In e Sn. A presença destes átomos no espectro indica que neste
caso, a técnica de EDS, apesar de ser um método de análise de superfície, pôde ser
utilizada para indicar a composição do bulk, pois a profundidade de penetração do
feixe (ca. 1 μm),136 é maior do que a espessura do filme Ppi-AB (0,23 μm).
Capítulo III – Caracterização do filme polimérico Parte I
42
Figura 19: Intensidades dos picos de N e Br no espectro de EDS da amostra de
Ppi-AB eletropolimerizado sobre FTO-vidro.
Através do espectro de EDS (Figura 19) obtiveram-se os resultados
quantitativos relacionados à composição atômica destes átomos para o filme Ppi-AB.
Esta análise (Tabela 1) mostrou uma proporção de ca. 15% de nitrogênio para 6%
de bromo (porcentagens atômicas). Considerando que cada molécula de AB possui
4 átomos de bromo, um cálculo simples mostra que existe 1 molécula de AB para
cada 9 unidades repetitivas de pirrol. Estes resultados sugerem que de fato, o
corante atua como um agente compensador de carga (dopante) no Ppi.
In
N
F
O
Br
SiSn
S
S
Cl
Cl
Sn
In
SnIn
In
In
In
0
100
200
300
400
500
600
700In
tensid
ade
/ uni. a
rb.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
keV
Capítulo III – Caracterização do filme polimérico Parte I
43
Tabela 1: Análise quantitativa por EDS dos átomos presentes no Ppi-AB
eletropolimerizado sobre FTO-vidro.
Elemento % Massa % Atômica Erro
N K 4,65 14,75 +/- 1,29
O K 19,15 53,15 +/- 1,62
F K 0,00 0,00 +/- 0,00
Si K 0,34 0,54 +/- 0,15
S K 0,66 0,91 +/- 0,16
Cl K 0,47 0,59 +/- 0,13
Br L 11,51 6,40 +/- 0,29
In L 0,82 0,32 +/- 0,31
Sn L 62,40 23,35 +/- 0,67
Total 100,00 100,00
III.4.3. Microscopia de Força Atômica (AFM)
Utilizando a microscopia de força atômica (AFM), investigamos a morfologia e
uniformidade das superfícies dos filmes de Ppi-AB e Ppi-ClO4, sintetizados sobre
FTO-vidro com Pt previamente depositada. As propriedades físicas e químicas dos
materiais poliméricos podem sofrer grandes alterações com a mínima variação em
seus processos de síntese e deposição, por exemplo, com a mudança do dopante
de ClO4- para AB.
A Figura 20 apresenta as imagens de AFM para o Ppi-AB e Ppi-ClO4. Com a
incorporação do indicador AB na matriz polimérica de Ppi, observou-se a
modificação do tamanho e forma dos grânulos, comparando-se com Ppi-ClO4,
apresentando diâmetros e formas variadas, que resultou na diminuição da
rugosidade média quadrática (Rms) na superfície, de 69 para 40 nm.
Apesar do Ppi-AB possuir grânulos menores que o Ppi-ClO4, o que poderia
favorecer o aumento da rugosidade, estes se encontram bem empacotados,
resultando em menor rugosidade.
Capítulo III – Caracterização do filme polimérico Parte I
44
Figura 20: Imagens de AFM na escala de 2,55 μm x 2,55 μm para o Ppi-AB e
2,81 μm x 2,81 μm para o Ppi-ClO4. Rms = rugosidade média quadrática.
A aderência do filme é um fator importante a ser considerado, sendo que o
desprendimento dos filmes pode acarretar um comportamento falho em seu
desempenho. A aderência depende bastante dos procedimentos de limpeza e da
rugosidade do substrato. Uma maior rugosidade pode aumentar a aderência de um
filme (maior área de contato) ou, por outro lado, pode gerar defeitos de cobertura
prejudicando a formação dos filmes. Experimentalmente, verificou-se que a
aderência do filme Ppi-AB foi melhorada em relação aos filmes de Ppi-ClO4. Como o
substrato utilizado é o mesmo para ambos os casos, podemos sugerir que esta
maior adesão esteja relacionada com a granulometria dos materiais obtidos, já que o
Ppi-AB possui granulometria de tamanho variado com aglomerados de partículas
menores comparadas com a do filme Ppi-ClO4, permitindo que haja uma maior área
de contato entre o filme polimérico e o substrato.
A Figura 21 apresenta as imagens de AFM correspondentes ao Ppi-AB e
Ppi-ClO4, onde é possível visualizar a diferença de fase na superfície da amostra.
Com relação ao Ppi-ClO4, praticamente não ocorre esta diferença de fase, que é
relativa à dureza da superfície, sendo a superfície bastante homogênea. Com
relação ao Ppi-AB é bem nítida a presença de diferentes fases na amostra, o que
pode estar associado com o processo de polimerização utilizando um íon dopante de
baixa mobilidade.
276.01
[nm]
0.001.00 um 2.55 x 2.55 um
ppi-bpb p83b-pt21
472.13
[nm]
0.001.00 um 2.81 x 2.81 um
ppi-clo4 p83b-pt71
Ppi-AB Ppi-ClO4
2,55 x 2,55 μm 2,81 x 2,81 μm1,00 μm 1,00 μm
Rms = 40,75 nm Rms = 69,05 nm
472,13
276,01
[nm]
0,00 0,002,81 x 2,81 μm
Capítulo III – Caracterização do filme polimérico Parte I
45
Figura 21: Imagens de AFM (diferença na dureza da superfície) na escala de
2,52 x 2,52 μm para Ppi-AB e 2,81 x 2,81 μm para Ppi-ClO4.
III.4.4. Voltametria Cíclica (VC)
Foram obtidos os voltamogramas cíclicos para os filmes de Ppi-ClO4 e Ppi-AB
sintetizados sobre ouro. A faixa de potencial foi variada entre -0,6 e 0,9 V com
velocidade de varredura de 20 mV.s-1. A Figura 22 mostra os voltamogramas para o
Ppi-ClO4 e Ppi-AB medidos em pH 1,5 e 7,5. O polipirrol apresentou comportamento
eletroquímico dependente do pH, com maior corrente faradaica em menores valores
de pH (note a alta corrente em pH 1,5 na Figura 22a). Esta dependência já foi
descrita na literatura,137 sendo atribuída principalmente à desprotonação do Ppi em
soluções alcalinas, que diminui o nível de oxidação e portanto o nível de dopagem
do polímero (diminuição da eletroatividade), consequentemente, com a
desprotonação do polímero, o contra-íon aniônico move-se da matriz polimérica em
direção ao eletrólito. Por outro lado, em soluções ácidas, as cadeias de Ppi estão
altamente protonadas, permitindo que o íon dopante mova-se para o interior da
matriz polimérica, restaurando a neutralidade de carga.138-140
-0.27
[V]
-6.171.00 um 2.52 x 2.52 um
ppi-bpb p83b-pt21
-2.74
[V]
-6.681.00 um 2.81 x 2.81 um
ppi-clo4 p83b-pt71
Ppi-AB Ppi-ClO4
1,00 μm 1,00 μm2,52 x 2,52 μm 2,81 x 2,81 μm-6,17 -6,68
-0,27
[V]
-2,74
[V]
Capítulo III – Caracterização do filme polimérico Parte I
46
Figura 22: Voltamogramas cíclicos do a) Ppi-ClO4 e b) Ppi-AB em pH 1,5 e 7,5. Em
detalhe: voltamograma cíclico do AB em pH 1,5. Solucão tampão fosfato foi utilizada
como eletrólito. Velocidade de varredura de 20 mV.s-1.
Outra característica interessante na Figura 22a é a diminuição constante do
potencial de oxidação do Ppi quando o filme é condicionado em meios mais
alcalinos, mudando de +0,0 V (pH 1,5) para -0,3 V (pH 7,5) no caso do Ppi-ClO4.
Durante o processo de oxidação, os íons presentes no eletrólito migram para o
interior da matriz polimérica com a finalidade de estabilizar as cargas geradas.140 A
alta atividade dos íons OH- em soluções alcalinas fornece uma contribuição extra
para a estabilização da forma oxidada do Ppi, abaixando o potencial de oxidação
(este comportamente será discutido com mais detalhes na discussão da Figura 22b).
Tendências similares à descrita acima foram obtidas para Ppi auto-dopado (poli(3-
carboximetilpirrol)).141 Também neste caso, uma diminuição do potencial de oxidação
foi observado com o aumento do pH (até pH 6).
De acordo com a Figura 22b, o Ppi-AB apresenta um comportamento
eletroquímico diferente do apresentado pelo Ppi-ClO4. Em pH baixo, o par redox em
0,7/0,6 V (destacado na Figura 22) é evidente no voltamograma do Ppi-AB. Os
voltamogramas do AB em solução tampão de pH 1,5, também apresentaram um par
-0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8
-1,2
-0,6
0,0
0,6
1,2
1,8
2,4
-0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8
-0,1
0,0
0,1
0,2
0,5 0,6 0,7 0,8 0,9
i / m
A
E / V vs. Ag|AgCl
AB
- 0,3 V
pH 1,5
pH 7,5
i / m
A
E / V vs. Ag|AgCl
a) Ppi-ClO4
Eoxi
0,0 V
+ 0,6 V
+ 0,7 V
(i)
(ii)
(i)
b) Ppi-AB
pH 1,5
pH 7,5
(ii)
Capítulo III – Caracterização do filme polimérico Parte I
47
reversível em ca. 0,7/0,6 V (em detalhe na Figura 22), portanto, este par redox do
filme pode ser diretamente relacionada ao processo redox do AB. Além disso, dois
novos processos (i) e (ii) observados em 0,5/0,4 V e -0,2/-0,3 V, respectivamente,
não foram previamente observados para o Ppi e também não para o AB. Assume-se
que estes novos processos sejam resultados da interação entre o corante e o
polímero. O potencial de oxidação em -0,2 V podem resultar de uma estabilização
mais eficiente dos cátions na cadeia de Ppi pelas moléculas de corante presas na
matriz polimérica. As espécies negativamente carregadas do corante (Figura 10)
interagem com o Ppi oxidado (positivamente carregado), atuando como dopante e
esta interação estabiliza a cadeia polimérica no estado oxidado, diminuindo o
potencial de oxidação. Em pH 7,5 o processo redox relacionado ao AB (0,7/0,6 V) no
filme Ppi-AB (Figura 22b) não é tão evidente quanto em pH 1,5. Um pequeno
deslocamento para potenciais mais catódicos foi observado para o pico de oxidação
do AB em solução alcalina. As VCs do Ppi-AB em pH 7,0; 8,0 e 11,0, apresentaram
comportamento similar ao pH 7,5.
III.4.5. Caracterização in situ
Nesta seção, serão discutidos os resultados obtidos através das
caracterizações espectroeletroquímicas in situ. Para isso utilizou-se técnicas
espectroscópicas (Raman e UV-Vis) e eletroquímicas (cronoamperometria –
aplicação de potencial em função do tempo) objetivando a obtenção de informações
à nível molecular sobre as características do filme de Ppi dopado com AB.
III.4.5.1. UV-Vis
O espectro de absorção do AB e de suas formas desprotonadas (AB- e AB2-)
em solução, foram coletados em diferentes pHs (Figura 23). O espectro de absorção
do corante em solução apresenta duas bandas dependentes do pH, em 435 e
580 nm. A atribuição destas bandas não é bem descrita na literatura, já que uma só
banda tem sido relacionada a diferentes formas do corante AB.142-146
Capítulo III – Caracterização do filme polimérico Parte I
48
Figura 23: Espectros UV-Vis do corante AB solubilizado em solução tampão fosfato
de pH 1,5; 3,0; 7,0; 7,5; 8,0 e 11,0.
O corante AB possui diferentes colorações no espectro visível, quando está
solubilizado em soluções tamponadas de diferentes pHs. Baseando-se nesta
propriedade, utilizamos a roda de cores de Newton durante as atribuições das
bandas, já que a cor observada em uma espécie pode trazer informações sobre sua
correspondente faixa de comprimento de onda de absorção através de sua cor
complementar (maiores detalhes serão dados no Capítulo IV). Desta forma as
soluções amarela, vermelha e azul deveriam ter absorção entre 400 e 430 nm, entre
490 e 560 nm e entre 560 e 620 nm, respectivamente.147
A Figura 24 mostra os espectros obtidos durante as medidas in situ para o
Ppi-AB em pH 1,5; 3,0; 7,5 e 11,0. Os espectros apresentam dois picos principais em
ca. 600 e 700 nm. Esta banda em 700 nm é atribuída à transição do estado polaron
ligante para os estados polaron antiligantes do Ppi.20 A banda em ca. 600 nm é
atribuída à forma AB2-. Em ambos os pHs, (1,5 e 3,0, Figura 24a e b,
respectivamente), a absorção desta banda aumenta quando o potencial se torna
mais anódico. A absorção em ca. 700 nm é também dependente do potencial em
400 450 500 550 600
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,011,0
8,0
7,5
7,0
3,0
Ab
so
rbâ
ncia
/ u
ni.a
rb.
Comprimento de onda / nm
1,5
a)
AB
AB-
AB2-
Capítulo III – Caracterização do filme polimérico Parte I
49
meio ácido, aumentando sua intensidade com o aumento do nível de oxidação do
Ppi. Esta banda em pH 1,5, é sempre mais intensa do que a banda relacionada à
forma AB2- do dopante, entretanto, em pH 3,0, a banda relacionada ao corante
(600 nm), se torna mais intensa do que a banda do Ppi (700 nm) na escala de
potencial entre -0,4 e + 0,2 V. Uma banda em 525 nm também é observada em
pH 3,0, podendo ser atribuída à transição da banda de valência para o estado
polaron antiligante no Ppi11 ou à forma mono carregada do corante (AB-), ou
provavelmente é resultante da sobreposição de ambas as absorções.
Comparando-se o comportamento do Ppi-AB em meio ácido, nota-se que ocorre
mudanças drásticas no seu comportamento óptico quando este é imerso em pH 7,5,
como mostrado na Figura 24c. A absorção do corante em 600 nm é muito forte e a
banda relacionada à matriz polimérica aparece como um ombro em 700 nm. Embora
ambas as bandas apresentem alguma dependência com o pH, a banda em 600 nm
não muda significantemente em pHs neutro e alcalino (Figura 24c e d). A
dependência dos espectros de UV-Vis do Ppi-AB com o potencial aplicado em pH
7,0; 8,0 (não mostrados) e 11,0 (Figura 24d) são similares aos observados para pH
7,5 (Figura 24c), onde a banda de absorção atribuída ao corante em ca. 600 nm
apresenta pouca dependência com o potencial.
As medidas de UV-Vis apresentadas na Figura 24 fornecem uma idéia sobre
a interação entre o corante e a matriz polimérica. Especificamente, é possível notar a
forte dependência da intensidade da banda em 600 nm (atribuída ao corante na
forma AB2-) com o potencial em soluções mais ácidas. Em baixos valores de pH, o
equilíbrio favorece a forma protonada da espécie, AB. No entanto, mesmo em pH 1,5
e 3,0 (Figura 24a e b), a absorção em 600 nm (devido à forma carregada do corante)
aumenta quando o potencial é variado em direção a valores mais positivos. Pode-se
explicar este comportamento considerando que à medida que o polipirrol é oxidado,
as formas carregadas do corante agem como contra-íons, estabilizando as cargas
positivamente carregadas presentes na cadeia polimérica. Assim, a oxidação do Ppi
afeta diretamente o equilíbrio de dissociação do corante (Figura 10), devido ao
aumento da demanda por contra-íons para a estabilização da cadeia polimérica
durante o processo de oxidação.
Capítulo III – Caracterização do filme polimérico Parte I
50
Figura 24: Espectros UV-Vis para o Ppi-AB imerso em solução tampão fosfato de pH
a )1,5; b) 3,0; c) 7,5 e d) 11,0.
A observação feita para estas medidas estão de acordo com a literatura, já
que estudos utilizando micro-balança de cristal de quartzo mostraram a difusão de
íons presentes no eletrólito em direção à matriz polimérica a fim de alcançar
eletroneutralidade.148,149 Em nosso trabalho, sugere-se que as espécies carregadas
do corante agem como contra-íons e, portanto o equilíbrio da Figura 10 se desloca
buscando compensar a demanda por contra-íons gerada durante a oxidação do Ppi.
Em altos valores de pH, o equilíbrio do corante favorece a forma AB2-, resultando em
uma alta absorção em 600 nm. Além disso, íons OH-, os quais desprotonam as
cadeias de Ppi estão também presentes no meio e contribuem significantemente
para a estabilização das cargas positivas do polímero após a oxidação do filme.
Nestes casos, (pH maior que 7,0), a banda em 600 nm não é significantemente
afetada pelo potencial aplicado, como mostrado na Figura 24c e d.
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
550 600 650 700 750 800 850
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
550 600 650 700 750 800 850
+0,4V
-0,2V
-0,4V
+0,2V
Ab
so
rbâ
ncia
/ u
ni. a
rb.
0,0V
Ppi-AB_pH 1,5
a) b)
Ppi-AB_pH 3,0
+0,4V
-0,2V
-0,4V
+0,2V
0,0V
Ppi-AB_pH 7,5
c)
Comprimentos de onda / nm
+0,4V
-0,2V
-0,4V
+0,2V
0,0V
+0,4V
-0,2V
-0,4V
+0,2V
0,0V
Ppi-AB_pH 11,0
d)
Capítulo III – Caracterização do filme polimérico Parte I
51
Nath e cols.65 estudaram a dependência do pH no interior de microtubos de
Ppi-AB com potencial aplicado. Eles assumiram que a solução de monômero
contendo concentração de AB ≤ 8 x 10-4 mol.L-1 gera um filme com VCs similares à
do filme de Ppi-ClO4. Em outras palavras, a presença do AB no micro-ambiente não
afeta o processo redox do filme polimérico. Estas observações contrastam com os
nossos resultados (Figura 22), os quais mostram um claro efeito do corante no
comportamento redox do filme polimérico na superfície do ouro (neste caso,
utilizou-se uma solução do monômero contendo 4 x 10-4 mol.L-1 de AB).
III.4.5.2. Medidas por espectroscopia Raman
O comportamento do corante durante o processo redox do polímero também
foi avaliado por espectroscopia Raman in situ. A espectroscopia Raman é uma
técnica que tem uma maior especificidade molecular (transições vibracionais) que a
espectroscopia UV-Vis (transições eletrônicas).
A Figura 25 mostra os espectros Raman de soluções aquosas contendo
4,0 x 10-4 mol.L-1 do corante AB em solução tampão (STF) de diferentes pH (1,5; 3,0
e 8,0). Os espectros foram obtidos utilizando um laser com emissão em 785 nm para
evitar a interferência da fluorescência na resposta. As formas AB, AB- e AB2- do
corante foram unicamente caracterizadas, sendo que suas vibrações características
foram usadas como impressões digitais das moléculas, para em seguida confirmar a
presença destas formas específicas do corante preso no filme de Ppi, em um certo
pH e potencial aplicado. A banda em 860 cm-1 é atribuída à deformação angular
(bending) fora do plano da ligação CH do anel aromático,123 e se desloca para
maiores frequências, alcançando 893 cm-1 em pH 1,5. Em pH 3,0, a banda
vibracional relacionada ao estiramento assimétrico do grupo SO32- é observada em
1074 cm-1.150 Esta banda é também atribuída ao grupo PO43-, presente na solução
tampão. Em pH 7,5 e 8,0 esta banda ainda está presente, como esperado, e ainda é
observado uma forte banda em 989 cm-1 relacionada ao “modo de respiração” do
anel benzênico151 e estiramentos simétricos dos grupos SO32- e PO3
2-.
Consequentemente, os modos de vibração em 860, 882 e 893 cm-1 (atribuídos à
deformação angular fora do plano da ligação CH do anel aromático) serão usados
como marcadores para a presença das formas do dopante: AB2-, AB- e AB,
respectivamente.
Capítulo III – Caracterização do filme polimérico Parte I
52
Figura 25: Espectros Raman do corante AB (Azul de Bromofenol) solubilizado em
solução tampão fosfato com diferentes pH. Fonte com emissão em 785 nm.
Os espectros Raman dos filmes Ppi-AB em baixo pH e com diferentes
potenciais aplicados estão apresentados na Figura 26. Os espectros do Ppi-ClO4
com diferentes potenciais aplicados estão mostrados como em detalhe nesta figura
para futuras comparações. Em meio ácido, o espectro do filme Ppi-AB em +0,4 V
(Ppi altamente oxidado) é semelhante ao do Ppi-ClO4,129,152 apresentando duas
bandas intensas em 925 e 1620 cm-1, características do Ppi no estado oxidado. A
intensidade destas bandas diminui com o aumento do potencial catódico. As bandas
em 925 e 1620 cm-1 desaparecem quando valores de potencial mais negativos que
0,1 V são atingidos, sendo substituído por novas bandas em 987 e 1560 cm-1
atribuídos ao Ppi no estado reduzido. Os espectros em potenciais negativos
apresentam algumas diferenças interessantes comparando-se com o espectro do
Ppi-ClO4 no mesmo potencial.
A presença da banda em 1620 cm-1 no espectro do Ppi-AB em meio ácido em
potenciais negativos, sugere um maior nível de oxidação do Ppi no Ppi-AB do que no
Ppi-ClO4 nas mesmas condições.129 Esta observação pode também ser confirmada
800 1000 1200 1400 1600
989
1319
1305
1074
AB2-
AB-
AB
Azul de Bromofenol
Inte
nsid
ad
e /
un
i. a
rb.
Deslocamento Raman / cm-1
860
882
893
pH 8,0
pH 3,0
pH 1,5
Capítulo III – Caracterização do filme polimérico Parte I
53
comparando-se a corrente obtida nas VCs do Ppi-ClO4 e Ppi-AB nas mesmas
condições (Figura 22). Além disso, a banda em 1560 cm-1, atribuída ao estiramento
C=C (característica da forma neutra do polímero), domina o espectro do Ppi-ClO4 em
-0,4 V, sendo muito mais fraca no espectro do filme do Ppi-AB.134,153 Outro
comportamento observado nos espectros do Ppi-AB está relacionado à presença da
banda em 882 cm-1 atribuída à forma AB- do corante (ver Figura 25). Com a
oxidação do Ppi, um novo modo vibracional aparece em 860 cm-1, o qual é
relacionado à forma AB2- do indicador. Um ombro em 893 cm-1 atribuído à forma
neutra AB aparece em +0,2 V. A demanda por cargas negativas na matriz polimérica
afeta o equilíbrio, diminuindo a concentração das espécies neutras no meio. Esta
dependência com o potencial corrobora as análises prévias por UV-Vis, onde foi
mostrado que o corante na forma carregada age como contra-íon, interagindo com a
cadeia polimérica e afetando a posição do equilíbrio ácido-base do corante (Figura
10).
Figura 26: Espectros Raman in situ em pH 3,0 dos filmes de Ppi-AB e Ppi-ClO4 (em
detalhe) aplicando potenciais entre -0,4 V e +0,4 V. Fonte com emissão em 633 nm.
800 1000 1200 1400 1600
800 1000 1200 1400 1600
-0,4 V
-0,2 V
0,0 V
+0,2 V
+0,4 V
Inte
nsi
dade / u
ni.
arb
.
Deslocamento Raman / cm-1
Ppi_pH 3,0
987
882
Ppi-AB_pH 3,0
Inte
nsid
ad
e /
un
i. a
rb.
Deslocamento Raman / cm-1
+0,4V
+0,2V
-0,2V
-0,1V
-0,4V
0,0V 860
925 990925 990
1560 16201560 1620
Ppi-ClO4 _pH 3,0
Capítulo III – Caracterização do filme polimérico Parte I
54
A Figura 27 apresenta os espectros do filme Ppi-AB em pH 7,0. Neste caso,
quantidades significantes de ambos, AB2- e AB, caracterizados respectivamente
pelas bandas em 860 cm-1 e 893-1, parecem coexistir para todos os potenciais
aplicados, de forma similar aos resultados obtidos por UV-Vis (Figura 24). Os
espectros Raman do filme imerso em meio tamponado neutro apresenta um
equilíbrio do corante independente do potencial aplicado, diferente do filme imerso
em meio ácido. Nos espectros Raman do Ppi-ClO4 imerso em pH 8,0 (Figura 27),
nota-se a diminuição da intensidade do modo vibracional relacionado ao estado
bipolaron (1080 cm-1) do polímero comparado com o do Ppi-ClO4 em meio ácido.
Este comportamento é consistente com o efeito de desprotonação no mecanismo de
desdopagem, como discutido nas VCs (Figura 22). Com relação ao Ppi-AB,
observa-se que seu nível de oxidação em meio alcalino não é tão dependente do
potencial aplicado quanto em meio ácido. Em pH > 7,0 o modo vibracional
característico do Ppi no estado intermediário de dopagem,129,154 ca. 950 cm-1, é
observado em todos os espectros do filme condicionado de +0,4 a -0,4 V, assim
como o modo de vibração em 1590 cm-1 (atribuída à forma polaron).129 Sugere-se
que em meio alcalino a presença das formas aniônicas do corante presas na matriz
polimérica mantém o filme em um nível intermediário de oxidação. Estes resultados
sugerem uma diminuição da entrada de íons presentes no eletrólito, na matriz
polimérica, como OH-, os quais podem desprotonar o polímero levando à diminuição
do nível de oxidação, como discutido anteriormente.
Capítulo III – Caracterização do filme polimérico Parte I
55
Figura 27: Espectros Raman in situ em pH 7,0 dos filmes de Ppi-AB e Ppi-ClO4 (em
detalhe) aplicando potenciais entre -0,4 V e +0,4 V. Fonte com emissão em 633 nm.
O filme imerso em pH = 8,0 também apresenta-se independente do potencial
aplicado com relação à razão entre as espécies AB- e AB2-. É interessante destacar
a presença da forma neutra do corante, caracterizado pela presença da banda em
893 cm-1 quando o Ppi-AB é imerso em meio alcalino (Figura 28). Esta forma do
corante (AB) desaparece completamente em soluções com pH > 4,81146 (Figura 23).
A presença desta banda em meio alcalino sugere que ocorre um deslocamento no
pKa155 do corante devido à interação deste com a matriz polimérica. Este é um
exemplo perfeito de como o equilíbrio ácido-base de um indicador é afetado pelo
ambiente que o cerca.
800 1000 1200 1400 1600
800 1000 1200 1400 1600
-0,4 V
-0,2 V
0,0 V
+0,2 V
+0,4 V
Ppi_pH 7,0
Inte
nsi
dade / u
ni.
arb
.
Deslocamento Raman / cm-1
Inte
nsid
ad
e /
un
i. a
rb.
Deslocamento Raman / cm-1
Ppi-AB_pH 7,0
+0,4V
+0,2V
-0,2V
-0,1V
-0,4V
0,0V
860
893
Ppi-ClO4 _pH 7,0
Capítulo III – Caracterização do filme polimérico Parte I
56
Figura 28: Espectros Raman in situ em pH 8,0 dos filmes de Ppi-AB e Ppi-ClO4 (em
detalhe) aplicando potenciais entre -0,4 V e +0,4 V. Fonte com emissão em 633 nm.
A Figura 29 mostra a dependência da intensidade das bandas características
das formas do corante com o nível de oxidação do Ppi-AB em pH 3,0 e 8,0. O
Ppi-AB em pH 3,0 apresenta alta concentração da forma neutra AB no estado
reduzido, a qual diminui com a oxidação do Ppi. Ao mesmo tempo, a concentração
da forma AB2- (a qual não foi observada em -0,4 V) aumenta durante o processo de
oxidação. A comparação destes resultados por Raman com os obtidos por VC para o
Ppi-AB em meio ácido (Figura 22b), confirma que ocorrem mudanças drásticas na
concentração da forma AB dentro da região de potencial relacionada à formação de
cátions (polarons) na cadeia de Ppi.
O Ppi-AB em meio alcalino, em estado reduzido, apresenta bandas bem
definidas em 860 e 893 cm-1, atribuídas às formas AB2- e AB, respectivamente. É
observada uma diminuição sutil de ambas as bandas durante o processo de
oxidação, entretanto a razão entre as formas AB/AB2- praticamente não muda. Estes
resultados corroboram o mecanismo sugerido anteriormente pelos resultados de
UV-Vis (Figura 24), no qual a dependência do equilíbrio AB/AB2- com o potencial foi
800 1000 1200 1400 1600
860
Inte
nsid
ad
e /
un
i. a
rb.
Deslocamento Raman / cm-1
+0,4V
+0,2V
-0,2V
-0,1V
-0,4V
0,0V
860893
860
+0.4V
+0.2V
-0.2V
-0.1V
-0.4V
0.0V
860893
860
Ppi-AB_pH 8,0
+0.4V
+0.2V
-0.2V
-0.1V
-0.4V
0.0V
860893
860
+0.4V
+0.2V
-0.2V
-0.1V
-0.4V
0.0V
860893
860
+0.4V
+0.2V
-0.2V
-0.1V
-0.4V
0.0V
860893
800 1000 1200 1400 1600
-0,4 V
-0,2 V
0,0 V
+0,2 V
+0,4 V
Ppi_pH 8,0
Inte
nsi
dade / u
ni.
arb
.
Deslocamento Raman / cm-1
860
+0.4V
+0.2V
-0.2V
-0.1V
-0.4V
0.0V
860893
Ppi-ClO4 _pH 8,0
Capítulo III – Caracterização do filme polimérico Parte I
57
explicada em termos do aumento da demanda por cargas durante a oxidação do Ppi.
Entretanto, em meio alcalino, devido à alta concentração de espécies aniônicas no
interior da matriz polimérica, a dependência da razão entre as formas do corante
com o potencial não é observada.
Figura 29: Dependência do equilíbrio do corante com o potencial aplicado em pH 3,0
e 8,0. As intensidades analisadas correspondem às bandas em 860 cm-1 (AB2-) e em
893 cm-1 (AB).
Considerando a interação entre as formas aniônicas do corante e a cadeia
polimérica positivamente carregada, seria esperado um aumento do Ka para o
equilíbrio do corante mostrado na Figura 10, diminuindo consequentemente o pKa do
-400 -200 0 200 400
pH 3,0
Inte
nsid
ad
e /
un
i. a
rb.
E / mV
pH 8,0
E / mV vs. Ag|AgCl
AB
AB2-
AB2-
AB
Capítulo III – Caracterização do filme polimérico Parte I
58
sistema. O pKa foi determinado através das intensidades das bandas Raman
relacionadas às diferentes formas do corante AB (860, 882 e 893 cm-1). A razão
entre as formas neutra e monocarregada do corante foi calculada (IAB/IAB- e também
IAB-/IAB) com a finalidade de determinar o pKa para o equilíbrio AB/AB-. Similarmente,
o pKa para o equilíbrio AB-/AB2- foi determinado através das razões IAB-/IAB
2- e
IAB-2/IAB
- (em detalhe Figura 30).
A Figura 30 mostra a razão entre as espécies em função do pH para cada
potencial aplicado. A dependência do pKa com o potencial aplicado é observado
para ambos os equilíbrios. Entretanto, a partir de -0,2 até 0,0 V, a mudança do pKa
não é tão dependente quanto em meio ácido, ao aplicar-se potenciais catódicos.
Esta observação corrobora os dados obtidos através de VC (Figura 22), os quais
mostram o processo redox ocorrendo fora da faixa de potencial entre -0,2 e 0,0 V.
Figura 30: Dependência do pKa do Ppi-AB com o potencial aplicado para os
equilíbrios envolvendo as formas AB e AB- (curva em vermelho) e AB- e AB2- (curva
em azul). Em detalhe: intensidades relativas das bandas Raman atribuídas às
formas AB- e AB2- com potencial aplicado de -0,4 V.
-0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4
3
4
5
6
7
8
2 3 4 5 6 7 8
0,98
0,99
1,00
1,01
1,02
0,98
0,99
1,00
1,01
1,02
IA
B- /
IA
B2-
I AB
2- /
IA
B-
pH
pK
a
E / V vs. Ag|AgCl
Br
BrBr
O
OH
SO3
-
Br
Br
BrBr
O
SO3
-
-O
Br
O
S
OH
Br
BrO
O
BrBr
OH
H+H+
BPB BPB-
BPB2-
pKa = 4.6pKa = 3.0
AB AB-
Br
BrBr
O
OH
SO3
-
Br
Br
BrBr
O
SO3
-
-O
Br
O
S
OH
Br
BrO
O
BrBr
OH
H+H+
BPB BPB-
BPB2-
pKa = 4.6pKa = 3.0
AB- AB2-
Capítulo III – Caracterização do filme polimérico Parte I
59
Levando em conta sensores baseados em polímeros condutores, várias
considerações têm sido feitas com relação ao efeito e transporte de íons no
desempenho do sensor.156,157 Nesse sentido, nosso estudo mostra novas
perspectivas para o desenvolvimento de um sensor eficiente, onde a demanda para
o transporte dos íons presentes na solução pode ser aliviado através das diferentes
formas do corante AB presente na matriz polimérica.
Capítulo III – Caracterização do filme polimérico Parte I
60
III.5. Conclusões Parciais
De acordo com os resultados apresentados neste trabalho, concluímos que a
presença do indicador AB exerceu um efeito significativo sobre as propriedades do
Ppi, sendo que a presença do AB foi evidenciada através das análises de FTIR-ATR,
EDS-MEV, Raman e também por espectrofotometria UV-Vis. Através da análise por
EDS-MEV, foi possível sugerir uma proporção entre dopante e polímero sendo de
uma molécula de AB para cada 9 unidades pirrólicas. A presença do dopante AB
modificou a morfologia do material, permitindo a obtenção de filmes menos rugosos
e mais aderentes. Além disto, o método de deposição eletroquímica permitiu a
obtenção de filmes uniformes com o controle da espessura do filme sintetizado.
Pode-se dizer ainda, que o fato do material ser sintetizado eletroquimicamente
facilitaria a industrialização do sistema, já que fornece um bom controle durante a
síntese, podendo-se obter materiais com propriedades reprodutíveis, sem correr o
risco de obter materiais com características indesejadas.
Adicionalmente, os resultados obtidos por Raman in situ com eletroquímica
mostram uma dependência significante da interação entre corante e polímero tanto
com o pH quanto com o potencial aplicado, onde o equilíbrio de ionização do AB
desloca-se em busca da estabilização das cargas positivas geradas no Ppi oxidado.
Sistemas como esse podem ser usados para minimizar a interferência causada por
íons presentes no eletrólito, minimizando a migração destes íons em direção à matriz
polimérica. Além disso, conhecimentos sobre o ambiente interno do polímero na
química do dopante fornecem novas perspectivas para o desenvolvimento de
sensores de pH baseados em polímeros.
61
Capítulo IV
Caracterização óptica
para aplicação em
sensor de pH
Capítulo IV – Caracterização óptica para aplicação em sensor de pH Parte I
62
IV. Caracterização óptica para aplicação em sensor de pH
IV.1. Introdução
A pesquisa envolvendo sensores ópticos é uma área que tem crescido muito
nas últimas três décadas. Como consequência, durante os últimos anos houve um
avanço significativo no desenvolvimento de sensores e biosensores ópticos para
determinação de espécies de interesse químico e biológico. Além disso, muitos livros
e revisões foram publicados, onde se destacam as vantagens da sensibilidade óptica
comparadas com os outros métodos de transdução.158-162
Trabalhos recentes no campo dos sensores ópticos têm focado a busca por
materiais com baixo custo, o desenvolvimento de dispositivos optoeletrônicos
miniaturizados (fontes de luz e detectores) e a detecção de multi-analitos. Novas
tecnologias têm surgido particularmente na área de biosensores devido aos avanços
na tecnologia de microfluídos e imagens.163 Embora os princípios ópticos usados
nestes sensores não mudaram substancialmente com os anos, em muitos casos as
plataformas de transdução sofreram consideráveis mudanças, gerando sensores
com melhores propriedades, incluindo sensibilidade, estabilidade e seletividade. A
melhora destas propriedades ocorre devido ao design da plataforma, o qual busca o
desenvolvimento de um sensor óptico integrado altamente eficiente que combine a
forma como a luz atinge a amostra e a funcionalidade intrínseca do sensor.
O primeiro sensor com transdução química óptica foi baseado na medida de
mudanças no espectro de absorção e foi desenvolvido para determinação de CO2 e
O2.164 Desde então, uma variedade de sistemas ópticos de detecção estão sendo
utilizados em sensores e biosensores, incluindo entre outros, elipsometria,
espectroscopia (luminescência, fosforescência, fluorescência, Raman),
interferometria (interferometria de luz branca, interferometria modal) e a ressonância
de plasmón de superfície (SPR). Nestes sensores, a quantificação da espécie de
interesse é realizada por medidas do índice de refração, quantidade de luz
absorvida, propriedades fluorescentes das moléculas analisadas ou por um meio de
transdução químico-óptico.165
Medidas de pH são usualmente realizadas utilizando um eletrodo
potenciométrico (eletrodo de vidro), no entanto, em algumas circunstâncias, a
Capítulo IV – Caracterização óptica para aplicação em sensor de pH Parte I
63
determinação de pH utilizando sensores ópticos (optodos) é mais viável.166,167 O
conceito básico do método óptico para medidas de pH consiste no fato que o feixe
de luz incidente passa através do sensor e portanto, interage com o indicador
químico, o qual altera a intensidade do feixe de luz, normalmente por absorção ou
por fluorescência.96 O sinal óptico modificado é guiado para o detector e um
indicador é normalmente confinado no sensor óptico, que pode ser chamado de
optodo.168
Os optodos de pH oferecem vantagens devido a algumas de suas
características favoráveis, como tamanho, imunidade a interferências elétricas,
ausência da necessidade de um sensor de referência, possibilidade de
monitoramento remoto, dentre outras.169-172 Estas características dos sensores
baseados em polímeros condutores explicam o porquê de eles serem os mais
utilizados em conjuntos sensoriais, podendo ser facilmente fabricados com baixo
consumo de energia, podendo também operar em temperatura ambiente.
Apesar das boas características dos optodos de pH, uma limitação é sua
estreita faixa de operação. Isto ocorre porque o optodo não mede diretamente o pH,
mas usualmente, a concentração de um corante indicador em suas formas ácida ou
básica. Deste modo, as medidas dependem do pKa do corante e a escala de pH é
restrita a cerca de 3 a 4 unidades. Então, esforços têm sido empregados para se
desenvolver sensores para um extensa faixa de operação (de pH). Os corantes que
apresentam mudança de coloração com o pH são os indicadores ácido-base mais
comuns, sendo utilizados inicialmente nas titulações volumétricas clássicas.173
Corantes orgânicos como vermelho de fenol,174 vermelho de cresol,175 azul de
bromofenol e outros98,176 têm sido apresentados como indicadores de pH
absorventes ou fluorescentes, enquanto a fluorosceinamina,177 piranina,178 assim
como corantes azo,179 são indicadores de pH tipicamente fluorescentes.
Os indicadores de pH são ácidos fracos com propriedades espectrais distintas
associadas com suas formas protonadas (HInd) e desprotonada (Ind-). As
concentrações das formas HInd e Ind- são relacionadas através da equação de
Henderson-Hasselbach (Equação 3), onde Ka é a constante de dissociação, pKa é
-log Ka, e os colchetes indicam a concentração das respectivas formas.180
Equação 3
𝑝𝐻 = 𝑝𝐾𝑎 + log
𝐼𝑛𝑑−
𝐻𝐼𝑛𝑑
Capítulo IV – Caracterização óptica para aplicação em sensor de pH Parte I
64
Vários materiais foram estudados para permitir a imobilização de indicadores.
Aqueles considerados úteis na imobilização do corante incluem vidros sinterizados
com porosidade controlada,181 materiais poliméricos hidrofóbicos,99 e materiais
hidrofílicos como a celulose182 e a poliacrilamida.183,184 O método de imobilização
que parece ser mais eficiente é aquele onde ocorre ligações covalentes do corante
com uma matriz adequada, proporcionando membranas quase isentas de lixiviação
do corante.174-177 Embora bons resultados foram obtidos com a maioria destes
optodos de pH, eles requerem um método de preparação longo e tedioso, o qual
envolve tratamento da matriz e imobilização do corante.
Polímeros condutores que mudam de cor em função do pH podem ser
empregados no desenvolvimento de optodos com uma extensa faixa de pH.185 Isto é
possível porque esses polímeros são basicamente polieletrólitos com múltiplos
valores de pKa. Existem vários tipos de polímeros, incluindo uma grande variedade
de derivados e, além disso, um grande número de polímeros novos surge todos os
anos. Recentemente, polímeros como o polipirrol, têm sido usados na preparação de
plataformas para sensores ópticos.186 O espectro do polipirrol obtido por oxidação
química é dependente do pH entre pH 6 e pH 12, com pKa em torno de 8,6. De
acordo com a literatura,156 filmes de polipirrol dopado com ânions bissulfato
apresentam resposta à mudança de pH. Em outro trabalho, Tamm e cols.187
verificaram o comportamento sensível a cátions dos filmes de polipirrol dopado com
sulfato e naftalenosulfonato.187,188
Polímeros conjugados podem ser também associados a diferentes
mecanismos de transdução. Por exemplo, sensores ópticos podem ser fabricados
com PICe uma vez que estes polímeros apresentam mudanças espectrais na região
do UV-Vis quando sofrem processos de dopagem e desdopagem.189 Recentemente,
foram desenvolvidos sensores ópticos que incorporam polímeros condutores
sensíveis à amônia,67 umidade, pH e ácido acético.68 Além disso, polímeros
condutores proporcionam uma superfície que pode imobilizar elementos biológicos
como enzimas ou anticorpos, possibilitando-se assim sua aplicação em biosensores.
Saoudi e cols. propuseram um monitoramento dielétrico para estudar o processo de
adsorção de biomoléculas em PICe, tais como DNA em polipirrol.69 Outros exemplos
de aplicações incluem medidas de pH fisiológico,98,70,71 monitoramento do pH da
água do mar,72,73 monitoramento de processos industriais,74 dentre outros.99,190
Capítulo IV – Caracterização óptica para aplicação em sensor de pH Parte I
65
Destacando as aplicações como sensores, o Ppi pode ser aplicado na
detecção de pH, já que suas propriedades ópticas e elétricas são afetadas pelo pH
do meio. O pH tem um efeito significante nas reações químicas, deste modo o
controle e as medidas desta propriedade se tornam importantes em diferentes áreas,
incluindo química, bioquímica e ciência ambiental. Rotineiramente estas medidas
são feitas utilizando o convencional eletrodo de vidro, devido à sua confiabilidade,
boa precisão, medidas não destrutivas, rápidas e reversíveis. A ampliação de seu
uso para outras áreas, entre elas as biomédicas, ambientais e industriais, tem sido
limitada devido a fatores como tamanho, falta de flexibilidade, dependência de um
dispositivo de referência, conexões elétricas, entre outros.191,192 Desta forma, em
algumas circunstâncias é necessária a determinação do pH usando sensores
ópticos,166 incluindo a aplicação em medidas de pH fisiológico,105 monitoramento do
pH da água do mar,98,73 controle de processos industriais,99 entre outras.99 Nestes
casos, o optodo de pH oferece vantagens devido à algumas de suas características
favoráveis, como tamanho, segurança intrínseca, imunidade à interferência elétrica,
entre outras.169,170
Capítulo IV – Caracterização óptica para aplicação em sensor de pH Parte I
66
IV.2. Objetivo específico
O objetivo do trabalho apresentado neste capitulo foi o estudo e
desenvolvimento de um sensor opticamente sensível ao pH. Foi utilizado o polipirrol
como matriz hospedeira e o indicador ácido-base azul de bromofenol. A imobilização
do corante foi realizada durante a polimerização eletroquímica do pirrol. As
propriedades ópticas do material obtido foram estudadas buscando a aplicabilidade
deste material como sensor óptico para pH.
Capítulo IV – Caracterização óptica para aplicação em sensor de pH Parte I
67
IV.3. Parte Experimental
IV.3.1. Materiais, Reagentes e Equipamentos
Materiais
Eletrodo de trabalho: FTO-vidro (preparado como descrito no Capítulo III)
Eletrodo de referência: calomelano saturado (ECS).
Contra-eletrodo: placa de platina de 1,0 x 1,5 cm (99,99% pureza, Platilab Ltda).
Reagentes
Os mesmos descritos no Capítulo III, além de:
Perclorato de lítio (95%, Sigma-Aldrich), usado como recebido.
Pirofosfato de sódio decahidratado (99%, Sigma-Aldrich), usado como recebido.
Cloreto de sódio (99,5%, Sigma-Aldrich), usado como recebido.
Nitrato de sódio (99,0%, Sigma-Aldrich), usado como recebido.
Bissulfito de sódio (Nuclear p.a.), usado como recebido.
Soro fisiológico comercial (JP Indústrias Farmacêuticas).
Equipamentos
Para a eletrodeposição de platina (Pt) e síntese eletroquímica dos filmes
sintetizados sobre FTO-vidro utilizou-se um potenciostato/galvanostato AUTOLAB,
modelo PGSTAT-30. Para termostatização da célula durante as sínteses, foi utilizado
um acessório de controle de temperatura Tecnal modelo TE-184. Na calibração das
soluções tampão, foi utilizado um pHmetro HANNA Instruments, modelo HI 9321.
Todas as medidas efetuadas nesta etapa foram realizadas em circuito aberto.
IV.3.2. Modificação do eletrodo de FTO-vidro por eletrodeposição de
platina e Síntese dos filmes de polipirrol
A modificação do eletrodo de FTO-vidro com platina foi realizada da mesma
forma como descrita na seção III.3.2 (Capítulo III). A síntese dos filmes de Ppi está
descrita na seção III.3.3 (Capítulo III).
Capítulo IV – Caracterização óptica para aplicação em sensor de pH Parte I
68
IV.4. Resultados e Discussão
IV.4.1. Sensibilidade Óptica ao pH
Apesar do Ppi ser bem conhecido como material sensível a mudanças de pH,
suas propriedades podem ser afetadas pelas condições de síntese como tipo de
dopante e concentração do mesmo. Baseando-se nestas informações, filmes de
Ppi-ClO4 foram sintetizados nas mesmas condições de síntese dos filmes de Ppi-AB
para futuras comparações.
Na Figura 31a estão mostrados os espectros de absorção dos filmes de
Ppi-ClO4 imersos em soluções tampão com diferentes valores de pH. Os espectros
foram coletados em temperatura ambiente (ca. 25°C). O filme de Ppi-ClO4 apresenta
mudanças na intensidade da banda de absorção em função do pH de forma similar
ao trabalho previamente publicado na literatura para filmes de Ppi quimicamente
sintetizados.186 Esta banda de absorção que começa em 550 nm é atribuída às
transições interbandas (modelo polaron-bipolaron), a qual possui o máximo
deslocado para menores comprimentos de onda ao ser exposto a pH > 7. De acordo
com a literatura193 este deslocamento para menores comprimentos de onda é devido
a processos de desdopagem, que ocorre quando o filme de Ppi é exposto a pH > 6.
Durante este processo os íons ClO4- são lentamente trocados por íons hidróxido. A
sensibilidade a mudanças de pH observada para o Ppi pode ser em parte explicada
através da dissociação de hidroxilas ligadas aos anéis de pirrol, além disso a
presença de íons hidróxido pode levar à desprotonação da cadeia polimérica,
resultando em diminuição do nível de oxidação do polímero. Esta observação pôde
também ser feita através das análises por Raman e VC (Capítulo III).
A curva de calibração para o Ppi-ClO4 imerso em soluções de diferentes pHs
está mostrada na Figura 31b. Através desta curva de calibração, estimamos o valor
de pKa do Ppi igual a 7,4, o qual pode ser comparado com valores obtidos para Ppi
sintetizados quimicamente186 (pKa = 8,6). Esta diferença mostra que o polipirrol
sintetizado eletroquimicamente neste trabalho possui maior acidez, podendo ser
desprotonado com maior facilidade.
Capítulo IV – Caracterização óptica para aplicação em sensor de pH Parte I
69
Figura 31: a) Espectros de absorção do filme Ppi-ClO4 imerso em solução tampão
fosfato com pH 1,5; 3,0; 7,0; 7,5; 8,0; e 11,0 à temperatura ambiente. b) Curva de
calibração para Ppi-ClO4 imerso em solução tampão de diferentes pH para valores
de absorbância em 680 nm.
O corante utilizado como dopante, AB, possui três formas estruturais no
intervalo de pH estudado, cuja distribuição relativa obedece ao equilíbrio ácido-base
mostrado na Figura 10. De acordo com a literatura, o pKa do AB é 4,0,194 sendo que
a coloração da solução muda de amarelo (meio ácido) para azul (meio alcalino).
A Figura 32 mostra os espectros de absorção UV-Vis das diferentes formas
do indicador AB em soluções com diferentes pH. Como mencionado anteriormente
na seção III.4.5.1, utilizou-se as cores específicas de cada solução com a finalidade
de determinar a absorção característica de cada forma do indicador AB. Para isto,
uma simples relação foi feita com a roda de cores desenhada por Newton em 1666
(Figura 32b).195 A porção do espectro eletromagnético entre 380 e 780 nm é
correspondente a região do visível. Ondas de luz com comprimentos de onda nesta
faixa são coloridas aos olhos humanos. Quando a luz branca é difratada por um
prisma, resulta em um arco-íris, sendo violeta em um extremo e vermelha no outro.
Entretanto, o fenômeno da cor em compostos coloridos não é tão simples. Quando
um material é iluminado por luz branca, possui uma coloração específica, sendo
branco quando não absorver nenhuma faixa de comprimento de onda da luz visível,
ou colorido quando absorver parte desta luz. Diferentemente de fontes coloridas,
como os lasers por exemplo, os compostos que absorvem luz na região visível do
500 550 600 650 700
0,50
0,52
0,54
0,56
0,58
0,60
0,62
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
b) A
bso
rbâ
ncia
/ u
ni.a
rb.
pH 11,0
pH 1,5
a)
Comprimento de onda / nm
pH
pKa = 7,4
Capítulo IV – Caracterização óptica para aplicação em sensor de pH Parte I
70
espectro não possuem a cor correspondente ao comprimento de onda da luz
absorvida. Ao contrário, existe uma relação inversa entre a cor observada (cor
característica do material) e a cor absorvida (comprimento de onda de absorção).
Quando observamos a luz emitida de uma fonte, como em uma lâmpada ou
laser, observamos a cor correspondente ao comprimento de onda da luz sendo
emitida. Uma fonte de luz que emite na cor violeta, emite luz correspondente ao
extremo mais energético do espectro visível, enquanto que uma fonte que emite
vermelho corresponde à região de mais baixa energia no espectro visível.
Entretanto, quando observamos a cor de um objeto ou substância, esta coloração
não é resultante de emissão, já que o material não permanece com a mesma
coloração no escuro.
Figura 32: a) Espectros de absorção do indicador AB solubilizado em solução
tampão fosfato com pH 1,5; 3,0; 7,0; 7,5; 8,0 e 11,0 à temperatura ambiente. Em
detalhe: imagem das soluções de pH 1,5; 3,0 e 7,0 com suas respectivas colorações.
b) Roda de cores desenhada por Newton.
Quando o material colorido é iluminado por luz branca, uma faixa de
comprimento de onda é absorvida e a porção restante é refletida. Essa porção
restante dá a cor característica do material, a qual se assume como sendo a cor
complementar do comprimento de onda absorvido. As cores complementares estão
localizadas diametricamente em lados opostos na Figura 32b. Desta forma, as
soluções coloridas podem indicar a faixa de comprimento de onda onde a banda de
absorção correspondente deve aparecer no espectro de absorção. Portanto, as
400 450 500 550 600
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,011,0
8,0
7,5
7,0
3,0
Ab
so
rbâ
ncia
/ u
ni.a
rb.
Comprimento de onda / nm
1,5
a) b)
1,5 3,0 7,0
Capítulo IV – Caracterização óptica para aplicação em sensor de pH Parte I
71
soluções amarela, vermelha e azul deveriam apresentar uma banda de absorção
característica destas cores na região do violeta/azul (de 400 a 430 nm), verde
(de 490 a 560 nm) e alaranjado (de 580 a 620 nm), respectivamente. A banda de
absorção em 435 nm é a dominante no espectro em pH 1,5; sendo que desaparece
para pH > 4,81.146 De acordo com a roda de cores de Newton, essa banda é
resultante da solução amarela e portanto é característica da forma neutra AB. A
banda de absorção em 580 nm se torna mais intensa para meios mais alcalinos,
como resultado a solução alcalina é azul e portanto atribuída a forma AB2- do
indicador. Finalmente, a solução vermelha é o resultado do ombro em cerca de
525 nm presente na banda de absorção em 580 nm (Figura 32).
Na Figura 33 estão os espectros de absorção do filme Ppi-AB imerso em
soluções tampão com diferentes pHs. Comparando estes espectros com os
espectros da Figura 31 e Figura 32, nota-se a maior semelhança do espectro do
Ppi-AB com a resposta óptica do dopante AB, sugerindo que: (i) a concentração do
corante na matriz polimérica é maior que a concentração de Ppi, ou (ii) que a
resposta do Ppi esteja sendo mascarada pela resposta do indicador AB. No entanto,
as análises de EDS (Espectroscopia de Energia Dispersiva de Raios-X) discutidas
no Capítulo III, evidenciaram 15% de nitrogênio para 6% de bromo (porcentagem
atômica), que leva à proporção de 1 molécula de AB para cada 9 unidades
repetitivas de Pi. Portanto, descarta-se a primeira hipótese, podendo-se afirmar que
o corante está atuando como dopante para o Ppi e, portanto, está presente em
menor quantidade. Com relação à segunda hipótese, nota-se que apesar do Ppi-AB
e do indicador AB possuírem bandas de absorção na mesma região, é notável a
diferença de sensibilidade em relação ao pH. Neste ponto é importante destacar a
presença da banda em 439 nm mesmo em pH alcalino (pH 8,0), já que como
mencionado antes, esta banda desaparece para pH > 4,81146 quando a espécie AB
está em solução. Este fato pode ser devido a dois fatores: (i) a absorção pode ser
resultante do indicador com uma contribuição da absorção do polímero, já que em
níveis intermediários de oxidação, este apresenta bandas de absorção nesta
região20 e (ii) a interação do indicador com a matriz polimérica, favoreceria o
deslocamento da reação mostrada na Figura 10 para a forma neutra do indicador
(cor amarela), favorecendo uma maior estabilização da forma ácida AB. Se isto
realmente for verdade, significa que ocorre uma diminuição da acidez do corante,
Capítulo IV – Caracterização óptica para aplicação em sensor de pH Parte I
72
sendo esperado um aumento no valor aparente do pKa do material. O interessante é
que este comportamento poderia ser usado eficientemente na aplicação do possível
sensor no monitoramento de pequenas variações de pH em amostras ambientais e
fisiológicas.
Figura 33: a) Espectros de absorção do filme Ppi-AB imerso em solução tampão
fosfato com pH 1,5; 3,0; 7,0; 7,5; 8,0 e 11,0 à temperatura ambiente. b) Curva de
calibração para Ppi-AB imerso em solução tampão de diferentes pH.
Na Figura 33b estão mostradas as duas curvas de calibração para os
comprimentos de onda em 439 e 594 nm. Como a absortividade das espécies AB e
AB2- são diferentes, optou-se em determinar o pKa do sistema através do método
por cálculos. Para um equilíbrio ácido-base do tipo representado na Figura 10, a
relação entre as concentrações das espécies para cada valor de pH varia de acordo
com a expressão de Henderson-Hasselbach. De acordo com a lei de Beer,196,197 a
concentração da espécie absorvente é proporcional à sua absorbância (A) segundo
a relação A = ε.b.C, onde ε é a absortividade (molar, quando C é a concentração da
espécie em mol.L-1) e b é o caminho óptico. Portanto, a equação de
Henderson-Hasselbach pode ser reescrita em termos de absorbância (Equação 4),
onde Aác é a absorbância somente da forma ácida, Abás é a absorbância somente da
forma básica e Ai é a absorbância total da mistura (formas ácida + básica) para um
dado pH.
400 450 500 550 600 650 2 4 6 8 10
1,2
1,0
0,8
0,6
soro fisiológico
11,0
1,5
11,0
8,0
7,5
7,0
3,0
soro
fisiológico
Absorb
ância
/ a
.u.
Comprimento de onda / nm
1,5
a)
0,4
439 nm
594 nm
b)
pH
pH 7,4
Absorb
ância
/ u
ni. a
rb.
Capítulo IV – Caracterização óptica para aplicação em sensor de pH Parte I
73
ibás
áci
aAA
AApHpK log
Equação 4
Desta forma a Equação 4 pode ser usada diretamente para cada uma das
soluções e uma vez conhecido o pH e o termo logarítmico, obtém-se algebricamente
os valores de pKa. Substituindo-se os valores obtidos dos dados
espectrofotométricos na Equação 4, obtêm-se o valor de pKa em cada solução
tampão para os comprimentos de onda 435 e 584 nm. Tomando-se a média entre os
valores, obteve-se como pKa aparente, o valor de 7,7. Este valor é bem próximo do
pKa obtido para Ppi-ClO4 (7,4), o que corrobora a hipótese de que o polímero
contribui para a sensibilidade do material, facilitando a estabilização da forma neutra
do indicador (AB), diminuindo a acidez aparente e consequentemente aumentando o
pKa do sistema. O aumento do pKa é resultante do estado de oxidação do polímero,
como mostrado nas medidas in situ (seção III.4.5). Desta forma, o pKa observado
sugere que o polímero está parcialmente reduzido nas condições do experimento.
Esse estado parcialmente reduzido é resultante do processo de síntese utilizado
neste trabalho. Como descrito na seção experimental (seção III.3.3), os filmes de Ppi
foram sintetizados por VC, sendo -0,3 V o potencial final de síntese. De acordo com
as VC mostradas no Capítulo III, em -0,3 V o polímero está reduzido, possuindo
menor número de estados polaronicos/bipolaronicos na cadeia polimérica,
resultando em menor demanda por cargas negativas do dopante. Como resultado,
ocorre a diminuição da acidez do indicador AB, resultando em um aumento do pKa
do sistema, o qual é próximo de optodos sensíveis ao pH baseados em Ppi (8,6).186
Desta forma, assume-se que ambos Ppi e AB participam da sensibilidade ao pH, e
portanto, a resposta do material é resultado de um efeito sinérgico. Ao se aumentar o
pH, os íons hidróxido afetam ambas as espécies individualmente, assim como o
sistema Ppi-AB de forma geral. Com relação ao indicador em solução, os íons
hidróxido provocam a desprotonação da molécula, deslocando o equilíbrio (Figura
10) em direção às formas aniônicas do indicador. Considerando o Ppi, os íons
hidróxido podem estabilizar as cargas positivas presentes na cadeia polimérica
parcialmente oxidada, e podem ainda desprotonar o polímero, levando à diminuição
do nível de oxidação do Ppi. Todos os efeitos do pH sobre as moléculas do dopante
AB, sobre o Ppi e sobre as interações entre moléculas do corante presas na cadeia
polimérica, afetam o equilíbrio do indicador AB.
Capítulo IV – Caracterização óptica para aplicação em sensor de pH Parte I
74
De fato, o Ppi e o indicador AB são individualmente materiais sensíveis ao pH,
possuindo pKa bem específicos, sendo alcalino para o Ppi e ácido para o AB. Para o
material apresentado neste trabalho (Ppi-AB), o pKa foi observado em cerca de 7,7.
Este efeito sinérgico aumenta a faixa de trabalho do sensor onde o material é
sensível, comparando-se com a faixa sensível à mudanças de pH dos materiais
individualmente, possibilitando a sua aplicação no monitoramento de variações do
pH de amostras biológicas e ambientais.
Buscando a aplicação do material obtido neste trabalho como sensor de pH
para amostras reais, coletou-se o espectro de absorção para o Ppi-AB imerso em
soro fisiológico. Esta amostra é comumente usada para infusão intravenosa,
enxague de lentes de contato, entre outras aplicações. De acordo com a Figura 33a,
o pH da amostra de soro fisiológico analisada possui pH próximo a 7,5 (linha
vermelha pontilhada). Ao graficar os valores de absorbância obtidos para a amostra
na curva de calibração (Figura 33b), obtêm-se um valor de pH em torno de 7,4. Este
resultado é consistente com medidas experimentais usando pHmetro (igual a 7,43).
IV.4.2. Histerese
Na Figura 34 estão os valores de absorbância medidos para Ppi-AB após a
imersão em solução tampão fosfato de pH 1,5 a 11,0 e de pH 11,0 a 1,5 (o filme
Ppi-AB ficou imerso durante 3 min em cada solução tampão para que ocorresse o
condicionamento inicial do filme). Este experimento foi realizado em ciclo com a
finalidade de analisar a histerese do material. A histerese é um fenômeno observado
em alguns materiais, no qual certas propriedades, em determinado estado,
dependem de estados anteriores. O estudo desta propriedade é importante para a
caracterização de um sensor devido à confiabilidade das medidas, já que a resposta
depende da amostra analisada anteriormente, para materiais que apresentem
histerese.
De acordo com a Figura 34, os filmes de Ppi-AB apresentam uma pequena
histerese no comportamento óptico. A histerese observada na resposta óptica pode
ser relacionada à desprotonação das cadeias de Ppi, a qual rapidamente ocorre
após a imersão em meio alcalino. De fato, quando a medida foi realizada novamente
com o mesmo filme em um segundo ciclo, observou-se uma histerese similar,
Capítulo IV – Caracterização óptica para aplicação em sensor de pH Parte I
75
entretanto a absorbância registrada foi menor quando comparada com o primeiro
ciclo.
Figura 34: Curva de histerese para Ppi-AB imerso em solução tampão fosfato de
pH 1,5 a 11,0 e pH 11,0 a 1,5.
Essa observação sugere que a desprotonação da cadeia polimérica, que
possivelmente causa a histerese do comportamento óptico do Ppi-AB, também leva
à perda de reprodutibilidade. Em meio muito alcalino, as ligações N-H são rompidas,
levando à desprotonação do Ppi.138,139 A desprotonação da cadeia polimérica diminui
o comprimento de conjugação , já que os íons OH- podem se ligar covalentemente
à cadeia polimérica,198 levando à diminuição dos portadores de carga e
consequentemente diminuição da condutividade do filme. O fato de filmes de Ppi
apresentarem histerese após imersão em meio alcalino foi previamente estudado,
sendo que a resposta do filme após imersão apresentou maiores valores de
resistência ôhmica.199
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Absorb
ância
/ u
ni. a
rb.
439nm
pH
594nm
Capítulo IV – Caracterização óptica para aplicação em sensor de pH Parte I
76
IV.4.3. Tempo de resposta
O tempo de resposta é definido como o tempo necessário para que ocorra a
mudança de um sinal.200 Um tempo de resposta de 100% é definido como o tempo
necessário para atingir uma mudança total do sinal. No entanto, como na maioria
das vezes o tempo de resposta apresenta um perfil exponencial, a determinação
exata de 100% da variação do sinal é difícil. Consequentemente, usualmente o
tempo de resposta é analisado em termos de somente 63% a 90% da mudança do
sinal.201 O tempo de resposta depende da temperatura, da quantidade de indicador
imobilizado, da espessura do sensor, do material usado e do procedimento de
fabricação. Para optodos em geral, têm sido relatados tempos de resposta flutuando
desde poucos segundos,202 até vários minutos.203
O tempo de resposta para o filme Ppi-AB foi analisado através de medidas de
absorbância do filme de Ppi-AB ao ser variado o pH do meio. Para isso, utilizou-se
uma cubeta conectada a duas seringas. Uma das seringas foi utilizada para sugar a
solução, enquanto que a outra foi usada para injetar a solução tampão dentro da
cubeta. A Figura 35 mostra o tempo de resposta para o filme Ppi-AB, onde as
absorbâncias em 594 nm foram normalizadas (variação de absorbância de
1 unidade). O filme apresenta tempo de resposta mais curto quando próximo ao pKa
(ca. 1,0 s). De fato, a mudança de cor (Figura 33) pode ser facilmente visualizada,
ocorrendo com a mesma velocidade que a mudança de cor do corante em solução.
No entanto, o tempo de estabilização requerido para meio ácido é ca. 35 s, sendo
mais curto do que o observado para meio alcalino. Este longo tempo de
estabilização em meio alcalino pode ser devido ao processo de desprotonação que
ocorre neste meio.186 Um comportamento similar foi observado para filmes de
PANI.204
Uma das grandes vantagens do material estudado (Ppi-AB) em relação a
sensores convencionais49 está relacionado ao tempo de resposta. Para que ocorra a
mudança de coloração no Ppi-AB (Figura 33a) é necessário um tempo muito curto,
(< 1,0 s, sendo estimado visualmente†), pois o sensor mantém o tempo de resposta
do indicador, ou seja, semelhante ao seu tempo de conversão da forma ácida para a
† O tempo para que ocorra a mudança de coloração é muito curto, sendo difícil de ser registrado
experimentalmente, pois está abaixo do limite de detecção do equipamento. No entanto, pode-se
determinar experimentalmente o tempo para a estabilização da mudança de cor no material.
Capítulo IV – Caracterização óptica para aplicação em sensor de pH Parte I
77
forma básica. Desta forma, o tempo de resposta do material é uma das propriedades
que o viabiliza para a aplicação comercial, já que é muito rápido, até mesmo quando
se compara com sensores de pH baseados em Ppi recentemente obtidos, cujo
tempo de resposta é na ordem de 2 a 6 min.157,205
Figura 35: Tempo de resposta do filme Ppi-AB em 594 nm para diferentes pH.
IV.4.4. Estabilidade Óptica
A estabilidade de um material é um requisito importante para a aplicação
como dispositivo. Com a finalidade de testar a estabilidade óptica dos filmes de
Ppi-AB, espectros de absorção dos filmes mantidos em solução tampão com
diferentes pHs (1,5; 3,0; 7,0; 7,5; 8,0 e 11,0) foram coletados por um período de 16
dias (Figura 36). A absorbância foi monitorada em função do tempo em 439 nm para
meio ácido e 584 nm para meio alcalino, todos em função do tempo.
De acordo com a Figura 36, observa-se que o filme é bastante estável em
meio ácido, sendo que sua absorbância praticamente não muda durante os 16 dias
em que esteve imerso nas soluções tampão. Com relação aos demais (exceto
pH 11,0) verifica-se que o filme possui um comportamento inicial similar, ocorrendo
Capítulo IV – Caracterização óptica para aplicação em sensor de pH Parte I
78
aumento da absorbância, a qual permanece constante até cerca de 2 dias e depois
diminui gradualmente.
Figura 36: Estabilidade óptica dos filmes Ppi-AB imersos em solução tampão fosfato
de diferentes pH. O desvio padrão foi calculado utilizando diferentes filmes de
Ppi-AB.
O aumento inicial da absorbância pode ser devido ao “condicionamento” do
filme, um fenômeno bastante conhecido e que está associado ao tempo necessário
para homogeneização da distribuição de carga e/ou transporte de massa no
material.206 Com relação à desestabilização do material caracterizada pela
diminuição gradual da absorbância, pode-se sugerir que esta desestabilização
ocorre devido ao efeito de desdopagem,193,207 onde as moléculas de dopante (AB)
0 50 100 150 200 250 300 3500,0
0,4
0,8
1,2
1,6
2,0
2,4
0,7
0,8
0,9
1,0
1,1
0,4
0,8
1,2
1,6
2,0 b)
c)
Tempo / horas
607 nm 595 nm
pH 8,0 pH 11,0
a)
435 nm
pH 1,5
pH 3,0
Absorb
ância
/ u
ni. a
rb.
607 nm
pH 7,0
pH 7,5
Capítulo IV – Caracterização óptica para aplicação em sensor de pH Parte I
79
são lentamente trocadas por íons hidróxido. Este processo foi evidenciado pela
mudança de coloração da solução tampão, observada principalmente para pH 11,0;
sendo espectroscopicamente medida durante os experimentos. Desta forma, os
diferentes comportamentos ópticos observados para Ppi-AB imerso em meio ácido,
neutro e alcalino podem ser relacionados principalmente ao processo de
desdopagem das cadeias de Ppi. Em meio neutro o processo de desprotonação é
muito sutil, entretanto, quando o filme permanece imerso neste meio por mais de
100 horas, o corante começa a sair da cadeia polimérica para a solução (lixiviação).
Em meios fortemente alcalinos, a desprotonação leva à diminuição do comprimento
de conjugação, o qual afeta as propriedades ópticas do filme antes mesmo de
ocorrer o condicionamento inicial.138,139
O material sintetizado neste trabalho (Ppi-AB) possui boa estabilidade,
principalmente em meio ácido, semelhante a sensores baseados em compósitos de
polipirrol N-substituído dopados com azul da prússia,208 os quais são estáveis em ar
e em soluções de HCl por 150 dias e por 14 dias quando estocados em soluções
etanólicas. Além disso, são materiais obtidos com facilidade, baixo custo e com boa
estabilidade ambiental, a qual é semelhante a materiais baseados neste polímero
condutor.207
IV.4.5. Reprodutibilidade e Reversibilidade Óptica
Na Figura 37 estão os dados referentes à reprodutibilidade e reversibilidade
da resposta óptica medidas por espectrofotometria UV-Vis do Ppi-AB. As
absorbâncias em 584 nm foram sucessivamente registradas após 2 min de contato
com as soluções tampão em diferentes pH. A absorbância foi primeiramente medida
para o filme imerso em pH 1,5; o filme foi então enxaguado com água deionizada e
posteriormente imerso na próxima solução tampão, pH 3,0; pH 7,0; pH 7,5; e então
pH 8,0. Finalizando o ciclo, após a medida em pH 8,0, enxaguou-se o filme e
voltou-se a imergi-lo na solução tampão de pH 1,5 e nas demais soluções. Este
experimento realizado desta maneira permite a caracterização simultânea da
reversibilidade e da reprodutibilidade do sistema.208 Somente após 70 ciclos, o filme
de Ppi-AB foi testado em pH 11,0, já que sensores ópticos de pH apresentam
irreversibilidade, perdendo completamente a sensibilidade ao pH quando mantidos
em soluções com alto valor de pH.186 Como as medidas em pH 3,0 e 7,5 possuem o
Capítulo IV – Caracterização óptica para aplicação em sensor de pH Parte I
80
mesmo comportamento que as medidas em pH 1,5 e 7,0, respectivamente, optou-se
em não mostrar estas curvas buscando um gráfico com a visualização mais fácil dos
resultados, Figura 37.
Após o condicionamento do filme, a resposta é reprodutível e reversível entre
o 20 o e o 70 o ciclo. Entretanto, após imergir o filme na solução tampão com pH 11,0
o sistema torna-se irreversível, tendo sua reprodutibilidade afetada. Este
comportamento era esperado uma vez que já foi mostrado que ocorre a expulsão do
corante da matriz polimérica em meios extremamente alcalinos (seção IV.4.2) devido
ao processo de desdopagem provocado pela presença dos íons hidróxido na
solução tampão. Além disso, a diminuição da absorbância sugere que esteja
ocorrendo uma redução irreversível com parcial degradação e perda da
eletroatividade,209,210 já que o Ppi pode ser dopado ou desdopado reversivelmente
somente na escala de pH de 2 a 10.211,212
Figura 37: Absorbância em 584 nm para Ppi-AB imerso em soluções tampão de
diferentes pH em função do número de medidas para determinação da
reprodutibilidade e reversibilidade do filme. Os desvios padrão foram calculados
utilizando diferentes filmes de Ppi-AB.
0 10 20 30 40 50 60 70 80
0,34
0,36
0,38
0,40
0,42
0,44
Absorb
ância
/ u
ni. a
rb.
pH 1,5
pH 7,0
pH 8,0
pH 11,0
Número de medidas
Capítulo IV – Caracterização óptica para aplicação em sensor de pH Parte I
81
Resultados similares foram obtidos para um compósito de Ppi N-substituído
dopado com azul da prússia, sendo que este torna-se irreversível quando imerso em
pH maior que 9,0.208
IV.4.6. Efeito da Temperatura
Para os estudos do efeito da temperatura sobre a determinação óptica do pH,
foram realizadas medidas de absorbância do filme Ppi-AB em diferentes
temperaturas (15, 25 e 35 ºC). Na Figura 38a, estão os espectros correspondentes a
estas temperaturas para o filme imerso em pH 3,0. De acordo com o resultado
obtido, verifica-se que a temperatura praticamente não afeta a resposta do sensor
em meio ácido.
Na Figura 38b está mostrada a variação da absorbância em 584 nm do
Ppi-AB em diferentes temperaturas para os pH 1,5; 3,0; 7,0; 7,5 e 8,0. A interferência
causada pela temperatura não é tão significativa em meio ácido quanto em meio
neutro/alcalino.
Figura 38: (a) Espectro UV-Vis do filme Ppi-AB imerso em pH 3,0 em diferentes
temperaturas e (b) efeito da temperatura na resposta óptica do Ppi-AB em 584 nm
imerso em diferentes pH.
15 20 25 30 35
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
400 450 500 550 600
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
pH 8,0
pH 7,5
pH 7,0
pH 3,0
pH 1,5
b)
Temperatura / ºCComprimento de onda / nm
Ab
so
rbâ
ncia
/ u
ni.a
rb.
15 ºC
25 ºC
35 ºC
a)
Capítulo IV – Caracterização óptica para aplicação em sensor de pH Parte I
82
A resposta do material em meio ácido praticamente não sofre alteração,
enquanto que a interferência torna-se significativa acima de pH 7,0. Acima deste pH,
o aumento da temperatura induz o aumento da absorbância da banda em 580 nm.
Este comportamento pode ser explicado baseando-se na dissociação do indicador
AB. Como a dissociação é endotérmica, ocorre aumento da concentração da forma
aniônica do indicador (AB2-). Com relação ao polímero, ocorre o aumento da
mobilidade intercadeia dos portadores de carga (hopping), favorecido pelo aumento
de temperatura, contribuindo assim para as transições interbandas.213,214
IV.4.7. Efeito de Interferentes
Para os estudos de interferência de íons na resposta óptica do sensor, foram
preparadas diferentes soluções contendo os íons bissulfito (HSO3-), cloreto (Cl-),
potássio (K+), nitrato (NO3-) e pirofosfato (P2O7
4-) com concentrações 0,01 e
0,15 mol.L-1 em diferentes pH. A análise da interferência foi realizada nos
comprimentos de onda de máxima absorção (584 nm) utilizando como base para a
comparação entre as medidas a Equação 5, onde C.I. é o coeficiente de
interferência, Ax é a absorbância do filme imerso na solução tampão contendo o íon
interferente e A0 é a absorbância coletada na ausência do interferente.
0
0 )(..
A
AAIC x
Equação 5
Na Tabela 2 estão mostrados os resultados obtidos para a análise de
interferência. Com relação a 0,01 mol.L-1, o comportamento do material na presença
dos interferentes foi semelhante, sendo que as interferências mais significativas
foram observadas na presença de íons nitrato e bissulfito. Este fato pode ser
explicado pelo comportamento redox dos íons nitrato e bissulfito, que alteram o nível
de oxidação do Ppi, levando a mudanças das propriedades ópticas do filme Ppi-AB.
Em 584 nm os íons cloreto e potássio praticamente não interferiram, o que
torna o material interessante já que esses íons são comumente encontrados em
amostras como leite, plasma sanguíneo e água do mar. Ao aumentar a concentração
do interferente 15 vezes, ocorre interferência praticamente para os mesmos íons.
Esta observação sugere que a força iônica praticamente não interfere na resposta do
sensor Ppi-AB.
Capítulo IV – Caracterização óptica para aplicação em sensor de pH Parte I
83
Tabela 2: Coeficientes de interferência (C.I.) obtidos por medidas de absorção do
Ppi-AB imerso em soluções tamponadas contendo 0,01 e 0,15 mol.L-1 de
interferentes.
0,01 mol.L-1 0,15 mol.L-1
pH P2O74- Cl- K+ NO3
- HSO3- P2O7
4- Cl- K+ NO3- HSO3
-
1,5 0,01 0,03 0,03 0,03 0,25 0,01 0,05 0,05 0,09 0,30
3,0 0,06 0,03 0,03 0,00 0,25 0,06 0,05 0,06 0,08 0,25
7,0 0,05 0,05 0,00 0,14 0,20 0,04 0,06 0,04 0,27 0,24
7,5 0,04 0,00 0,04 0,32 0,16 0,06 0,06 0,04 0,32 0,25
8,0 0,03 0,03 0,03 0,30 0,23 0,01 0,07 0,07 0,30 0,31
Estes resultados podem ser comparados com a literatura, onde estudos de
interferência para o Ppi na presença de metais pesados resultaram em C.I. de 0,16 e
0,18.186 Em outro trabalho, a interferência do NaCl, LiCl e NaClO4 foi investigada
para sensores baseados em poli(o-metoxianilina), onde foram obtidos C.I. de 0,01;
0,13 e 0,31, respectivamente, para soluções contendo 0,15 mol.L-1 dos
interferentes.215
Capítulo IV – Caracterização óptica para aplicação em sensor de pH Parte I
84
IV.5. Conclusões Parciais
O método para a preparação do Ppi-AB descrito neste trabalho é simples,
reprodutível e ainda possui um baixo custo. O filme obtido responde sensivelmente
ao pH na escala de 1,5 a 11,0 com mudança reversível da coloração em
comprimentos de onda fixos. Entretanto ocorre perda da reversibilidade quando o
material é exposto a pH 11,0, contudo esta desvantagem não desvaloriza a
aplicabilidade do material, já que é um material obtido com baixo custo. Uma das
vantagens deste material é a maior faixa de detecção obtida quando comparado com
outros sensores ópticos de pH,216 os quais usualmente são sensíveis a somente
3 unidades de pH. Outra vantagem do material proposto se baseia na resposta
desde meio ácido até meio alcalino, incluindo pH de amostras fisiológicas, enquanto
que outros optodos apresentam sensibilidade somente em meio ácido ou
alcalino.186,217
85
Capítulo V
Caracterização ôhmica
para aplicação em
sensor de pH
Capítulo V – Caracterização ôhmica para aplicação em sensor de pH Parte I
86
V. Caracterização ôhmica para aplicação em sensor de pH
V.1. Introdução
Muitos processos e reações químicas são dependentes do pH, portanto, o
desenvolvimento de dispositivos que forneçam medidas rápidas e precisas do pH é
uma linha de pesquisa bastante explorada.218-220 Como mencionado anteriormente, o
procedimento padrão para medidas de pH é feito utilizando o eletrodo de vidro, o
qual apresenta muitas vantagens, como resposta Nernstiana de pH 2 a pH 12, alta
reprodutibilidade, alta seletividade a íons hidrogênio, longo tempo de vida e, além
disso, interferentes redox não alteram sua sensibilidade.221 Por outro lado, os
eletrodos de vidro apresentam desvantagens relacionadas à instabilidade em meios
fortemente ácidos ou alcalinos, alto preço e dificuldade para a miniaturização, sendo
inconveniente quando se trabalha com amostras fisiológicas, por exemplo.106 Desta
forma, existe uma clara necessidade na obtenção de métodos alternativos para
medidas de pH, principalmente na busca por um dispositivo capaz de trabalhar com
pequenas quantidades de amostra. Neste sentido, muitos sensores de pH têm sido
desenvolvidos, sendo alguns deles baseados em membranas, óxidos metálicos,
fibras ópticas, entre outros.103,104 No entanto, muitos destes dispositivos são
instáveis, precisando de constantes re-calibrações. Estudos recentes mostram que
os eletrodos modificados eletroquimicamente com polímeros condutores são bons
candidatos para a substituição dos populares eletrodos de vidro.222
Vários trabalhos têm mostrado a aplicação de polímeros condutores
eletroativos no desenvolvimento de células solares,223,224 dispositivos emissores de
luz,225,226 e dispositivos eletroquímicos e eletrocrômicos.227-230 Entre esta variedade
de aplicações, o uso desta classe de material em sensores de pH têm sido foco de
muitos trabalhos na última década,231,232 podendo ser utilizados na produção de
sensores condutimétricos devido à suas propriedades elétricas. A
eletropolimerização de compostos heteroaromáticos em superfícies de eletrodos é
um dos muitos modos efetivos para produção de eletrodos quimicamente
modificados com alta condutividade elétrica.233 Como exemplos de sensores
químicos de pH usando eletrodos cobertos com filmes poliméricos, além dos obtidos
por eletropolimerização do pirrol, têm-se os baseados em anilina, tiofeno, e
Capítulo V – Caracterização ôhmica para aplicação em sensor de pH Parte I
87
derivados de benzeno.42,199,204,234,235 Heineman e cols.236 foram os primeiros a usar
um eletrodo de platina recoberto com poli-(1,2-diaminobenzeno) eletropolimerizado
para aplicação em um sensor de pH. Oyama e cols.237 estudaram as respostas
potenciométricas de eletrodos de platinas recobertos com polifenol, polianilina,
poli(1,2-diaminobenzeno) e poli(4,4’-diaminodifeniléter) obtidos por polimerização
eletroquímica dos respectivos monômeros. Em outros eletrodos obtidos por
eletropolimerização também foi possível observar a sensibilidade ao pH.238,239
Também podem ser encontrados alguns estudos da resposta potenciométrica dos
eletrodos de polipirrol frente a soluções contendo diferentes ânions.240-242Como uma
propriedade inerente dos polímeros conjugados, no estado oxidado ele é um cátion
poliradical e atrai eletrostaticamente ânions para o interior da matriz polimérica. Além
disso, o Ppi apresenta distribuição de carga e de tamanho de poros, possuindo
portanto, certa funcionalidade para a identificação de ânions e estes requisitos
estéricos podem também controlar possíveis interferências de outros íons.156 Neste
sentido, sensores baseados em polímeros com propriedades extras para a
identificação de analitos, podem melhorar a seletividade do sensor quando
comparado com sensores de troca iônica.156
Muitos polímeros condutores possuem grupamentos ácidos e/ou básicos, os
quais podem ser protonados ou desprotonados. A PANI e o Ppi são alguns dos
polímeros que pertencem a esta família. A desprotonação destes polímeros
conjugados resulta na diminuição dos portadores de carga ao longo da cadeia
polimérica, a qual é acompanhada de mudanças nas propriedades redox do
polímero. A protonação aumenta a condutividade do Ppi, enquanto que a
desprotonação leva à diminuição da condutividade.139
O efeito do pH no polipirrol dopado com íons cloreto (Ppi-Cl) e ácido
polivinilssulfônico (Ppi-PVS) foi anteriormente descrito.199 Sensores potenciométricos
miniaturizados para pH baseados em filmes de polipirrol eletroquimicamente
sintetizados foram recentemente desenvolvidos por Lakard e cols.231 Esses eletrodos
de pH consistem em 2 microeletrodos interdigitados, fabricados por fotolitografia,
como mostrado na Figura 39.
Capítulo V – Caracterização ôhmica para aplicação em sensor de pH Parte I
88
Figura 39: Esquema mostrando eletrodos com microarranjos interdigitados.168
Outros exemplos de eletrodos cobertos com polímeros sensíveis ao pH, são
os baseados em pirrol (Pi), 3-(2,5-dihidroxibenzil) pirrol (PiQH), anilina (An) e
o-fenilenodiamina (oPD).75 Os polímeros são sintetizados utilizando como dopante
perclorato e albumina de soro bovino (BSA). As propriedades potenciométricas do
filme resultante apresentaram resposta aproximadamente Nernstiana. Obtiveram-se
as seguintes sensibilidades para estes sensores: -43,2 mV.pH-1 para o Ppi,
-46,0 mV.pH-1 para o PpiQH, -42,1 mV.pH-1 para a Pan e -50,7 mV.pH-1 para PoPD.
Todos se apresentaram sensíveis à faixa de pH entre 3 e 10 e foi obtido um tempo
de resposta médio de 3 a 5 min. Em um outro trabalho107 foi estudado o efeito do
dopante e do eletrólito na sensibilidade e tempo de resposta do Ppi através de
mudanças de pH da solução. Foi observado que a resposta do Ppi dopado com
ânions comuns (Cl-, NO3-, ClO4
-) é lenta. Em contraste, filmes de polipirrol
depositados na presença de ânions de ácidos fracos, como ftalatos, oxalatos e
salicilatos, foram caracterizados por resposta instantânea à mudança de pH (< 1 s).
Capítulo V – Caracterização ôhmica para aplicação em sensor de pH Parte I
89
V.2. Objetivo
Esta etapa do trabalho teve como objetivo a síntese de um material cuja
resistência elétrica seja afetada por mudanças do pH do meio. O material foi obtido
por polimerização do pirrol como matriz hospedeira e o indicador ácido-base azul de
bromofenol. A imobilização do corante foi realizada durante a polimerização
eletroquímica do pirrol. As propriedades ôhmicas do material obtido foram estudadas
buscando a aplicabilidade deste material como sensor ôhmico para pH.
Capítulo V – Caracterização ôhmica para aplicação em sensor de pH Parte I
90
V.3. Parte Experimental
V.3.1. Materiais, Reagentes e Equipamentos
Materiais
Eletrodo de trabalho: Vidro coberto com filme de ouro digitalizado com área de ca.
10 mm2 e separados por um intervalo de 10 m (fornecido pela Escola Politécnica da
Universidade de São Paulo).
Eletrodo de referência: calomelano saturado (ECS).
Contra-eletrodo: placa de platina de 1,0 x 1,5 cm (99,99% pureza, Platilab Ltda).
Reagentes
Os mesmos descritos na seção IV.3.1 (Capítulo IV).
Equipamentos
Para a síntese dos filmes sobre o eletrodo de ouro digitalizado (Figura 40),
utilizou-se um potenciostato/galvanostato AUTOLAB, modelo PGSTAT-30. Para
termostatização da célula durante as sínteses foi utilizado um acessório de controle
de temperatura Tecnal modelo TE-184. Para calibração das soluções tampão foi
utilizado um pHmetro HANNA Instruments, modelo HI 9321. Durante as medidas de
resistência utilizou-se um eletrodo programável Keithley, modelo 617 interfaceado a
um computador.
V.3.2. Síntese dos filmes de polipirrol sobre eletrodos de ouro
digitalizado
As eletropolimerizações dos filmes foram realizadas de forma similar à
descrita anteriormente (seção III.3.3 – Capítulo III) sobre a superfície do eletrodo de
ouro digitalizado (dedos de ouro, Figura 40). O filme foi depositado com 15 ciclos de
VC, sendo equivalente à espessura necessária para fechar o contato elétrico entre
os dedos de ouro. Após a síntese, o sensor foi seco a 45oC por 2 h e mantido em
dessecador sob vácuo.
Capítulo V – Caracterização ôhmica para aplicação em sensor de pH Parte I
91
Figura 40: a) Eletrodo digitalizado de ouro e b) com o filme de Ppi-AB depositado
eletroquimicamente. Dimensão do substrato de vidro 2,5 cm2.
Capítulo V – Caracterização ôhmica para aplicação em sensor de pH Parte I
92
V.4. Resultados e Discussão
V.4.1. Sensibilidade Ôhmica ao pH
Os filmes Ppi-AB (Figura 40b) foram imersos durante 5 min em soluções
tampão de diferentes pH (1,5; 3,0; 7,0; 7,5; 8,0 e 11,0). A resistência elétrica medida
durante estas imersões foi convertida para sensibilidade ôhmica (S%) utilizando a
Equação 6, onde Rx é a resistência obtida após a imersão do sensor na solução
tampão e R0 é a resistência antes da imersão.221
𝑆% = 𝑅0 −𝑅𝑥
𝑅0 × 100 Equação 6
Na Figura 41 estão os valores de sensibilidade ôhmica (S%) do filme Ppi-AB
em função do pH. Observa-se que a sensibilidade aumenta ao condicionar o filme de
meio ácido a meio neutro, e que de acordo com a Equação 6, é um resultado da
diminuição da resistência do filme. Este comportamento é esperado já que a
concentração das espécies com cargas negativas (corante AB) aumenta de pH 1,5 a
pH 7,5.146 Entretanto, a sensibilidade começa a diminuir após a imersão em pH 7,5
até pH 11,0.
As medidas espectrofotométricas mostradas no Capítulo IV para filmes de
Ppi-AB mostram um deslocamento do pKa para 7,7243 quando comparado com o
corante em solução (pKa 4,0).194 Desta forma, a inversão do comportamento da
sensibilidade mostrada na Figura 41 ocorre próxima ao pKa do sistema Ppi-AB.
Portanto, sugere-se que parte das mudanças na condutividade do filme polimérico
ocorra devido ao deslocamento do equilíbrio apresentado na Figura 10 juntamente
com a desprotonação da cadeia polimérica do Ppi.
No pH correspondente ao pKa, as concentrações das espécies alcalinas e
ácidas são as mesmas para um equilíbrio simples. De acordo com os resultados
apresentados no Capítulo IV, o pKa do Ppi-AB ocorre em 7,7, portanto em pH ácido
a concentração da forma neutra é maior do que a concentração da forma aniônica
(AB2-). Aumentando-se o pH do meio, o equilíbrio se desloca no sentido de aumentar
a concentração da forma carregada do corante, resultando em um maior nível de
dopagem do polímero, e consequentemente levando a um aumento na
condutividade do Ppi-AB. Baseando-se nesta explicação, esperaríamos um
Capítulo V – Caracterização ôhmica para aplicação em sensor de pH Parte I
93
comportamento linear para a sensibilidade versus pH (Figura 41). Entretanto, em
pH 7,5 é observada uma inversão do comportamento, onde a sensibilidade começa
então a diminuir. Este comportamento pode ser explicado levando em consideração
que ocorre uma ruptura das ligações N-H, em resultado do processo de
desprotonação em meio alcalino.138,139 Como discutido no Capítulo IV, a
desprotonação diminui o comprimento de conjugação , levando à diminuição da
mobilidade dos portadores de carga e consequentemente diminuição da
condutividade (aumento da resistência). De fato, durante as medidas em pH alcalino,
observou-se a saída do corante da matriz polimérica em direção ao eletrólito. Apesar
de ocorrer um aumento da concentração das formas aniônicas do indicador em
meios mais alcalinos, ocorrem também processos de desprotonação e desdopagem,
impedindo que o filme alcance maiores condutividades que a obtida em pH 7,5.
Figura 41: Sensibilidade ôhmica (resistência relativa) ao pH dos filmes Ppi-AB.
A inversão do comportamento da curva de sensibilidade dos filmes de Ppi-AB
em relação ao pH mostra uma desvantagem do sensor ôhmico quando comparado
ao sensor óptico (Capítulo IV), já que o Ppi-AB com resposta ôhmica apresenta
menor faixa de detecção, sendo de pH 1,5 a pH 7,5 ou 7,5 a 11,0 (desde que se
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
10
12
14
16
18
20
22 Aum
ento da resistência
Dimin
uição d
a resis
tência
S /
%
pH
Capítulo V – Caracterização ôhmica para aplicação em sensor de pH Parte I
94
conheça previamente se o meio é ácido ou básico). As faixas de detecção
encontradas nesse trabalho podem ser comparadas a dados da literatura,64,175 onde
foram estudados materiais baseados em Ppi dopado com Cl- e diferentes
indicadores, os quais apresentaram faixa de detecção entre pH 2 e 12.
V.4.2. Tempo de resposta
O tempo de resposta do filme Ppi-AB foi medido através das medidas de
resistência versus tempo em meio alcalino e ácido (Figura 42). Para essas medidas,
o Ppi-AB foi removido da solução tampão de pH 8,0 após 40 segundos e então
imerso em meio ácido (pH 3,0).
Figura 42: Dinâmica da resposta ôhmica do Ppi-AB entre meio alcalino (pH 8,0) e
meio ácido (pH 3,0).
O comportamento do Ppi-AB mostrado na Figura 42 corrobora os resultados
apresentados na Figura 41, onde o valor de resistência para o filme imerso em meio
ácido (pH 3,0) é maior quando comparado com o mesmo filme imerso na solução
com pH próximo ao pKa do sistema (pH 8,0).
Capítulo V – Caracterização ôhmica para aplicação em sensor de pH Parte I
95
Um resultado muito interessante obtido para este sistema é o curto tempo de
resposta quando comparado com dados da literatura. 244-246 As mudanças nos
valores de resistência foram observadas dentro de um intervalo de 10 segundos,
partindo de meio ácido para meio básico e vice-versa. Grant e Glass244 trabalharam
com o corante seminaftorodamina-1-carboxilado encapsulado por sol-gel, o qual
resultou em um sensor de pH com tempo de resposta de 15 s. Tempos de resposta
de 3 a 5 min foram obtidos para sensores de pH baseados em polímeros
sintetizados eletroquimicamente, como Ppi e polianilina.245 Porém, tempos de
resposta mais curtos, menores que 1 s, também foram obtidos para Ppi sintetizado
eletroquimicamente sobre eletrodos de platina.246
V.4.3. Estabilidade Ôhmica
A estabilidade de um material é um dos requisitos mais importantes para a
aplicação de um sensor. Neste trabalho a estabilidade foi analisada através de
medidas de resistência dos filmes Ppi-AB imersos em soluções tampão de diferentes
pHs (1,5; 3,0; 7,0; 7,5; 8,0 e 11,0). A Figura 43 mostra a variação da resistência dos
filmes imersos em pH 3,0; 7,0 e 8,0 durante um período de ca. 225 horas.
De acordo com os resultados obtidos, o filme Ppi-AB pode ser considerado
estável em meio ácido e neutro, sendo pouco estável em meio alcalino,
principalmente em pH 11, o qual perde a estabilidade durante os primeiros minutos
da medida (por este motivo os resultado não estão mostrados). A perda de
estabilidade ocorre principalmente devido à perda de aderência do filme ao
substrato. Para pH 7,0 e 8,0, a resistência do filme diminui após um certo tempo de
condicionamento. Este comportamento foi previamente explicado (seção IV.4.1) em
termos da maior disponibilidade de ânions presentes neste meio, favorecendo o nível
de dopagem e portanto a diminuição da resistência.
As medidas em pH 1,5 e 7,5 apresentaram comportamentos similares às
medidas em pH 3,0 e 7,0, respectivamente. Resultados semelhantes foram obtidos
para sensores ópticos de pH baseados em Ppi,186 o qual possui maior estabilidade
em meio ácido. É importante ressaltar que o sensor obtido (Ppi-AB) possui maior
área de trabalho (ca. 10 mm2) em relação à espessura, e de acordo com a literatura,
esta maior área pode ser favorável para a estabilidade.204
Capítulo V – Caracterização ôhmica para aplicação em sensor de pH Parte I
96
Figura 43: Estabilidade ôhmica do filme Ppi-AB imerso em tampão fosfato de pH 3,0,
7,0 e 8,0.
V.4.4. Reprodutibilidade e Reversibilidade Óptica
Durante este experimento, o mesmo filme foi imerso em soluções de pH 1,5;
3,0; 7,0; 7,5 e 8,0, sucessivamente. A leitura da resistência elétrica foi realizada após
5 minutos de imersão do filme nas respectivas soluções tampão. O filme foi então
enxaguado com água deionizada e imerso na próxima solução tampão fosfato (STF).
Como as medidas em pH 1,5 e 7,5 possuem o mesmo comportamento que as
medidas em pH 3,0 e 7,0, respectivamente, optou-se em não mostrar estas curvas
buscando um gráfico com a visualização mais fácil dos resultados, que estão
mostrados na Figura 44.
No início das medidas foi observada uma queda drástica da resistência,
sendo este comportamento associado com o tempo de condicionamento do filme,206
o qual é necessário para que ocorra a distribuição e homogeneização das cargas na
matriz polimérica. Após o tempo de condicionamento, o filme pode ser considerado
reversível e reprodutível entre a 25 o e a 59 o medida. Com a finalidade de avaliar se
o filme mantinha suas propriedades ôhmicas após ser seco, um intervalo de 24 h foi
0,0 0,8 1,6 2,4 75 150 225
-1,0
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
pH 3,0
pH 7,0
pH 8,0
R
(R
tam
pã
o -
Ra
r) /
Tempo / h
Capítulo V – Caracterização ôhmica para aplicação em sensor de pH Parte I
97
usado entre a 59 o e a 60 o medida para secar o sensor Ppi-AB. Os resultados
indicaram um comportamento reprodutível, já que o sistema retorna à sua resistência
inicial, se recondiciona, e então se tornar estável, reprodutível e reversível
novamente. No entanto, a resistência do filme em meio ácido e neutro foi mais
reversível do que aquela para os filmes em pH 8,0. Este comportamento pode ser
resultado do processo de desprotonação, que de acordo com a Figura 41, já ocorre
neste meio.
Figura 44: Reversibilidade e reprodutibilidade do filme Ppi-AB imerso em solução
tampão fosfato com pH 3,0; 7,0 e 8,0.
Estes resultados podem ser comparados com os da literatura,231,247 onde
foram estudados filmes de polipirrol sintetizados com diferentes dopantes, os quais
se apresentaram reversíveis e reprodutíveis. Esta característica pode ser decorrente
da forte influência dos processos de oxidação/redução destes materiais, a qual
permite mudanças conformacionais reversíveis no polímero.
0 20 40 60 80 100 120
650
700
750
800
850
900
950
pH 3,0
pH 7,0
pH 8,0
Re
sis
tên
cia
/
Número de medidas
Capítulo V – Caracterização ôhmica para aplicação em sensor de pH Parte I
98
V.4.5. Efeito da Temperatura
A Figura 45 mostra a resistência relativa do filme Ppi-AB imerso em solução
tampão de pH 1,5; 3,0; 7,0; 7,5 e 8,0 em função da temperatura (15, 25, e 35 °C). A
resistência diminui com o aumento da temperatura, sendo que as curvas
correspondentes em todos os pH apresentam aproximadamente a mesma
inclinação. A resistividade de um semicondutor convencional, como silício, diminui
exponencialmente com o aumento da temperatura (T). Este mesmo fenômeno
também pode ser observado para polímeros conjugados, visto que são considerados
também semicondutores (dependendo do grau de dopagem podem ser considerados
desde isolantes até metais). Especificamente para polímeros conjugados a
resistividade diminui com o aumento da temperatura, variando relativamente à
T-1/4.248
A diminuição da resistência com o aumento da temperatura pode ser
explicado pelo aumento na excitação térmica dos elétrons da banda de valência, que
são então transferidos para a banda de condução, tendo, portanto, maior mobilidade
e conseqüentemente favorecendo o aumento da condutividade (que neste caso pode
ser traduzido em diminuição de resistência elétrica).213-249 Poderíamos esperar um
comportamento diferente em pH alcalino, já que este meio afeta a cadeia polimérica
devido ao processo de desprotonação. Entretanto, a cadeia polimérica mesmo após
a desprotonação, permanece parcialmente dopada, possuindo bandas polarônicas e,
portanto, possibilita a migração dos elétrons das bandas ligantes para as bandas
antiligantes.
Capítulo V – Caracterização ôhmica para aplicação em sensor de pH Parte I
99
Figura 45: Efeito da temperatura sobre a resistência elétrica do filme Ppi-AB imerso
em soluções tampão fosfato de pH 1,5; 3,0; 7,0; 7,5 e 8,0.
V.4.6. Efeito de Interferentes
Os efeitos de diferentes íons na resposta ôhmica do filme Ppi-AB foram
estudados adicionando-se 0,01 e 0,15 mol.L-1 dos íons pirofosfato (P2O74-), cloreto
(Cl-), potássio (K+), nitrato (NO3-), e bissulfito (HSO3
-) nas soluções tamponadas. Os
valores obtidos foram normalizados utilizando a Equação 7. Os coeficientes de
interferência (C.I.) foram calculados a partir da resistência do Ppi-AB imerso em
solução tampão contendo o interferente (Ri) comparado com a resistência do Ppi-AB
imerso em solução tampão sem interferente (Rx). Valores de C.I. próximos de zero
equivalem a interferência irrelevante.
x
xi
R
RRIC
)(.(%).
Equação 7
Os resultados obtidos estão mostrados na Tabela 3. De acordo com os
valores calculados, a resposta ôhmica do Ppi-AB foi afetada somente pela presença
dos íons nitrato e bissulfito a 0,15 mol.L-1, assim como observado para o efeito de
15 20 25 30 35
-0,4
-0,2
0,0
0,2
0,4
(R
tam
pã
o-R
ar)
/ R
ar
Temperatura / oC
pH 1,5
pH 3,0
pH 7,0
pH 7,5
pH 8,0
Capítulo V – Caracterização ôhmica para aplicação em sensor de pH Parte I
100
interferentes na resposta óptica do sensor. Estas mudanças podem ser relacionadas
às propriedades redutoras e oxidantes destes íons, respectivamente, já que eles
podem modificar o nível de oxidação do Ppi e, portanto a resistência do filme.
Entretanto, esta interferência foi relativamente pequena quando comparada com
valores da literatura.186
Os íons cloreto e potássio não afetaram a resposta do sensor de forma
significativa. Considerando que estes íons estão normalmente presentes no leite,
soro e água do mar, o filme Ppi-AB pode ser aplicado para analisar esse tipo de
amostra. Além disso, a variação da concentração dos íons interferentes não foi
significativa, sugerindo que a força iônica do meio não interfere na resposta ôhmica
do Ppi-AB.
Tabela 3: Coeficientes de interferência (C.I.) obtidos por medida de resistência para
o Ppi-AB imerso em soluções tamponadas contendo 0,01 e 0,15 mol.L-1 de
interferentes.
0,01 mol.L-1 0,15 mol.L-1
pH P2O74- Cl- K+ NO3
- HSO3- P2O7
4- Cl- K+ NO3- HSO3
-
1,5 0,00 0,04 0,06 0,05 0,07 0,00 0,03 0,10 0,15 0,17
3,0 0,01 0,00 0,01 0,06 0,08 0,00 0,00 0,01 0,08 0,15
7,0 0,00 0,04 0,00 0,03 0,08 0,00 0,02 0,01 0,12 0,10
7,5 0,00 0,00 0,07 0,01 0,13 0,01 0,08 0,09 0,08 0,18
8,0 0,00 0,02 0,05 0,02 0,10 0,00 0,04 0,11 0,15 0,17
Capítulo V – Caracterização ôhmica para aplicação em sensor de pH Parte I
101
V.5. Conclusões Parciais
O filme obtido através da dopagem eletroquímica do Ppi com AB responde a
mudanças de pH possuindo sensibilidade de 1,71 ± 0,20 M.pH-1. Além disso,
apresenta mudanças reversíveis da resistência na faixa de pH entre 1,5 e 7,5. O
Ppi-AB é um material promissor para aplicação como sensor de pH, já que possui
importantes características de um sensor eficiente, como tempo de resposta curto,
estabilidade, reversibilidade, reprodutibilidade e adicionalmente à estas
propriedades, ele pode ser usado como um sensor miniaturizado para pH, permitindo
análises em pequenos volumes de amostras.
Conclusões Gerais Parte I [Year]
102
VI. Conclusões Gerais
Obteve-se um material com potencial aplicação para sensor de pH
utilizando-se um método fácil, reprodutível, eficiente e de baixo custo. O material foi
obtido através da dopagem eletroquímica do polipirrol com um indicador ácido-base
(azul de bromofenol). Os filmes de Ppi-AB obtidos eletroquimicamente foram
caracterizados por diferentes técnicas, as quais mostraram que as propriedades do
Ppi são afetadas de forma significante na presença do AB. Medidas de Raman
ressonante in situ permitiram a análise do comportamento do corante no interior da
matriz polimérica de Ppi imerso em soluções tampão de diferentes pH (eletrólito),
aplicando-se diferentes potenciais. Tanto as propriedades ópticas, quanto ôhmicas
do Ppi-AB apresentaram-se como dependentes do pH do meio, desta forma,
estudou-se estas propriedades para a possível aplicação do filme como sensor de
pH. De acordo com as análises destas propriedades o sensor apresenta um bom
potencial de aplicação, já que ambos os comportamentos óptico e ôhmico
apresentam boa estabilidade, reversibilidade, reprodutibilidade e tempo de resposta.
No entanto, o sensor óptico apresenta uma vantagem sobre o ôhmico, apresentando
sensibilidade para uma maior faixa de pH, a qual inclui a faixa de pH de meios
fisiológicos. O sensor ôhmico de pH apresentou inversão do comportamento da
curva de sensibilidade ao pH, acarretando na diminuição da faixa de sensibilidade.
103
Parte II
Sensor biológico baseado
em filmes de ouro
nanoestruturado
Introdução Parte II [Year]
104
Parte II
I. Considerações Iniciais
I.1. Introdução
I.1.1. Câncer
A palavra câncer tem origem no latim, cujo significado é caranguejo. A doença
tem esse nome, pois as células doentes atacam e se infiltram em células sadias
como se utilizassem as garras de um caranguejo para isso.250 Esta doença tem um
período de evolução inconstante, podendo muitas vezes, levar anos para evoluir até
ser descoberta. Atualmente, foram identificados mais de cem tipos de câncer, sendo
que a maioria tem cura, desde que tratados em um estágio inicial de
desenvolvimento. Esse conjunto de mais de cem doenças tem em comum o
crescimento desordenado (maligno) de células que invadem tecidos e órgãos,
podendo espalhar-se (metástase) para outras regiões do corpo. Estas células
tendem a ser muito agressivas e incontroláveis quando dividem-se rapidamente,
levando à formação de tumores (acúmulo de células cancerosas) ou neoplasias
malignas. Por outro lado, um tumor benigno significa simplesmente uma massa
localizada de células que se multiplicam vagarosamente e se assemelham ao seu
tecido original, raramente constituindo um risco de vida.251
A Agência Internacional de Pesquisa do Câncer aponta para este ano a
descoberta de 12 milhões de novos casos, e mais de 7 milhões de mortes
decorrentes da doença, sendo que a previsão só no Brasil, corresponde a mais de
460 mil novos casos de câncer. A projeção para 2030 é de 20 a 26 milhões de
diagnósticos e de 13 a 17 milhões de óbitos.252 As causas que levam ao câncer são
variadas, podendo ser externas ou internas ao organismo, estando ambas inter-
relacionadas. As causas externas estão relacionadas ao meio ambiente e aos
hábitos ou costumes próprios de um ambiente social e cultural. Dentre todos os
casos de câncer, cerca de 80% a 90% estão associados a fatores ambientais.253 As
causas internas são, na maioria das vezes, geneticamente pré-determinadas e estão
ligadas à capacidade do organismo de se defender das agressões externas. Esses
fatores causais podem interagir de várias formas, aumentando a probabilidade de
Introdução Parte II [Year]
105
transformações malignas nas células normais. Alguns deles são bem conhecidos: o
tabagismo pode causar câncer de pulmão, de boca e de garganta; a exposição
excessiva ao sol pode causar câncer de pele, e distúrbios hormonais podem levar à
geração de câncer de mama. O envelhecimento traz mudanças nas células que
aumentam sua suscetibilidade à transformação maligna. Além disso, as células das
pessoas idosas foram expostas por mais tempo aos diferentes fatores de risco para
o câncer,253 explicando em parte a razão de o câncer ser mais freqüente nesses
indivíduos. Outros fatores como alguns componentes dos alimentos que ingerimos,
ainda estão em fase de estudo, além de vários outros fatores que infelizmente ainda
são desconhecidos. São raros os casos de câncer que se devem exclusivamente a
fatores hereditários, apesar de o fator genético exercer um papel importante na
oncogênese.
Desde o início do século a postura da sociedade em geral é acreditar que o
câncer é sempre sinônimo de morte e, portanto o seu tratamento raramente leva à
cura. Atualmente, muitos tipos de câncer podem ser curados, na verdade mais da
metade dos casos de câncer tem cura, desde que tratados em estágios iniciais. Esta
dependência da chance de cura com o tratamento da doença na fase inicial
demonstra a importância do diagnóstico precoce. Um dos principais desafios no
diagnóstico precoce é que não há um marcador comum para os mais de 100 tipos de
câncer. Portanto, os médicos não podem simplesmente utilizar um sensor para
detectar a presença de uma forma específica de câncer. Devido a falta de sistemas
que proporcionem detecção eficiente e rápida, o diagnóstico e prognóstico de câncer
atualmente dependem de análises que patologistas têm usado por mais de
100 anos.254 Estima-se que apenas nos Estados Unidos, cerca de R$ 206 bilhões
são gastos anualmente em tratamentos, em geral, para melhorar a chance daqueles
que estão nas fases avançadas. No Brasil, esse número gira em torno de R$ 1,2
bilhão, de acordo com uma pesquisa realizada pelo Instituto Nacional de Câncer em
2007.252 Infelizmente, todo este investimento em muitos casos, aumentam apenas
marginalmente o tempo de sobrevida do paciente, ao custo de muito sofrimento. A
detecção precoce de câncer significa um avanço muito importante na luta contra a
doença, possibilitando a aplicação de tratamento no estágio inicial do seu
desenvolvimento, aumentando assim a taxa de sobrevivência dos pacientes.
Introdução Parte II [Year]
106
I.1.1.1. Marcadores de Câncer
Marcadores de câncer são substâncias produzidas por células cancerígenas e
por outras células do corpo em resposta ao câncer ou a tumores benignos.‡ Estas
substâncias podem ser encontradas no sangue, na urina, no tecido do tumor ou em
outros tecidos.255
Atualmente já foram identificados mais de 100 tipos de substâncias que
podem ser encontradas em concentrações alteradas no organismo de pacientes
portadores de algum tipo câncer. Pesquisadores já encontraram marcadores para
todos os tipos de câncer, mas embora a medida de concentrações anormais destas
substâncias sugira a presença de câncer, somente esta medida não é suficiente para
o diagnóstico da doença. Desta forma, medidas das concentrações dos marcadores
são combinadas com outros testes, como a biópsia, para um diagnóstico indubitável
do câncer.256 Além disso, a medida da variação da concentração destes marcadores
pode ser utilizada para checar a evolução do paciente em resultado a um tratamento.
O desafio tecnológico que separa os cientistas dos testes de diagnóstico
precoce bem-sucedidos, não está mais relacionado com a procura de potenciais
marcadores genéticos da doença, mas da dificuldade de detecção destes no
organismo, pois existe um abismo entre as quantidades que precisam ser detectadas
e a sensibilidade das técnicas atuais.252
I.1.2. Sensores biológicos
O estudo e desenvolvimento de biosensores para detecção de compostos
químicos e biológicos tem atraído pesquisadores da área de química, física e de
materiais. Estes sensores têm se mostrado ferramentas muito importantes para a
análise de produtos químicos e biológicos que contaminam o meio ambiente,
agentes patogênicos presentes em alimentos, vírus, etc.257-260 Os biosensores
apresentam uma série de vantagens quando comparados aos métodos
convencionais de cromatografia e bioquímicos como cromatografia gasosa acoplada
a espectrometria de massa (CG-MS) e Análise-Enzima-Imuno-Adsorvida (ELISA,
enzyme-linked imunosorbent assay). Utilizando biosensores o tempo necessário
para as análises é menor, os dispositivos são encontrados em tamanhos
‡ Tumores benígnos podem crescer muito, mas são localizados, não se espalham para outras partes
do corpo.
Introdução Parte II [Year]
107
miniaturizados, com instrumentação compacta; são fáceis de manusear, são
portáteis, facilitando análises de campo e ainda apresentam baixo custo. Uma
grande variedade de métodos ópticos tem sido investigada para uso em
biosensores, incluindo SPR (ressonância de plasmón de superfície),
quimioluminescência, interferometria e elipsometria.261-264 Levando-se em
consideração a grande quantidade de novos casos de câncer somada a limitada
disponibilidade de dinheiro do sistema de saúde, fica clara a necessidade de um
sistema de detecção precoce da doença. Um biosensor integrado é uma tecnologia
que tem grande potencial para resolver este problema. O sistema integrado pode ter
multiplicidade de resposta, possibilitando a detecção de várias formas de câncer pelo
mesmo sensor e pode ser pequeno e de baixo custo. Esta é uma grande vantagem
já que para proporcionar aos médicos um perfil de biomarcadores, é necessário
produzir um conjunto de biosensores. O sistema de microfluídos chamado
lab-on-chip tem sido adequadamente aplicado para este tipo de análise. Também
chamados de sistemas completos de microanálise, estes dispositivos apresentam
muitas vantagens sobre aqueles em macro escala em termos de velocidade de
análise, custo, eficiência e quantidade de reagente e amostras consumidas durante a
análise.265 Uma vantagem a mais destes sistemas que usam microcanais é a
possibilidade de serem integrados a biosensores baseados em ressonância de
plasmón de superfície, e que exploram este efeito através de um conjunto de
nanoburacos.266
I.1.3. Ressonância de plasmón de superfície (SPR)
O fenômeno da difração em grades devido à excitação de plasmóns de
superfície (SP) foi primeiramente descrito no início do século XX por Wood.267 No
final dos anos 60, a excitação óptica dos plasmóns de superfície foi demonstrada por
Kretschmann268 e Otto.269 Desde então, os SP têm sido extensivamente
estudados.270,271
O SPR é a oscilação de densidade de carga que pode existir na interface
entre dois meios com constantes dielétricas de sinais opostos, por exemplo, um
metal e um dielétrico. A densidade de carga é associada a uma onda
eletromagnética, cujo vetor de onda é máximo na interface e decai
exponencialmente com a distância (campo evanescente). Desta forma, o SPR pode
Introdução Parte II [Year]
108
ser afetado e afetar as regiões próximas à interface. De acordo com Hanken e
cols.272 o vetor de onda do campo evanescente é dado pela Equação 8.
𝜅𝑝𝑎𝑟𝑎 = 𝑛𝑝 𝜔
𝑐 𝑠𝑒𝑛𝜃 Equação 8
Onde kpara é o vetor de onda do fóton paralelo ao plano de incidência, np é o
índice de refração do prisma, θ é o ângulo de incidência do prisma, ω é a frequência
da luz incidente, c é a velocidade da luz no vácuo. A constante de propagação do SP
na interface dielétrico|metal é dada pela Equação 9, onde ksp é o vetor de onda do
fóton que entra em ressonância com os elétrons livres na superfície
(induz plasmóns), e εm e εa são as constantes dielétricas do metal e do meio
dielétrico (ar ou água), respectivamente.
𝜔 = 𝑐𝜅𝑠𝑝 1
𝜀𝑚 +
1
𝜀𝑎 Equação 9
É importante ressaltar a necessidade dos dois meios da interface terem
constantes dielétricas (ε) de sinais opostos (como o ouro de sinal negativo e a água
de sinal positivo) para que ocorra a ressonância plasmônica. Quando kpara se iguala
a ksp, o campo elétrico entra em ressonância com os elétrons livres da superfície
metálica (por isso o nome ressonância plasmônica) e plasmóns de superfície são
criados, aumentando a intensidade do campo evanescente.
Geralmente, utiliza-se ouro como metal devido a sua grande resistência à
oxidação e boa condutividade elétrica. A incidência de uma fonte luminosa com um
certo ângulo de incidência faz com que os elétrons livres do metal oscilem,
absorvendo energia luminosa, gerando ondas evanescentes que se propagam
paralelamente à interface metal|dielétrico (Figura 46). Nesta situação tem-se a
ressonância de plasmón de superfície, detectada pela diminuição na intensidade da
luz refletida (portanto, com máximo de condição ressonante). O ângulo de incidência
no qual ocorre este fenômeno é denominado ângulo de SPR (θSPR) e é utilizado para
quantificar a variação no índice de refração causado pela presença de diferentes
moléculas na superfície metálica.
Como mencionado anteriormente, a intensidade da onda evanescente decai
exponencialmente com a distância da superfície do ouro (Figura 46), sendo que a
extensão do decaimento varia conforme a espécie que está sendo analisada,
Introdução Parte II [Year]
109
correspondendo a cerca de 25 a 50% do comprimento de onda da luz utilizada,273
que em equipamentos comerciais varia de 600 a 850 nm.
Figura 46: Decaimento exponencial da onda evanescente relacionada com a
distância da superfície metálica.
O decaimento é obtido em nanômetros pela Equação 10,274 onde é o
comprimento de onda utilizado pelo equipamento, neff é o valor do índice de refração
monitorado pelo equipamento de SPR e ε é a constante dielétrica do ouro
(-23,124)275 ou de outro metal utilizado. O valor do decaimento pode também ser
estimado em 0,4 ± 0,1 (ou aproximadamente 25 a 50%) do comprimento de onda.274
𝐼𝑑 = 𝜆
2𝜋 /
−𝑛𝑒𝑓𝑓4
𝑛𝑒𝑓𝑓2 +𝜀𝑚𝑒𝑡𝑎𝑙
12
Equação 10
O ângulo em que ocorre o máximo de ressonância depende do índice de
refração do meio que está em contato com o metal, e varia proporcionalmente com a
concentração de moléculas na região de propagação da onda evanescente. É,
portanto, uma ferramenta de extrema utilidade para detectar a associação e
dissociação de biomoléculas em tempo real. Contudo, a técnica de SPR
convencional apresenta uma grande desvantagem: trabalhar com o modo de
aquisição por reflexão experimentalmente é muito difícil, principalmente devido à
dificuldade de se alinhar o sistema óptico para encontrar o ângulo apropriado de
Introdução Parte II [Year]
110
incidência de luz. Apesar da grande sensibilidade dos sensores baseados em SPR,
a dificuldade experimental da análise é um grande inconveniente que tem que ser
levada em consideração.
I.1.3.1. SPR através de filme de ouro com nanoburacos
O aumento no interesse em SP é também devido aos avanços em métodos
de nanofabricação, que têm permitido estruturar e caracterizar metais em escala
nanométrica, resultando em materiais com propriedades químicas e físicas
incomuns. Estes materiais podem controlar as propriedades do SP, possibilitando
sua aplicação em óptica, microscopia, células solares, assim como em sensores
para marcadores biológicos.276
No século XX começou o interesse pela tecnologia envolvendo buracos de
sub-comprimento de onda§ (subwavelength). Com o aumento da importância da
tecnologia de microondas nos anos 40, Bethe277 fez um estudo teórico das
propriedades de difração de um buraco que ele idealizou como tendo diâmetro de
sub-comprimento de onda, em um filme metálico perfeitamente condutor com
espessura próxima de zero. Através destas observações ele concluiu que a
transmissão de luz através deste buraco seria mínima. Com estas considerações,
ele chegou a uma equação simples para expressar a eficiência de transmissão ηB
(normalizada para a área de abertura), Equação 11, onde k = 2π/ é o comprimento
do vetor de onda da luz incidente de comprimento de onda e r é o raio do buraco.
𝜂𝐵 =64 𝑘𝑟 4
27𝜋2 Equação 11
De acordo com esta equação, seria esperado que a transmissão óptica caísse
rapidamente conforme se torna maior que r, como mostrado na Figura 47.
§ Buracos com diâmetro nanométrico, sendo menores que o comprimento de onda da luz incidente
Introdução Parte II [Year]
111
Figura 47: Difração e espectro de transmissão típico de luz visível através de um
buraco com sub-comprimento de onda em um filme metálico perfeito infinitamente
fino.278
No entanto, a luz transmitida pode ter um comportamento completamente
inesperado.279 Através de alguns experimentos, Ebbesen278 mostrou que uma
abertura circular simples, como a mostrada na Figura 48 apresenta um espectro de
transmissão com uma banda que não era prevista pela teoria de Bethe.277
Figura 48: Transmissão óptica através de um único buraco em um filme metálico de
prata. a) Buraco circular de 270 nm de diâmetro em um filme com 200 nm de
espessura e b) seu espectro de transmissão.278
O comportamento apresentado na Figura 48 revela a presença de um
fenômeno ressonante, o qual melhora a transmissão de luz através do nanoburaco,
ou seja, a geração de plasmóns de superfície ligada às propriedades físicas do
nanoburaco aumentam muito a quantidade de luz transmitida. Esta transmissão
pode ser definida como extraordinária (EOT – Extraordinary Optical Transmission)
Comprimento de onda / nm
Inte
nsid
ade
/ un
i. ar
b.In
ten
sid
ad
etr
an
smiti
da
/ un
i. a
rb.
Comprimento de onda / nm
Introdução Parte II [Year]
112
quando a eficiência de transmissão é maior que 1, em outras palavras, quando o
fluxo de fótons por unidade de área transmitidos é maior do que o fluxo incidente.
A teoria de Bethe é muito idealizada para tratar de situações onde são
envolvidos modos de superfícies e onde modos evanescentes e de propagação
podem ser excitados dentro da abertura.280 Uma abertura real é caracterizada por
uma profundidade e, portanto possui propriedades de um guia de ondas. A
transmissão de luz através deste guia de ondas é bem diferente da propagação da
luz em um espaço vazio.
O espaço confinado modifica a dispersão do campo eletromagnético. As
dimensões laterais do guia de ondas definem o comprimento de onda no qual a luz
não se propaga através do buraco, conhecido como comprimento de onda de corte
c. Quando o comprimento de onda da luz incidente for maior que o comprimento de
onda de corte ( > c), a transmissão é exponencialmente pequena, caracterizando o
regime de não propagação como mostrado na Figura 49. Com metais reais, o
comprimento de onda de corte não pode ser exatamente definido, pois com o
aumento do comprimento de onda ocorre a contínua conversão do regime de
propagação para o regime evanescente.
Figura 49: Guia de ondas cilíndrico com raio r muito menor que o comprimento de
onda do campo eletromagnético incidente, perfurado em um filme metálico de
espessura h. A diminuição exponencial representa a atenuação do regime de
sub-comprimento de onda.278
O espectro de transmissão de luz através de um único buraco é definido
somente pelo diâmetro do buraco e pela espessura do filme metálico. Contudo ao
preparar-se um filme metálico com um arranjo de buracos periodicamente ordenados
Introdução Parte II [Year]
113
pode-se controlar o espectro de luz transmitida, controlando-se a periodicidade dos
buracos (distância centro-centro).
Figura 50: Imagens (esquerda) e espectros (direita) de transmissão com incidência
normal de luz branca através de arranjos quadrados contendo buracos com
sub-comprimento de onda. Para os arranjos azul, verde e vermelho, foram utilizadas
periodicidades de 300, 450 e 550 nm, respectivamente, os diâmetros dos buracos
são 155, 180 e 225 nm e o comprimento de onda para máxima transmissão ocorre
em 436, 538 e 627 nm. Os arranjos foram fabricados em um filme de prata de
300 nm de espessura.276
Entre outras aplicações, estes arranjos podem atuar como filtros de luz, como
mostra a Figura 50, onde os arranjos de nanoburacos estão sendo irradiados por
trás com uma fonte de luz branca. O espectro é dominado pelos modos de SP
devido à periodicidade dos arranjos como mostrado na Figura 50. O formato e
dimensões dos buracos no arranjo também influenciam o espectro de
transmissão.281,282
Os arranjos de nanoburacos foram caracterizados tanto teoricamente283-293
quanto experimentalmente.292-299 O conjunto de nanoburacos age como uma grade
de difração bidimensional que converte os fótons incidentes em plasmóns de
superfície. Embora os mecanismos de como a luz é transmitida através dos
nanoburacos ainda não sejam completamente conhecidos, geralmente aceita-se a
idéia de que os fótons incidentes acoplam com os elétrons da superfície metálica.309
Esta interação resulta em plásmons de superfície, que acoplam através do filme
metálico, sendo re-irradiados do lado oposto ao incidente. Em outras palavras, a luz
incidente é espalhada pelos conjuntos de nanoburacos produzindo ondas
I/I 0
(un
i. a
rb.)
770670570470370
Comprimento de onda (nm)
Introdução Parte II [Year]
114
evanescentes que tunelam através dos nanoburacos. O plasmón de superfície
intensifica o campo eletromagnético associado com as ondas evanescentes,
resultando num aumento da transmissão.276
A posição max das bandas de transmissão (Figura 50) para um ângulo normal
de incidência pode ser estimada pela Equação 12, onde P é a periodicidade do
arranjo, εm e εd são, respectivamente, as constantes dielétricas do metal e do
material dielétrico em contato com o metal e i,j são os coeficientes de difração do
arranjo geométrico.
𝜆𝑚𝑎𝑥 =𝑃
43 𝑖2+𝑖𝑗 +𝑗 2
𝜀𝑚 𝜀𝑑
𝜀𝑚 +𝜀𝑑 Equação 12
Como esta equação não leva em consideração a presença dos buracos e as
perdas associadas com a difração, ela negligencia a interferência que origina o
deslocamento do pico de ressonância.290,291
As condições de ressonância definidas pela Equação 12 são relacionadas à
simetria do arranjo. Portanto, os SPs gerados nos arranjos se propagarão nos eixos
de simetria definidos com sua própria polarização dependendo de (i,j). Isto resulta
em um comportamento fortemente dependente da polarização.300
Ambas as superfícies dos dois lados dos buracos podem sustentar os modos
de SP de forma independente devido à diferença na εa do material próximo à
superfície metálica (normalmente vidro e ar), como previsto pela Equação 12. Assim,
o espectro de transmissão das estruturas assimétricas contém dois picos de
ressonância, onde cada pico pertence a uma interface. Quando as constantes
dielétricas entram em ressonância (valores próximos), obtém-se um pico de
transmissão mais intenso. Em muitas aplicações, arranjos de buracos de tamanho
finito são usados por razões práticas. Se o arranjo possui pequena quantidade de
buracos, então a periodicidade não é bem definida e a contribuição das
extremidades se torna significante, mudando o espectro e levando a re-emissões
não usuais.301
Como o efeito da transmissão ressonante ocorre através da excitação e
propagação de SP próximo à interface metal|dielétrico, este efeito é sensível a
mudanças de índice de refração próximo à interface, da mesma forma que ocorre em
sensores SPR convencionais baseados em um prisma.302,303
Introdução Parte II [Year]
115
A sensibilidade (S) da superfície em detectar diferentes índices de refração é
definida pela variação do comprimento de onda () em função da variação do
índice de refração. Durante a adsorção de moléculas sobre a superfície do sensor
ocorrem mudanças no índice de refração, o qual passa a ser chamado neff e
admite-se como valor de nb o índice de refração atingido após a injeção de uma
solução tampão (eg. STF), correspondente ao branco da medida.
∆𝜆 = 𝑆 𝑛𝑒𝑓𝑓 − 𝑛𝑏 Equação 13
Considerando o decaimento exponencial característico do campo
eletromagnético evanescente, a intensidade da luz decai em função da distância z
acima da superfície do metal como o quadrado de uma exponencial, tal qual a
equação [exp(-z/Id)]2, o que implica no fator de ponderação a ser utilizado no cálculo
do índice de refração neff ser igual a exp(-2z/Id) (Equação 14), na qual n(z) é o índice
de refração a uma distância z.
𝑛𝑒𝑓𝑓 = 2
𝐼𝑑 𝑛 𝑧 𝑒𝑥𝑝
−2𝑧
𝐼𝑑 𝑑𝑧
∞
0 Equação 14
O uso desta equação não está restrito a estruturas de bicamadas,274 podendo
ser empregado em sistemas de multicamadas. As multicamadas podem ser
consideradas como tendo n(z) = na para valores de z compreendidos entre 0 e d
(espessura dos filmes), e n(z) = nb para os valores de z compreendidos entre d e o
infinito, pode-se então simplificar a integral da Equação 14. Obtém-se desta forma a
Equação 15, que substituída na Equação 13, fornece a Equação 16.
𝑛𝑒𝑓𝑓 = 𝑛𝑏 + 𝑛𝑎 − 𝑛𝑏 1 − 𝑒𝑥𝑝 −2𝑑
𝐼𝑑 Equação 15
𝜆 = 𝑆 𝑛𝑎 − 𝑛𝑏 1 − 𝑒𝑥𝑝 −2𝑑
𝐼𝑑 Equação 16
O deslocamento espectral devido às ligações das moléculas sobre a
superfície sensorial é então dado por = S(η) onde S é a sensibilidade espectral
e depende dos parâmetros geométricos das matrizes de nanoburacos e das funções
dielétricas do meio. No caso de imagens SPR para detecção múltipla, pode ser mais
Introdução Parte II [Year]
116
útil a medida em tempo real da variação da intensidade transmitida IT em um
comprimento de onda fixo, o qual é dado por:
∆𝐼𝑇 = − d𝐼𝑇 dλ . S∆η Equação 17
A dimensão da EOT depende de muitos parâmetros, incluindo o índice de
refração do meio sobre a superfície do filme metálico, o comprimento de onda da luz
incidente, a geometria do buraco e a periodicidade. Em 2002, foi apresentado a
possibilidade em se explorar a EOT e os arranjos de nanoburacos como sensores
biológicos.304
I.1.3.2. Aplicação de sensores baseados em SPR
A EOT pode ser utilizada para monitorar a mudança do índice de refração
próximo à superfície, resultante, por exemplo, da modificação desta superfície com
uma monocamada, pois é dependente do índice de refração do meio em contato
com a superfície do filme metálico. Este conceito induziu muitas pesquisas no estudo
de reações químicas ou interações físicas com filmes metálicos, acerca da
intensidade305 ou a respeito do espectro306-308,309 da EOT através de arranjos de
nanoburacos. A utilização de plataformas com estes arranjos de nanoburacos tem
vantagens únicas, como:
i) área extremamente pequena, o que viabiliza a obtenção de um sensor para
detecção múltipla, facilitando a integração com microcanais e outros sistemas
miniaturizados para a detecção em tempo-real;
ii) em contraste ao modo de detecção por luz refletida, como nos sensores
convencionais que não utilizam moléculas marcadas, como prismas e grades
de difração, este material detecta EOT, ou seja, luz transmitida através dos
nanoburacos. Esta mudança simplifica a integração da instrumentação e a
miniaturização;
iii) a EOT através dos arranjos de nanoburacos é afetada por muitos parâmetros,
incluindo a forma e a periodicidade dos buracos. Estes parâmetros podem ser
usados para moldar o sinal do sensor de acordo com várias aplicações;
iv) os arranjos de nanoburacos podem ser produzidos em massa com alta
reprodutibilidade.
Introdução Parte II [Year]
117
Dispositivos baseados em SPR foram desenvolvidos para ser empregados em
vários campos, incluindo diagnose médica, monitoramento ambiental e análise de
alimentos.309-311 Sensores baseados em SPR já estão disponíveis comercialmente,
sendo usados na pesquisa biomédica e bioquímica para o monitoramento de
ligações na superfície de substratos,312 análises biomédicas,313 detecção da
sequência genômica de DNA,314 e detecção de materiais e organismos que
contaminam o ambiente.315 Liu e cols.311 demonstraram que conjuntos de
nanoburacos podem ser integrados em um sistema simples para uso como
biosensor óptico. Brolo e cols.309 demonstraram o uso de matrizes de nanoburacos
periodicamente organizados em filmes de ouro, como um sensor SPR para a
adsorção de biomoléculas (operado no modo de transmissão). O mecanismo
explorado consistiu na mudança do índice de refração na interface ouro|solução, o
qual resulta em um deslocamento do espectro de transmissão para maiores
comprimentos de onda. Conjuntos de nanoburacos também mostraram-se
promissores para a aplicação em biosensores na detecção com fluorescência316 e
para SERS (Surface Enhanced Raman Spectroscopy).309
I.1.3.3. Aplicação de sensores baseados em SPR para detecção de câncer
O diagnóstico de câncer é uma das áreas mais pesquisadas em química
bioanalítica. Uma grande variedade de métodos de detecção foram investigada.317 O
método mais comumente utilizado em biosensores emprega a detecção de
marcadores tumorais que se ligam a anticorpos imobilizados sobre a superfície do
sensor. A detecção da ligação é geralmente feita através de vários métodos,
podendo-se utilizar moléculas marcadas com fluoróforos ou bioconjugados de
nanopartículas. A estratégia mais comum é através do ELISA. Neste sistema, a
ligação anticorpo-antígeno (AC-AG) é indicada por um anticorpo, que acoplado a
uma enzima produz um sinal que é então detectado.254 Um grande desafio nesta
área é desenvolver um método que não precise de moléculas marcadas e que ao
mesmo tempo possibilite um alto grau de sensibilidade e baixo limite de detecção.
Os biosensores baseados em SPR são utilizados para monitorar interações
biomoleculares que ocorrem próximas à superfície do metal transdutor, sem a
necessidade de se marcar as biomoléculas. Através desta técnica, medidas em
tempo real podem ser realizadas para se estudar a ligação entre uma molécula
imobilizada sobre a superfície do metal com um analito específico presente em
Introdução Parte II [Year]
118
solução (eg. anticorpo-antígeno). A resposta é obtida através de medidas da
mudança do índice de refração, que é alterado devido a ligação entre as espécies
imobilizadas e o analito.318-321 A literatura descreve vários estudos onde biosensores
baseados em SPR foram eficientemente aplicados na detecção de marcadores de
câncer de pâncreas, mama, colo-retal, pulmão e gastrointestinal.322-327
O desenvolvimento de um circuito integrado contendo biosensores baseados
em SPR com análise de diferentes analitos acoplado a um leitor contendo um
controle de fluxo e equipamentos ópticos, proporcionaria um sistema de detecção
eficiente e de fácil manuseio.266,328
I.1.3.4. Tecnologia de sensores baseados em SPR
Modificação química da superfície do metal
Em sensores baseados em SPR a superfície do sensor é geralmente ouro ou
prata.329 Nesta superfície, ocorrem interações biomoleculares e ligações são
convertidas em sinais óptico-elétricos. A seletividade de um teste imunológico
baseado em SPR é obtida através de reconhecimento biológico do sistema
imobilizado sobre a superfície do metal (detecção por interação chave-fechadura). A
superfície do sensor é modificada com moléculas onde os analitos se ligam,
proporcionando resultados reprodutíveis e consistentes. Para se obter superfícies
altamente sensíveis, é necessária a formação de uma camada de moléculas
receptoras que seja organizada, de maneira a proporcionar sítios de ligação, sem
restrições de impedimento estérico. Diversos métodos de imobilização adequados
para testes imunológicos baseados em SPR têm sido publicados. Os anticorpos são
imobilizados através de suas cadeias glicol oxidadas,330 ou através de suas ligações
dissulfito.331 Os grupamentos ésteres N-hidroxisuccinimida (NHS) são usados em
monocamadas de alcanotióis de cadeia longa para a imobilização de anticorpos e
proteínas. Assim, estes alcanotióis possuem em uma extremidade grupos reativos
adequados para a imobilização de biomoléculas e em outra extremidade grupos tióis
que se ligam à superfície do ouro.332,333 Processos de silanização utilizando
3-aminopropiltrietoxisilano (3-APTES) também têm sido usados para ligar anticorpos
à superfície de ouro através do ligante glutaraldeído.334 Contudo, para a ligação de
receptores mais específicos, o complexo biotina-estreptavidina tem sido amplamente
utilizado (Figura 51).335,336
Introdução Parte II [Year]
119
Figura 51: Esquema de imobilização e detecção por bioafinidade das moléculas
biotina e estreptavidina.
Biomolécula de Interação
A escolha da espécie a ser imobilizada sobre a superfície do sensor depende
do método de detecção que será empregado. Quando se aplica o modo de detecção
direto, sanduíche e competitivo, a molécula a ser imobilizada é o elemento de
bio-reconhecimento; enquanto que no modo de detecção por inibição, a molécula a
ser imobilizada é o analito, ou seja, a espécie alvo. A escolha do elemento de
bio-reconhecimento e do método de imobilização apropriado é crucial para a
montagem de um sistema eficiente, afetando diretamente as características do
sensor como o limite de detecção, a sensibilidade e a especificidade.
Vários tipos de elementos de bio-reconhecimento são empregados em
biosensores baseados em SPR. Os anticorpos são sem dúvida os mais
freqüentemente utilizados, pois apresentam alta afinidade e especificidade em
relação a molécula alvo. Além disso, anticorpos que apresentam afinidade com
várias moléculas alvo estão disponíveis comercialmente. Contudo, o processo de
desenvolvimento de anticorpos de alta qualidade é muito caro e trabalhoso.337
cisteaminabiotina
estreptavidina
anticorpo
antígeno
Introdução Parte II [Year]
120
Recentemente, fragmentos de anticorpos têm sido usados como elementos de
bio-reconhecimento.338 Estudos mostram que estes fragmentos de anticorpos
biotinilados (ligados a moléculas de biotina) presentes em processo de fermentação,
podem ser detectados diretamente da solução sem a necessidade de purificação da
amostra. Para tal detecção é utilizado um sensor contendo estreptavidina imobilizada
sobre a superfície.339 Os peptídeos são outros tipos de elementos de
bio-reconhecimento que têm sido amplamente utilizados. Em comparação com os
anticorpos, os peptídeos são geralmente baratos, mais estáveis e mais fáceis de
manipular. Entretanto, nem sempre apresentam alta afinidade e especificidade em
relação a molécula alvo. Em biosensores baseados em SPR, os peptídeos são
principalmente aplicados para a detecção de anticorpos, por exemplo de
Hepatite G,340 herpes tipo 1 e tipo 2.341 Recentemente, aptâmeros**,342 têm sido
também aplicados em biosensores baseados em SPR.343,344
Imobilização de moléculas biológicas
A superfície do sensor, ou seja, a superfície do metal deve possibilitar a
imobilização de um número suficiente de elementos de bio-reconhecimento, evitando
ligações não específicas. Além disso, os elementos de bio-reconhecimento devem
ser imobilizados na superfície do sensor sem que esta imobilização afete a sua
atividade biológica. A princípio, as moléculas podem ser imobilizadas diretamente
sobre a superfície ou em uma matriz tridimensional. A imobilização direta sobre a
superfície é mais simples, contudo o número de elementos de bio-reconhecimento
que podem se ligar à superfície é limitado e ainda, se a densidade de elementos de
bio-reconhecimento é alta demais, a resposta do sistema pode ser prejudicada pelo
impedimento estérico. Por outro lado, um sistema tridimensional geralmente
proporciona um maior número de sítios de ligação para a imobilização das
moléculas.345 O sistema tridimensional mais comumente usado é obtido através de
dextran carboximetilado.332 Para a imobilização em duas dimensões sobre
superfícies de ouro, os métodos mais comuns envolvem o uso de camadas auto
montadas (SAMs) de alcanotiolatos ou dissulfitos.346
** Aptâmeros são moléculas de DNA ou RNA que agem como anticorpos, ligando-se com alta
afinidade a um particular alvo.
Introdução Parte II [Year]
121
As proteínas representam a classe de moléculas mais comumente usada
como elementos de bio-reconhecimento. O método mais utilizado para imobilização
de proteínas é via ligação covalente formada entre grupos funcionais nucleofílicos
presentes nos aminoácidos das proteínas e grupos eletrofílicos presentes na
superfície do sensor.332,347 A imobilização através de ligação covalente é estável,
contudo a grande quantidade de grupos funcionais presentes nas proteínas resulta
em imobilização de orientação randômica, a qual pode bloquear os grupamentos
ativos da proteína.
Outro método utilizado para a imobilização de proteínas é baseado na
afinidade bioquímica das espécies. O exemplo mais comum deste método é a
reação estreptavidina-biotina (Figura 51). Através deste método de imobilização, a
proteína estreptavidina é imobilizada sobre a superfície do sensor (imobilizada
covalentemente ou via biotina pré-imobilizada) proporcionando sítios de ligação para
subseqüente ligação de proteínas conjugadas com a biotina. A proteína pode ser
biotinilada através de vários métodos objetivando a detecção de diferentes grupos
funcionais presentes nas proteínas. A orientação das proteínas imobilizadas
depende da orientação das moléculas de estreptavidina, do método de biotinilação
empregado e das propriedades da proteína.347
I.1.4. Estratégias para a melhora da sensibilidade
I.1.4.1. Fatores Geométricos
Vários fatores geométricos influenciam as propriedades ópticas dos
nanoburacos: simetria da estrutura, razão entre o diâmetro e a profundidade do
buraco, área, e periodicidade. Estas variáveis determinam a distribuição do campo
eletromagnético sobre a superfície do metal, as dinâmicas de propagação das ondas
sobre a superfície e a eficiência com que elas se espalham. O tamanho do
nanoburaco, a periodicidade e a organização do arranjo afetam a posição e a
intensidade do pico de ressonância. A profundidade dos buracos, ou seja, a
espessura do filme metálico, é importante devido a diversas razões: se o filme
metálico for muito fino ele é parcialmente transparente à luz incidente e, portanto, a
transmissão de luz não ocorre preferencialmente pelos nanoburacos, especialmente
se a superfície é rugosa e esta rugosidade propicie a ressonância da luz.348,349 O
Introdução Parte II [Year]
122
metal deve ser opaco, (opticamente espesso), para se obter um grande contraste
entre a luz que passa através dos nanoburacos e a luz que passa através do metal.
Isto implica no fato de que a espessura do filme deve ser várias vezes maior que a
profundidade de penetração da luz no metal. Mesmo em filmes espessos, os modos
de energia em ambos os lados do filme metálico podem interagir, se desacoplar e
originar novos modos de energia. Este efeito pode ser observado através de estudos
onde conjuntos periodicamente ordenados de nanoburacos são obtidos em filmes
metálicos com várias espessuras. Observa-se que o aumento da espessura dos
filmes leva os modos de energia em ambos os lados do filme a se desacoplarem.286
I.1.4.2. Métodos de imobilização
A adsorção de proteínas sobre a superfície do sensor é um dos fatores mais
importantes no desenvolvimento de biosensores para aplicações biológicas e
biomédicas. Vários estudos mostram que os processos de adsorção não específica
de proteínas sobre a superfície é um problema chave e que deve ser corrigido para
melhorar a interação entre a molécula imobilizada e o analito presente na
solução.350,351 A formação de ligações não específicas é um inconveniente ainda
maior quando se analisa amostras de sangue e fluídos com partes de células
destruídas.352,353 Em biosensores é extremamente importante a obtenção de
superfícies com alta organização e que proporcionem um grande número de sítios
de ligação para imobilização de elementos de bio-reconhecimento. Durante a
imobilização é importante evitar processos de modificação da superfície que
possibilitem a adsorção não específica sobre o sensor (fouling), levando à
diminuição da quantidade de sítios de ligação e podendo ainda gerar um
falso-positivo.
Vários métodos têm sido aplicados no desenvolvimento de superfícies:
polímeros hidrofílicos como o poli(etileno glicol) (PEG) e seus derivados são
empregados no desenvolvimento de superfícies resistentes a proteínas, ou seja,
superfícies que não permitem que as moléculas de proteína se liguem com a
monocamada e que não “se deitem” sobre a superfície. Os fatores que influenciam
as propriedades de organização geradas por superfícies cobertas com PEG incluem
a barreira estérica e o alto grau de hidratação.354 Pasche e cols.355,356 utilizaram
poli(L-lisina) enxertada em PEG para minimizar adsorções não específicas de
Introdução Parte II [Year]
123
proteínas sobre a superfície. Através deste sistema eles observaram a adsorção de
soro sanguíneo em concentração menor que 2 ng/cm2. A imobilização de elementos
de bio-reconhecimento nestas amostras foi possível através da ligação de biotina à
superfície. As superfícies biotiniladas se mostraram muito resistentes a adsorções
não específicas de moléculas presentes na amostra de soro, permitindo a ligação da
proteína correspondente ao seu sítio ativo (estreptavidina) e posteriormente a
ligação de moléculas biotiniladas.357-359
I.1.5. Microcanais para fluxo de soluções
A litografia soft, particularmente usando poli(dimetilsiloxano) (PDMS), é uma
técnica muito utilizada em fabricação de microcanais de fluxo na montagem de
sensores biológicos.360,361
O PDMS apresenta propriedades físico-químicas como durabilidade, baixa
reatividade e transparência óptica, que o tornam um material adequado para a
fabricação de microestruturas moldadas.362 Além disso, é possível fazer o selamento
reversível da peça de PDMS, contendo os microcanais, com o substrato. A natureza
elástica do PDMS permite que ele se ajuste a imperfeições da superfície planar
através de forças de van der Waals.363 O selamento reversível suporta fluxos com
baixa pressão, (até 5 psi)360 e permite o re-selamento sem danos ao PDMS ou à
superfície ao qual está selado.
Objetivos Parte II [Year]
124
I.2. Objetivos
O objetivo nesta parte do trabalho foi o desenvolvimento de um sensor
biológico para a detecção de marcadores biológicos de câncer de ovário, baseado
em filmes finos de ouro nanoestruturado com arranjos de nanoburacos. O dispositivo
explorou o fenômeno de Transmissão Óptica Extraordinária (EOT) resultante da
ressonância de plasmóns de superfície (SPR) e foi integrado a microcanais com
funcionamento automatizado. O método de detecção utilizado foi baseado em
medidas de transmissão utilizando uma câmera CCD e um espectrofotômetro
UV-Vis.
Neste estudo, o foco foi o desenvolvimento de dois tipos de sensores:
1) Os métodos de detecção para sensores baseados em SPR normalmente
utilizam espectros de transmissão para a análise. Neste trabalho, utilizou-se o
modo por detecção de imagens, o qual detecta a mudança na intensidade da
luz transmitida através dos nanoburacos em resultado da imobilização de
moléculas sobre a superfície do sensor. Este método viabiliza a aplicação do
sensor para a detecção múltipla (eg. de vários marcadores tumorais) durante
uma medida em tempo real.
2) Até o momento, a imobilização em todos os biosensores baseados em SPR
utilizando nanoburacos é feita sobre toda a superfície de ouro, já que os
plasmóns de superfície se propagam em toda a região do arranjo de
nanoburacos (dentro dos nanoburacos e ao redor deles, Figura 52). Neste
trabalho, objetivou-se o desenvolvimento de algo novo, para isto, cobriu-se o
filme de ouro com uma camada isolante (SiOx) e posteriormente os arranjos
de nanoburacos foram fabricados. Este procedimento foi realizado com o
objetivo de se obter uma plataforma sensível que confinasse tanto os
plasmóns de superfície quanto as moléculas biológicas dentro dos
nanoburacos.
Resultados e Discussão Parte II [Year]
125
I.3. Parte Experimental
I.3.1. Materiais, Reagentes e Equipamentos
Materiais
Lâmina de vidro coberto com filme de ouro de 100 nm de espessura (uma camada
de 5 nm de cromo foi previamente depositado sobre o vidro para ajudar na aderência
do filme de ouro ao substrato), EMF (Evaporated Metal Films, Ithaca, Nova Iorque,
EUA).
Reagentes
Anticorpo para câncer de ovário PAX8 (Pared Box Gene 8) (Instituto de Câncer de
British Columbia, Canadá).
Antígeno para câncer de ovário r-PAX8 (recombinant Pared Box Gene 8) (Instituto
de Câncer de British Columbia, Canadá).
Albumina de Soro Bovino (BSA, Sigma-Aldrich).
Álcool isopropílico (99,5%, Sigma).
Acetona (p.a., Aldrich).
Biotina éster N-hidróxi succinimidil (BNHS, 95%, Fluka).
Cisteamina (98%, Sigma-Aldrich).
Cloreto de potássio (99%, ACP).
Cloreto de sódio (99%, ACP).
Ditiobis (succinimidil undecanoato) (DSU, 92,7%, Laboratórios Dojindo).
Dimetil sulfóxido (DMSO, 99,9%, Caledon).
Etanol anidro (99,5%, Sigma-Aldrich).
Estreptavidina de Streptomyces avidinii (Sigma-Aldrich).
Fosfato dibásico de sódio (99%, ACP).
Fotoresiste SU-8 50 e revelador (Microchem, Newton, MA).
Glicose (99,5%, Sigma-Aldrich).
3-Mercaptopropiltrimetoxisilano (MPTMS, 95%, Sigma-Aldrich).
Polidimetilsiloxano e agente de cura Sylgard 184 (PDMS, Dow Corning).
Poli (tereftalato de etileno) (PET, SK Chemicals).
Wafer de silício (Silicon Quest International, Santa Clara, CA).
Resultados e Discussão Parte II [Year]
126
Água nanopura (18,1 Mcm, Barnstead) foi utilizada para a preparação das
soluções.
Equipamentos
Fabricação e imagem dos nanoburacos: FIB (feixe de íons (gálio) focado), e
Microscopia eletrônica de varredura (MEV).
Fabricação dos microcanais: Spincoater SCG/G3P-8 (Specially coating systems,
Coakson Electronics Equipments), expositor à luz UV OAI Hybralign Series 200 e
controles de exposição (Tamarack Scientific Co), câmara de vácuo e limpador com
plasma PDC-32G (Harrick) e forno Isotemp modelo 280A, (Fisher Scientific).
Experimentos: Bomba de seringa (Havardi), microscópio Leica (Microsystems
(DMLM)), com lente objetiva de 50X de longa distância de trabalho, acoplado a uma
fibra óptica e espectrofotômetro UV-Vis (USB2000), câmera CCD (Photometrics
HQ2), refratômetro portátil (ATAGO, modelo 3850).
I.3.2. Fabricação dos nanoburacos
Vários arranjos de nanoburacos foram empregados em diferentes estágios
deste trabalho. As micrografias obtidas por MEV de alguns arranjos de nanoburacos
estão mostradas na Figura 52. Neste trabalho dois tipos de amostras foram
fabricados:
1) os arranjos de nanoburacos foram fabricados for FIB através de um filme
de ouro de 100 nm de espessura depositado sobre uma lâmina de vidro. Estas
amostras foram usadas para detecção de marcadores tumorais de câncer de ovário
através de imagens obtidas por uma câmera CCD. Os nanoburacos foram fabricados
com aproximadamente 200 nm de diâmetro. O tamanho dos arranjos foi de
aproximadamente 15 µm x 15 µm.
2) os arranjos de nanoburacos foram fabricados por FIB em um filme de SiOx
e de ouro (Figura 67). O filme de SiOx (50 nm de espessura) foi depositado sobre o
filme de ouro (100 nm de espessura) e este sobre uma lâmina de vidro.†† Esta
amostra foi usada para medidas onde tanto as moléculas quanto os plasmóns se
encontravam confinados dentro dos nanoburacos, já que a superfície de ouro é
exposta somente dentro dos nanoburacos. A fabricação e micrografias (MEV) dos
††
Os nanoburacos foram perfurados através de ambos filmes de SiOx e ouro.
Resultados e Discussão Parte II [Year]
127
arranjos de nanoburacos foram realizadas na Simon Fraser University, Vancouver,
Canadá. O feixe de íons gálio foi programado para 30 keV com uma taxa de
remoção de ouro de 1,6 nm/µs, e a corrente do feixe foi de 300 nA. Os nanoburacos
foram fabricados com aproximadamente 170 nm de diâmetro. O tamanho dos
arranjos foi de aproximadamente 8 µm x 8 µm, correspondendo a uma área de
detecção muito pequena, viabilizando o uso do substrato para a montagem de um
dispositivo miniaturizado.
Figura 52: Micrografias obtidas por MEV de a) arranjos de nanoburacos
periodicamente ordenados, fabricados por FIB em um filme de ouro de 100 nm de
espessura. b) Imagem ampliada mostrando o tamanho do arranjo de nanoburacos.
c) Imagem ampliada mostrando a dimensão dos nanoburacos. Esta amostra foi
utilizada durante as medidas por aquisições de imagens (seção I.4.1).
I.3.3. Fabricação dos microcanais
Os microcanais foram fabricados em uma peça de PDMS através da técnica
de litografia soft360,361 (Figura 53). O primeiro passo foi a obtenção de uma
fotomáscara da estrutura dos microcanais, sendo criada usando o AutoCAD 2006.
Posteriormente foi impressa em filmes de PET (poli (tereftalato de etileno)),
utilizando-se uma impressora com alta resolução (Islands Graphics, Victoria, BC). O
fotoresiste SU-8 50 foi depositado por spin coating sobre um wafer de silício sob
rotação de 500 rpm em 5 s, mantendo por 8 s. Em seguida, aumentou-se a
velocidade para 2000 rpm em 5 s, mantendo por 25 s. Este procedimento produz
filme com espessura uniforme de 50 µm. A espessura do fotoresiste determina a
altura dos microcanais resultantes.364 Os wafers de silício foram usados devido a sua
superfície extremamente plana, onde o fotoresiste adere facilmente. O wafer de
a) b) c)
Resultados e Discussão Parte II [Year]
128
silício coberto foi pré-aquecido a 65 ºC por 6 min, e então a 95 ºC por 25 min para
eliminar o solvente, deixando o fotoresiste mais denso. A fotomáscara foi
posicionada sobre o wafer de silício. Ambos foram então expostos a luz UV colimada
(320 a 380 nm), durante 45 s. A função da máscara é proteger determinadas partes
do substrato contra a luz UV. Este passo foi seguido por aquecimento da amostra,
sendo primeiramente em 65 ºC por 1 min e a 95 ºC por 5 min para promover a
polimerização do fotoresiste. O sistema foi então imerso no revelador de SU-8 até
todo fotoresiste, não exposto a luz UV, ser removido. Em seguida, o wafer de silício
foi imerso em álcool isopropílico para remover o excesso do revelador. Depois disto,
o wafer de silício contendo a microestrutura foi limpo rapidamente em acetona e
seco em seguida. Sendo assim, um molde foi criado.
Figura 53: Esquema e descrição do método de fabricação de microestruturas por
litografia soft.
Passo 1:Exposição do fotoresiste (SU-8) usandoluz UV que passa através de umatransparência com o desenho daestrutura desejada.
Passo 2:O fotoresiste não exposto é dissolvido,levando a um modelo positivo dodesenho em um substrato.
Passo 3:Sobre o modelo positivo é colocado opolímero PDMS e levado para cura emuma câmara de vácuo.
Passo 4:A remoção do molde leva a estruturanegativa, onde os canais estãopresentes no PDMS.
Resultados e Discussão Parte II [Year]
129
Os microcanais foram criados através da cura do PDMS sobre o molde.
Aproximadamente 30 g de PDMS e agente de cura foram misturados em uma razão
10:1 (m:m) respectivamente. A mistura foi então espalhada sobre o molde e o
sistema foi colocado na estufa a 900C por 30 minutos. A peça de PDMS, já no
estado sólido e flexível, foi removida do molde criando-se assim um sistema de micro
canais. Os 30 g de PDMS foram usados para criar uma peça com espessura de
aproximadamente 4 mm. Esta peça foi então alinhada aos arranjos de nanoburacos
para orientar o fluxo das soluções sobre estes.
I.3.4. Deposição de SiOx
Filmes finos de SiOx foram preparados sobre os filmes de ouro de 100 nm de
espessura, os quais foram previamente depositados sobre lâminas de vidro. A
lâmina de vidro coberta com filme de ouro, foi montada em uma célula de teflon® de
ca. 15 mL, com área exposta de 1 cm2. Uma camada de MPTMS
(3-mercaptopropiltrimetoxisilano) foi aplicada entre o ouro e o SiOx para servir de
adesivo. Foi adicionada solução 1 mmol.L-1 de MPTMS na célula, o qual
permaneceu por 24 h sem agitação. A adsorção inicial é rápida, levando apenas
alguns minutos. No entanto, o sistema foi deixado em repouso por 24 horas para se
obter um alto nível organizacional da monocamada. Após a montagem da
monocamada, uma solução contendo 0,54% de silicato de sódio, com pH em torno
de 9,5 foi adicionada à célula de teflon® e deixado em repouso por 120 h.365-367
Figura 54: (a e b) Imagens MEV de arranjos de nanoburacos perfurados através do
filme de SiOx (50 nm de espessura) e de ouro (100 nm de espessura). Os
nanoburacos foram fabricados com 170 nm de diâmetro e periodicidade de 500 nm.
Resultados e Discussão Parte II [Year]
130
Após a obtenção da camada de 50 nm de SiOx, os nanoburacos foram obtidos
por FIB seguindo o mesmo procedimento descrito na seção I.3.2, amostra 2 (Figura
54).
I.3.5. Teste de sensibilidade
A sensibilidade dos arranjos de nanoburacos foi estudada utilizando soluções
de glicose com índices de refração conhecidos, variando entre 1,320 e 1,358.
Durante estas medidas utilizou-se uma célula de fluxo simples, contendo uma
entrada e uma saída para a solução. Esta célula é construída em teflon®, possuindo
uma câmara de 2,54 cm x 2,54 cm, onde a amostra contendo nanoburacos, foi
colocada para que as soluções fluíssem sobre sua superfície.
I.3.6. Prova de conceito – detecção de proteína dentro do nanoburaco
A detecção da proteína dentro do buraco envolve um procedimento de
3 passos.306 Primeiramente, o substrato é imerso em uma solução aquosa contendo
6,2 mmol.L-1 de cisteamina por 72 horas. Esta molécula contém grupamentos tiol, os
quais se ligam fortemente ao ouro, além disso possui grupos amino que se ligam
covalentemente à grupos NHS. Desta forma, após a montagem da monocamada
dentro dos buracos, a amostra foi enxaguada com água nanopura e etanol para a
retirada das moléculas que não foram adsorvidas sobre a superfície de ouro. A
amostra foi então colocada em uma célula de fluxo e através de uma bomba
peristáltica, injetou-se STF (pH 7,5) sobre o arranjo de nanoburacos. O espectro
UV-Vis foi então registrado (ver esquema na Figura 55). Após esta etapa, uma
solução contendo 6 mg.mL-1 de biotina modificada com grupos NHS em DMSO foi
injetada sobre a amostra, mantendo o fluxo por 45 min. A amostra foi então
enxaguada com STF e o espectro UV-Vis foi em seguida registrado. Finalmente,
fluiu-se uma solução contendo 0,25 mg.mL-1 de estreptavidina (proteína) em STF
sobre a amostra por 15 min, o espectro UV-Vis foi registrado enquanto a amostra era
enxaguada com STF.
I.3.7. Medidas Ópticas e Sistema de Fluxo
Uma bomba de injeção com controle fino de fluxo foi utilizada para fluir as
soluções, a um fluxo constante de 20 μL.min-1, sobre a superfície do arranjo de
nanoburacos. As amostras foram caracterizadas utilizando luz branca de uma fonte
Resultados e Discussão Parte II [Year]
131
de halogênio, a qual foi direcionada perpendicularmente sobre o arranjo de
nanoburacos utilizando um microscópio com lente objetiva de longa distância de
trabalho . Coletou-se a luz transmitida através nos nanoburacos utilizando-se um
cabo de fibra óptica, que é conectado a um espectrofotômetro UV-Vis (Figura 55).
Figura 55: Arranjo experimental para as medidas de transmissão de luz através dos
arranjos de nanoburacos.
Obtenção de imagens de SPR
Para a obtenção das imagens de SPR montou-se um circuito integrado
contendo a amostra de ouro com nanoburacos selada com a peça de PDMS
contendo microcanais. Estes microcanais foram alinhados com os arranjos de
nanoburacos (Figura 61). Utilizou-se como fonte de excitação um laser de He-Ne
(emissão em 633 nm). O feixe de luz foi expandido e espalhado uniformemente
sobre o arranjo de nanoburacos através de lentes plano-convexas. A luz transmitida
foi coletada por um microscópio, sendo direcionada para uma câmera CCD. As
imagens foram então registradas em um computador (Figura 56), utilizando um
tempo de aquisição de 20 ms. As imagens obtidas foram analisadas,
Espectrofotômetro UV-Vis
Fibra óptica
Lente objetiva
Plataforma de translação
Luz branca
Resultados e Discussão Parte II [Year]
132
quantificando-se a intensidade da luz transmitida através dos nanoburacos através
do software Image J (desenvolvido por National Institutes of Health).
Figura 56: Esquema experimental para a aquisição de imagens por transmissão de
luz através dos arranjos de nanoburacos usando uma câmera CCD.
He-NeLaser
CCDMicroscópio
Resultados e Discussões Parte II [Year]
133
I.4. Resultados e Discussão
I.4.1. Detecção por imagens
Utilizou-se os arranjos de nanoburacos perfurados através do filme de ouro
para a detecção da presença de anticorpo e antígeno do câncer de ovário. Para isso,
imagens da superfície do dispositivo foram adquiridas através de uma câmera
CCD.368 O CCD, ou dispositivo de carga acoplado, é extremamente sensível à luz. A
exibição dos dados de uma determinada imagem é realizada pela transformação da
luz refletida em sinais elétricos, que são convertidos em bites, através de um
conversor analógico-digital. Este tipo de câmera permite a obtenção de imagens da
luz transmitida através dos nanoburacos.
A quantidade de luz transmitida é dependente do índice de refração próximo à
superfície do ouro. A presença das moléculas muda o índice de refração efetivo,
acarretando o deslocamento do máximo de transmissão para maiores comprimentos
de onda (Figura 57). Considerando um determinado comprimento de onda
(eg. 633 nm, fonte He-Ne), a variação do índice de refração leva à mudanças na
intensidade da luz transmitida através dos nanoburacos. Um fator interessante do
método de detecção por imagens, é a possibilidade de se obter a visualização de
uma extensa área da superfície do sensor contendo os vários arranjos de
nanoburacos. Estes arranjos podem ser modificados diferentemente, através da
funcionalização diferenciada em cada um dos conjuntos. A variação na transmissão
devido à interação molecular (ou biomolecular) em cada um dos conjuntos é então
registrada pela câmera CCD através de uma fotografia da superfície.
Neste trabalho utilizou-se uma amostra com arranjos de nanoburacos de
200 nm de diâmetro os quais foram fabricados através de um filme de ouro de
2,54 cm x 2,54 cm com 100 nm de espessura. Esta espessura é cerca de duas
vezes maior que a profundidade de penetração do SP no filme de ouro, o que
significa que os SP de um dos lados do filme tem mínima comunicação com os SP
do outro lado do filme.305 Cada arranjo possui uma área de 15 x 15 μm2 e a distância
entre os nanoburacos é de 420 nm (periodicidade). Esta periodicidade foi
previamente determinada para que a transmissão através dos nanoburacos
estivesse em ressonância com a fonte monocromática utilizada (laser He-Ne)
durante as medidas (Figura 57). Trabalhou-se com luz vermelha porque nesta região
Resultados e Discussões Parte II [Year]
134
não ocorre significante fluorescência de amostras biológicas. Além disto, este
comprimento de onda é compatível com muitos materiais, facilitando a construção do
dispositivo.
Figura 57: Espectros de transmissão para um arranjo de nanoburacos ilustrando a
diminuição da intensidade da luz transmitida no comprimento de onda equivalente a
633 nm.
Previamente às medidas de detecção por imagens, analisou-se a
sensibilidade da amostra frente a variações do índice de refração do meio. Durante
este experimento, utilizou-se soluções de glicose com diferentes concentrações.
Como resultado, obteve-se os valores de intensidade de luz transmitida mostrados
na Figura 58. A Figura 58b mostra a curva de calibração obtida através destas
medidas, a qual resultou em uma sensibilidade de 316 UIR-1, sendo semelhante à
obtida por espectroscopia UV-Vis.306
500 550 600 650 700 750 800 850
0,15
0,30
0,45
0,60
0,75
0,90
1,05
Diminuição da
Intensidade
em 633 nm
Inte
nsid
ad
e /
un
i. a
rb
Comprimento de onda / nm
Aumentando o
índice de refração
Resultados e Discussões Parte II [Year]
135
Figura 58: a) Intensidade da luz transmitida através de arranjos de nanoburacos para
diferentes índices de refração. b) Curva de calibração obtida através do gráfico em
a) Fonte utilizada: He-Ne.
A Figura 59b mostra uma imagem por MEV dos arranjos de nanoburacos, os
quais se encontram organizados em 7 colunas e 4 linhas. Esta organização foi
estabelecida com o objetivo de possibilitar a realização de um experimento em
tempo real para a detecção de anticorpos e antígenos presentes em diferentes
concentrações na amostra.
Figura 59: Micrografias obtidas por MEV das matrizes de nanoburacos criadas em
um filme de ouro. a) Imagem dos buracos com 200 nm de diâmetro e periodicidade
de 420 nm. b) Imagem da configuração da amostra com matrizes de nanoburacos
organizadas em 7 colunas espaçadas por 150 μm, contendo 4 linhas de arranjos
espaçados por 60 μm.
Para a distribuição da amostra em diferentes concentrações sobre a
plataforma sensível, utilizou-se um sistema de microcanais (Figura 60), o qual
3
6
9
12
15
18
21
24
Pixel
In
ten
sid
ad
e /
un
i. a
rb.
1,3324
1,3331
1,3350
1,3444
1,3568
1,3778
a)
1,3377 1,3468 1,3559 1,3650 1,3741
0
3
6
9
12
15
I
/ u
ni. a
rb.
Índice de Refração
Coeficiente angular = 316
b)
a) b)
Resultados e Discussões Parte II [Year]
136
consiste de 7 canais diferentes. Cada canal foi alinhado com uma coluna de arranjos
de nanoburacos (Figura 59 e Figura 61). Este sistema de microcanais é chamado de
sistema de diluição, pois 6 (seis) dos 7(sete) canais são alimentados por duas
câmaras de entrada (Figura 60). Na câmara 1, uma solução contendo o analito
(antígeno, por exemplo) com concentração conhecida é injetada ao mesmo tempo
em que na câmara 2 é injetada uma solução tampão.
Figura 60: Sistema de microcanais utilizado para a determinação da concentração de
um analito através de uma curva de calibração adquiridos durante experimento em
tempo real.
O sistema de microcanais funciona de forma a misturar as soluções injetadas
em ambas as câmaras, resultando em soluções com diferentes concentrações
NanoburacosSaída
Amostra
Solução STF1 2
3
Resultados e Discussões Parte II [Year]
137
fluindo em cada canal. A concentração de antígeno em cada canal ou sobre cada
coluna de arranjo de nanoburacos será diferente. Através de uma imagem da
superfície da amostra, pode-se analisar a intensidade de luz transmitida através de
cada arranjo de nanoburacos. Esta imagem fornece dados suficientes para se
graficar uma curva de calibração, que mostra a variação da intensidade transmitida
em função da concentração do analito. Na câmara 3, tem-se um microcanal
independente, o qual não faz parte do sistema de diluição. Esta câmara é utilizada
para injetar a amostra contendo concentração desconhecida do analito. A idéia final
é determinar a concentração do marcador tumoral de câncer de ovário, através da
curva de calibração obtida durante uma medida em tempo-real.
Os arranjos de nanoburacos foram limpos em banho de ultra-som por 3 min,
enxaguados com etanol, água e então secos com N2. Após a limpeza do substrato,
uma monocamada de DSU (ditiobis (succinimidil undecanoato) foi montada sobre a
superfície de ouro através da imersão da amostra em uma solução contendo
2 mmol.L-1 de DSU em DMSO, ficando em repouso por 72 horas. Após a montagem
da monocamada, a amostra foi enxaguada para eliminar as moléculas não
adsorvidas e só então foi alinhada com a peça de PDMS contendo microcanais.
Estes foram previamente modificados com BSA (albumina de soro bovino) para
evitar adsorções não específicas das moléculas analisadas. Para isso, fluiu-se
solução 0,1 mmol.L-1 de BSA em STF com velocidade de fluxo de 10 μL.min-1 por
2 horas (Figura 61).
Figura 61: Imagem fotográfica (lente objetiva 10X) das matrizes quadradas
(15 x 15 μm2) de nanoburacos alinhadas com os microcanais de 100 μm de largura.
Resultados e Discussões Parte II [Year]
138
Detecção do Anticorpo PAX8
Trabalhou-se com o anticorpo PAX8 porque recentemente o Instituto de
Tecnologia de Câncer de Ovário de Atlanta descobriu que esta proteína, PAX8, está
envolvida no desenvolvimento das trompas falopianas e está presente nas células
cancerígenas do ovário, não estando presente nos tecidos normais deste.369
O sistema de microcanais foi utilizado para diluir uma solução contendo
27 μg.mL-1 de PAX8 em STF. A Figura 62 apresenta a imagem obtida através do
esquema experimental mostrado na Figura 56. A amostra foi iluminada no lado
oposto ao ouro utilizando uma fonte de luz monocromática em 633 nm (laser He-Ne).
É nítida a mudança na intensidade da luz transmitida através dos nanoburacos
presentes nas diferentes colunas (Figura 62), o que é resultante de diferentes
quantidades de espécies detectadas. De acordo com a literatura,303,370 a diminuição
da intensidade transmitida seria esperada devido ao aumento do índice de refração
para amostras com a periodicidade maior que 405 nm. Portanto, o resultado
mostrado na Figura 62 sugere que esteja ocorrendo um aumento do índice de
refração a partir da coluna 1 em direção à coluna 6. Como a solução de PAX8 é uma
solução diluída, o índice de refração do meio (STF) e da solução contendo o
anticorpo (PAX8 em STF) é o mesmo (1,3333 a 22,1 oC). Assim, assume-se que as
mudanças que ocorreram na intensidade de luz transmitida através dos arranjos de
nanoburacos sejam decorrentes da imobilização do anticorpo sobre a plataforma do
sensor.
Figura 62: Imagem obtida por uma câmera CCD dos arranjos de nanoburacos
alinhados com os microcanais. Os arranjos de nanoburacos foram utilizados para a
detecção do anticorpo PAX8.
1 2 3 4 5 6 AmostraA
B
C
D
Resultados e Discussões Parte II [Year]
139
A Figura 63 mostra as intensidades de luz transmitida através dos arranjos de
nanoburacos para uma das linhas presentes na Figura 62, a qual contém matrizes
presentes em diferentes microcanais (de 1 a 6 e a amostra). O último pico na Figura
63a é referente à amostra analisada. O máximo de intensidade transmitida
normalizada é observado para o microcanal 1, no qual flui a solução mais diluída
sobre os nanoburacos e, portanto, o máximo de intensidade transmitida observada é
resultante do menor índice de refração efetivo.
Na Figura 63b estão apresentadas as intensidades médias obtidas para os
arranjos presentes em cada coluna em função da diluição. Através das intensidades,
obtém-se uma curva de calibração (Figura 63b), a qual permite a determinação em
tempo-real, da concentração da espécie presente na amostra. Utilizando a curva de
calibração obtida e, sabendo que a maior e menor intensidades de luz transmitida
correspondem respectivamente a STF e a solução de marcador biológico de partida
(de concentração conhecida), estimou-se a concentração de PAX8 presente na
solução como sendo 16,50 μg.mL-1 ± 0,05, o qual é próximo da concentração real da
amostra (15,70 μg.mL-1).
Figura 63: a) Intensidades normalizadas da luz transmitida para a linha B de arranjos
de nanoburacos após a detecção do anticorpo PAX8. b) Intensidade média
transmitida em função da diluição (calculada para os arranjos em cada microcanal).
Detecção do Antígeno r-PAX8
Para a detecção do antígeno foram seguidos os mesmos passos, descritos
para detecção do anticorpo PAX8. Entretanto, toda a superfície da amostra foi
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
EO
T N
orm
aliza
da
/ u
ni. a
rb.
Pixel
Amostra
a)
1 2 3 4 5 6
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Amostra
EO
T N
orm
aliza
da
/ u
ni. a
rb.
Microcanal
b)
Resultados e Discussões Parte II [Year]
140
homogeneamente modificada com o anticorpo para só então ser feita a detecção do
correspondente antígeno.
O sistema de microcanais foi utilizado na diluição de uma solução contendo
8,5 μg.mL-1 de r-PAX8 em STF, a qual fluiu sobre a amostra em uma velocidade de
10 μL.min-1. Como descrito anteriormente para a detecção do anticorpo, utilizou-se o
arranjo experimental da Figura 56 para a detecção do antígeno. A Figura 64 mostra
a imagem adquirida com uma câmera CCD do dispositivo integrado, onde ocorreu a
diluição da solução a partir da coluna 6 até a coluna 1. A amostra que consiste de
uma solução contendo “concentração desconhecida” do marcador biológico fluiu
sobre a última coluna com arranjos de nanoburacos (à direita). Embora as mudanças
de intensidade sejam visíveis, elas não foram tão intensas quanto aquelas obtidas
para o anticorpo PAX8. Este comportamento pode ser relacionado a dois fatores: i) a
concentração do AG é menor do que a do AC e ii) o AG consiste em uma molécula
pequena quando comparada com o AC, e portanto a imobilização do AC sobre o
biosensor tem maior efeito no índice de refração efetivo, resultando em maiores
mudanças na intensidade.
Figura 64: Imagem obtida por uma câmera CCD dos arranjos de nanoburacos
alinhados com os microcanais. Os arranjos de nanoburacos foram utilizados para a
detecção do antígeno r-PAX8.
A Figura 65 apresenta as intensidades normalizadas da luz transmitida pelos
nanoburacos dentro do microcanal. O último pico (à direita na Figura 65a) é
relacionado à amostra analisada de “concentração desconhecida”. De fato,
observam-se intensidades diferentes para cada microcanal. O máximo de
intensidade normalizado para 1,0 (ca. 50 pixels), da mesma forma que para o AC,
possui a solução mais diluída fluindo, resultando em menor índice de refração
1 2 3 4 5 6 AmostraA
B
C
D
Resultados e Discussões Parte II [Year]
141
efetivo. Além disso, através da Figura 65 verifica-se que o biosensor é capaz de
detectar diferentes concentrações de r-PAX8, sendo que uma amostra menos
concentrada foi detectada na Figura 65a e outra mais concentrada na Figura 65b.
Através destes resultados, pode-se afirmar que o método apresentado neste
experimento permite uma análise quantitativa da amostra.
Figura 65: Intensidades normalizadas de luz transmitida para a linha B de arranjos
de nanoburacos após a detecção do antígeno r-PAX8. a) amostra diluída e
b) amostra concentrada de r-PAX8.
A partir das imagens obtidas para a detecção do r-PAX8, plotou-se uma curva
de calibração para a detecção quantitativa do AG (Figura 66). Comparando esta
curva de calibração com a obtida para o AC (Figura 63b), observam-se
comportamentos diferentes. Este fato pode ser explicado levando-se em
consideração o tamanho das moléculas. Como os AC são maiores do que o AG,
seria mais fácil detectar uma pequena mudança da concentração do AC do que do
AG, já que o tamanho da molécula é levado em consideração durante os cálculos do
índice de refração efetivo.
A concentração do AG na amostra pode ser então estimada utilizando a curva
de calibração presente na Figura 66. Como foi utilizada uma solução contendo
8,5 μg.mL-1 de AG para a construção da curva de calibração e, sabendo que a maior
e menor intensidades de luz transmitida correspondem respectivamente a STF e a
esta solução com 8,5 μg.mL-1 de AG, pode-se estimar que a amostra diluída de
r-PAX8 contém 2,53 μg.mL-1 ± 0,08, enquanto que para a amostra concentrada
0 200 400 600 800 1000 1200
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0Amostra diluída
EO
T N
orm
aliza
da
/ u
ni. a
rb.
Pixel
a)
0 200 400 600 800 1000 1200
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Amostra concentrada
EO
T N
orm
aliza
da
/ u
ni. a
rb
Pixel
b)
Resultados e Discussões Parte II [Year]
142
obteve-se 4,73 μg.mL-1 ± 0,09. Estes valores obtidos através da medida óptica
experimental são próximos da concentração real das amostras, sendo 2,10 e
5,30 μg.mL-1, respectivamente. Estas concentrações são muito maiores do que a
presente no paciente com a doença. No entanto, tanto o dispositivo para microfluído
quanto a plataforma sensorial foram eficientes. O primeiro na distribuição da amostra
em vários canais contendo diferentes concentrações e o segundo na detecção não
somente do marcador tumoral, mas também das diferentes concentrações deste.
Desta forma, neste ponto avanços devem ser feitos para melhorar tanto a
sensibilidade quanto o limite de detecção do chip.
Figura 66: Intensidade média transmitida em função da diluição (calculada para os
arranjos de nanoburacos presentes em cada microcanal).
I.4.2. Detecção dentro dos nanoburacos por espectrofotometria UV-Vis
Os resultados aqui apresentados são provenientes de um dispositivo para
sensor SPR baseado em EOT através de arranjos de nanoburacos periodicamente
organizados. Neste dispositivo, a sensibilidade é baseada na detecção dentro do
nanoburaco. A Figura 67 mostra o esquema do sensor utilizado, onde os
1 2 3 4 5 6
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
Amostra concentrada
EO
T N
orm
aliz
ad
o /
un
i. a
rb.
Pixel
Amostra diluída
Resultados e Discussões Parte II [Year]
143
nanoburacos foram perfurados através do filme de SiOx e de ouro, confinando a área
sensível somente no interior do nanoburaco.
Figura 67: a) Representação de um nanoburaco, ilustrando a camada de ouro de
100 nm (amarelo) entre o substrato de vidro e uma camada de SiOx de 50 nm de
espessura. b) Esquema ilustrando a detecção das três camadas de moléculas
confinadas dentro do buraco. Os experimentos foram realizados utilizando arranjos
de 8 μm x 8 μm, contendo nanoburacos com 170 nm de diâmetro e periodicidade de
500 nm.
A eficiência do filme de SiOx em bloquear a superfície de ouro foi testada
através de medidas de voltametria cíclica (VC), utilizando solução 1 mmol.L-1 de
K3[Fe(CN)6] e velocidade de varredura de 20 mV.s-1. A Figura 68 mostra os
voltamogramas utilizando o eletrodo de ouro não coberto por SiOx (a) e o eletrodo de
ouro coberto com o filme de SiOx (b). A curva (a) mostra o processo redox do
K3[Fe(CN)6] com os picos característicos de oxidação em 0,34 V e redução em
0,18 V. Quando o filme de SiOx é depositado sobre o eletrodo de ouro (b), a corrente
faradaica diminui drasticamente devido à difusão limitada das espécies Fe(CN)63- em
direção à superfície do ouro. De acordo com a curva (b), o processo redox do
K3[Fe(CN)6] foi praticamente bloqueado pela camada de SiOx. O pequeno efeito de
capacitância de fundo na curva é relacionado à capacitância formada entre o ouro e
a solução eletrolítica. Além disso, a curva (b) não apresenta ondas de forma
sigmoidal como anteriormente mostrado na literatura, este comportamento é uma
forte indicação de um filme compacto, ou seja, com poucos defeitos.371,372
De acordo com os resultados de VC, foi possível confirmar que o filme de
SiOx cobre eficientemente a superfície do ouro.373 Isto significa que após a obtenção
dos nanoburacos através dos filmes de SiOx e ouro, somente a superfície de ouro no
interior dos nanoburacos estará disponível para a imobilização de moléculas. A
170 nm 100 nm
50 nm
a) SiOx
Au
Substrato de vidro
b)
Resultados e Discussões Parte II [Year]
144
grande vantagem deste sistema é que a quantidade de analito a ser detectada é
5 vezes menor do que em sistemas onde a superfície do ouro não está bloqueada,
(para os parâmetros mostrados na Figura 67), devido à área limitada de ouro
exposta. Esta é uma estimativa feita sem considerar o fato de que as ondas de SP
se propagam (e, portanto, são sensíveis) além da área das matrizes de nanoburacos
para o substrato não coberto.374,375
Figura 68: Voltamogramas em solução aquosa de K3[Fe(CN)6] utilizando como
eletrodo de trabalho: a) eletrodo de ouro sem modificação e b) eletrodo de ouro
coberto com filme de SiOx obtido após 120 h de deposição.
Sensibilidade
A sensibilidade do sensor em detectar variações de índice de refração
próximas à superfície foi analisada através de medidas de transmissão de luz do
sensor em contato com soluções de glicose com índices de refração diferentes
(Figura 69). A banda em 600 nm (Figura 69a) é relacionada ao modo de ressonância
(1,1) que ocorre devido à interface ouro|vidro, e a banda em cerca de 730 nm (Figura
69b) é relacionada ao modo (1,0) que ocorre devido à interface ouro|solução dentro
do buraco. O mínimo de absorção observado em todos os espectros ocorre devido à
-0,2 0,0 0,2 0,4 0,6-150
-100
-50
0
50
100
Densid
ade d
e c
orr
ente
/
A.c
m-2
E / V vs. Ag|AgCl
a
b
Resultados e Discussões Parte II [Year]
145
anomalia de Wood,376 sendo resultante da luz difratada que emerge paralelamente à
superfície do metal. Como previsto para sensores baseados em SPR, ocorre um
deslocamento do máximo de transmissão para maiores comprimentos de onda ao
aumentar o índice de refração próximo à superfície.
Como a superfície do ouro encontra-se bloqueada pela camada de SiOx, a
resposta do sensor é resultante das mudanças de índice de refração dentro dos
nanoburacos. O deslocamento para maiores comprimentos de onda da banda (1,1) é
semelhante à resposta de outros arranjos, estando de acordo com a conhecida
teoria da luz transmitida através de nanoburacos.306 No entanto, o deslocamento da
banda (1,0) presente na Figura 69 b, representa uma melhora da sensibilidade
quando comparada com a detecção onde a imobilização é feita sobre toda a
superfície, ou seja, em torno dos buracos e dentro deles.
Figura 69: Espectros de transmissão normalizados empregando soluções de glicose
com índices de refração conhecidos. Bandas relacionadas aos modos de
ressonância a) (1,1) e b) (1,0).
Através dos espectros apresentados na Figura 69 plotou-se curvas de
calibração para a amostra, referente às duas bandas de transmissão (Figura 70).
Através do gráfico de variação da posição do máximo de transmissão (comprimento
de onda) versus índice de refração, variando de 1,3320 a 1,3584 (variação de
0 a 2%), obteve-se um deslocamento da banda para maiores comprimentos de onda,
correspondendo a 10 nm para a banda (1,1). A sensibilidade pode ser obtida através
do coeficiente angular da curva, resultando em 360 nm/UIR. Como a banda é muito
560 580 600 620 640 660 680
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Banda (1,1)
1,3320
1,3331
1,3371
1,3447
1,3584
Inte
nsid
ad
e /
un
i. a
rb.
Comprimento de onda / nm
a)
680 700 720 740 760 780 800
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0 b)
Banda (1,0)
1,3320
1,3331
1,3371
1,3447
1,3584
Inte
nsid
ad
e /
un
i. a
rb.
Comprimento de onda / nm
Resultados e Discussões Parte II [Year]
146
larga, optou-se por medir o deslocamento usando o lado curva (em menores
comprimentos de onda), ao invés de utilizar o máximo de transmissão para o cálculo
do deslocamento. Com relação à banda (1,0), a mudança no máximo de
transmissão, para a faixa de índice de refração que se trabalhou (de 0 a 2% de
variação), foi calculada como sendo 19 nm, caracterizado por uma sensibilidade de
650 nm/UIR, a qual pode ser comparada com experimentos sem o filme de SiOx
(ca. 400 nm/UIR).306
Os resultados mostram que a deposição de SiOx sobre o ouro não diminuiu a
sensibilidade do sensor em comparação com a superfície não coberta. Este efeito
não esperado será discutido posteriormente ao se considerar a influência do índice
de refração da camada adsorvida nas propriedades de guia de onda de menor
ordem dentro do buraco.
Figura 70: Curvas de calibração resultantes dos deslocamentos dos máximos de
transmissão para a) banda (1,1) e b) banda (1,0).
Utilizou-se simulações através do método das Diferenças Finitas no Domínio
de Tempo (FDTD)377 para a avaliação das mudanças efetivas de índice de refração
devido à presença de diferentes espécies, sendo feita através de cálculos do campo
elétrico dentro do nanoburaco. A Tabela 4 mostra os valores correspondentes ao
máximo de transmissão obtidos experimentalmente e através de cálculos por FDTD
para diferentes índices de refração.
1,335 1,340 1,345 1,350 1,355
0
2
4
6
8
10
/ n
m
Índice de Refração
Coeficiente angular = 360
= 10 nm
Banda (1,1)
a)
1,335 1,340 1,345 1,350 1,355
0
5
10
15
20b)
n
m
Índice de refração
Coeficiente angular = 650
= 19nm
Banda (1,0)
Resultados e Discussões Parte II [Year]
147
Tabela 4: Comprimentos de onda referentes ao máximo de transmissão obtidos
através de cálculos por FDTD, comparado a valores experimentais onde foram
utilizadas soluções de glicose com diferentes índices de refração.
Dados Experimentais (nm) Simulação FDTD (nm)
Índice de Refração Banda (1,1) Banda (1,0) Banda (1,1) Banda (1,0)
1,3320 564 720 601 732
1,3331 565 724 601 732
1,3371 567 727 603 734
1,3447 569 731 604 737
1,3584 574 739 607 743
Para as medidas de detecção dentro dos buracos utilizou-se a ligação entre
as moléculas de biotina e estreptavidina devido à sua alta constante de bioafinidade
(Ka 1013M-1).378 Esta propriedade é uma das principais razões para a aplicação deste
esquema na detecção de biosensores, já que ele permite a utilização de condições
mais severas durante a análise bioquímica. Além disso, a especificidade da
interação permite a imobilização da proteína de forma uniformemente orientada,
fornecendo uma importante vantagem sobre outros métodos de imobilização.379 O
sistema biotina-estreptavidina tem sido estudado com detalhes por espectroscopia
SPR.380,381 A estreptavidina é uma proteína tetramérica, podendo ser ligada a quatro
moléculas biotiniladas (por exemplo, anticorpos, ácidos nucléicos, etc.) com mínimo
impacto em sua atividade biológica.382 Desta forma, este esquema fornece uma
plataforma pronta para a detecção de analitos dentro do buraco (ver Figura 51). A
Figura 71 apresenta os resultados relacionados à imobilização das proteínas no
biosensor.
Resultados e Discussões Parte II [Year]
148
Figura 71: a) Espectro de transmissão para arranjos de nanoburacos periodicamente
organizados, obtidos através de um filme de 50 nm de SiOx e um filme de 100 nm de
ouro, quando a superfície do ouro foi modificada sequencialmente por uma
monocamada de cisteamina, BNHS e estreptavidina. b) Medidas dos deslocamentos
do máximo de transmissão após a adição de BNHS e estreptavidina, relativos à
superfície modificada com cisteamina.
O espectro de transmissão para cada passo no processo de montagem foi
medido durante o fluxo de STF sobre a amostra, através da célula de fluxo. Como a
banda relacionada ao modo (1,0) é mais sensível e mais estreita, optou-se em
trabalhar com esta banda para a detecção das diferentes camadas de moléculas
sobre o sensor. Os deslocamentos do máximo de transmissão () foram calculados
usando o espectro de transmissão da superfície de ouro modificada com a
monocamada de cisteamina como referência. O processo de imobilização de todas
as camadas de moléculas sobre a superfície (cisteamina-BNHS-estreptavidina)
corresponde a um deslocamento para maiores comprimentos de onda de ca. 10 nm,
indicando um aumento no índice de refração efetivo, como esperado para a
adsorção de proteínas.383 Com relação à banda (1,1) ocorreu um deslocamento total
de ca. 7 nm. Os resultados foram analisados para 16 arranjos de nanoburacos com
as mesmas características (diâmetro do buraco e periodicidade) em 4 experimentos
separados. As barras de erro presentes na Figura 71b correspondem ao desvio
padrão calculado para as medidas. A reprodutibilidade para cada arranjo de
nanoburaco, estimada para o deslocamento do comprimento de onda relacionado à
imobilização da proteína, foi de cerca de 20%.
700 725 750 775 800
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0 Cisteamina
Biotina
Estreptavidina
Inte
nsid
ad
e /
un
i.a
rb.
Comprimento de onda / nm
a)
Biotina Estreptavidina0
2
4
6
8
10
12
/n
m
b)
Resultados e Discussões Parte II [Year]
149
Considerando que cada molécula de estreptavidina cobre uma área de
25 nm2, é possível estimar que somente 2000 moléculas foram detectadas em cada
buraco. Como cada arranjo contém 900 buracos (30 x 30 nanoburacos), os 10 nm de
deslocamento do comprimento de onda visualizados na Figura 71 foram resultante
de cerca de 3 attomols (3 x 10-18 mols) de proteína. A detecção desta pequena
quantidade de amostra só foi possível devido ao fato de que o filme de SiOx não
diminuiu a sensibilidade dos arranjos investigados. A quantidade de proteína
detectada pode ainda ser diminuída através da redução do tamanho dos arranjos
(diminuição do número de nanoburacos), sem afetar a sensibilidade do dispositivo.305
Experimentos de controle negativo‡‡ foram empregados para verificação de
ligação não específica da estreptavidina sobre o filme de SiOx. O espectro de
transmissão dos arranjos não modificados antes e após imersão em solução de
estreptavidina não apresentaram nenhum deslocamento relativo ao STF.
O fato de que a camada de SiOx não afete a sensibilidade da amostra pode
ser explicado através da análise do campo elétrico dentro do buraco, comparando-se
uma mudança uniforme do índice de refração dentro do buraco com a mudança no
índice de refração resultante das camadas do sistema cisteamina-BNHS e
estreptavidina. Resolvendo-se a equação de Helmholtz384 para o campo longitudinal
do modo de menor ordem, encontrou-se índice de refração efetivo de 1,3518 para as
multicamadas de cisteamina-BNHS-estreptavidina com 7 nm de espessura (η = 1,45)
e STF (η = 1,3376). Estes cálculos teóricos corroboram nossos experimentos. O
modo de menor ordem foi o único modo considerado durante os cálculos já que ele
domina o processo de transmissão óptico nestas condições.385 É óbvia a alta
sensibilidade do modo dentro do buraco em relação à adsorção de espécies na
superfície, a qual resulta da componente do alto campo longitudinal na superfície.
Resumidamente, o isolamento da superfície de ouro buscando a detecção
confinada dentro do nanoburaco permitiu a obtenção de uma plataforma com boa
sensibilidade e detecção de poucas moléculas dentro dos nanoburacos (na ordem
de attomols). A sensibilidade do dispositivo foi de 650 nm/UIR, sendo comparável a
valores previamente descritos na literatura para detecção em toda a superfície.306 No
‡‡
Controle negativo: consiste em um experimento para verificação de mudanças na resposta em
função de ligações não específicas, o termo negativo é utilizado pois espera-se que não ocorram
mudanças na resposta.
Resultados e Discussões Parte II [Year]
150
entanto, o conceito de detecção dentro do buraco permite a detecção de uma menor
quantidade de moléculas devido à redução (5 vezes) da área sensível e ao
confinamento do plasmón na região onde as moléculas foram imobilizadas. Como as
medidas de EOT através de menores arranjos de nanoburacos são simples, o
processo descrito aqui pode ser facilmente aplicado para a detecção de quantidades
sub-attomolares de proteínas, principalmente se for integrado a um sistema de
microfluído para fluxo através dos nanoburacos. Sendo assim, a quantidade de
amostra analisada também seria reduzida, facilitando a detecção de marcadores
tumorais presentes em amostras de pacientes com câncer no estágio inicial de
evolução da doença.
Conclusões Parte II [Year]
151
I.5. Conclusões
O substrato baseado no modo de detecção por EOT permite que seja utilizado
um arranjo experimental simples e de fácil alinhamento. O método de detecção por
aquisição de imagens é uma opção que viabiliza a aplicação do material para a
detecção múltipla e em diferentes concentrações, de forma similar ao ELISA, método
comumente utilizado na detecção de marcadores biológicos. Neste trabalho foi
possível a detecção quantitativa tanto do anticorpo (PAX8) quanto do antígeno
(r-PAX8) através de uma medida em tempo real, a qual é realizada pela aquisição de
imagens fotográficas do substrato. A detecção destes marcadores biológicos é de
suma importância já que eles são relacionados ao câncer de ovário e sua detecção
na fase inicial da doença diminuiria os riscos de morte de forma significativa. Além
disso, a detecção quantitativa dos marcadores tumorais permite a aplicação do
dispositivo para a verificação da eficiência do tratamento de câncer utilizado no
paciente. Um tratamento adequado resultaria em diminuição da concentração destes
marcadores tumorais. O método desenvolvido neste trabalho possui a vantagem de
não trabalhar com moléculas marcadas, o que acontece no caso do ELISA.
Os resultados referentes à amostra onde os plasmóns de superfície foram
confinados dentro dos nanoburacos, mostraram que esta possui semelhante
eficiência quando comparado com sensores cuja detecção é dada por toda a
superfície. O dispositivo integrado foi aplicado com sucesso na detecção de
mudanças do índice de refração, apresentando sensibilidade de 360 nm/UIR e
650 nm/UIR para as bandas de ressonância (1,1) e (1,0), respectivamente. Esta
última amostra consiste em excelente melhora ao se comparar com valores
previamente descritos,306 principalmente ao se levar em conta a área sensível da
plataforma. Além disso, o substrato plasmônico desenvolvido neste trabalho foi
aplicado com sucesso na detecção de multicamadas de moléculas, o qual resultou
em um dispositivo que permitiu a detecção de quantidades attomolares da proteína
estreptavidina em resultado da diminuição da área sensorial da plataforma e
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