Tese Evelyn Rabelo Andrade · 16 científica deste trabalho sob a forma de três artigos...
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1. Introdução
O ovário dos mamíferos contém milhares de oócitos inclusos em
folículos ovarianos (antrais e pré-antrais). Os folículos pré-antrais (FOPA)
representam cerca de 90% da população folicular (SAUMANDE, 1991) e são
responsáveis pela constante renovação de folículos antrais no ovário
(IRELAND, 1987). No entanto, cerca de 99,9% dos folículos de um ovário não
ovulam, pois morrem por um processo fisiológico conhecido como atresia
(SAUMANDE, 1981). Com o intuito de minimizar a grande perda folicular que
ocorre naturalmente in vivo, vem sendo desenvolvida a biotécnica de
Manipulação de Oócitos Inclusos em Folículos Ovarianos Pré-antrais
(MOIFOPA).
A MOIFOPA tem como principal objetivo, recuperar ou isolar FOPA
do tecido ovariano, antes que estes se tornem atrésicos, bem como cultivá-los
até o estágio de maturação, evitando a atresia (FIGUEIREDO et al.,1999).
Assim, para o sucesso da biotécnica de MOIFOPA, torna-se necessário o
desenvolvimento de métodos de cultivo folicular eficientes, que possibilitem o
aproveitamento in vitro de um grande número de FOPA. Neste sentido, o
cultivo de FOPA representa um ponto fundamental para o desenvolvimento
desta biotécnica.
Nas seções seguintes serão abordados aspectos relacionados à
oogênese, foliculogênese, população e classificação folicular, atresia, bem
como os métodos utilizados para obtenção de ativação e crescimento in vitro
de folículos pré-antrais. Será mostrada também a importância da ativação e
crescimento de folículos pré-antrais ovinos in vitro para a melhoria da eficiência
reprodutiva destes animais. Em seguida, será apresentada a contribuição
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científica deste trabalho sob a forma de três artigos científicos, referentes ao
cultivo in vitro de folículos ovarianos pré-antrais ovinos.
2. Revisão de literatura
2.1. Oogênese e foliculogênese
Nas espécies mamíferas, as fêmeas nascem com um estoque de
oócitos formados no decorrer da vida fetal como conseqüência de dois
processos: a oogênese e a foliculogênese (SAUMANDE, 1991).
2.1.1 Oogênese
A oogênese pode ser definida como o desenvolvimento e
diferenciação das células germinativas primordiais da fêmea, culminado com a
formação do oócito haplóide fecundado (RÜSSE, 1983). Nos mamíferos, a
oogênese inicia-se durante a vida fetal e desenvolve-se por meses a anos nos
animais adultos (WASSARMAN, 1988). Em embriões ovinos com 24 dias de
vida, é possível observar a gônada rudimentar na superfície do mesonefro.
Neste estágio, algumas células germinativas primordiais, originárias do saco
vitelínico do embrião em desenvolvimento (HAFEZ, 1996) migram para a crista
genital, onde convertem-se em oogônias, antes que a diferenciação sexual da
gônada tenha ocorrido (BETTERIDGE et al.,1989).
A diferenciação sexual da gônada ocorre, em ovinos, entre os dias
32-35 da vida fetal. Nesse período, a túnica albugínea começa a se formar na
gônada primitiva, permitindo que esta seja diferenciada da gônada feminina, a
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qual apresenta-se indiferenciada até que grupos de células germinativas
iniciem seu desenvolvimento. No mesmo período, a gônada torna-se
esteroidogenicamente ativa (McNATTY et al., 2000).
As oogônias iniciam a prófase da meiose e passam a ser conhecidas
como oócitos (HILSCHER et al.,1974). A diferenciação da oogônia em oócito
primário é marcada pela replicação final do DNA durante o estágio de pré-
leptóteno (interfase que segue a última divisão mitótica da oogônia),
preparando a célula para a divisão meiótica. Em ovinos, a meiose é iniciada
aos 55o de gestação (JUENGEL et al., 2002). Entretanto, no oócito primário ou
imaturo, ocorre a 1a interrupção da meiose e o núcleo permanece estacionado
em prófase I da 1a divisão meiótica (ERICKSON, 1966). A fase de crescimento
do oócito de ruminantes ocorre durante a parada meiótica (prófase I) e é
caracterizada por uma intensa atividade sintética, assinalada pela formação de
várias organelas citoplasmáticas e desenvolvimento de certos elementos
oócito-específicos como a zona pelúcida e os grânulos da cortical (FAIR et
al.,1997). O oócito primário, ou imaturo, permanece no estágio de prófase I até
imediatamente antes da ovulação, quando reiniciará o processo de meiose em
resposta à estimulação pelo hormônio folículo estimulante (FSH) e hormônio
luteinizante (LH) (BUCCIONE et al.,1990), passando em seguida pelas fases
de metáfase I, anáfase I e telófase I, ocorrendo a liberação do 1o corpúsculo
polar e formação do oócito secundário (BETTERIDGE et al.,1989). O processo
de maturação meiótica, in vivo, pode ocorrer apenas no oócito do folículo pré-
ovulatório dominante e resulta, dentre outros fatores, da estimulação específica
do pico pré-ovulatório de LH e FSH (ERICKSON, 1986).
No estágio de metáfase II, ocorre uma segunda interrupção da
meiose (BETTERIDGE et al.,1989). Na maioria das espécies domésticas, o
oócito permanece em metáfase II até ser ovulado e transportado para o
oviduto, onde poderá vir a ser fecundado. Caso a fecundação ocorra, o oócito
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retoma a meiose (BETTERIDGE et al.,1989; BUCCIONE et al.,1990) e culmina
com a extrusão do segundo corpúsculo polar (GORDON, 1994), marcando
assim o fim da oogênese.
2.1.2 Foliculogênese
A foliculogênese corresponde ao processo de formação, crescimento
(por aumento do diâmetro do oócito, multiplicação das células da granulosa e
desenvolvimento do antro) e maturação folicular, tendo início com a formação
do folículo primordial e culminando com o estágio de folículo maduro, também
conhecido como folículo de De Graaf ou pré-ovulatório (SAUMANDE, 1981). O
folículo é a unidade morfofuncional do ovário mamífero e apresenta uma dupla
função: proporcionar um ambiente ideal para o crescimento e a maturação do
oócito e produzir substâncias, principalmente esteróides, além de diferentes
peptídeos (GORDON, 1994).
No 75o dia de gestação na ovelha (McNATTY et al., 2000) os oócitos
em estágio de prófase da 1a divisão meiótica são circundados por uma camada
de células somáticas planas (células da pré-granulosa) e uma membrana
basal, formando, assim, o folículo primordial. Portanto, em ovinos, a
foliculogênese tem início ainda durante a vida fetal e não cessa durante o
período pré-puberal, gestação ou período pós-parto (SAUMANDE, 1991). A
duração total da foliculogênese na ovelha é estimada em 180 dias (CAHILL &
MAULÉON, 1980).
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2.2. Classificação e caracterização estrutural e ultra-estrutural dos
folículos ovarianos
A população folicular do ovário é bastante heterogênea
(SAUMANDE, 1981). De acordo com o estágio de desenvolvimento, os
folículos podem ser classificados como pré-antrais ou não cavitários e antrais
ou cavitários. Os folículos pré-antrais são caracterizados pela ausência da
cavidade antral e podem ser divididos em folículos primordiais, primários e
secundários. Dois tipos de folículos antrais podem ser distinguidos: os folículos
terciários e os folículos pré-ovulatórios, maduros ou de De Graaf. Os folículos
ovarianos estão esquematicamente apresentados na Figura 1.
Figura 1. Representação esquemática do desenvolvimento dos folículos
ovarianos. (Adaptado de RODGERS et al. 1999). 1. Oócito primário; 2. Célula
da Pré-granulosa; 3. Membrana basal; 4. Células da Granulosa; 5. Cavidade
antral; 6. Célula da teca e 7. Oócito secundário.
Primordial Primário Secundário Terciário
Pré-ovulatório
1
2 3 4
6
5
7
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2.2.1. Aspectos estruturais e ultra-estruturais de folículos ovarianos pré-antrais
Os folículos primordiais possuem um oócito circundado por uma
camada de células da granulosa de forma pavimentosa. Os folículos
primordiais ovinos possuem um diâmetro médio de 18,00 µm (AMORIM et al.,
1999). No tocante ao aspecto ultraestrutural folículos primordiais ovinos exibem
um número variável de vesículas dispersas pelo ooplasma. O citoplasma
apresenta numerosas mitocôndrias pleiomórficas, complexos de Golgi bem
desenvolvidos, retículo endoplasmático liso e rugoso em agregados isolados ou
associados a mitocôndrias e vesículas. As células da granulosa apresentam
núcleo de formato irregular com alta taxa núcleo:citoplasma (MATOS et al.,
2004).
Os folículos primários são caracterizados pela presença de uma
única camada de células da granulosa de forma cúbica em torno do oócito,
possuindo um diâmetro médio de 35,01 µm em ovinos (AMORIM et al., 1999).
Estudos de microscopia eletrônica de transmissão têm revelado que esta
categoria folicular é caracterizada por apresentar oócito esférico, com
mitocôndrias alongadas (HYTTEL et al., 1997), complexos de Golgi localizados
na região cortical profunda do ooplasma e presença de polirribossomos (FAIR
et al., 1997). Nos folículos primordiais e primários, a comunicação entre o
oócito e as células da granulosa é aparentemente mediada por endocitose
(HYTTEL et al., 1997), já que a membrana plasmática do oócito apresenta
projeções que penetram entre as células da granulosa (LUCCI et al., 2001)
Os folículos secundários possuem um oócito circundado por duas ou
mais camadas de células da granulosa de forma cúbica. Quando duas a três
camadas de células da granulosa são formadas, as células da teca podem ser
visualizadas em torno da membrana basal (SCARAMUZZI et al.,1993) podendo
ser identificada uma membrana hialinizada denominada zona pelúcida
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(FIGUEIREDO et al., 1995a). Os folículos secundários possuem um diâmetro
médio de 66,03 µm em ovinos (AMORIM et al., 1999). Do ponto de vista
ultraestrutural esta categoria folicular caracteriza-se pela presença de
mitocôndrias alongadas e por um grande número de partículas lipídicas (FAIR
et al., 1997). Nos folículos secundários e estágios subseqüentes a
comunicação entre as células da granulosa e o oócito é feita por junções
intercomunicantes (GAP junctions) que são formadas entre os dois tipos
celulares. (HYTTEL et al., 1997). No ooplasma, o número de organelas e
inclusões como complexo da Golgi, retículo endoplasmático liso, gotículas de
lipídeos e vesículas ligadas à membrana são gradualmente formadas e sofrem
deslocamento para a periferia.
O nucléolo do oócito é gradualmente ativado nos folículos primários e
secundários pela internalização dos centros fibrilares no nucléolo granular. Este
processo provavelmente sinaliza a associação dos genes rRNA com o
nucléolo. A completa internalização do centro fibrilar no folículo secundário
coincide com a ativação da transcrição do oócito e sinaliza a síntese de rRNA e
hnRNA, este último sendo o precursor de mRNA (HYTTEL et al., 1997).
2.2.2. Aspectos estruturais e ultraestruturais de folículos antrais
Com a intensa proliferação das células da granulosa, uma área
preenchida por fluido folicular é identificada na camada granulosa e, a partir de
então, os folículos passam a ser classificados como antrais. A formação dos
folículos antrais em ovinos é observada aos 135 de gestação (LUNDY et al.,
1999). A partir deste estágio, o diâmetro folicular aumenta acentuadamente
devido ao crescimento do oócito, multiplicação das células da granulosa, da
teca e aumento da cavidade antral.
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Os folículos terciários são constituídos de um oócito circundado pela
zona pelúcida, várias camadas de células da granulosa, uma pequena
cavidade antral, uma membrana basal e duas camadas de células tecais (teca
interna e teca externa; GORDON, 1994). Esta categoria folicular caracteriza-se
ultraestruturalmente pela presença de numerosas microvilosidades dentro da
zona pelúcida, bem como de numerosas partículas lipídicas e mitocôndrias
redondas e alongadas. Um maior número de complexos de Golgi pode ser
observado e os grânulos da cortical estão distribuídos no ooplasma, podendo-
se evidenciar ainda os microtúbulos (FAIR et al., 1997).
No tocante aos folículos de De Graaf, estes representam o estágio
terminal do desenvolvimento folicular. Nesta categoria, apesar da
predominância de mitocôndrias de forma arredondadas, mitocôndrias
encapuzadas (caracterizam o completo crescimento do oócito, pelo menos em
bovinos e ovinos, HYTTEL et al., 1997) também são comumente encontradas.
Ambos, retículo endoplasmático liso e rugoso, são observados em grande
número. Podem ser identificados ainda grânulos da cortical e microtúbulos no
ooplasma do oócito. O espaço perivitelino é formado neste estágio de
desenvolvimento e há um aumento no número de vesículas e de complexos de
Golgi. É também no final deste estágio que a função do nucléolo é inativada,
como indica a marginalização dos centros fibrilares, sinalizando uma
presumível retração dos genes rRNA do nucléolo. Concomitantemente, a
atividade transcricional do oócito é diminuída. Foi demonstrado, entretanto, que
a transcrição de mRNA não é completamente inativada com o crescimento total
do oócito (HYTTEL et al., 1997).
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2.3. População Folicular
O ovário dos ruminantes, bem como de todos os mamíferos, possui
uma vasta população de folículos ovarianos (FIGUEIREDO et al.,1995b). Esta
população foi estimada para ovinos adultos em 100.000 (LAND, 1970) folículos
por ovário. Alguns fatores, além da variação individual, podem afetar o número
de folículos presentes no ovário. Dentre eles, podem ser citados raça (CAHILL
et al., 1979), idade (ERICKSON, 1966a; 1966b; RÜSSE, 1983; MONNIAUX et
al., 1997), níveis hormonais (PETERS, 1976), genética (ERICKSON et al.,
1966a), estado reprodutivo (ERICKSON et al., 1976) do animal.
2.4. Atresia
Os FOPA representam 90% da população folicular (SAUMANDE,
1991) e são responsáveis pela renovação contínua de folículos antrais no
ovário (GUILBAULT et al.,1986). No entanto, cerca de 99,9% dos folículos de
um ovário não ovulam, mas sofrem um processo fisiológico conhecido como
atresia, que causa a morte do folículo, por via degenerativa (SAUMANDE,
1981) e/ou apoptótica (FIGUEIREDO et al.,1995a), fazendo com que o ovário
seja um órgão de baixíssima produtividade (IRELAND, 1987). A atresia não é
igualmente prevalente em todos os estágios de desenvolvimento folicular
(FORTUNE, 1994). Em ratos, folículos pré-antrais atrésicos são raros, sendo a
atresia predominante em folículos antrais (HIRSHFIELD, 1988). No entanto, em
ovelhas, DRIANCOURT et al. (1985) demonstraram que aproximadamente
50% dos folículos presentes nos ovários desaparecem durante a fase pré-
antral da foliculogênese. Embora estes dados suportem a idéia de que as
perdas oocitárias também ocorrem em folículos primordiais, primários e
secundários, informações concisas em outras espécies de animais domésticos
ainda não são disponíveis.
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2.4.1. Características morfológicas e apoptose
Ainda na década de 80, foi postulado que a atresia ocorre por um
processo de morte celular programada conhecido por apoptose (TSAFIRI &
BRAW, 1984). Recentemente, um grande número de evidências tem
demonstrado que a apoptose, realmente, é o mecanismo bioquímico
responsável pela atresia folicular (TILLY, 1996; REYNAUD & DRIANCOURT,
2000; MARKSTROM et al., 2002). A apoptose é um programa de suicídio
celular ativo encontrado em todas os organismos multicelulares e ocorre em
tecidos que estão sofrendo alterações de desenvolvimento ou respondendo a
um estímulo fisiológico. A alteração típica observada é a condensação da
cromatina, resultando na formação de zonas densas de heterocromatina sobre
a membrana nuclear (HUGHES & GOROSPE, 1991; TILLY, 1996).
Independentemente da condensação da cromatina, endonucleases
dependentes de cálcio e magnésio são ativadas, resultando na clivagem do
DNA entre as unidades nucleosomais, a cada 180-200 pares de bases
(HUGHES & GOROSPE, 1991; TILLY, 1996). O citoplasma de células
apoptóticas é caracterizado pela agregação e desorganização das organelas
citoplasmáticas. Concomitantemente, a membrana plasmática mostra sinais de
retração e finalmente, a célula rompe-se em diversos fragmentos conhecidos
por corpos apoptóticos (KAIPIA & HSUEH, 1997). Os corpos apoptóticos são,
então, fagocitados pelas células da circunvizinhas. Este processo usualmente
inicia-se antes que a membrana plasmática perca completamente sua
integridade, de forma a não permitir o extravasamento dos componentes
citoplasmáticos, além de não ser observada reação inflamatória (HSUEH et al.,
1994).
Durante a atresia, muitas características morfológicas da apoptose
têm sido demonstradas em oócitos e células da granulosa de folículos
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atrésicos. O processo de atresia usualmente difere entre folículos pré-antrais
(primordiais, primários e secundários) e antrais. Em folículos pré-antrais, as
primeiras alterações indicativas de atresia ocorrem no oócito, como por
exemplo, retração da cromatina nuclear e fragmentação oocitária, o que
desencadeia o processo de eliminação irreversível dos folículos ovarianos
neste estágio de desenvolvimento (MORITA & TILLY, 1999). Em folículos pré-
antrais, alterações nas células da granulosa são raramente observadas (JORIO
et al., 1991). É importante ressaltar que após a formação da cavidade antral,
ocorre uma alteração na sensibilidade do oócito e das células da granulosa. A
partir deste estágio, o oócito torna-se altamente resistente e as primeiras
alterações indicativas de atresia são observadas nas células da granulosa. O
aparecimento de células da granulosa com núcleos picnóticos, onde se
observa condensação da cromatina e retração nuclear, podem ser
considerados como os primeiros sinais morfológicos de atresia, que são
observados predominantemente em células da granulosa em proximidade da
cavidade antral. Posteriormente, fragmentos de núcleos picnóticos ou corpos
apoptóticos são observados na cavidade antral (HUGHES & GOROSPE, 1991;
TILLY, 1996). Com a progressão da atresia, observa-se uma redução do
número de camadas das células da granulosa e invasão do folículo por
fibroblastos e macrófagos. Após estas drásticas mudanças na camada
granulosa, o oócito freqüentemente sofre pseudomaturação, fragmenta-se, e
finalmente é removido pelas células invasoras durante os estágios finais de
atresia (BYSKOV, 1974).
2.5. Ativação e crescimento dos folículos pré-antrais in vitro
Para que o crescimento dos folículos primordiais ocorra, é
necessário, primeiramente, que eles sejam ativados. A ativação dos folículos
primordiais é um processo que se dá pela passagem dos folículos do pool de
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reserva ou folículos quiescentes para o pool de folículos em crescimento
(primário, secundário, terciário e/ou pré-ovulatório; RÜSSE, 1983). O primeiro
sinal de ativação dos folículos primordiais é a retomada da proliferação das
células da granulosa, ou seja, o folículo primordial, o qual apresenta-se
circundado por uma camada de células da granulosa de formato pavimentoso e
cúbico (BRAW-TAL & YOSSEFI, 1997) transforma-se em folículo primário
(VAN DEN HURK et al.,1997), circundado por somente uma camada de células
cubóides. Além da mudança da forma das células da granulosa, os volumes
citoplasmático e nuclear do oócito aumentam consideravelmente
(HIRSHFIELD, 1991). O conhecimento sobre os fatores e mecanismos
envolvidos na regulação e ativação dos folículos primordiais são escassos,
entretanto, existem hipóteses de que o número de folículos primordiais que
deixa o pool de folículos quiescentes é predeterminado e, que o FSH age sobre
a ativação folicular (BETTERIDGE et al.,1989). HIRSFIELD (1991) sugeriu que
a ativação e o crescimento dos folículos primordiais devem ser controlados
tanto por fatores endócrinos (gonadotrofinas), como por fatores intraovarianos
(fatores de crescimento). A ativação dos folículos primordiais continua assim
que é iniciada, independentemente da fase do ciclo, idade e gestação
(JEWGENOW & PITRA, 1993).
No tocante à ativação de folículos primordiais in vitro, EPPIG &
O’BRIEN (1996) obtiveram sucesso após cultivo de ovários de camundongas
recém-nascidas, onde um grande número de folículos primordiais iniciou seu
crescimento e desenvolveram-se até o estágio de folículos secundários. Da
mesma forma, a ativação de folículos primordiais bovinos (WANDJI et al.,1996;
BRAW-TAL & YOSSEFI, 1997) e babuínos (FORTUNE et al.,1998) também foi
alcançada com êxito após cultivo de pequenos fragmentos de córtex ovariano
de fetos.
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2.6. Técnicas utilizadas para comprovar a ativação, crescimento e
viabilidade de folículos pré-antrais
A análise morfológica, por meio de histologia clássica, tem sido de
grande valor para avaliar a integridade folicular. Associada à técnicas de
coloração específicas, a histologia clássica auxilia principalmente na detecção
da membrana basal ao redor do folículo (FIGUEIREDO et al., 1994; 1995b).
Entretanto, um grande número de alterações ultra-estruturais e moleculares
ocorre durante o desenvolvimento do oócito e podem afetar sua capacidade de
crescimento, maturação e fecundação (HYTTEL et al., 1997). Para completar a
maturação meiótica, ser fecundado com sucesso e sustentar o
desenvolvimento embrionário inicial, o oócito necessita que toda sua
maquinaria celular esteja presente e inalterada. Para se avaliar com
profundidade a qualidade dos oócitos dos folículos a serem destinados ao
cultivo e/ou criopreservação e após terem passado por estes processos, a
microscopia eletrônica de transmissão (MET) torna-se indispensável. Estudos
ultraestruturais têm sido realizados em folículos e oócitos de animais
domésticos como vacas (ASSEY et al., 1994; WEZEL & RODGERS, 1996) e
ovelhas (BRAND & JONG, 1973; CRAN et al., 1980), basicamente em folículos
terciários e pré-ovulatórios. Entretanto, poucos trabalhos até o presente
momento demonstraram a real situação dos oócitos e das células da granulosa
de folículos pré-antrais após os procedimentos de manipulação in vitro
(FIGUEIREDO et al., 1995a; JEWGENOW & STOLTE, 1996; VAN DEN HURK
et al., 1998; MATOS et al., 2004).
Além disso, o estudo do início do crescimento folicular pode ser
realizado pelo uso de marcadores sensíveis para detectar o início deste
crescimento (WANDJI et al.,1996). Dentre os marcadores mais utilizados, o H3-
timidina, a Bromodesoxiuridina (BrdU) e o Antígeno Nuclear de Proliferação
Celular (PCNA) têm sido utilizados com sucesso na detecção do início do
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crescimento de folículos primordiais bovinos (BRAW-TAL & YOSSEFI, 1997),
felinos (JEWGENOW, 1998a) e babuínos (FORTUNE et al.,2000),
respectivamente, pela incorporação dos referidos marcadores no DNA de
células com atividade proliferativa.
2.7. Ácido 3-indol-acético (IAA)
O IAA é o principal representante de um grupo de hormônios
vegetais denominados auxinas (TONIOLLI et al., 1996). Segundo VALIO
(1976), o estudo dos hormônios vegetais teve início com o pesquisador Julius
Sachs na segunda metade do século XIX, cujas observações sugeriram que o
crescimento e desenvolvimento sistemático das plantas seriam controlados por
substâncias de distribuição localizada e ação específica. Essas substâncias
foram isoladas e classificadas como hormônios, denominados auxinas, palavra
de origem grega que significa crescer. O IAA atua em células vegetais ligando-
se a proteínas solúveis da seiva, sendo transportado a receptores
transmembranários, provocando, direta ou indiretamente, respostas celulares
variadas (TONIOLLI et al., 1996), como, por exemplo, aumentando a
plasticidade da parede celular e a entrada de água na célula e alterando o
metabolismo dos ácidos nucléicos, bem como a respiração celular (GALSTON
& PURVES,1960), o que promove o crescimento celular (BARBIER-BRYGOO,
1995).
Entretanto, os mecanismos moleculares da ação das auxinas em
células animais ainda não foram esclarecidos. NUNES & COMBARNOUS
(1995) isolaram o IAA na água de coco, verificando que esta auxina apresenta
ação benéfica sobre o metabolismo dos espermatozóides caprinos,
aumentando a motilidade e taxa de fertilidade, além de permitir sua
conservação durante períodos mais longos. TONIOLLI et al. (1996) utilizaram o
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IAA em concentrações que variaram de 10 a 1000 ng/ml, para conservar
sêmen suíno a 15 °C, apresentando resultados satisfatórios. O IAA também foi
utilizado com sucesso para conservar folículos pré-antrais caprinos a 4 oC por
até 24 h (FERREIRA et al., 2001).
Os efeitos deletérios do IAA são pouco conhecidos. Formas reativas
de oxigênio podem ser formadas após sua peroxidação, gerando produtos
citotóxicos (PIRES DE MELO et al., 1992; FOLKES & WARDMAN, 2001).
PIRES DE MELO et al. (1997) relataram o efeito moderadamente citotóxico do
IAA em neutrófilos. A morte celular foi relacionada à atividade de peroxidases
endógenas, causando alterações ultra-estruturais e produção elevada de
radicais superóxido e peróxido de hidrogênio. Células HL60 humanas perderam
aproximadamente 25 % da viabilidade, 72h após o cultivo por 1h com IAA
(FOLKES et al., 1998). O IAA em altas concentrações pode ligar-se à glutationa
S-transferase (GST), reduzindo sua atividade em substratos nos tecidos
vegetais (BILANG & STURM, 1995). Ressalta-se que a GST tem importante
atuação na proteção contra o dano oxidativo em tecidos vegetais e animais
(IRZYK & FUERST, 1993).
2.8. Fator de Crescimento Epidermal (EGF)
Entre os fatores locais que podem estar envolvidos na foliculogênese
inicial está o Fator de Crescimento Epidermal (EGF), que atua tanto em células
animais quanto em células vegetais (MOON et al., 1994). O EGF é uma
proteína de 6 kDa que tem sido demonstrada em oócitos e células da
granulosa de folículos pré-antrais e antrais (humano: MARUO et al., 1993;
BENNETT et al., 1996, hamster: ROY & GREENWALD, 1990; suíno: SINGH et
al., 1995). É importante mencionar que o RNA mensageiro para EGF tem sido
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demonstrado em oócitos e células da granulosa de folículos antrais em suínos
(SINGH et al., 1995).
A ação do EGF nos folículos ovarianos é mediada por um receptor
presente na membrana celular, ErbB1, que pertence à superfamília ErbB
(RIESE & STERN, 1998). Este receptor de EGF (EGF-R) funciona como
receptor para os membros da família EGF que atuam no controle da
foliculogênese (RIESE & STERN, 1998). O RNA mensageiro e a proteína para
o EGF-R têm sido identificados em oócitos e células da granulosa de folículos
pré-antrais e antrais (camundonga: HILL et al., 1999; rata: CHABOT et al.,
1986; FENG et al., 1987; hamster: GARNETT et al., 2002, vaca: LONERGAN
et al., 1996; porca: SINGH et al., 1995; mulher: MARUO et al., 1993; BENNETT
et al., 1996; QU et al., 2000).
Todas estas evidências sugerem que o EGF exerce um papel central
no controle da atividade ovariana em mamíferos. Vários estudos in vitro têm
demonstrado que o EGF tem promovido a multiplicação de células da
granulosa oriundas de folículos pré-antrais suínos (MORBECK et al., 1993) e
aumenta o crescimento de folículos pré-antrais de bovinos (GUTIERREZ et al.,
2000), hamsters (ROY, 1993), camundongos (BOLAND & GOSDEN, 1994), e
humanos (ROY & KOLE, 1998). O EGF também mostrou reduzir a atresia em
folículos pré-antrais bovinos cultivados in vitro (WANDJI et al., 1996a).
Em folículos antrais, o EGF tem estimulado a maturação oocitária in
vitro (murinos: SMITZ et al., 1998; DE LA FUENTE et al., 1999; ovinos: GULER
et al.,2000; bovinos: LONERGAN et al., 1996; humanos: GOUD et al., 1998;
suínos: PROCHAZKA et al., 2003; LI et al., 2002), expansão das células do
cúmulus (camundongo: O’DONNELL et al., 2004), proliferação das células da
granulosa (suínos: MAY et al., 1992) e produção de estrógeno (humano:
MISAJON et al., 1999). Por outro lado, experimentos in vivo sugerem um
31
possível papel do EGF na indução de atresia (MONNIAUX et al., 1997). No
entanto, o efeito do EGF na indução da atresia em condicões fisiológicas é
questionável, pois um efeito anti-apotótico do EGF tem sido demonstrado
durante o cultivo de células da granulosa de folículos pré-ovulatórios de ratas
(TILLY et al., 1992). Além disso, o EGF pode atuar localmente no ovário
controlando a ação de FSH e LH, pois alguns estudos mostraram que o EGF
inibe a produção de receptores de LH (HATTORI et al., 1995) e aumenta a
expressão de receptores de FSH (LUCIANO et al., 1994).
Em um estudo recente, SILVA et al. (2004a) constataram que o EGF
(100 ng/ml) foi capaz de estimular o crescimento oocitário in vitro durante a
transição de folículo primordial para primário em caprinos; entretanto, não
aumentou a viabilidade folicular quando comparado a folículos não cultivados
(controle). Em um trabalho posterior (SILVA et al., 2004b) foi observado que
tanto os RNA mensageiros como as proteínas para EGF e seu receptor estão
presentes em folículos caprinos em todos os estágios de desenvolvimento, o
que indica a provável participação deste fator de crescimento no controle da
viabilidade e do crescimento folicular nesta espécie.
2.8.1. Fatores de crescimento pertencentes à família EGF
Outros fatores de crescimento pertencentes à família EGF também
participam do controle da foliculogênese. Dentre estes, podem ser citados o
fator de crescimento transformante-α (TGF-α), o heparin binding EGF-like
growth factor (HB-EGF), a anfiregulina, a betacelulina e a epiregulina. A
expressão de TGF-α tem sido demonstrada em oócitos, células do cúmulus,
células da granulosa e da teca em todos os estágios do desenvolvimento
folicular (humanos: BENNETT et al., 1996; REEKA et al., 1998). Estudos in
vitro têm demonstrado que o TGF-α estimula a proliferação de células da
granulosa e da teca em bovinos (SKINNER & COFFEY, 1988). O TGF-α
32
também atua modulando a expressão de receptores de FSH (FINDLAY &
DRUMMOND, 1999), pois este fator tem inibido a ação estimulatória do FSH
sobre a atividade da enzima aromatase (ADASHI et al., 1987). Com relação
aos outros membros da família EGF, o HB-EGF tem sido recentemente
demonstrado em células da granulosa de folículos pré-antrais e antrais, mas
não em folículos pré-ovulatórios (PAN et al., 2004). Isto sugere que o HB-EGF
pode ser um fator mitogênico para as células da granulosa e que a redução da
sua expressão pode ser necessária para a maturação folicular (PAN et al.,
2004). Anfiregulina, betacelulina e epiregulina foram também recentemente
demonstradas em células da granulosa de folículos pré-ovulatórios. A
expressão destes fatores é estimulada pelo LH, e in vitro, anfiregulina,
betacelulina e epiregulina estimulam a expansão das células do cúmulus e a
maturação oocitária, sugerindo que eles funcionam como mediadores
parácrinos que propagam a ação do LH em folículos pré-ovulatórios (PARK et
al., 2004).
2.8.2. Demais fatores de crescimento relacionados à foliculogênese
Recentes estudos têm demonstrado que outros fatores de
crescimento além do EGF, como por exemplo, kit ligand, FGF, TGF-�, IGF-1
promovem manutenção de viabilidade e inibem a atresia folicular (McGEE et
al., 1999; REYNAUD & DRIANCOURT, 2000; MARKSTROM et al., 2002;
NILSSON & SKINNER, 2003).
O Kit ligand (KL) é um fator de crescimento produzido localmente
que desempenha importantes funções no controle da foliculogênese (YOSHIDA
et al., 1997). O KL tem sido demonstrado em células da granulosa de folículos
pré-antrais e antrais em diferentes espécies estudadas (murinos: MANOVA et
al., 1993; MOTRO & BERNSTEIN, 1993; ISMAIL et al., 1996, humanos:
LAITINEN et al., 1995, ovinos: TISDALL et al., 1997, 1999). O receptor para
33
KL, c-Kit, é expresso em oócitos de folículos em todos os estágios de
desenvolvimento, pelo menos em roedores (HORIE et al., 1991; MANOVA et
al., 1993; MOTRO & BERNSTEIN, 1993) e ovinos (CLARK et al., 1996). O
receptor c-Kit também é encontrado nas células da teca de folículos antrais em
murinos e ovinos (MANOVA et al., 1993; MOTRO & BERNSTEIN, 1993,
CLARK et al., 1996). Recentes estudos têm demonstrado que KL promove o
início do crescimento de folículos primordiais (PARROTT & SKINNER, 1999),
crescimento oocitário (DRIANCOURT et al., 2000), proliferação das células da
granulosa e esteroidogênese (murinos: REYNAUD et al., 2001; suínos:
BRANKIN et al., 2003), bem como crescimento e diferenciação das células da
teca (PARROTT & SKINNER, 1997).
O grupo de fatores de crescimento fibroblásticos (FGF) é composto
de pelo menos 20 membros estruturalmente relacionados (POWERS et al.,
2000). No entanto, apenas três fatores deste grupo (FGF-1, FGF-2 e FGF-7)
exercem importantes funções no controle da foliculogênese. Os FGF-1 e -7 são
expressos em células da granulosa e da teca de folículos antrais (BERISHA et
al., 2004) enquanto que o FGF-2 tem sido demonstrado em oócitos de folículos
primordiais e primários e também em células da granulosa de folículos
secundários e antrais (WEZEL et al., 1995). Existem quatro tipos de receptores
de FGF (FGFR-1, -2, -3, -4) que têm sido demonstrados em folículos ovarianos
(BERISHA et a., 2004). O FGF-2 é um importante regulador da função
ovariana, pois ele promove início do crescimento de folículos primordiais
(NILSSON et al., 2001), bem como a proliferação de células da granulosa
(ROBERTS & ELLIS, 1999) e esteroidogênese (VERNON & SPICER, 1994) em
folículos antrais. O FGF-7 também exerce importantes funções na regulação
das atividades de células da granulosa (PARROTT et al. 1994).
A família de fatores de crescimento TGF-β é composta por mais de
40 membros que são agrupados de acordo com homologia estrutural (CHANG
34
et al., 2002), constituindo seus principais membros as bone morphogenetic
proteins-2 (BMP-2), BMP-4, -6, -7, -15 e o fator de diferenciação do
crescimento-9 (GDF-9). Diversos estudos e revisões (DRUMMOND et al.,
2003; KNIGHT & GLISTER, 2003) têm mostrado que várias proteínas
pertencentes à família TGF-β são expressas em oócitos, células da granulosa e
da teca e funcionam como reguladores intraovarianos dos processos de
ativação de folículos primordiais, proliferação de células da granulosa e da
teca, esteroidogênese e maturação oocitária, bem como no processo de
atresia.
Diversas evidências têm mostrado que um sistema formado pelos
fatores de crescimento semelhantes à insulina (IGF) e proteínas de ligação de
IGF (IGFBP) exerce importantes funções no controle do desenvolvimento
folicular e atresia em animais domésticos (MONGET et al., 2002). O sistema
IGF é composto de diferentes elementos, ou seja, IGF-1 e IGF-2, dois tipos de
receptores (IGFR-1 e IGFR-2) e seis IGFBP (IGFBP-1, -2, -3, -4, -5 e -6). O
IGFR-1 funciona como receptor para os dois tipos de IGF enquanto que o
IGFR-2 tem maior afinidade para IGF-2 (JONES & CLEMMONS, 1995). As
IGFBP estão presentes nos fluidos biológicos e atuam inibindo ou
potencializando a ação dos dois tipos de IGF nas células alvo (MONGET et al.,
2002). Em ovários de suínos e roedores, o IGF-1 tem sido localizado nas
células da granulosa de folículos antrais saudáveis enquanto que o IGF-2 é
encontrado nas células da granulosa de folículos saudáveis e atrésicos (ZHOU
et al., 1996). Ambos os receptores de IGF estão presentes em células da
granulosa de folículos primários, secundários e antrais (MONGET et al., 1989;
WANDJI et al., 1992). A ação do IGF consiste em estimular a proliferação e
diferenciação das células da granulosa e da teca (GIUDICE, 1995). Durante o
crescimento de pequenos folículos antrais para o estágio de folículos pré-
ovulatórios observa-se uma redução progressiva dos níveis de IGFBP devido,
principalmente, a alterações nos processos de síntese e/ou degradação
35
(MONGET et al., 2002). Por outro lado, em folículos que estão sofrendo atresia,
os níveis de IGFBP são altos, principalmente, devido a uma redução no
processo de degradação (BESNARD et al., 1997). Com o aumento dos níveis
de IGFBP ocorre uma redução da disponibilidade de IGF livre no ambiente
folicular.
2.9. Hormônio Folículo Estimulante (FSH)
O hormônio gonadotrófico FSH é um crítico regulador da função
ovariana. A ligação do FSH é restrita às células da granulosa e resulta em uma
variedade de reações, tais como a estímulo da proliferação destas células,
síntese de esteróides e expressão de receptores para o EGF e para o
Hormônio Luteinizante (LH) (ROY & GREENWALD, 1991). Entretanto, ainda
não está claro se o FSH afeta a proliferação de células da granulosa de
pequenos folículos pré-antrais. O FSH é conhecido por estimular o crescimento
e a manutenção da viabilidade em células da granulosa de suínos (HIRAO et
al., 1994), ovinos (CECCONI et al., 1999), bovinos (SAHA et al., 2000), búfalos
(GUPTA et al., 2002) e humanos (ROY & TREACY, 1993; ABIR et al., 1997;
WRIGHT et al., 1999). Em hamsters, pequenos folículos pré-antrais são
dependentes de FSH para a síntese de DNA (ROY & GREENWALD, 1986),
além deste hormônio reduzir, significativamente, a porcentagem de folículos
atrésicos (ROY & GREENWALD, 1991).
Em um trabalho recente, ADRIAENS et al. (2004) demonstraram que
na ausência de FSH a sobrevivência de folículos pré-antrais murinos foi
reduzida e a qualidade oocitária foi comprometida. ROY & ALBEE (2000)
mostraram que o FSH é essencial para a diferenciação de células somáticas
em células da granulosa durante o desenvolvimento folicular primordial inicial.
Por outro lado, estudos realizados com camundongos mostraram que o FSH é
36
indispensável somente para a formação do antro (NAYUDU & OSBORN,
1992). NUTTINCK et al. (1996) relataram que o FSH induz a degeneração
oocitária em folículos pré-antrais bovinos cultivados in vitro. Estes relatos estão
de acordo com os resultados obtidos por BRAW-TAL & YOSSEFI (1997) que
determinaram que a adição de FSH (100 ng/ml) no cultivo in vitro de córtex
ovariano de bovinos adultos não aumentou a incorporação de timidina triciada
em células da granulosa após 2 ou 4 dias. Além disso, verificou-se também que
a adição desta gonadotrofina, no meio de cultivo in vitro, não afeta a proporção
de folículos bovinos primários ou secundários presentes após 8 dias (DERRAR
et al., 2000).
O FSH não é um fator determinante para o início do crescimento de
folículos primordiais, já que camundongos transgênicos que não produzem
FSH possuem folículos em crescimento (KUMAR et al., 1997). Além disso,
experimentos in vitro demonstraram que o FSH não estimula o recrutamento ou
ativação de folículos em diferentes espécies (murinos: EPPIG & O’BRIEN,
1996; MAYERHOFER et al., 1997; bovinos: BRAW-TAL & YOSSEFI, 1997,
FORTUNE et al., 1998; DERRAR et al., 2000). Estes resultados são
suportados pelas observações de que os receptores de FSH não são
encontrados em folículos primordiais (RANNIKKI et al., 1995; OKTAY et al.,
1997).
Apesar do FSH não exercer um efeito direto sobre o recrutamento de
folículos primordiais, um efeito estimulatório indireto de FSH tem sido descrito.
Baixos níveis de FSH após hipofisectomia ou tratamento com antagonistas do
hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH) resulta na manutenção do pool
de reserva de folículos primordiais e redução do número de folículos em
crescimento (WANG & GREENWALD, 1993; ATAYA et al., 1995). Além disso,
altos níveis séricos de FSH estimulam o recrutamento de folículos para o grupo
de folículos em crescimento (humanos: FADDY et al., 1992; GOUGEON et al.,
37
1994; murinos: FLAWS et al., 1997). Estes efeitos do FSH são indiretos,
provavelmente via folículos secundários ou antrais que expressam receptores
para ambos os hormônios. Estes folículos podem produzir um ou mais fatores
de crescimento que exercem efeitos diretos sobre o início do crescimento de
folículos primordiais.
Folículos primários e secundários expressam receptores para FSH
(ovinos: TISDALL et al., 1995; roedores: OKTAY et al., 1997) e estudos in vivo
e in vitro têm demonstrado que o FSH estimula o crescimento destes folículos
em roedores (CORTVRINDT et al., 1997, 1998), embora não seja essencial.
Em animais domésticos, o FSH promove aumento do diâmetro oocitário e
crescimento de folículos pré-antrais, bem como estimula a formação de antro e
secreção de estrógeno (bovinos: HULSHOF et al., 1995; GUTIERREZ et al.,
2000; ovinos: CECCONI et al., 1999; suínos: MAO et al., 2002). Em caprinos,
folículos pré-antrais cresceram in vitro em meio contendo FSH, mas apenas
uma pequena percentagem atingiu a formação de antro (HUANMIN & YOUNG,
2000). Com relação a folículos primários e secundários, alguns estudos têm
reportado que o FSH reduz as taxas de atresia (WANDJI et al., 1996a) durante
cultivo in vitro, mas neste estágio, são os fatores de crescimento produzidos
localmente que exercem um papel fundamental.
2.10. Estado atual do cultivo in vitro de folículos pré-antrais
Notável progresso tem sido observado no cultivo in vitro de folículos
pré-antrais em diferentes espécies animais. Em felinos (JEWGENOW &
STOLTE, 1996) e marsupiais (BUTCHER & ULLMAN, 1996), já foi observado o
crescimento de folículos ovarianos pré-antrais isolados após o cultivo in vitro,
porém, sem a formação de antro. Nas espécies ovina (CECCONI et al.,1999),
bovina (GUTIERREZ et al.,2000; McCAFFERY et al.,2000) e caprina
38
(HUANMIN & YONG, 2000), folículos pré-antrais isolados desenvolveram-se in
vitro até o estágio antral. O desenvolvimento de folículos antrais a partir de
folículos pré-antrais foi igualmente obtido para humanos (ROY & TREACY,
1993). Em suínos, folículos secundários crescidos, in vitro, chegaram até a
ovulação e tiveram seus oócitos fecundados in vitro (HIRAO et al.,1994) com
desenvolvimento até o estágio de blastocisto (WU et al.,2001). Apesar do
grande avanço no cultivo in vitro de folículos pré-antrais nas espécies
supracitadas, os resultados mais satisfatórios têm sido observado em animais
de laboratório. DANIEL et al. (1989) relataram a produção in vitro de embriões
de ratos a partir da fecundação de oócitos oriundos de folículos ovarianos pré-
antrais cultivados in vitro. Em camundongos, o desenvolvimento in vitro de
folículos pré-antrais foi descrito por vários autores (QVIST et al.,1990;
CARROLL et al.,1991; NAYÜDU & OSBORN, 1992; EPPIG, 1997). Entretanto,
os melhores resultados foram observados por EPPIG & O’BRIEN (1996) que
obtiveram o nascimento de camundongos a partir de folículos primordiais
ativados, desenvolvidos, maturados e fecundados in vitro.
2.11. Importância da biotécnica de MOIFOPA
Com o intuito de minimizar a grande perda folicular (99,9%) que
ocorre naturalmente in vivo, vem sendo desenvolvida a biotécnica de
MOIFOPA. A possibilidade de isolar folículos pré-antrais do ambiente ovariano
e de cultivá-los in vitro até o estágio de maturação oocitária, representa uma
alternativa para preservá-los, prevenindo-os assim da atresia que ocorreria
fatalmente in vivo e servindo também para o estudo desta importante
população folicular. A MOIFOPA é de relevante importância tanto para a
pesquisa fundamental, quanto para a pesquisa aplicada. In vivo, alguns
aspectos estruturais, fisiológicos, endócrinos e bioquímicos do
desenvolvimento e maturação das células germinativas da fêmea não são
39
ainda bem compreendidos devido aos complexos mecanismos envolvendo o
eixo hipotálamo-hipófise-ovário.
A biotécnica de MOIFOPA é uma importante ferramenta para o
estudo e controle do efeito individual de várias substâncias (hormônios, fatores
de crescimento, peptídeos, carboidratos, matriz extracelular, etc.) sobre o
desenvolvimento desses estágios foliculares. Além disso, esta biotécnica têm
permitido elucidações dos mecanismos de ativação, desenvolvimento e atresia
folicular. No que diz respeito à pesquisa aplicada, o desenvolvimento da
biotécnica de MOIFOPA poderá contribuir de maneira significativa para a
multiplicação de animais de alto valor zootécnico. A MOIFOPA poderá ainda
otimizar a utilização de outras biotécnicas reprodutivas, tais como a fecundação
in vitro, clonagem e transgênese para o uso na produção animal, já que irá
fornecer uma grande e uniforme população de oócitos oriundos de um mesmo
animal (BETTERIDGE et al., 1989).
Uma outra importante aplicação desta biotécnica é a multiplicação de
espécies mamíferas em risco de extinção. Os milhares de folículos pré-antrais
poderiam também ser criopreservados e utilizados para a formação de bancos
de germoplasma para uma posterior utilização. Tendo em vista a prevalência
dos folículos pré-antrais sobre os folículos antrais, milhares de oócitos neles
contidos poderiam ser recuperados a partir de um ovário de um mesmo animal,
congelados e estocados por vários anos, preservando desta forma o material
genético das mais variadas espécies mamíferas.
40
3. Justificativa
O enfoque principal do presente trabalho foi o estudo da população
de folículos pré-antrais, com ênfase nos folículos primordiais, os quais
constituem o pool de reserva de folículos quiescentes e compreendem cerca de
90 a 95% de toda população folicular presente no ovário mamífero. No entanto,
para que os folículos primordiais possam entrar em fase de crescimento
(primário, secundário, antral e pré-ovulatório), é preciso que sejam ativados, ou
seja, retomem a proliferação das células da granulosa, bem como aumentem o
volume citoplasmático do oócito. Neste contexto, é de vital importância o
desenvolvimento de um sistema de cultivo capaz de ativar esses folículos e
assegurar seu posterior crescimento in vitro. No tocante à espécie ovina, até o
presente momento não estão esclarecidos os fatores que regulam a ativação e
o desenvolvimento de folículos pré-antrais, especialmente os relacionados com
o estudo da ação do IAA e de sua interação com o EGF e o FSH na ativação
folicular. Além disso, a qualidade folicular após o cultivo é avaliada somente em
estudos histológicos ou imunohistoquímicos, havendo uma grande carência de
se avaliar as alterações ultraestruturais que ocorrem durante o
desenvolvimento de folículos pré-antrais ovinos in vitro.
Tendo em vista que os ovinos desempenham mundialmente uma
importante função econômica devido a produção de carne, leite e pele, a
compreensão da foliculogênese inicial nesta espécie pode possibilitar o
desenvolvimento de meios de cultivo que permitissem o crescimento de
folículos primordiais in vitro. Futuramente, oócitos provenientes destes folículos
poderiam ser usados para fecundação in vitro e produzir um grande número de
embriões, sendo um fator determinante para otimizar a multiplicação de
ovelhas de alto valor zootécnico e/ou em via de extinção, o que poderia trazer
41
benefícios econômicos para as populações que utilizam esta espécie como
fonte de proteína e de renda. Estes protocolos poderão ainda ser
extensivamente aplicados a outros mamíferos, incluindo a espécie humana,
pois os ovários ovinos assemelham-se aos humanos em tamanho e
composição tecidual (SALLE et al., 2002).
42
4. Hipóteses científicas
Diante do exposto na revisão de literatura, as seguintes hipóteses
foram postuladas:
1) O IAA pode estimular a ativação e o crescimento de folículos pré-antrais
ovinos in situ;
2) O IAA pode interagir com o EGF e com o FSH na ativação e no crescimento
in situ de folículos pré-antrais ovinos;
3) Os folículos pré-antrais ovinos cultivados nestas condições permanecem
ultraestruturalmente normais.
43
5. Objetivos
O presente trabalho foi dividido em três capítulos e os objetivos gerais e
específicos são descritos abaixo.
5.1. Gerais:
• Desenvolver um sistema de cultivo eficiente para FOPA ovinos in situ
5.2. Específicos:
• Avaliação, por histologia clássica, de condições de cultivo in vitro que
permitam e mantenham o crescimento e a sobrevivência de folículos
pré-antrais ovinos com diferentes concentrações de IAA
• Avaliação histológica dos efeitos da adição de IAA, EGF e FSH ao meio
de cultivo in vitro dos fragmentos ovarianos ovinos e determinação dos
seus efeitos na ativação e viabilidade dos folículos pré-antrais
• Investigar as características ultraestruturais de folículos pré-antrais após
o cultivo de fragmentos ovarianos ovinos por 6 dias na presença de IAA,
EGF e FSH
• Instalação da linha de pesquisa - cultivo folicular - na Universidade
Estadual de Londrina
44
6. Capítulo 1
Efeito de diferentes
concentrações de ácido 3-indol-
acético na ativação e crescimento
in vitro de folículos pré-antrais
ovinos
Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e
Zootecnia, v. 57, p.334-339, 2005
45
Efeito de diferentes concentrações de ácido 3-indol-acético na ativação e crescimento in vitro de folículos pré-antrais ovinos
[Effect of different concentrations of indol acetic acid in the activation and growth of ovine preantral follicles]
E.R. Andrade1*, M.M. Seneda2, A.A. Alfieri2, J.A. Oliveira3, J.R. Figueiredo4, R. Toniolli4
1Doutoranda em Ciências Veterinárias
Faculdade de Veterinária - Universidade Estadual do Ceará – Fortaleza, CE 2DCV – CCA – UEL - Londrina, PR 3FMVZ - UNESP – Jaboticabal, SP
4FAVET - UECE – Fortaleza, CE
RESUMO
Avaliou-se o desenvolvimento de folículos pré-antrais ovinos após o cultivo in vitro do córtex ovariano em várias concentrações de ácido 3-indol acético (IAA). O córtex ovariano foi dividido em fragmentos de aproximadamente 3×3mm. Um fragmento foi imediatamente fixado em Bouin (controle – dia 0) e os demais destinados ao cultivo por dois ou seis dias em meio essencial mínimo (MEM+) acrescido de 10, 40, 100, 500 ou 1000ng/ml de IAA. Após o cultivo in vitro, não houve variação entre folículos dos tratamentos e folículos-controle, exceto nos suplementados com 40ng/ml de IAA. Nestes observaram-se redução de folículos primordiais e aumento de folículos em desenvolvimento (P<0,05). Em relação aos folículos do grupo-controle, houve redução de pré-antrais normais no cultivo de seis dias, exceto nos suplementados com 40ng/ml de IAA (P<0,05). Após dois dias de cultivo, a redução foi observada somente nos folículos suplementados com 500 ou 1000ng/ml de IAA. Folículos pré-antrais ovinos podem ser ativados in vitro com sucesso após o cultivo em MEM+ suplementado com 40ng/ml de IAA. Palavras-chave: ovino, folículo pré-antral, cultivo in vitro, ácido 3-indol acético
Recebido para publicação em 19 de janeiro de 2004
Recebido para publicação, após modificações, em 28 de julho de 2004 *Endereço para correspondência (corresponding address)
Rua Paranaguá, 450, apto. 102, Centro
86020-030 – Londrina, PR E-mail: [email protected]
46
ABSTRACT
The development of ovine preantral follicles after in vitro culture of ovarian cortex in various concentrations of indol acetic acid (IAA) was evaluated. The ovarian cortex was divided into fragments of approximately 3×3mm. One fragment was immediately fixed in Bouin (control – day 0) whereas the other fragments were cultured for two or six days in minimum essential medium (MEM) supplemented (MEM+) with 10, 40, 100, 500 or 1000ng/ml of IAA. After six days of in vitro culture the percentage of primordial and developing follicles remained unaltered when compared to control follicles, except for MEM+ added of 40ng/ml of IAA that presented reduction of primordial follicles and increase of developing follicles (P<0.05). The culture of ovarian cortex for six days, in all tested media, except for MEM+ added of 40ng/ml of IAA, reduced the percentages of healthy follicles when compared to control follicles (P<0.05). After two days of culture this reduction was only observed in the follicles treated with 500 or 1000ng/ml of IAA. Ovine primordial follicles may be successfully activated in vitro after culturing in MEM+ containing 40ng/ml of IAA. Keywords: ovine, preantral follicles, in vitro culture, indol acetic acid
INTRODUÇÃO Ao nascimento, as fêmeas de mamíferos apresentam ovários com milhares de folículos primordiais (Hirshfield, 1991). No entanto, apenas alguns deles se desenvolvem até o estádio de folículo pré-ovulatório, pois a maioria torna-se atrésica após iniciar o crescimento in vivo (Eppig e O’Brien, 1996). Os folículos primordiais constituem importante fonte de oócitos que podem ser utilizados em estudos in vitro. Nesse sentido, a biotécnica de manipulação de oócitos inclusos em folículos pré-antrais objetiva o desenvolvimento in vitro de folículos primordiais até o oócito tornar-se apto à fecundação (Figueiredo et
al., 1999). A ativação é a primeira e essencial etapa para o crescimento dos folículos primordiais (Fortune et al., 2000). Apesar de os fatores responsáveis pela ativação não se encontrarem totalmente esclarecidos, destaca-se o nascimento de um camundongo a partir da manipulação de oócitos em folículos pré-antrais (Eppig e O’Brien, 1996). O crescimento in vitro de folículos primordiais depende de métodos de cultivo capazes de ativar o folículo primordial, além de promover sua manutenção e crescimento até o estádio antral. O meio essencial mínimo (MEM) tem sido usado com sucesso no cultivo in vitro de córtex ovariano bovino (Braw-Tal e
47
Yossefi, 1997) e de folículos pré-antrais isolados (Figueiredo et al., 1994). A adição do ácido 3-indol acético (IAA) viabilizou a conservação de sêmen caprino (Nunes e Combarnous, 1995), suíno (Toniolli et al., 1996) e humano (Nunes, 1998). Entretanto, o papel do MEM suplementado com IAA no desenvolvimento folicular permanece desconhecido. O objetivo deste estudo foi estabelecer condições de cultivo in vitro que permitam e mantenham o crescimento e a sobrevivência de folículos pré-antrais ovinos com diferentes concentrações de IAA.
MATERIAL E MÉTODOS Ovelhas adultas (n=4), sem raça definida, foram abatidas para obtenção dos ovários. As oito gônadas foram submersas em álcool a 70,0 % por 10 segundos e lavadas duas vezes em solução salina a 0,9%. Os ovários, depositados em solução salina a 0,9% suplementada com penicilina (200UI/ml) e estreptomicina (200mg/ml) a 39°C, foram imediatamente transportados para o laboratório em tempo inferior a uma hora. No laboratório, após a retirada dos ligamentos e do tecido circundante dos ovários seccionou-se cada gônada, longitudinalmente, para retirada da medula, grandes folículos antrais e corpos lúteos. O córtex foi dividido em fragmentos de aproximadamente 3×3×1mm. Um fragmento, escolhido
aleatoriamente, foi fixado em Bouin para análise histológica – tratamento-controle (TC) - dia 0. Os outros fragmentos foram cultivados individualmente em placas de cultivo de 24 poços, cada um contendo 1ml dos seguintes meios: MEM suplementado com penicilina (200UI/ml), estreptomicina (200mg/ml), albumina sérica bovina (1,25mg/ml), insulina (6,25µg/ml), transferrina (6,25µg/ml) e selênio (6,25ng/ml (MEM+; T1), MEM+ suplementado com 10ng/ml de IAA (T2), MEM+ suplementado com 40ng/ml de IAA (T3), MEM+ suplementado com 100ng/ml de IAA (T4), MEM+ suplementado com 500ng/ml de IAA (T5) e MEM+ suplementado com 1000ng/ml de IAA (T6), como apresentado na Fig. 1. O cultivo in vitro foi realizado a 39°C em atmosfera com 5% CO2, durante dois ou seis dias, conforme o tratamento. Foram realizadas quatro réplicas de cada tratamento. No TC e nos dias dois ou seis, os fragmentos de córtex ovariano de cada tratamento foram destinados ao processamento histológico clássico. O procedimento inicial consistiu na fixação em Bouin por 24h, com posterior desidratação em etanol, diafanização em xilol e imersão em parafina. Cada fragmento foi cortado de forma seriada a cada 5µm. As secções resultantes foram montadas em lâminas e coradas pelo método hematoxilina-eosina. Os folículos foram classificados de acordo com o estádio de desenvolvimento. Como primordiais,
48
consideraram-se aqueles com uma camada de células da granulosa de formato pavimentoso envolvendo o oócito. Três categorias foram consideradas como folículos em desenvolvimento. Os folículos primários iniciais (primeira categoria) apresentavam uma camada de células da granulosa de formato pavimentoso-cúbico envolvendo o oócito. Nos folículos primários (segunda categoria), observou-se uma camada de células da granulosa de formato cúbico envolvendo o oócito. A
terceira categoria consistiu de folículos secundários, cujos oócitos estavam envolvidos por duas ou mais camadas de células da granulosa de formato cúbico (Fortune et al., 1998). A morfologia folicular foi avaliada de acordo com a integridade da membrana basal, a densidade celular, a ocorrência de corpos picnóticos e a integridade do oócito. Cada folículo foi classificado como morfologicamente normal ou degenerado. Foram avaliados 120 folículos por tratamento, sendo 30 por réplica.
PAR DE OVÁRIOS (remoção da medula) fragmentação do córtex
fragmentos
Cultivo in vitro Placas de cultivo de 24 poços 39 oC e 5% CO2
(T1) (T2) (T3) (T4) (T5) (T6) Figura 1. Protocolo experimental para o cultivo in vitro de folículos primordiais ovinos na presença ou ausência de IAA. A eficiência para indução da ativação foi considerada pelo aumento do percentual de folículos em desenvolvimento e redução do percentual de folículos primordiais. Esta análise foi realizada a partir da comparação dos folículos do grupo-controle e folículos dos tratamentos dos dias 2 e 6 de cultivo. A
viabilidade dos folículos foi considerada a partir do percentual de folículos pré-antrais morfologicamente normais. A comparação foi realizada entre os folículos do grupo-controle e os folículos dos tratamentos dos dias 2 e 6 de cultivo. A eficiência para indução da ativação e a viabilidade
Controle – fixação em Bouin (TC – D0)
49
dos folículos foram comparadas pelo teste Tukey (P<0,05).
RESULTADOS Em relação à ativação folicular, nos folículos fixados logo após a obtenção dos ovários (TC), verificaram 92,6% de folículos primordiais e 7,4% de folículos em desenvolvimento. Após dois dias de cultivo, essa proporção permaneceu inalterada, exceto nos folículos do T3. Neste tratamento, observou-se redução do percentual de folículos primordiais para 64,2% e acréscimo de folículos em desenvolvimento para 35,8 %, (P<0,05). Após seis dias de cultivo, os melhores resultados de ativação foram obtidos nos folículos submetidos ao T3 e T4, respectivamente, 48,4 % e 34,1% de folículos em desenvolvimento (P<0,05). Os tratamentos mais ineficazes para induzir a ativação após seis dias de
cultivo foram o T1 e T5, respectivamente, com 12,5% e 10,8% de folículos em desenvolvimento (P<0,05). A apresentação detalhada desses dados é mostrada na Tab. 1. Os resultados da viabilidade folicular são apresentados na Tab. 2. Foram considerados os percentuais dos folículos pré-antrais normais no fragmento controle (TC) e após o cultivo por dois e seis dias nos tratados. No córtex ovariano cultivado por seis dias, em todos os meios testados, exceto no T3, verificou-se redução da porcentagem de folículos morfologicamente normais em relação aos folículos do TC (P<0,05). Nos folículos cultivados por dois dias, os resultados mais favoráveis foram observados em T1, T3 e T4. A proporção de folículos morfologicamente normais nestes tratamentos foi similar à do tratamento controle (P>0,05).
50
Tabela 1. Porcentagem de folículos primordiais e em desenvolvimento em tecido não-cultivado (TC) e no tecido após cultivo por dois e seis dias nos diferentes tratamentos Variável Folículos primordiais (%) Folículos em desenvolvimento
(%) TC 92,6 7,4 Cultivado Dia 2 Dia 6 Dia 2 Dia 6 T1 88,4aA 87,5aA 11,6aA 12,5aA T2 90,9aA 78,6aAB 9,1aA 21,4aA,B T3 64,2*aB 51,6*bB 35,8*aB 48,4*aC T4 88,3aA 65,9*bB 11,7aA 34,1*bB,C T5 85aA 89,2aA 15aA 10,8aA T6 91,8aA 75,8aA,B 8,2aA 24,2aA,B * Difere significativamente do tecido não cultivado Valores seguidos por letras distintas minúsculas na linha e maiúsculas na coluna diferem entre si (P<0,05). T1= MEM +; T2= MEM+IAA (10ng/ml); T3= MEM+IAA (40ng/ml); T4= MEM+IAA (100ng/ml); T5= MEM+IAA (500ng/ml); MEM+IAA (1000ng/ml). Tabela 2. Viabilidade folicular em tecido não-cultivado (TC) e no tecido após cultivo por dois e seis dias nos diferentes tratamentos Variável Viabilidade folicular TC 96,6 Cultivado Dia 2 Dia 6 T1 83,3a,A 66,6*a,A T2 80,8a,AB 65,8*a,A T3 88,5a,A 82,8a,A T4 88,3a,A 68,3*b,A T5 64,1*a,B 48,3*a,B T6 64,6*a,B 38,3*b,B * Difere significativamente do tecido não cultivado Valores seguidos por letras distintas minúsculas na linha e maiúsculas na coluna diferem entre si (P<0,05) T1= MEM +; T2= MEM+IAA (10ng/ml); T3= MEM+IAA (40ng/ml); T4= MEM+IAA (100ng/ml); T5=
MEM+IAA (500ng/ml); MEM+IAA (1000ng/ml).
DISCUSSÃO Os resultados permitem considerar a relação dose dependente do IAA no crescimento de folículos pré-antrais ovinos inclusos no tecido ovariano. A partir de dois dias de cultivo, constataram-se a ativação de folículos primordiais e o seu subseqüente desenvolvimento. Resultados similares foram descritos para folículos primordiais bovinos (Braw-Tal e Yossefi, 1997) e babuínos (Fortune et al., 1998). O mecanismo responsável pela ativação desses folículos não foi completamente esclarecido. Em condições naturais, o processo de
51
ativação ocorre regularmente ao longo da vida reprodutiva da fêmea (Nilsson et al., 2002). Os processos de cultivo in vitro poderiam acelerar a ativação dos folículos primordiais, pela maior disponibilidade de nutrientes e oxigênio (Wandji et al.; 1997; Wezel e Rodgers, 1996). Outra hipótese seria a presença de um inibidor da ativação folicular de origem medular. Esta inibição cessaria com a separação do córtex e da medula, primeira etapa do procedimento in vitro (Wandji et al., 1996). Essa idéia é sustentada pelos resultados de Eppig e O’Brien (1996), que observaram reduzido percentual de ativação de folículos primordiais quando ovários inteiros foram cultivados in vitro. No entanto, a ativação não foi inibida quando fragmentos de córtex ovariano bovino foram cultivados na presença de tecido medular (Derrar et al., 2000). As auxinas constituem um grupo de hormônios vegetais, sendo o IAA um dos mais importantes (Toniolli et al., 1996). Os mecanismos de ação de auxinas em plantas foram explicados por Barbier-Brygoo (1995). As auxinas ligam-se a uma proteína solúvel, e o complexo formado associa-se a um receptor de membrana (Toniolli et al., 1996). As ações resultantes compreendem aumento da plasticidade da parede celular, alteração na permeabilidade celular, além de modificações nos padrões respiratórios e no metabolismo de ácidos nucléicos (Galston e Purves, 1960). A ação das auxinas em células animais ainda é pouco conhecida. Nunes e
Combarnous (1995) relataram a ação benéfica do IAA em espermatozóides caprinos, facilitando sua conservação, além do aumento da motilidade e conseqüente incremento da fertilidade. Resultados promissores também foram obtidos com sêmen suíno, conservado satisfatoriamente na presença de IAA (Toniolli et al., 1996). Os resultados deste trabalho evidenciam a relação dose resposta do IAA no cultivo in vitro dos folículos pré-antrais ovinos. Observaram-se ativação e crescimento folicular após dois e seis dias de cultivo in vitro apenas com 40ng/ml de IAA. Esta concentração é a mesma da auxina ativa encontrada na água-de-coco (Dua e Chandra, 1993) e esta é a provável razão do seu sucesso nos protocolos de conservação de folículos pré-antrais caprinos (Silva et al., 2000) e ovinos (Andrade et al., 2002). Constatou-se redução da porcentagem de folículos normais quando o córtex ovariano foi cultivado por apenas dois dias em meio contendo IAA nas concentrações de 500ng/ml e 1000ng/ml. Resultados semelhantes foram descritos por Ferreira et al. (2001). Esses autores observaram decréscimo na porcentagem de folículos pré-antrais caprinos morfologicamente normais conservados em TCM 199 com 100ng/ml por até 24h.
52
Os efeitos deletérios do IAA são pouco conhecidos. Formas reativas de oxigênio podem ser formadas após sua peroxidação, gerando produtos citóxicos (Pires de Melo et al., 1992; Folkes e Wardman, 2001). Pires de Melo et al. (1997) relataram o efeito moderadamente citotóxico do IAA em neutrófilos. A morte celular foi relacionada à atividade de peroxidases endógenas, causando alterações ultra-estruturais e produção elevada de radicais superóxido e peróxido de hidrogênio. Células HL60 humanas perderam aproximadamente 25,0% da viabilidade, 72h após o cultivo por 1h com IAA (Folkes et al., 1998). O IAA em altas concentrações pode ligar-se à glutationa S-transferase (GST), reduzindo sua atividade em substratos nos tecidos vegetais (Bilang e Sturm, 1995). Ressalta-se que a GST tem importante atuação na proteção contra o dano oxidativo em tecidos vegetais e animais (Irzyk e Fuerst, 1993). Conclui-se que folículos pré-antrais ovinos podem ser ativados in vitro com sucesso após o cultivo em MEM+ suplementado com 40 ng/ml de IAA e que altas concentrações desse ácido podem ser deletérias para esses folículos. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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55
7. Capítulo 2
Interações do ácido indol-acético
com EGF e FSH no cultivo de
folículos pré-antrais ovinos
Theriogenology, v.64, p.1104-1113, 2005
56
Interactions of indol acetic acid with EGF and FSH in the culture of ovine
preantral follicles
Evelyn Rabelo Andrade a,* , Marcelo Marcondes Senedab, Amauri Alcindo Alfierib,
João Ademir de Oliveirac, Ana Paula Frederico Rodrigues Loureiro Bracarenseb,
José Ricardo Figueiredoa and Ricardo Toniollia
a Faculty of Veterinary Medicine, PPGCV, State University of Ceará, Fortaleza, CE,
Brazil b State University of Londrina, Londrina, PR, Brazil c State University of São Paulo, Jaboticabal, SP, Brazil
* Corresponding author. Tel.: + 55- 43- 33714064.
E-mail adress: [email protected] (E.R. Andrade).
Acknowledgements
This study was sponsored by CNPq, Brazil. The authors thank the generous
donation of pFSH by Dr. Jean-François Beckers of the University of Liège, Belgium.
57
Abstract
The mechanisms that regulate the gradual exit of ovarian follicles from the non-
growing, primordial pool are very poorly understood. The objective of this study was
to evaluate the effects of adding indol acetic acid (IAA), epidermal growth factor
(EGF) and follicle stimulating hormone (FSH) to the media for in vitro culture of ovine
ovarian fragments and determine their effects on growth activation and viability of
preantral follicles. The ovarian cortex was divided into small fragments; one fragment
was immediately fixed in Bouin (Control). The other fragments were cultured for 2 or
6 d in culture plates with: Minimum Essential Medium (MEM) supplemented with ITS
(insulin-transferrin-selenium), pyruvate, glutamine, hypoxantine, bovine serum
albumine and antibiotics (MEM+); MEM+ plus IAA (40 ng/mL); MEM+ plus EGF (100
ng/mL); MEM+ plus FSH (100 ng/mL); MEM+ plus IAA+EGF; MEM+ plus IAA+FSH;
MEM+ plus EGF+FSH; or MEM+ plus IAA+EGF+FSH. After 2 or 6 d of culture in
each treatment, the pieces of ovarian cortex were fixed in Bouin for histological
examination. Follicles were classified as primordial or developing (primary and
secondary) follicles. Compared to the control, in all media tested, the percentages of
primordial follicles were reduced (P<0.05) and the percentages of developing follicles
were increased (P<0.05) after 2 or 6 d of culture. Furthermore, culture of ovarian
cortex for 6 d reduced the percentages of healthy, viable follicles when compared
with the control (P<0.05), except for cultures supplemented with IAA+EGF and
EGF+FSH. In conclusion, the addition of IAA and EGF or EGF and FSH to the
culture media were the most effective treatments to sustain the health and viability of
activated ovine primordial follicles during in vitro culture.
Keywords: Preantral follicles; Ovine; IAA; EGF; FSH
58
1. Introduction
The mammalian ovary is endowed with a large number of preantral follicles,
which represent the resting stockpile of germ cells [1]. The mechanisms responsible
for the initiation of follicular growth, also known as primordial follicle activation, and
the mechanisms that regulated the time of growth initiation, are unknown [2].
Primordial follicles can be considered the storage form of the ovarian follicle, even
though many undergo degeneration [3]. Development of a culture system that can
support the activation and growth of preantral follicles to a stage at which the oocytes
can be matured and fertilized in vitro would provide large numbers of homogeneous
oocytes and would facilitate the identification of factors controlling ovarian follicular
development and acquisition of oocyte developmental competence [4].
Gonadotrophins and growth factors have important roles in the regulation of
ovarian function. Treatment of isolated preantral follicles with follicle stimulating
hormone (FSH) stimulates granulosa cell proliferation and eventual antrum formation
[5-8]. Peptide growth factors like epidermal growth factor (EGF) are involved in the
regulation of several ovarian processes [9], including cell proliferation, differentiation
and steroidogenesis [10]. The auxin indole acetic acid (IAA) is found in cerebrospinal
fluid, in blood and in several tissues, including lung, kidney, liver and brain [11-13].
Although there is considerable interest in using IAA to enhance development of
caprine preantral follicles during in vitro culture [14], very little is known about
potential interactions among IAA, EGF and FSH. A unique study [15] reported that
the interaction between IAA and EGF improved growth in various plants compared to
IAA per se; however, there are apparently no reports regarding the interaction
between IAA and FSH. Interactions between IAA and EGF or FSH in promoting
initiation of growth and viability of ovine primordial follicles during in vitro culture of
pieces of ovarian cortex are unknown. The objective of the present study was to
evaluate the effects of adding IAA, EGF and FSH to the media for in vitro culture of
ovine ovarian fragments and determine their effects on growth activation and viability
of preantral follicles.
59
2. Materials and methods
2.1. Source of ovaries
Ovaries (n=8) from four cyclic adult (1 to 3 yr-old), nonpregnant merino ewes
(in good body condition) were collected at local abbatoirs. Ovaries were washed and
transported in Phosphate Buffered Saline (PBS) to the laboratory within 1 h after
slaughter.
2.2. Experimental protocol
In the laboratory, each pair of ovaries from a single animal was processed
together. Fat and ligaments were removed, the ovary was cut in half and the
medulla, large antral follicles and corpora lutea were removed. Following this, the
ovarian cortex was divided into fragments approximately 3 x 3 x 1 mm. One fragment
was randomly selected and immediately immersed in Bouin solution for 24 h (Control
– Day 0). The remaining pieces of ovarian cortex were cultured individually for 2 or 6
d in culture dishes containing 1 mL aliquots of culture media at 39 °C with 5% CO2 in
air. Every other day, the culture media was replaced with fresh media. The media
used were: (T1) Minimum Essential Medium (MEM; osmolarity, 300 mOsm/L and
pH:7.2; Cultilab, Rio de Janeiro, RJ, Brazil) supplemented with ITS (insulin 6.25
µg/mL, transferrin 6.25 µg/mL and selenium 6.25 ng/mL), 0.23 mM pyruvate, 2 mM
glutamine, 2 mM hypoxantine, 1.25 mg/mL bovine serum albumin (BSA), and
antibiotics (100 µg/mL penicillin and 100 µg/mL streptomycim) (MEM+); (T2) MEM+
plus IAA (40 ng/mL); (T3) MEM+ plus EGF (100 ng/mL; Sigma, St Louis, MO, USA);
(T4) MEM+ plus FSH (100 ng/mL; porcine FSH, a gift from Dr. J.F. Beckers, Liège,
Belgium); (T5) MEM+ plus IAA + EGF; (T6) MEM+ plus IAA + FSH; (T7) MEM+ plus
EGF + FSH or; (T8) MEM+ plus IAA + EGF + FSH. The media were compared using
ovarian fragments from the same animal and each treatment was repeated four
times. The duration of culture was based on the time-course of primordial follicle
activation in other species [16-17]. The concentration of IAA was based on
preliminary studies culturing ovine preantral follicles in our laboratory (unpublished
results) whereas concentrations of FSH and EGF were based on previous reports of
culturing pig granulosa cells recovered from primary and secondary follicles [18] and
bovine small preantral follicles [10].
60
2.3. Qualitative analysis of preantral follicles
After 2 or 6 d of culture in each media, pieces of ovarian cortex were fixed in
Bouin solution (as described for the Control tissues). After fixation, tissues were
dehydrated in increasing concentrations of ethanol series, clarified with xylene, and
embedded in paraffin wax. Serial sections (5 µm) were cut, and every 5th section was
mounted on glass slides and stained by a standard hematoxilin-eosin protocol.
Sections were examined by microscopy (Zeiss, Germany) under × 400 magnification.
Follicles were classified based as described by Hulshof et al. [19]. Preantral
follicles were classified according to the stage of development as primordial follicles
(one layer of flattened granulosa cells surrounding the oocyte) or as developing
follicles (primary or secondary, with one versus two or more layers of cuboidal
granulosa cells, respectively, surrounding the oocyte). Primordial and developing
follicles were individually classified as morphologically normal when they had a
healthy oocyte (without a pyknotic nucleus) with granulosa cells organized in layers.
Conversely, degenerated follicles were defined as those with a retracted oocyte,
pyknotic nucleus, and disorganized granulosa cells detached from the basement
membrane [20]. Overall, 120 follicles were evaluated for each treatment (30 follicles
per replicate). To evaluate follicular activation and growth, only healthy follicles were
considered, and the percentage of primordial and developing follicles was calculated
on Day 0 (control) and after 2 or 6 d of culture in each treatment.
2.4. Statistical analysis
To evaluate follicular activation and growth, only healthy follicles were
considered. The efficiency for induction of the activation was considered by the increase
of the percentage of follicles in development and reduction of the percentage of
primordial follicles. In this analysis, we compared follicles of the control (Day 0) group
and follicles of all treatments on Days 2 and 6 of culture. Follicle viability was considered
by the percentage of all preantral follicles that were morphologically normal; this
comparison was done among the control (Day 0) and all treatments (on Days 2 and 6 of
culture).
An arcsine transformation was done prior to analysis. Repeated measures
analysis of variance was used to evaluate the percentages of primordial and developing
follicles and the percentage of viable follicles among noncultured ovarian cortex and
61
after culture for 2 or 6 d. Pair-wise comparisons were done using Tukey's procedure. All
analyses were done with the Statistical Analysis System (SAS Institute, Cary, NC, USA)
and P < 0.05 was considered significant.
3. Results
3.1. Primordial follicle activation and growth
In relation to follicle activation, non-cultured ovarian cortex (Day 0) contained
mostly primordial follicles (91.7%) and a small percentage of developing follicles (8.3%).
However, by Days 2 and 6 of culture, the percentages of primordial follicles was
reduced, concomitant with an increase in the percentages of developing follicles in all
media tested (P< 0.05 for both) when compared to control.
Comparisons between the treatments at the same culture period were performed
(Figs. 1 and 2); only ovarian cortex cultured for 6 d in cultures supplemented with
IAA+FSH and IAA+EGF+FSH had higher percentages of primordial follicles and lower
percentages of developing follicles when compared with the other treatments (P<0.05
for each).
3.2 . Follicular viability
Data for follicular viability are shown in Fig. 3. On Day 2, the percentage of viable
follicles was significantly lower in cultures supplemented with IAA+FSH and
IAA+EGF+FSH than in the Control group; however, none of the other treatments were
significantly different from the Control group. On Day 6, the percentages of viable cells
in the cultures supplemented with IAA+EGF and EGF+FSH were not significantly
different from the percentage in the Control group; in all of the other treatments, the
percentage of viable follicles was significantly lower than in the Control group.
Regarding the effect of duration of culture, the percentage of healthy follicles decreased
(P<0.05) from 2 to 6 d in only three cultures: MEM only or MEM supplemented with
IAA+FSH or IAA+EGF+FSH.
62
4. Discussion
After only 2 d in culture, there was a sharp decrease in the percentage of
primordial follicles and a concomitant increase in the percentage of developing
follicles, indicating activation of primordial follicles, i.e., the exodus of follicles from
the resting pool and entry into the growth pool. Similarly, primordial follicles in cattle
[16,21] and baboons [17] were activated 2 d after the start of in vitro culture. Although
the mechanisms responsible for activation of these follicles are very poorly
understood, it is well known that, in vivo, primordial follicles leave the resting pool
over the course of many years [22]. Wandji et al. [23] suggested that in vitro
conditions provide a richer environment for the primordial follicles than in situ in the
ovarian cortex, which is poorly vascularized [24-26]. Another hypothesis is that an
inhibitor of medullary origin regulates activation in vivo; perhaps separation of the
cortex from the medulla and in vitro culture activates primordial follicles [21]. In that
regard, Eppig and O’Brien [3] observed activation of only a small proportion of
primordial follicles when whole mouse ovaries were cultured in vitro. Conversely,
when bovine ovarian cortical pieces were cultured in the presence of medullary
tissue, follicle activation was not inhibited [27].
Culture conditions have a profound influence on follicle activation and viability.
In the present study, the addition of IAA (with and without other additives) had
variable effects on preantral follicles. The molecular mechanisms of auxin action in
plants were explained by Barbier-Brygoo [28]. Auxins bind to a soluble auxin-binding
protein and the so-formed complex consecutively associates with a transmembrane
receptor causing, directly or indirectly, a variety of cell responses [29], including
increased cell wall plasticity and cell water uptake, changed cell permeability and
respiratory patterns, and acid nucleic metabolism [30]. However, the molecular
mechanisms of auxin action in animal cells have not been elucidated.
In the present study, the highest percentage of viable follicles occurred when
IAA was used in combination with EGF, as well as EGF in combination with FSH.
This is apparently the first report that ovine preantral follicles in ovarian cortical
pieces can successfully activate and survive after in vitro culture in MEM
supplemented with a combination of IAA and EGF. Growth factors are ubiquitous
peptides, acting in a paracrine and/or endocrine manner, and are involved in
regulation of cell proliferation, differentiation and survival [10]. In that regard, EGF
63
caused proliferation of granulosa cells in pigs [18], hamsters [31], cats [32] and cows
[21]. Maruo et al. [33] reported that EGF participated in oocyte maturation and in
follicular growth in the human ovary. However, very little is known about the
interactions between IAA and EGF. According to Moon et al. [15], the interaction
between IAA and EGF improved growth in various plants when compared to IAA per
se. Conversely, IAA could bind to EGF or another molecule and potentiate its action
in animals. Thus, IAA might bind to the animal growth factors present in the ovarian
tissue, which in turn improve the action of these growth factors in animal cells, and
still keep the cell permeability and respiratory patterns, which may explain the
effectiveness of this treatment.
It was noteworthy that there was a significant decrease in the percentage of
healthy preantral follicles when ovarian cortex was cultured for only 2 d in MEM
containing IAA combined with FSH. There are apparently no previous reports
regarding this combination. Furthermore, the findings related to the addition of
exogenous FSH in cultures of preantral follicles are conflicting. It is reported that FSH
stimulated follicular growth and the health of granulosa cells in pigs [34], sheep [35],
cattle [10] and buffalo [36]. In hamster, small preantral follicles were dependent on
FSH for DNA-synthesis [37] and FSH significantly reduced the percentage of atretic
follicles [38]. Binding of FSH to its receptor and expression of the FSH receptor gene
in granulosa cells of human [39] and bovine [40] follicles and in oocytes of primordial
follicles from small laboratory animals [31] supported the view of a physiological
action of FSH on preantral follicles [41]. Furthermore, in the absence of FSH,
preantral mouse follicle survival was significantly reduced and oocyte quality was
compromised [42]. On the other hand, Nuttinck et al. [43] reported FSH induced
oocyte degeneration in cultured bovine preantral follicles. Similarly, Braw-Tal and
Yossefi [16] reported that addition of FSH (100 ng/mL) to in vitro cultures of adult
bovine cortex did not increase tritiated thymidine incorporation in granulosa cells at 2
or 4 d of culture. Furthermore, the addition of FSH did not affect the proportion of
bovine primary or secondary follicles present after 8 d of culture [27]. The role, if any,
of FSH in causing follicular degeneration is not clear. During the preovulatory period,
FSH stimulates cumulus granulosa cells to synthesize hyaluronic acid which causes
dissociative effects [44]. Perhaps excessive FSH could induce a premature decrease
in cumulus cell-oocyte gap junctional communications that would prevent the transfer
64
of nutrients from granulosa cells to the oocyte, resulting in oocyte death. In the
present study, we were unable to determine why the combination of IAA and FSH
reduced the percentage of healthy follicles. It has been shown IAA can accelerate
lipid peroxidation catalysed by hydrogen peroxide [45]; this reaction is expected to
have adverse effects on sperm fertilizing ability [46]. Peroxidase-catalysed oxidation
of IAA showed that stable products of oxidation were cytotoxic [47]. The mechanism
of cytotoxicity is not clear, however, the cytotoxic effect of IAA has been postulated to
be caused by the products of the peroxidation of this acid, leading to the formation of
reactive oxygen species (ROS) [48-50].
Although the combination of IAA and FSH was deleterious for in vitro culture of
ovine preantral follicles (even in the presence of EGF), FSH and EGF alone or in
combination promoted activation of primordial follicles and supported follicular
viability for up to 6 d in culture. In a recent study from our laboratory, both FSH and
EGF stimulated an increase in follicle size by promoting oocyte growth in caprine
preantral follicles [51]. The addition of EGF plus FSH to in vitro culture of bovine
preantral follicles reduced the percentage of atretic follicle cells and increased the
proliferation rate of granulosa cells relative to controls [10]. An accelerated growth of
bovine preantral follicles to the antral stage has been achieved over a period of as
many as 28 d [52], with FSH and EGF enhancing follicular growth and development.
Roy and Greenwald [53] suggested FSH increases DNA synthesis indirectly by
stimulating EGF production by cultured hamster follicles, which then acts directly in a
paracrine/autocrine manner.
In summary, supplementing the in vitro culture media with either a combination
of IAA and EGF or EGF and FSH maintained follicle viability at percentages that were
not significantly different from those in non-cultured controls, whereas follicle viability
decreased significantly (relative to controls) in all other treatments. Although the
mechanisms of action were not identified, these results open a vast field of research
regarding interactions between plant and animal hormones and growth factors in the
development of a culture system that can support primordial follicles to a stage at
which the oocytes can be matured and fertilized in vitro.
65
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growth factor-1, fibroblast growth factor and follicle-stimulating hormone on
hamster follicular deoxyribonucleic acid synthesis and steroidogenesis. Biol
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70
Fig.1. Mean (± SEM) percentages of healthy preantral ovine follicles that were at
primordial ( ) and developing ( ) stages in non-cultured ovarian tissue (Control)
and in ovarian tissue after in vitro culture for 2 d in various treatments. For both
primordial- and developing-stage follicles, there were differences (P<0.05 for each)
between the Control group and all other treatments, but no significant difference
among all the other treatments (excluding the Control group).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Control MEM IAA EGF FSH
Foll
icle
s (%
)
IAA+
EGF
IAA+
FSH
EGF+
FSH
IAA+EGF+
FSH
71
Fig. 2. Mean (± SEM) percentages of healthy preantral ovine follicles that were at
primordial ( ) and developing ( ) stages in non-cultured ovarian tissue (Control)
and in ovarian tissue after in vitro culture for 6 d in various treatments. For both
primordial- and developing-stage follicles, there were differences (P<0.05 for each)
between the Control group and all other treatments. abFor primordial-stage follicles, treatments (excluding the control) without a common
superscript differ (P<0.05). cdFor developing-stage follicles, treatments (excluding the control) without a common
superscript differ (P<0.05).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Control MEM IAA EGF FSH
Fo
llic
les
(%)
IAA+
EGF
IAA+
FSH
EGF+
FSH
IAA+EGF
+FSH
a
aa
aaa
bb
c
cc
cc c
dd
72
Fig. 3. Mean (± SEM) percentages of preantral ovine follicles that were healthy (viable)
in non-cultured ovarian tissue (Control) and in tissue after culture for 2 d ( ) or 6 d
( ) in various treatments.
*Different (P<0.05) from Control group. abWithin treatments, adjacent bars without a common superscript differ (P<0.05).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Control MEM IAA EGF FSH
Foll
icle
s (%
)
*b
*a*a
*b
*a*a
aa a
a a a
* a
a
*b
a
IAA+EGF
+FSH
IAA+
EGF
IAA+
FSH
EGF+
FSH
73
8. Capítulo 3
Análise ultraestrutural de folículos
pré-antrais ovinos cultivados na
presença de ácido-indol-acético,
EGF e FSH
Artigo Submetido à Publicação
Animal Reproduction Science
74
Ultrastructural analysis of ovine preantral follicles cultured in the presence of
indol acetic acid, EGF and FSH
Evelyn Rabelo Andrade a,*, Fernanda da Cruz Landim-Alvarengab, José Roberto
Viana Silva a, Amauri Alcindo Alfieric, Marcelo Marcondes Senedac, José Ricardo de
Figueiredoa and Ricardo Toniollia
a Faculty of Veterinary Medicine, PPGCV, State University of Ceará, Fortaleza, CE,
Brazil b State University of São Paulo, Botucatu, SP, Brazil c State University of Londrina, Londrina, PR, Brazil
* Corresponding author. Tel.: + 55- 43- 33714064.
Address: Rua Sergipe, 1600 apto 704A. Londrina – Paraná – Brazil. Cep:86020-330
E-mail: [email protected] (E.R. Andrade).
Acknowledgements
The authors wish to thank the Brazilian Institutes CNPq, CAPES and
Fundação Araucária (FAP/PR) for financial support. Alfieri, A.A. is recipient of CNPq
felowship.
75
Abstract
The aim of this study was to investigate the ultrastructural characteristics of preantral
follicles after culturing of ovine ovarian cortical slices for 6 days in the presence of
IAA, EGF and FSH. To evaluate ultrastructure of preantral follicles cultured in MEM
(control) or in MEM containing IAA, EGF, FSH and their interaction, fragments of
cultured cortical tissue were fixed and processes for transmission electron
microscopy. Except in the control, preantral follicles cultured in supplemented media
for 6 d were ultrastructurally normal. They had oocyte with intact nucleus and the
cytoplasm contained heterogeneous-sized lipid droplets and numerous round or
elongated mitochondria with intact parallel cristae were observed. Occasionally these
organelles were associated with smooth endoplasmic reticulum (SER). Rough
endoplasmic reticulum (RER) was rarely found. The granulosa cells cytoplasm
contained a great number of mitochondria and abundant RER. In contrast, follicles
cultured in MEM (control) showed a high number of vacuoles on the oocyte
cytoplasm and the presence of excessive clustering of the chromatin material in the
nucleus, suggesting an initial process of oocyte degeneration. In conclusion, the
presence of IAA, EGF, FSH and their combinations helped to maintain ultrastructural
integrity of ovine preantral follicles cultured in vitro.
Key-words: preantral follicles, ovine, ultrastructural, IAA, EGF, FSH
1. Introduction
The use of oocytes from primordial follicles on reproductive techniques
could offer significant new ways for the propagation of valuable animal stocks. As
these follicles account for the vast majority of follicles (95%) in the ovary (Saumande,
1991), they can provide a great number of potentially viable oocytes for in vitro
reproductive techniques, such as IVF and cloning. Biotechnologies developed for
isolation (Figueiredo et al., 1993; Amorim et al., 2000; Lucci et al., 2002),
cryopreservation (Jewgenow et al., 1998b) and culture (Liu et al., 2002) of primordial
follicles strive to prevent follicular atresia by culturing theses follicles in vitro.
76
Much research on the regulation of early follicular growth has focused on the
control by hormones or growth factors. In bovine, the presence of FSH in the culture
medium did not stimulate follicular activation (Fortune et al., 2000) but did increase
oocyte and follicle diameter in goat primordial follicles activated in vitro (Silva et al.,
2004). Treatment of isolated preantral follicles with follicle stimulating hormone (FSH)
stimulates granulosa cell proliferation and eventual antrum formation (Roy &
Greenwald, 1989; Gore-Langton & Daniel, 1990; Nayudu & Osborn, 1992; Roy &
Treacy, 1993). Peptide growth factors like epidermal growth factor (EGF) are
involved in the regulation of several ovarian processes (Jewgenow, 1996), and has
promoted oocyte growth in goat primary follicles cultured in vitro (Silva et al., 2004).
The auxin indole acetic acid (IAA) is found in blood and in several tissues, including
lung, kidney, liver and brain (Weissbach et al., 1959; Tussel et al., 1984). Previous
studies from our team demonstrated that ovine primordial follicles are successfully
activated in vitro after culturing in medium supplemented with 40 ng/mL IAA; besides
that, the addition of IAA and EGF or EGF and FSH to the culture media were the
most effective treatments to sustain the health and viability of activated ovine
primordial follicles during in vitro culture (Andrade et al., 2005).
In addition to our studies on primordial follicle activation in small ruminants
(Silva et al., 2004), several other groups have demonstrated that a massive
percentage of primordial follicles can be activated in vitro after culture ovarian cortical
slices (bovine: Wandji et al., 1996; primate: Hovatta, 2004). However, primary
follicles obtained in vitro failed to develop to secondary stages even after 20 days in
culture (Fortune et al., 1998). In these works, follicular quality was assessed only by
histological or immunohistochemical studies and there is a great need to evaluate
ultrastructural changes occurring in primordial follicles during activation in vitro. Hyttel
et al. (1997) reported a great number of ultrastructural and molecular alterations
during oocyte development that can affect its growth capacity. Thus, ultrastructural
studies are very important to evaluate the quality of oocytes enclosed in primordial
follicles activated in vitro and to understand why these follicles do not continue their
growth in vitro.
The objective of the present study was to investigate the ultrastructural
characteristics of preantral follicles before and after culturing of ovine ovarian cortical
slices for 6 days in the presence of IAA, EGF and FSH.
77
2. Materials and methods
2.1. Source of ovaries
Ovaries (n=8) from four cyclic adult (1 to 3 yr-old), nonpregnant merino ewes
(in good body condition) were collected at local slaughterhouses. Ovaries were
washed and transported in Phosphate Buffered Saline (PBS) to the laboratory within
1 h after slaughter.
2.2. General culture procedure and media
In the laboratory, each pair of ovaries from a single animal was processed
together. Fat and ligaments were removed, the ovary was cut in half and the
medulla, large antral follicles and corpora lutea were removed. Following this, small
pieces of ovarian fragments were removed for transmission electron microscopy
(TEM). These pieces of ovarian cortex were cultured individually for 6 d in culture
dishes containing 1 mL aliquots of culture media at 39 °C with 5% CO2 in air. Every
other day, the culture media was replaced with fresh media. The media used were:
(T1) Minimum Essential Medium (MEM; osmolarity, 300 mOsm/L and pH:7.2;
Cultilab, Rio de Janeiro, RJ, Brazil) supplemented with ITS (insulin 6.25 µg/mL,
transferrin 6.25 µg/mL and selenium 6.25 ng/mL), 0.23 mM pyruvate, 2 mM
glutamine, 2 mM hypoxantine, 1.25 mg/mL bovine serum albumin (BSA), and
antibiotics (100 µg/mL penicillin and 100 µg/mL streptomycim) (MEM+, control
media); (T2) MEM+ plus IAA (40 ng/mL); (T3) MEM+ plus IAA + EGF (100 ng/mL;
Sigma, St Louis, MO, USA) or (T4) MEM+ plus EGF + FSH (100 ng/mL; porcine
FSH, a gift from Dr. J.F. Beckers, Liège, Belgium). The media were compared using
ovarian fragments from the same animal and each treatment was repeated four
times. The duration of culture was based on the time-course of primordial follicle
activation in ovine (Andrade et al., 2005). The treatments tested was based on the
best results of culturing ovine preantral follicles in our laboratory (Andrade et al.,
2005) whereas concentrations of FSH and EGF were based on previous reports of
culturing pig granulosa cells recovered from primary and secondary follicles (Morbeck
et al., 1993) and bovine small preantral follicles (Saha et al., 2000).
78
2.3. Qualitative analysis of preantral follicles by transmission electron microscopy
Follicular morphology was evaluated based on the integrity of the basement
membrane, cellular density, presence or absence of pycnotic bodies, and oocyte
integrity. Based on these variables, preantral follicles were classified as
morphologically normal (follicles had a healthy spherical oocyte with uniform
cytoplasm, and granulosa cells, well organized in layers, without pycnotic nuclei,
were observed surrounding the oocyte) or degenerate (follicles had an oocyte that
was sometimes retracted, with or without a pycnotic nucleus and disorganized low-
density, swollen granulosa cells).
After 6 d of culture in each media, ultrastructural analysis was performed on
preantral follicles (n=3 in each treatment) included in small cortical fragments. Only
preantral follicles classified as morphologically normal in semi-thin sections were
evaluated. Briefly, small pieces of ovarian cortex were fixed in a solution containing
2.5% glutaraldehyde in 0.1 M phosphate buffer (pH 7.4) and post-fixed in 1% osmium
tetroxide in the same buffer. Subsequently, samples were dehydrated in growing
series of acetone and embedded in Epon resin. Semi-thin sections (3 µm) were
stained with toluidine blue. Thin sections (80 nm) were obtained with razor diamond,
mounted in copper grating, contrasted with uranyl acetate and lead citrate and
examined using a Philips CM100 transmission electron microscope.
3. Results
3.1. Ultrastructural aspects of normal preantral follicles after culture
Based on transmission electron microscopy, only preantral follicles cultured
in MEM+IAA, MEM+IAA+EGF and in MEM+EGF+FSH for 6 d were ultrastructurally
normal. They consisted of a centrally located oocyte with intact nucleus and
surrounded by an organized layer of granulosa cells; the follicle boundary was
demarcated by basal membrane that presented homogeneous and fibrilar aspect, not
being observed breaking in none of the follicles. These follicles were surrounded by a
79
dense connective tissue consisting of fibroblasts, smooth muscle cells, blood vessels
and prominent collagen bundles (Fig. 1).
Large round oocyte nucleus occupying a central or eccentrally position in
the cytoplasm and containing granular substance and intact membrane was
observed. Although the nucleolus was not clearly visualized, an electron dense
fibrilar material was observed in oocyte nucleus (Fig.2). Nuclear envelop contained
pores in which communication of granular material between nucleus and cytoplasm
was occasionally observed (2A).
The cytoplasm contained heterogeneous-sized lipid droplets that did not
have a membrane, but occasionally had fibrilar material (Fig.3A). Numerous round or
elongated mitochondria with intact parallel cristae were observed (Fig.3B). Vacuoles
with electron material were often found in mitochondria (Fig.4). Occasionally these
organelles were associated with smooth endoplasmic reticulum (SER) (Fig.3B).
Rough endoplasmic reticulum (RER) was rarely found, but long or short cisterns of
SER were spread throughout the oocyte cytoplasm (Fig. 4). A few Golgi apparatus
were observed in the oocyte and occasionally they were associated with different
sizes of vacuoles, mitochondria and smooth endoplasmic reticulum (Fig.5).
The granulosa cells around the oocyte were characterized by a centrally
located nucleus with an irregular shape, loose chromatin and little peripheral
agglomerates of dense chromatin. They present a high nuclear-to-cytoplasmic ratio;
the cytoplasm contained a great number of mitochondria and abundant RER (Fig.6).
The oocyte and granulosa cells appeared only juxtaposed, without any specific
junctions; however, in the oocyte surface it was noticed the presence of great amount
of coated vesicles (Fig.7). In the cortical surface of the oocyte were observed
microvilli that penetrated in the adjacent cells (Fig.8). In the contact surface between
granulosa cells was noticed the presence of cellular prolongations and areas of gap
junctions (Fig.9).
3.2. Ultrastructural aspects of degenerated preantral follicles after culture
When cultured in MEM+ some discreet changes in the ultrastructure of
preantral follicles was observed. These follicles showed a high number of vacuoles
80
on the oocyte ooplasm and the presence of excessive clustering of the chromatin
material at the ultrastructural level, suggesting an initial process of oocyte
degeneration. The oocyte nucleus appeared misshapen and retracted with a wavy
membrane (Fig.10 and 11).
4. Discussion
The present study shows the ultrastructural characteristics of ovine
preantral follicles in fragments of cortical tissue cultured in vitro in MEM+, MEM+IAA,
MEM+IAA+EGF and in MEM+EGF+FSH for 6 d.
In contrast to follicles culture in control medium (MEM+), follicles that were
cultured for 6 d in the presence of IAA, IAA+EGF and EGF+FSH were
ultrastructurally normal. In normal follicles, the nuclear envelop contained pores in
which transferring of granular material from nucleus to cytoplasm was occasionally
observed. In oocytes from other species, morphological evidences also indicate
transference of material especially from nucleolus to oocyte cytoplasm (Cruz-Landim
& Cruz-Hofling, 1979). The transferred material is, probably, ribonucleoproteins that
can associate with mitochondria in the cytoplasm (Eddy, 1975, Clérot, 1976). The
phenomena of transferring material from nucleolus to cytoplasm can be observed in
other cell types, but it is more easily observed in oocytes.
We observed numerous round or elongated mitochondria with intact
parallel cristae in normal ovine preantral follicles. The ultrastructural results described
here and in a previous study by Lucci et al. (2001) with goat preantral follicles are in
good agreement. The observed pleiomorphic variations in mitochondrial shape
possibly represent their role in the metabolism of the developing oocyte. The round
shape of the mitochondria indicates immaturity (Perkins and Frey, 2000) and the
presence of dumbbell-shaped mitochondria suggest that they were in the process of
division (Wassarman and Josefowicz, 1978).
The ooplasm also contains REL e RER associated with round or elongated
mitochondria and vesicles. Such a feature is commonly observed in fresh preantral
follicles of goats (Sharma et al., 1994) and in ovine primordial follicles preserved in
saline solution and TCM 199 (Matos et al., 2004). In normal preantral follicles, the
association of endoplasmic reticulum with mitochondria and vesicles suggests a
81
mechanism for the transport of substrates into the mitochondria. Furthermore,
vesicles containing a variety of internal substances also appear to be evidence of
transport to the paranuclear metabolic center from the oocyte surface or vice versa
(Hertig and Adams, 1967).
The Golgi complex consisted initially solely of lamellae arranged in a
parallel fashion. However, as the oocyte enlarges a small number of vacuoles and
granules appear in close association with the lamellae and at the late stages of
growth the Golgi complex consists of a large conglomerate of vacuoles, granules and
lamellaes (Hyttel et al., 1986). Changes in the ultrastructure of the Golgi complex are
strongly suggestive of its increasing activity, possibly involving the concentration of
secreting products (Wassarman & Josefowicz, 1978).
The preantral follicles presented numerous coated vesicles in the cortical
ooplasm besides a profusion of slender microvilli that extends from the oocyte
membrane into the adjacent cells and presumably increases the absorptive capacity
at the surface of the oocyte. Substances required for the oocyte metabolic needs
could gain access to its cytoplasm by diffusion through the closely opposed
membranes of oocyte and granulosa cells in the areas of intercellular contact, or they
could be incorporated by endocytosis, as suggested by the presence of numerous
coated vesicles at the cortical cytoplasm (Lucci et al., 2001). Besides that, cellular
prolongations and gap junctions were observed between adjacent granulosa cells.
Gap junctions and zonula adherens-like junctions were also observed in bovine
primordial follicles (Fair et al., 1997). However, in goats, special types of junctions
were not observed among granulosa cells or between granulosa cells and oocyte
(Lucci et al., 2001), which may indicate either species specific differences or different
phases of follicular development.
Preantral follicles cultured for 6 d in MEM+ exibited an ooplasm with
numerous vacuoles, as revealed by ultrastructural analysis. Van den Hurk et al.
(1998) and Devine et al. (2000) demonstrated that oocytes with atretic signs contain
numerous vacuoles in the ooplasm. Cytoplasmic vacuoles are also a characteristic
sign of degeneration in granulosa (Hay et al., 1976) and cumulus cells (Assey et al.,
1994) during degeneration in vivo and may represent endoplasmic reticulum swelling
(Tassel and Kennedy, 1980). On the other hand, these vacuoles may be altered
mitochondria, as observed by Fuku et al. (1995) in cryopreserved bovine oocytes.
Silva et al. (2001) reported that mitochondria exhibiting extensive swelling and
82
disappearance of most of cristae as well endoplasmic reticulum enlarged in volume
are the first sign of degeneration in preantral follicles. Proliferation of the endoplasmic
reticulum was also indicative of degeneration in goat follicles conserved in vitro (Silva
et al., 2001). Degeneration of preantral follicles, especially primordial and primary,
could be a consequence of improper growth activation (Mhawi et al., 1991). After the
oocyte activation, organelle multiplication and an increase of the uptake of nutrient
occurs (Rüsse, 1983). The results present here suggest that MEM+ did not provide
an appropriate environment to follicles continue their normal development.
In summary, supplementing the in vitro culture media with IAA or either a
combination of IAA and EGF or EGF and FSH maintained normal ultrastructural
characteristics of ovine preantral follicles in ovarian tissue fragments. These results
suggest that the failure of primary follicles obtained in vitro to develop to secondary
stages is more likely to be because of lacking of one or more specific factors in the
culture media, but not because of ultrastructural changes. This study opens a vast
field of research regarding interactions between plant and animal hormones and
growth factors in the development of a culture system that can support primordial
follicles to a stage at which the oocytes can be matured and fertilized in vitro.
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87
17000 X
cf
cf
gc
gc
n
4350 X
oo
Figure 1. A) Electron micrography of a normal ovine preantral follicle, showing a
centrally located oocyte (oo) with intact nucleus (n) and surrounded by an
organized layer of granulosa cells (gc); B) Notice the basal membrane and the
presence of a fibrilar material (arrows) and collagen fibers (cf)
88
Figure 2: Electron micrography showing the transit of electron dense material (el)
from the nucleus (n) to the cytoplasm (A), and association of this material to
mitochondria (m) and smooth endoplasmic reticulum (ser) (B).
A
el
el
n
m
m
42000 X
B
el
m
57500 X
ser
ser
89
Figure 3. Electron micrography of a normal preantral follicle. Notice: A) the aspect of
the lipid droplets (l) with a membranous material inside (arrows), B) Round and
elongated mitochondria (m) associated with lamellas of smooth endoplasmic
reticulum (ser)
77500 X
A
B
l
m
m
ser
77500 X
90
Figure 4. Electron micrography showing the aspect of normal preantral follicle
mitochondria (m). Notice the presence of an electron dense inclusion (arrow).
31500 X
m
m
m
m
ser
91
Figure 5. Aspect of the Golgi apparatus (G) associated with different sizes of
vacuoles (v), mitochondria (m) and smooth endoplasmic reticulum (ser)
23000 X v
v
v
m
G
G G
ser
92
Figure 6. Electron micrography of a normal preantral follicle. Notice the
aspect of the granulosa cells (gc) around the oocyte (oo).
n n
m
m
m
m
rer
rer
gc
gc
oo
93
Figure 7. Detail of the peripheral region of the oocyte. Notice the presence of
coated vesicles (cv) in the plasmatic membrane.
77500 X
cv
cv
l
94
Figure 8. Detail of the cortical region of the oocyte (oo). Notice the
presence of microvilli (mv) in direct contact with the granulosa cells (gc)
57500X
oo
gc
gc
mv
95
57500 X
gc gc
cp
m
Figure 9. Detail of the contact between granulosa cells (gc). Notice the presence
of citoplasmatic prolongaments (cp) and gap junctions (arrows). m=mithocondria
96
7750 X
gc
gc
n
gc
v v
v
bl
Fig.10: Electron micrography of a degenerated preantral follicle. Notice the
presence of large vacuoles (v) in the oocyte cytoplasma.
97
Fig.11. Electron micrograph of a degenerated preantral follicle. Note the irregularity of
the nuclear outline (arrow) and the presence of a great vacuole (v) in the oocyte
nuclei (n)
7750 X
v
nu
98
9. Discussão geral
Os folículos primordiais representam a fonte pela qual todos folículos
serão recrutados para o crescimento ao longo da vida reprodutiva da fêmea (VAN
DEN HURK & ZHAO, 2005). Sua formação em ratos e camundongos ocorre
sincronicamente dentro de poucos dias após o nascimento (HIRSHFIELD, 1991). Ao
contrário, o desenvolvimento folicular em humanos e espécies domésticas como
bovinos e ovinos é um processo lento, levando cerca de 6 meses da ativação
folicular até o desenvolvimento do folículo pré-ovulatório em humanos e bovinos
(LUSSIER et al., 1994). Os mecanismos que regulam o início deste crescimento, ou
seja, a ativação folicular, permanecem fracamente compreendidos (FORTUNE,
2003). O crescimento in vitro de oócitos a um estágio em que possam sustentar o
desenvolvimento embrionário normal é dependente do oócito alcançar um nível
adequado para responder aos sinais parácrinos e endócrinos responsáveis pela
indução da maturação. Os trabalhos descritos nesta tese avaliaram os efeitos de
diferentes concentrações de IAA, bem como da interação desta auxina com EGF e
FSH sobre a ativação e viabilidade dos folículos pré-antrais ovinos cultivados in vitro.
Além disso, para confirmação da integridade folicular, as características
ultraestruturais foram investigadas. Neste capítulo final, realiza-se uma discussão
dos principais resultados obtidos neste trabalho e consideram-se suas implicações
para futuros estudos da foliculogênese na espécie ovina.
9.1. Modelos in vitro de estudo da ativação folicular
Uma variedade de métodos tem sido desenvolvida para ativação e/ou
crescimento de folículos pré-antrais in vitro. Ovários inteiros de roedores são
suficientemente pequenos para serem mantidos em cultivo e estes cultivos são úteis
para o estudo dos fatores que podem afetar a entrada dos folículos primordiais no
pool de crescimento e a transição de folículos primários para secundários. In vitro,
folículos primordiais inclusos em ovários inteiros de roedores foram ativados e
progrediram aos estágios primário e secundário em cerca de 8 dias (EPPIG &
99
O’BRIEN, 1996); os folículos secundários foram então cultivados in vitro, sendo
obtidos embriões e prole viáveis.
Ao contrário, o tamanho dos ovários de grandes animais impede seu
cultivo como unidades intactas, mas métodos para o cultivo de pequenos fragmentos
do córtex ovariano, a área onde os folículos primordiais estão localizados, têm sido
desenvolvidos em estudos de ativação folicular e crescimento de folículos ativados
em bovinos (WANDJI et al., 1996; BRAW TAL & YOSSEFI,1997), babuínos
(WANDJI et al., 1997) e humanos (HOVATTA et al., 1997). Em todas estas espécies
os fragmentos corticais continham principalmente folículos primordiais e um pequeno
número de folículos primários no início do cultivo. Com base nestes dados
resolvemos testar um sistema de cultivo semelhante em ovinos, ou seja, com
pequenos fragmentos de córtex ovariano, em que obtivemos uma média de 92,1%
de folículos primordiais e 7,9% de folículos em desenvolvimento (primários e
secundários) nos fragmentos do controle (não cultivados).
9.2. Estudo da eficiência de diferentes meios de cultivo para ativação e
manutenção da viabilidade de folículos primordiais ovinos in vitro
Em um trabalho realizado por WANDJI et al. (1997) foram observados
muitos folículos nos quais o oócito tinha iniciado o crescimento e aumentado o
diâmetro, mas em que as células da granulosa permaneciam achatadas, como em
folículos primordiais. Esta observação é interessante porque sugere que a transição
de folículo primordial para primário pode ser iniciada separadamente entre os
compartimentos foliculares e isto implica em mais de um sinal envolvido na ativação
folicular. A partir deste pressuposto e com o intuito aprofundar os estudos sobre o
controle da atresia e crescimento folicular inicial em ovinos, realizou-se neste
trabalho, experimentos para testar o efeito do IAA, EGF e FSH, assim como suas
interações, no cultivo in vitro de folículos pré-antrais ovinos.
Os resultados obtidos no Capítulo 1 evidenciaram a relação dose resposta
do IAA no cultivo in vitro dos folículos pré-antrais ovinos. Observou-se ativação e
manutenção da viabilidade folicular após dois e seis dias de cultivo in vitro apenas
quando utilizamos IAA na concentração de 40 ng/ml. Esta concentração é a mesma
100
da auxina ativa encontrada na água-de-côco (DUA & CHANDRA, 1993). Esta é a
provável razão do sucesso da utilização desse fluido natural nos protocolos de
conservação de folículos pré-antrais caprinos (SILVA et al., 2000) e ovinos
(ANDRADE et al., 2002).
No entanto, pudemos constatar a redução da porcentagem de folículos
normais quando o córtex ovariano foi cultivado por apenas dois dias em meio
contendo IAA nas concentrações de 500 ng/ml e 1000 ng/ml. Resultados
semelhantes foram descritos por FERREIRA et al. (2001). Em um trabalho recente,
PIRES DE MELO e colaboradores (2004) caracterizaram a morte induzida pelo IAA
em neutrófilos cultivados por apenas 12 h, sendo observados a perda da integridade
da membrana (necrose), fragmentação do DNA, condensação da cromatina e perda
do potencial de membrana mitocondrial (apoptose). Entretanto, o mecanismo
envolvido na morte celular induzida pelo IAA ainda não foi determinado.
Há um relato, também de PIRES DE MELO et al. (1997) sobre o efeito
moderadamente citotóxico do IAA em neutrófilos. A morte celular foi relacionada à
atividade de peroxidases endógenas, causando alterações ultra-estruturais e
produção elevada de radicais superóxido e peróxido de hidrogênio. Células HL60
humanas perderam aproximadamente 25,0 % da viabilidade, 72h após o cultivo por
1h com IAA (FOLKES et al., 1998). O IAA em altas concentrações pode ligar-se à
glutationa S-transferase (GST), reduzindo sua atividade em substratos nos tecidos
vegetais (BILANG & STURM, 1995). Ressalta-se que a GST tem importante
atuação na proteção contra o dano oxidativo em tecidos vegetais e animais (IRZYK
& FUERST, 1993). Foi hipotetizado que quando a defesa celular antioxidativa é
limitada, as espécies reativas de oxigênio (ROS) causam oxidação de moléculas
fundamentais liberando proteases, lipases e nucleases das mitocôndrias (FIERS et
al., 1999).
A partir do resultado obtido neste primeiro capítulo, passamos então a
uma segunda fase, onde testamos a interação IAA, EGF e FSH. Os dados
apresentados no Capítulo 2 são os primeiros relatos que folículos pré-antrais ovinos
inclusos em fragmentos corticais ovarianos podem ser ativados e sobreviver com
sucesso após o cultivo in vitro em MEM suplementado com uma combinação de IAA
101
e EGF. Porém, muito pouco é conhecido sobre as interações entre IAA e EGF. De
acordo com MOON et al. (1994), a interação entre IAA e EGF melhorou o
crescimento em várias plantas quando comparado a IAA per se. Reciprocamente, o
IAA poderia ligar-se ao EGF ou outra molécula e potencializar sua ação em células
e/ou tecidos animais. Assim, IAA poderia ligar-se a fatores de crescimento animal
presentes no tecido ovariano, o que em troca melhoraria a ação destes fatores nas
células animais, e ainda mantém o permeabilidade e os padrões respiratórios das
células, o que poderia explicar a efetividade deste tratamento.
Por outro lado observou-se que houve uma diminuição significativa na
porcentagem de folículos pré-antrais viáveis quando o córtex ovariano foi cultivado
por apenas 2 d em MEM suplementado com IAA em combinação com FSH.
Aparentemente não há nenhum relato prévio sobre esta associação. Os estudos
relacionados à adição de FSH exógeno ao cultivo de folículos pré-antrais são
conflitantes. O FSH estimula o crescimento folicular e a viabilidade de células da
granulosa em suínos (HIRAO et al.,1994), ovinos (CECCONI et al., 1999), bovinos
(SAHA et al., 2000) e bubalinos (GUPTA et al., 2002). Além disso, na ausência de
FSH, folículos pré-antrais de camundongas apresentaram redução significativa da
viabilidade e qualidade oocitária comprometida (ADRIAENS et al., 2004). Por outro
lado, NUTTINCK et al. (1996) descreveram que o FSH induziu degeneração
oocitária em folículos pré-antrais bovinos cultivados in vitro. Semelhantemente,
BRAW-TAL E YOSSEFI (1997) relataram que a adição de FSH (100 ng/mL) no
cultivo in vitro de córtex ovariano bovino adulto não aumentou a incorporação de
timidina triciada em células de granulosa após 2 ou 4 d de cultivo. Não está claro se
o FSH pode causar degeneração folicular. Durante o período pré-ovulatório, o FSH
estimula a síntese de ácido hialurônico pelas células da granulosa do cumulus, o
que provoca um efeito de dissociação (EPPIG, 1979). Talvez o excesso de FSH
possa induzir uma diminuição prematura nas comunicações juncionais, o que
prejudicaria a transferência de nutrientes das células da granulosa para o oócito,
resultando em morte oocitária.
Embora a combinação de IAA e FSH tenha sido deletéria no cultivo in vitro
de folículos pré-antrais de ovinos (até mesmo na presença de EGF), FSH e EGF
sozinho ou em combinação promoveram a ativação de folículos primordiais e
102
sustentaram a viabilidade folicular por até 6 dias de cultivo. Foi obtido o
desenvolvimento de folículos pré-antrais bovinos até o estágio antral em um período
de 28 d (GUTIERREZ et al., 2000), com o FSH e EGF estimulando o crescimento
folicular. Um efeito indireto do FSH pode ter ocorrido via Kit Ligand, pois JOYCE et
al. (1999) mostraram que o FSH estimula a expressão de Kit Ligand em células da
granulosa de folículos pré-antrais. Além disso, estudos in vitro mostraram que o Kit
ligand é essencial para o crescimento oocitário (NILSSON & SKINNER, 2001,
EPPIG, 2001). Apesar do efeito do FSH ser dependente do estágio de
desenvolvimento folicular (MARKSTROM et al., 2002) e, em camundongos,
somente ter reduzido as taxas de atresia após 6 dias de cultivo, os fatores que
podem ter sido produzidos durante o cultivo de córtex ovariano caprino podem ter
contribuído para reduzir o efeito do FSH. SILVA et al. (2004) observaram que o
EGF, sozinho ou em combinação com o FSH, estimulou o crescimento oocitário
durante a transição de folículos primordiais para folículos primários. Entretanto, os
mesmos autores demonstraram que FSH e EGF não influenciaram a viabilidade
folicular durante o cultivo de córtex ovariano caprino.
9.3. Que mecanismos regulam a transição de folículo primordial para
primário?
Após apenas 2 dias de cultivo houve uma significativa diminuição na
porcentagem de folículos primordiais e um aumento concomitante na porcentagem
de folículos em desenvolvimento, indicando ativação de folículos primordiais.
Resultados similares foram descritos para folículos primordiais bovinos (BRAW-TAL
& YOSSEFI, 1997) e babuínos (FORTUNE et al., 1998).
O mecanismo responsável pela ativação desses folículos não foi
completamente esclarecido. Em condições naturais, o processo de ativação ocorre
regularmente ao longo da vida reprodutiva da fêmea (NILSSON et al., 2002). Os
processos de cultivo in vitro poderiam acelerar a ativação dos folículos primordiais,
devido ao seu microambiente in vitro ser mais rico em nutrientes e oxigênio que in
vivo (WANDJI et al.; 1997; WEZEL & RODGERS, 1996), já que a região cortical do
ovário é pobremente vascularizada (GURAYA, 1985).
103
Outra hipótese seria a presença de um inibidor da ativação folicular de
origem medular. Esta inibição cessaria com a separação do córtex e da medula,
primeira etapa do procedimento in vitro (WANDJI et al., 1996). Esta idéia é
sustentada pelos resultados de EPPIG & O’BRIEN (1996). Estes autores
observaram um reduzido percentual de ativação de folículos primordiais quando
ovários inteiros foram cultivados in vitro. No entanto, a ativação não foi inibida
quando fragmentos de córtex ovariano bovino foram cultivados na presença de
tecido medular (DERRAR et al., 2000). Portanto, é ainda incerto se a ativação de
folículos primordiais é regulada por um inibidor, um estimulador ou um balanço entre
os fatores inibitórios e estimulantes.
Apesar de um grande número de fatores terem sido ligados ao
crescimento folicular inicial, poucos têm sido apontados como reguladores da
ativação folicular. O único fator específico relacionado à ativação de folículos
primordiais é o Kit ligand. O Kit ligand é produzido pelas células da granulosa,
considerando as células germinativas primordiais e as células da teca expressam o
receptor para kit ligand, c-kit (MANOVA et al., 1993; MOTRO & BERNSTEIN, 1993).
YOSHIDA et al. (1997) injetaram camundongos com anticorpos bloqueadores de
função para c-kit em vários períodos durante as primeiras duas semanas de vida e
concluíram que o kit ligand é necessário para a ativação de folículos primordiais,
mas não para sua formação. Um papel essencial para o GDF-9 no crescimento
após o estágio primário é indicado pela análise de mutantes GDF-9 free (DONG et
al., 1996), mas BODENSTEINER et al. (1999) reportaram uma baixa expressão de
mRNA para GDF-9 em folículos primordiais ovinos e bovinos e sugeriram um papel
para este fator de crescimento na ativação folicular de ruminantes. No entanto, é
improvável que a ação isolada de um destes fatores seja responsável pela indução
da ativação folicular. Possivelmente uma combinação de vários destes fatores já
identificados, e talvez de alguns ainda desconhecidos, promova o início do
crescimento dos folículos primordiais in vivo e in vitro. Isto mostra que o meio de
cultivo deve ser igualmente eficiente para manter a viabilidade e crescimento não
somente dos folículos, mas também dos outros tipos celulares presentes no córtex
ovariano.
104
9.4. Confirmação ultraestrutural da viabilidade folicular
Os resultados apresentados nos Capítulos 1 e 2 mostraram que os meios
testados não são igualmente efetivos em promover a manutenção da viabilidade
folicular. Assim, no Capítulo 3 analisamos as características ultraestruturais de
folículos pré-antrais ovinos cultivados em MEM+IAA (40 ng/ml), MEM+IAA+EGF e
em MEM+EGF+FSH, ou seja, os melhores resultados obtidos em nossa pesquisa,
pois apesar deste resultado satisfatório, não havia indicação precisa da qualidade
dos folículos e seus oócitos, assim como uma discriminação do dano a membranas
e organelas citoplasmáticas. Estudos ultraestruturais têm sido realizados em
folículos e oócitos de animais domésticos como vacas (ASSEY et al., 1994; VAN
WEZEL & RODGERS, 1996) e ovelhas (BRAND & JONG, 1973; CRAN et al., 1980),
basicamente em folículos terciários e pré-ovulatórios. Entretanto, poucos trabalhos
até o presente momento demonstraram a real situação dos oócitos e das células da
granulosa de folículos pré-antrais após os procedimentos de manipulação in vitro
(FIGUEIREDO et al., 1995; JEWGENOW & STOLTE, 1996; HURK et al., 1998;
MATOS et al., 2004).
Em contraste com os folículos cultivados no meio controle (MEM+), os
folículos cultivados na presença de IAA, IAA+EGF e EGF+FSH apresentaram-se
ultraestruturalmente normais. Com relação às organelas citoplasmáticas, as
variações pleiomórficas observadas na forma mitocondrial possivelmente
representam seu papel no metabolismo do oócito em desenvolvimento. O ooplasma
continha também retículo endoplasmático liso e rugoso associados com
mitocôndrias circulares ou alongadas e vesículas. Tal característica é comumente
observada em folículos pré-antrais caprinos frescos (SHARMA et al., 1994) e em
folículos pré-antrais ovinos preservados em solução salina e TCM199 (MATOS et
al., 2004). A associação do RE com mitocôndrias e vesículas sugere um mecanismo
de transporte de substratos para a mitocôndria. Além disso, vesículas contendo uma
variedade de substâncias internas também parecem ser uma evidência de
transporte do centro metabólico paranuclear para a superfície do oócito e vice-versa
(HERTIG & ADAMS, 1967).
105
Os oócitos estavam sempre completamente circundados por células da
granulosa e nunca em contato direto com a lâmina basal. De acordo com EPPIG
(1991), a membrana plasmática dos oócitos é provavelmente incapaz de manter um
influxo adequado de nutrientes e um efluxo de produtos metabólicos para propiciar
um ótimo crescimento oocitário. Portanto, a membrana plasmática das células da
granulosa pode atuar como uma extensão da membrana plasmática do oócito
promovendo a ingestão de nutrientes, que se difundem para o oócito através de
conexões estreitas entre as células da granulosa e o oócito.
Nos folículos pré-antrais observados o oolema apresentava numerosas
vesículas cobertas no ooplasma cortical além de uma profusão de finos microvilos
que estendiam-se da membrana do oócito em direção às células adjacentes e
presumivelmente aumentam a capacidade de absorção na superfície do oócito. As
substâncias requeridas para o metabolismo oocitário poderiam ter acesso ao
citoplasma por difusão através de membranas proximamente opostas do oócito e
das células da granulosa nas áreas de contato intercelular, ou poderiam ser
incorporadas por endocitose, como sugerido pela presença de numerosas vesículas
cobertas no citoplasma cortical (LUCCI et al., 2001). Além disso, prolongamentos
celulares e junções gap foram observadas entre as células da granulosa adjacentes.
Junções gap e junções zônula-aderentes são também observadas em folículos
primordiais bovinos (FAIR et al., 1997). Entretanto, em caprinos, tipos especiais de
junções celulares não foram observados entre as células da granulosa e o oócito
(LUCCI et al., 2001), o que pode indicar tanto diferenças espécie-específicas como
fases diferentes de desenvolvimento folicular.
A membrana basal (MB) parecia ser composta de uma compacta e bem
organizada lâmina na parte interna, circundada por uma espessa camada de fibras
de colágeno, de acordo com a descrição de FIGUEIREDO et al. (1995) para folículos
pré-antrais bovinos. Estudos sugerem que a matriz extracelular pode ser ativamente
rearranjada pelas células da granulosa in vitro (RICHARDSON et al., 2000). Já que
as MB são matrizes extracelulares especializadas, é possível que a MB em torno do
folículo seja rearranjada in vivo também. Entretanto, estudos adicionais são
necessários para comprovar esta idéia. Várias funções potenciais da MB foram
propostas, incluindo a criação e manutenção da integridade tecidual, transporte e
106
filtração de várias substâncias (HESSLE et al., 1984) e ligação a alguns fatores de
crescimento (FEIGE & BAIRD, 1992).
Os folículos pré-antrais cultivados por 6 d em MEM+ exibiam numerosos
vacúolos no ooplasma como revelado pela análise UE. VAN den HURK et al. (1998)
e DEVINE et al. (2000) demostraram que oócitos com sinais de atresia possuem
numerosos vacúolos no ooplasma. Os vacúolos citoplasmáticos também são sinais
de degeneração característicos de células da granulosa (HAY et al., 1976) e do
cumulus (ASSEY et al., 1994) durante a degeneração in vivo e podem representar o
inchaço do retículo endoplasmático (TASSEL & KENNEDY, 1980). Alternativamente,
estes vacúolos podem representar mitocôndrias alteradas, como observado por
FUKU et al. (1995). SILVA et al. (2001) relataram que mitocôndrias exibindo
extensivo inchaço e desaparecimento da maioria das cristas, assim como o retículo
endoplasmático aumentado de volume são os primeiros sinais de degeneração em
folículos pré-antrais. A degeneração dos folículos pré-antrais, especialmente os
primordiais e primários, pode ser conseqüência de ativação folicular inadequada
(MHAWI et al., 1991). Após a ativação do oócito, ocorre a multiplicação de organelas
e o aumento do influxo de nutrientes (RUSSE, 1983). Os resultados do Capítulo 3
sugerem que o MEM+ não proporciona um ambiente adequado para que os folículos
se desenvolvam normalmente.
107
10. Conclusões
- Folículos pré-antrais ovinos podem ser ativados in vitro e manter sua viabilidade por
até 6 dias quando cultivados em MEM+ suplementado com 40 ng/ml de IAA.
Entretanto, concentrações mais elevadas (500 e 1000 ng/ml) desse ácido podem ser
deletérias para estes folículos.
- Folículos pré-antrais ovinos inclusos em fragmentos corticais ovarianos podem ser
ativados e sobreviver com sucesso após o cultivo in vitro por 6 dias em MEM
suplementado com uma combinação de IAA e EGF, bem como EGF combinado ao
FSH.
- A suplementação do MEM+ com IAA, IAA combinado com EGF ou EGF combinado
com FSH mantêm as características ultraestruturais normais de folículos pré-antrais
ovinos cultivados in vitro por 6 dias.
108
11. Perspectivas
- A habilidade de iniciar o crescimento dos folículos primordiais e manter o
crescimento folicular a um estágio em que o oócito possa ser maturado e
fecundado aumentará drasticamente o potencial reprodutivo das espécies
mamíferas. As condições de cultivo aqui apresentadas são de grande importância
para estudar os sinais que regulam a ativação folicular e os requerimentos para
sustentar o crescimento in vitro de folículos pré-antrais mamíferos, proporcionando,
no futuro, uma grande quantidade de oócitos que poderão ser utilizados nos
programas de fecundação in vitro e clonagem.
- Embora os mecanismos de ação do IAA sozinho ou em combinação com o EGF e
FSH não tenham sido identificados, seus efeitos sobre a ativação e viabilidade de
folículos pré-antrais ovinos abrem um campo vasto de pesquisa relativo a
interações entre hormônios e fatores de crescimento vegetais e animais.
- Apesar de havermos confirmado que folículos pré-antrais ovinos mantêm a
normalidade ultraestrutural quando cultivados nos tratamentos supracitados, é
necessário que sejam realizados estudos adicionais, com períodos maiores de
cultivo, que permitam a produção de folículos secundários viáveis. O estudo
aprofundado da organização ultraestrutural de folículos pré-antrais ovinos poderá
facilitar a compreensão dos faores implicados na atresia e crescimento folicular.
109
12. Referências bibliográficas
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