Estudo de fungos endofíticos associados a plantas da família ...
TESE Fungos Endofíticos Michelia Champaca
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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “Julio de Mesquita Filho”
Instituto de Química de Araraquara
Tese de Doutorado
“BUSCA DE SUBSTÂNCIAS BIOATIVAS EM FUNGOS ASSOCIADOS COM A ESPÉCIE Michelia champaca L. (Magnoliaceae)”
IOANIS HCRISTOS LEPTOKARYDIS
Araraquara – 2008
FICHA CATALOGRÁFICA
Leptokarydis, Ioanis Hcristos L611b Busca de substâncias bioativas em fungos endofíticos associados com a espécie Michelia champaca L. (Magnoliaceae) / Ioanis Hcristos Leptokarydis. - Araraquara : [s.n], 2008 262 f. : il. Tese (doutorado) – Universidade Estadual Paulista, Instituto de Química Orientador: Angela Regina Araújo
1. Química orgânica. 2. Fungos endofíticos. 3. Colletotrichum
gloeosporioides. 4. Michelia champaca L. I. Título.
Elaboração: Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação do Instituto de Química de Araraquara
Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação
IOANIS HCRISTOS LEPTOKARYDIS
Busca de Substâncias Bioativas em Fungos Associados com a Espécie Michelia
champaca L. (Magnoliaceae)”
Tese apresentada ao Instituto de Química,
Universidade Estadual Paulista, como parte dos
requisitos para obtenção do titulo de Doutor em
Química.
Orientadora: Prof.ª Dra. Ângela Regina Araújo.
Araraquara 2008
Dedico este trabalho...
A minha Mãe, pela pessoa maravilhosa e que sempre esteve presente, apoiando e me fortalecendo em todos os momentos. É meu exemplo de vida.
A meu irmão (Daniel) e cunhada (Simone) que sempre estiveram ao meu lado, participando de cada momento de desafio e alegria durante esta trajetória. E meu querido sobrinho. Thiago que traz mais felicidade a nossa família, e um novo sentido a minha vida.
A minha querida Veridiana Dionízio pelo amor, constante incentivo e companheirismo. Conhecê-la me fez uma pessoa melhor, amá-la me fez uma pessoa muito mais feliz.
A querida Prof.ª Ângela, a qual serei grato pelos seus ensinamentos. Graças a sua dedicação se tornou possível a realização deste trabalho sendo de fundamental importância para minha formação.
A querida Prof.ª Márcia Nasser, a qual serei eternamente grato pelos seus conselhos, ensinamentos e sua dedicação nos momentos mais difíceis que passei durante este trajeto, tornando possível a finalização deste trabalho.
A todas as pessoas que por motivos profissionais, pessoais ou acadêmicos chegarem a esta Tese.
AGRADECIMENTOS
“O cientista que raciocina segundo o plano da percepção dos sentidos é o que se acha mais afastado do reconhecimento da verdade, porque toma todas as ilusões produzidas pêlos sentidos como realidades e repele as revelações de sua própria intuição. O filósofo, incapaz de perceber a verdade, procura adquiri-la por meio da inteligência, podendo dela aproximar-se até certo ponto. Só aquele que adquiriu a condição consciente da verdade, reconhecendo-a por percepção direta, a ela se acha intimamente unido e não pode absolutamente enganar-se. poderosa tribuna do aperfeiçoamento.” (Prof. José Henrique de Sousa)
A Deus, pela presença constante iluminando minha vida, orientando meus caminhos e me dando sabedoria.
Ao Departamento de Química Orgânica do Instituto de Química - UNESP, Araraquara, pela possibilidade do desenvolvimento deste trabalho e por ter sido cenário de uma etapa muito importante da minha vida.
À Prof.ª Dra. Ângela R. Araújo pela orientação. Obrigado por sua dedicação em todos estes anos.
Aos professores membros da banca que gentilmente aceitaram o convite para avaliação desta tese.
Aos docentes do Departamento de Química Orgânica: Vanderlan S. Bolzani, Márcia Nasser Lopes, Maysa Furlan, Alberto J. Cavalheiro, Lúcia M. X. Lopes, Dulce H. Siqueira, Wagner Vilegas, Lourdes Campaner dos Santos, lan Castro-Gamboa e Isabele Nascimento pêlos ensinamentos transmitidos e pela amizade.
Às Professoras Lúcia M. X. Lopes, Wagner Vilegas que participaram do meu exame de qualificação e contribuíram valiosamente com sugestões e ensinamentos.
Ao Dr. Nivaldo Boralle pela realização dos inúmeros espectros, amizade e por estar sempre disposto a compartilhar seus conhecimentos.
Ao Dr. Alberto Camilo Alécio por ser tão prestativo, não medindo esforços para colaborar com o trabalho cientifico.
Aos meus grandes amigos Ms. Renata Sordi, Dr. Helder L. Teles, ex-colegas de grupo e competentes profissionais. Obrigado pelas inúmeras dicas, discussões pertinentes e ensinamentos que colaboraram para a realização deste trabalho.
Aos amigos de grupo: Mariana C. Cafêu, Lisinéia M. Zanardi, Camila M. de Oliveira, pela amizade convivência e colaboração dentro e fora do laboratório.
A todos os amigos do departamento, que ainda estão ou já passaram por lá: Carenina Vidoti, Daniara, Karin Bandeira, Fernanda Garcia, Amanda Danuelo, Marcos Pivato, Cláudio Viegas, Guilherme Zucolo, Cristiano, Fernando Continguiba, Otávio Fausino, Ana Lúcia, Andréa Morandim, Viviane Cândida, Amélia, Jonas Mota, Hosana, Douglas Pichi, Aline, André, Gisele Baraidi, Marcos Batista, Patrícia Pauleti, Marcos, Wanessa, Magela, Sara, Aristeu Tininis e a todos que passaram por este grupo, pêlos momentos de alegria compartilhados que fizeram a rotina do laboratório ainda mais agradável.
As festinhas de defesa e de final de ano, reuniões de grupo e congressos serão para sempre lembradas.
Aos meus eternos amigos da Tarraketa local onde morei e guardarei pela eternidade os momentos maravilhosos que tive lá.
Aos meus eternos amigos da República GA: Allynsom, Marcos (Tomate) Norberto (Yo) pelas inúmeras conversas que tivemos e pelos momentos de amizade que sempre ficarão em minha mente.
Às secretárias da Pós-Graduação - Sandra, Patrícia e Célia – por serem atenciosas e gentis.
Às funcionárias da Biblioteca: Cristina e Valéria, sempre a disposição para ajudar e a todos os outros funcionários que estão ou já passaram por lá, pela dedicação e auxílio.
Agradeço a todos que participaram direta ou indiretamente do desenvolvimento deste trabalho e aos meus inimigos ocultos que ao tentarem me atrapalhar acabaram me ajudando muito no meu desenvolvimento.
As Empresas Anaber Cosméticos e Asca Brinquedos por permitir que eu pudesse trabalhar em período diferenciado dando a possibilidade de continuar o meu Doutorado.
PENSAMENTOS
“O mestre está disponível para todas as pessoas e não rejeita nenhuma delas. Ele está pronto a usar todas as situações e nada desperdiça. Isto é o que se chama personificar a luz.” (Lao-Tzu, Tão Te King) “Nunca desista nesse momento, porque é exatamente neste lugar e hora que a maré vai mudar.” (Harriet Beecher Stowe) “Só é útil o conhecimento que nos torna melhores.” (Sócrates) “Sábio é aquele que conhece os limites da própria ignorância.” (Sócrates) “Três coisas devem ser feitas por um juiz: ouvir atentamente, considerar sobriamente e decidir imparcialmente.” (Sócrates)
RESUMO Os fungos, diferente dos vegetais são heterotróficos, mais especificamente
quimiorganotróficos, por suas características específicas pertencem a um reino separado. Alguns dos fungos através de sua evolução se especializaram em invadir os espaços intercelulares das plantas passando a sobreviver dentro dos seus hospedeiros, não provocando nenhuma patologia. Estes microrganismos são denominados de fungos endofíticos. A disputa por alimentos entre os fungos no interior das espécies vegetais, gerou a necessidade dos fungos produzirem metabolitos secundários com atividades contra outros microrganismos, podendo assim demarcar seu território. Todo este processo deve acontecer de forma a não causar patologias na planta que é a fonte de seu alimento, em alguns casos essas relações de mutualismo e comensalismo se aprimoraram sendo muito comum alguns vegetais possuirem fungos endofíticos protegendo contra pragas insetos e patógenos. Este trabalho descreve o isolamento e a purificação dos fungos endofíticos associados às folhas, caules, raízes e sementes da espécie vegetal Michela champaca. Foram isolados 8 fungos, sendo 3 dos caules, 4 das folhas, 1 das raízes, nenhum fungo foi isolado das sementes. Os extratos brutos produzidos por estes fungos em caldo de dextrose e batata foram avaliados quimicamente (CLAE-DAD e RMN1H) e submetidos à bioensaios para avaliação da potencialidade anticancerígena, antifúngica e anticolinesterásica. Todos os extratos apresentaram atividade contra os fungos fitopatogênicos Cladosporium cladosporioides e Cladosporium sphaerospermum e 40% apresentaram atividade frente às linhagens mutantes de Saccharomyces cerevisiae. Após esta triagem, os fungos endofíticos Mc-8R (ainda não identificado) e Colletotrichum gloeosporioides (Mc-7F) foram selecionados para estudo químico/biológico. Estes foram cultivados em culturas fermentativas em larga escala em CDB para obtenção dos extratos brutos. O extrato bruto AcOEt, obtido após cultivo de Mc-8R em CDB, levou, após fracionamento cromatográfico, ao isolamento das Pirenocinas A (1), E (2) e B (3) e dos Ácidos Pirenochaéticos, C (4), A (5) e B (6), já descritos na literatura e os Ácidos Pirenochaéticos (7) e (8) inéditos. No estudo da variação metabólica, modificando os meios de cultivo, foi possível identificar o Ergosterol (9) e o Peróxido de Ergosterol (10) nos extratos hexânicos de Arroz e Milho, respectivamente. O extrato AcOEt de Mc-7F identificado como Colletotrichum gloeosporioides, foi submetido a técnicas cromatográficas e espectroscópicas de RMN uni e bidimensionais e permitiu o isolamento e identificação das substâncias Uracila (11), ciclo-(S*-Pro-S*-Tyr) (12), ciclo-(S*-Pro-S*-Val) (13), Ácido-(2-Amino-fenil)-acético (14), Ácido-(4-Hidroxi-fenil)-acético (15), 4-Hidroxi-benzamida (16) e Ácido-(2-Hidroxi fenil)-acético (17), e dos derivados indólicos inéditos (18) e (19). Dos extratos AcOEt de Mc-C3 (Xylaria sp.) e Mc-6F (Phomopsis stipata) foram isoladas as substâncias Ácido 2- hexilideno-3- metilsuccínico (20) e o Ácido 3-nitropropiônico (21). Todas substâncias tiveram suas estruturas identificadas ou determinadas através de técnicas espectroscópicas (RMN de 1H e 13C, HMBC, HMQC, NOESY, COSY) e espectrometria de massas (ESI-MS). Das substâncias isoladas de Mc-8R e Colletotrichum gloeosporioides, 72% e 66% apresentaram atividade antifúngica e 56% e 89 % atividade anticolinesterase, respectivamente.
Palavras-chave: fungo endofitico, Colletotrichum gloeosporioides; Michelia champaca
ABSTRACT
Some fungal species, through their evolution, have specialized in invading plants and surviving inside their hosts causing no warm them. These microorganisms have been called endophytic which in the invasion process, produce chemical substances that inhibit competitors to invade their neighborhood and thus survive in harmony with the host. This work seeks to evaluate the chemical diversity of substances from endophytic fungi associated to Michelia champaca L. that present biological activity by isolating and identification of their secondary metabolites. This work resulted in the isolation of eight fungi species and selection of 2 strains which presented strong antifungal activity against Cladosporium cladosporioides and C. sphaerospermum, both of them pathogenic fungus; and a weak antitumor activity against mutant strains of Saccharomyces cerevisiae. The first one was codified as Mc-8R and chromatographic fractionation of its EtOAc extract allowed the identification of the Pirenocines A (1), E (2) and B (3) and the Pirenochaetic acids, C (4), A (5) and B (6), and in addition to the novel (7) and (8). Ergosterol (9), was found in the hexanic extract obtained from growing Mc-8R in rice, and the Ergosterol peroxide (10), which was isolated from the hexanic extract in corn. The other selected fungi species was identified as Colletotrichum gloeosporioides. The fractioning of its EtOAc extract led to the isolation of the known substances as Uracil (11), cyclo-(S*-Pro-S*-Tyr) (12), cyclo-(S*-Pro-S*-Val) (13), 2-Aminophenyl acetic acid (2-APA), (14), p-Hydroxyphenylacetic acid (15), 4-Hydroxy-benzamide (16) and (2-Hydroxy-phenyl)- acetic acid (17), in addition to the novel compounds (18) and (19). 2-Hexylidene-3-methylsuccinic acid (20) was also identified as major compound from the fungus Mc-C3, (Xylaria sp.). The fungus Mc-6F was identified as Phomopsis stipata and its extract contained 3-Nitro-propionic acid (21) as major compound. The eight endophytic studied presented activity against the phytopathogenic fungi Cladosporium sphaerospermum and C. cladosporioides; about 40% of the isolated fungi had also presented activity against mutant strains of Saccharomyces cerevisiae. Of isolated substances from Mc-8R, 72% they had presented antifungal activity and 56% had presented anticholinesterasic activity. From Colletotrichum gloeosporioides, 78% of the isolated compounds presented antifungal and anticholinesterase activity. Keywords: endophytic fungus; Colletotrichum gloeosporioides; Michelia champaca
LISTA DE FIGURAS Figura 1: Substâncias bioativas obtidas a partir de fungos .................................................................. 22 Figura 2: Foto de Michelia Champaca L. (Magnoliaceae) Fonte: Ioanis H. Leptokarydis ................. 31 Figura 3: Substâncias bioativas obtidas a partir do fungo Colletotrichum gloeosporioides ................ 33 Figura 4: Cromatogramas em grad. explorat. das frações Mc-8R XAD Solto e XAD Saco (H2O0,5%
HOAc/MeOH; 95:5 a 0:100 em 40’, com fluxo de 1,0 mL/mim. a 254 nm) em C-18............................. 48 Figura 5: Cromatogramas em grad. explorat. do extrato Mc-8R (H2O/MeOH; 95:5 a 0:100 em 40’ em C-18....................................................................................................................................................... 52 Figura 6: Cromatogramas em grad. explorat. das frações Mc-8R1, Mc-8R2, e Mc-8R3 obtidas do fracionamento cromatográfico do extrato AcOEt de Mc-8R (H2O0,5%HOAc/MeOH; 95:5 a 0:100 em 40’, com fluxo de 1,0 mL/mim. a 254 nm)................................................................................................... 54 Figura 7: Cromatogramas em grad. explorat. das frações Mc-8R3, Mc-8R4, e Mc-8R5 obtidas do fracionamento cromatográfico do extrato AcOEt de Mc-8R (H2O0,5% HOAc/MeOH; 95:5 a 0:100 em 40’, com fluxo de 1,0 mL/mim. a 254 nm)................................................................................................... 55 Figura 8: Cromatogramas em grad. explorat. das frações Mc-8R5, Mc-8R6, e Mc-8R7 obtidas do fracionamento cromatográfico do extrato AcOEt de Mc-8R (H2O0,5% HOAc/MeOH; 95:5 a 0:100 em 40’, com fluxo de 1,0 mL/mim. a 254 nm)................................................................................................... 55 Figura 9: Cromatogramas em grad. explorat. das frações Mc-8R7, Mc-8R8, Mc-8R9 e Mc-8R10 obtidas do fracionamento cromatográfico do extrato AcOEt de Mc-8R (H2O0,5% HOAc/MeOH; 95:5 a 0:100 em 40’, com fluxo de 1,0 mL/mim. a 254 nm). .......................................................................... 56 Figura 10: Gráfico 01: variação metabólica de Mc-8R com vários meios de culturas e condições de crescimento ........................................................................................................................................... 68 Figura 11: Estrutura da Citreopirona (Pirenocina A) (1) ..................................................................... 74 Figura 12: Estrutura da Pirenocina E (2) ............................................................................................. 76 Figura 13: Estrutura da Pirenocina B (3) ............................................................................................. 77 Figura 14: Estrutura parcial A para substância (4)............................................................................... 79 Figura 15: Estrutura parcial B para substância (4) ............................................................................... 79 Figura 16: Estrutura do Ácido Pirenochaético C (4)............................................................................ 79 Figura 17: Estrutura parcial B para a substância (5) ............................................................................ 80 Figura 18: Estrutura do Ácido Pirenochaético A (5)............................................................................ 81 Figura 19: Estrutura parcial B para a substância (6) ............................................................................ 81 Figura 20: Estrutura do Ácido Pirenochaético B (6)............................................................................ 83 Figura 21: Estrutura parcial B para a substância (7) ............................................................................ 84 Figura 22: Estrutura da substância (7) ................................................................................................. 84 Figura 23: Estrutura parcial B para a substância (8) ............................................................................ 85 Figura 24: Estrutura da substância (8) ................................................................................................. 85 Figura 25: Estrutura da do Ergosterol (9) ............................................................................................ 87 Figura 26: Estrutura do Peróxido de Ergosterol (10) ........................................................................... 88 Figura 27: Estrutura da Uracila (11) .................................................................................................... 89 Figura 28: Estrutura ciclo-(S*-Pro-S*-Tyr) substância (12) ................................................................ 91 Figura 29: Estrutura da ciclo-(S*-Pro-S*-Val) para substância (13) ................................................... 93 Figura 30: Estrutura da Ácido-(2-Amino-fenil)-acético para substância (14) ..................................... 95 Figura 31: Estrutura da Ácido-(4-Hidroxi-fenil)-acético para substância (15).................................... 97 Figura 32: Estrutura da 4-Hidroxi-benzamida para substância (16) .................................................... 98 Figura 33: Estrutura da Ácido-(2-Hidroxi fenil)-acético para substância (17) .................................... 99 Figura 34: Estruturas Parciais A e B da Substância (18) ................................................................... 101 Figura 35: Principais correlações observadas em gHMBC para a substância (18)............................ 102 Figura 36: Estruturas Parciais A e B da Substância (19) ................................................................... 104 Figura 37: Principais correlações observadas em gHMBC para a substância (19)............................ 104 Figura 38: Estrutura do Ácido 2-hexilideno-3-metilsuccínico (20) ................................................... 106
Figura 39: Gráfico 2: Atividade antifúngica das substâncias (1) a (19) frente os fungos Cladosporium cladosporioides e C. sphaerospermum ............................................................................................... 108 Figura 40: Gráfico 3: Atividade antifúngica das substâncias isoladas de Mc-7F frente os fungos Cladosporium cladosporioides em limite de detecção........................................................................ 108 Figura 41: Gráfico 4: Atividade antifúngica das substâncias isoladas de Mc-7F frente os fungos Cladosporium sphaerospermum em limite de detecção...................................................................... 109 Figura 42: Gráfico 5 e 6: Atividade inibidora da acetilcolinesterase das substâncias isoladas de Mc-8R e Mc-7F ............................................................................................................................................... 110 Figura 43: Espectro de RMN de 1H de Mc-1C (CDCl3 a 11,7 T) ..................................................... 121 Figura 44: Espectro de RMN de 1H de Mc-2C (CDCl3 a 11,7 T)...................................................... 122 Figura 45: Espectro de RMN de 1H de Mc-3C (CDCl3 a 11,7 T)...................................................... 122 Figura 46: Espectro de RMN de 1H de Mc-4F (CDCl3 a 11,7 T)....................................................... 122 Figura 47: Espectro de RMN de 1H de Mc-5F (CDCl3 a 11,7 T) ...................................................... 123 Figura 48: Espectro de RMN de 1H de Mc-6F (CDCl3 a 11,7 T) ...................................................... 123 Figura 49: Espectro de RMN de 1H de Mc-7F (CDCl3 a 11,7 T) ...................................................... 124 Figura 50: Espectro de RMN de 1H de Mc-8R (CDCl3 a 11,7 T)...................................................... 124 Figura 51: Cromatograma em CLAE-DAD de Mc-8R Czapek com detecção monitorada em 254nm.............................................................................................................................................................. 125 Figura 52: Espectro de RMN de 1H de Mc-8R Czapek (DMSO-d6 a 11,7 T) ................................... 125 Figura 53: Cromatograma em CLAE-DAD de Mc-8R Nutriente com detecção monitorada em 254nm.............................................................................................................................................................. 126 Figura 54: Espectro de RMN de 1H de Mc-8R Nutriente (DMSO-d6 a 11,7 T)................................ 126 Figura 55: Cromatograma em CLAE-DAD de Mc-8R YM com detecção monitorada em 254nm. . 127 Figura 56: Espectro de RMN de 1H de Mc-8R YM (DMSO-d6 a 11,7 T) ......................................... 127 Figura 57: Cromatograma em CLAE-DAD de Mc-8R Extrato de Malte com detecção monitorada em 254nm.................................................................................................................................................. 128 Figura 58: Espectro de RMN de 1H de Mc-8R Extrato de Malte (DMSO-d6 a 11,7 T)..................... 128 Figura 59: Cromatograma em CLAE-DAD de Mc-8R Arroz ACN com detecção monitorada em 254nm.................................................................................................................................................. 129 Figura 60: Espectro de RMN de 1H de Mc-8R Arroz ACN (DMSO-d6 a 11,7 T) ............................ 129 Figura 61: Cromatograma em CLAE-DAD de Mc-8R Milho ACN com detecção monitorada em 254nm.................................................................................................................................................. 130 Figura 62: Espectro de RMN de 1H de Mc-8R Milho ACN (DMSO-d6 a 11,7 T) ............................ 130 Figura 63: Espectro de RMN de 1H do extrato de Mc-8R Arroz Hex (CDCl3 a 11,7 T ).................. 131 Figura 64: Espectro de RMN de 1H do extrato de Mc-8R Milho Hex (CDCl3 a 11,7 T) .................. 131 Figura 65: CCDC das fases Hexânicas do Milho, Arroz e Arroz hex ppt, com eluente em 86% Hex 3% HAc 11 % (Solução A) em tripla eluição. .................................................................................... 131 Figura 66: Cromatograma em grad. explorat. do extrato AcOEt Mc-7F.1 (H2O+0,5% HAc/MeOH; 95:5 a 0:100 em 40’, com fluxo de 1,0 mL/mim. a 254 nm)............................................................... 132 Figura 67: Espectro de RMN de 1H do extrato de Mc-7F.1 (DMSO-d6 a 11,7 T) ............................. 132 Figura 68: Cromatograma em grad. explorat. do extrato AcOEt Mc-7F.2 (H2O+0,5% HAc/MeOH; 95:5 a 0:100 em 40’, com fluxo de 1,0 mL/mim. a 254 nm)............................................................... 133 Figura 69: Espectro de RMN de 1H do extrato de Mc-7F.2 (DMSO-d6 a 11,7 T) ............................. 133 Figura 70: Cromatograma em grad. explorat. do extrato AcOEt Mc-7F.3 (H2O+0,5% HAc/MeOH; 95:5 a 0:100 em 40’, com fluxo de 1,0 mL/mim. a 254 nm)............................................................... 134 Figura 71: Espectro de RMN de 1H do extrato de Mc-7F.3 (DMSO-d6 a 11,7 T) ............................ 134 Figura 72: Cromatograma em grad. explorat. do extrato AcOEt Mc-7F.4 (H2O+0,5% HAc/MeOH; 95:5 a 0:100 em 40’, com fluxo de 1,0 mL/mim. a 254 nm)............................................................... 135 Figura 73: Espectro de RMN de 1H do extrato de Mc-7F.4 (DMSO-d6 a 11,7 T) ............................ 135 Figura 74: Cromatograma em grad. explorat. do extrato AcOEt Mc-7F.5 (H2O+0,5% HAc/MeOH; 95:5 a 0:100 em 40’, com fluxo de 1,0 mL/mim. a 254 nm)............................................................... 136 Figura 75: Espectro de RMN de 1H do extrato de Mc-7F.5 (DMSO-d6 a 11,7 T) ............................ 136 Figura 76: Cromatograma em grad. explorat. do extrato AcOEt Mc-7F.6 (H2O+0,5% HAc/MeOH; 95:5 a 0:100 em 40’, com fluxo de 1,0 mL/mim. a 254 nm)............................................................... 137 Figura 77: Espectro de RMN de 1H do extrato de Mc-7F.6 (DMSO-d6 a 11,7 T) ............................ 137
Figura 78: Cromatograma em grad. explorat. do extrato AcOEt Mc-7F.7 (H2O+0,5% HAc/MeOH; 95:5 a 0:100 em 40’, com fluxo de 1,0 mL/mim. a 254 nm)............................................................... 138 Figura 79: Espectro de RMN de 1H do extrato de Mc-7F.7 (DMSO-d6 a 11,7 T) ............................ 138 Figura 80: Cromatograma em grad. explorat. do extrato AcOEt Mc-7F.8 (H2O+0,5% HAc/MeOH; 95:5 a 0:100 em 40’, com fluxo de 1,0 mL/mim. a 254 nm)............................................................... 139 Figura 81: Espectro de RMN de 1H do extrato de Mc-7F.8 (DMSO-d6 a 11,7 T) ............................ 139 Figura 82: Cromatograma em grad. explorat. do extrato AcOEt Mc-7F.9 (H2O+0,5% HAc/MeOH; 95:5 a 0:100 em 40’, com fluxo de 1,0 mL/mim. a 254 nm)............................................................... 140 Figura 83: Espectro de RMN de 1H do extrato de Mc-7F.9 (DMSO-d6 a 11,7 T) ............................ 140 Figura 84: Cromatograma em grad. explorat. do extrato AcOEt Mc-7F.10 (H2O+0,5% HAc/MeOH; 95:5 a 0:100 em 40’, com fluxo de 1,0 mL/mim. a 254 nm)............................................................... 141 Figura 85: Espectro de RMN de 1H do extrato de Mc-7F.10 (DMSO-d6 a 11,7 T) .......................... 141 Figura 86: Cromatograma em grad. explorat. do extrato AcOEt Mc-7F.11 (H2O+0,5% HAc/MeOH; 95:5 a 0:100 em 40’, com fluxo de 1,0 mL/mim. a 254 nm)............................................................... 142 Figura 87: Espectro de RMN de 1H do extrato de Mc-7F.11 (DMSO-d6 a 11,7 T) .......................... 142 Figura 88: Espectro de RMN de 1H de (1) (DMSO-d6 a 11,7 T)....................................................... 143 Figura 89: Espectro de RMN de 13C de (1) (DMSO-d6 a 11,7 T) ...................................................... 144 Figura 90: Mapa de contorno gHMQC de (1) (DMSO-d6 a 11,7 T) .................................................. 145 Figura 91: Mapa de contorno gHMBC de (1) (DMSO-d6 a 11,7 T) .................................................. 146 Figura 92: Espectro de RMN de gCOSY de (1) (DMSO-d6 a 11,7 T)............................................... 147 Figura 93: Espectro de Massas de (1) ................................................................................................ 148 Figura 94: Espectro de RMN de 1H de (2) (DMSO-d6 a 11,7 T) ....................................................... 149 Figura 95: Espectro de RMN de 13C de (2) (DMSO-d6 a 11,7 T T)................................................... 150 Figura 96: Mapa de contorno gHMQC de (2) (DMSO-d6 a 11,7 T) .................................................. 151 Figura 97: Mapa de contorno gHMBC de (2) (DMSO-d6 a 11,7 T) .................................................. 152 Figura 98: Espectro de RMN de gCOSY de (2) (DMSO-d6 a 11,7 T)............................................... 153 Figura 99: Espectro de Massas de (2) ................................................................................................ 154 Figura 100: Espectro de RMN de 1H de (3) (DMSO-d6 a 11,7 T) ..................................................... 155 Figura 101: Mapa de contorno gHMQC de (3) (DMSO-d6 a 11,7 T) ................................................ 156 Figura 102: Mapa de contorno gHMBC de (3) (DMSO-d6 a 11,7 T) ................................................ 157 Figura 103: Espectro de RMN gCOSY de (3) (DMSO-d6 a 11,7 T).................................................. 158 Figura 104: Espectro de Massas de (3) .............................................................................................. 159 Figura 105: Espectro de RMN de 1H de (4) (DMSO-d6 a 11,7 T) ..................................................... 160 Figura 106: Espectro de RMN de 13C de (4) (DMSO-d6 a 11,7 T) .................................................... 161 Figura 107: Mapa de contorno gHMQC de (4) (DMSO-d6 a 11,7 T) ................................................ 162 Figura 108: Mapa de contorno gHMBC de (4) (DMSO-d6 a 11,7 T) ................................................ 163 Figura 109: Espectro de gCOSY de (4) (DMSO-d6 a 11,7 T)............................................................ 164 Figura 110: Espectro de NOESY 1D de (4) (DMSO-d6 a 11,7 T) ..................................................... 165 Figura 111: Espectro de Massas de (4) .............................................................................................. 166 Figura 112: Espectro de RMN de 1H de (5) (DMSO-d6 a 11,7 T) ..................................................... 167 Figura 113: Espectro de RMN de 13C de (5) (DMSO-d6 a 11,7 T) .................................................... 168 Figura 114: Mapa de contorno gHMQC de (5) (DMSO-d6 a 11,7 T) ................................................ 169 Figura 115: Mapa de contorno gHMBC de (5) (DMSO-d6 a 11,7 T) ................................................ 170 Figura 116: Espectro de gCOSY de (5) (DMSO-d6 a 11,7 T)............................................................ 171 Figura 117: Espectro de Massas de (5) .............................................................................................. 172 Figura 118: Espectro de RMN de 1H de (6) (DMSO-d6 a 11,7 T) ..................................................... 173 Figura 119: Espectro de RMN de 13C de (6) (DMSO-d6 a 11,7 T) .................................................... 174 Figura 120: Mapa de contorno gHMQC de (6) (DMSO-d6 a 11,7 T) ................................................ 175 Figura 121: Mapa de contorno gHMBC de (6) (DMSO-d6 a 11,7 T) ................................................ 176 Figura 122: Espectro de gCOSY de (6) (DMSO-d6 a 11,7 T)............................................................ 177 Figura 123: Espectro de Massas de (6) .............................................................................................. 178 Figura 124: Espectro de RMN de 1H de (7) (DMSO-d6 a 11,7 T) ..................................................... 179 Figura 125: Espectro de RMN de 13C de (7) (DMSO-d6 a 11,7 T) .................................................... 180 Figura 126: Mapa de contorno gHMQC de (7) (DMSO-d6 a 11,7 T) ................................................ 181 Figura 127: Mapa de contorno gHMBC de (7) (DMSO-d6 a 11,7 T) ................................................ 182
Figura 128: Espectro de gCOSY de (7) (DMSO-d6 a 11,7 T)............................................................ 183 Figura 129: Espectro de Massas de (7) .............................................................................................. 184 Figura 130: Espectro de RMN de 1H de (8) (DMSO-d6 a 11,7 T) ..................................................... 185 Figura 131: Espectro de RMN de 13C de (8) (DMSO-d6 a 11,7 T) .................................................... 186 Figura 132: Mapa de contorno gHMQC de (8) (DMSO-d6 a 11,7 T) ................................................ 187 Figura 133: Mapa de contorno gHMBC de (8) (DMSO-d6 a 11,7 T) ................................................ 188 Figura 134: Espectro de gCOSY de (8) (DMSO-d6 a 11,7 T)............................................................ 189 Figura 135: Espectros de Massas de (8)............................................................................................. 190 Figura 136: Espectro de RMN de 1H de (9) (CDCl3 a 11,7 T) .......................................................... 191 Figura 137: Espectro de RMN de 13C de (9) (CDCl3 a 11,7 T) ......................................................... 192 Figura 138: Espectro de RMN de 1H de (10) (CDCl3 a 11,7 T) ........................................................ 193 Figura 139: Espectro de RMN de 13C de (10) (CDCl3 a 11,7 T) ....................................................... 194 Figura 140: Mapa de contorno gHMQC de (10) (CDCl3 a 11,7 T) ................................................... 195 Figura 141: Mapa de contorno gHMBC de (10) (CDCl3 a 11,7 T) ................................................... 196 Figura 142: Espectro de RMN de 1H de (11) (DMSO-d6 a 11,7 T) ................................................... 197 Figura 143: Espectro de RMN de 13C de (11) (DMSO-d6 a 11,7 T) .................................................. 198 Figura 144: Mapa de contorno gHMQC de (11) (DMSO-d6 a 11,7 T) .............................................. 199 Figura 145: Mapa de contorno gHMBC de (11) (DMSO-d6 a 11,7 T) .............................................. 200 Figura 146: Espectro de gCOSY de (11) (DMSO-d6 a 11,7 T).......................................................... 201 Figura 147: Espectro de RMN de 1H de (12) (DMSO-d6 a 11,7 T) ................................................... 202 Figura 148: Espectro de RMN de 13C de (12) (DMSO-d6 a 11,7 T) .................................................. 203 Figura 149: Mapa de contorno gHMQC de (12) (DMSO-d6 a 11,7 T) .............................................. 204 Figura 150: Mapa de contorno gHMBC de (12) (DMSO-d6 a 11,7 T) .............................................. 205 Figura 151: Espectro de gCOSY de (12) (DMSO-d6 a 11,7 T).......................................................... 206 Figura 152: Espectro de NOESY 1D de (12) (DMSO-d6 a 11,7 T) ................................................... 207 Figura 153: Espectro de Massas de (12) ............................................................................................ 208 Figura 154: Espectro de RMN de 1H de (13) (DMSO-d6 a 11,7 T) ................................................... 209 Figura 155: Espectro de RMN de 13C de (13) (DMSO-d6 a 11,7 T) .................................................. 210 Figura 156: Mapa de contorno gHMQC de (13) (DMSO-d6 a 11,7 T) .............................................. 211 Figura 157: Mapa de contorno gHMBC de (13) (DMSO-d6 a 11,7 T) .............................................. 212 Figura 158: Espectro de gCOSY de (13) (DMSO-d6 a 11,7 T).......................................................... 213 Figura 159: Espectro de NOESY 1D de (13) (DMSO-d6 a 11,7 T) ................................................... 214 Figura 160: Espectro de Massas de (13) ............................................................................................ 215 Figura 161: Espectro de RMN de 1H de (14) (DMSO-d6 a 11,7 T) ................................................... 216 Figura 162: Espectro de RMN de 13C de (14) (DMSO-d6 a 11,7 T) .................................................. 217 Figura 163: Mapa de contorno gHMQC de (14) (DMSO-d6 a 11,7 T) .............................................. 218 Figura 164: Mapa de contorno gHMBC de (14) (DMSO-d6 a 11,7 T) .............................................. 219 Figura 165: Espectro de gCOSY de (14) (DMSO-d6 a 11,7 T).......................................................... 220 Figura 166: Espectros de Massas de (14)........................................................................................... 221 Figura 167: Espectro de RMN de 1H de (15) (DMSO-d6 a 11,7 T) ................................................... 222 Figura 168: Espectro de RMN de 13C de (15) (DMSO-d6 a 11,7 T) .................................................. 223 Figura 169: Espectro de DEPT 135 de (15) (DMSO-d6 a 11,7 T) ..................................................... 224 Figura 170: Mapa de contorno gHMQC de (15) (DMSO-d6 a 11,7 T) .............................................. 225 Figura 171: Mapa de contorno gHMBC de (15) (DMSO-d6 a 11,7 T) .............................................. 226 Figura 172: Espectros de Massas de (15)........................................................................................... 227 Figura 173: Espectro de RMN de 1H de (16) (DMSO-d6 a 11,7 T) ................................................... 228 Figura 174: Espectro de RMN de 13C de (16) (DMSO-d6 a 11,7 T) .................................................. 229 Figura 175: Mapa de contorno gHMQC de (16) (DMSO-d6 a 11,7 T) .............................................. 230 Figura 176: Mapa de contorno gHMBC de (16) (DMSO-d6 a 11,7 T) .............................................. 231 Figura 177: Espectro de RMN de 1H de (17) (DMSO-d6 a 11,7 T) ................................................... 232 Figura 178: Espectro de RMN de 13C de (17) (DMSO-d6 a 11,7 T) .................................................. 233 Figura 179: Espectros de DEPT de (17) (DMSO-d6 a 11,7 T)........................................................... 234 Figura 180: Mapa de contorno gHMQC de (17) (DMSO-d6 a 11,7 T) .............................................. 235 Figura 181: Mapa de contorno gHMBC de (17) (DMSO-d6 a 11,7 T) .............................................. 236 Figura 182: Espectros de Massas de (17)........................................................................................... 237
Figura 183: Espectro de RMN de 1H de (18) (DMSO-d6 a 11,7 T) ................................................... 238 Figura 184: Espectro de RMN de 13C de (18) (DMSO-d6 a 11,7 T) .................................................. 239 Figura 185: Espectro de DEPT de (18) (DMSO-d6 a 11,7 T) ............................................................ 240 Figura 186: Mapa de contorno gHMQC de (18) (DMSO-d6 a 11,7 T) .............................................. 241 Figura 187: Mapa de contorno gHMBC de (18) (DMSO-d6 a 11,7 T) .............................................. 242 Figura 188: Espectro de gCOSY de (18) (DMSO-d6 a 11,7 T).......................................................... 243 Figura 189: Espectro de NOESY 1D de (18) (DMSO-d6 a 11,7 T) ................................................... 244 Figura 190: Espectros de Massas de (18)........................................................................................... 245 Figura 191: Espectro de RMN de 1H de (19) (DMSO-d6 a 11,7 T) ................................................... 246 Figura 192: Espectro de RMN de 13C de (19) (DMSO-d6 a 11,7 T) .................................................. 247 Figura 193: Espectro de DEPT de (19) (DMSO-d6 a 11,7 T) ............................................................ 248 Figura 194: Mapa de contorno gHMQC de (19) (DMSO-d6 a 11,7 T) .............................................. 249 Figura 195: Mapa de contorno gHMBC de (19) (DMSO-d6 a 11,7 T) .............................................. 250 Figura 196: Espectro de gCOSY de (19) (DMSO-d6 a 11,7 T).......................................................... 251 Figura 197: Espectro de NOESY 1D de (19) (DMSO-d6 a 11,7 T) ................................................... 252 Figura 198: Espectros de Massas de (19)........................................................................................... 253 Figura 199: Espectro de RMN de 1H de (20) (DMSO-d6 a 11,7 T) ................................................... 254 Figura 200: Espectro de RMN de 13C de (20) (DMSO-d6 a 11,7 T) .................................................. 255 Figura 201: Espectro de DEPT de (20 (DMSO-d6 a 11,7 T).............................................................. 256 Figura 202: Mapa de contorno gHMQC de (20) (DMSO-d6 a 11,7 T) .............................................. 257 Figura 203: Mapa de contorno gHMBC de (20) (DMSO-d6 a 11,7 T) .............................................. 258 Figura 204: Espectro de gCOSY de (20) (DMSO-d6 a 11,7 T).......................................................... 259 Figura 205: Espectros de Massas de (20)........................................................................................... 260 Figura 206: Espectro de RMN de 1H de (21) (DMSO-d6 a 11,7 T) ................................................... 261 Figura 207: Espectros de Massas de (21)........................................................................................... 262
LISTA DE ESQUEMAS Esquema 1: Isolamento dos fungos associados.................................................................................... 44 Esquema 2: Cultivo dos fungos, obtenção dos extratos e triagem químico/biológica......................... 46 Esquema 3: Extrato Produzido por Mc-8R em CDB........................................................................... 46 Esquema 4: Extrato Produzido por Mc-8R em CDB na Presença de XAD 2...................................... 47 Esquema 5: Extratos obtidos em Mc-8R em Czapek, Nutriente, YM e Extrato de Malte................... 49 Esquema 6: Extratos Obtidos da Variação Metabólica de Mc-8R em Arroz e Milho ......................... 51 Esquema 7: Separação Cromatográfica do Extrato de Mc-8R obtido no crescimento em CDB via CLAE. ................................................................................................................................................... 53 Esquema 8: Separação Cromatográfica do Extrato Mc-8R XAD Saco via CLAE.............................. 53 Esquema 9: Fracionamento em coluna comatrográfica do Extrato Mc-8R obtido no crescimento em CDB ...................................................................................................................................................... 54 Esquema 10: Fracionamento Cromatográfico Fração Mc-8R.3 .......................................................... 57 Esquema 11: Fracionamento Cromatográfico de Mc-8R4 .................................................................. 58 Esquema 12: Fracionamento Cromatográfico Fração Mc-8R Milho Hex ........................................... 59 Esquema 13: Extrato obtido do crescimento de Colletotrichum Gloeosporioides (Mc-7F) em CDB. 59 Esquema 14: Fracionamento Cromatográfico do Extrato Mc-7F em C-18 ......................................... 60 Esquema 15: Fracionamento Cromatográfico em C-18 do Extrato Mc-7F.1 ...................................... 61 Esquema 16: Fracionamento Cromatográfico Extrato Mc-7F.1 .......................................................... 61
LISTA DE TABELAS Tabela 1: Metabólitos secundários produzidos por microrganismos endofíticos. ............................... 25 Tabela 2: Meios de cultura utilizados para os crescimentos dos fungos.............................................. 39 Tabela 3: Rendimento dos extratos dos fungos endofíticos fermentados em 500 ml de CDB ............ 62 Tabela 4: Resultados das atividades antifúngicas dos extratos produzidos pelos endofíticos isoldos de M. champaca. ........................................................................................................................................ 62 Tabela 5: Resultados obtidos no ensaio com S. cerevisiae dos extratos produzidos pelos endofíticos isolados de M. champaca. ..................................................................................................................... 63 Tabela 6: Resultados obtidos no ensaio ensaios de inibição da acetilcolinesterase para os extratos dos endofíticos isolados de M. champaca. .................................................................................................. 63 Tabela 7: Resultados do limite de detecção em bioautografia dos extratos Mc-6F e Mc-8R. ............. 64 Tabela 8: Relação produtiva dos fungos por quantidade de meio de cultura....................................... 68 Tabela 9: Dados de RMN de 1H e 13C da Pirenocina A (1) (CDCl3 a 11,7 T) ..................................... 75 Tabela 10: Dados de RMN de 1H e 13C da Pirenocina E (2) (CDCl3 a 11,7 T).................................... 76 Tabela 11: Dados de RMN de 1H e 13C da Pirenocina B (3) (DMSO-d6 a 11,7 T) .............................. 77 Tabela 12: Dados de RMN de 1H, 13C, gHMBC e NOESY 1D do Ácido Pirenochaético C (4) (DMSO-d6 a 11,7 T).............................................................................................................................. 80 Tabela 13: Dados de RMN de 1H e 13C dos Ácidos Pirenochaéticos A, B, 7 e 8 (DMSO-d6 e CDCl3, a 11,7 T) ................................................................................................................................................... 82 Tabela 14: Dados de RMN de 13C do Ergosterol (9) (CDCl3 a 11,7 T) e dados de RMN de 13C literatura para o Ergosterol (SHIRANE, et al., 1996). .......................................................................... 87 Tabela 15: Dados de RMN de 13C do Peróxido de Ergosterol (10) (CDCl3 a 11,7 T) e dados de RMN de 13C literatura para o Peróxido de Ergosterol (YUE, J. M. et al, 2001) ............................................. 88 Tabela 16: Dados de RMN de 1H, 13C, gHMBC e gCOSY da Uracila (11) (DMSO-d6 a 11,7 T)....... 89 Tabela 17: Dados de RMN de 1H, 13C, gHMBC e NOESY 1D da ciclo-(S*-Pro-S*-Tyr) (12) (DMSO-d6 a 11,7 T). ........................................................................................................................................... 92 Tabela 18: Dados de RMN de 1H, 13C, gHMBC e NOESY 1D da ciclo-(S*-Pro-S*-Val) (13) (DMSO-d6 a 11,7 T) ............................................................................................................................................ 94 Tabela 19: Dados de RMN de 1H, 13C e gHMBC Ácido-(2-Amino-fenil)-acético (14) (DMSO-d6 a 11,7 T). .................................................................................................................................................. 95 Tabela 20: Dados de RMN de 1H, 13C e gHMBC Ácido-(4-Hidroxi-fenil)-acético (15) (DMSO-d6 a 11,7 T) ................................................................................................................................................... 97 Tabela 21: Dados de RMN de 1H, 13C e gHMBC 4-Hidroxi-benzamida (16) (DMSO-d6 a 11,7 T) ... 98 Tabela 22: Dados de RMN de 1H, 13C e gHMBC Ácido-(2-Hidroxi fenil)-acético (17) (DMSO-d6 a 11,7 T) ................................................................................................................................................. 100 Tabela 23: Dados de RMN de 1H, 13C e gHMBC da Substância (18) (DMSO-d6 a 11,7 T) ............. 102 Tabela 24: Dados de RMN de 1H, 13C e gHMBC da Substância (19) (DMSO-d6 a 11,7 T) ............. 104 Tabela 25: Dados de RMN 1H, 13C, gHMBC, e gCOSY do Ácido 2-hexilideno-3-metilsuccínico (20) (CDCl3, a 11,7 T) ................................................................................................................................ 106 Tabela 26: Resultados da atividade antifúngica das substâncias isoladas do extrato de Mc-7F Colletotrichum gloeosporioides e Mc-8R. .......................................................................................... 107 Tabela 27: Resultados da atividade antifúngica em limite de detecção das substâncias isoladas do extrato de Mc-7F frente o fungo Cladosporium cladosporioides ....................................................... 108 Tabela 28: Resultados da atividade antifúngica em limite de detecção das substâncias isoladas do extrato de Mc-7F frente o fungo Cladosporium sphaerospermum ..................................................... 109 Tabela 29: Resultados dos ensaios de inibição da acetilcolinesterase das substâncias isoladas. ....... 110
ABREVIATURAS E SÍMBOLOS AcOEt Acetato de etila AChE Acetilcolinesterase ACN Acetonitrila BDA Batata Dextrose Agar CDB Caldo de Batata Dextrose CC Cromatografia em coluna CCDC Cromatografia em camada delgada comparativa CLAE Cromatografia líquida de alta eficiência CLAE-DAD Cromatografia líquida de alta eficiência com detector em arranjo de diodos C-18 Sílica gel de fase reversa tipo octadecil silano Czapek Sacarose, NaNO3, Na2(PO4)3, MgSO4, KCl, FeSO4 DMSO-d6 Dimetilsulfóxido deuterado explorat. Exploratório gCOSY Gradient Correlated Spectroscopy gHMBC Gradient Heteronuclear Multiple Bond Coherence gHMQC Gradient Heteronuclear Multiple Quantum Coherence grad. Gradiente HAc Ácido acético Hex. Hexano ISP Isopropanol J Constante de Acoplamento 1JCH Correlação entre carbono hidrogênio a uma ligação
2JCH Correlação entre carbono hidrogênio a duas ligações 3JCH Correlação entre carbono hidrogênio a três ligações 4JCH Correlação entre carbono hidrogênio a quatro ligações ME Extrato de Malte MeOH Metanol min. Minutos multip. Multiplicidade NuBBE Núcleo de Bioensaio, Biosíntese e Ecofisiologia de Produtos Naturais Nutrient Extrato de carne, peptona p. Pagina pgs. Paginas ppt Precipitado rf Retention factor RMN de 1 H Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio RMN de 13C Ressonância Magnética Nuclear de Carbono 13 subst. Substância TMS Tetrametilsilano tr. Tempo de retenção YM Extrato de levedura, extrato de malte, peptona e dextrose δC Deslocamento químico de carbono δH Deslocamento químico de hidrogênio
SUMÁRIO 1 – INTRODUÇÃO .............................................................................................................................. 20 1.1 - A Importância Ecológica e Biotecnológica dos Microrganismos em Química de Produtos Naturais ................................................................................................................................................. 20 1.2 - A Importância Ecológica e Biotecnológica dos Fungos ............................................................... 21 1.3 - Microrganismos Endofíticos......................................................................................................... 23 1.3.1 - Fungos Endofíticos. ................................................................................................................... 23 1.4 - A Espécie Vegetal Michelia champaca (Magnoliaceae) Planta Exótica. ..................................... 30 1.5 – O Fungo Colletotrichum gloeosporioides Isolado de Michelia champaca .................................. 31 1.5.1 – O Gênero Colletotrichum .......................................................................................................... 31 1.5.1.1 – O Fungo Colletotrichum gloeosporioides .............................................................................. 32 2 - OBJETIVOS .................................................................................................................................... 34 3 - DESENVOLVIMENTO EXPERIMENTAL .................................................................................. 35 3.1 - Especificação dos Materiais, Instrumentos e Técnicas Utilizadas................................................ 35 3.1.1 - Solventes Utilizados: ................................................................................................................. 35 3.1.2 - Evaporador Rotatório:................................................................................................................ 35 3.1.3 - Cromatografia Líquida de Alta Eficiência: ................................................................................ 35 3.1.4 - Cromatografia em Camada Delgada Comparativa (CCDC):..................................................... 36 3.1.5 - Cromatografia em Coluna:......................................................................................................... 36 3.1.6 - Ressonância Magnética Nuclear: ............................................................................................... 37 3.1.7 - Espectrometria de Massas (EM): ............................................................................................... 37 3.1.8 – Ensaio Bioautográfico: .............................................................................................................. 38 3.1.9 - Bioensaio com Saccharomyces cerevisiae:................................................................................ 38 3.1.10 - Cultivo dos Fungos Endofíticos em Vários Meios de Cultura:................................................ 38 3.2 - Análises Químicas e Biológicas.................................................................................................... 39 3.2.1 - Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com Detector UV em Arranjo de Diodos (CLAE-DAD):.................................................................................................................................................... 39 3.2.2 - Cromatografia em Camada Delgada Comparativa (CCDC):..................................................... 39 3.2.3 - Critérios de Pureza:.................................................................................................................... 40 3.2.4 - Ensaio para Detecção de Substâncias com Atividade Antitumoral Potencial e/ou Citotóxica: . 40 3.2.5 - Ensaio para Avaliação da Atividade Antifúngica Através de Bioautografia: ............................ 41 3.2.6 - Ensaio Preliminar para a Detecção de Inibidores da Enzima Acetilcolinesterase: .................... 42 3.3 - Isolamento e Purificação dos Fungos Endofíticos Associados à Michelia champaca.................. 43 3.3.1 – Identificação dos Fungos Isolados de Michelia champaca. ...................................................... 45 3.4 - Cultivo dos Microrganismos e Obtenção dos Extratos. ................................................................ 45 3.4.1 - Triagem Química a e Biológica dos Extratos dos Fungos Associados à Michelia champaca... 45 3.5 – Cultivo com CDB em Larga Escala do Fungo Endofítico Mc-8R com CDB.............................. 46 3.5.1 – Variação Metabólica de Mc-8R em CDB na Presença de XAD 2 ............................................ 47 3.5.2 Variação Metabólica de Mc-8R em Diferentes Meios de Cultura. .............................................. 48 3.5.3 – Variação Metabólica Triagem dos Extratos para Estudo de Mc-8R em Arroz e Milho............ 49 3.6 - Fracionamento do Extrato Mc-8R ................................................................................................ 51 3.6.1 - Fracionamento via CLAE do Extrato Mc-8R Obtido em CDB ................................................. 51 3.6.2 – Fracionamento do Extrato Mc-8R XAD Saco via CLAE. ........................................................ 53 3.6.3 - Fracionamento via CC do Extrato Mc-8R Obtido em CDB ...................................................... 54 3.6.4 – Purificação da Fração Mc-8R Milho Hex. ................................................................................ 58 3.7 – Cultivo do Fungo Mc-7F com CDB em Larga Escala. ................................................................ 59 3.8 - Fracionamento do Extrato Mc-7F Obtido em CDB...................................................................... 59 3.8.1 - Fracionamento em CLAE das Frações Mc-7F.1 e Mc-7F.2 ...................................................... 60 4 - RESULTADOS E DISCUSSÕES. .................................................................................................. 62 4.1 – Triagem Química e Biológica dos Extratos dos Fungos Endofíticos Isolados de Michelia champaca. ............................................................................................................................................. 62
4.1.1 – Fungos Endofíticos Isolados dos Caules de Michelia champaca.............................................. 64 4.1.2 – Fungos Endofíticos Isolados das Folhas de Michelia champaca. ............................................. 65 4.1.3 – Fungos Endofíticos Isolados das Raízes de Michelia champaca .............................................. 67 4.2 – Cultivo do Endofítico Mc-8R em Diferentes Meios de Cultura................................................... 67 4.3 – Elucidação Estrutural das Substâncias Isoladas. .......................................................................... 73 4.3.1 – Elucidação Estrutural das Substâncias Produzidas por Mc-8R................................................. 73 4.3.1.1 – Identificação Estrutural da Citreopirona (Pirenocina A) (1). ................................................. 73 4.3.1.2 – Identificação Estrutural da Pirenocina E (2). ......................................................................... 75 4.3.1.3 – Identificação Estrutural da Pirenocina B (3). ......................................................................... 76 4.3.1.4 – Identificação Estrutural do Ácido Pirenochaético C (4)......................................................... 78 4.3.1.5 – Identificação Estrutural do Ácido Pirenochaético A (5). ....................................................... 80 4.3.1.6 – Identificação Estrutural do Ácido Pirenochaético B (6)......................................................... 81 4.3.1.7 – Elucidação Estrutural do Ácido Pirenochaético (7) ............................................................... 83 4.3.1.8 – Elucidação Estrutural do Ácido Pirenochaético (8) ............................................................... 84 4.3.1.9 – Identificação Estrutural de Ergosterol (9) .............................................................................. 86 4.3.1.10 – Identificação Estrutural do Peróxido de Ergosterol (10)...................................................... 87 4.3.2 – Elucidação Estrutural das Substâncias Produzidas por Mc-7F ................................................. 89 4.3.2.1 – Identificação Estrutural da Uracila (11) ................................................................................. 89 4.3.2.2 – Identificação Estrutural do ciclo-(S*-Pro-S*-Tyr) (12).......................................................... 90 4.3.2.3 – Identificação Estrutural do ciclo-(S*-Pro-S*-Val) (13).......................................................... 92 4.3.2.4 – Identificação Estrutural de Ácido-(2-Amino-fenil)-acético (14)............................................ 94 4.3.2.5 – Identificação Estrutural de Ácido-(4-Hidroxi-fenil)-acético (15) .......................................... 96 4.3.2.6 – Identificação Estrutural de 4-Hidroxi-benzamida (16)........................................................... 97 4.3.2.7 – Identificação Estrutural do Ácido-(2-Hidroxi fenil)-acético (17) .......................................... 98 4.3.2.8 – Elucidação Estrutural de (18) ............................................................................................... 100 4.3.2.9 – Elucidação Estrutural de (19) ............................................................................................... 102 4.3.3 – Elucidação Estrutural da Substância Produzida por Mc-3C Xylaria sp. ................................. 105 4.3.3.1 – Identificação Estrutural do diácido Ácido 2-hexilideno-3-metilsuccínico (20) ................... 105 4.4 – Atividade Biológica das Frações e Substâncias Isoladas de Mc-7F e Mc-8R............................ 107 4.4.1 – Avaliação da Atividade Antifúngica de (1) a (19) Frente aos Fungos Fitopatogênicos Cladosporium cladosporioides e C. sphaerospermum........................................................................ 107 5 – CONSIDERAÇÕES FINAIS........................................................................................................ 111 REFERÊNCIAS.................................................................................................................................. 114 ANEXOS............................................................................................................................................. 120
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ____________________________________________1 - Introdução 20
1 – INTRODUÇÃO
1.1 - A Importância Ecológica e Biotecnológica dos Microrganismos em Química de
Produtos Naturais
Entre todos os produtores de moléculas naturais conhecidas, os microrganismos
representam uma rica fonte de metabólitos biologicamente ativos com larga aplicação como
agroquímicos, antitumorais, antiparasitários, imunossupressores entre outros. Estima-se que
apenas 1% das bactérias e 5% dos fungos encontrados nos solos são conhecidos, indicando a
possibilidade de se encontrarem milhares de espécies ainda desconhecidas. Estes
microrganismos são encontrados na Antártida, Ártico, Alpes, desertos, regiões áridas,
vulcânicas e solos férteis ou inférteis, englobando assim todo planeta abrangendo todos os
ecossistemas, independente de suas condições geográficas ou climáticas.
Historicamente, de todos os microrganismos estudados, os actinomicetos e os fungos
imperfeitos mostraram-se melhores produtores de metabólitos secundários. Isto sugere que os
fungos são essenciais para a saúde e prosperidade de todo ecossistema terrestre sendo
essenciais para sua sustentabilidade e biodiversidade. Existem as relações simbióticas entre
espécies que se beneficiam reciprocamente (mutualismo) que oferecem proteção a pragas e
outros microrganismos patogênicos através da produção de metabólitos secundários ou uma
relação, alimentar, na qual uma espécie se beneficia sem prejudicar a outra (comensalismo),
tendo assim uma relação harmônica entre microrganismos e hospedeiros.
A evolução dos estudos biológicos vem demonstrando um ciclo de interação
intrinsecamente forte entre hospedeiros e microrganismos sendo estes endofítico. Em estudos
mais aprofundados é possível averiguar a existência de fungos micorrízicos arbusculares
migrando para o interior da planta e estabelecendo uma relação mutualista (GUNATILAKA,
2006).
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ____________________________________________1 - Introdução 21
1.2 - A Importância Ecológica e Biotecnológica dos Fungos
Os fungos são organismos heterotróficos, mais especificamente quimiorganotróficos
típicos de ambientes úmidos e encontra-se distribuídos em habitats diversos como água, solo,
ar e sobre partículas em suspensão e podem ser unicelulares (leveduriforme) ou pluricelulares
(micélio). São divididos, conforme o habitat, em grupos como coprófilos, micoparasitas de
água doce ou marinhos, termofílicos, filoplanos, epifíticos, endofíticos, entre outros. Estima-
se que existam pelo menos um milhão e quinhentas mil espécies de fungos
(HAWKSWORTH, 2001).
Os fungos comumente prosperam em ambientes competitivos, mantendo relações
simbióticas (mutualismo ou comensalismo), tróficas (predação e parasitismo) e de competição
(por território e recursos alimentares) com outros organismos do seu ecossistema. Eles podem
ser predadores de insetos e nematóides. Fungos endofíticos do gênero Claviceps são
encontrados principalmente em gramíneas e produzem os alcalóides de ergot, substâncias que
ao serem ingeridas junto com a planta provocam doenças em insetos e mamíferos herbívoros,
protegendo a planta e o fungo dos predadores (TAN; ZHANG; SONG, 2006).
A relação de parasitismo fungo-planta envolve a produção de fitoalexinas, que são
produzidas pela planta visando conter a infecção fúngica (GLOER, 1995). Os fungos por sua
vez, produzem fitotoxinas que causam a necrose e a morte do tecido vegetal (HARBONE,
1994). Fungos patogênicos de ervas daninhas apontam como uma fonte de novos herbicidas,
com forte atividade (HOAGLAND, 1990). Nas relações de competição, o mecanismo de
antagonismo envolve a produção de agentes químicos por uma espécie, inibindo o
crescimento da outra. Isto é um indicativo de que os metabólitos responsáveis por esses
efeitos são essencialmente antibióticos naturais (WICKLOW, 1992 e CARROL, 1992).
Aproximadamente 25% dos produtos naturais biologicamente ativos até hoje
conhecidos, foram obtidos a partir de fungos (KONGSAEREE, et al., 2003).
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ____________________________________________1 - Introdução 22
Dentre eles destacam-se os antibióticos β-lactâmicos das classes da Penicilina F
(Penicillium chrysogenum) e Cefalosporina C (Cephalosporium acremonium) que juntos
representam um mercado mundial de 15,0 bilhões de dólares e a Ciclosporina A
(Tolypocladium inflatum gams) (imunossupressor) e Lovastatina (Aspergillus terreus)
(redutor de colesterol), (Figura 1: p. 22) que são responsáveis por um mercado mundial de
1,5 e 8,4 bilhões de dólares, respectivamente (DEMAIN, 2000). Entre 2000 e 2003, de todos
os fármacos originados de produtos naturais ou derivados destes lançados nos EUA, Europa e
Japão, pelo menos quatro foram derivadas ou sintetizadas a partir de metabólitos secundários
de fungos (BUTLER, 2004).
Penicilina F
CONHS
NO
COOH
N
SCONHHOOC
HH2N
COOH
CH2OAc
H
O
Cefalospporina C
OO
OCH3
H3C
OHO
LovastatinaCONHCONMe
HO
CONMeMeN
CO CONMe
OC NHCO NHCO NMeCO NHCO NMe
CONMe
H
Ciclosporina A
OOH
OH
CH2OH
O
OH
HO
COOH Papulacadina
N
N
N
NN
O
O
O
OHH
H
H
Aspercilina
Figura 1: Substâncias bioativas obtidas a partir de fungos
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ____________________________________________1 - Introdução 23
1.3 - Microrganismos Endofíticos
Microrganismos endofíticos são geralmente bactérias e/ou fungos que colonizam o
interior de órgãos vegetais, sem causarem nenhuma patologia ou danos ao hospedeiro. Esta é
uma relação simbiótica (GUNATILAKA, 2006).
Os primeiros relatos de endofíticos datam de 1904. Na época foi dada pouca
relevância a esta classe. Recentemente, descobriram a importância ecológica destes
microrganismos através da produção de metabólitos secundários com diferentes estruturas e
atividades biológicas. Há duas décadas atrás existiam apenas 100 espécies de endofíticos
avaliados sob a ótica de suas produções metabólicas, cujas estruturas apresentaram atividades
biológicas interessantes (GUNATILAKA, 2006).
1.3.1 - Fungos Endofíticos.
Com a evolução das espécies fúngicas algumas se tornaram endofíticas se
especializando em invadir os espaços celulares dos tecidos vegetais, através das raízes,
estômatos e feridas (ANDREWS; HIRANO, 1991).
Apresentam um enorme potencial ainda muito pouco explorado sendo um importante
nicho de produção de novos metabólitos secundários bioativos (GUNATILAKA, 2006).
Uma vez instalado, o endófito pode habitar a planta por toda sua vida, em alguns casos
sendo transmitido através das sementes (CARROL, 1988).
Qualquer espécie de planta vascular pode hospedar entre 10 e 100 diferentes espécies
de fungos endofíticos, sendo no mínimo duas específicas do hospedeiro (DREYFUSS;
CHAPELA, 1994). Os endofíticos não apresentam estruturas que perfuram as células da
planta e digerem as substâncias no seu interior (haustórios), estrutura comum em fungos
fitopatogênicos e em geral, as infecções causadas por fungos endofíticos não produzem
sintomas externos, podendo estar latentes ou serem assintomáticas (PETRINI; CARROL,
1981 & PETRINI, 1986).
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ____________________________________________1 - Introdução 24
Entretanto, mudanças no hospedeiro causadas por fatores de stress, podem induzir a
transição de um estado simbiótico (mutualismo ou comensalismo) a trófico (parasitismo)
(PETRINI, O, 1991).
Nas relações mutualistas, além de proteger as plantas contra insetos e patógenos, os
fungos endofíticos ainda são capazes de produzir metabólitos que aumentam o crescimento e
enraizamento da planta hospedeira e a sua resistência a estresses bióticos e abióticos
(HALLMANN, J. et al., 1997). Estas moléculas que podem possuir várias atividades:
hormônios, antibióticos, antitumorais entre outras funções biológicas, apresentam grande
interesse industrial e biotecnológico. Pesquisadores da Sandoz, em um programa de triagem
de produtos naturais oriundos de fungos verificaram que entre os fungos filamentosos, os
endofíticos são os mais produtivos quimicamente, apresentando uma produção de metabólitos
secundários 73% maior que os outros fungos (DREYFUSS, M. M., 1994).
O estudo feito por Schulz, B. et al., (2002), mostra que 51% das substâncias
biologicamente ativas isoladas de fungos endofíticos eram inéditas em comparação com
somente 38% de novas substâncias isoladas da microbiota de solo.
Gunatilaka A. A. L. (2006) fez um levantamento da diversidade dos metabólitos
isolados de microrganismos endofíticos e relatou o isolamento de substâncias pertencentes a
diversos grupos estruturais como esteróides, xantonas, fenóis, isocumarinas, alcalóides,
quinonas, furandionas, terpenóides, peptídeos, citocalasinas compostos alifáticos entre outros.
Levantamento bibliográfico sobre a ocorrência de metabólitos secundários isolados de
microrganismos endofíticos evidenciou um grande número de substâncias bioativas, sendo
destacadas algumas na Tabela 1: p. 25
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ____________________________________________1 - Introdução 25
Tabela 1: Metabólitos secundários produzidos por microrganismos endofíticos.
Microrganismo Hospedeiro (tecido vegetal) Produto Natural Atividade Biológica
Acremonium zeae (NRRL 13540) (mitosporic Hypocreales)
Zea maydis L. (Milho) (Poaceae); (Semente)
pirrocidina A pirrocidina B
Antifúngico; bactericida
Aspergillus clavatus strain H-037 (Trichocomaceae)
Taxus mairei (Lemée & Lév.) and Torreya grandis Arn. (Taxaceae); Casca
Brefeldina A antifúngico; antiviral; anticancer; herbicida
Aspergillus fumigatus CY018 (Trichocomaceae)
Cynodon dactylon (L.) Pers. (Poaceae); folha
asperfumoide asperfumina monometilsulocina fumigaclavina C fumitremorgina C pisiona ergosterol ácido helvolico peroxido de ergosterol cyclo (Ala-Leu) cyclo (Ala-Ile)
antifúngico;antimicótico antifúngico; antimicótico
Aspergillus niger IFB-E003 (Trichocomaceae)
Cynodon dactylon (L.) Pers. (Poaceae); folhas
rubrofusarina B fonsecinona A aurasperona A asperpirona B
citotóxico; inibidor da xantina oxidase antifúngico; inibidor da xantina oxidase
Aspergillus parasiticus RDWD1-2 (Trichocomaceae)
Sequoia sempervirens (D. Don) Endl. (Taxodiaceae); casca
sequoiatona C sequoiatona D sequoiatona E sequoiatona F sequoiamonascina A sequoiamonascina B sequoiamonascina C sequoiamonascina D
tóxico para Artêmia salina tóxico para Artêmia salina tóxico para Artêmia salina tóxico para Artêmia salina tóxico para Artêmia salina; citotóxico tóxico para Artêmia salina tóxico para Artêmia salina tóxico para Artêmia salina
Aspergillus sp. (Strain #CY725) (Trichocomaceae)
Cynodon dactylon (L.) Pers. (Poaceae); folhas
monometilsulocrim ácido helvolico ergosterol peróxido de ergosterol
antibiótico; inibidor de célula brancas bactericida
Botrytis sp. (Sclerotiniaceae) Taxus brevifolia Nutt. (Taxaceae); casca
ramulosina 6-hidroxramulosina 8-dihidroramulosina
antibiótico antibiótico antibiótico
Cephalosporium sp. IFB-E001 (mitosporic Hypocreales)
Trachelospermum jasminoides Lemoire (Apocynaceae); vine
grafislactona A antioxidante; anti radicais livres
Cephalosporium sp. (mitosporic Hypocreales)
Dendrobium nobile Sw. (Orchidaceae); raízes
ergosterol cyclo (Gly-Val) ácido butanodioico sulfato de colina 2-[2-(hidroxi-tetracosanoil) amino]-1,3,4-octadecatriol leucine D-manitol meso-eritritol ácido piridina-3-carboxilico α-estearina uracila
Ceratopycnidium baccharidicola (Ascomycetes, Incerte sedis)
Baccharis cordifolia L. (Asteraceae); tronco; folhas
rodicins verrucarins
Tóxico para animais Tóxico para animais
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ____________________________________________1 - Introdução 26
Tabela 1: Metabólitos secundários produzidos por microrganismos endofíticos (continuação).
Microrganismo Hospedeiro (tecido vegetal) Produto Natural Atividade Biológica
Chaetomium chiversii CS-36-62 (Chaetomiaceae)
Ephedra fasciculata A. Nels (Ephedraceae); tronco
radicicol
citotóxico; inibidor da Hsp90
Chaetomium globosum (chaetomiaceae)
Ephedra fasciculata A. Nels (Ephedraceae); tronco
ácido orselinico globosumona A globosumona B globosumona C tricodiona orcinol
citotóxico citotóxico
Cladosporium herbarum IFB-E002 (Mycosphaerellaceae)
Cynodon dactylon (L.) Pers. (Poaceae); folhas
aspernigrina A rubrofusarina B fonsecinona A 3α,5α,6β-trihidroxi- ergosta-7,22-diene 7-hidroxi-4-metoxi-5- metilcoumarina orlandina kotanina
citotóxico; inibidor da xantina oxidase Inibidor de germinação de plantas
Colletotrichum sp. strain EG4 (Phyllachoraceae)
Ginkgo biloba L. (Ginkgoaceae); folhas
compostos flavonoídicos
Cytospora sp. CR 200 (Valsaceae)
Conocarpus erecta L. (Combretaceae); tronco
citosporona A citosporona B citosporona C citosporona D citosporona E citoskirina A citoskirina B
citotóxico; antifúngico bactericida
Diaporthe sp. CR 146 (Valsaceae)
Forsteronia spicata G. Meyer (Apocynaceae); tronco
citosporone A citosporone B citosporone C citosporone D citosporone E
citotóxico; antifúngico bactericida
Dothiorella sp. strain HTF3 (Botryosphaeriaceae)
Aegiceras corniculatum Gaertner. (Myrsinaceae) (Mangrove); casca
citosporone B dothiorelone A dothiorelone B dothiorelone C dothiorelone D
citotóxico; antifúngico citotóxico citotóxico citotóxico citotóxico
Eupenicillium sp. (Trichocomaceae)
Murraya paniculata (L.) Jack (Rutaceae); folhas
alanditripinona alantrifenona alantripinene alantrileunona
Fusarium oxysporum strain 97CG3 (mitosporic Hypocreales)
Catharanthus roseus (L.) G. Don (Apocynaceae); casca interna
vincristina anticancerígena
Fusarium sp. IFB-121 (mitosporic Hypocreales)
Quercus Variabilis L. (Fagaceae); casca
cerebroside fusaruside
Bactericida; inibidor da xantina oxidase bactericida; inibidor da xantina oxidase
Fusidium sp. (Mitosporic fungi)
Mentha aVensis L. (Lamiaceae); folhas
fusidilactona A fusidilactona B fusidilactona C cis-4-hidroxi-6- deoxiscitalona
Guignardia sp. (Botryosphaeriaceae)
Spondias mombin L. (Anacardiaceae); folhas
ácido (-)-(S)-guignardic (72)*
Hormonema sp. ATCC 74360 (Dothioraceae)
Juniperus communis L. (Cupressaceae); folhas
enfumafungina Antifúngico
Leptosphaeria sp. strain IV403 (Leptosphaeriaceae)
Artemisia annua L. (Asteraceae); tronco
ácido leptosfaerico leptosfaerona
Melanconium betulinium (Melanconidaceae)
Betula pendula Roth; B. pubescens Ehrh. (Betulaceae); partes acima do solo
ácido 3-hidroxipropiônico
Anti nematóide
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ____________________________________________1 - Introdução 27
Tabela 1: Metabólitos secundários produzidos por microrganismos endofíticos (continuação).
Microrganismo Hospedeiro (tecido vegetal) Produto Natural Atividade Biológica
Microsphaeropsis olivacea (mitosporic Ascomycota)
Pilgerodendron uviferum (D. Don) flores (Cupressaceae) [Gymnosperm]; Floema
7-hidroxi-2,4-dimetil-3(2H)-benzofuranona enalina grafislactona A botralina ulocladol 2,5-diacetilfenol butirolactona I
inibidor da acetilcolinesterase inibidor da acetilcolinesterase
Microsphaeropsis sp. strain NRRL15684 (mitosporic Ascomycota)
Buxus sempervirens L. (Buxaceae); folhas
lactona S 39163/F-I antimicrobial; antiviral
Monochaetia sp. (Amphisphaeriaceae)
Folhas tronco pecíolo de várias plantas floresta tropical
ácido ambuico antimicotico
Muscodor albus (mitosporic Xylariales)
Cinnamomum zeylanicum Schaelter. (Lauraceae); caules
Antibióticos volateis antibiótico
Mycelia sterila strain 4567 (Ascomycota)
Cirsium arvense (Canadian thistle) (Asteraceae); ns
3-acetil-6-hidroxi-4-metil-2,3-dihidrobenzo-furano 3-(3’,5’-dihidroxi-2’-metilfenil)-2-butanona 4-acetil-3,4-dihidro-6,8-dihidroxi-5-metilisocoumarina 4-acetil-3,4-dihidro-6,8- dihidroxi-3-metoxi-5- metilisocoumarina 3,4-dihidro-3,6,8-tri- hidroxi-3,5-dimetil-isocoumarina 6,8-diacetoxi-3,5-dimetilisocoumarina
Mycelia sterilia (Ascomycota)
Atropa belladonna L. (Solanaceae); raízes
preussomerina G preussomerina H preussomerina I preussomerina J preussomerina K preussomerina L
bactericida; antifúngico; inibidor da FPTase bactericida; antifúngico; bactericida; antifúngico; bactericida; antifúngico; bactericida; antifúngico; bactericida; antifúngico;
Nectria galligena (Nectriaceae)
Malus x domestica Borkch (apple) (Rosaceae); xilema
colletorina B colletoclorina B ilicicolina C ilicicolina E ilicicolina F α,β-dehidrocurvularina
inibidor da acetilcolinesterase; inibidor da β-glucuronidase inibidor da acetilcolinesterase; inibidor da β-glucuronidase inibidor da acetilcolinesterase; inibidor da β-glucuronidase citotóxico para germinação de sementes e inibidor de crescimento de novas raízes
Nodulisporium sp. MF 5954, ATCC74245 (microsporic Xylariales)
Bontia daphnoides L. (Scrophulariaceae); madeira
ácido nodulisporico A ácido nodulisporico A1 ácido nodulisporico A2
inseticida inseticida
Paecilomyces sp. H-036 and W-001 (Trichocomaceae)
Taxus mairei (Lemée & Lév) and Torreya grandis Arn. (Taxaceae); tronco
brefeldina A Antifúngico; antiviral; anticancerígeno; herbicida
Penicillium implicatum (isolate SJ21) (Trichocomaceae)
Diphylleia sinensis H L. Li (Berberidaceae);. raízes; nódulos; pecíolos
Substâncias análogas ao podofilotoxina
anticancerígeno
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ____________________________________________1 - Introdução 28
Tabela 1: Metabólitos secundários produzidos por microrganismos endofíticos (continuação).
Microrganismo Hospedeiro (tecido vegetal) Produto Natural Atividade Biológica
Penicillium janczewskii (Trichocomaceae)
Prumnopitys andina (Endl.) Laubenf. (Podocarpaceae); floema
peniprequinolona gliovicina melleina
nematicida; hormônio de crescimento das raízes citotóxico contra bactérias; antiviral; fitotóxico
Periconia sp. OBW-15 (Halosphaeriaceae)
Taxus cuspidata Siebold & Zucc. (Taxaceae); interior das cascas
periconicina A periconicina B
antimicótico; aumento da germinação e crescimento das raízes (em baixa concentração) aumento da germinação e crescimento das raízes (em baixa concentração)
Pestalotiopsis jesteri (Amphisphaeriaceae)
Fragraea bodenii Thunb. (Gentianaceae); interior das cascas
jesterona hidroxijesterona
antifungal; antimycotic
Pestalotiopsis microspora (Amphisphaeriaceae)
Terminalia morobensis L. (Combretaceae); tronco
pestacina Isopestacina
antimicótico; antioxidante antifúngico; antioxidante
Pestalotiopsis spp. (Amphisphaeriaceae)
folhas e troncos de plantas tropicais
ácido ambuico antimicótico
Phomopsis phaseoli (Valsaceae)
Folhas de plantas tropicais ácido 3-hidroxipropiônico nematicida
Phomopsis sp. (Valsaceae)
Erythrina crista-galli L. (Fabaceae); galhos mortos
phomol bactericida; antifúngico; antiinflamatório (ensaios com edemas em ratos); fracamente citotóxico
Phyllosticta capitalensis (telemorph Guignardia mangiferae) (Botryosphaeriaceae)
temperate and tropical madeira e folhas da árvore
Pseudomassaria sp. ATCC 74411 (Hyponectriaceae)
Planta não identificada (collected near Kinshasa, Democratic Republic of Congo); folhas
demetilasterriquinona B1 (DMAQ-B1) Asterriquinona Asterriquinona oxidada e decomposta
Ativador de receptores de insulina
Rhizoctonia sp. Cy064 (mitosporic Hymemomycetes)
Cynodon dactylon (L.) Pers. (Poaceae); folhas
ácido rizoctônico monometilsulocrim ergosterol 3β,5α,6β-trihidroxergosta-7,22-dieno
bactericida fraco bactericida fraco bactericida fraco bactericida fraco
Serratia marcescens MSU-97 (Enterobacteriaceae)
Rhyncholacis penicillata Tul. (Podostemaceae); ns
(-)-oocidina A antifúngico
Scytalidium sp. (mitosporic Ascomycota)
Salix sp. (Salicaceae); folhas
ácido 4,6-dihidroxi3-metil-2-(2-oxopropionico)-benzoico ácido 2-(1-acetil-2-hidroxivinil)- 4,4-dihidroxi-3-metilbenzoico 4-acetil-3,4-dihidro-6,8-dihidroxi-5-metilisocoumarina 4-acetil-3,4-dihidro-6,8-dihidroxi-3-metoxi-5-metilisocoumarina descarboxicitrinona 6,8-dihidroxi-4-hidroximetil-3,5-dimetilisocromo-1-ona 4-acetoximetil-6,8-dihidroxi-3,5- dimetilisocromo-1-ona 4-acetil-6,8-dihidroxi-5-metil-2-benzopirano-1-ona (+)-dihidronaftol(1,2-b)-furano-5,6-dicarboxilico anidrido acetona aduto com atronetinona
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ____________________________________________1 - Introdução 29
Tabela 1: Metabólitos secundários produzidos por microrganismos endofíticos (continuação).
Microrganismo Hospedeiro (tecido vegetal) Produto Natural Atividade
Biológica Streptomyces aureofaciens CMUAc130 (Streptomycetaceae)
Zingiber officinale Roscoe (Zingiberaceae); raízes
5,7-dimetoxi-4-fenilcoumarina 5,6-dimetoxi-4-(p-metoxi- fenil) coumarina Vanilina 3-metoxi-4-hidroxitoluene
antifúngico antifúngico fraco antifúngico fraco antifúngico
Streptomyces griseus subsp. (strain HKI0412) (Streptomycetaceae)
Kandelia candel (L.) Druce (Rhizophoraceae) [Mangrove]; tronco
ácido 7-(4-aminofenil)-2,4-dimetil-7- oxo-hept-5-enoico ácido 9-(4-aminofenil)-7-hidroxi-2,4,6- trimetil-9-oxo-non-2-enoico ácido 12-(4-aminofenil)-10-hidroxi-6-(1-hidroxietil)-7,9-dimetil-12- oxo-dodeca-2,4-dienóico
Streptomyces sp. NRRL 30562 (Streptomycetaceae)
Kennedia nigricans Lindley (Fabaceae); stem
munumbacinas A-D (peptides)* antibiótico
Streptomyces sp. NRRL 30566 (Streptomycetaceae)
GreVillea pteridifolia J. Knight (Proteaceae); tronco
Kakadumicina A (peptide)* antibiótico
Streptomyces sp. MSU-2110 (Streptomycetaceae)
Monstera sp. (Araceae); tronco
Coronamicina (peptide)* antibiótico
Xylaria sp. No. 2508 (Xylariaceae)
sementes de arvore de mangue não identificada
ácido piliformico ergosterol 3β,5α,6β-trihidroxiergosta-7,22-diene α-glicerol monopalmitato ácido p-hidroxibenzoico
Fungo não identificado CR115 (90% similar a não caracterizado nas raízes Basidiomycete)
Daphnopsis americana (Miller) J. S. Johnson (Thymelaeaceae); ns
guanacastepeno A guanacastepeno B guanacastepeno C guanacastepeno D guanacastepeno E guanacastepeno F guanacastepeno G guanacastepeno H guanacastepeno I guanacastepeno J guanacastepeno K guanacastepeno L guanacastepeno M guanacastepeno N guanacastepeno O
bactericida bactericida
Fungo não identificado No. 1893
Kandelia candel (DC) Wight & Arn. (Rhizophoraceae); dropper
lactona 1893 A lactona 1893 B cyclo (Phe-Gly) cyclo (Ser-Leu) 5-(p-hidroxibenzoil)-hidantoina
Fungo não identificado SWS11I1 (DAOM 221611)
Picea glauca (Moench) Voss. (Pinaceae); needles
vermiculina trans-3-metildodec-cis-6-en-4-olida trans-8-hidroxi-3-metildodec-cis-6-en-4-olida trans-8-acetoxi-3-metildodec-cis-6-en-4-olida trans-9-hidroxi-3- metil-8-oxo-dodec-trans-6- en-4-olida trans-8,9-dihidroxi-3- metil-dodec-cis-6-en-4-olida trans-9-hidroxi-8-oxo-3-metil-dodecan-4-olida trans-7,9-dihidroxi-3-metil-8-oxo-dodecan-4-olida trans-6-hidroximetil-3-metil-7-oxo-dodecan-4-olida 7α,8β-11-trihidroxidrimana ácido 10,11-dihidroxifarnesoico
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ____________________________________________1 - Introdução 30
Tabela 1: Metabólitos secundários produzidos por microrganismos endofíticos (continuação).
Microrganismo Hospedeiro (tecido vegetal) Produto Natural Atividade Biológica
Fungo não identificado SWS 2611L (DAOM 229664)
Picea glauca (Moench) Voss. (Pinaceae); needles
6,7-dihidroxi-2-propil-2,4-octadien-4-olida 5,6,8-trihidrox-4-(1’-hidroxietil) isocoumarina sescandelina sescandelina B
tóxico cultura de células de CF-1 praga mariposa fracamente tóxico cultura de células de CF-1 praga mariposa fracamente tóxico cultura de células de CF-1 praga mariposa fracamente tóxico cultura de células de CF-1 praga mariposa
Fungo não identificado No. 2524
Avicennia marina Forssk. (Acanthaceae); sementes (Mangue)
4-hidroxi-2-metoxiacetanilida (3S,4R)-dihidroxi-(6S)- undecil-α-piranona cyclo-(L-Phe-L-Leu1-L-Leu2 L-Leu3-L-Ile)
não citotóxico não citotóxico
Fungo não identificado No. 2533
Avicennia marina Forssk. (Acanthaceae); folhas novas
vermopirona avicenina A avicenina B 5-decloroavicenina A 6,7-dimetil-8-hidrox-3-metilisocoumarina
Fungo não identificado No. 2534
Kandelia candel (L.) Druce (Rhizophoraceae);
ergosterol 5α,8α-epidioxiergosterol 3β,8α,6β-trihidroxiergosta-7,22-dieno cyclo-(Phe-Phe) cyclo-(Leu-Tyr) guanidina 4-hidroxi-2-metoxiacetofenona ácido protocatecuico metil ester
Fungo não identificado E-3 Prumnopitys andina (Endl.) Laubenf. (Podocarpaceae); floema
meleina p-hidroxibenzaldeido 4-(2-hidroxetil)fenol
bactericida ; antiviral; fitotóxico
Fonte: GUNATILAKA, A. A. L. Natural products from plant-associated microorganisms: distribution, structural diversity, bioactivity, and implications of their occurrence. Journal of Natural Products, v. 69, n. 3, p. 509-526, Nov. 2006.
1.4 - A Espécie Vegetal Michelia champaca (Magnoliaceae) Planta Exótica.
A família Magnoliaceae compreende cerca de 10 gêneros encontrados na Ásia (Índia,
Malásia) e América do Sul (Brasil) sendo que a maioria ocorre no hemisfério Norte. No Brasil
são cultivadas várias espécies dos gêneros Magnólia e Michelia (popularmente conhecida
como magnólia amarela). O gênero nativo do Brasil é o Talauma, com seu fruto seco muito
característico, que floresce no Sul do Brasil durante a primavera (JOLY, 1975).
Michelia champaca é uma árvore sempre verde e a madeira obtida da árvore adulta é
macia, forte e muito durável, com uma densidade de 706,0 Kg/m3. São fáceis de trabalhar,
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ____________________________________________1 - Introdução 31
sendo usadas para a fabricação de móveis, madeira compensada, navios, artigos decorativos,
na construção civil, etc. (NOATAY, 2007).
Medicinalmente eram empregadas em Java, como tônico, estimulante, diurético e
febrífugo. O chá das raízes e das folhas é usado para provocar a menstruação e no combate às
infecções da garganta, respectivamente. A casca, após a decocção, possui propriedades
digestivas e o óleo essencial das sementes é empregado em fricção, contra as dores articulares
e os reumatismos (PIO CORRÊA, 1974). O extrato da casca da raiz de M. champaca
mostrou-se um potente inseticida frente à larva do Aedes egyptii (JACOBSSON, et al., 1995).
Figura 2: Foto de Michelia Champaca L. (Magnoliaceae) Fonte: Ioanis H. Leptokarydis
1.5 – O Fungo Colletotrichum gloeosporioides Isolado de Michelia champaca
1.5.1 – O Gênero Colletotrichum
O gênero Colletotrichum é membro da subdivisão Deuteromycotinia da ordem das
Melanconidiales e se caracterizam pela formação de estruturas denominadas acérvulos, em
forma de disco achatado, subepidérmico, com espinhos ou setas, conidióforos simples e
alongados, conídios hialinos unicelulares, geralmente em forma de bastonete, que
permanecem nos acérvulos aderidos por uma massa mucilaginosa de polissacarídeos, solúveis
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ____________________________________________1 - Introdução 32
em água. Apesar destes esporos não serem estruturas de resistência, os micélios do fungo
podem permanecer viáveis por longo período de tempo, em sementes, restos culturais, ou em
infecções latentes em frutos. As espécies anamórficas do gênero Colletotrichum (teleomorph,
Glomerella) geralmente são as responsáveis pela doença antracnose formando lesões
neuróticas ovais em frutas. As várias espécies de Colletotrichum incluem as mais
devastadoras pragas patogênicas infectando plantas como cereais, frutas, legumes, etc. Estas
têm crescimento rápido em meio de cultura Batata Dextrose Agar (BDA), formando colônias
concêntricas, de coloração verde-oliva à marrom, podendo ocorrer à formação ou não de
setores (GARCIA-PAJÓN; COLLADO, 2003).
1.5.1.1 – O Fungo Colletotrichum gloeosporioides
O Fungo Colletotrichum gloeosporioides, é uma espécie, pertencente à ordem
Melanconiales da classe Coelomycetes, cuja fase perfeita é classificada com estirpes
homotálicas ou heterotálicas de ascomicetos do gênero Glomerella sp.. Os fungos deste
gênero, juntamente com sua fase perfeita, são considerados os maiores patógenos de plantas
em todo o mundo. A antracnose se constitui um dos mais sérios problemas do maracujazeiro
amarelo (Passiflora edulis Simmonds f. flavicarpa). Essa doença tem como agente causal o
fungo Colletotrichum gloeosporioides (GARCIA-PAJÓN; COLLADO, 2002).
C. gloeosporioides possui uma ampla gama de hospedeiros infectando goiabeira,
mangueira, mamoeiro, cajueiro, jaqueira, certas anonáceas, como pinha, biriba, cherimóia,
condessa, frutíferas do grupo da Spondia como cajazeira, cajarana, seriguela, umbu, e
emboquela (MENEZES, 2002 & SANTOS FILHO, SANTOS, 2003).
È muito bem conhecido que Colletotrichum gloeosporioides é uma espécie que produz
metabólitos fitotóxicos similares aos produzidos por outros do mesmo gênero. Alguns destes
metabólitos (Figura 3, p. 33), é que lhe conferem resistência contra outros patógenos
(GARCIA-PAJÓN; COLLADO, 2003).
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ____________________________________________1 - Introdução 33
HO2CN
N CO2H
CO2H
H CO2H
H1
HO2CN
N
CO2H
H CO2H
H
CO2H
NH22
O
HOO
O
O
3
O
O
O
H11C5
HOH
113
4
5
7
4
N
R2
R1
O
HR1=H, R2=CH3
R1=CH3, R2=H
5
6
HOHO
O
OMe
R
NNH2
O
CO2H
H
N CO2H
CO2H
H
N
CO2H
H
8 R=
9 R=
10 R=
O
O
N
CH NHCOHN
(CH2)3
NO
O
COCHNHCO
NH
CH
CO
CH2
NH
CH2OH
NH
CO
CH2
O
O N(CH2)3
(CH2)3
M3+
16
HO
O
OO
O OH
OOH
OMe
OH
A
B
C
5
3 1 7 3'
9' 5'
7'
3''1'' 7''
5''
8''
9''
8'
17 HO
H
OH
H
OR
1
35
7
913
1920
21 28
24 2625
27
17
18 R=19 R=
COCH3COCH2C6H5
N
CH3
O
H
CO2 HH
7
N
COOH
H20
4
1'
3 '5 '
4 '7 9
2
8
Figura 3: Substâncias bioativas obtidas a partir do fungo Colletotrichum gloeosporioides
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ____________________________________________2 - Objetivos 34
2 - OBJETIVOS
Isolar, purificar, identificar e preservar os fungos associados à espécie vegetal
Michelia champaca (Magnoliaceae);
Isolar, determinar e/ou identificar os metabólitos secundários;
Busca de substâncias com atividade biológica frente às linhagens mutantes de
Saccharomyces cerevisiae, fungos fitopatogênicos Cladosporium cladosporioides e C.
sphaerospermum e atividade inibidora da acetilcolinesterase;
Realizar o isolamento, elucidação e identificação estrutural dos metabólitos
secundários através de técnicas cromatográficas e espectrométricas;
Verificar a co-produção de metabólitos secundários;
Avaliar as substâncias puras frente aos fungos fitopatogênicos Cladosporium
cladosporioides e C. sphaerospermum e atividade inibidora da acetilcolinesterase;
Realizar a variação metabólica cultivando o fungo Mc-8R em diferentes meios de
cultura e condições;
Contribuir para o estudo quimiotaxonômico de fungos endofíticos e verificar a
simbiose dos fungos endofíticos com a espécie vegetal (Michelia champaca).
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ___________________________3 – Desenvolvimento Experimental 35
3 - DESENVOLVIMENTO EXPERIMENTAL
3.1 - Especificação dos Materiais, Instrumentos e Técnicas Utilizadas.
3.1.1 - Solventes Utilizados:
Foram utilizados solventes Pa. e CLAE dos fabricantes JT. Backer p., Mallinckrodt e
Synth. Nos experimentos de RMN, foram utilizados os solventes deuterados CDCl3 e DMSO-
d6 produzidos por Merck, Aldrich e Fluka.
3.1.2 - Evaporador Rotatório:
As soluções foram concentradas em evaporador rotatório sob pressão reduzida do
fabricante Buchi.
3.1.3 - Cromatografia Líquida de Alta Eficiência:
As análises cromatográficas foram obtidas por cromatografia líquida de alta eficiência
(CLAE) em aparelhos:
• Varian Pro Star (Solvent Delivery Module 240 e Auto Sampler 410) acoplado ao
detector Varian Pro Star Photodiode Array Ultra-violet (PDA-UV) 330 e registrados em
microcomputador de 500 MHz com processador Pentium II, utilizando o software Varian Star
Cromatography Workstation versão 5.52 – Modo analítico em gradiente exploratório.
• Varian Pro Star (Solvent Delivery Module SDM 230) acoplado ao detector Varian
Pro Star UV/Vis 310 e registrados em microcomputador de 500 MHz com processador
Pentium II, utilizando o software Varian Star Cromatography Workstation versão 5.52 –
Modo analítico em modo isocrático.
• Shimadzu (bomba Shimadzu LC-10 AD, auto injetor Shimadzu SIL 10 A) acoplado
ao detector ultravioleta em arranjo de diodos Shimadzu SPD MX AVP e registrados em
microcomputador de 500 MHz com processador Pentium II, utilizando o software Shimadzu
CLASS-LC10 versão 1.64A – Modo analítico e/ou gradiente exploratório.
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ___________________________3 – Desenvolvimento Experimental 36
• Varian Pro Star (Solvent Delivery Module SDM SD-1) acoplado ao detector Varian
Pro Star UV/Vis 320 e registrados em microcomputador de 500 MHz com processador
Pentium II, utilizando o software Varian Star Cromatography Workstation versão 5.52 em
modo preparativo.
Foram utilizadas colunas analíticas Phenomenex tipo LUNA (C18 e Fenil-Hexil, 250 x
4,6 mm, 5 μm) e coluna preparativa Phenomenex tipo LUNA (C18 e Fenil-Hexil, 250 x 21,20
mm, 10 μm).
3.1.4 - Cromatografia em Camada Delgada Comparativa (CCDC):
Nas análises por CCDC foram utilizadas placas pré-prontas de sílica gel da marca
Sorbent Technologies (TLC Plates W/UV 254, Aluminium backed, 200 μm 20 x 20 cm)
recortadas em pedaços de 5 x 5 cm. Foram também utilizadas placas de vidro preparadas com
sílica gel 60G. As placas foram feitas aplicando-se uma suspensão de sílica em água destilada,
na proporção 1:2 (m/v), sobre placa de vidro de 5, 10 e 20 x 20 cm, obtendo-se 0,25 mm de
espessura para placas comparativas e 0,75 mm de espessura para as placas de preparativas,
através da utilização de espalhador Quickfitt. Após a preparação das placas, estas foram
deixadas em repouso por cerca de 6 horas à temperatura ambiente, posteriormente sendo
ativadas em estufa a 120 oC por 120 minutos. As visualizações foram por radiação na região
do ultravioleta nos λ 254 e 366 nm os cromatogramas foram obtidos por nebulização com
anisaldeído seguida de aquecimento ou exposição a iodo sublimado.
3.1.5 - Cromatografia em Coluna:
Nas separações cromatográficas em coluna aberta ou sob pressão se utilizou como
fases estacionárias sílica gel de fase reversa C18 (Merck) e sílica gel de fase normal (Acros
com diâmetro de partícula de 0,035-0,070 mm).
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ___________________________3 – Desenvolvimento Experimental 37
3.1.6 - Ressonância Magnética Nuclear:
Os espectros de Ressonância Magnética Nuclear de 1H, 13C e experimentos uni e
bidimensionais foram obtidos em espectrômetro Varian AS 500 - OXFORD operando com
campo magnético de 11,7 T, utilizando TMS como referência interna.
3.1.7 - Espectrometria de Massas (EM):
Os espectros de massas foram obtidos em espectrômetro de massas de alta resolução
utilizando as técnicas EI e ESI (+ e/ou -).
• Modelo: ultrOTOFQ - ESI-TOF Mass Spectrometer
• Fabricante: Bruker Daltonics, Billerica, MA, EUA.
• Preparação e condições do experimento:
Solubilização da amostra em: MeOH, MeOH/H2O ou CHCl3 com ou sem a adição de 0,1% de
Ácido acético
Injeção da Amostra: Bomba de Infusão, Fluxo 100µl/h
Condições de operação:
End Plate: 4000 Volts
Capillary: 4500 Volts
Capillary Exit: 300 Volts
Skimmer 1: 55 Volts
Skimmer 2: 25 Volts
Dry Gas Temp 150C
Dry Gas Flow 4 L/min
Neb Gas Pressure 2 Bar
Calibração quando utilizado em alta resolução: usa-se para calibração interna uma
solução de NA-TFA a 10mg/ml e na calibração externa uma solução de Formiato de Sódio, a
10 mM.
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ___________________________3 – Desenvolvimento Experimental 38
3.1.8 – Ensaio Bioautográfico:
O ensaio para avaliação do potencial antifúngico foi realizado com os fungos
Cladosporium sphaerospermum e Cladosporium cladosporioides. Foram utilizadas placas de
CCDC da Merck TLC Sílica Gel 60 F 254. Para a preparação da solução estoque utilizou-se:
quantidades especificadas de glicose. A solução foi autoclavada a 120 oC, por 20 minutos
(HAMBURGER; HOSTETTMANN, 1991).
3.1.9 - Bioensaio com Saccharomyces cerevisiae:
O meio de cultura utilizado para o desenvolvimento e crescimento de Saccharomyces
cerevisiae constitui-se em 2% de peptona, 2% de dextrose e 2% de Agar (GUNATILAKA et
al., 1994). Foram utilizadas as seguintes linhagens:
• Rad +: Linhagem selvagem
• Rad 6: Linhagem controle
• Rad 52Y: Linhagem mutante recombinante (associada com reparo na dupla hélice e
recombinação meiótica)
• Rad 321N: Linhagem mutante associada à Topoisomerase II (enzima vital no
processo de divisão celular)
3.1.10 - Cultivo dos Fungos Endofíticos em Vários Meios de Cultura:
O meio de cultura sólido BDA foi preparado com o antibiótico Sulfato de Gentamicina
e acondicionado e homogeneizado em frascos tampados com pedaços de espumas com 1 cm
de espessura amarradas com elástico. Estes foram autoclavados a 121°C durante 40 min., e
resfriados a 45 °C em câmara asséptica. O meio BDA foi depositado em placas de Petri até
formar uma camada de aproximadamente 0,5 cm, sendo posteriormente tampadas e vedadas
com filme plástico. Os meios de cultura líquidos utilizam o mesmo procedimento citado
anteriormente tendo as diferenças da não adição de antibiótico e não deposição em placas de
Petri permanecendo em seus frascos originais. As concentrações utilizadas para cada meio de
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ___________________________3 – Desenvolvimento Experimental 39
cultura estão descritas na (Tabela 2: p.39). Para o cultivo dos fungos endofíticos em meios
líquidos foi utilizado às incubadoras rotatórias dos fabricantes Marconi e Tecnal.
Tabela 2: Meios de cultura utilizados para os crescimentos dos fungos. Meio de cultura Tipo C
g/L Composição Especificação Fabricante
BDA Sólido 39 Fécula de batata (4g), dextrose (20g), agar (15g)
Base para cultivo de leveduras e fungos SIGMA
CDB Líquido 24 Caldo de Fécula de batata (4g), dextrose (20g)
Base para cultivo de leveduras e fungos DIFCO
ME Líquido 20 Extrato de malte (20g) Base para cultivo de fungos e bactérias DIFCO
YM Líquido 21 Extrato de levedura (3g), extrato
de malte (3g), peptona (5g), dextrose (10g)
Base para cultivo de leveduras, fungos e outros microrganismos acidúricos
DIFCO
Nutrient Líquido 8 Extrato de carne (3g), peptona (5g)
Base para cultivo de microrganismos não-
fastidiosos DIFCO
Czapek Líquido 35 Sacarose (30g), NaNO3 (3g),
Na2(PO4)3 (1g), MgSO4 (0,5g), KCl (0,5g), FeSO4 (0,01g)
Base para cultivo de fungos e bactérias capazes de utilizar
Nitrogênio inorgânico DIFCO
3.2 - Análises Químicas e Biológicas
3.2.1 - Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com Detector UV em Arranjo de
Diodos (CLAE-DAD):
Os extratos e frações escolhidos foram submetidos a gradiente exploratório utilizando
coluna analítica de fase reversa Fenil-Hexil ou C-18 tipo Luna da Phenomenex e eluídos com
H2O/ACN ou H2O/MeOH (95:5) até (0:100) em 40 min., permanecendo 10 min. nesta
condição, com fluxo de 1,0 mL/min., utilizando ou não a adição de 0,5% de ácido acético
dopando a água, utilizando detector UV-DAD operando inicialmente a 254 nm.
Os extratos foram pré-tratados por “Clean up” por solubilização em MeOH/H2O
(95:5), centrifugação, eluição em C-18 e filtração em acrodisc 13CR PTFE 0,45μm da
Gelman.
3.2.2 - Cromatografia em Camada Delgada Comparativa (CCDC):
Estabelecer condições primárias de separação cromatográfica, como etapa inicial para
o ensaio de detecção de substâncias antifúngicas. Para isso, empregou-se a metodologia do
triângulo de seletividade com solventes dos tipos Localizante Básico, Localizante não Básico,
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ___________________________3 – Desenvolvimento Experimental 40
Não Localizante e Doador ou Receptor de prótons. Realizaram-se experimentos com
solventes puros, misturas binárias, ternárias e quaternárias ajustando-se a força de eluição
com Hex. (SNYDER; KIRKLAND; GLAJCH, 1997).
3.2.3 - Critérios de Pureza:
O critério de pureza adotado foi à obtenção de uma única mancha após análise em
CCDC, utilizando diferentes sistemas de eluentes e, quando separado por CLAE, a obtenção
de um único pico simétrico, mesmo após variação das condições de análise.
3.2.4 - Ensaio para Detecção de Substâncias com Atividade Antitumoral Potencial e/ou
Citotóxica:
O bioensaio utilizando linhagens de Saccharomyces cerevisiae, é um modelo para
avaliação do potencial antitumoral e citotóxico, e se fundamenta no emprego de células desta
levedura (eucarióticas com propriedades similares às das células humanas) que foram
geneticamente modificadas, para apresentarem os mesmos defeitos observados em células
cancerígenas humanas, com a principal vantagem de serem facilmente crescidas “in vitro”, e
assim serem ensaiadas frente a substâncias candidatas a novos fármacos anticancerígenos.
Este bioensaio constitui uma importante ferramenta no estudo de produtos naturais, pois
permitem a detecção de substâncias puras potencialmente antitumorais, como também
extratos e frações cromatográficas, possibilitando um estudo biomonitorado.
Para o desenvolvimento e crescimento das linhagens de Saccharomyces cerevisiae, o
meio de cultura utilizado foi levado ao aquecimento sob agitação constante até a
homogeneização. Em seguida, o mesmo foi esterilizado em autoclave, sendo posteriormente
resfriado a 45-50 oC e transferido para placas de Petri em capela de fluxo laminar, formando
uma camada fina. Da cultura estoque de cada linhagem, preparou-se uma suspensão diluída
com água destilada nas seguintes densidades ópticas, lidas a 600 nm: Rad 52Y (0,05-0,1),
Rad+ (0,05) e Rad 321 (0,05 a 0,1). Soluções destas linhagens foram adicionadas sobre as
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ___________________________3 – Desenvolvimento Experimental 41
placas contendo os meios de cultura, de modo a cobri-los. Após a retirada do excesso e
secagem das placas foram feitos poços sobre sua superfície (6 mm de diâmetro) através de um
tubo conectado a uma bomba de vácuo.
Todos os extratos foram avaliados na concentração de 2mg/mL, utilizando-se como
veículo solução de DMSO:MeOH (50:50) e aplicados cerca de 100 μL dentro dos poços do
meio de cultura para cada linhagem e posteriormente incubados por 48 horas. São utilizados
como substâncias referências: Camptotecina (4 e 5 μg/mL) respectivamente para RAD+ e
52Y; estreptonigrina (200 μg/mL) para 321N. Os resultados preliminares obtidos através
do ensaio são relatados como halos de inibição do crescimento das linhagens. Resultados mais
elaborados (para substâncias já isoladas) são expressos como valores de IC12, que é a
concentração (em μg/mL) requerida para produzir uma zona de inibição de 12 mm de
diâmetro ao redor do ponto de aplicação da amostra (halo considerado mínimo para a
atividade antitumoral).
Um extrato é considerado ativo como um potencial antitumoral, se apresentar
atividade seletiva frente uma ou mais linhagens mutantes (IC12 menor que 1/3 do IC12 de
Rad+) e também ter IC12 menor que 2.000 μg/mL. Se o halo de inibição das linhagens for
maior que 12 mm, porém não obedecer estas condições, este indica ser citotóxico.
(GUNATILAKA, et al., 1994).
3.2.5 - Ensaio para Avaliação da Atividade Antifúngica Através de Bioautografia:
A bioautografia consiste da associação entre a cromatografia em camada delgada e um
ensaio biológico “in situ” (HAMBURGER; HOSTETTMANN, 1991), possibilitando
localizar constituintes biologicamente ativos presentes em uma matriz complexa ou indicar o
potencial biológico de substâncias puras.
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ___________________________3 – Desenvolvimento Experimental 42
O método fundamenta-se na capacidade de inibição do crescimento do
microrganismo aplicado sobre um cromatograma e incubação deste visando o aparecimento
de possíveis zonas de inibição por constituintes ativos (HOMANS; FUCHS, 1970).
Todos os extratos dos endofíticos foram submetidos a este bioensaio, sendo
aplicados (em duplicatas) na concentração 2,0 mg/mL em placas cromatográficas pré-prontas,
utilizando 400 ug para extrato bruto; 200 ug para fração e 100 ug para subfração e substância
pura, posteriormente eluídos empregando-se um sistema de solventes pré-estabelecido, à
temperatura de ~ 30oC.
Após a evaporação dos solventes e localização das manchas (substâncias) por meio
de absorção no UV, nebulizou-se as placas cromatográficas com uma suspensão de esporos
dos fungos Cladosporium sphaerospermum e Cladosporium cladosporioides em um meio
preparado no ato da aplicação do ensaio (10 mL de solução aquosa de glicose a 30% e 60 mL
da solução estoque do fungo). Após nebulização, procedeu-se a incubação das placas em
atmosfera úmida por 2 a 3 dias a 25 oC. O aparecimento de zonas de inibição indicaram a
presença de substâncias com potencial antifúngico.
3.2.6 - Ensaio Preliminar para a Detecção de Inibidores da Enzima Acetilcolinesterase:
A inibição da AChE é possível seguindo-se a metodologia de Marston; Kissling;
Hostettmann, (2002) para cromatografia em camada delgada fina. Neste ensaio o extrato foi
dissolvido em metanol (80 mg/mL). Uma amostra de 200 μg (2,5 μL) do extrato foi analisada
em CCDC de sílica gel 60 F254 (0,2 mm, MERCK).
Como controles positivos foram utilizados galantamina (1 μg) e fisostigmina (0,3
μg), dissolvidos em metanol. Foi utilizado como eluente CHCl3:MeOH (90:10). Após o
desenvolvimento da cromatografia, a placa foi borrifada com a solução da enzima
acetilcolinesterase (Solução A) seguida da evaporação do solvente.
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ___________________________3 – Desenvolvimento Experimental 43
A placa cromatográfica foi incubada em uma câmara úmida a 37 °C por 20 minutos,
e em seguida borrifada com a solução D.
A coloração roxa aparece em aproximadamente 2 minutos. O aparecimento de
mancha branca (indicação de inibição da reação enzimática), sobre um fundo de coloração
roxa indica que houve inibição da atividade da enzima acetilcolinesterase. Os resultados são
observados e fotografados em câmera fotográfica Epson e os valores de rf calculados onde
houver inibição da reação.
Solução A: Acetilcolinesterase (1000 U, Sigma, produto no C2880) dissolvida em
150 mL do tampão Tris-HCl (0,05 M; pH = 7,9), a solução estoque foi armazenada a 4 °C, no
momento do uso é adicionado 0,1% de albumina de soro bovino fração V;
Solução B: 250 mg de 1-naftil acetato em 100 mL de etanol;
Solução C: 400 mg do sal Fast Blue B em 160 mL de água destilada;
Solução D: mistura de 10 mL da solução B + 40 mL da solução C.
Todos os ensaios foram realizados no Instituto Botânico de São Paulo – seção de
Fisiologia Vegetal, sob responsabilidade da Dra. Maria Cláudia M. Young.
3.3 - Isolamento e Purificação dos Fungos Endofíticos Associados à Michelia champaca.
O material botânico coletado (caules, folhas, raízes e sementes) de Michelia champaca
foi processado no prazo de 24 horas, após a coleta. A retirada dos epifíticos superficiais foi
realizada lavando o material coletado abundantemente com água corrente e detergente neutro.
Em câmara asséptica, o material foi imerso em álcool 70% por 1 minuto, em hipoclorito 1%
por 5 minutos e novamente em álcool 70% por 1 minuto. Realizou-se então uma dupla
lavagem em água destilada estéril (1 minuto) da qual se retirou 5 mL para fazer o controle da
assepsia (MAIER, et al., 1997).
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ___________________________3 – Desenvolvimento Experimental 44
Os pedaços de caules, folhas, raízes e sementes (esterilizados), foram seccionados
assepticamente e inseridos nas placas de Petri contendo BDA preparado com sulfato de
gentamicina e incubados durante 10 dias a 25 °C. O crescimento dos fungos foi monitorado
até que suas hifas atingissem aproximadamente 2-3 cm de diâmetro, em seguida as culturas
foram repicadas e replaqueadas sucessivamente até a obtenção de linhagens puras avaliadas
através da aparência uniforme nas placas, sendo posteriormente preservadas em água estéril.
Os órgãos vegetais de M. champaca possibilitaram o isolamento de 8 fungos endofíticos
sendo todos codificados com Mc de Michelia champaca em seguida organizados por ordem
alfabética sendo os 3 fungos dos caules numerados de 1 a 3 (Mc-1C, Mc-2C e Mc-3C), 4 das
folhas sendo numerados de 4 a 7 (Mc-4F, Mc-5F, Mc-6F e Mc-7F) e 1 das raízes sendo o 8
(Mc-8R). Nenhum fungo foi isolado das sementes (Esquema 1, p. 44).
Michelia champaca
Folhas, caules, raízes e sementes
8 LinhagensIsoladas
Esterilização (NaOCl 1%, EtOH 70%)Limpeza (H2O destilada esterilizada)Isolamento dos endofíticos (BDA)
LinhagensPuras
Replaqueamento em (BDA) Purificação
PreservaçãoH2O estéril
MC-7FMC-6FMC-5FMC-4FMC-3CMC-2CMC-1C MC-8R
Esquema 1: Isolamento dos fungos associados
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ___________________________3 – Desenvolvimento Experimental 45
3.3.1 – Identificação dos Fungos Isolados de Michelia champaca.
Dos 8 endofíticos isolados de Michelia champaca, as linhagens Mc-3C, Mc-6F e Mc-
7C foram identificadas como sendo Xylaria sp., Phomopis stipata e Colletotrichum
gloeosporioides. A identificação foi realizada pelo Prof. Dr. Ludwig H. Pfenning do
Departamento de Fitopatologia da Universidade Federal de Lavras - MG.
3.4 - Cultivo dos Microrganismos e Obtenção dos Extratos.
O cultivo das cepas foi realizado em meio sólido BDA conforme procedimento citado
no item 3.1.10; p. 38 e incubadas a 25 °C até que suas hifas atingissem 2 a 3 cm de
crescimento. Estas foram inoculadas em dois frascos de 500 mL contendo 250 mL cada do
meio líquido CDB, e incubadas em mesa agitadora orbital (shaker) sob temperatura de 25°C
por 28 dias.
Ao término do processo de fermentação, a fase aquosa foi separada dos micélios por
filtração sob pressão reduzida e particionados com AcOEt, (3X 300 ml) fornecendo os
extratos, após evaporação do solvente (Esquema 2, p. 46). Este mesmo procedimento foi
aplicado para crescimento nos meios de cultura: Czapek, Nutriente, YM, Extrato de Malte.
3.4.1 - Triagem Química a e Biológica dos Extratos dos Fungos Associados à Michelia
champaca.
Os extratos obtidos dos fungos isolados foram enviados para avaliação da atividade
antifúngica frente aos fungos fitopatogênicos Cladosporium sphaerospermum e C.
cladosporioides, ensaios antitumoral e de citotoxidade frente às linhagens mutantes de
Saccharomyces cerevisiae e inibição da enzima acetilcolinesterase.
Todos os extratos obtidos foram submetidos à análise espectrométrica de RMN 1H
(Figura 43-Figura 50; pgs. 121-124) (Esquema 2, p. 46).
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ___________________________3 – Desenvolvimento Experimental 46
Bioensaios ExtratosBrutos
Crescimento (500 mL CDB, 28 dias)Filtração a pressão reduzida
FiltradosMicélios
Partição líq/líq AcOEt (3x300 mL)Evaporação do solvente
RMN 1H
MC-7F15,0 mg
MC-6F30,5 mg
MC-5F8,7 mg
MC-4F5,2 mg
MC-3C91,3 mg
MC-2C7,3 mg
MC-1C15,6 mg
MC-8R48,5 mg
Esquema 2: Cultivo dos fungos, obtenção dos extratos e triagem químico/biológica
3.5 – Cultivo com CDB em Larga Escala do Fungo Endofítico Mc-8R com CDB.
O fungo Mc-8R foi cultivado em 10 L CDB divididos em 40 frascos de 500 mL
contendo 250 mL em cada frasco, de acordo com os procedimentos citados no item 3.4; p. 45,
obtendo-se 3,82 g de extrato, (Esquema 3, p. 46).
Mc-8RCrescimento (10,0 L (CDB), 28 dias, Agitação Orbital, Filtração
Partição (3 X 2,0L AcOEt)
Extrato aquoso5,0g
Extração comEtOH 1,0L (5X)Filtração
Micélio
Extrato AcOEt 3,82g
Fração Aquosa
Filtrado
Micélio
Trituração com 1,0L de águaFiltração
MicélioExtrato EtOHMicélio
Evaporação do solvente
Extrato EtOHMicélio 5,0 g
Fase Aquosa Descarte
Secagem
Evaporação dosolvente
ExtraçãoMeOH/H2O (95:5)ppt, Filtração
Goma 2,5 gExtrato MeOH/H2O
1,5gMicélio seco
25,0g
Evaporação dosolvente
Evaporação dosolvente
Evaporação dosolvente
Esquema 3: Extrato Produzido por Mc-8R em CDB
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ___________________________3 – Desenvolvimento Experimental 47
3.5.1 – Variação Metabólica de Mc-8R em CDB na Presença de XAD 2
Utilizando o procedimento citado no item 3.4; p. 45 o isolado Mc-8R foi cultivado na
presença de XAD 2 em 500 mL de CDB contendo 50 g de XAD 2 solto e em 500 mL de CDB
contendo 10 cartuchos de tecido sintético preenchidos com 5,0 g de XAD 2. No termino do
período da fermentação, o frasco contendo XAD 2 solto foi submetido à filtração. A fração
aquosa foi descartada ao XAD 2 impregnado com o micélio foi adicionado 500 mL água,
ocorrendo a decantação parcial do XAD 2 e flotação do micélio. Este foi retirado
cuidadosamente com uma espátula côncava. O frasco com XAD 2 Saco foi submetido à
raspagem do micélio aderido. Ambos, separadamente foram extraídos com AcOEt (3 x 300
mL). Após a evaporação do solvente obteve-se os extratos Mc-8R XAD Saco (436,7 mg) e
Mc-8R XAD Solto (105,9 mg). Estes extratos foram analisados por CLAE, de acordo com o
procedimento citado no item 3.2.2. p. 39 utilizando como fase estacionária C-18, adicionando
0,5% HOAc a água (Esquema 4, p. 47, Figura 4:, p. 48).
Linhagem fúngicaMc-8R
Inoculação em 400 mL(CDB) 28 dias + 10 sacos com 5 g de XAD 2 cadaRaspagem Micélio
Extração (3X 300 ml AcOEt)Evaporação do solvente
FiltradoDescarte
Micélio +XAD 2
Extrato BrutoMc-8R XAD Saco
436,7mg
Sacos com XAD 2
XAD 2 Solto
Flotação
MicélioDescarte
Extrato BrutoMc-8R XAD Solto
105,9mg
Inoculação em 500 mL (CDB) 28 dias + 50g XAD 2 Solto Filtração
Extração (3X 300 ml AcOEt)Evaporação do solvente
FiltradoDescarte
Esquema 4: Extrato Produzido por Mc-8R em CDB na Presença de XAD 2
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ___________________________3 – Desenvolvimento Experimental 48
Figura 4: Cromatogramas em grad. explorat. das frações Mc-8R XAD Solto e XAD Saco (H2O0,5% HOAc/MeOH; 95:5 a 0:100 em 40’, com fluxo de 1,0 mL/mim. a 254 nm) em C-18.
3.5.2 Variação Metabólica de Mc-8R em Diferentes Meios de Cultura.
Os extratos produzidos por Mc-8R quando cultivado em Czapek, Nutriente, YM e
Extrato de Malte foram obtidos de acordo com o procedimento citado no item 3.4; p. 45
(Esquema 5, p. 49).
Estes extratos foram analisados por CLAE, utilizando como fase estacionária sílica de
fase reversa C-18, de acordo com o procedimento citado no item 3.2.2, p. 39 adicionando
0,5% HOAc a água (Figura 51-Figura 57, pgs. 125-128) e experimentos de RMN 1H
(Figura 52-Figura 58, pgs. 125-128).
XAD Solto
XAD Saco
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ___________________________3 – Desenvolvimento Experimental 49
Mc-8R
Crescimento separado em frascos com Czapeck, Nutriente, YM, Extrato de Malte (28 dias, 25 °C, agitador orbital 500 mL cada), Filtração
Partição (3 X 200 mL AcOEt)
Extrato BrutoMc-8R
Nutriente 13,4 mg
Fração aquosaDescarte
Filtradosseparadamente
Fração AcOEt
Evaporaçãodo solvente
Extrato BrutoMc-8R
Czapeck 25,3 mg
Extrato BrutoMc-8R
YM 30,4 mg
Extrato BrutoMc-8R
Extrato de Malte 148,8 mg
MicélioDescarte
Esquema 5: Extratos obtidos em Mc-8R em Czapek, Nutriente, YM e Extrato de Malte
3.5.3 – Variação Metabólica Triagem dos Extratos para Estudo de Mc-8R em Arroz e
Milho
Para o cultivo do endofítico em cereais, foram utilizados 90 g de arroz parboilizado
(Tio João) e 90 de milho de canjica descascado (Yoki) colocados em quatro frascos de 500
mL contendo 90 mL de água destilada cada.
Estes meios foram autoclavados quatro vezes de 12 em 12 horas por 40 minutos à
temperatura de 121 oC. Após as primeiras 24 horas foram adicionados mais 20 mL de água
deionizada em cada frasco, dando seqüência a autoclavagem. Após o termino do processo de
altoclavagem o fungo foi inoculado nos meios de cultura e foram incubados por 21 dias à
temperatura ambiente (cultura estática). Após este período procedeu-se a extração dos cereais
com metanol por trituração em liquidificador, seguida de filtração a pressão reduzida.
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ___________________________3 – Desenvolvimento Experimental 50
A massa triturada foi novamente extraída com MeOH (3x500 mL). Após a evaporação
do solvente forneceram 1,86 g e 1,90 g de extrato de Arroz e Milho, respectivamente
(Esquema 6, p. 51).
Ambos os extratos foram solubilizados em ACN (1L) e particionados com Hexano
(3x300 mL) separadamente. Após a evaporação dos solventes, obteve-se 1,10 g e 0,93 g de
extrato Hexânico Milho e Arroz, respectivamente e 0,81 g e 0,93 g de extrato ACN Milho e
Arroz, respectivamente (Esquema 6, p. 51). Na manipulação do extrato Mc-8R Arroz Hex.,
observou-se a formação de um precipitado que foi separado e seco fornecendo 47,5 mg, foram
realizados experimentos de RMN de 1H e 13C onde pode-se identificar o Ergosterol
(Esquema 6, p. 51, Figura 136 e Figura 137, p. 191 e 192). Os extratos Mc-8R-ACN-Arroz
e Mc-8R-ACN-Milho foram analisados por CLAE, utilizando como fase estacionária sílica de
fase reversa C-18, seguindo o mesmo procedimento citado no item 3.2.2, p. 39. Adicionando-
se 0,5% de HOAc a água, (Figura 59 e Figura 61, pgs. 129 e 130) os extratos Mc-8R-Hex-
Arroz, Mc-8R-Hex-Milho e Mc-8R-Hex-Arroz-ppt (Ergosterol) foram analisados em CCDC
(Figura 65, p. 131). Os extratos Mc-8R-ACN-Arroz, Mc-8R-ACN-Milho, Mc-8R-Hex-Arroz
e Mc-8R-Hex-Milho foram submetidos a experimentos de RMN de 1H (Figura 60 - Figura
64, pgs. 129-131).
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ___________________________3 – Desenvolvimento Experimental 51
Mc-8RCrescimento, 21 dias, 90g Cereal(Milho e Arroz) + 110 g água
Evaporação do solvente
Milho
Extrato BrutoMc-8R ArrozMeOH 1,91g
TrituradoDescarte
Arroz
TrituradoDescarte
FraçãoMeOH
Fração MeOH
Partição Hex/ACNEvaporação do solvente
Extrato BrutoMc-8R ArrozHexano 0,93 g
Extrato BrutoMc-8R Arroz ACN 0,93 g
Filtração pptEvaporação do solvente
Arroz ppt Hex 47,5 mg
Extrato BrutoMc-8R MilhoMeOH 1,90 g
Trituração com MeOH, FiltraçãoExtração 3 X do triturado c/ MeOHFiltração
Evaporação do solvente
Extrato BrutoMc-8R MilhoHexano 1,1g
Extrato BrutoMc-8R Milho ACN 0,81 g
Partição Hex/ACNEvaporação do solvente
Trituração com MeOH, FiltraçãoExtração 3 X do triturado c/ MeOH
Filtração
Esquema 6: Extratos Obtidos da Variação Metabólica de Mc-8R em Arroz e Milho
3.6 - Fracionamento do Extrato Mc-8R
3.6.1 - Fracionamento via CLAE do Extrato Mc-8R Obtido em CDB
Nesta etapa do trabalho foram testadas em CLAE, duas condições de eluição:
H2O/MeOH, com e sem a dopagem de 0,5% de HAc na água em Fenil-hexil utilizando
gradiente exploratório seguindo o mesmo procedimento citado no item 3.2.2, p. 39 e de
detecção em 254 e 319 nm (Figura 5, p. 52). Posteriormente parte do extrato de Mc-8R (0,32
g) foi submetida a “clean up” e analisado em CLAE. Em que otimizou-se a separação
cromatográfica do extrato foi em sistema de eluição isocrático H2O0,5%HOAc/MeOH (65:35) a
319 nm com fluxo de 1 ml/min.
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ___________________________3 – Desenvolvimento Experimental 52
5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 3 5
M i n u t e s
0
1 0 0
2 0 0
3 0 0
4 0 0
5 0 0
m A U
1.91
7
9.57
9
10.8
03
13.7
28
18.8
64
25.8
03
26.5
49 30.1
95
30.7
31
31.2
05
0
2 5 0
5 0 0
7 5 0
m A U
16.4
45
19.3
55
22.6
05
24.8
72
26.1
79 28.8
96
30.1
20 31.6
0031
.885
32.2
56
32.7
6833
.056
33.7
47 34.3
1234
.600
34.9
04
-2 5
0
2 5
5 0
m A U
22.6
03
24.8
72
28.8
96
30.1
17
31.6
00
Figura 5: Cromatogramas em grad. explorat. do extrato Mc-8R (H2O/MeOH; 95:5 a 0:100 em 40’ em C-18
O extrato AcOEt Mc-8R foi submetido à análise em CLAE analítico acertando a sua
melhor condição utilizando sistema de eluição isocrático H2O0,5%HOAc/MeOH (65:35) a 320
nm, em coluna Fenil-hexil (Esquema 7, p. 53).
Esta condição foi transportada para CLAE preparativo em Fenil-Hexil com fluxo de
20 mL/min., resultando em oito frações codificadas Pa1-Pa8. A fração Pa2 apresentou pureza
analítica suficiente para realização de experimentos de RMN possibilitando a identificação do
ácido Pirenochaético C (4) (Esquema 7, p. 53). As frações Pa.3, 4 e 5 por apresentarem perfil
cromatográfico semelhante foram reunidas e submetidas a fracionamento via CLAE
preparativa nas mesmas condições utilizadas para purificação do extrato citado no parágrafo
anterior, resultando no isolamento da citreopirona (1). As frações Pa.6, 7 e 8 também foram
reunidas e submetidas à CLAE preparativo nas mesmas condições citadas anteriormente,
resultando no isolamento da Pirenocina E (2) (Esquema 7, p. 53).
As substâncias isoladas tiveram suas estruturas elucidadas através de técnicas
espectrométricas RMN de 1H, 13C, gHMQC, gHMBC, gCOSY, NOESY 1D e EM.
Mc-8R sem ácido acético 0,5 %
Mc-8R com ácido acético 0,5 %
λ= 254 nm
λ= 254 nm
λ= 319 nmMc-8R com ácido acético 0,5 %
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ___________________________3 – Desenvolvimento Experimental 53
Pa 111,2mg
Pa 2 60,0mgÁcido
Pirenochaético C 4
Pa 319,9mg
Pa 59,5mg
Pa 48,6mg
Pa 619,0mg
Pa 75,8mg
Pa 876,2mg
Mc-8R320,0 mg
Sol. H2O/MeOH (5:95) “clean up” C-18CLAEprep. Phenyl-hexil, H2O0,5%HAc/MeOH (65:35)Fluxo de 20ml/min a λ 319 nm
P 4.15,5mg
Citreopirona A 1
P 59,6mg
Pirenocina E 2
CLAE prep.MeOH/H2O0,5%, (65:35)Fluxo 20ml/minλ 319 nm
Pa 3 Pa 6
CLAE prep.MeOH/H2O0,5%, (65:35)Fluxo 20ml/minλ 319 nm
Esquema 7: Separação Cromatográfica do Extrato de Mc-8R obtido no crescimento em CDB via CLAE. 3.6.2 – Fracionamento do Extrato Mc-8R XAD Saco via CLAE.
O extrato Mc-8R XAD Saco foi submetido a fracionamento via CLAE preparativo
utilizando sistema de eluição isocrático H2O0,5%HOAc/MeOH (65:35) a 320 nm, em coluna C-
18 (Esquema 8, p. 53). As frações isoladas foram analisadas por experimentos de RMN de
1H e 13C, possibilitando a identificação das Pirenocinas A (1), B (3) e E (2).
Extrato BrutoMc-8R XAD Saco
436,7mg
XAD Saco 310,1 mg
Mistura (2)+(1)
XAD Saco 263,0 mg
Mistura (3)+(2)+(1)
CLAEpre p. C-18- MeOH/H2O0,5%HA c (35:65) Fluxo de 20ml/min a 320 nmEvaporação do solvente
XAD Saco 128,5 mg
Mistura (3)+(1)
Esquema 8: Separação Cromatográfica do Extrato Mc-8R XAD Saco via CLAE
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ___________________________3 – Desenvolvimento Experimental 54
3.6.3 - Fracionamento via CC do Extrato Mc-8R Obtido em CDB
Uma parte do extrato de Mc-8R (1,6 g) foi submetida à CC em fase reversa C-18 sob
pressão reduzida, utilizando como eluente (H2O0,5%HOAc/MeOH 95:5 a 0:100), fornecendo 12
frações de aproximadamente 100 mL cada, codificadas Mc-8R.1-10 e submetidas a CLAE em
gradiente exploratório, utilizando como fase estacionária C-18, seguindo o procedimento
citado no item 3.2.2, p. 39 adicionando-se 0,5% de HOAc a H2O. (Esquema 9, p. 54).
Mc-8R1125,0 mg
Mc-8R2217,6 mg
Mc-8R3 221,8 mg
Mc-8R5 218,1 mg
Mc-8R4 86,8 mg
Mc-8R646,7 mg
Mc-8R7243,3 mg
Mc-8R883,5 mg
Mc-8R9107,3 mg
Extrato Mc-8R(1,6 g)
CC (C18) Gradiente H2O0,5% HAc/MeOH 5:95 a MeOH 100%Evaporação dos Solventes
Mc-8R4304,9 mg
Mc-8R1022,4 mg
Mc-8R1199,1 mg
Mc-8R1235,7 mg
Reunião de frações
Esquema 9: Fracionamento em coluna comatrográfica do Extrato Mc-8R obtido no crescimento em CDB
Mc-8R 1
Mc-8R2
Mc-8R3
Figura 6: Cromatogramas em grad. explorat. das frações Mc-8R1, Mc-8R2, e Mc-8R3 obtidas do fracionamento cromatográfico do extrato AcOEt de Mc-8R (H2O0,5%HOAc/MeOH; 95:5 a 0:100 em 40’, com fluxo de 1,0 mL/mim. a 254 nm).
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ___________________________3 – Desenvolvimento Experimental 55
10 20 30 40
24.4
96
25.7
8726
.285
27.6
19
25.3
52
27.6
80
29.8
88
29.0
37
29.7
87
Mc-8R3
Mc-8R4
Mc-8R5
Figura 7: Cromatogramas em grad. explorat. das frações Mc-8R3, Mc-8R4, e Mc-8R5 obtidas do fracionamento cromatográfico do extrato AcOEt de Mc-8R (H2O0,5% HOAc/MeOH; 95:5 a 0:100 em 40’, com fluxo de 1,0 mL/mim. a 254 nm).
10 20 30 40
29.0
37
29.7
8730
.245
31.5
25
34.1
73
Mc-8R5
Mc-8R6
Mc-8R7
Figura 8: Cromatogramas em grad. explorat. das frações Mc-8R5, Mc-8R6, e Mc-8R7 obtidas do fracionamento cromatográfico do extrato AcOEt de Mc-8R (H2O0,5% HOAc/MeOH; 95:5 a 0:100 em 40’, com fluxo de 1,0 mL/mim. a 254 nm).
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ___________________________3 – Desenvolvimento Experimental 56
1 0 20 3 0 4 031
.525
34.1
73
31.5
7631
.851
32.1
9732
.696
33.0
51 33.4
0533
.776
34.2
56
31.5
6831
.851 32
.197
32.7
01 32.9
84
33.7
73
34.3
2834
.613
34.9
0735
.381
36.3
1236
.597
37.2
27
36.6
03
37.2
48
39.7
73
Mc-8R7
Mc-8R8
Mc-8R10
Mc-8R9
Figura 9: Cromatogramas em grad. explorat. das frações Mc-8R7, Mc-8R8, Mc-8R9 e Mc-8R10 obtidas do fracionamento cromatográfico do extrato AcOEt de Mc-8R (H2O0,5% HOAc/MeOH; 95:5 a 0:100 em 40’, com fluxo de 1,0 mL/mim. a 254 nm).
Após a analise em CLAE as frações Mc-8R 3, 4 e 5 foram escolhidas por
apresentarem um bom perfil cromatográfico e foram submetidas a CCDC utilizando a
metodologia citada no item 3.2.3; p. 39. A melhor condição acertada foi: [75% Hexano + 3%
HOAc + 22% da (Sol A) = (CHCl3/ISP 90:10)] em tripla eluição.
A fração Mc-8R.3 foi fracionada em CC utilizando com fase estacionária Sílica Gel
Acros, e sistema de eluente em gradiente iniciando a Hex/(Sol A)/HAc (80:17:3) a (Sol
A)/HOAc (97:3) com posterior limpeza em MeOH 100% (Esquema 10, p. 57), resultando em
20 frações que foram analisadas em CCDC com a fase móvel, Hex/(Sol A)/HOAc (75:22:3)
sendo reunidas em 7 frações (Mc-8R.3.1-3.7) (Esquema 10, p. 57). Destas, a fração Mc-
8R.3.4 (34,3 mg) foi enviada para fazer espectros de RMN, possibilitando a identificação do
Ácido Pirenochaético B (6).
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ___________________________3 – Desenvolvimento Experimental 57
As frações Mc-8R.3.6 e 3.7 foram reunidas (42,5 mg) e fracionadas por CC, utilizando
com fase estacionária Sílica Gel Acros e sistema de eluição Hex/(Sol A)/HOAc (60:37:3) em
gradiente até (Sol A)/HOAc (97:3) com posterior limpeza em MeOH 100% (Esquema 10, p.
57). O fracionamento resultou em 10 frações, que foram reunidas em 6. (Esquema 10, p. 57).
Destas, a fração Mc-8R.3.6.6 apresentou alto grau de pureza em CCDC, sendo então
submetida a experimentos de RMN uni e bidimensionais sendo identificada como a Ácido
Pirenochaético Inédito (7).
Mc-8R3221,8 mg
Mc-8R3.340,7 mg
Mc-8R3.126,3 mg
Mc-8R3.611,9 mg
Mc-8R3.730,6 mg
Mc-8R3.4Ácido Pirenochaético B (6)
34,3 mg
Mc-8R3.234,5 mg
Mc-8R3.527,5 mg
Mc-8R3.642,5 mg
CC Sílica Gel, Gradiente Hex/(Sol A)/HAc (80:17:3) a 97% (Sol A) + 3% HAc Evaporação do Solvente
Mc-8R3.6.39,7 mg
Mc-8R3.6.11,3 mg
Mc-8R3.6.49,3 mg
Mc-8R3.6.27,5 mg
Mc-8R3.6.52,5 mg
Mc-8R.3.6.6Substância (7)
11,9 mg
CC Sílica Gel gradiente Hex/(Sol A)/HAc (60:37:3) a (Sol A)/HAc (97:3), Evaporação do solvente
Reunião de Frações
Esquema 10: Fracionamento Cromatográfico Fração Mc-8R.3
As frações Mc-8R4 e Mc-8R5 (Esquema 9, p. 54) foram reunidas por apresentarem
mesmo perfil cromatográfico e renomeadas como Mc-8R.4. Foi realizado o fracionamento por
CC, utilizando com fase estacionária Sílica gel Acros e sistema de eluição em Hex/(Sol
A)/HAc (85:12:3) em gradiente até (Sol A)/HOAc (97:3) com posterior limpeza em MeOH
100% (Esquema 11, p. 58). O fracionamento resultou em 35 frações, que após análise por
CCDC foram reunidas em 7 e codificadas Mc-8R.4.1 a 4.7 (Esquema 11, p. 58).
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ___________________________3 – Desenvolvimento Experimental 58
Destas, a fração Mc-8R.4.3 apresentou alto grau de pureza e foi submetida a
experimentos de RMN uni e bidimensionais permitindo a identificação do Ácido
Pirenochaético A (5).
A fração Mc-8R4.2 foi avaliada por RMN de 1H e 13C e após análise dos espectros
obtidos identificou-se a Ácido Pirenochaético inédito (8).
Mc-8R4304,9 mg
Mc-8R4.17,4 mg
Mc-8R4.614,5 mg
Mc-8R4.729,7 mg
Mc-8R4.431,0 mg
Mc-8R4.58,4 mg
Mc-8R 4.3Ácido Pirenochaético A (5)
111.2 mg
Mc-8R 4.2Substância (8)
9,4 mg mg
CC Silica Gel, Gradiente Hex/(Sol A)/3% HAc (85:12:3)a 97% (Sol A)+ 3% HAc, Evaporação do solvente
Esquema 11: Fracionamento Cromatográfico de Mc-8R4
3.6.4 – Purificação da Fração Mc-8R Milho Hex.
A fração Mc-8R Milho Hex (1,10 g) foi submetida a CC, utilizando com fase
estacionária Sílica gel Acros e sistema de eluição em Hex/(Sol A)/HOAc (86:11:3) em
gradiente até (Sol A)/HOAc (97:3), resultando em 44 frações, sendo reunidas por CCDC em
21 frações e codificadas Mc-8R Milho hex.1 a 21 (Esquema 12, p. 59). Destas a fração Mc-
8R Milho Hex.10 (12,0 mg) apresentou alto grau de pureza e foi submetida a experimentos de
RMN uni e bidimensionais identificando do Peróxido de Ergosterol (10).
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ___________________________3 – Desenvolvimento Experimental 59
Mc-8R Milho Hex.10
Peróxido de Ergosterol
(10)12,0 mg
Fração Mc-8R Milho Hex
(1,1g)CC, Sílica gel Hex/(Sol A)/HAc (86:11:3) até (Sol A)/HAc (97:3) Evaporação do Solvente
Mc-8R Milho Hex.1-9 4,3 mg
Mc-8R Milho Hex.11 -21
29,5 mg
Esquema 12: Fracionamento Cromatográfico Fração Mc-8R Milho Hex
3.7 – Cultivo do Fungo Mc-7F com CDB em Larga Escala.
O fungo Colletotrichum gloeosporioides (Mc-7F) foi cultivado em 18 L de CDB
divididos em 6 frascos de 4 litros com 3 litros cada de acordo com os procedimentos citados
no item 3.4; p. 45, obteve-se 3,0 g de extrato (Esquema 13, p. 59).
Mc-7FColletotrichum gloeosporioides
Partição (10X 4,0 L (AcOEt)
Extrato Mc-7F3,0g
Fração aquosaDescarte
Filtrado
Extração AcOEt
Evaporação do solvente
Micélio Descarte
Crescimento (18,0 L (CDB), 28 dias, Agitação Orbital, Filtração
Esquema 13: Extrato obtido do crescimento de Colletotrichum Gloeosporioides (Mc-7F) em CDB
3.8 - Fracionamento do Extrato Mc-7F Obtido em CDB
Parte do extrato produzido pelo fungo Mc-7F, obtido em larga escala (1,60 g) foi
submetido a fracionamento cromatográfico em CC, utilizando sílica de fase reversa (C-18) e
sistema de eluentes em forma de gradiente iniciando em H2O0,5%HOAc/MeOH (95:05) até
100% MeOH sob pressão reduzida obtendo-se 11 frações que foram codificadas Mc-7F.1 a 11
(Esquema 14, p. 60). Estas foram submetidas à análise por RMN de 1H (Figura 67-Figura
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ___________________________3 – Desenvolvimento Experimental 60
87, pgs. 132-142) e CLAE, utilizando-se como fase estacionária sílica de fase reversa C-18,
conforme o procedimento citado no item 3.2.2, p. 39 adicionou-se 0,5% de HOAc a água
(Figura 66-Figura 86, pgs. 132-142). Destas as frações Mc-7F.5 e Mc-7F.9 apresentaram
espectros de RMN de 1H de substâncias puras, sendo submetidos a experimentos de RMN uni
e bidimensionais possibilitando a identificação dos derivados indólicos (18) e (19).
Mc-7F.1235,4 mg
Mc-7F.2379,3 mg
Mc-7F.3437,8 mg
Mc-7F.5Subst (18) 70,6 mg
Mc-7F.4 49,7 mg
Mc-7F.648,1 mg
Mc-7F.748,1 mg
Mc-7F.852,4 mg
Mc-7F.9Subst (19)51,7 mg
Extrato AcOEt Mc-7F (1,6 g)
CC (C18) Gradiente H2O0,5% HAc/MeOH 5:95 a MeOH 100%Evaporação do solvente
Mc-7F.1049,3 mg
Mc-7F.1139,5 mg
Esquema 14: Fracionamento Cromatográfico do Extrato Mc-7F em C-18
3.8.1 - Fracionamento em CLAE das Frações Mc-7F.1 e Mc-7F.2
Nesta etapa do trabalho foram testadas em CLAE, quatro condições de eluição:
H2O/MeOH, H2O/ACN, com e sem 0,5%HOAc em duas fases estacionárias C-18 e Fenil-
Hexil. Destas a fração Mc-7F.1 demonstrou melhor resolução em C-18 e a fração Mc-7F.2
demonstrou melhor resolução em Fenil-Hexil ambas com 0,5% de HOAc misturado a água.
As Frações Mc-7F.1 e Mc-7F.2 tiveram otimizadas suas separações em CLAE isocrático, nas
condições H2O0,5%HOAc/MeOH (83:17) a 320 nm para Mc-7F.1 e (80:20) a 320 nm para Mc-
7F.2 ambas com fluxo de 1 ml/min. Estas condições foram transportada para CLAE
preparativo com fluxo de 20 mL/min. (Esquema 15 e Esquema 16, pgs. 61 e 61). Este
fracionamento resultou em oito frações para Mc-7F.1 e Mc-7F.2, posteriormente analisadas
por espectros de RMN de 1H.
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ___________________________3 – Desenvolvimento Experimental 61
Mc-7F.1.1Uracila (11)
16,7 mg
Mc-7F.1.211,9 mg
Mc-7F.1.35,9 mg
Mc-7F.1.5 5,0 mg
Mc-7F.1.4 4,8 mg
Mc-7F.1.6Subst. (12)
28,5 mg
Mc-7F.1.7Subst. (13)
53,2 mg
Mc-7F.1.86,8 mg
Fração Mc-7F.1 (235 mg)
CLAE prep..C-18 MeOH/H2O0,5% , (17:83)Fluxo 20ml/min λ 320 nmEvaporação do Solvente
Esquema 15: Fracionamento Cromatográfico em C-18 do Extrato Mc-7F.1
Após analises de RMN de 1H, as frações (Mc-7F.1.1, 1.4, 1.6, 1.7 e Mc7F.2.1, 2.2,
2.4, 2.6) foram submetidas a técnicas espectrométricas RMN 13C, gHMQC, gHMBC,
gCOSY, NOESY 1D e EM, sendo possível identificar as substâncias Uracila (11), ciclo-(S*-
Pro-S*-Tyr) (12), ciclo-(S*-Pro-S*-Val) (13), Ácido-(2-Amino-fenil)-acético (14), Ácido-(4-
Hidroxi-fenil)-acético (15), 4-Hidroxi-benzamida (16) e Ácido-(2-Hidroxi fenil)-acético (17).
Mc-7F.2.1Subst.(14)16,7 mg
Mc-7F.2.2Subst. (16)
11,9 mg
Mc-7F.2.3Subst. (15)
5,9 mg
Mc-7F.2.5 5,0 mg
Mc-7F.2.4Subst. (13)
4,8 mg
Mc-7F.2.6Subst. (17)
28,5 mg
Mc-7F.2.753,2 mg
Mc-7F.2.86,8 mg
Fração Mc-7F.2 (379,3 mg)
CLAE prep..C-18 MeOH/H2O0,5% , (20:80)Fluxo 20ml/min λ 320 nmEvaporação do Solvente
Esquema 16: Fracionamento Cromatográfico Extrato Mc-7F.1
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. _________________________________4 – Resultados e Discussões 62
4 - RESULTADOS E DISCUSSÕES.
4.1 – Triagem Química e Biológica dos Extratos dos Fungos Endofíticos Isolados de
Michelia champaca.
Os extratos produzidos pelos oito fungos endofíticos em CDB (Tabela 3: p. 62) foram
analisados por RMN de 1H (Figura 43-Figura 51, pgs. 121-124) (Tabela 6: p. 63) para
avaliação do perfil químico. Foram submetidos aos ensaios de bioautografia contra os fungos
fitopatogênicos Cladosporium cladosporioides e C. sphaerospermum para detecção do
potencial antifúngico (Tabela 4: p. 62), com Saccharomyces cerevisiae para detecção da
atividade antitumoral (Tabela 5: p. 63), e com a enzima acetilcolinesterase para a avaliação
da atividade anticolinesterásica.
Tabela 3: Rendimento dos extratos dos fungos endofíticos fermentados em 500 ml de CDB Código do Fungo Fungos Identificados Massa (mg)
Mc-1C 15,6 Mc-2C 7,2 Mc-3C Xylaria sp. 91,3 Mc-4F 5,2 Mc-5F 8,7 Mc-6F Phomopis stipata 30,5 Mc-7F Colletotrichum gloeosporioides 15,0 Mc-8R 48,5
Tabela 4: Resultados das atividades antifúngicas dos extratos produzidos pelos endofíticos isoldos de M. champaca.
Bioautografia em camada delgada Concentração
μg Cladosporium
sphaerospermum Cladosporium
cladosporioides Código Fungo
rf Potencial rf Potencial Mc-1C 200 0,26/ rastro **/ * 0,28/ 0,51/ 0,6 **/ */ * Mc-2C 200 Origem/ rastro */ * Origem/rastro */ * Mc-3C 200 0,38/ rastro ***/ * 0,38 *** Mc-4F 200 0,42/ 0,61 */ * 0,46/ 0,59 **/ * Mc-5F 200 0,51/ 0,59 */ * 0,24/ 0,51/ 0,6 */ **/ **
Mc-6F 200 Origem/0,07 /rastro/0.61
**/ **/ */ *** Origem/08/0,31/0,37/0,51 **/**/**/**/**
Mc-7F 200 0,66 * Origem/ 0,62 **/ **
Mc-8R 200 Origem/ 0,2/ 0,48
**/ ***/ *** Origem/0,17/0,49/0,59 ***/***/***/***
Nistatina 100 - *** - *** *= atividade fraca **= atividade média ***= atividade forte
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. _________________________________4 – Resultados e Discussões 63
Tabela 5: Resultados obtidos no ensaio com S. cerevisiae dos extratos produzidos pelos endofíticos isolados de M. champaca.
Halo de Inibição (mm) Extrato do fungo Concentração da Amostra (μg/mL) Rad+ Rad 52Y Rad 321
Mc-1C 2000,0 - - - Mc-2C 2000,0 - - - Mc-3C 2000,0 - - - Mc-4F 2000,0 - - - Mc-5F 2000,0 - - - Mc-6F 2000,0 - 15 13 Mc-7F 2000,0 - - 13 Mc-8R 2000,0 - - 14
Padrão 1 estreptonigrina 4,0 - - 20 Padrão 2 camptotecina 200,0 19 - - Padrão 3 camptotecina 5,0 - 17 -
Tabela 6: Resultados obtidos no ensaio ensaios de inibição da acetilcolinesterase para os extratos dos endofíticos isolados de M. champaca.
Extrato do fungo Concentração (μg/mL) rf Mc-1C 200 - Mc-2C 200 0,49/ 0,02 Mc-3C 200 0,51/ 0,39 Mc-4F 200 0,03 Mc-5F 200 0,52/ 0,02 Mc-6F 200 0,54 Mc-7F 200 0,7/ 0,47/ 0,3 Mc-8R 200 0,7/ 0,53/ 0,44
Os fungos Mc-8R e Mc-6F apresentaram forte atividade no ensaio de bioautografia e
foram submetidos novamente ao mesmo ensaio para verificação do limite de detecção
(Tabela 7: p. 64).
Os resultados observados nas Tabela 4:, Tabela 5: e Tabela 6: evidenciam a
potencialidade dos endofíticos na produção de metabólitos secundários bioativos, que aliados
aos dados observados nos espectros de RMN de 1H, nos conduziram à seleção dos fungos
codificados como Mc-7F e Mc-8R para crescimento em larga escala e estudo químico/
biológico.
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. _________________________________4 – Resultados e Discussões 64
Tabela 7: Resultados do limite de detecção em bioautografia dos extratos Mc-6F e Mc-8R. Cladosporium sphaerospermum Cladosporium cladosporioides Concentração
Fator de retenção Potencial Fator de retenção Potencial Mc-6F 400 ug 0,14/ 0,40/ 0,65 **/ */ **/ * 0,04/ 0,14/ 0,37 ***/ ***/ **/ ** 200 ug 0,14/ 0,40/ 0,65 **/ */ */ * 0,14/ 0,37 ***/ */ * 100 ug 0,14/ 0,40/ 0,65 **/ */ */ * 0,14/ 0,38 **/ */ * 10 ug Origem * i - 1ug I - i -
Nistatina - *** - *** Mc-8R 400 ug 0,18/ 0,43/ 0,63 **/ ***/ ***/ *** 0,18/ 0,32/ 0,42/ 0,49/ 0,62 **/ ***/ ***/ ***/ ***/ ** 200 ug 0,18/ 0,43/ 0,63 */ ***/ ***/ * 0,18/ 0,32/ 0,42/ 0,49/ 0,62 */ ***/ **/ ***/ **/ * 100 ug 0,18/ 0,43/ 0,63 */ ***/ ***/ * 0,18/ 0,32/ 0,42/ 0,49/ 0,62 */ ***/ */ ***/ **/ * 50 ug 0,18/ 0,43/ 0,63 **/ ***/ * 0,18/ 0,32/ 0,42/ 0,49 */ ***/ */ ***/ * 10 ug 0,18/ 0,43 */ *** 0,18/ 0,42 ***/ *** 1ug 0,18/ 0,43 */ ** 0,18/ 0,42 **/ **
Nistatina - *** - *** *= atividade fraca **= atividade média ***= atividade forte
4.1.1 – Fungos Endofíticos Isolados dos Caules de Michelia champaca.
A experiência adquirida no crescimento de endofíticos em larga escala, permitiu
estabelecer que a quantidade mínima de extrato produzida para cada 500 mL de meio de
cultura CDB fosse de 30 mg. Abaixo desta quantidade foi considerado um rendimento baixo e
o dobro desta quantidade é considerado um rendimento alto. Estes dados em conjunto com
seus respectivos espectros de RMN de 1H permitiram fazer algumas considerações:
Mc-1C: (15,6 mg) este fungo tem uma produção metabólica baixa, mas o espectro de
RMN de 1H apresentou grande quantidade de sinais abrangendo toda região espectral,
destacando-se sinais característicos de metoxilas, metilas e hidrogênios aromáticos (Figura
43, p. 121). O extrato produzido por este endofítico apresentou fraca atividade frente aos
fungos fitopatogênicos C. sphaerospermum e C. cladosporioides (Tabela 4: p. 62), não
apresentou atividade contra as linhagens mutantes de S. cerevisiae (Tabela 5: p. 63) e de
inibição da acetilcolinesterase (Tabela 6: p. 63).
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. _________________________________4 – Resultados e Discussões 65
Mc-2C: (7,2 mg) No cultivo deste fungo obteve-se um rendimento muito baixo. A
análise do espectro de RMN de 1H (Figura 44, p. 122) mostrou sinais característicos de
hidrogênios aromáticos, metilênicos, olefínicos e de metoxilas. Os ensaios biológicos
demonstram que este fungo é inativo frente Saccharomyces cerevisiae (Tabela 5: p. 63),
apresentou atividade fraca frente Cladosporium sphaerospermum e C. cladosporioides
(Tabela 4: p. 62), e inibidora da acetilcolinesterase (Tabela 6: p. 63).
Mc-3C: (91,3 mg) Este fungo apresentou um ótimo rendimento metabólico. O espectro
de RMN de 1H (Figura 45, p. 122) mostrou a existência de uma substância majoritária que
após experimentos de RMN, uni e bidimensionais, foi identificada como sendo o ácido 2-
hexilideno-3-metilsuccínico (20) (Figura 38, p. 106). Este fungo foi classificado como
Xylaria sp. gênero já estudado pelo grupo, do qual se isolou o mesmo diácido identificado no
extrato e este diácido isolado apresentou atividade antifúngica frente Cladosporium
sphaerospermum e C. cladosporioides (CAFÊU, et al. 2005). Esta atividade também foi
encontrada no extrato produzido por Mc-3C (Tabela 4: p. 62), entretanto não se observou
nenhuma atividade antitumoral frente às linhagens mutantes de Saccharomyces cerevisiae
(Tabela 5: p. 63), mas apresentou atividade inibidora da acetilcolinesterase (Tabela 6: p. 63).
4.1.2 – Fungos Endofíticos Isolados das Folhas de Michelia champaca.
Mc-4F: (5,2 mg) Este fungo não apresentou um bom endimento, mas uma análise do
espectro de RMN de 1H (Figura 46, p.122) evidenciou sinais de metilas e metoxilas alifáticas,
hidrogênios olefínicos e carbinólicos. O extrato produzido por este fungo apresentou fraca
atividade frente C. sphaerospermum, atividade média frente C. cladosporioides (Tabela 4: p.
62) e nenhuma atividade contra Saccharomyces cerevisiae (Tabela 5: p. 63), mas apresentou
atividade inibidora da acetilcolinesterase (Tabela 6: p. 63).
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. _________________________________4 – Resultados e Discussões 66
Mc-5F: (8,7 mg) Apesar do baixo rendimento metabólico, o espectro de RMN de 1H
(Figura 47, p. 123) apresentou vários sinais de hidrogênios metílicos, metoxílicos,
carbinólicos e poucos sinais de hidrogênios aromáticos e olefínicos. Nos ensaios biológicos, o
endofítico apresentou fraca atividade frente Cladosporium sphaerospermum e média atividade
frente C. cladosporioides (Tabela 4: p. 62), sendo inativo frente Saccharomyces cerevisiae
(Tabela 5: p. 63), mas apresentou atividade inibidora da acetilcolinesterase (Tabela 6: p. 63).
Mc-6F: (30,5 mg) Este endofítico apresentou o mínimo rendimento metabólico
necessário e foi identificado como Phomopsis stipata, Uma cuidadosa avaliação do espectro
de RMN de 1H do extrato deste endófito, evidenciou uma substância predominante. Podendo
ser identificado a presença do ácido 3-nitropropiônico (21) através dos sinais característicos
em δH 3,00 (2H, t, J = 6,0 Hz) e 4,63 (2H, t, J = 6,0 Hz) (Figura 206, p. 261). A confirmação
da presença desta substância foi através do espectro de massas de baixa resolução (Figura
207, p. 262), obtido através da técnica ESI-MS (+), e observado o pico do íon m/z 98
indicando a formação do fragmento [M+H-CO2]+.
Esta mesma substância já foi isolada do fungo Phomopis sp. e apresentou atividade
frente 15 tipos de micobactérias de plantas (CHOMEHEON, et al., 2005).
O extrato produzido por Mc-6F apresentou atividade forte frente aos fungos
Cladosporium sphaerospermum e atividade média com C. cladosporioides (Tabela 4: p. 62).
Este extrato também apresentou atividade frente às linhagens mutantes de Saccharomyces
cerevisiae (Tabela 5: p. 63) e nos ensaios de inibição da acetilcolinesterase (Tabela 6: p. 63).
Mc-7F: (15,0 mg) Esta linhagem foi identificada como Colletotrichum gloeosporioides,
apresentando um rendimento metabólico baixo, mas o espectro de RMN de 1H (Figura 49, p.
124) apresentou muitos sinais de hidrogênios aromáticos e metoxilas, algumas metilas
aromáticas e alifáticas.
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. _________________________________4 – Resultados e Discussões 67
Nos ensaios biológicos, o endofítico apresentou fraca atividade frente ao fungo
Cladosporium sphaerospermum, média frente C. cladosporioides (Tabela 4: p. 62) e
atividade seletiva frente Saccharomyces cerevisiae (Tabela 5: p. 63), apresentou também
atividade inibidora da acetilcolinesterase (Tabela 6: p. 63). Apresar do baixo rendimento
metabólico, estes resultados motivaram a seleção deste fungo para estudo químico.
4.1.3 – Fungos Endofíticos Isolados das Raízes de Michelia champaca
Mc-8R: (48,5 mg) Apresenta um rendimento metabólico razoável. O espectro de
RMN de 1H (Figura 50, p.124) mostrou sinais abrangendo toda região espectral. O extrato
produzido por este fungo mostrou forte atividade antifúngica frente ao fungo Cladosporium
sphaerospermum e C. cladosporioides (Tabela 4: p. 62), além de atividade seletiva em
Saccharomyces cerevisiae, onde atingiu 70% da atividade do padrão utilizado
(estreptonigrina) (Tabela 5: p. 63). Nos ensaios de inibição da acetilcolinesterase também
apresentou atividade (Tabela 6: p. 63) estes resultados fizeram com que este fungo fosse
escolhido para o estudo químico.
4.2 – Cultivo do Endofítico Mc-8R em Diferentes Meios de Cultura.
Os fungos endofiticos Mc-8R e Mc-7F se mostraram excelentes produtores de
metabólitos potencialmente bioativos e com uma diversidade estrutural notável. Considerando
estes fatos, e que a produção metabólica de microrganismos é altamente dependente das
condições e meios de cultivo, nos propusemos a avaliar a produção metabólica de Mc-8R em
outros meios.
Com este procedimento, objetivávamos a obtenção de outros metabólitos secundários,
talvez mais bioativos que os inicialmente obtidos.
Levando-se em consideração que cada meio de cultura tem concentrações diferentes
estabelecemos a relação de massa de extrato produzido em (mg) para cada (grama) de
substrato utilizado, estes dados estão apresentados na Tabela 8: p. 68.
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. _________________________________4 – Resultados e Discussões 68
Tabela 8: Relação produtiva dos fungos por quantidade de meio de cultura Meio Conc. g/L Quant. gramas (g) p/
500 ml Massa extrato
(mg) Massa de extrato/Meio de
cultura (mg/g) CDB 24 12,0 48,8 4,07 ME 20 10,0 148,8 14,88 YM 21 10,5 30,4 2,89
Nutriente 8 4,0 13,4 3,35 Czapek 35 17,5 25,3 1,44 Milho 90 Sólido = 90 1910,0 21,22 Arroz 90 Sólido = 90 1900,0 21,11
Milho ACN 90 Sólido = 90 810,0 9,00 Arroz ACN 90 Sólido = 90 930,0 10,33 XAD 2 Saco 24 CDB 12 436 36,33 XAD 2 Solto 24 CDB 12 105 8,75
O cultivo em diferentes meios forneceu massa de extrato bruta distintas o que pode ser
obserado Figura 10, Gráfico 01, p. 68 evidenciando que em XAD 2 saco, a massa obtida
apresentou melhor rendimento.
Considerando a natureza de média a alta polaridade das substâncias extraídas pela
partição com AcOEt, foi de fundamental importância a submissão dos extratos e frações à
CLAE, verificando a adequação desta técnica cromatográfica no trabalho experimental, e
contribuiu para o conhecimento da natureza química das substâncias presentes.
Estes dados em conjunto com seus respectivos espectros de RMN de 1H permitiram
fazer algumas considerações:
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
CDB ME YM Nutriente Czapek Milho Arroz MilhoACN
ArrozACN
XAD 2Saco
XAD 2Solto
Figura 10: Gráfico 01: variação metabólica de Mc-8R com vários meios de culturas e condições de crescimento
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. _________________________________4 – Resultados e Discussões 69
Czapek: O fungo apresentou baixa produção metabólica neste meio de cultura (25,3
mg) (1,44 mg/g). O cromatograma em gradiente exploratório deste extrato (Figura 51, p. 125)
mostrou poucos picos de baixa à média absorvância. Observou-se no espectro e RMN de 1H
(Figura 52, p. 125) a presença de sinais característicos de pironas e a ausência dos sinais
aromáticos característicos de ácidos pirenochaéticos.
YM: Neste meio o fungo produziu a quantidade de (30,4 mg) mas sua massa
proporcional foi de (2,89 mg/g), se apresentando intermediário em comparação com os meios
Czapek e Nutriente. O cromatograma em gradiente exploratório (Figura 55, p. 127)
apresentou cinco picos com maior absorvância, indicando média variação metabólica. Uma
análise do espectro de RMN de 1H (Figura 56, p. 127) mostrou sinais característicos de
pironas mais intensos do que os de ácidos pirenochaéticos, portanto, pode-se concluir que este
meio também favorece a produção de pironas.
Nutriente: O cultivo de Mc-8R neste meio apresentou o menor rendimento em massa
(13,4 mg), mas um rendimento proporcional (3,35 mg/g) maior que em Czapek. Uma análise
do cromatograma em gradiente exploratório deste extrato (Figura 53, p. 126) confirma a
baixa produção metabólica devido à presença de apenas três picos. No espectro de RMN de
1H (Figura 54, p. 126), observaram-se poucos sinais característicos de ácido pirenochaético
não se observando sinais de pironas. Aparentemente, este meio de cultura favorece a produção
dos ácidos em relação às pironas, ao contrário meio Czapek.
CDB: Este meio de cultura é o mais utilizado para crescimento de fungos endofíticos
tanto na literatura como nos trabalhos de nosso grupo. Seria de se esperar que este meio fosse
o meio que apresentasse o maior rendimento metabólico, mas para este fungo em questão isso
não é observado, apresentando uma produção de (48,8 mg), com a produção proporcional de
(4,0 mg/g) demonstrando ter uma produção pouco maior do que no meio Nutriente.
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. _________________________________4 – Resultados e Discussões 70
No espectro de RMN de 1H (Figura 50, p.124), observaram-se poucos sinais característicos
de ácido pirenochaético e observando sinais de pironas em maior intensidade. Aparentemente,
este meio de cultura favorece a produção de pironas em relação aos ácidos pirenochaéticos.
Extrato de Malte: De todos os meios de cultura líquidos, este apresentou o maior
rendimento em massa (148,8 mg) e em massa proporcional (14,9 mg/g). Uma análise do
cromatograma em gradiente exploratório (Figura 57, p. 128) revelou vasta produção
metabólica apresentando vários picos abrangendo toda a extensão do cromatograma. O
espectro de RMN de 1H (Figura 58, p. 128 apresentou sinais característicos de pironas mais
intensos que os sinais de ácidos pirenochaéticos, indicando que a produção de pironas é
favorecida neste meio de cultura.
Arroz: Em meio sólido a produção de extrato foi de 1,90 g e a produção proporcional
foi de (21,2 mg/g). Análise do espectro de RMN de 1H deste extrato revelou uma grande
quantidade de triglicerídeos, que atrapalham a visualização de outros metabólitos. Para
contornar este problema o extrato foi submetido a uma partição líquido/líquido com
Hex/ACN retirando material apolar.
Este processo resultou em 0,93 g de extrato Hexânico e 0,93 g de extrato ACN, ou
seja, 50% do extrato total de natureza graxa, não podendo ser analisado em CLAE de fase
reversa. O cromatograma em gradiente exploratório do extrato ACN/Arroz (Figura 59, p.
129) revelou uma vasta variação metabólica, com picos abrangendo toda a região do
cromatograma. O espectro de RMN de 1H (Figura 60, p. 129), apresentou sinais
característicos de pironas e de ácidos pirenochaéticos, sendo estes mais intensos, sugerindo
uma maior produção de ácidos pirenochaéticos do que de pironas.
Milho: O extrato produzido neste meio sólido foi submetido ao mesmo procedimento
que o extrato obtido em Arroz, resultando em 1,10 g de extrato Hexânico e 0,81g de extrato
ACN. O cromatograma em gradiente exploratório do extrato ACN/Milho (Figura 61, p. 130),
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. _________________________________4 – Resultados e Discussões 71
apresentou-se semelhante ao do extrato ACN/Arroz, apenas diferenciando-se na intensidade
de alguns sinais. Apesar dos extratos obtidos em milho e arroz serem muito parecidos pode-se
observar uma pequena diferença na produção metabólica de Mc-8R quando cultivado nestes
dois meios. Uma análise dos dados de RMN de 1H (Figura 62, p. 130) mostra sinais
característicos de pironas e ácidos pirenochaéticos, onde os ácidos estão em maior quantidade.
Os Extratos hexânicos obtidos das culturas de Arroz e Milho foram submetidos à
CCDC (Figura 65, p. 131), onde se observa a semelhança na constituição química destes. Os
espectros de RMN 1H (Figura 63 e Figura 65, p. 131 e 131) dos extratos Hexânicos
confirmaram essa similaridade. Se observou também sinais característicos de ergosterol (9),
substância encontrada no resíduo insolúvel obtido a partir do extrato Hex/Milho (Figura 136,
p. 191).
XAD 2 Saco: Esta é uma variação metodológica por estar utilizando o meio de cultura
CDB juntamente com XAD 2 acondicionados em sacos de tecido sintético.
Esta técnica foi desenvolvida única e exclusivamente por mim e apresentou resultados
surpreendentes. Seria de se esperar que por estar utilizando o meio de cultura CDB o
rendimento fosse estar próximo aos (4,0 mg/g), mas este rendimento passou para a ordem de
(36,3 mg/g), isso demonstra que a idéia de o XAD 2 estar seqüestrando do meio de cultura os
metabólitos produzidos pelo fungo é verídico e pode ser observado no cromatograma que
apresenta apenas a produção de 3 substâncias.
XAD 2 Solto: Nesta variação metodológica o procedimento adotado foi o de se
adicionar XAD 2 solto no meio de cultura CDB. Seria de se esperar um rendimento
metabólico parecido com o XAD 2 Saco, mas se observou uma produção bem menor. No
experimento é observado que o XAD 2 Solto atrapalha o desenvolvimento micelar do fungo
onde verifica-se o micélio todo triturado juntamente com o XAD 2 no meio. Sugerimos este
o motivo deste experimento ter apresentado o rendimento metabólico de (8,0 mg/g). Apesar
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. _________________________________4 – Resultados e Discussões 72
de ser bem inferior a XAD 2 Saco este ainda apresenta um rendimento duas vezes maior que o
crescimento apenas em CDB.
No cromatograma é observada uma variação metabólica muito grande, podemos
sugerir que neste experimento o XAD 2 não tem a mesma eficiência quanto comparado com
este estando acondicionado em sacos de tecido sintético.
Aparentemente não se observa variação no crescimento de Mc-8R utilizando vários
meios, tendo por base apenas o volume de micélio obtido no momento da filtração, seria
intuitivo imaginar que houvesse a mesma relação de produção de extrato nos vários meios.
No entanto observa-se que o meio onde se obteve a menor produção foi o meio mais artificial
contendo vários sais e um açúcar como nutrientes (Czapek). O meio rico em açucares e pobre
em fonte de nitrogênio (YM), apresenta-se com um rendimento um pouco maior, o meio que
tem fonte de carbono na foram de açucares e nitrogênio na forma de proteínas (Nutriente)
vem com uma produção um pouco maior que os anteriores. Mas os meios que realmente são
favoráveis a este fungo em questão, são os de origem natural sem aditivos, como CDB extrato
de malte, milho e arroz.
Destes últimos dois existe a possibilidade de se extrair óleos que já fazem parte da
constituição das sementes milho e arroz, podendo resultar em uma constatação errônea, mas
mesmo se utilizando dos dados do extrato sem a parte graxa, a produção é muito mais
significativa quando comparado aos outros meios de cultura líquidos, chegando a ser da
ordem de 3 vezes mais extrato. Seguindo neste raciocínio ainda podemos estar cometendo o
erro de desconsiderar e existência de uma produção metabólica de caráter apolar que pode ser
produzida pelo fungo. Exemplo disso foi a identificação dos ergosteróis (9) e (10) muito
encontrados em fermentados de fungos endofíticos.
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. _________________________________4 – Resultados e Discussões 73
Algumas considerações que podem ser feitas com relação à variação é que
aparentemente não houve uma grande alteração na produção de metabólitos secundários tendo
por base apenas os sinais de RMN de 1H característicos das pironas e ácidos pirenochaéticos.
Observando os cromatogramas pode-se constatar que em alguns casos ocorre uma
variação na quantidade de picos sugerindo uma maior variação metabólica.
Este estudo serviu para nos concluirmos que, tomando por base as análises realizadas
nesta triagem, este endofítico deva produzir estruturas com pelo menos os mesmos esqueletos
das substâncias já identificadas.
4.3 – Elucidação Estrutural das Substâncias Isoladas.
4.3.1 – Elucidação Estrutural das Substâncias Produzidas por Mc-8R.
4.3.1.1 – Identificação Estrutural da Citreopirona (Pirenocina A) (1).
A substância (1) foi submetida à análise por espectrometria de massas (Figura 93, p.
148), utilizando-se a técnica ESI-MS-MS (+) e apresentou o pico base m/z 209, referente à
formação do íon quasi molecular [M+H]+. A massa calculada foi de 208, sugerindo à fórmula
molecular C11H12O4.
O espectro de RMN de 1H (Tabela 9: p. 75, Figura 88, p. 143) mostrou um singleto em
δH 5,46 (1H, s, H-3), dois duplos quartetos em δH 6,30 (1H, dq, J= 1,6 e 15,5 Hz, H-10) e δH
6,78 (1H, dq, J = 6,9 e 15,5 Hz, H-11), característicos de hidrogênios olefínicos, onde a
constante de acoplamento de 15,5 Hz aponta para uma dupla ligação em trans. O
deslocamento observado em δH 1,95 (3H, dd, J= 1,6 e 6,9 Hz, H-12) refere-se à metila ligada
a insaturação. Estas posições são confirmadas pelas constantes de acoplamento e
multiplicidade características. O espectro apresentou ainda sinais de metoxila em δH 3,79 (3H,
s, H-8) e metila ligada a carbono olefínico em δH 2,16 (3H, s, H-7).
O espectro de RMN de 13C (Tabela 9: p. 75, Figura 89, p. 144) apresentou sinais em
161,5 (C-6), 114,0 (C-5), 133,1 (C-10), 147,2 (C-11), 168,7 (C-4) e 87,7 (C-3)
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. _________________________________4 – Resultados e Discussões 74
correspondentes aos carbonos olefínicos. O sinal observado em δC 163,0 (C-2) é característico
de carbonila de lactona e o sinal em δC 190,5 (C-9) característico de cetona α,β-insaturada. O
espectro de RMN de 13C apresentou ainda sinais em δC 18,5 (C-12) e δC 18,2 (C-7)
correspondentes aos carbonos metílicos.
Pela análise conjunta dos dados de RMN de 1H, 13C e os mapas de contorno gHMQC
(correlações diretas 1H x 13C - gHMQC - 1JCH) (Tabela 9: p. 75, Figura 90, p. 145) todos os
hidrogênios foram atribuídos aos respectivos átomos de carbono.
Os experimentos bidimensionais de gHMBC (Figura 91, p.146) a curta e longa
distância 2JCH, 3JCH e 4JCH, mostraram correlação entre a metoxila H-8↔C-3 e H-7↔C-6. O
hidrogênio desprotegido em δ 5,46 s H-3↔C-4/C-2 sugere um anel característico de pironas.
Uma análise adicional dos mapas de contorno bidimensionais de gHMBC (Figura 91,
p.146) evidenciou as correlações H-11↔C-12/C-9.
A correlação entre H-10 ↔ C-5 não foi observada nos experimentos de gHMBC, mas
um levantamento na literatura conduziu à estrutura da citreopirona (Pirenocina A), um
metabólito produzido por Penicillium citreo-viride B. (SHIZURI; KOSEMURA;
YAMAMURA, 1984) permitindo atribuir a estrutura (1) para a pirona em análise (Figura 11,
p.74).
Verificou-se que Pirenochaeta terrestris, também produz esta substância e apresenta
alta atividade citotóxica frente à germinação de alface (SATO; KONOMA; SAKAMURA,
1981) e atividade citotóxica frente girassol (TAL; ROBESON, 1986).
O
CH3
O
O
O
CH3
H3C
12
34
5
6
7
10119
12
8
Figura 11: Estrutura da Citreopirona (Pirenocina A) (1)
Correlação de gHMBC
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. _________________________________4 – Resultados e Discussões 75
Tabela 9: Dados de RMN de 1H e 13C da Pirenocina A (1) (CDCl3 a 11,7 T) Nº 1H ppm (multip. J= Hz) 13C (ppm) 2 163,0 3 5,46 (s) 87,7 4 - 168,7 5 - 114,0 6 - 161,5 7 2,16 (s) 18,2 8 3,79 (s) 56,3 9 - 190,5
10 6,30 (dq, 1,6/15,5) 133,1 11 6,78 (dq, 6,9/15,5) 147,2 12 1,95 (dd, 1,6/6,9) 18,5
4.3.1.2 – Identificação Estrutural da Pirenocina E (2).
A substância (2) foi submetida à análise por espectrometria de massas de baixa
resolução (Figura 99, p. 154) utilizando-se a técnica ESI-MS-MS (+) e apresentou o pico
base m/z 263 indicando a formação do aduto com sódio [M+Na]+ e o fragmento em 209 [M-
CH3O]+. A massa calculada foi de 240, sugerindo à fórmula molecular C12H16O5.
Os espectros de RMN de 1H e de 13C (Tabela 9: e Tabela 10: p. 75 e 76, Figura 88 e
Figura 89 (1) e Figura 94e Figura 95, (2), pgs. 143 e 144, 149 e 150), gHMQC (Figura 90 e
Figura 96 pgs. 145 e 151) e gHMBC (Figura 91 e Figura 97, pgs. 146 e 152) mostraram
muita semelhança entre (1) e (2) evidenciado o desaparecimento dos hidrogênios olefínicos
H-10 e H-11 e o aparecimento dos hidrogênios diastereotópicos α à carbonila em δH 2,72 (1H,
dd, J= 4,9 e δH 15,8 Hz, H-10) e δH 2,92 (1H, dd, J= 8,2 e 15,8 Hz, H-10) e uma metoxila
alifática em δH 3,26 (3H, s, H-13), indicando que a estrutura parcial B perdeu a conjugação.
A análise dos dados de 13C (Tabela 10: p. 76, Figura 95, p. 150) desta parte da
estrutura permitiu confirmar o desaparecimento dos carbonos olefínicos e o aparecimento dos
carbonos em δC 51,6 (C-10), 73,7 (C-11) e 56,1 (C-13) característicos de um carbono α
carbonílico, com influencia de desproteção e dos carbonos metínico e metílico, ambos ligado
a oxigênio.
As correlações observadas nos espectros de RMN de gHMBC (Figura 97, p. 152) a
curta e longa distância 2JCH e 3JCH, mostraram correlação entre H-13↔C-11 confirmando a
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. _________________________________4 – Resultados e Discussões 76
presença da metoxila em C-11. Esta informação possibilitou propor a estrutura para a
substância (2). Uma comparação com dados da literatura permitiu atribuir, sem ambigüidades,
a estrutura da pirona (2) como sendo a Pirenocina E (Figura 12, p. 76).
Uma pirona produzida por Penicillium waksmanii, e que apresentou atividade citotóxica
(AMAGATA, et al., 1998).
O
CH3
O
O
O
CH3
H3COCH3
13
1211
109
7
8
2
34
5
6
1 Figura 12: Estrutura da Pirenocina E (2)
Tabela 10: Dados de RMN de 1H e 13C da Pirenocina E (2) (CDCl3 a 11,7 T) Nº 1H (multip. J= Hz) 13C (ppm) 2 - 162,6 3 5,46 (s) 87,6 4 - 168,4 5 - 115,9 6 - 163,4 7 2,23 (s) 18,3 8 3,84 (s) 56,3 9 - 199,3
10 2,72 (dd, 4,9/15,8) 2,92 (dd, 8,2/15,8)
51,6
11 3,81 (tq 1,3/4,9/6,0/8,2) 73,7 12 1,18 (d, 6,0) 18,9 13 3,26 (s) 56,1
4.3.1.3 – Identificação Estrutural da Pirenocina B (3).
A substância (3) foi isolada em mistura com (1) e (2) devido a pouca quantidade de
material optamos pela determinação estrutural de (3) em mistura. Esta foi submetida à
espectrometria de massas de baixa resolução (Figura 104, p. 159), utilizando-se a técnica
ESI-MS-MS (+) e apresentou o pico base m/z 249 indicando a formação do aduto com sódio
[M+Na]+. A massa calculada foi de 226, sugerindo à fórmula molecular C11H12O4.
Comparação dos dados de RMN de 1H e 13C e gHMQC Tabela 11: p. 77, (Figura 94 e
Figura 95 (2), Figura 100 e Figura 101 (3), pgs. 149 e 150, 155 e 156) e gHMBC (Figura
Correlação de gHMBC
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. _________________________________4 – Resultados e Discussões 77
97 e Figura 102, pgs. 152 e 157) de (2) e (3) mostram muitas semelhanças entre as
substâncias (1) e (2). Entretanto, a diferença observada entre (2) e (3) ocorre com o
desaparecimento dos hidrogênios da metoxila em δH 3,26 (3H, s, H-13) e o deslocamento do
hidrogênio carbinólico em δH 3,81 (1H, qt, 1,3/4,9/6,0 e 8,2 Hz, H-11) de (2) para δH 4,01
(1H, m, H-11) de (3) evidenciando que ocorreu a desmetilação da hidroxila em C-11.
Uma comparação com dados da literatura permitiu atribuir sem ambigüidades a
estrutura da pirona (3) como sendo a Pirenocina B, uma pirona produzida por Penicillium
citreo-viride B e Pyrenochaeta terrestris (SHIZURI; KOSEMURA; YAMAMURA, 1984)
(Figura 13, p. 77). Esta substância apresentou atividade citotóxica ao girassol (TAL;
ROBESON, 1986).
O
CH 3
O
O
O
CH 3
H 3C OH
7
8
2
34
12111095
6
1 Figura 13: Estrutura da Pirenocina B (3)
Tabela 11: Dados de RMN de 1H e 13C da Pirenocina B (3) (DMSO-d6 a 11,7 T) Nº 1H (multip. J= Hz) 13C (ppm) 2 - 162,2 3 5,66 (s) 87,5 4 - 168,4 5 - 115,4 6 - 162,0 7 2,13 (s) 18,2 8 3,84 (s) 56,8 9 - 200,1
10 2.72 (d, 3,0) 2.74 (s) 53,4
11 4,01 (m) 63,4 12 1.08 (d, 6,2) 23,7
Correlação de gHMBC
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. _________________________________4 – Resultados e Discussões 78
4.3.1.4 – Identificação Estrutural do Ácido Pirenochaético C (4)
A substância (4) foi submetida à espectrometria de massas de baixa resolução (Figura
111, p. 166), utilizando-se a técnica ESI-MS (+) e apresentou o pico em m/z 259 (100%)
indicando a formação do aduto com sódio [M+Na]+ e o íon quasi molecular em 237 [M+H]+.
A massa calculada foi de 236, sugerindo à fórmula molecular C13H16O4.
O espectro de RMN de 1H (Tabela 12: p. 80, Figura 105, p. 160) apresentou sinais em
δH 3,81 (3H, s, H-11) e 2,15 (3H, s, H-12), característicos de metoxila e metila aromáticas
respectivamente, além de dois singletos em δH 7,38 (1H, s, H-2) e δH 7,42 (1H, s, H-6),
evidenciando a presença de um anel tetrasubstituído.
O espectro de RMN de 13C (Tabela 12: p. 80, Figura 106, p. 161) apresentou seis
carbonos aromáticos (quatro quaternários), três carbonos metílicos, sendo um ligado a
oxigênio, dois carbonos metilênicos, além de uma carbonila de cetona e outra de ácido
carboxílico.
Pela análise conjunta dos dados de RMN de 1H, 13C e os mapas de contorno gHMQC
(correlações diretas 1H x 13C - gHMQC - 1JCH) (Tabela 12: p. 80, Figura 107, p. 162), foi
possível atribuir todos os hidrogênios aos respectivos átomos de carbono.
Através das correlações observadas nos experimentos bidimensionais de gHMBC
(Tabela 12: p. 80, Figura 108, p. 163) a longa distância 2JCH e 3JCH, foi possível visualizar as
interações entre os hidrogênios aromáticos entre H-2↔C-6/C-13 e H-6↔C-2/C-5/C-12/C-13
e atribuir a estrutura parcial A para a substância (4) (Figura 14, p.79). A localização dos
substituintes no anel foi estabelecida com base nas informações obtidas no espectro
unidimensional de NOESY-1D (Tabela 12: p. 80, Figura 110, p. 165).
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. _________________________________4 – Resultados e Discussões 79
OCH3
CH3
O
HO6
5
4
32
1
11
1213
Figura 14: Estrutura parcial A para substância (4)
Uma análise adicional do mapa de contorno gHMBC (Figura 108, p. 163) evidenciou as
correlações a longa distância 2JCH e 3JCH de H-8↔ C-7/C-10/C-12, H-9↔ C-8/ C-7/C-10 e H-
10↔C-9/C-8. Observou-se ainda a mesma constante de acoplamento (7 Hz) entre os
hidrogênios H-8 e H-9 o que juntamente com as multiplicidades apresentadas permitiram
sugerir a estrutura parcial B (unidade não aromática) para a substância (4) (Figura 15, p. 79).
8
7 9
10CH3
O
Figura 15: Estrutura parcial B para substância (4)
A conexão entre as estruturas parciais A e B foi determinada com base nos
experimentos de NOESY-1D (Tabela 12: p. 80, Figura 110, p. 165), onde foi verificada a
interação espacial entre H-8↔H-10/H-9/H-12/H-11.
Estas informações, aliadas aos dados da literatura permitiu identificar a substância em
questão como sendo o ácido Pirenochaético C (4), também produzido pelo fungo
Pyrenochaeta terrestris (Figura 16, p. 79), e com alta atividade citotóxica frente à
germinação de alface (SATO; KONOMA; SAKAMURA, 1981).
CH3
OOCH3
CH3
O
HO8
7
65
43
2
1
9
10
11
1213
Figura 16: Estrutura do Ácido Pirenochaético C (4)
Correlação de gHMBC
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. _________________________________4 – Resultados e Discussões 80
Tabela 12: Dados de RMN de 1H, 13C, gHMBC e NOESY 1D do Ácido Pirenochaético C (4) (DMSO-d6 a 11,7 T). Nº 1H ppm (multip., J= Hz) 13C (ppm) gHMBC NOESY 1D 1 - 134,5 - 2 7,38 (s) 109,3 C-6/C-5/C-13 H-11 3 - 155,6 - 4 - - - 5 - 134,6 - 6 7,42 (s) 123,7 C-1/C-2/C-12/C-13 H-12 7 - 206,5 - 8 2,69 (t, 7,0) 45,4 C-7 / C-10 / C-12 H-9/H-10/H-11/H-12 9 1,58 (sex, 7,0) 16,4 C-7 / C-8/ C-10
10 0,90 (t, 7,0) 13,4 C-8/C-9 11 3,81 (s) 55,8 C-3 H-6 12 2,15 (s) 18,2 C-5/C-6 H-6/H-8 13 - 166,7 - 4.3.1.5 – Identificação Estrutural do Ácido Pirenochaético A (5).
A substância (5) foi submetida à espectrometria de massas de baixa resolução (Figura
117, p. 172), utilizando-se a técnica ESI-MS (+) e apresentou o pico base m/z 257 indicando a
formação do aduto [M+Na]+ e o íon pseudo molecular em 235 [M+H]+. A massa calculada foi
de 234 sugerindo à fórmula molecular C13H14O4.
As semelhanças observadas entre os dados de RMN de 1H e 13C (Tabela 13: p. 81,
Figura 105 e Figura 106 (4), Figura 112 e Figura 113 (5), pgs. 160 e 161, 167 e 168),
gHMQC (Figura 107 e Figura 114, pgs. 162 e 169) e gHMBC (Figura 108 e Figura 115,
pgs. 163 e 170) de (4) e (5) apontam para a mesma estrutura parcial A (Figura 14, p.79).
Entretanto, observa-se o aparecimento de dois duplos dubletos em δH 6,35 (1H, dq, J= 1,5 e
15,5 Hz, H-8) e δH 6,55 (1H, dq, J= 7,0 e 15,5 Hz, H-9), característicos de hidrogênios
olefínicos, e constante de acoplamento (J= 15,5 Hz) correspondente a dupla ligação em trans
na unidade não aromática, sugerindo a estrutura parcial B (Figura 17, p. 80).
O
78
910
Figura 17: Estrutura parcial B para a substância (5)
Comparação com dados da literatura permitiu atribuir à estrutura de (5) como sendo o
Ácido Pirenochaético A (Figura 18, p. 81), também produzido por Pyrenochaeta terrestris e
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. _________________________________4 – Resultados e Discussões 81
apresentando uma alta atividade citotóxica frente à germinação de alface (SATO; KONOMA;
SAKAMURA, 1981).
CH3
OOCH3
CH3
O
HO8
7
65
4
32
1
9
10
11
1213
Figura 18: Estrutura do Ácido Pirenochaético A (5)
4.3.1.6 – Identificação Estrutural do Ácido Pirenochaético B (6)
O espectro de massas de (6) (Figura 123, p. 178), foi obtido utilizando-se a técnica ESI-
MS (+) em baixa resolução, apresentou o pico em m/z 275 indicando a formação do aduto
[M+Na]+. A massa calculada foi de 252, sugerindo à fómula molecular (C13H16O5)
As semelhanças observadas entre os dados de RMN de 1H e 13C (Tabela 13: p. 81,
Figura 112 e Figura 113 (5), Figura 118 e Figura 119 (6), pgs. 167 e 168, 173 e 174),
gHMQC (Figura 114 e Figura 120 pgs. 169 e 175) e gHMBC (Figura 115 e Figura 121
pgs. 170 e 176) de (5) e (6) apontam para a mesma estrutura parcial (A). Entretanto, na
unidade não aromática, observa-se o desaparecimento dos hidrogênios olefínicos H-8 e H-9 e
o aparecimento de um carbono carbinólico em δC 62,8 (C-9) que desloca o valor da metila C-
10 para δC 23,7. De acordo com estas considerações e análise dos experimentos
bidimensionais de gHMBC (Figura 121 p. 176), foi possível determinar a estrutura parcial B
para a substância (6) (Figura 19, p. 81).
O OH
7 8 9 10 Figura 19: Estrutura parcial B para a substância (6)
Correlação de gHMBC
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. _________________________________4 – Resultados e Discussões 82
Tabela 13: Dados de RMN de 1H e 13C dos Ácidos Pirenochaéticos A, B, 7 e 8 (DMSO-d6 e CDCl3, a 11,7 T)
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. _________________________________4 – Resultados e Discussões 83
Apesar da conexão das estruturas parciais A e B não serem visualizada nos
experimentos de gHMBC, um levantamento na literatura, para a substância (6) pode-se
identificá-la como Ácido Pirenochaético B (Figura 20, p. 83), também produzido pelo
fitopatógeno Pyrenochaeta terrestris, com alta atividade citotóxica frente à germinação de
alface (SATO; KONOMA; SAKAMURA, 1981)
CH3
OOCH3
CH3
O
HO
O H
8
7
65
4
32
1
9
1 0
11
1 21 3
Figura 20: Estrutura do Ácido Pirenochaético B (6)
4.3.1.7 – Elucidação Estrutural do Ácido Pirenochaético (7)
O espectro de massas de (7) foi obtido utilizando-se a técnica ESI-MS (+) em alta
resolução (Figura 129, p. 184), apresentou o pico base em m/z 275,0894 correspondendo ao
aduto com sódio [M+Na]+, o pico em 235,097 correspondendo à perda de água [M-H2O+H]+.
A massa calculada foi de 252,0997 sugerindo a fórmula molecular (C13H16O5).
As semelhanças observadas entre os dados de RMN de 1H e 13C (Tabela 13: p. 81,
Figura 118 e Figura 119 (6), Figura 124 e Figura 125 (7), pgs. 173 e 174, 179 e 180),
gHMQC (Figura 120 e Figura 126, pgs. 175 e 181) e gHMBC (Figura 121 e Figura 127,
pgs. 176 e 182 de (6) e (7) apontam para a mesma estrutura parcial A (Figura 14, p.79).
Entretanto, na unidade não aromática, observa-se o aparecimento do sinal em δH 1,71 (2H,
dddd, J= 6,0/6,5/7,3 e 14,3 Hz, H-9) referente aos hidrogênios metilênicos H-9. Observou-se
ainda o desaparecimento da metila terminal. O espectro de 13C observa-se a desproteção do
carbono em δC 59,9 (C-10), sugerindo o aparecimento de uma hidroxila nesta posição. A
análise do espectro de gCOSY (Figura 128, p. 183), revelou a correlação do hidrogênio H-
9↔H-8/H-10, possibilitando sugerir uma nova estrutura parcial B (Figura 21, p. 84).
Correlação de gHMBC
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. _________________________________4 – Resultados e Discussões 84
OH
O
7 8 9
Figura 21: Estrutura parcial B para a substância (7)
A substância (7) foi identificada como sendo um Ácido Pirenochaético de estrutura
ainda não descrita, através da análise dos dados espectrométricos e comparação com similares
da literatura (SATO; KONOMA; SAKAMURA, 1981), pôde-se atribuir a estrutura da
substância (7) (Figura 22, p. 84). Esta apresentou forte atividade biológica frente aos fungos
fitopatogênicos Cladosporium cladosporioides e C. sphaerospermum e atividade inibidora da
acetilcolinesterase. O levantamento bibliográfico foi realizado utilizando-se o sistema
SciFinder Scholar na data de 10 de Agosto de 2007.
OOCH3
CH3
O
HO
OH8
7
65
4
32
1
9
10
11
1213
Figura 22: Estrutura da substância (7)
4.3.1.8 – Elucidação Estrutural do Ácido Pirenochaético (8)
A substância (8) foi identificada através da análise dos dados espectrométricos e
comparação com similares da literatura (SATO; KONOMA; SAKAMURA, 1981), como
sendo um Ácido Pirenochaético também de estrutura desconhecida, com fórmula molecular
C12H14O4, sugerida pelo espectro de massas de alta resolução, obtido pela técnica ESI-MS (+)
(Figura 135, p. 190), que apresentou o pico com m/z 262,035, sugerindo ser a molécula com
seu hidrogênio ácido trocado por deutério proveniente do solvente deuterado nos
experimentos de RMN formando o aduto com potássio [M+K]+.
As semelhanças observadas entre os dados de RMN de 1H e 13C (Tabela 13: p. 81,
Figura 105 e Figura 106 (4), Figura 130 e Figura 131 (8), pgs. 160 e 161, 185 e 186),
Correlação de gHMBC
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. _________________________________4 – Resultados e Discussões 85
gHMQC (Figura 107 e Figura 132, pgs 162 e 187) e gHMBC (Figura 108 e Figura 133,
pgs. 163 e 188) de (4) e (8) apontam para a mesma estrutura parcial A (Figura 14, p.79).
Entretanto, na região não aromática, observa-se o desaparecimento da metila em δC 13,4 (C-
10) de (4) e o surgimento de uma metila protegida em δC 7,0 (C-9) sugerindo que esta se
encontra em posição β à cetona. Observou-se ainda a desproteção do carbono C-8 em δC 29,8
(C-8), evidenciando sua posição α à carbonila. No espectro de gCOSY (Figura 134, p. 189)
observou-se apenas uma correlação entre H-8↔H-9 confirmando as observações acima. De
acordo com estas considerações foi possível propor a estrutura parcial B visualizada abaixo na
Figura 23, p. 85.
O
7 8 9
Figura 23: Estrutura parcial B para a substância (8)
Comparação com dados da literatura (SATO, 1981) permitiu identificar a substância (8)
(Figura 24, 85) como sendo um Ácido Pirenochaético de estrutura ainda não descrita e
similar a do Ácido pirenochaético C (4). A substância (8) também apresentou uma forte
atividade biológica frente os fungos fitopatogênicos Cladosporium cladosporioides e C.
sphaerospermum e atividade inibidora da acetilcolinesterase. O levantamento bibliográfico foi
realizado utilizando-se o sistema SciFinder Scholar na data de 10 de agosto de 2007.
OOCH3
CH3
O
HO8
7
65
4
32
1
9
10
1112
Figura 24: Estrutura da substância (8)
Correlação de gHMBC
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. _________________________________4 – Resultados e Discussões 86
4.3.1.9 – Identificação Estrutural de Ergosterol (9)
O espectro de RMN de 1H de (9) (Figura 136, p. 191) apresenta sinais de hidrogênios
alifáticos, metílicos, carbinólicos. No espectro de RMN de 13C (Tabela 14: p. 87, Figura 137,
p. 192) foi possível observar a presença de 28 átomos de carbono. A comparação dos dados
da literatura (SHIRANE, et al., 1996) com os dados de RMN de 1H e 13C da substância (9)
sugeriu tratar-se do ergosterol, um esteróide comum em fungos (Figura 25, p. 87).
No espectro de RMN de 13C (Tabela 14: p. 87, Figura 137, p. 192) foram observados
seis carbonos olefínicos em δC 139,8 (C-5), 119,6 (C-6), 116,3 (C-7), 141,3 (C-8), 135,6 (C-
22) e 132,0 (C-23) e um carbinólico em δC 70,4, (C-3).
No espectro de RMN de 1H, (Figura 136, p. 191) foram observados sinais de metilas,
hidrogênios carbinólicos e olefínicos. O multipleto em δH 3,62 (1H, m, H-3) foi atribuído ao
hidrogênio carbinólico, um duplo dubleto em δH 5,55 (1H, dd, J= 2,3 e 5,6 Hz, H-7) e um
multipleto em δH 5,33 (1H, m, H-6) pertencentes dos hidrogênios olefínicos do dieno e um
duplo quarteto em δH 5,19 (2H, dq, 7,0/7,7 e 15,5 Hz) pertence aos hidrogênios do sistema
olefínico H-22 e H-23.
Na região entre δH 0,5-1,0 observa-se a presença de dois singletos e quatro dubletos,
sendo que dois destes coalescem se apresentando como um tripleto com constantes de
acoplamento diferentes. Os singletos foram atribuídos aos hidrogênios metílicos H-18 e H-19
em δH 0,93 (3H, s) e 0,62 (3H, s), respectivamente; os dubletos que coalescenram estão em δH
0,81-0,82 (3H, d, J= 7,1 Hz, H-26), 0,82-0,83 (J= 6,9 Hz H-27) e os dubletos em δH 1,02
(3H, d, J= 6,6 Hz, H-28) e δH 0,90 (3H, d, J= 6,8 Hz, H-21) foram atribuídos aos hidrogênios
metílicos H-28 e H-21 respectivamente (SHIRANE, et al., 1996).
Os valores dos deslocamentos químicos dos átomos de carbono do ergosterol
encontram-se na Tabela 14: p. 87 esta substância é muito comum em fungos e segundo
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. _________________________________4 – Resultados e Discussões 87
SUBBIAH; ABPLANALP, 2003 o ergosterol tem atividade inibidora de células cancerígenas
em ensaios realizados “in vitro”.
HO
HH1
2
34
5
6
7
8
9
10
1112
13
14 1516
17
18
19
2122
23 2425
26
27
28
20
Figura 25: Estrutura da do Ergosterol (9)
Tabela 14: Dados de RMN de 13C do Ergosterol (9) (CDCl3 a 11,7 T) e dados de RMN de 13C literatura para o Ergosterol (SHIRANE, et al., 1996).
N° (9) 13C (ppm)
(SHIRANE, et al.., 1996) 13C (ppm) N° (9) 13C
(ppm) (SHIRANE, et al., 1996) 13C
(ppm) 1 38,4 38,3 15 23,0 23,0 2 31,9 32,0 16 28,3 28,2 3 70,4 70,4 17 55,7 55,7 4 40,7 40,8 18 12,0 12,0 5 139,8 139,8 19 16,3 16,2 6 119,6 119,6 20 40,4 40,4 7 116,3 116,3 21 21,1 21,1 8 141,3 141,3 22 135,6 135,5 9 46,3 46,2 23 132,0 132,0
10 37,0 37,0 24 42,8 42,8 11 21,1 21,1 25 33,0 33,1 12 39,1 39,1 26 19,9 19,9 13 42,8 42,8 27 19,6 19,6 14 54,6 54,5 28 17,6 17,6
4.3.1.10 – Identificação Estrutural do Peróxido de Ergosterol (10)
O espectro de RMN de 1H de (10) (Tabela 15: p. 88, Figura 138, p. 193) apresenta
sinais de hidrogênios alifáticos, metílicos, carbinólicos e vinílicos. A presença de um duplo
duplo duplo dubleto em δH 3,96 (1H, dddd, J= 5,1/6,5/11,0 e 11,5 Hz, H-3), evidencia o
hidrogênio metínico carbinólico. Os dois dubletos em δH 6,23 (1H, d, J= 8,5 Hz, H-6) e δH
6,48 (1H, d, J= 8,5 Hz, H-7) apresentam constantes de acoplamento característica de dupla
ligação em cis, enquanto os dois duplos dubletos em δH 5,21(1H, dd, J= 7,5 e 15,6 Hz, H-22)
e 5,14 (1H, dd, J= 8,1 e 15,6 Hz, H-23), apresentam constantes de acoplamento característica
de dupla ligação em trans. Na região entre δH 0,75-1,10 pode-se observar a presença de dois
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. _________________________________4 – Resultados e Discussões 88
singletos e quatro dubletos. Os singletos em δH 0,87 (3H, s, H-18) e 0,81 (3H, s, H-19) e os
dubletos em δH 0,90 (3H, d, J= 6,8 Hz, H-21), 0,80-0,81 (3H, d, J= 6,8 Hz, H-26), 0,82-0,83
(J= 6,8 Hz, H-27) e 1,02 (3H, d, J= 6,6 Hz, H-28), foram atribuídos aos hidrogênios metílicos
No espectro de RMN de 13C (Tabela 15: p. 88, Figura 139, p. 194) foi possível
observar 28 átomos de carbono, sendo que quatro são olefínicos δC 135,2 (C-6), 130,7 (C-7),
135,4 (C-22) e 132,3 (C-23) e três carbinólicos δC 70,4 (C-3), 82,1 (C-5) e 79,4 (C-8).
Comparação dos dados da literatura (YUE, et al, 2001) com todos os valores
encontrados no espectro de RMN de 1H e 13C da substância 10, sugeriu tratar-se do Peróxido
de Ergosterol (Figura 26, p. 88), um esteróide comum em fungos (SUBBIAH;
ABPLANALP, 2003) e com atividade inibidora de células cancerígenas em ensaios realizados
“in vitro”.
HO
O
O
12
34
5
67
8
9
10
1112
13
14 1516
17
18
19
21
22
2324
2526
27
2820
Figura 26: Estrutura do Peróxido de Ergosterol (10)
Tabela 15: Dados de RMN de 13C do Peróxido de Ergosterol (10) (CDCl3 a 11,7 T) e dados de RMN de 13C literatura para o Peróxido de Ergosterol (YUE, J. M. et al, 2001)
N° 1H ppm (multip., J=
Hz) (10) 13C (ppm)
YUE, J. M. et al, 2001 13C (ppm)
N° 1H ppm (multip., J=
Hz) (10) 13C (ppm)
YUE, J. M. et al, 2001 13C (ppm)
1 30,1 30,2 15 1,48 (m) 23,4 23,4 2 1,67 (m) 34,7 34,8 16 1,31 (m) 28,6 28,6
3 3,96 (oct, 5,1/6,5/11,0/11,5) 66,5 66,5 17 1,20 (m) 56,3 56,3
4 1,21 (m) 39,4 39,4 18 0,81 (s) 12,9 12,9 5 - 82,1 82,1 19 0,87 (s) 18,2 18,2 6 6,23 (d, 8,5) 135,2 135,2 20 1,92 (m) 39,7 39,6 7 6,48 (d, 8,5) 130,7 130,8 21 0,90 (d, 6,9) 20,9 20,9 8 - 79,4 79,4 22 5,21 (dd, 7,5, 15,6) 135,4 135,4 9 1,47 (m) 51,1 51,2 23 5,14 (dd, 8,1, 15,6) 132,3 132,4
10 - 37,0 37,0 24 1,83 (m) 42,8 42,8 11 0,98 (d, 6,6) 20,6 20,7 25 2,30 (m) 33,1 33,1 12 2,0 (m) 36,9 37,03 26 0,80 (d, 6,8) 19,6 19,6 13 - 44,6 44,6 27 0,82 (d, 6,8) 19,9 19,9 14 1,57 (m) 51,7 51,8 28 1,00 (d, 6,6) 17,5 17,6
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. _________________________________4 – Resultados e Discussões 89
4.3.2 – Elucidação Estrutural das Substâncias Produzidas por Mc-7F
4.3.2.1 – Identificação Estrutural da Uracila (11)
O espectro de RMN de 1H de (11) (Tabela 16: p. 89, Figura 142, p. 197) apresentou
apenas dois sinais em δH 5,43 (1H, d, J= 7,5 Hz, H-5), e 7,35 (1H, d, J= 7,5 Hz, H-6).
A grande diferença de deslocamento químico observado para estes dois hidrogênios
sugere que estejam em vizinhança química muito diferenciada, como em hidrogênios
localizados nas posições α,β de uma carbonila α,β insaturada, com constantes de
acoplamento características de uma dupla ligação em cis.
O espectro de RMN de 13C (Tabela 16: p. 89, Figura 143, p. 198) observados sinais em
δC 151,5 (C-2), 164,3 (C-4), 100,2 (C-5) e 142,1 (C-6) destes, dois são quaternários e dois
metínicos.
Pela análise conjunta dos dados de RMN de 1H, 13C e os mapas de contorno gHMQC
(correlações diretas 1H x 13C - gHMQC - 1JCH), (Tabela 16: p. 89, Figura 144, p. 199), foi
possível atribuir todos os hidrogênios aos respectivos átomos de carbono.
Através dos mapas de contorno dos experimentos de gHMBC (Figura 145, p. 200),
onde foi possível visualizar as correlações a curta e longa distância 2JCH e 3JCH entre H-5↔C-
4/C-6 e H-6↔C-2/C-4, comparação com dados da literatura (BLICHARSKA; KUPKA, 2002)
permitiu atribuir para a substância (11) a estrutura da uracila (Figura 27, p. 89). Existe uma
vasta literatura sobre atividades biológicas da uracila, mas sempre associada a outras
moléculas como açúcares, aminoácidos, proteínas etc. Nos ensaios biológicos realizados não
foi detectada nenhuma atividade.
N
N
O
O1 2
34
5
6
Figura 27: Estrutura da Uracila (11)
Tabela 16: Dados de RMN de 1H, 13C, gHMBC e gCOSY da Uracila (11) (DMSO-d6 a 11,7 T) Nº 1H ppm (multip., J= Hz) 13C gHMBC gCOSY
NH-1 10,95 (s) 2 151,5
NH-3 10,79 (s) 4 164,3 5 5,43 (d, 7,5) 100,2 C-4/C-6 H-6 6 7,35 (d, 7,5) 142,1 C-2/C-4/C-5 H-5
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. _________________________________4 – Resultados e Discussões 90
4.3.2.2 – Identificação Estrutural do ciclo-(S*-Pro-S*-Tyr) (12)
O espectro de RMN de 1H de (12) (Tabela 17: p. 92, Figura 147, p. 202) apresentou
dois dubletos em δH 7,03 (2H, d, J= 8,1 Hz, H-2’) e 6,62 (2H, d, J= 8,3 Hz, H3’) indicando
um sistema de anel aromático para-dissubstituído. A presença do sinal em δC 155,8 (C-4’).
No espectro de RMN de 13C (Tabela 17: p. 92, Figura 148, p. 203) indicou a presença de um
grupo (–OH) ligado a carbono do anel aromático, evidenciando a presença do resíduo do
aminoácido Tirosina (Tyr). O espectro de gCOSY (Figura 151, p. 206) apresentou
correlações entre os hidrogênios benzílicos H-10↔H-9 (δH 2,94 e 4,23), demonstra a
possibilidade da presença da unidade de Tyr. Considerando que os hidrogênios H-10 são
diastereotópicos, a multiplicidade esperada seria de dois duplos dubletos o que é visualizado
no espectro de RMN de 1H (Tabela 17: p. 92, Figura 147, p. 202), tal fato é suportado pela
observação em gHMQC duas correlações para este mesmo valor de carbono.
O espectro de RMN de 13C (Tabela 17: p. 92, Figura 148, p. 203) apresentou sinais em
δC 165,0 (C-1) e 168,0 (C-7) indicando os grupos (CONH), que aliado aos deslocamentos
químicos de RMN de 1H em δH 4,03 (1H, ddl, J= 6,4 e 9,3 Hz, H-6) e 4,23 (1H, t, J= 4,2 Hz,
H-9) conduziram a presença de um anel dicetopiperazínico (JAYATILAKE, et al., 1996)
Análise detalhada dos experimentos de RMN de 1H, 13C, gHMQC, gCOSY e gHMBC
(Figura 147 a Figura 150, pgs.202 a 205) evidenciaram a presença do resíduo Prolina (Pro)
nesta molécula (JAYATILAKE, H. et al., 1996).
A analise dos mapas de contorno gHMQC de (12) permitiu atribuir os hidrogênios aos
respectivos átomos de carbono (Tabela 17: p. 92,Figura 149, p. 204).
O sinal em δH 7,78 (s) no experimento de RMN de 1H foi atribuído ao (NH-8) uma vez
que não apresentou correlação direta com o átomo de carbono em gHMQC, mas mostra
correlação a longa distância por gHMBC com C-6 (δC 58,3) e C-1 (δC 165,0)
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. _________________________________4 – Resultados e Discussões 91
A configuração relativa de (12) foi atribuída com base na interação espacial observada
no experimento de NOESY-1D (Tabela 17: p. 92, Figura 152, p. 207), entre H-6↔H-9
colocando-os no mesmo plano da molécula.
O espectro de massas de baixa resolução (Figura 153, p. 208), obtido através da técnica
ESI-MS (+) apresentou o íon m/z 283, correspondente ao aduto [M+Na]+ e o íon quasi
molecular m/z 261, [M+H]+. A massa calculada foi de 260, sugerindo à fórmula molecular
C14H16N2O3.
Os dados espectrais foram comparados com a literatura (JAYATILAKE, H. et al., 1996)
e permitiram identificar a substância (12) como ciclo-(S-Pro-S-Tyr). Esta substância é
relatada como metabólito de diversos fungos e bactérias como por ex., Pseudomonas
aeruginosa, uma bactéria associada à esponja marinha Isodictya seteira (JAYATILAKE, et
al., 1996). Os ensaios biológicos realizados apontam para uma atividade inibidora da
acetilcolinesterase, mas sem atividade observada frente aos fungos fitopatogênicos.
N
N
O
O
OHH
H
123
45 6
78
9
101'
2'
3'
4'5'
6'
Figura 28: Estrutura ciclo-(S*-Pro-S*-Tyr) substância (12)
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. _________________________________4 – Resultados e Discussões 92
Tabela 17: Dados de RMN de 1H, 13C, gHMBC e NOESY 1D da ciclo-(S*-Pro-S*-Tyr) (12) (DMSO-d6 a 11,7 T).
Nº 1H ppm (multip., J= Hz) 13C gHMBC NOESY 1D 1 - 165,0 3 3,24 (qui, 5,7/6,5/11,5)
3,40 (dt, 8,0/11,5) 44,5 C-4
4 1,70 (m) 21,8 C-3/C-5 5 1,40 (sext, 9,3/9,7/11,0/12,5)
1,99 (sext, 5,1/6,3/6,4/12,5) 27,8 C-3
6 4,03 (ddl, 6,4/9,3) 58,3 C-5/C-7 H-5/H4//H-9 7 - 168,8 - 9 4,23 (tl, 4,5) 56,0 C-10/C-1’/C-1 H-10/H-6/H2’/NH-8
10 2,90 (dd, 4,5/14,0) 2,94 (dd, 4,5/14,0)
34,7 C-9/C-2’/C-1’/C-1
1’ - 127,0 2’ 7,03 (d, 8,1) 130,7 C-4’/C-6’/C-3’e 5’/C-10 3’ 6,62 (d, 8,3) 114,7 C-1’/C-4’ 4’ - 155,8 5’ 6,62 (d, 8,3 Hz) 114,7 C-1’/C-4’ 6’ 7,03 (d, 8,1Hz) 130,7 C4’/C-2’/C-3’e 5’/C-10
NH-8 7,78 (s) C-6 4.3.2.3 – Identificação Estrutural do ciclo-(S*-Pro-S*-Val) (13)
A substância (13) foi submetida á análise detalhada dos espectros de RMN de 1H e 13C
(uni e bidimensionais) e os hidrogênios foram atribuídos aos respectivos átomos de carbono
pela análise de gHMQC (Figura 156, p. 211).
A análise dos espectros de RMN de 1H e 13C mostrou a presença de dois hidrogênios
em δH 4,10 (δC 58,2; 1H, tl, J= 7,5 Hz, H-6) e δH 3,89 (δC 59,4; 1H, sl, H-9) e duas carbonilas
em δC 165,1 e 170,1 característicos de anel dicetopiperazínico.
A presença de três multipletos (3,33; 3,40 e 1,75-1,85) referentes aos hidrogênios
metilênicos, observados no espectro de RMN de 1H (Tabela 18: p. 94, Figura 154, p. 209),
aliado as correlações em gCOSY (Figura 158, p. 213) entre H-3↔H-4↔H-5 indicaram a
presença do resíduo de aminoácido Prolina na estrutura (FDHILA et al., 2003).
O espectro de RMN de 1H (Tabela 18: p. 94, Figura 154, p. 209) apresentou ainda
dois dubletos em δH 0,84 (3H, d, J= 6,7 Hz) e 1,00 (3H, d, J= 7,2 Hz), que foram atribuídos
aos hidrogênios metílicos (H-11 e H-12) em multipleto em δH 2,30-2,36 (m, H-10) que foi
atribuído a H-10. O espectro de gCOSY (Figura 158, p. 213), mostrou correlação dos
hidrogênios metílicos (H-11 e H-12) com um hidrogênio metínico em δH 2,30-2,36 (m, H-10;
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. _________________________________4 – Resultados e Discussões 93
δC 27,7) e evidenciou uma unidade isopropila , indicando o aminoácido Valina como um dos
componentes desta substância (13).
A ausência de correlação gHMQC (Figura 156, p. 211) do sinal em δH 7,91,
evidenciou que este hidrogênio esteja ligado a átomos de nitrogênio ou oxigênio.
As correlações a longa distância observadas em gHMBC (Tabela 18: p. 94, Figura 157, p.
212) de δH 7,91 com os carbonos em δC-6 58,2 e δC-7 165,1, permitiram atribuir este
deslocamento ao (NH-8).
Baseando-se nos espectros e nas correlações e nas correlações observadas nos
experimentos uni e bidimensionais, foi proposto que a substância (13) é uma dicetopiperazína
constituída pelos aminoácidos Prolina (Pro) e Valina (Val).
A configuração relativa de (13) foi determinada pela análise do espectro de NOESY-
1D (Tabela 18: p. 94, Figura 159, p. 214) onde foi observada a interação espacial entre os
hidrogênios H-9↔H-6 colocando-os no mesmo plano espacial da molécula. Comparação com
dados da literatura (FDHILA, et al., 2003), confirmou esta proposta.
O espectro de massas de baixa resolução ESI-MS (+) (Figura 160, p. 215), apresentou o
pico do íon pseudo molecular com m/z 197 [M+H]+ e pico em m/z 219, correspondente a
formação do aduto com sódio [M+Na]+. A massa calculada foi de 196, sugerindo à fórmula
molecular C10H16N2O2 estão coerentes com a estrutura proposta (Figura 29, p. 93)
confirmando.
12
34
5 67
8
9N
NH
O
O
H
H
10
11
12
Figura 29: Estrutura da ciclo-(S*-Pro-S*-Val) para substância (13)
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. _________________________________4 – Resultados e Discussões 94
Há relato (GARCIA-PAJÓN; COLLADO, 2003) da produção deste metabólito pelo
fungo Colletotrichum gloeosporioides exatamente o mesmo fungo de onde foi isolada esta
substância, e por outros fungos deste gênero. Esta substância é relatada como fitotóxica e
como um bioerbicida em potencial. Nossos ensaios biológicos apontam para uma atividade
inibidora da acetilcolinesterase e uma atividade mediana frente aos fungos fitopatogênicos C.
cladosporioides e C. sphaerospermum.
Tabela 18: Dados de RMN de 1H, 13C, gHMBC e NOESY 1D da ciclo-(S*-Pro-S*-Val) (13) (DMSO-d6 a 11,7 T)
Nº 1H ppm (multip., J= Hz) 13C ppm gHMBC NOESY 1D 1 - 170,1 - 3 3,33 (m)
3,40 (m) 44,5 C-4/C-5/C-6
4 1,75-1,85 (m) 22,0 C-5/C-3/C-6 5 1,75-1,85 (m) 27,8 C-4/C-3/C-6 6 4,10 (tl, 7,5) 58,2 C-5/C-1 3,89/2,10 7 - 165,1 - 9 3,89 (sl) 59,4 C-12/C-10/C-7 4,10/2,30/1,00/0,84
10 2,10-2,15 (m) 2,30-2,36 (m)
27,7 C-12/C-11/C-1
11 1,00 (d, 7,2) 18,2 C-12/C-10/C-9 12 0,84 (d, 6,7) 16,4 C-11/C-10/C-9
NH-8 7,90 C-6/C-7
4.3.2.4 – Identificação Estrutural de Ácido-(2-Amino-fenil)-acético (14)
A substância (14) foi submetida à espectrometria de massas (Figura 166, p. 221),
utilizando-se a técnica ESI-MS (+) e apresentou o pico base m/z 107 indicando a formação do
fragmento [M+H-CO2]+. A massa calculada foi de 151, sugerindo à fórmula molecular
C8H9NO2.
O espectro de RMN de 1H (Tabela 19: p. 95, Figura 161, p. 216) apresentou dois duplo
tripletos em δH 7,15 (1H dt, J= 7,7 e 1,1 Hz, H-4) e 6,89 (1H, dt, J= 7,5 e 0,7 Hz, H-5),
característico de sistema aromático orto substituído, ainda nesta região do espectro apresentou
dois dubletos em δH 7,28 (1H, d, J= 7,4 Hz, H-3) e 6,75 (1H, d, J= 7,8 Hz, H-6) confirmando
a existência do sistema aromático. Foi observado também um sinal em δH 2,73 (2H, d, J=
15,0 Hz H-7), característico de grupo metilênico vizinho a carbonos quaternários.
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. _________________________________4 – Resultados e Discussões 95
O espectro de RMN de 13C (Tabela 19: p. 95, Figura 162, p. 217) apresentou um
sinal em δC 178,2 (C-8) característico de carbonila ácida, e sinais dos carbonos aromáticos em
δC 134,0 (C-1), 142,2 (C-2), 123,8 (C-3), 128,7 (C-4), 121,1 (C-5), e 109,2 (C-6). O espectro
mostrou ainda um sinal em δC 41,8 (C-7) característico de carbono benzílico α carbonílico.
Pela análise conjunta dos dados de RMN de 1H, 13C e os mapas de contorno gHMQC
(correlações diretas 1H x 13C - gHMQC - 1JCH), (Tabela 19: p. 95), pudemos atribuir todos os
hidrogênios aos respectivos átomos de carbono.
Através dos experimentos bidimensionais de gHMBC (Tabela 19: p. 95, Figura 164,
p. 219) foi possível visualizar as correlações a curta e longa distância 2JCH e 3JCH entre H-
3↔C-2/C-4, H-4↔C-3/C-2, H-5↔C-1/C-6, H-6↔C-1/C-5 e H-7↔C-8. Estes dados aliados
aos deslocamentos dos carbonos e hidrogênios permitiram propor a estrutura da substância
(14) como sendo o Ácido-(2-Amino-fenil)-acético (Figura 30, p. 95). Nenhum relato de
atividade biológica foi encontrado na literatura, sendo que em nossos ensaios também não foi
observada nenhuma atividade frente aos fungos patogênicos, mas a apresentou atividade
inibidora da acetilcolinesterase.
NH2
OH
O1
23
45
6
78
Figura 30: Estrutura da Ácido-(2-Amino-fenil)-acético para substância (14)
Tabela 19: Dados de RMN de 1H, 13C e gHMBC Ácido-(2-Amino-fenil)-acético (14) (DMSO-d6 a 11,7 T). Nº 1H ppm (multip., J= Hz) 13C, ppm gHMBC 1 134,0 2 - 142,2 3 7,28 (d, 7,4) 123,8 C-2/C-4 4 7,15 (ddd, 7,6/7,8/1,1) 128,7 C-2/C-3 5 6,89 (ddd, 7,4/7,6/0,7) 121,1 C-1/C-6 6 6,75 (d, 7,8) 109,2 C-1/C-5 7 2,73 (d, 15,0) 41,8 C-8 8 178,2
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. _________________________________4 – Resultados e Discussões 96
4.3.2.5 – Identificação Estrutural de Ácido-(4-Hidroxi-fenil)-acético (15)
A substância (15) foi submetida à espectrometria de massas baixa resolução (Figura
172, p 227), utilizando-se a técnica ESI-MS (+) e apresentou o pico com m/z 175,
correspondente ao aduto com sódio [M+Na]+, o pico em 197 (100%) pode corresponder a
troca do hidrogênio ácido por sódio apresentando-se como um sal sódico formando aduto com
sódio [NaM+Na]+. A massa calculada foi de 152 sugerindo a fórmula molecular C8H8O3.
O espectro de RMN de 1H (Tabela 20: p. 97, Figura 167, p. 222) apresentou dois
dubletos em 7,02 (2H, d, J= 8,5 Hz, H-2/H-6) e 6,68 (2H, d, J= 8,5 Hz, H-3/5),
característicos de sistema aromático para-substituído. O espectro apresentou ainda um
singleto em δH 3,40 (s) que foi atribuído a um metileno benzilico com ajuda do experimento
de DEPT (Figura 169, p. 224)
O espectro de RMN de 13C (Tabela 20: p. 97, Figura 168, p. 223), apresentou um
sinal em δC 156,0 (C-4) característico de carbono fenólico, dois sinais em δC 130,2 (C-2/6) e
δC 115,1 (C-3/5) atribuídos a dois carbonos metínico sp2 e uma carbonila em δC 173,2 que foi
visualizada no experimento de gHMBC (Tabela 20: p. 97, Figura 171, p. 226).
Pela análise conjunta dos dados de RMN de 1H, 13C e os mapas de contorno gHMQC
(correlações diretas 1H x 13C - gHMQC - 1JCH), (Tabela 20: p. 97, Figura 170, p. 225), foi
possível atribuir todos os hidrogênios aos respectivos átomos de carbono.
As correlações observadas nos experimentos bidimensionais de gHMBC (Tabela 20:
p. 97, Figura 171, p. 226), a curta e longa distância 2JCH e 3JCH entre H-7↔C-1/C-2/C-8, e H-
2/6↔(C-3/5)/C-4/C-7 e H-3/5↔C-1/C-4, permitiu propor a estrutura da substância (15)
(Figura 31, p. 97) como sendo o ácido-(4-Hidroxi-fenil)-acético. Esta substância avaliada em
conjunto com mais 20 substâncias extraídas da planta Vulpia myuros, apresenta atividade
alelopática mediana e colabora para a atividade do extrato da planta 2,63% de atividade (AN;
PRATLEY; HAIG, 2001).
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. _________________________________4 – Resultados e Discussões 97
HO
OH
O
12
34
56
78
Figura 31: Estrutura da Ácido-(4-Hidroxi-fenil)-acético para substância (15)
Tabela 20: Dados de RMN de 1H, 13C e gHMBC Ácido-(4-Hidroxi-fenil)-acético (15) (DMSO-d6 a 11,7 T) Nº 1H ppm (multip., J= Hz) 13C, ppm gHMBC 1 - 125,2 2 7,02 (d, 8,5) 130,2 C-3 e 5/C-4/C-6/C-7 3 6,68 (d, 8,5) 115,1 C-1/C-4/C-5 4 - 156,0 - 5 6,68 (d, 8,5) 115,1 C-1/C-3/C-4 6 7,02 (d, 8,5) 130,2 C-2/C-3 e 5/C-4/C-7 7 3,40 (s) 40,1 C-1/C-2/C-8 8 - 173,2 -
4.3.2.6 – Identificação Estrutural de 4-Hidroxi-benzamida (16)
O espectro de RMN de 1H (Tabela 21: p. 98, Figura 173, p. 228) apresentou dois
dubletos em δH 6,79 (2H, d, J= 8,5 Hz, H-3/5) e 7,76 (2H, d, J= 8,6 Hz, H-2/6), com
multiplicidades e constantes de acoplamento características de sistema aromático para
substituído.
O espectro de RMN de 13C (Tabela 21: p. 98, Figura 174, p. 229), apresentou um
sinal em δC 161,3 (C-4) característico de carbono fenólico. Os sinais dos carbonos em δC
131,3 (C-2/6) e 115,0 (C-3/5) apresentaram o dobro da intensidade, confirmando a presença
de um sistema aromático para-substituído.
Pela análise do experimento de gHMBC (Tabela 21: p. 98, Figura 176, p. 231) foi
visualizado um carbono δC 167,1 atribuído a uma carbonila de amida.
Pela análise conjunta dos dados de RMN de 1H, 13C e os mapas de contorno gHMQC
(correlações diretas 1H x 13C - gHMQC - 1JCH), (Tabela 21: p. 98, Figura 175, p. 230), foi
possível atribuir todos os hidrogênios aos respectivos átomos de carbono.
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. _________________________________4 – Resultados e Discussões 98
As correlações observadas nos experimentos bidimensionais de gHMBC (Tabela 21:
p. 98, Figura 176, p. 231), permitiu visualizar as correlações a curta e longa distância 2JCH e
3JCH entre H-2/6↔C-4/C-7 e entre H-3/5↔C-1/C-4 apontando a presença de um carbono
aromático em δC 122,0 (C-1), Estes dados em conjunto com os deslocamentos dos carbonos e
hidrogênios, permitiu propor a estrutura da substância (16) como sendo a 4-Hidroxi-
benzamida (Figura 32, p. 98). Segundo Thakur, et al., 2004 esta substância tem atividade
media frente células leucêmicas “in vitro” confirmando a atividade teórica em QSAR.
HO
NH2
O
123
4
5 6
7
Figura 32: Estrutura da 4-Hidroxi-benzamida para substância (16)
Tabela 21: Dados de RMN de 1H, 13C e gHMBC 4-Hidroxi-benzamida (16) (DMSO-d6 a 11,7 T) Nº 1H ppm (multip., J= Hz) 13C gHMBC COSY 1 - 122,0 2 7,76 (d, 8,6) 131,3 C-4/C-6/C-7 H-3 e 5
3 6,79 (d, 8,5) 115,0 C-1/ C-4/C-5 H-2 e 6
4 - 161,3 - 5 6,79 (d, 8,5) 115,0 C-1/C-3/C-4 H-2 e 6
6 7,76 (d, 8,6) 131,3 C-2 e 6/C-4/C-7 H-3 e 5
7 - 167,1
4.3.2.7 – Identificação Estrutural do Ácido-(2-Hidroxi fenil)-acético (17)
A substância (17) foi submetida à espectrometria de massas de baixa resolução (Figura
182, p. 237), utilizando-se a técnica ESI-MS (+), e apresentou o pico com m/z 191, indicando
a formação do aduto com potássio [M+K]+, foi observado ainda a formação do aduto com
sódio em 175 [M+Na]+ e a presença do sal sódico com aduto com sódio em 197 (100%)
[NaM+Na]+. A massa calculada foi de 152 sugerendo a fórmula molecular C8H8O3.
O espectro de RMN de 1H (Tabela 22: p. 100, Figura 177, p. 232) apresentou um duplo
dubleto em δH 7,07 (1H, dd, J= 1,2 e 7,5 Hz, H-3), um duplo tripleto em δH 7,03 (1H, dt, J=
1,6 e 7,5 Hz, H-4), um tripleto em δH 6,70 (1H, t, J= 7,5 Hz, H-5) e um dubleto em δH 6,76
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. _________________________________4 – Resultados e Discussões 99
(1H, d, J= 7,5 Hz, H-6), característicos de sistema aromático orto-substituído. O espectro
apresentou ainda um singleto em δH 3,45 (2H, s, H-7) o que com o auxílio dos experimentos
de RMN de 13C e DEPT (Figura 179, p. 234) demonstrou se tratar de um CH2, carbinólico
benzílico.
O espectro de RMN de 13C (Tabela 22: p. 100, Figura 178, p. 233) apresentou um
sinal em δC 172,8 (C-8) característico de carbonila de ácido, quatro carbonos metínicos sp2
em δC 131,0 (C-3), 127,7 (C-4), 114,8(C-5) 118,7 (C-6) e dois carbonos quaternários em δC
121,9 (C-1) e 155,4 (C-2) característicos de anel aromático orto-substituído. Foi visualizado
também um metileno em δC 35,5 atribuído à C-7.
Pela análise conjunta dos dados de RMN de 1H, 13C e os mapas de contorno gHMQC
(correlações diretas 1H x 13C - gHMQC - 1JCH), (Tabela 22: p. 100, Figura 180, p. 235), foi
possível atribuir todos os hidrogênios aos respectivos átomos de carbono.
As correlações observadas nos experimentos bidimensionais de gHMBC (Tabela 22:
p. 100, Figura 181, p. 236), permitiu visualizar as correlações a curta e longa distância 2JCH e
3JCH entre H-3↔C-2/C-4, H-4↔ C-2/C-3, H-5↔C-1/C-4, H-6↔C-1/C-2/C-7 e H-7↔ C-1/C-
2/C-3/C-8. Estes dados, em conjunto com os deslocamentos e multiplicidades características
dos carbonos e hidrogênios permitiu propor a estrutura da substância (17) como sendo o
Ácido-(2-hidroxi-fenil)-acético (Figura 33, p. 99). Apesar de não se ter encontrado dados
sobre atividade biológica desta substância na literatura esta apresentou uma forte atividade
frente Cladosporium sphaerospermum e C. cladosporioides e atividade inibidora da
acetilcolinesterase.
OH
O
OH
12
3
45
6
78
Figura 33: Estrutura da Ácido-(2-Hidroxi fenil)-acético para substância (17)
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. _________________________________4 – Resultados e Discussões 100
Tabela 22: Dados de RMN de 1H, 13C e gHMBC Ácido-(2-Hidroxi fenil)-acético (17) (DMSO-d6 a 11,7 T) Nº 1H ppm (multip., J= Hz) 13C gHMBC 1 - 121,9 - 2 - 155,4 - 3 7,07 (dd, 1,6 e 7,5) 131,0 C-2/C-4 4 7,03 (dt, 1,6 e 7,5) 127,7 C-2/C-3 5 6,70 (t, 7,5) 114,8 C-1/C-4 6 6,76 (d, 8,0) 118,7 C-1/C-2/C-7 7 3,45 (s) 35,5 C-1/C-2/C-3/ C-8 8 - 172,8 -
4.3.2.8 – Elucidação Estrutural de (18)
A substância (18) foi submetida à espectrometria de massas de alta resolução (Figura
190, p. 245), através técnica ESI-MS (+) e apresentou o pico do íon molecular m/z 265,119
sugerindo ser o ion quasi molecular [M+H]+, e a fragmentação em 212,080 sugerindo que o
fragmento formou aduto com potássio [C10H9N2O+K]+. A massa calculada foi de 264,126
sugerindo a fórmula molecular C17H16N2O.
O espectro de RMN de 1H (Tabela 23: p. 102, Figura 183, p. 238) apresentou dois
dubletos em δH 7,36 (1H, d, J= 8,0 Hz, H-6) e 7,49 (1H, d, J= 8,0 Hz, H-9) e dois tripletos
largos em δH 7,08 (1H, tl, J = 7,6 Hz, H-7) e 6,99 (1H, tl, J = 7,6 Hz, H-8), que foram
atribuídos a um anel aromático dissubstituído em posição orto.
Os outros sinais em δH 7,27 (2H, m, H-14/18), 7,30 (2H, m, H-15/17), e 7,24 (1H, m,
H-16), foram atribuídos ao sistema aromático mono-substituído. Foram observados ainda dois
singletos em δH 3,74 (3H, s, H-11) com valor característico de hidrogênio metílico ligado ao
nitrogênio e δH 3,60(2H, s, H-12), atribuído ao hidrogênio metilênico ligado a carbono α
carbonílico de amida α anel aromático. O singleto em δH 10,90 (s), foi atribuído a NH.
O espectro de RMN de 13C (Tabela 23: p. 102, Figura 184, p. 239) apresentou 18
sinais de carbonos sendo 12 auferidos aos anéis aromáticos com deslocamentos em δC 129,7
(C-4), 136,1 (C-5), 111,4 (C-6), 121,0 (C-7), 118,5 (C-8), 118,4 (C-9), 130,2 (C-13), 129,7
(C-14/18), 128,3 (C-15/17), 124,0 (C-16). Observou-se ainda um sinal em δC 172,0 (C-10)
pode ser de carbonila de amida e outros sinais em δC 51,5 (C-12) e 30,5 (C-11) que com o
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. _________________________________4 – Resultados e Discussões 101
auxílio dos experimentos de DEPT (Figura 185, p. 240) demonstrou se tratar de uma metila
ligada a nitrogênio e um CH2 α carbonila de amida.
Pela análise conjunta dos dados de RMN de 1H, 13C e os mapas de contorno gHMQC
(correlações diretas 1H x 13C - gHMQC - 1JCH) (Tabela 23: p. 102, Figura 186, p. 241) todos
os hidrogênios foram atribuídos aos respectivos átomos de carbono.
Com base em todos os dados obtidos e uma criteriosa análise nos mapas de contorno dos
experimentos bidimensionais gHMBC (Tabela 23: p. 102, Figura 187, p. 242), foi possível
propor as estruturas parciais A e B para a substância (18) (Figura 34, p. 101).
N
H
N
CH3
12
34
57
8
9
6
1 1
1 8
1 01 2
1 3
1 4
1 5
1 61 7
O
Estrutura Parcial A Estrutura Parcial B
Figura 34: Estruturas Parciais A e B da Substância (18)
A conexão entre as estruturas parciais A e B foi realizada com auxilio do experimento
bidimensional gHMBC (Tabela 23: p. 102, Figura 187, p. 242) com o qual foi possível
visualizar a correlação a longa distância 2JCH e 3JCH entre H-11↔C-10 e H-11↔C-3/C-2.
Deste modo foi possível propor para a substância (18) (Figura 35, p. 102) como sendo uma
substância inédita de acordo com o sistema SciFinder Scholar na data de 10 de agosto de
2007.
A localização dos hidrogênios H-11 e H-12 foi estabelecida com base nas informações
obtidas no espectro unidimensional de NOESY-1D e gHMBC (Tabela 23: p. 102, Figura
189, p. 244 e Figura 187, p. 242).
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. _________________________________4 – Resultados e Discussões 102
N
H
N
O
CH3
1 81
2
34
57
8
9 1 01 2
1 3
1 41 5
1 6
1 7
6
1 1
Figura 35: Principais correlações observadas em gHMBC para a substância (18)
Tabela 23: Dados de RMN de 1H, 13C e gHMBC da Substância (18) (DMSO-d6 a 11,7 T) Nº 1H ppm (multip., J= Hz) 13C gHMBC NOESY 1D 2 7,24 (m) 127,0 C-3/C-5 3 - 107,0 - 4 - 129,7 - 5 - 136,1 - 6 7,36 (d, 8,0) 111,4 C-2/C-8 7 7,08 (tl,7,6) 121,0 C-5/C-9 8 6,99 (tl, 7,6) 118,5 C-2/C-6 9 7.49(d, 8,0) 118,4 C-5/C-7
10 - 172,0 - 11 3,74 (s) 30,5 C-3/ C-2/C-10 H-2/H-9 12 3,60 (s) 51,5 C-10/C-14/C-18 13 - 130,2 - 14 7,27 (m) 129,2 C-15 15 7,30 (m) 128,3 - 16 7,24 (m) 124,0 - 17 7,30 (m) 128,3 - 18 7,27 (m) 129,2 -
10,90 (s) N C-2/C-3/C-5 H-2/H-6
4.3.2.9 – Elucidação Estrutural de (19)
A substância (19) foi submetida à espectrometria de massas de alta resolução (Figura
198, p. 253) utilizando-se a técnica ESI-MS (+) e apresentou o pico m/z 302,134 (100%)
sugerindo a formação do aduto com sódio [M+Na]+. A massa calculada foi de 279,125
sugerindo a fórmula molecular C18H17NO2.
O espectro de RMN de 1H (Tabela 24: p. 104, Figura 191, p. 246) apresentou dois
tripletos em δH 6,97 (1H, t, J = 7,5 Hz, H-8) e δH 7,08 (1H, t, J = 7,5 Hz, H-7) e dois dubletos
em δH 7,42 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-9) e δH 7,37 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-6) atribuídos ao anel
aromático dissubstituído em posição orto da parte indólica da molécula. Os dubletos δH 7,14
(2H, d, J = 6,7 Hz, H-15/19) e δH 7,26 (2H, d, J = 7,5 Hz, H-16/18) foram atribuídos ao
sistema aromático mono-substituído, nesta região observou-se ainda os multipletos em δH
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. _________________________________4 – Resultados e Discussões 103
7,18 (1H, m, H-17) e δH 7,22 (1H, m, H-10). O singleto em δH 3,70 (3H, s, H-10) corresponde
aos hidrogênios metilênicos α carbonila, o tripleto em δH 2,87 (2H, t, 6,8 Hz, H-13),
corresponde ao metileno benzílico um duplo tripleto em δH 4,24 (2H, dt J= 1,2 e 6,8 Hz, H-
12), corresponde a outro metileno com deslocamento característico de hidrogênios ligados a
carbono carbinólico. Observou-se ainda o singleto δH 10,90, atribuído a -NH.
O espectro de RMN de 13C (Tabela 24: p. 104, Figura 192, p. 247) apresentou 19
sinais de carbono onde 6 foram auferidos a anel aromático orto substituído em δC 126,3 (C-4),
136,1 (C-5), 111,4 (C-6), 121,0 (C-7), 118,50 (C-8) e 118,4 (C-9) e 6 foram auferidos ao anel
aromático mono-substituído em δC 138,0 (C-14), e 124,0 (C-17) destes, dois com intencidades
duplicadas correspondendo aos carbonos em δC 128,8 (C-15/19), 128,3 (C-16/18). O espectro
apresentou ainda um sinal em δC 171,4 (C-11) sugerindo ser uma carbonila de éster e um sinal
em δC 64,6 (C-12), característico de carbono metilênico ligado a oxigênio. Os sinais em δC
34,3 (13) e 30,8 (10) correspondem aos grupos metilênico e metílico ligados em carbonos sp2,
com o auxílio dos experimentos de DEPT (Figura 193, p. 248) foi possível atribuir todos os
carbonos metilênicos.
Pela análise conjunta dos dados de RMN de 1H, 13C e os mapas de contorno gHMQC
(correlações diretas 1H x 13C - gHMQC - 1JCH) (Tabela 24: p. 104, Figura 194, p. 248) todos
os hidrogênios foram atribuídos aos respectivos átomos de carbono. Com base em todos os
dados obtidos e uma criteriosa análise nos mapas de contorno dos experimentos
bidimensionais gHMBC (Tabela 24: p. 104, Figura 195, p. 250) foi possível visualizar a
correlação a longa distância 2JCH e 3JCH entre H-12↔C-11, e definiu a conexão entre as
estruturas parciais A e B (Figura 36, p. 104). Deste modo foi possível propor para a
substância em questão a estrutura (19) (Figura 37, p. 104), inédita segundo o sistema
SciFinder Scholar, na data de 10 de agosto de 2007
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. _________________________________4 – Resultados e Discussões 104
A localização dos hidrogênios H-2, H-10 e H-12 foi estabelecida com base nas
informações obtidas no espectro unidimensional de NOESY-1D (Tabela 24: p. 104, Figura
197, p. 252)
6
109
8
7 5
4 3
21N
H 19 17
1615
1413
12
11
18
O
O
Estrutura Parcial A Estrutura Parcial B
Figura 36: Estruturas Parciais A e B da Substância (19)
18N
H
O
O
12
34
57
8
910
11
12
1314
1516
176
19
Figura 37: Principais correlações observadas em gHMBC para a substância (19)
Tabela 24: Dados de RMN de 1H, 13C e gHMBC da Substância (19) (DMSO-d6 a 11,7 T)
Nº 1H ppm (multip., J= Hz) 13C gHMBC NOESY 1D 2 7,18 (m) 127,0 C-10 3 - 106,9 - 4 - 126,3 - 5 - 136,1 - 6 7,35 (d, 8,0) 111,4 C-2/C-8 7 7,08 (t, 7,5) 121,0 C-5/C-8 8 6.97 (t, 7,5) 118,5 C-4/C-6 9 7.42 (d, 8,0) 118,4 C-5/C-7
10 3,70 (s) 30,8 C-2/C-3/C-11 H-2/H-9 11 - 171,4 - 12 4,24 (dt,1,2/6,8) 64,6 C-11/C-13/C-14 H-13/H-15 13 2,87 (t, 6,8) 34,4 C-12/ C-14/C-15/C-19 H-12/H-2 14 - 138,0 - 15 7,14 (d, 6,7) 128,8 C-13/C-15 e 19 16 7,26 (d, 7,5) 128,3 C-14/C-16 e 18 17 7,18 (m) 124,0 - 18 7,26 (d, 7,5) 128,3 C-14/C16/C-18 19 7,14 (d, 6,7) 128,8 C-13/C-15/C-19
10,90 (s) N C-6 H-2/H-6
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. _________________________________4 – Resultados e Discussões 105
4.3.3 – Elucidação Estrutural da Substância Produzida por Mc-3C Xylaria sp.
4.3.3.1 – Identificação Estrutural do diácido Ácido 2-hexilideno-3-metilsuccínico (20)
A substância (20) foi submetida à espectrometria de massas (Figura 205, p. 260) com a
técnica ESI-MS (+) e apresentou o pico m/z 237 (100%) indicando a formação do aduto
[M+Na]+. A massa calculada foi de 214 sugerindo a fórmula molecular C11H18O4.
O espectro de RMN de 1H (Tabela 25: p. 106, Figura 199, p. 254) apresentou sinais
em δH 1,28 (2H, m, H-2’) e δH 2,20 (2H, m, H3’) referentes aos hidrogênios alifáticos, um
tripleto em δH 0,87 (3H, t, J= 7,1 Hz, H-6’) referente à metila terminal e um quinteto em δH
1,47 (2H, qui, J= 7,2 Hz, H-4’) pertencente à cadeia lateral hexilideno. O quarteto em δH 3,59
(1H, q, J = 7,1 Hz, H-3) e o dubleto em δH 1,32 (3H, d, J= 7,0 Hz, H-Me (3)) tem
multiplicidades e constantes de acoplamento característicos as posições onde foram
atribuídos.
A configuração da insaturação Δ2,1’ foi estabelecida com base na fórmula de Pascual
(PASCUAL; MEIER; SIMON, 1966) que atribuiu valores de deslocamento químico para o
hidrogênio olefínico em aproximadamente δH 6,8 e δH 6,2 ppm que correspondem as formas E
e Z, respectivamente (ANDERSON; EDWARDS; WHALLEY, 1985). Para (20), o
deslocamento químico de H-1’ em δH 6,97, sugere a configuração E.
O espectro de RMN de 13C (Tabela 25: p. 106, Figura 200, p. 255) mostraram sinais
característicos de carbonilas ácidas em δC 171,0 (C-1) e 179,0 (C-4). Os sinais em δC 31,5 (C-
2’), 28,8 (C-3’), 28,1 (C-4’) e 22,4 (C-5’), foram atribuídos as suas posições, baseado em seus
deslocamentos e dados obtidos nos espectros de DEPT (Figura 201, p. 256), os sinais em δC
15,5 (MeC-3) e 13,9 (C-6’) tem valores e multiplicidades característicos de metila vicinal a
carbono metínico e metilênico respectivamente.
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. _________________________________4 – Resultados e Discussões 106
Pela análise conjunta dos dados de RMN de 1H, 13C e os mapas de contorno gHMQC
(correlações diretas 1H x 13C - gHMQC - 1JCH (Tabela 25: p. 106, Figura 202, p. 257) todos
os hidrogênios foram atribuídos aos respectivos átomos de carbono.
Com base em todos os dados obtidos e uma criteriosa análise nos mapas de contorno
dos experimentos bidimensionais gHMBC (Tabela 25: p. 106, Figura 203, p. 258) foi
possível visualizar a correlação a longa distância 2JCH e 3JCH entre H-3↔C-Me (3)/C-2/C-
1’/C-1/C-4 e H-Me (3)↔C-3/C-2/C-4 o confirma a posição do carbono metílico Me(3).
Observou-se ainda as correlações entre H-1’↔ C-1/ C-2/ C-3/C-4’, H-3’↔C-4’/C-2/C-1’, H-
4’↔C-1’/C-6’ e H-6’↔C-5’/C-2’.
Uma análise das correlações feitas a partir das correlações citadas e gCOSY (Tabela
25: p. 106, Figura 204, p. 259) permitiu propor a estrutura para este diácido (20) como sendo
o Ácido 2-hexilideno-3-metilsuccínico (Figura 38, p. 106).
O
OH
O
HO1'
2'
3'
4'
5'
6'
3
12
4
Figura 38: Estrutura do Ácido 2-hexilideno-3-metilsuccínico (20)
Tabela 25: Dados de RMN 1H, 13C, gHMBC, e gCOSY do Ácido 2-hexilideno-3-metilsuccínico (20) (CDCl3, a 11,7 T)
Nº 1H ppm (multip., J= Hz) 13C (ppm) gHMBC COSY 1 - 171,0 - - 2 - 131,3 - - 3 3,59 (q, 7,1) 37,5 C-Me(3)/C-2/C-1’/C-1/C-4 H-4’/H-2’ 4 - 179,0 - - 1’ 6,97 (t, 7,7) 146,9 C-4’/C-3/-2/-1 H-3’ 2’ 1,28 (m) 31,5 - - 3’ 2,20 (m) 28,8 C-4’/C-2/C-1’ H-4’ 4’ 1,47 (qui, 7,2) 28,1 C-6’/C-1’ H-3’ 5’ 1,27 (m) 22,4 - - 6’ 0,87 (t, 7,1) 13,9 C-5’/C-2’ H2’
Me (3) 1,32 (d, 7,1) 15,5 C-3/C-2/C-4 -
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. _________________________________4 – Resultados e Discussões 107
4.4 – Atividade Biológica das Frações e Substâncias Isoladas de Mc-7F e Mc-8R.
4.4.1 – Avaliação da Atividade Antifúngica de (1) a (19) Frente aos Fungos
Fitopatogênicos Cladosporium cladosporioides e C. sphaerospermum
As substâncias de (1) a (19) foram isoladas do extrato do fungo Mc-7F (Colletotrichum
gloeosporioides) e Mc-8R e testadas contra aos fungos fitopatogênicos Cladosporium
cladosporioides e C. sphaerospermum, (Tabela 26: p. 107). As substâncias (1), (2), (3), (5),
(6) e (8) apresentaram forte atividade contra os dois fungos, enquanto a substância (7) e (4)
apresentaram forte atividade frente C. cladosporioides e média frente C. sphaerospermum, a
substância (9) mostrou-se inativa. As substâncias (16), (17) e (18) apresentaram forte
atividade frente os fungos fitopatogênicos, à substância (15) apresentou forte atividade apenas
com C. cladosporioides e média frente C. sphaerospermum, a substância (19) apresentou
atividade média com ambos os fungos e a substância (13) apresentou fraca atividade também
com ambos os fungos, todas as outras substâncias foram inativas (Tabela 26: p. 107) o que
pode ser melhor visualizado no Gráfico 02 (Figura 39:, p. 108).
Tabela 26: Resultados da atividade antifúngica das substâncias isoladas do extrato de Mc-7F Colletotrichum gloeosporioides e Mc-8R.
Substância Quantidade C .cladosporioides C. sphaerospermum Potencial Potencial
Pirenocinas A e B (1) e (3) 100 μg ***/*** ***/*** Pirenocinas A, E e B (1), (2) e (3) 100 μg ***/*** ***/***
Pirenocinas A, e E (1) e (2) 100 μg ***/***/* ***/***/* Ác Pirenochaético C (4) 100 μg ***/***/* ** Ác Pirenochaético A (5) 100 μg **/*** **/***
Ácido Pirenochaético B (6) 100 μg ***/*/*** ***/*/*** Ácido Pirenochaético (7) 100 μg *** ** Ácido Pirenochaético (8) 100 μg ** ***/***/*
Ergosterol (9) 100 μg i i Uracila (11) 100 μg i i
ciclo-(S*-Pro-S*-Tyr) (12) 100 μg i i ciclo-(S*-Pro-S*-Val) (13) 100 μg * *
Ácido-(2-Amino-fenil)-acético (14) 100 μg * i Ácido-(4-Hidroxi-fenil)-acético (15) 100 μg *** **
4-Hidroxi-benzamida (16) 100 μg *** *** Ácido-(2-Hidroxi fenil)-acético (17) 100 μg *** ***
Inédita (18) 100 μg *** *** Inédita (19) 100 μg *** ***
Nistatina 100 μg *** *** Atividade fraca = * Média atividade = ** Atividade forte = *** inativo = i
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. _________________________________4 – Resultados e Discussões 108
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
(1) 0,1 mg
(2) 0,1 mg
(3) 0,1 mg
(4) 0,1 mg
(5) 0,1 mg
(6) 0,1 mg
(7) 0,1 mg
(8) 0,1 mg
(9) 0,1mg
(11) 0,1 mg
(12) 0,1 mg
(13) 0,1 mg
(14) 0,1 mg
(15) 0,1 mg
(16) 0,1 mg
(17) 0,1 mg
(18) 0,1 mg
(19) 0,1 mg
Nistatina0,1mg
C.cladosporioidesC.sphaerospermum
Figura 39: Gráfico 2: Atividade antifúngica das substâncias (1) a (19) frente os fungos Cladosporium cladosporioides e C. sphaerospermum
Através destes resultados as Substâncias (13), (15), (16), (17), (18) e (19) foram
submetidas aos ensaios frente os fungos Cladosporium cladosporioides e C. sphaerospermum
em limite de detecção, estes resultados demonstraram quantidade mínima inibitória de cada
substância. Verificou-se que as substâncias (18) e (19) apresentaram as atividades
promissoras, podendo ser melhor visualizadas nas Tabela 27: e Tabela 28: pgs. 108 e 109,
Gráficos 03 e 04 (Figura 40: e Figura 41:, pgs. 108 e 109).
Tabela 27: Resultados da atividade antifúngica em limite de detecção das substâncias isoladas do extrato de Mc-7F frente o fungo Cladosporium cladosporioides
Amostras 100 μg 50 μg 25 μg 10 μg 5 μg 1 μg ciclo-(S*-Pro-S*-Val) (13) * i I i i i
Ácido-(4-Hidroxi-fenil)-acético (15) ** i I i i i 4-Hidroxi-benzamida (16) *** * I i i i
Ácido-(2-Hidroxi fenil)-acético (17) *** ** * i i i Inédita (18) *** *** ** ** ** i Inédita (19) ** ** * * * *
Nistatina *** *** *** *** *** ***
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
13 15 16 17 18 19 Nistatina
0,1 mg
0,05 mg
0,025 mg
0,010 mg
0,005 mg
0,001 mg
Figura 40: Gráfico 3: Atividade antifúngica das substâncias isoladas de Mc-7F frente os fungos Cladosporium cladosporioides em limite de detecção
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. _________________________________4 – Resultados e Discussões 109
Tabela 28: Resultados da atividade antifúngica em limite de detecção das substâncias isoladas do extrato de Mc-7F frente o fungo Cladosporium sphaerospermum
Amostras 100 μg 50 μg 25 μg 10 μg 5 μg 1 μg ciclo-(S*-Pro-S*-Val) (13) * i I i i i
Ácido-(4-Hidroxi-fenil)-acético (15) ** i I i i i 4-Hidroxi-benzamida (16) *** ** * i i i
Ácido-(2-Hidroxi fenil)-acético (17) *** ** * i i i Inédita (18) *** *** *** *** ** * Inédita (19) *** *** ** * * * Nistatina *** *** *** *** *** ***
0
0,5
1
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2
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3
13 15 16 17 18 19 Nistatina
0,1 mg
0,05 mg
0,025 mg
0,010 mg
0,005 mg
0,001 mg
Figura 41: Gráfico 4: Atividade antifúngica das substâncias isoladas de Mc-7F frente os fungos Cladosporium sphaerospermum em limite de detecção
4.4.2– Avaliação da Atividade Inibidora da Acetilcolinesterase de (1) a (19) de
Mc-7F (Colletotrichum gloeosporioides) e Mc-8R.
Das substâncias isoladas de Mc-8R (1) a (9) 60% apresentaram atividade inibidora da
acetilcolinesterase. Estes resultados indicam que o fungo em questão pode ser promissor na
produção de substâncias bioativas e serão melhor visualizados na (Tabela 29: p. 110);
Gráfico 05 (Figura 42:, p. 110). Para as substâncias de (11) a (19) isoladas de Mc-7F os
resultados mostraram-se ainda mais promissores e 80% das substâncias apresentaram
atividade inibidora da acetilcolinesterase. Estes resultados são visualizados na (Tabela 29: p.
110); Gráfico 06 (Figura 42:, p. 110).
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. _________________________________4 – Resultados e Discussões 110
Tabela 29: Resultados dos ensaios de inibição da acetilcolinesterase das substâncias isoladas. Substâncias Dose μg rf
Pirenocinas A e B (1) e (3) 200 - Pirenocinas A, E e B (1), (2) e (3) 200 -
Pirenocinas A, e E (1) e (2) 200 - Ác Pirenochaético C (4) 200 0,15 Ác Pirenochaético A (5) 200 0,14
Ácido Pirenochaético B (6) 200 0,14 Ácido Pirenochaético (7) 200 0,03 Ácido Pirenochaético (8) 200 0,03
Ergosterol (9) 200 - Uracila (11) 200 -
ciclo-(S*-Pro-S*-Tyr) (12) 200 0,93 ciclo-(S*-Pro-S*-Val) (13) 200 0,89
Ácido-(2-Amino-fenil)-acético (14) 200 0,92 Ácido-(4-Hidroxi-fenil)-acético (15) 200 0,84
4-Hidroxi-benzamida (16) 200 0,86 Ácido-(2-Hidroxi fenil)-acético (17) 200 0,69
Inédita (18) 200 0,89 Inédita (19) 200 0,92 / 0,86
Atividade Inibidora da
Acetilcolinesterase Mc-8R
56%
44%
AtivasInativas
Atividade Inibidora da Acetilcolinesterase Mc-7F11%
89%AtivasInativas
Gráfico 5 Grafico 6 Figura 42: Gráfico 5 e 6: Atividade inibidora da acetilcolinesterase das substâncias isoladas de Mc-8R e Mc-7F
Após analise de todos os resultados das atividades biológicas pode-se observar que
tanto o fungo Mc-8R quanto o fungo Mc-7F são endofíticos com um potencial grande na
produção de metabólitos bioativos. Observa-se que a produção de ácidos é uma ocorrência
comum nos endofíticos isolados de Michelia champaca.
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. __________________________________5 – Considerações Finais 111
5 – CONSIDERAÇÕES FINAIS
O trabalho desenvolvido com a espécie vegetal de M. champaca conduziu ao
isolamento e purificação de oito fungos endofíticos, que foram cultivados em meio liquído
CDB e forneceram os respectivos extratos brutos. A metodologia para triagem, desenvolvida
pelo grupo, para avaliar o perfil químico por RMN1H e CLAE-DAD e a bioatividade frente
aos ensaios específicos, foi fundamental para a seleção dos extratos brutos estudados.
Todos os extratos brutos apresentaram atividade, variando de fraca a forte, contra os
fungos fitopatogênicos Cladosporium sphaerospermum e C. cladosporioides, 40%
apresentaram atividade seletiva frente às linhagens mutantes de Saccharomyces cerevisiae e
87,5% atividade inibidora da enzima acetilcolinesterase.
A triagem química e biológica do fungo endofítico Mc-8R, seguido do estudo químico
resultou no isolamento de substâncias com diversidade estrutural notável como as pironas,
Pirenocina A (1), E (2), B (3), dos Ácidos Pirenochaéticos C (4), A (5), B (6), (7) e (8), os
dois últimos inéditos, do Ergosterol (9) e Peróxido de Ergosterol (10). Do endófito Mc-7F,
foram isolados e identificados a Uracila (11), as dicetopiperazinas, ciclo-(S*-Pro-S*-Tyr) (12)
e ciclo-(S*-Pro-S*-Val) (13), Ácido-(2-Amino-fenil)-acético (14), Ácido-(4-Hidroxi-fenil)-
acético (15), 4-H droxi-benzamida (16) e Ácido-(2-Hidroxi fenil)-acético (17), e dois
derivados indólicos, ainda não descritos na literatura (18) e (19). Também foi possível
identificar nos extratos brutos produzidos por Mc-3C e Mc-6F, os Ácidos 2- hexilideno-3-
metilsuccínico (20) e o ácido 3-nitropropiônico (21), respectivamente.
Os resultados obtidos com o estudo químico biomonitorado dos fungos endofíticos
selecionados Mc-8R (ainda não identificado) e Mc-7F (Colletotrichum gloeosporioides)
foram muito bons, pois das substâncias isoladas 80% e 66% apresentaram atividades
antifúngica, 56% e 89% apresentaram atividade inibidora da acetilcolinesterase,
respectivamente.
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. __________________________________5 – Considerações Finais 112
A identificação de Mc-8R não foi possível pela taxonomia clássica, talvez este possa
ser um fungo pertencente ao gênero Pyrenochaeta. Esta observação é baseada em dados da
literatura, onde encontrou-se que o fungo patogênico Pyrenochaeta terrestris, produz
substâncias da mesma classe química que as isoladas de Mc-8R.
O fungo endofítico Colletotrichum gloeosporioides (Mc-7F) é o responsável pela
antracnose, doença de plantas frutíferas, devastando plantações por todo o mundo. É curioso
averiguar que este não causa nenhum mal a Michelia champaca, pois esta se encontra
saudável, evidenciando a robustez da espécie.
Um levantamento bibliográfico da literatura mostrou que os Ácidos Pirenochaéticos
A, B, C e Pirenocina A, atuam como fitotoxinas inibindo a germinação de sementes de alface
e crescimento de mudas de arroz e cebola. As pirenocinas A, B e E são fitotóxicos ao girassol
e inibem a germinação da alface.
Considerando a forte atividade antifúngica contra os fungos fitopatogênicos C.
cladosporioides e C. sphaerospermum apresentada pelo extrato bruto do fungo Mc-8R,
sugerimos que este possa estar atuando na proteção de M. champaca contra microrganismos
fitopatogênicos a esta espécie vegetal ou então, impedindo a entrada de outros
microrganismos.
Estes resultados são relevantes e promissores, pois evidenciam os fungos endofíticos
como uma fonte de substâncias com diversidade estrutural e potencialmente bioativas,
justificando a necessidade do estudo químico desta classe de microrganismos. Esta
observação é condizente com a teoria ecológica a qual prediz que microrganismos que vivem
sob alto nível de “stress” ambiental e intensas e freqüentes interações com outros
microrganismos, apresentam alta diversidade metabólica.
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. __________________________________5 – Considerações Finais 113
O estudo da variação na produção metabólica de Mc-8R quando cultivado em diferentes
meios liquídos e condições, indicou que o meio CDB em XAD 2 ensacado, produziu uma
excelente massa e evidenciou por RMN 1H uma variação na produção metabólica (PM).
Observou-se uma PM de aproximadamente 9 vezes maior que o padrão CDB, com a presença de
apenas três substâncias, quando avaliado por CLAE-DAD. Esta observação permite inferir que o
polímero XAD-2 ensacado, agiu como adsorvente, seqüestrando os principais compostos
produzidos pelo endófito. Este fato impediu a biotransformação dos mesmos, pela enzinas
excretadas no meio de cultivo, resultando em uma melhor especificidade metabólica.
Os dois extratos obtidos (XAD Saco e XAD Solto) apresentaram diferenças na
constituição metabólica, por CLAE-DAD. Foi observado melhor desenvolvimento, maior
quantidade de micélio e massa de extrato e especificidade de substâncias, quando o polímero foi
acondicionado em cartuchos de tecido. Pode-se sugerir que o microrganismo se desenvolveu
melhor na presença de uma superfície onde possa se instalar.
De acordo com o livro Evolution and Classification of Flowering Plants, 1988, a família
Magnoliaceae é considerada a mais primitiva de todos os vegetais encontrados no angiosperma.
Assim, Michelia champaca (Magnoliaceae) é uma espécie considerada primitiva, o que pode ser
constatado pela não alteração de suas características morfológicas durante a evolução vegetal em
milhares de anos. Será possível sugerir, que o fato desta espécie não ter evoluído, esteja de algum
modo, relacionado com os microrganismos endofíticos associados? Será que as bioatividades
observadas pelas substâncias isoladas de M. champaca colaboraram para robustez da espécie?
Outro fato a ser considerado, é que esta espécie vegetal encontra-se monitorada e
permanece saudável desde o isolamento dos endófitos. Nenhuma patologia, aparente, foi
constatada neste individuo, sugerindo uma relação de simbiose entre o hospedeiro e o
microrganismos (comensalismo ou mutualismo).
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ______________________________________________Curriculo 114
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Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ______________________________________________Curriculo 118
Ioanis Hcristos Leptokarydis DADOS PESSOAIS.
Endereço residencial.
Rua Dr. Luiz Nougues nº 681
Tel (residencial): (019) 81366560.
E-mail: [email protected]
FORMAÇÃO ACADÊMICA.
Pós-graduação (Mestrado) em Química Orgânica – Estudo Fitoquímico Biomonitorado
de Michelia champaca (Magnoliaceae). UNESP – Araraquara, 2003.
Bacharel em Química (Instituto de Química). UNESP – Araraquara, 2000.
EXPERIÊNCIA PROFISSIONAL. Empresa: Asca Brinquedos ind e com de brinquedos ltda
Função: Responsável pelas atividades relacionadas a P&D, gestão da qualidade e controle de qualidade, certificação e inclusão dos produtos junto aos órgãos certificadores Período: 06/2006 (emprego atual)
Empresa: Anaber Cosméticos ind e com de cosméticos ltda Função: Responsável pelo departamento de P&D de novos produtos, treinamento de técnicos, certificação e inclusão dos produtos junto aos órgãos certificadores Período: 03/2004 - 02/2007
Instituição: Escola Estadual Professora Lea de Freitas Monteiro Disciplina: Química e Matemática. Período: 07/2003 – 12/2003
o Professor do Ensino Médio.
Instituição: Escola Estadual Bento de Abreu - EEBA. Disciplina: Química, Física e Matemática. Período: 02/2003 – 12/2003
o Estágio de Docência. Instituição: Instituto de Química da UNESP Araraquara.
Curso: Química Orgânica Experimental. Período: 02/2001 – 07/2001.
o Monitor em Química Orgânica I Instituição: Instituto de Química da UNESP Araraquara.
Curso: Química Orgânica I e II. Período: 02/2000 – 12/2000.
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ______________________________________________Curriculo 119
IDIOMAS.
Inglês: avançado.
Espanhol: avançado.
CONHECIMENTO EM INFORMÁTICA.
Sistemas Operacionais: MS-DOS e WINDOWS (todos) Iniciante em LINUX.
Programas do Office: Excel, Front Page, Power Point e Word.
Outros programas: Corel Draw, ACDLabs 1D e 2D, Text Bridge, Chemwin, Chem
Office Win Zip, Vírus Scan, Adobe Acrobat, ChemSketch, Conhecimento sobre rede,
formatação e configuração de micros.
TRABALHOS DE CONCLUSÃO DE CURSO – TCC.
Estudo Fitoquímico Biomonitorado das Sementes de Michelia champaca
(Magnoliaceae), 2000.
CURSOS NA ÁREA QUÍMICA Teia do saber Titulo “A água” - UNESP 2004
• O Cotidiano do Ensino Médio – UNESP 2003 • Didática no Ensino Médio – UNESP, 2000. • Química Medicinal – UNESP, 2000. • Diversidade Química de Plantas de Serrado e mata Atlântica e seu Potencial Biológico
– UNESP, 1999. • Lixiviação de Metais por Bactéria – UNESP, 1999. • Cristais Líquidos – UNESP, 1997. • Cuidados no Manuseio de Substâncias Químicas em Laboratório – UNESP, 1996. • Tópicos de Produtos Naturais (1ºParte) Produção de Metabólitos secundários através de
células e tecidos de plantas (2º Parte) – UNESP, 1996.
PRÊMIOS & HONRARIAS.
Premiação por melhor trabalho da área de Ciências Exatas do Congresso de Iniciação Científica da UNESP – UNESP, 2000.
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ______________________________________________Anexos 120
ANEXOS
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ______________________________________________Anexos 121
8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5
Chloroform-d
0.98
1.05
1.07
1.08
1.24
1.30
1.31
1.33
1.34
1.64
2.01
2.06
2.07
2.15
2.18
2.63
2.64
3.02
3.47
3.91
3.92
4.31
4.53
4.62
4.83
4.92
5.055.1
7
5.41
5.88
6.14
6.49
6.68
6.78
7.25
7.39
7.67
7.68
Figura 43: Espectro de RMN de 1H de Mc-1C (CDCl3 a 11,7 T)
8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5
0.87
1.24
1.31
1.60
1.89
1.97
2.09
2.34
2.66
2.99
3.31
3.48
3.65
3.65
3.82
3.87
3.94
4.435.3
3
6.08
6.49
6.76
7.04
7.15
7.25
7.46
7.76
7.78
8.00
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ______________________________________________Anexos 122
Figura 44: Espectro de RMN de 1H de Mc-2C (CDCl3 a 11,7 T)
7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5
Chloroform-d
0.86
0.87
0.89
1.28
1.29
1.30
1.31
1.33
1.45
1.47
1.482.1
92.2
02.2
12.2
3
3.59
3.61
6.95
6.97
6.98
7.25
Figura 45: Espectro de RMN de 1H de Mc-3C (CDCl3 a 11,7 T)
8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0
0.87
1.24
1.30
1.60
2.08
2.22
2.34
2.61
2.66
2.67
2.97
3.01
3.48
3.65
3.77
4.21
4.43
4.92
5.35
5.96
6.917.0
27.1
67.2
5
7.46
7.76
8.00
8.28
Figura 46: Espectro de RMN de 1H de Mc-4F (CDCl3 a 11,7 T)
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ______________________________________________Anexos 123
7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0
Chloroform-d
1.07
1.16
1.26
1.31
1.35
1.44
1.51
1.64
1.66
1.78
1.90
1.92
1.94
2.03
2.14
2.16
2.33
2.43
2.90
3.01
3.04
3.44
3.45
3.47
3.79
3.80
4.24
4.44
4.53
4.60
4.63
4.72
6.50
7.04
7.25
7.46
7.67
Figura 47: Espectro de RMN de 1H de Mc-5F (CDCl3 a 11,7 T)
8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5
Chloroform-d
0.86
0.87
1.24
1.25
1.49
2.05
2.20
2.44
2.66
3.00
3.42
4.51
4.62
4.63
4.64
5.70
5.82
6.49
7.25
7.837.9
1
4.62
4.63
4.64
2.99
3.00
3.01
Figura 48: Espectro de RMN de 1H de Mc-6F (CDCl3 a 11,7 T)
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ______________________________________________Anexos 124
8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0
Chloroform-d
0.06
0.880.9
0
1.06
1.19
1.21
1.24
1.60
1.78
1.97
2.08
2.40
2.92
3.48
3.64
3.82
3.93
4.43
4.87
5.415.9
6
6.48
6.89
7.04
7.20
7.25
7.36
7.46
7.60
7.77
8.00
Figura 49: Espectro de RMN de 1H de Mc-7F (CDCl3 a 11,7 T)
7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0
Chloroform-d0.6
3
1.06
1.07
1.22
1.23
1.35
1.40
1.41
1.69
1.94
1.94
1.95
1.95
2.15
2.25
2.27
2.42
2.71
2.81
2.94
3.63
3.78
3.85
4.05
4.274.5
6
5.47
6.12
6.176.2
76.3
0
6.79
7.25
7.42
7.53
7.80
7.87
Figura 50: Espectro de RMN de 1H de Mc-8R (CDCl3 a 11,7 T)
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ______________________________________________Anexos 125
Figura 51: Cromatograma em CLAE-DAD de Mc-8R Czapek com detecção monitorada em 254nm.
7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0
DMSO-d6
0.66
0.84
1.071.0
91.2
2
1.49
1.89
1.91
1.91
2.06
2.13
2.26
2.48
2.49
2.50
2.722.7
4
3.32
3.56
3.77
3.84
5.65
6.266.3
2
6.79
6.81
6.87
Figura 52: Espectro de RMN de 1H de Mc-8R Czapek (DMSO-d6 a 11,7 T)
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ______________________________________________Anexos 126
Figura 53: Cromatograma em CLAE-DAD de Mc-8R Nutriente com detecção monitorada em 254nm.
8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5
DMSO-d6
0.84
0.87
0.88
0.89
1.22
1.81
2.49
2.49
2.77
2.90
3.32
3.65
3.89
4.28
4.39
5.085.3
8
7.26
7.96
8.03
8.12
Figura 54: Espectro de RMN de 1H de Mc-8R Nutriente (DMSO-d6 a 11,7 T)
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ______________________________________________Anexos 127
Figura 55: Cromatograma em CLAE-DAD de Mc-8R YM com detecção monitorada em 254nm.
9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5
DMSO-d6
0.57
0.84
1.20
1.22
1.28
1.46
1.88
1.99
2.25
2.35
2.49
2.72
3.33
3.81
3.95
5.30
5.58
5.635.9
4
6.11
6.15
6.39
7.26
7.38
7.42
7.75
7.78
8.72
Figura 56: Espectro de RMN de 1H de Mc-8R YM (DMSO-d6 a 11,7 T)
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ______________________________________________Anexos 128
Figura 57: Cromatograma em CLAE-DAD de Mc-8R Extrato de Malte com detecção monitorada em 254nm.
10.0 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0
DMSO-d6
0.89
1.07
1.09
1.22
1.431.5
7
1.86
1.88
1.89
2.06
2.13
2.18
2.30
2.41
2.49
2.50
2.72
2.74
2.88
3.04
3.38
3.75
3.77
3.84
4.01
4.25
4.43
4.99
5.165.3
0
5.65
5.66
5.86
6.26
6.32
6.45
6.62
6.796.8
16.8
46.8
67.1
2
7.38
8.28
10.10
Figura 58: Espectro de RMN de 1H de Mc-8R Extrato de Malte (DMSO-d6 a 11,7 T)
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ______________________________________________Anexos 129
Figura 59: Cromatograma em CLAE-DAD de Mc-8R Arroz ACN com detecção monitorada em 254nm.
8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5
DMSO-d6
0.81
0.83
0.84
0.91
0.92
0.95
1.10
1.12
1.20
1.22
1.24
1.29
1.30
1.471.7
01.7
11.7
21.8
61.8
82.1
12.1
22.1
52.1
92.2
3
2.48
2.49
2.49
2.73
2.74
2.80
2.81
3.12
3.31
3.41
3.42
3.50
3.67
3.76
3.79
3.81
3.82
5.30
5.31
7.36
7.38
7.43
Figura 60: Espectro de RMN de 1H de Mc-8R Arroz ACN (DMSO-d6 a 11,7 T)
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ______________________________________________Anexos 130
Figura 61: Cromatograma em CLAE-DAD de Mc-8R Milho ACN com detecção monitorada em 254nm.
7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5
DMSO-d6
0.660.7
50.7
60.8
30.8
30.8
40.8
50.8
60.9
10.9
70.9
81.0
71.0
91.1
01.1
21.1
41.2
21.2
41.3
01.3
11.3
31.3
51.4
71.4
81.7
01.71
1.86
1.87
1.88
1.88
2.00
2.01
2.11
2.15
2.19
2.23
2.26
2.31
2.49
2.49
2.50
2.71
2.732.7
42.8
02.8
13.0
93.1
23.1
3
3.31
3.41
3.50
3.67
3.76
3.81
3.82
4.06
4.08
5.305.3
15.3
2
7.38
7.43
Figura 62: Espectro de RMN de 1H de Mc-8R Milho ACN (DMSO-d6 a 11,7 T)
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ______________________________________________Anexos 131
7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0
0.000.740.75
0.78
0.80
0.81
0.82
0.83
0.85
1.19
1.23
1.26
1.27
1.29
1.30
1.541.
551.
56
1.92
1.931.
951.97
1.98
2.00
2.222.23
2.24
2.24
2.25
2.26
2.272.272.70
3.59
4.064.
074.08
4.09
4.22
4.23
4.245.
265.
275.27
5.29
5.30
7.19
Figura 63: Espectro de RMN de 1H do extrato de Mc-8R Arroz Hex (CDCl3 a 11,7 T )
7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 -0.5
0.00
0.61
0.79
0.81
0.82
0.83
1.19
1.23
1.541.
97
2.21
2.242.27
2.29
2.70
3.59
4.044.064.
084.
104.
204.21
4.24
4.25
5.25
5.27
5.29
5.30
7.20
Figura 64: Espectro de RMN de 1H do extrato de Mc-8R Milho Hex (CDCl3 a 11,7 T)
Figura 65: CCDC das fases Hexânicas do Milho, Arroz e Arroz hex ppt, com eluente em 86% Hex 3% HAc 11 % (Solução A) em tripla eluição.
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ______________________________________________Anexos 132
Figura 66: Cromatograma em grad. explorat. do extrato AcOEt Mc-7F.1 (H2O+0,5% HAc/MeOH; 95:5 a 0:100 em 40’, com fluxo de 1,0 mL/mim. a 254 nm)
9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0
DMSO-d6
1.96
2.07
2.08
2.11
2.12
2.49
2.82
3.01
3.60
4.02
4.27
4.52
5.34
6.54
7.74
7.76
7.79
7.80
8.12
8.13
8.15
8.89
Figura 67: Espectro de RMN de 1H do extrato de Mc-7F.1 (DMSO-d6 a 11,7 T)
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ______________________________________________Anexos 133
Figura 68: Cromatograma em grad. explorat. do extrato AcOEt Mc-7F.2 (H2O+0,5% HAc/MeOH; 95:5 a 0:100 em 40’, com fluxo de 1,0 mL/mim. a 254 nm)
8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0
DMSO-d6
0.86
0.87
1.02
1.80
1.91
2.49
2.53
3.19
3.42
3.47
3.57
3.79
6.70
6.70
6.72
6.817.03
7.05
7.08
7.09
7.24
7.89
Figura 69: Espectro de RMN de 1H do extrato de Mc-7F.2 (DMSO-d6 a 11,7 T)
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ______________________________________________Anexos 134
Figura 70: Cromatograma em grad. explorat. do extrato AcOEt Mc-7F.3 (H2O+0,5% HAc/MeOH; 95:5 a 0:100 em 40’, com fluxo de 1,0 mL/mim. a 254 nm)
11.0 10.5 10.0 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5
2.50
3.56
3.65
6.99
7.08
7.10
7.23
7.27
7.31
7.35
7.37
7.50
7.52
10.8
7
Figura 71: Espectro de RMN de 1H do extrato de Mc-7F.3 (DMSO-d6 a 11,7 T)
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ______________________________________________Anexos 135
Figura 72: Cromatograma em grad. explorat. do extrato AcOEt Mc-7F.4 (H2O+0,5% HAc/MeOH; 95:5 a 0:100 em 40’, com fluxo de 1,0 mL/mim. a 254 nm)
7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0
DMSO-d6
1.78
1.831.
901.
961.
97
2.49
2.532.
732.
742.
75
3.17
3.52
4.10
4.11
4.13
6.676.
69
7.00
7.02
7.24
Figura 73: Espectro de RMN de 1H do extrato de Mc-7F.4 (DMSO-d6 a 11,7 T)
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ______________________________________________Anexos 136
Figura 74: Cromatograma em grad. explorat. do extrato AcOEt Mc-7F.5 (H2O+0,5% HAc/MeOH; 95:5 a 0:100 em 40’, com fluxo de 1,0 mL/mim. a 254 nm)
11.0 10.5 10.0 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0
1.001.
011.
091.
101.
14
2.50
2.54
3.49
3.61
3.64
3.75
6.67
6.98
7.00
7.09
7.10
7.25
7.36
7.38
7.50
10.9
3
Figura 75: Espectro de RMN de 1H do extrato de Mc-7F.5 (DMSO-d6 a 11,7 T)
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ______________________________________________Anexos 137
Figura 76: Cromatograma em grad. explorat. do extrato AcOEt Mc-7F.6 (H2O+0,5% HAc/MeOH; 95:5 a 0:100 em 40’, com fluxo de 1,0 mL/mim. a 254 nm)
11.0 10.5 10.0 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5
DMSO-d6
0.89
0.90
1.78
1.91
1.99
2.49
2.73
2.99
3.17
3.52
3.643.
72
4.13
4.236.
656.
676.
976.
987.
067.
177.
227.
247.
26
7.66
7.75
10.6
610.8
310
.90
Figura 77: Espectro de RMN de 1H do extrato de Mc-7F.6 (DMSO-d6 a 11,7 T)
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ______________________________________________Anexos 138
Figura 78: Cromatograma em grad. explorat. do extrato AcOEt Mc-7F.7 (H2O+0,5% HAc/MeOH; 95:5 a 0:100 em 40’, com fluxo de 1,0 mL/mim. a 254 nm)
12.0 11.5 11.0 10.5 10.0 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 -0.5 -1.0
DMSO-d6
0.89
1.91
2.49
2.74
2.85
3.18
3.48
3.62
3.70
4.16
4.21
6.65
6.67
6.70
6.96
6.98
7.00
7.20
7.22
7.26
7.28
7.30
10.6
610
.8310.9
1
Figura 79: Espectro de RMN de 1H do extrato de Mc-7F.7 (DMSO-d6 a 11,7 T)
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ______________________________________________Anexos 139
Figura 80: Cromatograma em grad. explorat. do extrato AcOEt Mc-7F.8 (H2O+0,5% HAc/MeOH; 95:5 a 0:100 em 40’, com fluxo de 1,0 mL/mim. a 254 nm)
11.0 10.5 10.0 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5
DMSO-d6
1.91
2.49
2.49
2.84
2.85
2.87
3.47
3.53
3.61
4.06
4.19
4.21
4.22
5.95
6.72
7.05
7.06
7.18
7.20
7.25
7.26
7.41
10.8
3
Figura 81: Espectro de RMN de 1H do extrato de Mc-7F.8 (DMSO-d6 a 11,7 T)
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ______________________________________________Anexos 140
Figura 82: Cromatograma em grad. explorat. do extrato AcOEt Mc-7F.9 (H2O+0,5% HAc/MeOH; 95:5 a 0:100 em 40’, com fluxo de 1,0 mL/mim. a 254 nm)
11.0 10.5 10.0 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5
1.92
2.50
2.86
2.87
2.89
3.36
3.71
4.23
4.24
4.26
6.97
7.08
7.18
7.19
7.26
7.36
7.44
10.9
1
Figura 83: Espectro de RMN de 1H do extrato de Mc-7F.9 (DMSO-d6 a 11,7 T)
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ______________________________________________Anexos 141
Figura 84: Cromatograma em grad. explorat. do extrato AcOEt Mc-7F.10 (H2O+0,5% HAc/MeOH; 95:5 a 0:100 em 40’, com fluxo de 1,0 mL/mim. a 254 nm)
11.0 10.5 10.0 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5
DMSO-d6
0.93
1.23
2.49
2.85
2.86
2.88
3.32
3.62
4.23
4.24
4.25
7.17
7.19
7.28
7.29
10.8
310
.90
Figura 85: Espectro de RMN de 1H do extrato de Mc-7F.10 (DMSO-d6 a 11,7 T)
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ______________________________________________Anexos 142
Figura 86: Cromatograma em grad. explorat. do extrato AcOEt Mc-7F.11 (H2O+0,5% HAc/MeOH; 95:5 a 0:100 em 40’, com fluxo de 1,0 mL/mim. a 254 nm)
11.0 10.5 10.0 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0
DMSO-d6
0.84
1.23
1.48
2.17
2.49
3.17
3.33
3.50
4.04
5.32
7.23
10.8
310
.87
Figura 87: Espectro de RMN de 1H do extrato de Mc-7F.11 (DMSO-d6 a 11,7 T)
7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0
Chloroform-d
7.25
6.81
6.79
6.77
6.76
6.32
6.32
6.28
6.28
5.47
5.46
4.06
3.94
3.86
3.79
3.78
3.48
3.26
2.92
2.88 2.5
32.2
82.2
82.2
62.2
12.1
62.0
91.9
61.9
6 1.95
1.95
1.37
1.24
1.23 1.1
91.1
8
6.82
6.81
6.79
6.79
6.78
6.77
6.76
6.75 6.3
26.3
26.3
16.3
1
6.29
6.28
6.28
6.28
1.951.9
5
1.961.9
6
Figura 88: Espectro de RMN de 1H de (1) (DMSO-d6 a 11,7 T)
O
CH3
O
O
O
CH3
H3 C
1
2
3 4 5 67
4'5'
6'
7'
8
190 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10
Chloroform-d
18.23
18.47
18.6422
.7451.6152
.83
56.34
56.45
64.37
77.00
87.71
114.0
211
4.26
133.1
0
147.1
8
161.4
616
3.06
168.7
4
190.4
8
Figura 89: Espectro de RMN de 13C de (1) (DMSO-d6 a 11,7 T)
O
CH3
O
O
O
CH3
H3 C
1
2
3 4 5 67
4'5'
6'
7'
8
15 .020 .025.030.035.040.045.050.055.060.065.070.075.080.085.090.0
2 .00
2.25
2.50
2.75
3.00
3.25
3.50
3.75
4.00
4.25
4.50
4.75
5.00
5.25
5.50ppm (f1
130.0132.5135.0137.5140.0142.5145.0147.5150 .0
6 .25
6 .50
6 .75
7 .00ppm (f1
Figura 90: Mapa de contorno gHMQC de (1) (DMSO-d6 a 11,7 T)
O
CH3
O
O
O
CH3
H3 C
1
2
3 4 5 67
4'5'
6'
7'
8
132538506 3758810011312513815016 31751 88
1 .5 0
2 .0 0
2 .5 0
3 .0 0
3 .5 0
4 .0 0
4 .5 0
5 .0 0
5 .5 0
6 .0 0
6 .5 0
7 .0 0ppm (f1
Figura 91: Mapa de contorno gHMBC de (1) (DMSO-d6 a 11,7 T)
O
CH3
O
O
O
CH3
H3 C
1
2
3 4 5 67
4'5'
6'
7'
8
2 .002 .503 .003 .504 .004 .505 .0 05 .506 .0 06 .507 .0 07 .50
1 .0
2 .0
3 .0
4 .0
5 .0
6 .0
7 .0
ppm ( f1
Figura 92: Espectro de RMN de gCOSY de (1) (DMSO-d6 a 11,7 T)
O
CH3
O
O
O
CH3
H3 C
1
2
3 4 5 67
4'5'
6'
7'
8
135.0953 149.0754 163.0923 177.0724191.0892
209.1018
+MS2(209.1000), 5eV, Profile, 0.7min #14, 100%=9465
+MS2(209.1000), 10eV, Profile, 1.0min #19, 100%=1785
0.0
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
4x10
2500 Figura 93: Espectro de Massas de (1)
O
CH3
O
O
O
CH3
H3 C
1
2
3 4 5 67
4'5'
6'
7'
8
7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5
Chloroform-d
1.171.1
8
1.94
1.95
1.96
1.962.0
72.1
62.2
3
2.70
2.71
2.73
2.74
2.90
2.91
2.94
3.26
3.78
3.84
5.46
7.25
2.90
2.91
2.93
2.94
2.70
2.712.7
3
2.74
3.78
3.79
3.79
3.80
3.80
3.80
3.81
3.81
3.82
3.82
3.82
3.83
3.83
3.84
3.84
Figura 94: Espectro de RMN de 1H de (2) (DMSO-d6 a 11,7 T)
OO
O
CH3
H3 CO OCH3
1
2
34 '
5 '
6 '
7 '
8
45
6 7
200 190 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10
Chloroform-d
18.30
18.93
51.59
56.15
56.33
73.69
76.75
77.00
77.25
87.64
87.68
114.2
611
5.91
162.6
016
3.44
168.3
9
199.2
8
162.6
0
163.4
4
56.15
56.33 18.30
18.93
Figura 95: Espectro de RMN de 13C de (2) (DMSO-d6 a 11,7 T T)
OO
O
CH3
H3 CO OCH3
1
2
34 '
5 '
6 '
7 '
8
45
6 7
0255075100125150175200
1.00
1.50
2.00
2.50
3.00
3.50
4.00
4.50
5.00
5.50
6.00
ppm (f1
45.050.055.060.065.070.075.0
3.800
3.850
3.900
ppm (f1
Figura 96: Mapa de contorno gHMQC de (2) (DMSO-d6 a 11,7 T)
OO
O
CH3
H3 CO OCH3
1
2
34 '
5 '
6 '
7 '
8
45
6 7
132538506375881001131251 38150163175188200
1.25
1.50
1.75
2.00
2.25
2.50
2.75
3.00
3.25
3.50
3.75
4.00
4.25
4.50
4.75
5.00
5.25
5.50
5.75ppm (f1
Figura 97: Mapa de contorno gHMBC de (2) (DMSO-d6 a 11,7 T)
OO
O
CH3
H3 CO OCH3
1
2
34 '
5 '
6 '
7 '
8
45
6 7
0 .501 .001 .502 .002 .503 .003 .5 04 .004 .505 .005 .506 .006 .507 .0 0
1 .0 0
1 .5 0
2 .0 0
2 .5 0
3 .0 0
3 .5 0
4 .0 0
4 .5 0
5 .0 0
5 .5 0
6 .0 0
6 .5 0
7 .0 0
ppm (f1
Figura 98: Espectro de RMN de gCOSY de (2) (DMSO-d6 a 11,7 T)
OO
O
CH3
H3 CO OCH3
1
2
34 '
5 '
6 '
7 '
8
45
6 7
172.8788 191.0867209.1032
263.1154
+MS2(263.1000), 10eV, Profi le, 2.3min #44, 100%=317
+MS2(263.1000), 10eV, Profi le, 2.4min #45, 100%=402
0.0
0
100
200
300
400
600 Figura 99: Espectro de Massas de (2)
OO
O
CH3
H3 CO OCH3
1
2
34 '
5 '
6 '
7 '
8
45
6 7
6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0
DMSO-d6
1.08
1.22
1.56
1.90
2.06
2.13
2.17
2.49
2.74
3.16
3.39
3.77
3.84
4.01
4.03
4.04
5.56
5.66
2.72
2.73
2.74
2.06
2.07 1.0
81.0
9
Figura 100: Espectro de RMN de 1H de (3) (DMSO-d6 a 11,7 T)
OO
O
CH3
H3 CO OH
1
2
34'5 '
6 '
7 '
8
4 5 6 7
102030405060708090
2 .0
3 .0
4 .0
5 .0
6 .0
ppm (f1
Figura 101: Mapa de contorno gHMQC de (3) (DMSO-d6 a 11,7 T)
OO
O
CH3
H3 CO OH
1
2
34'5 '
6 '
7 '
8
4 5 6 7
13253850637588100113125138150163175188200
1.00
1.25
1.50
1.75
2.00
2.25
2.50
2.75
3.00
3.25
3.50
3.75
4.00
4.25ppm (f1
Figura 102: Mapa de contorno gHMBC de (3) (DMSO-d6 a 11,7 T)
OO
O
CH3
H3 CO OH
1
2
34'5 '
6 '
7 '
8
4 5 6 7
1.001.502.002.503.003.504.004.505.005 .50
1.00
1.50
2.00
2.50
3.00
3.50
4.00
4.50
5.00
5.50ppm (f1
Figura 103: Espectro de RMN gCOSY de (3) (DMSO-d6 a 11,7 T)
OO
O
CH3
H3 CO OH
1
2
34'5 '
6 '
7 '
8
4 5 6 7
203.0882231.0843
249.0972
+MS2(249.1000), 5eV, Profile, 0.5min #11, 100%=7754
+MS2(249.1000), 10eV, Profi le, 0.7min #14, 100%=7300.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.04x10
1000
Figura 104: Espectro de Massas de (3)
OO
O
CH3
H3 CO OH
1
2
34'5 '
6 '
7 '
8
4 5 6 7
7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0
DMSO-d6
0.90
1.08
1.15
1.58
1.59
2.15
2.49
2.69
3.63
3.65
3.68
3.81
7.38
7.42
2.68
2.69
2.70
1.55
1.56
1.58
1.59
1.60
1.62
0.89
0.90
0.92
Figura 105: Espectro de RMN de 1H de (4) (DMSO-d6 a 11,7 T)
CH3
OOCH3
CH3
O
HO8
7
65
4
32
1
9
10
11
1213
210 200 190 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
DMSO-d6
13.4
416
.36
18.1
9
39.1
639
.33
39.5
039
.67
45.4
0
55.7
7
109.
27
113.
76
123.
70134.
63
155.
56
206.
46
135.0 134.5 134.0
134.
55134.
63
Figura 106: Espectro de RMN de 13C de (4) (DMSO-d6 a 11,7 T)
CH3
OOCH3
CH3
O
HO8
7
65
4
32
1
9
10
11
1213
13253850637588100113125
1.00
1.50
2.00
2.50
3.00
3.50
4.00
4.50
5.00
5.50
6.00
6.50
7.00
7.50ppm (f1
Figura 107: Mapa de contorno gHMQC de (4) (DMSO-d6 a 11,7 T)
CH3
OOCH3
CH3
O
HO8
7
65
4
32
1
9
10
11
1213
13253850637588100113125138150163175188200
1 .00
1 .50
2 .00
2 .50
3 .00
3 .50
4 .00
4 .50
5 .00
5 .50
6 .00
6 .50
7 .00
7 .50ppm (f1
Figura 108: Mapa de contorno gHMBC de (4) (DMSO-d6 a 11,7 T)
CH3
OOCH3
CH3
O
HO8
7
65
4
32
1
9
10
11
1213
0.500.751.001.251.501.752.002.252.502.753.003.253.503.754.004.254.50
0.50
1.00
1.50
2.00
2.50
3.00
3.50
4.00
4.50
5.00ppm (f1
Figura 109: Espectro de gCOSY de (4) (DMSO-d6 a 11,7 T)
CH3
OOCH3
CH3
O
HO8
7
65
4
32
1
9
10
11
1213
7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0
3.81
7.41
8 7 6 5 4 3 2
2.10
7.42
7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5
2.15
2.63
2.802.917.47
5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5
0.94
1.67
2.21
2.69
3.82
8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5
3.82
7.38
Figura 110: Espectro de NOESY 1D de (4) (DMSO-d6 a 11,7 T)
175.1304
203.0896 219.1244237.1361
247.0825
259.1198
281.1039301.1713
120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 m/z0
1
2
3
5x10Intens.
Mc-8R Pa 2 - ESI - POS.d: +MS, 100%=523393 Figura 111: Espectro de Massas de (4)
CH3
OOCH3
CH3
O
HO8
7
65
4
32
1
9
10
11
1213
7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0
Chloroform-d
0.06
1.24
1.92
1.931.9
3
2.22
3.82
6.33
6.336.3
66.3
66.5
26.5
36.5
56.5
77.25
7.47
7.59
6.51
6.52
6.53
6.546.5
56.5
5
6.57
6.58
6.33
6.33
6.33
6.336.3
66.3
66.3
6
1.911.9
2
1.931.9
3
Figura 112: Espectro de RMN de 1H de (5) (DMSO-d6 a 11,7 T)
CH3
OOCH3
CH3
O
HO8
7
65
4
32
1
9
10
11
1213
200 190 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20
Chloroform-d
18.52
18.80
55.97
76.7577
.0077
.25
109.6
5
114.2
7
124.7
2
130.3
4
133.4
413
4.61
136.5
2
147.5
8
156.5
0
171.2
8197.2
3
133.4
4
134.6
1136.5
2
18.52
18.80
Figura 113: Espectro de RMN de 13C de (5) (DMSO-d6 a 11,7 T)
CH3
OOCH3
CH3
O
HO8
7
65
4
32
1
9
10
11
1213
13253850637588100113125138150
2.00
2.50
3.00
3.50
4.00
4.50
5.00
5.50
6.00
6.50
7.00
7.50
8.00ppm (f1
Figura 114: Mapa de contorno gHMQC de (5) (DMSO-d6 a 11,7 T)
CH3
OOCH3
CH3
O
HO8
7
65
4
32
1
9
10
11
1213
13253850637588100113125138150163175188200
2.00
2.50
3.00
3.50
4.00
4.50
5.00
5.50
6.00
6.50
7.00
7.50
ppm (f1
Figura 115: Mapa de contorno gHMBC de (5) (DMSO-d6 a 11,7 T)
CH3
OOCH3
CH3
O
HO8
7
65
4
32
1
9
10
11
1213
0.000.501.001 .502.002 .503.003.504.004.505 .005.506.006.507.007.508.008.50
0.00
0.50
1.00
1.50
2.00
2.50
3.00
3.50
4.00
4.50
5.00
5.50
6.00
6.50
7.00
7.50
8.00
8.50ppm (f1
Figura 116: Espectro de gCOSY de (5) (DMSO-d6 a 11,7 T)
CH3
OOCH3
CH3
O
HO8
7
65
4
32
1
9
10
11
1213
193.0702
235.1198
257.1041
273.0782
100 150 200 250 300 350 400 450 m/z0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
6x10Intens.
Mc-8R 4-3 - ESI - POS.d: +MS, 100%=1395880 Figura 117: Espectro de Massas de (5)
CH3
OOCH3
CH3
O
HO8
7
65
4
32
1
9
10
11
1213
8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0
DMSO-d6
1.10
1.12
1.21
1.861.8
61.8
7
2.10
2.18
2.49
2.752.7
62.7
92.8
02.8
12.8
5
3.42
3.443.6
73.7
53.8
2
4.05
4.07
4.08
4.09
6.286.3
16.3
16.4
36.4
46.4
56.4
76.4
9
6.50
7.38
7.41
7.44
8.28
2.75
2.76
2.792.8
02.8
0
2.81
2.83
2.85
4.04
4.05
4.07
4.08
4.09
4.10
1.10
1.12
Figura 118: Espectro de RMN de 1H de (6) (DMSO-d6 a 11,7 T)
CH3
OO CH3
CH3
O
HO
O H
8
7
65
4
32
1
9
1 0
1 1
1 21 3
200 190 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10
DMSO-d6
18.40
23.73
39.50
53.45
55.83
62.78
109.2
2
123.4
912
3.84
132.2
313
2.87
134.4
813
5.48
147.8
5
155.7
615
5.96166.7
7
196.3
2
205.4
7
155.7
615
5.96
132.2
3132.8
713
3.01
134.4
8
135.4
8
132.2
3132.8
713
3.01
134.4
8
Figura 119: Espectro de RMN de 13C de (6) (DMSO-d6 a 11,7 T)
CH3
OO CH3
CH3
O
HO
O H
8
7
65
4
32
1
9
1 0
1 1
1 21 3
13253850637588100113125
1.00
1.50
2.00
2.50
3.00
3.50
4.00
4.50
5.00
5.50
6.00
6.50
7.00
7.50
ppm (f1
Figura 120: Mapa de contorno gHMQC de (6) (DMSO-d6 a 11,7 T)
CH3
OO CH3
CH3
O
HO
O H
8
7
65
4
32
1
9
1 0
1 1
1 21 3
132538506375881001131251381501631 75188200213
1.50
2.00
2.50
3.00
3.50
4.00
4.50
5.00
5.50
6.00
6.50
7.00
7.50ppm (f1
Figura 121: Mapa de contorno gHMBC de (6) (DMSO-d6 a 11,7 T)
CH3
OO CH3
CH3
O
HO
O H
8
7
65
4
32
1
9
1 0
1 1
1 21 3
1.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.006.507.007.50
1.00
1.50
2.00
2.50
3.00
3.50
4.00
4.50
5.00
5.50
6.00
6.50
7.00
7.50ppm (f1
Figura 122: Espectro de gCOSY de (6) (DMSO-d6 a 11,7 T)
CH3
OO CH3
CH3
O
HO
O H
8
7
65
4
32
1
9
1 0
1 1
1 21 3
193.0703
235.1198
257.1040
275.1172
291.0915340.1236
393.3359
50 100 150 200 250 300 350 400 450 m/z0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
6x10Intens.
Mc-8R 3-4 - ESI - POS.d: +MS, 100%=1391109 Figura 123: Espectro de Massas de (6)
CH3
OO CH3
CH3
O
HO
O H
8
7
65
4
32
1
9
1 0
1 1
1 21 3
7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5
DMSO-d6
0.67
1.22
1.28
1.671.6
81.6
91.7
11.7
21.7
4
2.14
2.49
2.72
2.74
2.75
3.39
3.41
3.42
3.50
3.77
3.81
3.91
7.38
7.41
2.72
2.74
2.75
1.671.6
8
1.69
1.71
1.72
1.74
3.39
3.41
3.42
Figura 124: Espectro de RMN de 1H de (7) (DMSO-d6 a 11,7 T)
OO CH3
CH3
O
HO
O H
8
7
65
4
32
1
9
10
11
1213
210 200 190 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20
18.25
26.46
55.77
59.91
109.2
2
113.7
5
123.6
4
134.4
8155.4
6
206.6
8
DMSO-d6
39.50
40.36
134.2
5
134.4
8
Figura 125: Espectro de RMN de 13C de (7) (DMSO-d6 a 11,7 T)
OO CH3
CH3
O
HO
O H
8
7
65
4
32
1
9
10
11
1213
253850637588100113125
1.50
2.00
2.50
3.00
3.50
4.00
4.50
5.00
5.50
6.00
6.50
7.00
7.50
ppm (f1
Figura 126: Mapa de contorno gHMQC de (7) (DMSO-d6 a 11,7 T)
OO CH3
CH3
O
HO
O H
8
7
65
4
32
1
9
10
11
1213
1325385063758810011312513 81501631751 88200213
1.00
1.50
2.00
2.50
3.00
3.50
4.00
4.50
5.00
5.50
6.00
6.50
7.00
7.50ppm (f1
Figura 127: Mapa de contorno gHMBC de (7) (DMSO-d6 a 11,7 T)
OO CH3
CH3
O
HO
O H
8
7
65
4
32
1
9
10
11
1213
0.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.006.507.007.50
0.50
1.00
1.50
2.00
2.50
3.00
3.50
4.00
4.50
5.00
5.50
6.00
6.50
7.00
7.50
ppm (f1
Figura 128: Espectro de gCOSY de (7) (DMSO-d6 a 11,7 T)
OO CH3
CH3
O
HO
O H
8
7
65
4
32
1
9
10
11
1213
235.0970
275.0894
307.0256348.0515
393.2968
449.2865
493.3139
100 200 300 400 500 600 700 800 m/z0
2
4
6
5x10Intens.
Mc-8R 3-6-6- ESI - POS.d: +MS, 100%=690184 Figura 129: Espectro de Massas de (7)
OO CH3
CH3
O
HO
O H
8
7
65
4
32
1
9
10
11
1213
7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0
Chloroform-d
0.06
0.87
1.19
2.22
2.29
2.39
2.46
2.54
2.88
3.78
3.82
3.89
3.94
7.25
7.46
7.62
2.86
2.88
2.89
2.91
1.18
1.19
1.21
Figura 130: Espectro de RMN de 1H de (8) (DMSO-d6 a 11,7 T)
CH3
OOCH3
CH3
O
HO
200 190 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10
Chloroform-d
7.00
19.54
29.80
56.21
77.00
110.0
9
114.2
9
125.7
2
129.3
9
140.6
4
159.0
4
195.7
4
201.4
4
Figura 131: Espectro de RMN de 13C de (8) (DMSO-d6 a 11,7 T)
CH3
OOCH3
CH3
O
HO
13253850637588100113125
1.00
1.50
2.00
2.50
3.00
3.50
4.00
4.50
5.00
5.50
6.00
6.50
7.00
7.50
ppm (f1
Figura 132: Mapa de contorno gHMQC de (8) (DMSO-d6 a 11,7 T)
CH3
OOCH3
CH3
O
HO
013253850637588100113125138150163175188200213225
0.00
0.50
1.00
1.50
2.00
2.50
3.00
3.50
4.00
4.50
5.00
5.50
6.00
6.50
7.00
7.50ppm (f1
Figura 133: Mapa de contorno gHMBC de (8) (DMSO-d6 a 11,7 T)
CH3
OOCH3
CH3
O
HO
1.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.006.507.007.50
1.00
1.50
2.00
2.50
3.00
3.50
4.00
4.50
5.00
5.50
6.00
6.50
7.00
7.50ppm (f1
Figura 134: Espectro de gCOSY de (8) (DMSO-d6 a 11,7 T)
CH3
OOCH3
CH3
O
HO
149.0713
205.1022
252.1431
273.0944
346.0642
371.3430
393.3274
465.2629 523.1947
238.1259
193.0656
262.0351
289.0903
306.0286
100 200 300 400 500 m/z0.0
0.5
1.0
1.5
5x10Intens.
Mc-8R 4-2- ESI - POS.d: +MS, 100%=166979 Figura 135: Espectros de Massas de (8)
CH3
OOCH3
CH3
O
HO
7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0
Chloroform-d
0.06
0.62
0.80
0.81
0.82
0.83
0.93
1.02
1.03
1.24
1.26
1.29
1.31
1.33
1.47
1.60
1.86
2.03
2.29
2.76
3.65
4.11
4.13
4.14
4.15
4.27
5.14
5.16
5.17
5.19
5.21
5.245.3
75.3
85.55
5.55
5.56
6.21
6.23
6.48
6.49
7.25
0.62
0.80
0.81
0.81
0.82
0.83
0.83
0.85
0.87
0.89
0.90
0.90
0.910.9
3
1.00
1.02
1.03
5.55
5.55
5.56
5.56
5.36
5.36
5.37
5.37
5.38
5.14
5.16
5.17
5.19
5.19
5.21
5.225.2
4
3.593.6
03.613.6
23.6
3
3.65
Figura 136: Espectro de RMN de 1H de (9) (CDCl3 a 11,7 T)
HO
HH1
2
34
5
6
7
8
9
1 0
1 11 2
1 3
1 4 1 51 6
1 7
1 8
1 9
2 12 2
2 3 2 42 5
2 6
2 7
2 8
2 0
140 135 130 125 120 115 110 105 100 95 90 85 80 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10
Chloroform-d
12.04
14.08
16.28
17.59
19.63
19.94
21.09
22.67
23.00
28.26
29.69
31.91
31.99
33.09
37.04
38.38
39.11
40.38
40.80
42.83
46.28
54.5755
.78
70.48
76.75
77.00
77.25
116.3
0
119.5
9
132.0
0
135.5
6
139.7
714
1.31
12.04
14.08
16.28
17.59
19.63
19.94
21.09
21.13
22.67
23.00
28.26
29.34
29.69
29.7631
.9131
.9933
.09
37.04
38.38
39.11
40.38
40.80
42.83
42.85
46.28
Figura 137: Espectro de RMN de 13C de (9) (CDCl3 a 11,7 T)
HO
HH1
2
34
5
6
7
8
9
1 0
1 11 2
1 3
1 4 1 51 6
1 7
1 8
1 9
2 12 2
2 3 2 42 5
2 6
2 7
2 8
2 0
7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0
Chloroform-d
0.06
0.73
0.80
0.81
0.87
0.90
0.99
1.00
1.08
1.20
1.21
1.23
1.24
1.31
1.33
1.44
1.48
1.49
1.49
1.57
1.58
1.69
1.70
1.90
1.92
1.95
1.96
2.33
3.80
3.923.9
33.9
53.9
63.9
73.9
83.9
94.0
0
5.11
5.13
5.14
5.165.1
95.2
15.2
4
6.226.2
36.48
6.50
7.25
0.80
0.81
0.81
0.82
0.82
0.83
0.83
0.87
0.88
0.89
0.90
0.90
0.91
0.98
0.99
0.99
1.00
6.226.2
36.48
6.50
5.11
5.13
5.145.1
6
5.18
5.19
5.21
5.22
5.24
3.92
3.93
3.95
3.96
3.97
3.98
3.99
4.00
Figura 138: Espectro de RMN de 1H de (10) (CDCl3 a 11,7 T)
HO
O
O
12
34
5
67
8
9
1 0
1 11 2
1 3
1 4 1 51 6
1 7
1 8
1 9
2 1
2 2
2 32 4
2 52 6
2 7
2 82 0
135 130 125 120 115 110 105 100 95 90 85 80 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10
Chloroform-d
12.8
814
.08
17.5
518
.17
19.6
319
.93
20.6
420
.88
22.6
723
.41
28.6
130
.1433
.08
34.7
3
36.9
6
39.3
839
.68
42.7
944
.58
51.1
651
.71
56.2
6
66.4
8
76.7
577
.00
77.2
579
.42
82.1
4
114.
27
130.
7413
2.33
135.
2013
5.41
12.88
14.08
17.55
18.17
19.63
19.93
20.64
20.88
22.67
23.4128.61
29.69
30.14
31.91
33.08
34.7336
.9639.38
39.68
42.79
44.58
51.16
51.71
56.26
130.7
4
132.3
3
135.2
013
5.41
Figura 139: Espectro de RMN de 13C de (10) (CDCl3 a 11,7 T)
HO
O
O
12
34
5
67
8
9
1 0
1 11 2
1 3
1 4 1 51 6
1 7
1 8
1 9
2 1
2 2
2 32 4
2 52 6
2 7
2 82 0
255075100125
0.50
1.00
1.50
2.00
2.50
3.00
3.50
4.00
4.50
5.00
5.50
6.00
6.50
10.015.020.025.030.035.040.045.050.055.060.0
0.75
1.00
1.25
1.50
1.75
2.00
2.25
Figura 140: Mapa de contorno gHMQC de (10) (CDCl3 a 11,7 T)
HO
O
O
12
34
5
67
8
9
1 0
1 11 2
1 3
1 4 1 51 6
1 7
1 8
1 9
2 1
2 2
2 32 4
2 52 6
2 7
2 82 0
50100
1.0
2 .0
3 .0
4 .0
5 .0
6 .0
Figura 141: Mapa de contorno gHMBC de (10) (CDCl3 a 11,7 T)
HO
O
O
12
34
5
67
8
9
1 0
1 11 2
1 3
1 4 1 51 6
1 7
1 8
1 9
2 1
2 2
2 32 4
2 52 6
2 7
2 82 0
11.0 10.5 10.0 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 -0.5 -1.0
DMSO-d6
1.00
1.02
1.79
2.49
2.52
2.61
3.193.2
03.2
13.3
63.4
73.4
8
5.43
5.44
7.35
7.37
10.79
10.95
7.35
7.37
5.43
5.44
10.79
10.95
Figura 142: Espectro de RMN de 1H de (11) (DMSO-d6 a 11,7 T)
N
N
O
O1 2
34
5
6
190 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
DMSO-d6
39.50
100.1
9
113.7
8
142.1
3
151.4
5
164.3
1
Figura 143: Espectro de RMN de 13C de (11) (DMSO-d6 a 11,7 T)
N
N
O
O1 2
34
5
6
255075100125150
2.50
3.00
3.50
4.00
4.50
5.00
5.50
6.00
6.50
7.00
7.50
ppm (f1
98.099.0100.010 1.0102.0103.0
5.350
5.400
5.450
5.500
5.550ppm (f1
141.0142.0143.0144.0
7.300
7.350
7.400
7.450
ppm (f1
Figura 144: Mapa de contorno gHMQC de (11) (DMSO-d6 a 11,7 T)
N
N
O
O1 2
34
5
6
100110120130140150160
5.50
6.00
6.50
7.00
7.50
ppm (f1
Figura 145: Mapa de contorno gHMBC de (11) (DMSO-d6 a 11,7 T)
N
N
O
O1 2
34
5
6
2.55 .07.510.0
2 .5
5 .0
7 .5
10.0
ppm (f1
5 .255.505.756.006.256.506.757.007.25
5.255.505.756.006.256.506.757.007.257.50
ppm (f1
Figura 146: Espectro de gCOSY de (11) (DMSO-d6 a 11,7 T)
N
N
O
O1 2
34
5
6
9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5
DMSO-d6
0.66
1.02
1.22
1.40
1.70
1.71
1.72
2.49
2.49
2.91
2.92
2.92
2.93
3.23
3.24
3.27
3.37
3.39
3.41
3.51
3.53
4.03
4.04
4.23
4.24
6.62
6.64
6.65
7.03
7.04
7.78
9.67
6.626.6
46.6
5
7.03
7.04
4.024.0
34.0
44.0
5
4.22
4.23
4.24
3.22
3.233.2
43.25
3.27
3.37
3.39
3.40
3.41
3.43
3.50
3.51
3.53
2.88
2.89
2.912.9
22.9
22.9
3
2.95
2.96
2.57
2.59
2.60
1.97
1.98
1.99
2.00
2.01
2.02
1.68
1.70
1.71
1.72
1.72
1.74
1.36
1.381.4
01.40
1.42
1.44
Figura 147: Espectro de RMN de 1H de (12) (DMSO-d6 a 11,7 T)
N
N
O
O
OHH
H
123
45 6
78
9
1 01 '
2 '
3 '
4 '5 '
6 '
170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20
DMSO-d6
21.78
27.76
34.70
38.99
39.16
39.34
39.50
39.67
39.84
40.01
44.4955
.9658
.34
113.7
711
4.74
114.9
0
126.9
9
129.5
913
0.70
155.8
4
165.0
5
168.8
1
113.7
7
114.7
411
4.90
126.9
9
129.5
9
130.7
0
Figura 148: Espectro de RMN de 13C de (12) (DMSO-d6 a 11,7 T)
N
N
O
O
OHH
H
123
45 6
78
9
1 01 '
2 '
3 '
4 '5 '
6 '
255075100125
1.50
2.00
2.50
3.00
3.50
4.00
4.50
5.00
5.50
6.00
6.50
7.00
7.50
ppm (f1
Figura 149: Mapa de contorno gHMQC de (12) (DMSO-d6 a 11,7 T)
N
N
O
O
OHH
H
123
45 6
78
9
1 01 '
2 '
3 '
4 '5 '
6 '
255075100125150
2.00
2.50
3.00
3.50
4.00
4.50
5.00
5.50
6.00
6.50
7.00
7.50
ppm (f1
Figura 150: Mapa de contorno gHMBC de (12) (DMSO-d6 a 11,7 T)
N
N
O
O
OHH
H
123
45 6
78
9
1 01 '
2 '
3 '
4 '5 '
6 '
1.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.006.507.007.50
1.00
1.50
2.00
2.50
3.00
3.50
4.00
4.50
5.00
5.50
6.00
6.50
7.00
7.50
8.00ppm (f1
Figura 151: Espectro de gCOSY de (12) (DMSO-d6 a 11,7 T)
N
N
O
O
OHH
H
123
45 6
78
9
1 01 '
2 '
3 '
4 '5 '
6 '
8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5
2.92
4.03
4.23
7.03
7.78
5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0
1.71
1.99
4.03
4.23
Figura 152: Espectro de NOESY 1D de (12) (DMSO-d6 a 11,7 T)
261.1276
283.1099
393.3047
100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z0
1
2
3
4
5
5x10Intens.
MC 7 F-51-6 - POS.d: +MS, 100%=503800 Figura 153: Espectro de Massas de (12)
N
N
O
O
OHH
H
123
45 6
78
9
1 01 '
2 '
3 '
4 '5 '
6 '
8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5
DMSO-d6
7.90
7.77
7.47
4.10
3.90
3.41 3.4
03.4
03.3
3
2.49
2.49
2.33
2.12
2.02
1.85 1.8
31.8
31.8
0
1.22
1.01
1.00
0.85
0.84
0.67
3.383.4
03.4
0
3.41
3.42
3.44
1.75
1.77
1.78
1.80
1.81
1.82
1.83
1.83
1.841.8
5
1.86
4.094.1
04.1
2
2.10
2.12
2.13
2.14
2.15
2.15
2.30
2.30
2.31
2.32
2.33
2.33
2.34
2.35
2.36
2.36
0.840.85
1.00
1.01
Figura 154: Espectro de RMN de 1H de (13) (DMSO-d6 a 11,7 T)
12
34
5 67
8
9N
NH
O
O
H
H
1 0
1 1
1 2
170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20
16.36
18.24
21.98
27.79
38.99
39.16
39.33
39.50
39.67
39.84
40.01
44.55
58.17
59.44
113.7
4
165.1
6
170.1
3
28 27 26 25 24 23 22 21 20 19 18 17 16
16.3
6
18.2
4
21.9
8
27.6
927.7
9
Figura 155: Espectro de RMN de 13C de (13) (DMSO-d6 a 11,7 T)
12
34
5 67
8
9N
NH
O
O
H
H
1 0
1 1
1 2
255075100125
1.00
1.50
2.00
2.50
3.00
3.50
4.00
4.50
5.00
5.50
6.00
6.50
7.00
7.50
8.00
ppm (t1
Figura 156: Mapa de contorno gHMQC de (13) (DMSO-d6 a 11,7 T)
12
34
5 67
8
9N
NH
O
O
H
H
1 0
1 1
1 2
255075100125150
1.00
1.50
2.00
2.50
3.00
3.50
4.00
4.50
5.00
5.50
6.00
6.50
7.00
7.50
8.00ppm (t1
Figura 157: Mapa de contorno gHMBC de (13) (DMSO-d6 a 11,7 T)
12
34
5 67
8
9N
NH
O
O
H
H
1 0
1 1
1 2
0.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.006.507.007.508.00
1.00
1.50
2.00
2.50
3.00
3.50
4.00
4.50
5.00
5.50
6.00
6.50
7.00
7.50
8.00
8.50ppm (f1
Figura 158: Espectro de gCOSY de (13) (DMSO-d6 a 11,7 T)
12
34
5 67
8
9N
NH
O
O
H
H
1 0
1 1
1 2
5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0
2.113.90
4.10
8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5
0.83
0.99
2.33
3.90
4.107.89
Figura 159: Espectro de NOESY 1D de (13) (DMSO-d6 a 11,7 T)
161.0750183.0579
197.1348
219.1156
265.1217283.1109
75 100 125 150 175 200 225 250 275 300 m/z0
1
2
3
4
5
5x10Intens.
MC 7 F-2-4 - POS.d: +MS, 100%=481509 Figura 160: Espectro de Massas de (13)
12
34
5 67
8
9N
NH
O
O
H
H
1 0
1 1
1 2
10.5 10.0 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5
DMSO-d610
.13 7.30 7.2
87.1
57.1
4
6.90
6.76
6.75
3.58
3.50
3.30
2.71
2.49
2.49
1.23
0.85
0.67
6.88
6.88
6.90
6.90
6.91
6.91
7.14
7.14
7.157.1
5
7.17
7.17
2.71
2.74
6.756.7
6
7.28
7.30
Figura 161: Espectro de RMN de 1H de (14) (DMSO-d6 a 11,7 T)
NH2
OH
O1
23
45
6
78
180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10
DMSO-d6
39.50
109.2
8
113.7
4
121.1
712
3.80
128.7
4
142.2
0178.1
9
Figura 162: Espectro de RMN de 13C de (14) (DMSO-d6 a 11,7 T)
NH2
OH
O1
23
45
6
78
405060708090100110120130
2.50
3.00
3.50
4.00
4.50
5.00
5.50
6.00
6.50
7.00
7.50
ppm (f1
110.0112.5115.0117.5120.0122.5125.0127.5
6.60
6.70
6.80
6.90
7.00
7.10
7.20
7.30
7.40
7.50ppm (f1
39.040.041.042.043.044.0
2.7002.7102.7202.7302.7402.750ppm (f1
Figura 163: Mapa de contorno gHMQC de (14) (DMSO-d6 a 11,7 T)
NH2
OH
O1
23
45
6
78
pp m ( f2)110 .0115 .0120 .0125.0130 .0135.0140 .0145 .0150.0155 .0
6 .25
6 .50
6 .75
7 .00
7 .25
ppm (f1
176.0177 .0178 .0179.0180 .0181.0
2 .600
2 .650
2 .700
2 .750
2 .800ppm (f1
Figura 164: Mapa de contorno gHMBC de (14) (DMSO-d6 a 11,7 T)
NH2
OH
O1
23
45
6
78
6.506.757.007.257.50
6.50
6.75
7.00
7.25
7.50ppm (f1
Figura 165: Espectro de gCOSY de (14) (DMSO-d6 a 11,7 T)
NH2
OH
O1
23
45
6
78
85.0712
107.0519
146.0730
191.1135
230.0661
252.0479
301.1718
313.0921
185.1347104.0429
50 100 150 200 250 300 350 m/z0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
5x10Intens.
MC-7 F-2-1 - ESI - POS.d: +MS, 100%=129498 Figura 166: Espectros de Massas de (14)
NH2
OH
O1
23
45
6
78
7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5
DMSO-d6
3.40
6.67
6.69
7.02
7.03
6.67
6.69
7.02
7.03
Figura 167: Espectro de RMN de 1H de (15) (DMSO-d6 a 11,7 T)
HO
OH
O
12
34
56
78
155 150 145 140 135 130 125 120 115 110 105 100 95 90 85 80 75 70 65 60 55 50 45 40 35
DMSO-d6
39.50
113.7
811
4.98
125.2
3
130.1
8
155.9
8
Figura 168: Espectro de RMN de 13C de (15) (DMSO-d6 a 11,7 T)
HO
OH
O
12
34
56
78
PPM 124.0 120.0 116.0 112.0 108.0 104.0 100.0 96.0 92.0 88.0 84.0 80.0 76.0 72.0 68.0 64.0 60.0 56.0 52.0 48.0 44.0 40.0
130
.185
1
114
.983
7
40.
1361
40.
1244
40.
1099
Figura 169: Espectro de DEPT 135 de (15) (DMSO-d6 a 11,7 T)
HO
OH
O
12
34
56
78
50100
3.50
4.00
4.50
5.00
5.50
6.00
6.50
7.00
7.50
ppm (f1
115.0117.5120.0122.5125.0127.5130.0
6.70
6.80
6.90
7.00
7.10ppm (f1
30.032.535.037.540.042.545.047.550.052.5
2.50
2.75
3.00
3.25
3.50ppm (f1
Figura 170: Mapa de contorno gHMQC de (15) (DMSO-d6 a 11,7 T)
HO
OH
O
12
34
56
78
5075100125150175
3.50
4.00
4.50
5.00
5.50
6.00
6.50
7.00ppm (f1
130140150160170
3.300
3.350
3.400
3.450
3.500ppm (f1
5075100125150175
6.60
6.70
6.80
6.90
7.00
7.10
7.20
7.30ppm (f1
Figura 171: Mapa de contorno gHMBC de (15) (DMSO-d6 a 11,7 T)
HO
OH
O
12
34
56
78
98.9812
121.0683
140.0051
159.0007
175.0420
197.0240
212.9983
235.0526
251.0294
269.0392 301.1503
183.0322
202.0891
185.1205
107.0436
157.0878
167.0537
50 100 150 200 250 300 m/z0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
4x10Intens.
MC 7 F-2-3 - POS.d: +MS, 100%=27433 Figura 172: Espectros de Massas de (15)
HO
OH
O
12
34
56
78
7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5
DMSO-d6
1.23
2.49
6.79
6.80
7.76
7.77
6.796.8
0
7.76
7.77
Figura 173: Espectro de RMN de 1H de (16) (DMSO-d6 a 11,7 T)
HO
NH2
O
123
4
5 6
7
165 160 155 150 145 140 135 130 125 120 115 110 105 100 95 90 85 80 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25
DMSO-d6
39.50
113.7
411
4.95
122.0
8
131.3
5
161.3
4
Figura 174: Espectro de RMN de 13C de (16) (DMSO-d6 a 11,7 T)
HO
NH2
O
123
4
5 6
7
112.5115.0117.5120.0122.5125.0127.5130.0132.5
6.75
7.00
7.25
7.50
7.75
ppm (f1
Figura 175: Mapa de contorno gHMQC de (16) (DMSO-d6 a 11,7 T)
HO
NH2
O
123
4
5 6
7
ppm (f2 )11012013014015016 0170
7 .00
7 .50
ppm (f1
Figura 176: Mapa de contorno gHMBC de (16) (DMSO-d6 a 11,7 T)
HO
NH2
O
123
4
5 6
7
7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5
DMSO-d6
2.49
2.53
2.69
3.46
3.79
6.70
6.72
6.77
6.79
7.03
7.04
7.07
7.08 7.0
37.037.0
47.04
7.067.0
6
7.07
7.07
7.08
7.09
6.70
6.72
6.73
6.776.7
9
Figura 177: Espectro de RMN de 1H de (17) (DMSO-d6 a 11,7 T)
OH
O
OH
12
3
45
6
78
170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30
DMSO-d6
35.52
39.50
114.8
3
118.6
6
121.9
0
127.7
3
130.9
6
155.3
9
172.7
8
Figura 178: Espectro de RMN de 13C de (17) (DMSO-d6 a 11,7 T)
OH
O
OH
12
3
45
6
78
P PM 14 0. 0 13 0. 0 12 0. 0 11 0 .0 1 00 .0 9 0. 0 8 0. 0 7 0. 0 60 .0 50 .0 40
130
.98
32
12
7.74
50
118
.672
4
114
.840
2
Figura 179: Espectros de DEPT de (17) (DMSO-d6 a 11,7 T)
OH
O
OH
12
3
45
6
78
33506783100117133
3.50
3.75
4.00
4.25
4.50
4.75
5.00
5.25
5.50
5.75
6.00
6.25
6.50
6.75
7.00
7.25
ppm (f1
112.5115.0117.5120.0122.5125.0127.5130.0132.5
6.650
6.700
6.750
6.800
6.850
6.900
6.950
7.000
7.050
7.100
ppm (f1
Figura 180: Mapa de contorno gHMQC de (17) (DMSO-d6 a 11,7 T)
OH
O
OH
12
3
45
6
78
5075100125150175
3.00
3.50
4.00
4.50
5.00
5.50
6.00
6.50
7.00
ppm (f1
115.0120.0125.0130.0135.0140.0145.0150.0155.0
6.70
6.80
6.90
7.00
7.10
ppm (f1
Figura 181: Mapa de contorno gHMBC de (17) (DMSO-d6 a 11,7 T)
OH
O
OH
12
3
45
6
78
141.0186
167.0533
197.0239
212.9979 233.0198
251.0297
275.0601
284.3390
301.1493
191.0077
183.0322
175.0418
100 125 150 175 200 225 250 275 300 m/z0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
4x10Intens.
MC 7 F-2-6 - POS.d: +MS, 100%=25040 Figura 182: Espectros de Massas de (17)
OH
O
OH
12
3
45
6
78
11.0 10.5 10.0 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5
DMSO-d6
0.86
0.98
0.99
1.00
1.08
1.09
1.12
1.91
2.49
2.53
2.73
3.18
3.48
3.60
3.74
4.14
4.696.6
86.7
0
6.97
6.99
7.08
7.09
7.24
7.35
7.37
7.49
10.92
7.24
7.25
7.27
7.29
7.31
7.32
7.35
7.37
7.48
7.49
7.51 6.9
66.9
76.9
86.9
9
7.00
7.01
7.06
7.08
7.09
Figura 183: Espectro de RMN de 1H de (18) (DMSO-d6 a 11,7 T)
1 8N
H
N
CH3
O12
34
57
8
9 1 0
1 1
1 21 3
1 41 5
1 61 76
170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30
DMSO-d6
30.58
39.50
51.46
67.8973.96
74.27
106.9
7
111.3
811
1.42
113.7
911
5.11
118.3
911
8.53
121.0
612
3.94
124.0
5
127.0
712
9.23
129.7
413
0.20
136.1
2
172.0
3
121.0
6
123.9
412
4.05
127.0
7
128.2
8129.2
312
9.74
130.2
0
136.1
2 106.9
7
111.3
811
1.42
113.7
9
115.1
1
118.3
911
8.53
Figura 184: Espectro de RMN de 13C de (18) (DMSO-d6 a 11,7 T)
1 8N
H
N
CH3
O12
34
57
8
9 1 0
1 1
1 21 3
1 41 5
1 61 76
PPM 130.0 120.0 110.0 100.0 90.0 80.0 70.0 60.0 50.0 40.0 30.0
129
.753
5 1
29.2
511
128
.295
8
124
.062
8 1
23.9
592
121
.083
0 1
18.5
438
118
.495
4 1
18.4
305
118
.410
6 1
15.1
418
115
.129
0
111
.431
7 1
11.3
955
51.
4743
30.
5918
Figura 185: Espectro de DEPT de (18) (DMSO-d6 a 11,7 T)
1 8N
H
N
CH3
O12
34
57
8
9 1 0
1 1
1 21 3
1 41 5
1 61 76
255075100125
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
ppm (f1
105.0110.0115.0120.0125.0130.0
6.75
7.00
7.25
7.50
ppm (f1
Figura 186: Mapa de contorno gHMQC de (18) (DMSO-d6 a 11,7 T)
1 8N
H
N
CH3
O12
34
57
8
9 1 0
1 1
1 21 3
1 41 5
1 61 76
5075100125150175
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
ppm (f1110.0115.0120.0125.0130.0135.0
7.00
7.10
7.20
7.30
7.40
7.50
7.60ppm (f1
Figura 187: Mapa de contorno gHMBC de (18) (DMSO-d6 a 11,7 T)
1 8N
H
N
CH3
O12
34
57
8
9 1 0
1 1
1 21 3
1 41 5
1 61 76
1.32.53.85.06.37.58.810.011.3
1.7
3.3
5.0
6.7
8.3
10.0
11.7ppm (f1
Figura 188: Espectro de gCOSY de (18) (DMSO-d6 a 11,7 T)
1 8N
H
N
CH3
O12
34
57
8
9 1 0
1 1
1 21 3
1 41 5
1 61 76
8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 -0.5 -1.0
3.733.74
7.24
7.247.477.49
13.0 12.5 12.0 11.5 11.0 10.5 10.0 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0
7.20
7.23
7.33
7.35
10.90
Figura 189: Espectro de NOESY 1D de (18) (DMSO-d6 a 11,7 T)
130.0723176.0817
231.1118
270.1246
302.1530
371.3348399.1543
457.1959
212.0809
245.0920
265.1109
261.1230
289.1184
316.1680
100 200 300 400 500 600 m/z0
1
2
3
5x10Intens.
MC-7F-5 - ESI - POS.d: +MS, 100%=331365 Figura 190: Espectros de Massas de (18)
1 8N
H
N
CH3
O12
34
57
8
9 1 0
1 1
1 21 3
1 41 5
1 61 76
11.0 10.5 10.0 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0
DMSO-d6
1.91
2.49
2.86
3.18
3.70
4.22
4.24
4.25
6.95
6.96
7.08
7.17
7.18
7.25
7.35
7.36
7.41
7.43
10.90
6.95
6.96
7.06
7.08
7.09
7.17
7.18
7.20
7.21
7.24
7.25
7.267.3
57.3
6
7.41
7.43
4.22
4.22
4.24
4.24
4.25
4.25
2.85
2.86
2.88
Figura 191: Espectro de RMN de 1H de (19) (DMSO-d6 a 11,7 T)
18N
H
O
O
12
34
57
8
910 11
12
1314
1516
176
19
170 165 160 155 150 145 140 135 130 125 120 115 110 105 100 95 90 85 80 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30
DMSO-d6
30.80
34.37
39.50
64.60
106.9
0
111.3
5
113.7
7
118.4
8
121.0
3
124.0
312
6.28
127.0
412
8.26
128.8
1
136.0
9137.9
6
171.4
4
121.0
3
124.0
3
126.2
812
7.04
127.9
812
8.26
128.8
112
9.2913
6.09
137.9
6
118.4
2118.4
8
Figura 192: Espectro de RMN de 13C de (19) (DMSO-d6 a 11,7 T)
18N
H
O
O
12
34
57
8
910 11
12
1314
1516
176
19
PPM 120.0 110.0 100.0 90.0 80.0 70.0 60.0 50.0 40.0 30.0
128
.831
3 1
28.8
282
128
.282
3 1
28.2
796
126
.297
1
124
.050
5
121
.047
0
118
.498
6 1
18.4
430
111
.375
2
64.
6158
64.
6120
34.
3828
30.
8088
30.
8087
Figura 193: Espectro de DEPT de (19) (DMSO-d6 a 11,7 T)
18N
H
O
O
12
34
57
8
910 11
12
1314
1516
176
19
5075100125
2.50
3.00
3.50
4.00
4.50
5.00
5.50
6.00
6.50
7.00
7.50
ppm (f1
110.0112.5115.0117.5120.0122.5125.0127.5130.0
6.950
7.000
7.050
7.100
7.150
7.200
7.250
7.300
7.350
7.400
7.450
ppm (f1
Figura 194: Mapa de contorno gHMQC de (19) (DMSO-d6 a 11,7 T)
18N
H
O
O
12
34
57
8
910 11
12
1314
1516
176
19
637588100113125138150163175
2.50
3.00
3.50
4.00
4.50
5.00
5.50
6.00
6.50
7.00
7.50ppm (t1
105.0110.0115.0120.0125.0130.0135.0140.0
6.90
7.00
7.10
7.20
7.30
7.40
7.50ppm (t1)
Figura 195: Mapa de contorno gHMBC de (19) (DMSO-d6 a 11,7 T)
18N
H
O
O
12
34
57
8
910 11
12
1314
1516
176
19
1.32.53.85.06.37.58.810.011.3
2.5
5.0
7.5
10.0
ppm (f1
Figura 196: Espectro de gCOSY de (19) (DMSO-d6 a 11,7 T)
18N
H
O
O
12
34
57
8
910 11
12
1314
1516
176
19
13.5 13.0 12.5 12.0 11.5 11.0 10.5 10.0 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0
10.90
7.34
7.19
7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5
7.18
4.23
2.87 2.86
2.85
7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5
7.42
7.40 7.19
3.733.70
3.653.63
7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0
2.842.852.862.87
4.22
4.23
4.25
7.18
Figura 197: Espectro de NOESY 1D de (19) (DMSO-d6 a 11,7 T)
234.1284
259.1914
302.1162
334.1065
365.1368
393.2974
293.1146
100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z0
1
2
3
4
5
5x10Intens.
MC-7F-C9 - ESI - POS.d: +MS, 100%=546738 Figura 198: Espectros de Massas de (19)
18N
H
O
O
12
34
57
8
910 11
12
1314
1516
176
19
7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0
Chloroform-d
0.86
0.87
0.89
1.30
1.31
1.33
2.142.1
62.1
72.1
92.2
02.2
12.2
3
2.24
2.26
3.58
3.59
3.61
3.62
6.95
6.97
6.98
7.25
6.95
6.97
6.98
3.58
3.59
3.61
3.62
1.44
1.451.4
7
1.48
1.49
1.271.2
81.29
1.30
1.31
1.31
1.33
2.142.1
6
2.17
2.19
2.20
2.20
2.21
2.22
2.23
2.24
2.25
2.26
Figura 199: Espectro de RMN de 1H de (20) (DMSO-d6 a 11,7 T)
O
OH
O
HO1'
2'
3'
4'
5'
6'
3
12
4
180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10
Chloroform-d
13.90
15.52
22.40
28.12
28.77
31.49
37.49
73.51
76.65
77.00
114.2
4
131.3
3
146.8
6
170.9
9
178.9
7
13.90
15.52
22.40
28.12
28.77
31.49
37.49
Figura 200: Espectro de RMN de 13C de (20) (DMSO-d6 a 11,7 T)
O
OH
O
HO1'
2'
3'
4'
5'
6'
3
12
4
PPM 150.0 140.0 130.0 120.0 110.0 100.0 90.0 80.0 70.0 60.0 50.0 40.0 30.0 20.0 10.0
146
.900
1
37.
4942
31.
4897
28.
7785
28.
1182
22.
4030
15.
5216
13.
9063
Figura 201: Espectro de DEPT de (20 (DMSO-d6 a 11,7 T)
O
OH
O
HO1'
2'
3'
4'
5'
6'
3
12
4
13253850637588100113125138150
1.00
1.50
2.00
2.50
3.00
3.50
4.00
4.50
5.00
5.50
6.00
6.50
7.00
ppm (f1
5.010.015.020.025.030.035.040.045.050.055.060.0
1.00
1.25
1.50
1.75
2.00
2.25ppm (f1
Figura 202: Mapa de contorno gHMQC de (20) (DMSO-d6 a 11,7 T)
O
OH
O
HO1'
2'
3'
4'
5'
6'
3
12
4
13253850637588100113125138150163175188
1.00
1.50
2.00
2.50
3.00
3.50
4.00
4.50
5.00
5.50
6.00
6.50
7.00ppm (f1
Figura 203: Mapa de contorno gHMBC de (20) (DMSO-d6 a 11,7 T)
O
OH
O
HO1'
2'
3'
4'
5'
6'
3
12
4
1.001.502.002.503.003.5 04.004.505.005.506.006.507.007.50
1.00
1.50
2.00
2.50
3.00
3.50
4.00
4.50
5.00
5.50
6.00
6.50
7.00
7.50ppm (f1
Figura 204: Espectro de gCOSY de (20) (DMSO-d6 a 11,7 T)
O
OH
O
HO1'
2'
3'
4'
5'
6'
3
12
4
237.1152
251.1297
75 100 125 150 175 200 225 250 275 300 325 m/z0
1
2
3
4
5
5x10Intens.
MC - C 3 - POS.d: +MS, 100%=504800 Figura 205: Espectros de Massas de (20)
O
OH
O
HO1'
2'
3'
4'
5'
6'
3
12
4
8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5
Chloroform-d7.9
17.8
3
7.25
6.49 5.8
25.7
0
4.64
4.63
4.62
4.51
3.42
3.00
2.66
2.44
2.20 2.0
5 1.49
1.25
1.24
0.87
0.864.6
4
4.63
4.62
3.01
3.00
2.99
Figura 206: Espectro de RMN de 1H de (21) (DMSO-d6 a 11,7 T)
O
OH
NO2
98.9811
135.0055
157.0876
177.0209
189.0123
208.1753 223.1353
237.1157
269.1771
284.3379
128.9882
150.9795
159.0010
75 100 125 150 175 200 225 250 275 m/z0
2000
4000
6000
8000
Intens.
MC - 6 F - POS.d: +MS, 100%=8947 Figura 207: Espectros de Massas de (21)
O
OH
NO2