UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAISESCOLA DE VETERINÁRIA

PROGRAMA DE DOUTORADO EM CIÊNCIA ANIMAL

Isolamento, Identificação e Avaliação de Características Probióticas de Bactérias Ácido-Láticas isoladas de amostras de queijo de coalho

produzidas em Pernambuco – Brasil

Luiz Gonzaga Guedes Neto

BELO HORIZONTE2008

LUIZ GONZAGA GUEDES NETO

Isolamento, Identificação e Avaliação de Características Probióticas de Bactérias Ácido-Láticas isoladas de amostras de queijo de coalho

produzidas em Pernambuco – Brasil

Tese apresentada a Universidade Federal de Minas Gerais, como requisito parcial para obtenção do grau de Doutor em Veterinária.

Área de concentração: Medicina Veterinária Preventiva

Orientador: Prof. Dr. Wagner Luiz Moreira dos Santos

Coorientadores: Profa. Dra. Mônica Maria de Oliveira Pinho Cerqueira e  Prof Dr. Jacques Robert Nicoli.

Belo Horizonte200

Luiz Gonzaga Guedes NetoIsolamento, Identificação e Avaliação de Características Probióticas de Bactérias Ácido-Láticas isoladas de amostras de queijo de coalho produzidas em Pernambuco – Brasil.

Tese apresentada ao Programa de Doutorado em Veterinária da Universidade Federal

de Minas Gerais

A defesa desta dissertação foi realizada no dia __ de _____ de 2008 e a nota obtida

foi de ________________ concedida pela seguinte banca de examinadores:

Dr. Wagner Luiz Moreira dos Santos

Prof. Dr. Wagner Luiz Moreira dos Santos (Orientador) – UFMG

NOME

NOME– UNIVERSIDADE

NOME

NOME. – UNIVERSIDADE

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus.

Aos meus queridos pais, Carlos Alberto e Heloisa, por todo o apoio e amizade.

Aos meus irmãos, Carolina, Helena e Lucas, eternos companheiros.

A Ju pelo amor e carinho

Ao Francisco, Vilma e Vitor pelo apoio e amizade.

Ao Professor Wagner pela orientação e confiança.

Ao Professor e amigo Marcelo Resende de Souza pela dedicação, amizade e empenho durante a realização deste trabalho.

As Professoras e amigas Mônica Maria Oliveira Pinho Cerqueira e Cláudia Freire de Andrade Morais Penna, pela importante colaboração e incentivos dados desde a graduação.

A Professora e amiga Maria José de Sena, pela amizade, ajuda e inestimável colaboração à realização deste trabalho.

Aos Professores Leorges Moraes da Fonseca e Mônica Oliveira Leite.

Ao DTIPOA, na pessoa do chefe do Departamento, professor Renaldo Travassos Martins.

Aos funcionários do DTIPOA.

Ao Professor Jacques Robert Nicoli e a todos do Laboratório de Ecologia e Fisiologia de Microrganismos do ICB, pela acolhida e importante contribuição a realização deste trabalho.

A Professora Regina Maria Nardi Drummond, do Departamento de Microbiologia do ICB – UFMG, pelo apoio e colaboração ao trabalho.

Ao Professor Álvaro Cantini Nunes, e a todos do Laboratório de Biologia Molecular de Parasitos do ICB, pela confiança, dedicação e envolvimento.

Ao Doutor Luiz Simeão do Carmo, pela amizade e valiosa contribuição.

Ao Professor Ivan Barbosa Machado Sampaio.

Ao Professor Iran Borges.

Aos colegas de pós-graduação pelo incentivo e amizade, especialmente às amigas Ana Helena de Mendonça e Jamaira Ferreira Veras.

Ao Colegiado de Pós–Graduação da Escola de Veterinária da UFMG.

A URFPE e aos proprietários dos laticínios e fazendas visitadas no estado de Pernambuco.

A todos que de alguma forma contribuíram para a realização deste trabalho, por confiarem e

acreditarem em mim.

"Por muito tempo eu pensei que a minha vida fosse se tornar uma vida de verdade. Mas sempre havia um obstáculo no caminho, algo a ser ultrapassado antes de começar a viver, um

trabalho não terminado, uma conta a ser paga. Aí sim, a vida de verdade começaria.

Por fim, cheguei a conclusão de que esses obstáculos eram a minha vida de verdade. Essa perspectiva tem me ajudado a ver que não existe um caminho para a felicidade.

A felicidade é o caminho!”.

Henfil

SUMÁRIO

RESUMO 15

1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA 162. REVISÃO DA LITERATURA 182.1. Queijo de coalho 182.1.1. Critérios oficias de identidade e qualidade de queijo de coalho 202.1.1.1. Critérios físico-químicos 202.1.1..2. Critérios microbiológicos 202.1.2. Qualidade de queijo de coalho 212.2. Doenças transmitidas por alimentos e microrganiasmos patogênicos de

importância em queijos 22

2.2.1. Coliformes termotolerantes e Escherichia coli 242.2.2. Salmonella sp. 262.2.3. Listeria monocytogenes 272.2.4. Staphylococus sp e suas enterotoxinas 282.3. Bactérias Ácido-Lácticas (BAL) 322.3.1. Bactérias Ácido-Lácticas em queijos 322.3.2. Efeitos antimicrobianos de Bactérias Ácido-Lácticas 342.3.3. O gênero Lactobacillus sp 382.3.3.1. Efeitos probióticos e terapeuticos de Lactobacillus sp. 392.3.4. Métodos de isolamento e identificação de BAL. 412.4. Probióticos 472.4.1. Definição 482.4.2. Características desejáveis 482.4.3. Mecanismos de ação 502.4.4. Produtos carreadores de bactérias probióticas e microrganismos

empregados em sua formulação52

2.5. O modelo animal e a avaliação de microrganismos probióticos 543. MATERIAIS E MÉTODOS 563.1. Amostragem e produção de queijo de coalho estudados 573.2. Determinação de Características e Composição Físico-Químicas de Queijo

de Coalho produzido em Pernambuco.57

3.2.1. Determinação da acidez titulável 573.2.2. Determinação do extrato seco total (EST) e umidade - método gravimétrico 573.3. Isolamento, Enumeração, Caracterização Fisiológica e Purificação de

Bactérias Ácido-Lácticas de Queijo de Coalho Artesanal e Industrial, produzido no Estado de Pernambuco.

58

3.4. Isolamento, Enumeração, Purificação e Identificação de Microrganismos Patógenos (Coliformes a 30ºC e 45ºC, Escherichia coli O157:H7, Salmonella spp., Listeria spp.) presentes em Queijo de Coalho artesanal e

58

Industrial, produzido no Estado de Pernambuco.3.4.1. Pesquisa de coliformes a 30ºC - tubos múltiplos (APHA, 2001). 593.4.2. Pesquisa de coliformes a 45ºC (APHA, 2001) 593.4.3. Pesquisa de Escherichia coli O157:H7 (FDA, 2001) 593.4.4. Pesquisa de Salmonella spp. (APHA, 2001) 593.4.5. Pesquisa de Listeria spp. (IDF 1995; SILVA, 1996). 593.5. Isolamento, Enumeração, Purificação e Identificação de Staphylococcus

spp. e suas Enterotoxinas (CARMO, 2001)60

3.5.1. Isolamento e identificação do microrganismo 603.5.2. Caracterização bioquímica 603.5.3. Prova da coagulase 603.5.4. Prova da termonuclease 613.5.5. Prova da fermentação da maltose e manitol 613.5.6. Prova da hemólise em ágar sangue 613.5.7. Cultura estoque 613.5.8. Indução da produção de enterotoxinas 613.6. Identificação Molecular, ao nível de Espécies, de Bactérias Ácido-Láctico

Isoladas de Queijo de Coalho produzido no Estado de Pernambuco.62

3.6.1. Extração de DNA total 623.6.1.1. Obtenção das células sem parede e sem membrana 623.6.1.2. Extração com fenol – clorofórmio 623.6.1.3. Eletroforese em gel de agarose 623.6.1.4. Reação de Polimerização em Cadeia (PCR) 633.6.1.5. Digestão dos produtos de PCR 16S-23S 633.6.1.6. Seqüenciamento dos produtos de PCR 633.7. Pesquisa de Antagonismo In Vitro de Bactérias Ácido-Lácticas frente a

Patógenos da Microbiota de Queijo de Coalho Artesanal e Industrial, produzido em Pernambuco (TAGG et al., 1976).

64

3.7.1. Análise estatística 643.8. Susceptibilidade aos Antimicrobianos de Bactérias Ácido-Lácticas e

Staphylococcus spp Isolados de Queijo de Coalho Artesanal e Industrial, produzido no Estado de Pernambuco (CHARTERIS et al., 1998; NCCLS, 2003).

64

3.9. Avaliação de Características Probióticas - Capacidade de Colonização do Trato Gastrointestinal e do Efeito de Proteção Contra Salmonelose Experimental em Camundongos Gnotobióticos e Convencionais por Bactérias Ácido-Lácticas Isoladas de Queijos de Coalho, Produzidos no Estado de Pernambuco.

65

3.9.1. Animais de experimentação 653.9.1.1. Animais isentos de germes 653.9.1.2. Animais convencionais 653.9.2. Manejo dos animais 653.9.3. Análises dos animais isentos de germes 653.9.3.1. Obtenção dos animais gnotobióticos 653.9.3.2. Tratamentos e desafios 653.9.3.3. Determinação da capacidade de espécies de BAL de colonizar o trato

digestivo de camundongos isentos de germes65

3.9.3.4. Teste de antagonismo “in vivo” 663.9.3.5. Sobrevivência e sobrevida 663.9.4. Análises dos animais convencionais 663.9.4.1. Tratamentos e desafio 663.9.4.2. Ganho de peso, sobrevida e sobrevivência. 663.9.5. Análises histológicas 663.9.6. Análises estatísticas 674. RESULTADOS E DISCUSSÃO 674.1. Processamento dos queijos de coalho 674.1.1. Produção industrial de queijo de coalho 674.1.1.1. Laticínio BL 674.1.1.2. Laticínio LV 684.1.2. Produção artesanal de queijo de coalho 684.1.2.1. Fazenda AQ 684.1.2.2. Fazenda CM 68

4.1.3. Avaliação dos sistemas de produção de queijo de coalho 694.1.3.1. Fluxogramas de produção 694.1.3.2. Ingredientes 694.1.3.3. Utensílios 704.1.3.4. Prazo de validade 704.1.3.5. Condições higiênico-sanitárias 704.2. Determinação de características e composição físico-químicas 704.3. Isolamento, enumeração, purificação e caracterização fisiológica de

bactérias ácido-lácticas 72

4.3.1. Isolamento e enumeração 724.3.2. Caracterização fisiológica 734.3.2.1. Isolamento em ágar M17 734.3.2.2. Isolamento em ágar MRS 744.4. Identificação das bactérias ácido-lácticas isoladas, de acordo com técnicas

de Biologia Molecular.75

4.4.1 Diversidade da microbiota dos queijos de coalho 764.5. Isolamento, Enumeração, Purificação e Identificação de Microrganismos

Patógenos (Coliformes a 30 °C e 45 °C, Escherichia coli O157:H7, Salmonella spp., Listeria spp.) presentes em Queijo de Coalho artesanal e Industrial, produzido no Estado de Pernambuco.

78

4.6. Isolamento, enumeração, purificação e identificação de Staphylococcus spp. e suas enterotoxinas

80

4.7. Teste de antagonismo "in vitro" entre as cepas isoladas de queijo de coalho e contra microrganismos indicadores

82

4.7.1. Atividade antagonista frente a BAL, isoladas de queijo de coalho. 824.7.2. Atividade antagonista frente a Staphylococcus spp. e Escherichia coli,

isolados de queijo de coalho83

4.7.3. Atividade antagonista frente a cepas referência de patógenos relevantes em saúde pública

83

4.8. Teste de sensibilidade das bactérias ácido-lácticas isoladas frente aos antimicrobianos

84

4.9. Determinação da capacidade de espécies de Lactobacilus spp de colonizar o trato digestivo de camundongos isentos de germes

87

4.9.1. Determinação dos níveis populacionais da levedura nas diversas porções do trato gastrointestinal de camundongos gnotobióticos (GN)

88

4.10. Determinação do efeito da levedura na colonização intestinal por S. Typhimurium em camundongos gnotoxênicos (GN)

89

4.10.1. Anatomopatologia 934.11. Determinação do efeito de Lactobacillus spp no desenvolvimento ponderal

e na mortalidade por S. Typhimurium em camundongos convencionais (CV).

97

5. CONCLUSÕES 986. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 997. ANEXOS 184 Anexo A Fluxogramas de produção de queijo de coalho artesanal e industrial 184

Fluxograma 1: Fluxograma de produção de queijo de coalho do laticínio BL

184

Fluxograma 2: Fluxograma de produção de queijo de coalho do laticínio LV

185

Fluxograma 3: Fluxograma de produção de queijo de coalho da fazenda AQ 186Fluxograma 4: Fluxograma de produção de queijo de coalho da fazenda CM.

187

Anexo B Gram de culturas isoladas de queijo de coalho artesanal (AB e CM). 188Anexo C Resultados dos seqüenciamentos dos produtos de PCR16S-23S clonados

em vetor Topo.191

Anexo D Perfil de digestão dos fragmentos amplificados por PCR do espaçador 16S-23S rRNA de diferentes espécies de BAL

198

Anexo E Perfil bioquímico de cepas de Staphylococcus spp. isolados de queijo de coalho artesanal e industrial.

199

Anexo F Identificação bioquímica de linhagens de Staphylococcus spp. isolados de queijo de coalho artesanal e industrial.

200

Anexo G Antagonismo frente a Listeria monocytogenes e teste de sensibilidade aos antimicrobianos de Lactobacillus casei.

201

Anexo H Diversidade da microbiota presente em queijo de coalho artesanal e industrial, produzidos no estado de Pernambuco.

203

Anexo I Produção industrial e artesanal de queijo de coalho. 204Anexo J Extração do DNA total 213Anexo L Amplificação da região intergênica 16S-23S por PCR 215Anexo M Digestão enzimática dos produtos de PCR 217

LISTA DE FIGURASFigura 1 Níveis populacionais de Lactobacillus spp. no conteúdo do estômago (I),

intestino delgado – porção dista (II), ceco (III) e cólon (IV) do trato gastrointestinal de camundongos NIH gnotobióticos (A) monoassociados com dose única de 108 L. casei AB2 (A); L. acidophilus LV3 (B); L. rhamnosus AQ1 (C) e L. fermentum AB3 (D). N = 5.

89

Figura 2 Populações fecais de S. Typhimurium em camundongos NIH gnotobióticos, monoassociados (●) ou não (♦) com uma dose de 108 células viáveis da levedura L. rahmnosus AQ1 (■) dez dias antes do desafio com 103 células da bactéria patogênica. N = 3.

90

Figura 3 Populações fecais de S. Typhimurium em camundongos NIH gnotobióticos, monoassociados (●) ou não (♦) com uma dose de 108 células viáveis da levedura L. casei AB2 (■) dez dias antes do desafio com 103 células da bactéria patogênica. N = 3.

91

Figura 4: Populações fecais de S. Typhimurium em camundongos NIH gnotobióticos, monoassociados (●) ou não (♦) com uma dose de 108 células viáveis da levedura L. fermentum AB3 (■) dez dias antes do desafio com 103 células da bactéria patogênica. N = 3.

91

Figura 5 Populações fecais de S. Typhimurium em camundongos NIH gnotobióticos, monoassociados (●) ou não (♦) com uma dose de 108 células viáveis da levedura L. acidophilus LV3 (■) dez dias antes do desafio com 103 células da bactéria patogênica. N = 3.

92

Figura 6 Sobrevida dos camundongos monoassociados ou não (I), antes do desafio com 103 de S Typhimurium, com dose única de 108 de L. casei AB2 (II); L. fermentum AB3 (III); L. rhamnosus AQ1 (IV) e L. acidophilus LV3 (V). N = 5.

93

Figura 7 Corte Histológico de fígado de camundongos isentos de germes infectados com Salmonella typhimurium não tratados (A) e tratados com AQ1. Notar a presença de focos inflamatórios no parênquima hepático de fígado infectado não tratado (seta) Hematoxilina e Eosina. Barra = 100 µm.

94

Figura 8 Corte Histológico de ceco de camundongos isentos de germes infectados com Salmonella Typhimurium não tratados (A) e tratados com Lactobacillus spp.. Notar presença de infiltrado inflamatório (seta). Hematoxilina e Eosina. Barra = 100 µm

95

Figura 9 Corte Histológico de ceco de camundongos isentos de germes infectados com Salmonella Typhimurium não tratados (A) e tratados com Lactobacillus spp.. Notar presença de neutrófilos na submucosa (seta). Hematoxilina e Eosina. Barra = 25 µm

96

Figura 10 Gram de cultura isolada de queijo de coalho artesanal (AB), identificada como Lactobacillus fermentum.

188

Figura 11 Gram de cultura isolada de queijo de coalho artesanal (AB), identificada como Streptococcus thermophilus.

189

Figura 12 Gram de cultura isolada de queijo de coalho artesanal (CM), identificada como Weissella confusa.

190

Figura 13 Antagonismo de Lactobacillus casei isolado de queijo de coalho artesanal frente a Listeria monocytogenes.

201

Figura 14 Teste de sensibilidade de Lactobacillus casei isolado de queijo de coalho artesanal frente à diversas drogas antimicrobianas

202

Figura 15 Silos de estocagem de leite 204Figura 16 Detalhe de piso e parede da área de recepção do leite 204Figura 17 Vista interna da sala de processamento de queijos 205Figura 18 Detalhe da sala de processamento de queijos 205Figura 19 Área de recepção do leite. 206Figura 20 Tanque de fabricação de queijo de coalho 206Figura 21 Processo de salga na massa do queijo de coalho 207Figura 22 Enformagem do queijo de coalho 207

Figura 23 Sistema de ordenha mecânica da Fazenda onde está localizada a indústria LV

207

Figura 24 Recepção do leite na sala de produção de queijo 208Figura 25 Leite colocado no recipiente para coagulação 208Figura 26 Utensílios utilizados para produção dos queijos 209Figura 27 Mexedura e quebra do coágulo 209Figura 28 Massa do queijo dessorando dentro de sacos de plástico 210Figura 29 Enformagem dos queijos 210Figura 30 Vista externa do local destinado à produção de queijos 211Figura 31 Utensílios utilizados para fabricação dos queijos 211Figura 32 Enformagem dos queijos 212Figura 33 DNA total de amostras de microrganismos fermentadores de lactose,

isolados de queijo de coalho em ágar MRS (canaletas da esquerda para a direita: 1-marcador de peso molecular; 2-AB1; 3-AB2; 4-AB3; 5-marcador de peso molecular; 6-CM1; 7-CM2; 8-CM3; 9-CM4; 10-LV1; 11-LV2 e 12-LV3).

213

Figura 34 DNA total de amostras de microrganismos fermentadores de lactose, isolados de queijo de coalho em ágar M17 (canaletas da esquerda para a direita: 1-AQ1; 2-AQ2; 3-AQ3; 4-AQ4; 5-CM1; 6-CM2; 7-CM3; 8-CM4; 9-SM1; 10-SM2; 11-SM3; 12-SM4).

213

Figura 35 DNA total de amostras de microrganismos fermentadores de lactose, isolados de queijo de coalho em ágar M17 (canaletas da esquerda para a direita: 1-marcador de peso molecular; 2-AB1; 3-AB2; 4-AB3; 5-AB4; 6-marcador de peso molecular; 7-LV1; 8-LV2; 9-LV3; 10-LV4; 11-vazia; 12-vazia).

214

Figura 36 DNA total de amostras de microrganismos fermentadores de lactose, isolados de queijo de coalho em ágar MRS (canaletas da esquerda para a direita:1-vazia; 2-SM1; 3-SM2; 4-BL1; 5-BL2; 6-AQ1; 7-AQ2) e M17 (amostras da esquerda para a direita: 8-BL1; 9-BL2; 10-BL3; 11-BL4 e 12-marcador de peso molecular)

214

Figura 37 PCR 16S-23S de DNA de amostras de microrganismos fermentadores de lactose, isolados de queijo de coalho, em ágar MRS (canaletas da esquerda para a direita: 1-marcador de peso molecular; 2-AB1; 3-AB2; 4-AB3; 5-CM1; 6-CM2; 7-CM3; 8-CM4; 9-LV1; 10-LV2; 11-LV3 e 12-marcador de peso molecular)

215

Figura 38 PCR 16S-23S de DNA de amostras de microrganismos fermentadores de lactose, isolados de queijo de coalho, em ágar MRS (canaletas da esquerda para a direita: 1-marcador de peso molecular; 2-AQ1; 3-AQ2; 4-BL1; 5-BL2; 6-SM1 e 7-SM2) e M17 (canaletas da esquerda para a direita: 8-BL1; 9-BL2; 10-BL3; 11-BL4 e 12-marcador de peso molecular).

215

Figura 39 PCR 16S-23S de DNA de amostras de microrganismos fermentadores de lactose, isolados de queijo de coalho, em ágar M17 (canaletas da esquerda para direita: 1-marcador de peso molecular; 2-AQ1; 3-AQ2; 4-AQ3; 5-AQ4; 6-CM4; 7-CM3; 8-CM2; 9-SM1; 10-SM2; 11-SM3 e 12-SM4)

216

Figura 40 Digestão de produtos de PCR 16S-23S de cultura identificada como Lactobacillus rhamnosus (canaletas/enzimas da esquerda para a direita: 1-SphI, 2-NcoI, 3-NheI, 4-SspI, 5-SfuI, 6-EcoRV, 7-DraI, 8-VspI, 9-EcoRI, 10-HpaI, 11-HindIII e 12- marcador de peso molecular).

217

Figura 41 Digestão de produtos de PCR 16S-23S de culturas identificadas como Lactobacillus casei e Lactobacillus fermentum (canaletas/enzimas da esquerda para a direita: 1-marcador de peso molecular, 2-SphI, 3-NcoI, 4-NheI, 5-SspI, 6-SfuI, 7-EcoRV, 8-DraI, 9-VspI, 10-EcoRI, 11-HpaI, 12-HindIII).

217

Figura 42 Digestão de produtos de PCR 16S-23S de culturas identificadas como Lactobacillus rhamnosus (canaletas/enzimas da esquerda para a direita: 1-marcador de peso molecular, 2-SphI, 3-NcoI, 4-NheI, 5-SspI, 6-SfuI, 7-EcoRV, 8-DraI, 9-VspI, 10-EcoRI, 11-HpaI, 12-HindIII).

218

Figura 43 Digestão de produto de PCR 16S-23S de cultura identificada como Lactobacillus sp. do grupo acidófilo (canaletas/enzimas da esquerda para a direita: 1-marcador de peso molecular, 2-SphI, 3-NcoI, 4-NheI, 5-SspI, 6-SfuI, 7-EcoRV, 8-DraI, 9-VspI, 10-EcoRI, 11-HpaI, 12-HindIII)

218

LISTA DE QUADROSQuadro 1 Requisitos microbiológicos para inspeção de queijos de alta umidade. 21Quadro 2 Programa utilizado para obtenção dos produtos da PCR 63Quadro 3 Principais diferenças relacionadas à produção de queijo de coalho. 69Quadro 4 Microrganismos identificados por seqüenciamento de DNA isolados de

amostras de queijo de coalho artesanal e industrializado.75

Quadro 5 Identificação bioquímica de linhagens de Staphylococcus spp. isolados de queijo de coalho artesanal e industrial

200

Quadro 6 Diversidade da microbiota presente em queijo de coalho artesanal e industrial, produzidos no estado de Pernambuco

203

LISTA DE TABELASTabela 1 Resultados de análises físico-químicas de seis amostras de queijo de

coalho, produzido no Estado de Pernambuco.71

Tabela 2 Resultados de determinação da acidez titulável de queijo de coalho produzido no estado de Pernambuco.

72

Tabela 3 Enumeração (UFC/g) de microrganismos produtores de ácido láctico em amostras de queijo de coalho artesanal e industrializado

72

Tabela 4 Resultados de análises microbiológicas de culturas isoladas em ágar M17 a partir de queijo de coalho, produzido no estado de Pernambuco

73

Tabela 5 Resultados de análises microbiológicas de culturas isoladas em ágar MRS a partir de queijo de coalho, produzido no estado de Pernambuco

74

Tabela 6 Resultados da contagem de coliformes a 30 °C e a 45 °C e da pesquisa de E. coli O157:H7, Salmonella sp. e Listeria sp. em queijo de coalho

78

Tabela 7 Espécies de microrganismos do grupo coliforme e outros Gram negativo identificados em amostras de queijo de coalho artesanal e industrial, produzidos em Pernambuco

79

Tabela 8 Enumeração de E. coli (NMP/g) em amostras de queijo de coalho artesanal e industrial produzidos em Pernambuco.

80

Tabela 9 Enumeração de Staphylococcus spp. em amostras de queijo de coalho artesanal e industrializado.

80

Tabela 10 Atividade antagonista de culturas de BAL isoladas de queijo de coalho frente às mesmas e a outras BAL (halo de inibição em mm)

82

Tabela 11 Atividade antagonista de culturas de BAL isoladas de queijo de coalho frente a Staphylococcus spp. e Escherichia coli (halo de inibição em mm)

83

Tabela 12 Atividade antagonista de culturas de BAL isoladas de queijo de coalho frente a patógenos de referência.

84

Tabela 13 Perfil de resistência de microrganismos isolados de queijo de coalho em teste de difusão em ágar MRS com discos de antimicrobianos

85

Tabela 14 Perfil de resistência de microrganismos isolados de queijo de coalho em teste de difusão em ágar Müller Hinton frente a diferentes antimicrobianos

86

Tabela 15 Contagem de Bactérias Ácido-Lácticas nas fezes de camundongos monoassociados, durante 10 dias, após o inóculo inicial com 108 células.

88

Tabela 16 Sobrevivência, tempo médio de vida e peso médio dos camundongos CV após o desafio com Salmonella Typhimurium

97

Tabela 17 Perfil de digestão dos fragmentos amplificados por PCR do espaçador 16S-23S rRNA de diferentes espécies de BAL

198

Tabela 18 Perfil bioquímico de cepas de Staphylococcus spp. isolados de queijo de coalho artesanal e industrial

199

RESUMO

O queijo de coalho apresenta grande importância histórica, social, econômica e cultural para pequenos produtores do Nordeste do Brasil. Geralmente, produzido artesanalmente ou de forma industrializada por alguns laticínios, este alimento é amplamente consumido. Este trabalho foi conduzido com os objetivos de conhecer os processos artesanais e industriais em algumas unidades produtoras do estado de Pernambuco, isolar e identificar bactérias ácido-lácticas (BAL) e Staphylococcus spp. a partir de quatro amostras artesanais e duas industriais, bem como avaliar as propriedades antagonistas, a sensibilidade antimicrobiana destas BAL e as características físico-químicas das amostras analisadas. Foram isolados e identificados dezenove microrganismos, sendo seis pertencentes ao gênero Lactobacillus, quatro de Streptococcus, três de Enterococcus, dois de Lactococcus, um de Weissella, um de Escherichia e um de Erwinia. Um total de 36 cepas de Staphylococcus spp. foram identificadas. Os níveis populacionais destas bactérias foram superiores a 106 UFC/g tanto nas amostras de queijo artesanal, quanto nas amostras de queijo industrializado, incluindo cepas coagulase positivo e negativo produtoras de enterotoxina estafilocócica B (SEB). As BAL isoladas apresentaram atividade antagonista frente às mesmas, aos patógenos isolados dos mesmos queijos e também a cepas de referência, havendo diferença estatística significativa (p<0,05), exceto quando as próprias BAL foram utilizadas como reveladoras. Dentre as bactérias isoladas, Lactobacillus casei (AB2MRS) e Lactobacillus rhamnosus (AQ1MRS) apresentaram as atividades antagonistas mais potentes frente aos patógenos utilizados como reveladores. Microrganismos presentes em queijos de coalho artesanal e industrial demonstraram diferentes perfis de sensibilidade às drogas antimicrobianas, incluindo a presença de Enterococcus faecalis multi-resistente e Lactobacillus acidophilus sensível a vancomicina. Existem diferenças tecnológicas importantes entre as formas de produção de queijo de coalho artesanal e industrial, e este alimento apresenta uma microbiota muito variada, apresentando, em sua constituição, BAL (principalmente Lactobacillus spp. e Lactococcus spp.) com potencial probiótico para serem utilizadas visando a melhoria da qualidade higiênico-sanitária-tecnológica deste queijo.

Palavras-chave: queijo de coalho, bactérias ácido-lácticas, Staphylococcus, atividade antagonista, sensibilidade aos antimicrobianos, qualidade higiênico-sanitária-tecnológica; probióticos

ABSTRACT

“Queijo de coalho” is a typical cheese that shows historical, social, economical and cultural importance to the Brazilian population. Usually, artisanaly produced in rural areas of the Northeastern region or by dairies, that food is widely consumed throughout Brazil. The present study was carried out with the following aims: know the artisanal and industrial processes in some production units of Pernambuco state, isolate and identify LAB and Staphylococcus spp. from four samples of artisanal and two samples of industrial “queijo de coalho”, as well as evaluate the antagonistic properties, the antimicrobial sensibility of those LAB and the physical-chemical characteristics of the analyzed samples. There were isolated and identified nineteen microorganisms, as following: six Lactobacillus spp., four Streptococcus spp., three Enterococcus spp., two Lactococcus spp., one Weissella sp. one Erwinia sp. and one Escherichia sp. A total of 36 strains of Staphylococcus were also identified. Counts of that microorganism higher of 106 CFU/g were verified either in artisanal or industrial cheeses, including coagulase positive and negative SEB producer’s strains. The isolated LAB showed antagonistic activity against themselves, pathogens isolated from the same cheeses and reference strains, presenting statistical significant difference (p<0.05), except for the first antagonism. Among the isolated LAB, Lactobacillus casei (AB2MRS) and Lactobacillus rhamnosus (AQ1MRS) demonstrated the most potent antagonistic activities against the pathogens. Microorganisms present in artisanal and industrial “queijo de coalho” show distinct sensibility profile to the antimicrobials, including the presence of multi-resistant Enterococcus faecalis and vancomycin susceptible Lactobacillus acidophilus. It is concluded that there are important technological differences among the production of artisanal and industrial “queijo de coalho”. Furthermore, that food has a varied microbiota, including LAB which show probiotic potential to be used in order to improve its technological, hygienic and sanitary quality.

Key-words: “queijo de coalho”, lactic acid bacteria, Staphylococcus, antagonistic activity, antimicrobials susceptibility, technological, hygienic and sanitary quality, probiotics

1. INTRODUÇÃO & JUSTIVICATIVA

A preservação de alimentos e de bebidas por processos de fermentação tem sido utilizada pelo homem ao longo da história. Assim, há vários séculos, os microrganismos têm representado um papel importante na produção de queijos, iogurte, manteiga, vinho, cerveja, pães, etc. Inicialmente, os alimentos eram preservados por fermentações que ocorriam naturalmente. Atualmente, na produção moderna de alimentos e bebidas fermentadas utilizam-se processos controlados de fermentação, sendo utilizados microrganismos iniciadores selecionados, garantindo uniformidade e qualidade ao produto final.

Os queijos são alimentos fermentados, elaborados a partir do leite, possuindo grande importância nutricional para os homens, destacando-se por sua rica composição em proteínas de alto valor biológico e cálcio. Além disto, os queijos também possuem outros nutrientes como lipídeos, lactose e vitaminas lipossolúveis. Devido ao seu processo de fermentação, estes produtos lácteos apresentam uma microbiota bastante diversificada, podendo ser constituída de microrganismos desejáveis e indesejáveis. As bactérias ácido-lácticas (BAL) constituem importante exemplo de microrganismos desejáveis presentes nos diferentes tipos de queijo. Elas desempenham importantes funções neste alimento como a produção de ácidos orgânicos e de outros compostos químicos responsáveis pelo "flavour" além da elaboração de substâncias antagonistas aos microrganismos indesejáveis, dentre outras. Desta forma, a presença da microbiota desejável colabora para as características organolépticas e para a conservação e segurança higiênico-sanitária dos queijos.

As BAL são capazes de produzir substâncias de natureza protéica, conhecidas por bacteriocinas. Estes compostos possuem diferentes atividades bactericidas e bacteriostáticas contra vários microrganismos (Ross et al. 2002; Riley e Wertz, 2003). Estas ações também podem ocorrer no tratos gastrointestinal, respiratório superior e genito-urinário inferior humano e de outros animais. Desta forma, algumas BAL originárias de queijos, principalmente Lactococcus e Lactobacillus .podem, por diferentes mecanismos, contribuir para o equilíbrio da microbiota destes sítios, exercendo efeito probiótico (Fuller, 1993, Sabikhi et al., 2001).

Os microrganismos indesejáveis podem ser deteriorantes e/ou patógenos, estando presentes nos queijos em função de contaminações, resultantes de higiene deficitária, relacionada a todo o processo de produção, desde a obtenção da matéria-prima até o consumo. Estes problemas incluem manipulação inadequada, utilização de ingredientes não selecionados e de utensílios não higienizados e outros, comprometendo a qualidade dos produtos, tanto artesanais quanto industrializados. No caso dos queijos artesanais, elaborados a partir de leite cru, estes riscos

podem ser ainda mais sérios. Desta forma, queijos produzidos sob estas circunstâncias podem ser um veículo de toxinfecções alimentares, representando riscos à saúde pública. Nesta situação, microrganismos patogênicos como Listeria monocytogenes, Escherichia coli:H7, Salmonellaspp. (Donnelly, 2001) podem contaminar os queijos, incluindo Staphylococcusspp. e suas enterotoxinas, que são termoestáveis (Carmo et al, 2002).

Alguns tipos de queijos são elaborados artesanalmente e caracterizam culturalmente a região geográfica e o grupo étnico que os produz. Em muitas circunstâncias, apesar da significativa produção e consumo destes produtos, os mesmos apresentam deficiências em sua fabricação. Estes problemas podem levar à perda do produto ou até mesmo ameaçar a saúde dos consumidores. Este fato assume mais importância quando associado ao grande crescimento da população humana observada nos últimos anos, sem um planejamento adequado da produção de alimentos. Com isto, algumas populações convivem com o problema da falta de alimentos e com a fome.

Especialmente na região nordeste do Brasil tal situação assume proporções ainda mais significativas. Muitas pessoas desta região dependem economicamente da produção artesanal de alimentos, como é o caso do queijo de coalho. Desta forma, a produção artesanal de alimentos precisa ser mais bem estudada, caracterizada e aprimorada a fim de que os mesmos possam ser preservados, mantendo seu importante papel social e econômico em relação às populações envolvidas em sua produção.

O queijo de coalho vem sendo produzido há muitos anos no Nordeste do Brasil. Segundo a cultura local, este alimento surgiu quando as pessoas utilizavam recipientes feitos com estômago de animais para transportar leite. Depois de certo tempo em contato com o interior do utensílio, o leite transformava-se em uma massa coagulada, tendo sido submetido a ação das enzimas digestivas, como a renina ou a quimosina. Assim, quando as pessoas abriam o recipiente não encontravam o leite fluído, mas um coágulo. Com o decorrer do tempo, os homens passaram a apreciar o produto coagulado e a produção do queijo de coalho começou a ser disseminada. Inicialmente, pedaços de estômago de pequenos animais, como mocó, preá, cabritos, cordeiros e bezerros eram colocados dentro de um utensílio contendo leite cru (Aquino, 1983). Depois de certo tempo, o leite coagulava-se, então era feito o corte do coágulo, a mexedura da massa, a dessoragem e a enformagem, seguida de salga. Este costume sempre foi passado de geração para geração tornado-se, então, uma das principais características da cultura nordestina.

Atualmente, a produção de queijo de coalho é feita por pequenos produtores, cuja quantidade média é de aproximadamente 5 Kg por dia (Escobar et al., 2001). Em certas regiões, ainda se mantém a forma ancestral de

colocar pedaços de estômago de mamíferos no leite para a sua coagulação. Entretanto, hoje em dia, a maioria dos produtores artesanais deste tipo de queijo e a totalidade dos industriais utilizam coalho industrializado (líquido ou em pó) para a elaboração deste alimento.Infelizmente, há escassez com relação à disponibilidade de dados estatísticos sobre a produção de queijo de coalho nos estados e no país, como um todo. Porém, certamente a produção artesanal de queijo de coalho é bastante expressiva para o contexto da economia regional de vários estados nordestinos. Cerca de 30% do leite produzido em Pernambuco é destinado para esta finalidade, atingindo 40 a 50% em algumas microregiões (Escobar et al., 2001).

As bactérias probióticas são encontradas, principalmente, em alimentos fermentados, tendo os produtos lácteos um importante papel na veiculação desses microrganismos. Esses alimentos estão bem relacionados aos benefícios à saúde proporcionados pelos microrganismos probióticos por diversas razões: Geralmente os produtos lácteos têm uma imagem positiva relacionada à saúde; Os consumidores estão acostumados à idéia de produtos lácteos fermentados conterem microrganismos vivos e esses microrganismos podem ser usados como culturas iniciadoras no processo de fermentação, combinando o papel de culturas iniciadoras e probióticas.

Os queijos são alimentos fermentados, elaborados a partir do leite, possuindo grande importância nutricional para os homens, destacando-se por sua rica composição em proteínas de alto valor biológico e cálcio. Além disto, os queijos também possuem outros nutrientes, como: lipídeos, lactose e vitaminas lipossolúveis. Devido ao seu processo de fermentação, estes produtos lácteos apresentam uma microbiota bastante diversa, podendo ser constituída de microrganismos desejáveis e indesejáveis. As bactérias ácido-lácticas (BAL) constituem importante exemplo de microrganismos desejáveis presentes nos diferentes tipos de queijo. Elas desempenham importantes funções neste alimento, como: produção de ácidos orgânicos e outros compostos químicos responsáveis pelo "flavour" e elaboração de substâncias antagonistas aos microrganismos indesejáveis, dentre outras. Desta forma, a presença da microbiota desejável colabora para a conservação e segurança higiênico-sanitária dos queijos.

Lactobacillus estão entre as principais BAL utilizadas como probióticos em alimentos e são reconhecidos como geralmente seguro ( “Generally Recognized As Safe” - GRAS). Eles podem ser encontrados devido a sua presença natural, como por exemplo, no leite cru e em seus derivados ou devido à sua adição intencional, por razões tecnológicas ou para gerar um efeito benéfico à saúde dos consumidores. Na maioria dos casos as espécies de Lactobacillus adicionadas aos produtos fermentados industriais são exógenas e têm seus efeitos probióticos demosntrados. Contudo a falta de relação entre essas espécies e a microbiota normal originalmente encontrada nesses produtos não garante a preservação dos aspectos organolépticos característicos

desses produtos, especialmente em queijos.

Os probióticos podem suprimir a presença de microrganismos indesejáveis nos queijos e alimentos fermentados atuando pela exclusão competitiva (Alexandre et al, 2002; Caridi, 2003), pela produção de bacteriocinas (Riley e Wertz, 2002), por inibirem a ação de toxinas e pela produção de metabólitos bactericidas, como ácido lático (Fuller, 1989).

As BAL podem apresentar importantes efeitos benéficos à saúde humana. Isto pode ser comprovado por um número crescente de evidências que demostram estes fatos positivos. Dentre eles, podem ser citados: imunomodulação, proteção contra infecções causadas por bactérias e vírus patogênicos, redução de níveis plasmáticos de colesterol e de incidência de câncer, além de serem utilizadas no tratamento de úlceras pépticas e de vaginites (Naidu et al, 1999).

Apesar da importância das BAL na microbiota dos alimentos fermentados, não existem pesquisas relacionadas à caracterização dos microrganismos desejáveis em queijo de coalho, bem como seu potencial efeito probiótico. Neste sentido, o isolamento, a identificação e a seleção de BAL presentes em queijo de coalho podem ser uma alternativa viável para a elaboração de produtos com efeitos benéficos à saúde dos consumidores, facilitando a sua conservação e mantendo suas características sensoriais peculiares, sem colocar em risco a saúde dos consumidores. A utilização destas culturas de BAL, associada à adoção das Boas Práticas de Fabricação (BPF) nas indústrias são fundamentais para que a produção deste queijo esteja adequada às modernas normas de inspeção.

Desta forma, ressalta-se a relevância de buscar soluções para a melhoria da qualidade higiênico-sanitária-tecnológica deste queijo, para que o mesmo não possa oferecer risco a saúde dos consumidores e ser considerado seguro.

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1. Queijo de coalho

Com o desenvolvimento tecnológico da produção de queijo surgiram muitas variedades, sendo algumas de expressão regional, como os queijos artesanais queijo de “coalho” e queijo de “manteiga” produzidos no Nordeste (Nassu et al., 2001) “serro, canastra, Minas, Araxá e Salitre” produzidos em Minas Gerais, no Sudeste (Pinto, 2004; Araújo et al., 2004) e “colonial” produzido, principalmente, em Santa Catarina e Rio Grande do Sul, no Sul (Ide e Benedet, 2001).

O queijo de coalho vem sendo produzido há muitos anos no Nordeste do Brasil. Segundo a cultura local, este alimento surgiu quando as pessoas utilizavam recipientes feitos com estômago de animais para transportar leite. Depois de certo tempo em contato com o interior do utensílio, o leite transformava-se em uma

massa coagulada, tendo sido submetido a ação das enzimas digestivas, como a renina ou a quimosina. Assim, quando as pessoas abriam o recipiente não encontravam o leite fluído, mas um coágulo. Com o decorrer do tempo, os homens passaram a apreciar o produto coagulado e a produção do queijo de coalho começou a ser disseminada. Inicialmente, pedaços de estômago de pequenos animais, como mocó, preá, cabritos, cordeiros e bezerros eram colocados dentro de um utensílio contendo leite cru (Aquino, 1983). Depois de certo tempo, o leite coagulava-se, então era feito o corte do coágulo, a mexedura da massa, a dessoragem e a enformagem, seguida de salga. Este costume sempre foi passado de geração para geração tornado-se, então, uma das principais características da cultura nordestina.

A produção de queijo de coalho é feita por pequenos produtores, cuja quantidade média é de aproximadamente 5 Kg por dia (Escobar et al., 2001). Em certas regiões, ainda se mantém a forma ancestral de colocar pedaços de estômago de mamíferos no leite para a sua coagulação. Entretanto, hoje em dia, a maioria dos produtores artesanais deste tipo de queijo e a totalidade dos industriais utilizam coalho industrializado (líquido ou em pó) para a elaboração deste alimento.

Infelizmente, há escassez com relação à disponibilidade de dados estatísticos sobre a produção de queijo de coalho nos estados e no país, como um todo. Porém, certamente a produção artesanal de queijo de coalho é bastante expressiva para o contexto da economia regional de vários estados nordestinos. Cerca de 30% do leite produzido em Pernambuco é destinado para esta finalidade, atingindo 40 a 50% em algumas microregiões (Escobar et al., 2001).

A produção de produtos lácteos como queijo de manteiga, manteiga da terra e, em especial, o queijo de coalho, na região Nordeste, representa uma atividade relevante para a economia regional, por ser considerada fonte de renda e de trabalho para parcela considerável de pequenos e médios produtores rurais (Escobar et al., 2001; Cavalcante, Andrade e Silva, 2004). Além disso, desempenha importante papel no desenvolvimento da agricultura familiar, em pequenos municípios localizados nas bacias leiteiras. Esses produtos são fabricados em todos estados do Nordeste, mas a maior produção concentra-se nos estados do Pernambuco, Ceará, Rio Grande do Norte e Paraíba.

A indústria queijeira na região Nordeste divide-se, basicamente, em pequenas unidades artesanais, sem qualquer fiscalização, e em médias empresas, indústrias regulamentadas e inspecionadas pelo Ministério da Agricultura ou órgãos oficiais estaduais e municipais.

Tradicionalmente, a origem do queijo de coalho está ligada à fabricação artesanal, fato que ainda persiste em numerosas unidades de produção caseira e de fazendas produtoras, as quais não contam com tecnologia apropriada de manufatura e elaboram o queijo a partir de leite cru (Nassu et al., 2001). Os queijos, em sua maioria, são armazenados e comercializados à

temperatura ambiente em mercados, mercearias, padarias, feiras livres e outros estabelecimentos de vendas de alimentos.

De acordo com o Regulamento Técnico de identidade e Qualidade de Queijo de Coalho (Secretaria de Defesa Agropecuária, 2001) o queijo de coalho industrializado deve ser fabricado a partir de leite pasteurizado, com ou sem adição de culturas lácticas, e pode ser maturado ou não. Por produzido a partir de leite pasteurizado apresenta maior segurança microbiológica e padronização da qualidade. Geralmente, são armazenados e comercializados sob temperatura de refrigeração em supermercados, padarias e outros estabelecimentos especializados em venda de alimentos. Além disso, sua fabricação não é realizada de forma exclusiva nas indústrias regulamentadas e fiscalizadas por órgãos oficiais, nas quais também são manufaturados queijos padronizados como Minas frescal, prato e mussarela, cujo volume de produção supera a do queijo de coalho (Nassu et al., 2001).

Em relação à produção de queijo de coalho no Nordeste, constata-se escassez de dados estatísticos confiáveis, pelo fato da maior parte da sua produção ser artesanal e a comercialização ocorrer na informalidade, não sendo, portanto, incluída em estatísticas oficiais. Em levantamento realizado no Estado do Ceará, sobre o processamento do queijo de coalho em 57 unidades produtoras, constatou-se que 85% das unidades utilizavam leite cru e que apenas as quatro indústrias, submetidas à inspeção (Federal -SIF, Estadual - SIE e Municipal), pasteurizavam o leite utilizado na fabricação dos queijos (Nassu et al., 2001).

O queijo de coalho é consumido diretamente, grelhado em frigideira, chapa ou grelhado na brasa na forma de espetinho, principalmente nas praias, além de ser ingrediente em vários pratos típicos da Região, como baião-de-dois, feijão de corda, tapioca, entre outros.

O queijo de coalho, devido a suas características de consumo e sabor peculiar, vem a cada dia ganhando novos consumidores em outras regiões do país, principalmente a Sudeste. Hoje, o queijo de coalho industrializado representa parte do mercado de queijos no Rio de Janeiro, São Paulo, Goiânia e Brasília (Cavalcante, 2005). No período de entressafra na produção de leite no Nordeste, queijo de coalho industrializado produzido em Minas Gerais tem sido comercializado nos estados da Bahia e Pernambuco. Em Campinas (SP) foi identificada à comercialização de sete marcas de queijo de coalho industrializado produzidas em vários estados, sendo duas em Minas Gerais, duas no Paraná, uma no Mato Grosso, uma em Goiás e uma em Mato Grasso do Sul (Perez, 2005).

A Secretaria de Defesa Agropecuária (SDA) do Ministério da Agricultura, com base no Regulamento Técnico de Identidade e Qualidade de Queijo de Coalho (Secretaria de Defesa Agropecuária, 2001), define queijo de coalho como o produto obtido da coagulação do leite pasteurizado através do coalho ou outras

enzimas coagulantes apropriadas, complementada ou não pela ação de bactérias lácteas selecionadas e comercializado normalmente com até 10 dias de fabricação. É classificado como queijo de médio a alto teor de umidade, de massa cozida ou semicozida, apresentando um teor de gordura nos sólidos totais entre 35 e 60%. Quanto aos aspectos sensoriais, apresenta consistência semidura e elástica com textura compacta e macia. As principais características distintivas do processo de elaboração são: coagulação em torno de 40 minutos, corte e mexedura da massa, remoção parcial do soro, aquecimento da massa com água quente ou vapor indireto até obtenção de massa semicozida (até 45ºC) ou cozida (entre 45 e 55ºC), adição de sal (cloreto de sódio) a massa, prensagem, secagem, embalagem e estocagem a 10-12ºC, normalmente até 10 dias. Este queijo, também poderá ser elaborado a partir de massa crua, ou seja, sem aquecimento.

2.1.1. Critérios oficias de identidade e qualidade de queijo de coalho

Tecnicamente, o queijo de coalho pode ser definido como o produto obtido por coagulação enzimática, cuja coalhada pode ou não sofrer aquecimento, sendo prensado manualmente ou em pequenas prensas e salgado a seco, diretamente na massa ou na superfície (Mangueira et al., 2001).

O queijo de coalho produzido em estabelecimentos artesanais em Pernambuco pode ser definido pela legislação sobre Inspeção e Fiscalização Agropecuária deste estado em dois tipos:

Tipo A: queijo elaborado com leite integral ou desnatado pasteurizado, massa crua prensada, suficientemente dessorada, salgada e maturada;

Tipo B: queijo elaborado com leite cru integral ou desnatado, não pasteurizado, massa crua, prensada ou não, suficientemente dessorada, salgada e maturada.

Entretanto, o Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento (MAPA) não reconhece a variedade de queijo de coalho produzido a partir de leite cru. O Regulamento Técnico de Identidade e Qualidade de Queijo de Coalho (Brasil, 2001) define este produto como o queijo que se obtém por coagulação do leite por meio do coalho ou outras enzimas coagulantes apropriadas, complementada ou não pela ação de bactérias lácteas selecionadas e comercializado normalmente com até 10 (dez) dias de fabricação.

O queijo de coalho industrializado é um queijo de média a alta umidade, de massa semi-cozida ou cozida e apresentando um teor de gordura nos sólidos totais variável entre 35,0% e 60,0%. Os ingredientes obrigatórios são leite integral ou padronizado a 3% (m/m) em seu conteúdo de matéria gorda; coalho ou outras enzimas coagulantes apropriadas. Os ingredientes opcionais seriam: cloreto de cálcio, cultivo de bactérias lácteas selecionadas, sólidos de origem láctea, condimentos e especiarias e cloreto de sódio (Brasil, 2001).

2.1.1.1. Critérios físico-químicos

Os requisitos físico-químicos do queijo de coalho correspondem às características de composição e qualidade dos queijos de média a alta umidade, conforme estabelecido pelo MAPA, no Regulamento Técnico de Identidade e Qualidade de Queijos (Brasil, 1996) e com teor de gordura nos sólidos totais (GST) entre 35% e 60%.

2.1.1..2. Critérios microbiológicos

O queijo de coalho deverá obedecer os critérios estabelecidos para queijo de médio a alto teor de umidade no Regulamento Técnico Geral para Fixação dos Requisitos Microbiológicos de Queijos – Portaria nº 146/96 – MAPA (Brasil, 1996). Neste caso, recomenda-se a pesquisa de Staphylococcus coagulase positivo, Salmonella spp., Listeria monocytogenes, coliformes a 30ºC e a 45ºC (de acordo com o quadro a seguir).

Quadro 1: Requisitos microbiológicos para inspeção de queijos de alta umidade.

Microrganismo Critério de aceitação Categoria (ICMSF) Método de ensaioColiformes/g (30ºC) n=5, c=2, m=5.000, M=10.000 5 FIL 73

A:1985

Coliformes/g (45ºC) n=5, c=2, m=1.000, M=5.000 5 APHA 1922 c. 24 (1)Staphylococcus coagulase positivo n=5, c=2, m=100, M=1.000 5 FIL 145:1990Salmonella spp./25g n=5, c=0, m=0 10 FIL 93 A:1985Listeria monocytogenes/25g n=5, c=0, m=0 10 FIL 143:1990Fonte: Brasil (1996)

As práticas de higiene para elaboração do produto devem estar de acordo com o Regulamento Técnico sobre as Condições Higiênico-Sanitárias e de Boas Práticas de Fabricação para Estabelecimentos Elaboradores/Industrializadores de Alimentos (Brasil, 1997).

O leite a ser utilizado deverá ser higienizado por meios mecânicos adequados e submetido à pasteurização ou tratamento térmico equivalente, para assegurar fosfatase

alcalina residual negativa, nos termos da Portaria no 146/96 – MAPA, de acordo com metodologia analítica oficial do MAPA, combinado ou não com outros processos físicos ou biológicos que garantam a inocuidade do produto (Brasil, 1996).

2.1.2. Qualidade de queijo de coalho

Trabalhos científicos avaliando queijo de coalho têm demostrado diversos problemas relacionados à sua

qualidade microbiológica. Poucas pesquisas também relatam alterações microscópicas e físico-químicas deste produto lácteo. Vários destes fatores são causados pela produção inadequada, sem condições higiênico-sanitárias apropriadas.

Com relação aos aspectos microscópicos, Lima et al. (2002) avaliaram 51 amostras de queijo de coalho e verificaram que todas elas continham materiais estranhos (fibras, insetos e partículas de vidro e de metal), portanto, não sendo consideradas adequadas ao consumo humano.

Os constituintes físico-químicos (teores de umidade, gordura e gordura no estrato seco total) e pH de 70 amostras de queijo de coalho, comercializado em Recife (Pernambuco), foram analisados por Sena et al. (2000). Os resultados demostraram leves oscilações nos resultados dos parâmetros pesquisados, as quais foram atribuídas às diferentes formas de processamento deste queijo.

Os conteúdos de umidade, gordura, sal, amido e proteína e acidez de queijo de coalho apresentaram ampla variação de resultados, demonstrando falta de padronização do produto, de acordo com pesquisa realizada por Araújo et al. (2002), analisando amostras deste queijo nos estados do Rio Grande do Norte e do Ceará.

A qualidade microbiológica dos queijo de coalho também pode ser considerada deficiente, de acordo com relatos descritos na literatura científica. Florentino e Martins (1999) estudaram aspectos microbiológicos de 40 amostras de queijo de coalho, coletadas em vários municípios do sertão da Paraíba. Foram detectadas elevadas contagens de bolores e leveduras, Staphylococcus aureus, coliformes totais e fecais, assim como a presença de Salmonella spp. em 30% das amostras. Estes resultados demostraram as inadequadas condições higiênicas de produção artesanal deste queijo.

Mendes et al. (1999) avaliaram a qualidade bacteriológica de 105 amostras de queijo de coalho, comercializado em Recife, Pernambuco, oriundas de 15 municípios deste estado. Os resultados demostraram que a maioria das amostras analisadas foram consideradas impróprias para o consumo humano, devido à presença de Staphylococcus aureus, Salmonella spp. e coliformes fecais em valores superiores àqueles estabelecidos pela legislação.

Altos índices de contaminação com coliformes totais e fecais foram verificados em amostras de queijo de coalho, produzido e comercializado no Nordeste (Leite-Júnior et al., 2000; Bastos et al., 2001; Escobar et al., 2001; Nascimento et al., 2001). Estes resultados demonstram problemas higiênico-sanitários ocorridos durante a produção deste queijo, bem como a utilização de leite cru e a falta de tratamento de água nas unidades produtoras. Adicionalmente, os coliformes podem causar defeitos nos produtos levando à deterioração do alimento, como o estufamento precoce, alteração do

formato e do sabor. Além disto, existem cepas patogênicas de Escherichia coli e a presença deste microrganismo indica a probabilidade da existência de outros patógenos Gram negativo, como Salmonella spp. e Shigella spp..

Sena et al. (1998) isolaram Staphylococcus aureus de amostras de queijo de coalho e verificaram que 35% das mesmas eram produtoras da toxina da Síndrome do Choque Tóxico (TSST-1). Esta doença caracteriza-se por febre, hipotensão, congestão de vasos e choque letal. A associação de TSST-1 com a produção de uma ou mais enterotoxinas estafilocócicas, detectadas a partir de cepas envolvidas em casos de mastite foi relatada por Cardoso (1999).

Sena (2000), ao analisar 107 amostras de queijo coalho, provenientes de Recife (Pernambuco), constatou que 105 (98,1%) apresentavam-se contaminadas com Staphylococcus. As contagens variaram de 103 a 107

UFC/g, sendo a média igual a 106 UFC/g. Neste trabalho, 637 cepas de Staphylococcus spp. foram isoladas e submetidas a testes bioquímicos para identificação das espécies, sendo que 218 (58%) foram de Staphylococcus aureus; 96 (25%) foram de Staphylococcus coagulase-negativo; 41 (11%) foram de Staphylococcus hyicus e 22 (6%) de Staphylococcus intermedius. A produção de enterotoxinas deste microrganismo também foi investigada. Neste caso, tanto cepas coagulase positivo quanto negativo apresentaram este fenótipo. Ressalta-se que, a legislação oficial para a inspeção de queijos no Brasil ainda não leva este importante fato em consideração (Brasil, 1996). Os autores citaram este fato como o principal problema microbiológico deste queijo, principalmente porque as enterotoxinas estafilocócicas são termoestáveis e potenciais causadoras de surtos de intoxicação alimentar.

Rapini et al. (2002) avaliaram a presença de patógenos em dez amostras de queijo de coalho comercializado em praias de Salvador (Bahia) e Maceió (Alagoas). Staphylococcus aureus foi detectado em todas as

amostras, em contagens variando de 104 a 107UFC/g, sendo detectada a presença de suas enterotoxinas (SEB e SEC). Os autores concluíram que este queijo apresentava-se impróprio para o consumo humano, com grande potencial de causar intoxicação alimentar.

Salmonella sp. foi detectada em 8,7 % de 23 amostras de queijo de coalho pesquisadas por Escobar et al. (2001). Leite-Júnior et al. (2000) detectaram que 50% das amostras (9/18) de queijo de coalho comercializadas em Campina Grande (Paraíba), apresentavam-se contaminadas com Salmonella e coliformes fecais.

No Ceará, Borges et al (2003) avaliaram 43 amostras de queijo de coalho, produzidos em 11 municípios pertencentes a cinco microrregiões produtoras de leite e verificaram que 74% das amostras estavam contaminadas por coliformes fecais e &. coli em níveis superiores ao estabelecido na legislação.

Bruno et al (2005) verificaram que 100% (8) das amostras de queijo de coalho analisadas apresentavam níveis de coliformes fecais e &. coli em desacordo com os padrões microbiológicos vigentes.

No Rio Grande do Norte, Feitosa et al (2003) detectaram coliformes fecais acima dos limites legais em 36% (4/11) das amostras de queijo de coalho, produzido em diferentes microrregiões do Estado.

Paiva e Cardonha (1999) constataram que 60% (18/30) das amostras de queijo coalho artesanal,comercializadas no Estado também apresentavam níveis de coliformes fecais em desacordo com a legislação.

A ocorrência de L. monocytogenes foi detectada, tanto para queijos artesanais como para industrializados, A maior taxa (50%) de ocorrência do patógeno foi observada em queijo artesanal comercializado em João Pessoa (Sousa, 1999). Catão e Ceballos (2001) constataram alta incidência (51,5%) de L. monocytogenes em leite cru procedente de três municípios do estado da Paraíba.

No Ceará, a ocorrência de L. monocytogenes (19%) foi constatada em queijo de coalho industrializado, armazenado sob refrigeração (Branco et al., 2003). Já, em queijo artesanal elaborado a partir de leite cru a prevalência desta bactéria foi baixa (zero a 2,3%) (Borges et al., 2003; Branco et al., 2003; Bruno et al., 2005). Cunha Neto et al (2002) isolaram Staphylococcus enterotoxigênicos em vários alimentos, incluindo queijo de coalho e leite em pó integral, comercializados em Recife – PE. As contagens de Staphylococcus coagulase positiva variaram de 102 a 1,5 x 104UFC/g para estes dois produtos e 100% das cepas isoladas de queijo de coalho foram positivas para enterotoxinas estafilocócicas clássicas.

Lima (2005) avaliou a incidência de Staphylococcus coagulase positiva em 80 amostras de queijo de coalho industrial e artesanal comercializado em Fortaleza – CE e constatou que 54% (43) dos queijos estavam contaminados com esta bactéria, cujas contagens oscilaram entre 4,4 x 104 a 1,7 x 107 UFC/g. A presença de enterotoxinas estafilocócicas não foi observada nas amostras analisadas. Apenas 8,3% (1/12) dos pools de cepas de Staphylococcus produtores de coagulase foram positivos para enterotoxinas estafilocócicas clássicas.

A ocorrência de altos níveis de Staphylococcus coagulase positiva e S. aureus, em queijo de coalho produzido em vários estados do Nordeste (Algoas, Bahia, Ceará, Paraíba, Pernambuco e Rio Grande do Norte) tem sido relatada em muitos estudos (Florentino e Martins, 1999; Mendes et al., 1999; Paiva e Cardonha, 1999; Rapini et al., 2002; Feitosa et al., 2003; Borges et al., 2003). Na maioria destes estudos, os queijos foram classificados como impróprios para o consumo humano, dada a constatação de níveis de contaminação superiores aos permitidos pela legislação de 103UFC/g

(Agência Nacional de Vigilância Sanitária, 2001).

Borges et al (2003) avaliaram 43 amostras de queijo de coalho, produzido em 11 municípios, pertencentes a cinco microrregiões produtoras de leite, e verificaram que 91% (39) das amostras estavam contaminadas por Staphylococcus coagulase positiva em níveis superiores ao estabelecido pela legislação (103UFC/g).

Os dados acima demonstram a baixa qualidade microbiológica do produto, sendo causada não somente pela utilização de leite cru em sua produção, mas também pela deficiência de boas práticas de fabricação, tanto artesanais quanto industrializados.

2.2. Doenças transmitidas por alimentos e microrganiasmos patogênicos de importância em queijos

As doenças transmitidas por alimentos (DTA) são responsáveis, atualmente, pela maior parte dos surtos de diarréia em quase todos países do mundo. O desenvolvimento econômico e a globalização da comercialização de alimentos e as mudanças nos hábitos alimentares, aliados ao crescente consumo de alimentos industrializados preparados fora de casa, alteram o perfil epidemiológico dessas doenças.

As DTA são associadas, principalmente, ao consumo de produtos de origem animal, em especial os produtos lácteos. Em surtos e casos esporádicos de DTA, as bactérias patogênicas têm sido identificadas apenas em 30%, mas respondem por 60% dos casos de hospitalização e 70% dos casos fatais (Mead et al., 1999). A incidência global de DTA é reconhecidamente subnotificada, tornando-se impossível avaliar seu real impacto na saúde das populações e na economia dos países, mesmo os desenvolvidos (Flint et al., 2005). O impacto das DTA nos países em desenvolvimento é difícil de calcular, mas estima-se que nestes países ocorrem anualmente 2,1 milhões de mortes, principalmente crianças com até cinco anos de idade, devido à diarréia, veiculada, na maioria das vezes, pela água e pelos alimentos. Nos países industrializados, a mortalidade é limitada, mas a incidência de surtos (30%) permanece alta (World Health Organization, 2002).

Nos países da União Européia, estima-se que ocorram, anualmente, 45,4 milhões de casos esporádicos e surtos de DTA (Cashell, 2004). A salmonelose tem sido a doença relatada com maior freqüência, seguida da campilobacteriose (Food Administration Organization/ World Health Organization, 2002). Casos de listeriose são relatados por poucos países, mas a incidência é alta em países em que a notificação é obrigatória (Food Administration Organization/ World Health Organization, 2002; Haeghebaert et al., 2003). No período de 1993 a 1998, foram investigados mais de 30.000 surtos, com acometimento de 391.383 pessoas, em 42 países participantes do Programa de Vigilância da World Health Organization (WHO) para Controle de

DTA na Europa. Salmonella spp. foi identificada em 77,1% dos casos, com predominância de S. Enteritidis (35%), Staphylococcus aureus em 4%, entre outros patógenos. Leite e produtos lácteos representaram 8% dos alimentos envolvidos (Food Administration Organization/ World Health Organization, 2002).

Nos Estados Unidos, a incidência de DTA permanece alta, apesar do substancial declínio observado na incidência de alguns patógenos específicos (Escherichia coli O157:H7, Listeria monocytogenes) no período entre 1996 a 2004 (Centers for Disease Control and Prevention, 2003a; Centers for Disease Control and Prevention, 2004). A rede de vigilância de alimentos (FoodNet) diagnosticou, em 2004, 15.806 casos de doenças atribuídas ao consumo de alimentos. Entre os 10 patógenos rastreados, constatou-se a prevalência de Salmonella em 41% dos casos, Campylobacter em 36%, Shigella em 14%, &. coli STEC O157 em 2,5% e Listeria em 0,8% (Centers for Disease Control and Prevention, 2004). Embora, L. monocytogenes e &. coli O157:H7 tenham apresentado redução em sua incidência, a porcentagem de pessoas hospitalizadas foi muito alta, 91% para Listeria e 39% para &. coli O157 (Centers for Disease Control and Prevention, 2003a).

No Brasil, no período de 1999 a 2004, foram notificados 3.064 surtos, com o acometimento de 57.353 pessoas e registro de 37 mortes. As Secretarias Estaduais de Saúde dos estados das regiões Sudeste e Sul foram as que mais contribuíram com notificação de surtos, em função do nível mais avançado de implantação do sistema de Vigilância Epidemiológica das DTA nas Secretarias de Vigilância em Saúde nestas regiões. Alimentos preparados com ovos e maionese predominaram, com 22,2% dos casos, seguidos por alimentos com preparações mistas (21,5%); carnes vermelhas (13,8%); sobremesas (12,1%) e água (7,2%). Houve identificação etiológica em 1.882 surtos e a Salmonella foi identificada em 41% (772/1882) dos surtos, seguida pelo Staphylococcus aureus (18,1%) e outros agentes (Carmo et al., 2005).

2.2.1. Coliformes termotolerantes e Escherichia coli

Os coliformes termotolerantes ou fecais são membros da família Enterobacteriaceae e incluem os bastonetes curtos aeróbios e anaeróbios facultativos, Gram-negativos, catalase positiva e oxidase negativa que fermentam lactose a 45° C. O grupo dos coliformes termotolerantes é composto principalmente pela Escherichia coli, mas algumas espécies de Enterobacter e Klebsiella podem produzir ácido e gás a partir da lactose e outros carboidratos sem produzir H2S (International Commission on Microbiological Specifications for Foods, 1998; Holt et al., 2000).

Estes microrganismos fazem parte da flora normal do intestino de animais de sangue quente e, portanto, a sua presença nos alimentos constitui um indicador de contaminação fecal (Peresi et al., 2001). A &. coli

produz enterotoxinas e/ ou outros fatores de virulência, incluindo fatores invasivos e de colonização que causam doenças diarreicas.

O grupo dos coliformes termotolerantes é encontrado na água, no solo, nas plantas e nos alimentos, principalmente nos produtos de origem animal e nos manipulados por pessoas. Uma vez que suas células são sensíveis a altas temperaturas, sua presença em produtos pasteurizados, como o leite, ou cozidos representa contaminação após o tratamento térmico. A sobrevivência destes microrganismos em baixas temperaturas depende da espécie e do substrato (International Commission on Microbiological Specifications for Foods, 1998).

Os coliformes são responsáveis pelo desenvolvimento de estufamento precoce em queijos, caracterizado pela produção de gás H2 em 1 a 2 dias após a sua fabricação. Estes microrganismos podem ser inibidos pelo aumento na concentração de sal, dentre outros fatores (Fox et al., 2000). De acordo com os resultados de Gabutti et al. (2000), os coliformes fecais são os microrganismos mais sensíveis ao sal.

O grupo coliforme fecal consiste principalmente de espécies de &. coli pertencente ao gênero Escherichia, membro da família Enterobacteriaceae (Garrity, Bell e Lilburn, 2004). &.coli é a espécie predominante entre as diversas bactérias Gram-negativo, anaeróbias facultativas, que fazem parte da microbiota do trato intestinal do homem e dos animais de sangue quente. Esta bactéria ainda é encontrada na água, no solo, nos vegetais e alimentos, principalmente nos de origem animal como o leite e produtos lácteos. Com base nos fatores de virulência, distintos sorotipos O:H, mecanismos de patogenicidade (interação com a mucosa intestinal), manifestações clínicas e epidemiologia as cepas patogênicas de &. coli são divididas em seis grupos: &. coli enteropatogênica (EPEC), &. coli enteroinvasiva (EIEC), &. coli enterotoxigênica (ETEC), &. coli enterohemorrágica (EHEC), &. coli enteroagregativa (EAggEC) e &. coli difusamente adesiva (diffusely adherent &. coli) (Nataro e Kaper, 1998; Meng et al., 2001; Bopp et al., 2003; Clarke et al., 2003). Basicamente, apenas os quatros primeiros grupos de &. coli têm sido relacionados com surtos de DTA, sendo &. coli enteropatogênica (EPEC), o principal agente etiológico nas diarréias infantis.

A evolução da &. coli como um patógeno gastrointestinal é comparativamente recente (Pupo et al., 1997). Embora a &. coli seja encontrada no ambiente e como comensal no intestino de mamíferos, a transferência horizontal de genes permite a transição de algumas linhagens de &. coli da forma comensal para a forma patogênica (Baumler, 1997), normalmente pela aquisição de ilhas de patogenicidade (Lee, 1996). O que diferencia as diversas linhagens de &. coli patogênicas é o mecanismo de virulência de cada uma.

A EPEC é uma linhagem moderadamente invasiva, que produz uma adesina não fimbrial (Nataro e Kaper,

1998). É a principal causa de diarréia infecciosa em todo o mundo. Seu principal mecanismo de virulência é devido à adesão, seguida de lesões, destruição das microvilosidades e aplainamento das membranas dos enterócitos resultantes das lesões A/& (attaching and effacing) (Clarke, 2001).

As EIEC são importantes causas de diarréias, sendo responsáveis por uma doença semelhante à disenteria bacilar, o que torna a &. coli enteroinvasiva uma doença com sintomas indistinguíveis daqueles da disenteria causada pela Shigella spp., embora nenhum caso de síndrome urêmica hemolítica tenha sido observada em pacientes com disenteria causada por EIEC (Hart et al., 1993). As linhagens de EIEC invadem as células do cólon, os enterócitos, por endocitose e se espalham lateralmente para as células adjacentes. Estes passos de invasão e difusão célula a célula parecem ser virtualmente idênticos aos da Shigella spp. Mas, ao contrário das linhagens de Shigella, as linhagens de EIEC não produzem a Shiga-toxina o que poderia explicar a ausência da síndrome urêmica hemolítica na disenteria por EIEC. A habilidade da EIEC de invadir, sobreviver e multiplicar dentro dos enterócitos é dependente da presença de um plasmídeo de 120-140 MDa, que codifica todos os genes necessários para a virulência (Hart et al., 1993), incluindo as proteínas da membrana externa que são requeridas para a invasão (Levine, 1987). A infecção pela EIEC resulta em uma diarréia caracterizada pela presença de sangue e muco. Como a Shigella, a EIEC não fermenta a lactose ou o faz tardiamente e é não móvel. Um número de diferentes sorogrupos está associado com a EIEC, mas três sorogrupos predominam e estes não são vistos entre as linhagens de &. coli enterotoxigênica (ETEC), &. coli enteropatogênica (EPEC) e &. coli enterohemorrágica (EHEC) (Salyers; Whitt, 1994).

A EHEC também é uma linhagem moderadamente invasiva que produz a verotoxina, que é uma toxina que simula a shiga-toxina, além de outros fatores de virulência como a produção de adesinas (Clarke, 2001). Causa uma diarréia infantil hemorrágica copiosa que, em casos mais graves, leva a uma uremia hemolítica (Coia, 1998).

A ETEC é linhagem não invasiva e é a maior causa de diarréia do viajante em todo o mundo (Hart et al., 1993). Produz uma toxina termo-lábil, que é muito semelhante à toxina do cólera, e/ou uma toxina termo-estável (Nataro e Kaper, 1998). Como a EIEC, a ETEC está mais associada a baixas condições de saneamento e higiene (Clarke, 2001).

As &. coli que causam diarréia são uma importante causa de doenças em todo o mundo. Embora se tenha aprendido muito a respeito destas linhagens bacterianas, vários mecanismos ainda precisam ser elucidados. Para o desenvolvimento de vacinas é preciso identificar possíveis alvos, o que é difícil, uma vez que as linhagens patogênicas e as não-patogênicas compartilham várias propriedades (Clarke, 2001)

No Brasil, coliformes fecais e &. coli são detectados com freqüência em vários tipos de queijos. Carvalho (2003) também constatou contagens de coliformes fecais acima do limite permitido pela legislação em 34,4% (93) das amostras de queijo Minas frescal analisadas. Em outro estudo, Reibnitz e García (1998) constataram a presença de coliformes fecais e &. coli em 70% (20) das amostras de queijo colonial artesanal, comercializados em Blumenau – SC.

Em queijo de coalho, a ocorrência de coliformes fecais em níveis superiores aos permitidos pela legislação também tem sido relatada em vários estudos. No Ceará, Borges et al (2003) avaliaram 43 amostras de queijo de coalho, produzidos em 11 municípios pertencentes a cinco microrregiões produtoras de leite e verificaram que 74% das amostras estavam contaminadas por coliformes fecais e &. coli em níveis superiores ao estabelecido na legislação. Em outro estudo, Bruno et al (2005) verificaram que 100% (8) das amostras de queijo de coalho analisadas apresentavam níveis de coliformes fecais e &. coli em desacordo com os padrões microbiológicos vigentes.

2.2.2. Salmonella sp.

O gênero Salmonella pertencente à família Enterobactereaceae, é extremamente heterogêneo, compreendendo quase 2000 sorotipos, dos quais somente poucos são patogênicos ao homem. Ele é composto por bactérias Gram-negativos, com forma de bastonete curto, geralmente móveis, intracelulares facultativas, anaeróbias facultativas, não esporuladas, que fermentam glicose, mas não lactose e sacarose, geralmente produzindo ácido, gás e H2S. São oxidase negativa, catalase e lisina descaboxilase positivas, sendo que não hidrolisam a uréia. A temperatura considerada ótima para o crescimento destes microrganismos é de 37° C (Food and Drugs Administration, 1998; Holt et al., 2000; Kaufmann et al., 2001; Bopp et al., 2003).

Esta bactéria é comumente encontrada no trato intestinal de animais, especialmente em aves e suínos. As fontes ambientais deste microrganismo incluem a água, o solo, os insetos, as superfícies de cozinhas e indústrias, as fezes animais e as carnes, aves e frutos do mar crus. Outros alimentos associados à Salmonella são ovos, leite e seus derivados, coco, molhos, saladas, misturas para bolo, sobremesas recheadas com creme, gelatina em pó, manteiga de amendoim e chocolate (Food and Drug Administration, 1998; Holt et al., 2000).

Atualmente, o novo sistema de nomenclatura do gênero Salmonella inclui as espécies Salmonella bongori e Salmonella enterica, sendo que a espécie S. enterica, subdivide-se em seis subespécies (De Vos, Trüper e Tindall, 2002; Tindall et al., 2005). Até 2002, haviam sido descritos 2.541 sorovares de Salmonella spp., sendo 60% destes referentes à S. enterica subsp. Enterica (Centers for Disease Control and Prevention, 2005).

Com relação à patogenicidade em humanos, as espécies de Salmonella são divididas, de acordo com Kaufmann et al. (2001) em: causadoras de septicemia e produtoras da febre tifóide (S. typhi e espécies correlatas), causadoras de gastroenterites (a maioria das espécies de Salmonella, como S. typhimurium, S. enteritidis) e causadoras de uma doença invasiva (S. choleraesuis).

O mecanismo de patogenicidade se desenvolve pela penetração e passagem da Salmonella do lúmem intestinal para dentro do epitélio que reveste a parede intestinal, onde ocorre inflamação. O tempo de incubação é de 6-48 horas, seguido pelo início dos sintomas agudos, como náusea, vômito, cãibra abdominal, diarréia, febre e dor de cabeça. Algumas conseqüências crônicas, como sintomas de artrite, podem persistir por 3-4 semanas após o início dos sintomas agudos (International Commission on Microbiological Specifications for Foods, 1998).

A infecção inicia-se quando a Salmonella spp invade as células M, na superfície epitelial do intestino delgado (Takeuchi, 1967). As bactérias, aderidas à superfície das células epiteliais, induzem degeneração nas microvilosidades do enterócito. Posteriormente, projeções citoplasmáticas das células do hospedeiro circundam as bactérias até que elas fiquem contidas em vacúolos envoltos por membrana. Ocorre, então, a reconstituição da borda em escova dos enterócitos. A S. Typhimurium induz rearranjos na membrana celular como parte do processo de internalização (Finlay e Falkow, 1990; Finlay et al., 1992; Francis et al., 1992).

A salmonelose, geralmente, é causada pelo consumo de alimentos de origem animal contaminados por Salmonella, como aves, ovos carnes, e leite e seus derivados, embora muitos outros alimentos, incluindo vegetais contaminados, têm sido implicados na transmissão da doença. Este patógeno ocorre desde a cadeia de produção primária de alimentos até o ambiente doméstico ou estabelecimentos e instituições de serviços de alimentação. S. Enteritidis e S. Typhimurium são os sorotipos de maior importância na transmissão de salmonelose humana (D’Aoust, Maurer e Bailey, 2001).

Em camundongos inoculados intragastricamente, observou-se que o sítio primário de colonização por S. enteritidis é o íleo terminal (Carter e Collins, 1974). Também foi observado que a Salmonella interagia, preferencialmente, com as células das placas de Peyer (tecido linfóide associado ao intestino), como é o caso da S. Typhimurium que, seguindo a rota oral de colonização, associa-se rapidamente com o tecido das placas de Peyer (Hohmann et al., 1978). A bactéria entra seletivamente pelas células M (“microfold”) – que são células epiteliais especializadas, localizadas no epitélio folicular associado, que estão sobre o tecido linfóide – do epitélio associado aos folículos linfóides (Jones et al., 1994). A entrada bacteriana é seguia pela morte destas células M e, após a eliminação destas células, os microrganismos movem-se lateralmente ao longo da lâmina própria ou invadem os folículos onde se

multiplicam. Com o tempo, a infecção progride para os linfonodos que drenam a região, chegando ao fígado e ao baço (Carter e Collins, 1974; Nardi et al., 1991). Em camundongos, a Salmonella cresce em macrófagos residentes do fígado e do baço.

O estudo de salmoneloses em camundongos utilizando a S. Typhimurium é um excelente modelo, pois os sintomas provocados por esta bactéria e pela S. choleraesuis são muito semelhantes aos sintomas da febre tifóide causada pela S. Typhi em seres humanos (Salyers e Whitt, 1994). Os resultados obtidos, geralmente, têm sido extrapolados para a compreensão de vários aspectos da infecção causada pela S. Typhi. Em condições experimentais normais, este sorotipo não é virulento para o camundongo, sendo incapaz de induzir uma doença progressiva neste animal (Carter e Collins, 1974).

Embora a análise microbiológica de queijos industrializados raramente resulte no isolamento de Salmonella, este microrganismo pode crescer durante a fabricação e sobreviver em vários queijos por mais que 60 dias (International Commission on Microbiological Specificatios for Foods, 2000).

No Brasil, há vários relatos sobre a ocorrência de Salmonella spp. em queijos, principalmente em queijo de coalho artesanal (Nassu et al., 2001; Rapini et al., 2002; Araújo et al., 2004; Escobar et al., 2001). No Ceará, Borges et al (2003) detectaram a presença de Salmonella spp. em 34,9% (43) das amostras de queijo de coalho analisadas. Em outro estudo, Bruno et al (2005) verificaram que esta bactéria estava presente em 12,5% (8) dos queijos industrializados. No Rio Grande do Norte, Feitosa et al (2003) relataram a presença de Salmonella em 9% (11) dos queijos analisados, de diferentes microrregiões do Estado. Florentino e Martins (1999) observaram a presença do patógeno em 30% das amostras de queijo artesanal produzido em várias regiões do Estado da Paraíba. Em Recife, Mendes et al (1999) avaliaram 105 amostras de queijo de coalho, procedentes de 15 municípios de Pernambuco, e verificaram a presença de Salmonella em 73,3% dos queijos, enquanto Duarte et al (2005) isolaram este patógeno em apenas 5,5% dos queijos comercializados em 21 municípios do Estado.

2.2.3. Listeria monocytogenes

Segundo o Taxonomic outline of the prokaryotes, Bergey´s Manual of Systematic Bacteriology (Garrity, Bell e Lilburn, 2004), o gênero Listeria encontra-se classificado na classe Bacilli, Ordem I Bacillales e família IV Listeriaceae e apresenta seis espécies: L. monocytogenes, L. innocua, L. weishimeri, L. seeligeri, L. ivanovii e L. grayi.

As espécies do gênero são pequenos bastonetes Gram positivos, não formam esporos, não formam cápsula, anaeróbios facultativos, móveis devido a flagelos

peritríquios e em meio-sólido, a 20-25°C, apresentam motilidade típica de guarda-chuva (Bille e Rocourt, 2003). Crescem numa faixa de temperatura entre –0,4 a 50°C (Lou e Yousef, 1999), com crescimento ótimo a 30-37°C (Bille e Rocourt, 2003). A faixa de pH para crescimento situa-se entre 5,6 a 9,6 (Swaminathan, 2001), mas o crescimento de L. monocytogenes já foi constatado em pH abaixo de 4,0 (Lou e Yousef, 1999; Donelly, 2001). A atividade de água ótima é >0,97, porém, a mínima varia entre 0,90-0,93 (Lou e Yousef, 1999) e toleram altas concentrações de cloreto de sódio (10-12%), sobrevivendo a 25,5% de NaCl (Donelly, 2001).

A listeriose é uma doença causada pela ingestão de alimentos contaminados por L. monocytogenes. São descritas duas formas de manifestação clínica da doença, a listeriose invasiva e a listeriose gastrintestinal (não invasiva). A listeriose invasiva é uma doença severa, pois a taxa de mortalidade é alta (20 a 30%), principalmente para pessoas susceptíveis a adquirir a infecção, como gestantes, recém nascidos, idosos, pacientes submetidos a hemodiálise e a terapias prolongadas, indivíduos com sistema imunológico deprimido (Swaminathan, 2001), enquanto a listeriose não invasiva pode causar infecções suaves semelhantes a uma gripe, em indivíduos saudáveis, até surtos de gastrenterite febril, mas normalmente não evolui para óbito (Carrique-mas et al., 2003; Gahan e Hill, 2005).

Listeria monocytogenes é um patógeno intracelular com habilidade de penetrar, multiplicar-se dentro do citoplasma da célula do hospedeiro (macrófagos, fibroblasto, eritrócitos) e invadir células adjacentes, além de se proteger do sistema imunológico do hospedeiro (Vazquez-Boland et al., 2001). Inicialmente, o processo infeccioso parece ser uma associação com a membrana plasmática das células epiteliais das microvilosidades do trato intestinal do hospedeiro. Então, a célula bacteriana é internalizada pela célula por fagocitose, permanece no vacúolo por curto período de tempo e quando ocorre a lise da membrana fagossomal é liberada no citoplasma da célula do hospedeiro, onde se multiplica rapidamente e induz a polimerização de filamentos de actina da célula do hospedeiro, formando longas caudas em uma das extremidades da célula bacteriana. Os filamentos de actina favorecem o deslocamento da bactéria no citoplasma, permitindo a invasão das células adjacentes dando início a um novo ciclo da infecção (Swaminathan, 2001; Vazquez-Boland et al., 2001; Schmidt e Hensel, 2004).

A ocorrência de L. monocytogenes em leite e produtos lácteos tem sido relatada em muitos estudos (Silva, Hoffer e Tibana, 1998; Catão e Ceballos, 2001; Kabuki et al., 2004). Entre os produtos lácteos, os queijos são os mais comumente contaminados por esta bactéria, principalmente os de alta e média umidade. A contaminação de queijos por L. monocytogenes está relacionada com a contaminação do leite cru, o que pode ocorrer durante o processo de ordenha, estocagem, transporte até a indústria e a partir do ambiente do

processamento (Tompkin, 2002; Waak, Tham e Danielsson-Tham, 2002; Kabuki et al., 2004).

Em queijo de coalho, a incidência de L. monocytogenes também apresenta ampla variação (zero a 50%), tanto para queijos artesanais como para industrializados. A maior taxa (50%) de ocorrência do patógeno foi observada em queijo artesanal comercializado em João Pessoa (Sousa, 1999). Cabe ressaltar que, em outro estudo, Catão e Ceballos (2001) constataram alta incidência (51,5%) de L. monocytogenes em leite cru procedente de três municípios do estado da Paraíba. No Ceará, a maior ocorrência de L. monocytogenes (19%) foi constatada em queijo de coalho industrializado, armazenado sob refrigeração (Branco et al., 2003). Já, em queijo artesanal elaborado a partir de leite cru a prevalência desta bactéria foi baixa (zero a 2,3%) (Borges et al., 2003; Branco et al., 2003; Bruno et al., 2005).

2.2.4. Staphylococus sp e suas enterotoxinas

O gênero Staphylococcus é composto de 30 espécies e 20 subespécies (Garrity, Bell e Lilburn, 2004). Os membros deste gênero são cocos Gram positivos, quando visualizados ao microscópio ocorrem sozinhos, aos pares, tétrades, cadeias curtas (três ou quatro células) ou apresentam formação semelhante a um cacho de uva. As espécies são anaeróbias facultativas, exceto S. saccharolyticus e S. aureus subsp. anaerobius. São tipicamente encapsuladas ou com formação de cápsula limitada, usualmente catalase positiva, não apresentam motilidade e nem produzem esporos (Bannerman, 2003).

Staphylococcus são amplamente distribuídos na natureza, sendo o homem e os animais os principais reservatórios. Geralmente, são encontrados nos pêlos, na pele, boca, narinas, glândulas mamárias, trato respiratório e intestinal destes hospedeiros (Bannerman, 2003). Em geral, as espécies deste gênero têm uma relação benigna ou simbiótica com o hospedeiro, porém, por serem bactérias oportunistas, certas espécies são freqüentemente agentes etiológicos de várias infecções no homem e nos animais. A espécie S. aureus é a que está associada mais freqüentemente a doenças estafilocócicas, quer sejam de origem alimentar ou não. Estima-se que entre 30 a 50 % da população humana seja portadora desta bactéria (Le Loir, Baron e Gautier, 2003). A cavidade nasal é o principal habitat de Staphylococcus no homem e, a partir deste foco atingem tanto a epiderme e como ferimentos, água, ar, solo, esgoto, plantas de processamento de alimentos, leite, e alimentos diversos.

A espécie mais importante deste gênero, ligada aos alimentos, é a S. aureus, distinguida das demais espécies através dos testes de coagulase (coagulação do plasma sangüíneo) e termonuclease (estabilidade térmica da nuclease). Nenhum destes testes, entretanto, é absolutamente específico para o S. aureus. O S. hyicus é freqüentemente coagulase positiva e pode ser facilmente

confundido com o primeiro, no isolamento. A diferenciação entre ambos é realizada através de testes bioquímicos adicionais (International Commission on Microbiological Specifications for Foods, 1998). O S. aureus é uma bactéria mesófila, mas cresce em ampla faixa de temperatura (10-45ºC) e de pH (4,2-9,3), tolera elevadas concentrações de cloreto de sódio (até 23%) e baixa atividade de água (0,83 a 0,86). No entanto, concentrações entre 12 a 13 % de NaCl e 0,87 a 0,93 de atividade de água parecem ser limitantes para produção de enterotoxinas (Martin, Myers e Landolo, 2001; Bannerman, 2003).O S. aureus é muito resistente a temperaturas de congelamento, sobrevivendo em alimentos estocados até –20° C. Ele não resiste a temperaturas e pasteurização, porém é capaz de produzir toxinas altamente estáveis ao aquecimento (International Commission on Microbiological Specifications for Foods, 1998).

A intoxicação estafilocócica é causada pela ingestão de alimentos contendo enterotoxinas produzida por Staphylococcus enterotoxigênicos, como S. aureus (com maior prevalência), S. hyicus, S. intermedius, entre outras espécies. Esta intoxicação é um dos tipos mais comuns de DTA (Le Loir, Baron e Gautier, 2003).

A intoxicação alimentar causada por S. aureus se manifesta logo após a ingestão do alimento contaminado com enterotoxinas pré-formadas. A quantidade de enterotoxina necessária para causar a doença ainda não está bem estabelecida, mas sabe-se que depende da susceptibilidade do individuo, peso corporal e, especialmente, do estado de saúde da pessoa acometida (Jablonski e Bohach, 2001). Para a formação de enterotoxinas, em quantidade suficiente para provocar intoxicação, são necessárias 105 a 106 células de S. aureus por grama de alimento (Jablonski e Bohach, 2001). Além disso, o crescimento de S. aureus e a produção de enterotoxinas são afetados por parâmetros físicos e químicos, como temperatura, pH, atividade de água (Aa), concentração de sal (NaCl) e disponibilidade de oxigênio.

A intoxicação estafilocócica é, geralmente, de início repentino e severo, com náusea, vômitos e cólicas, prostração, hipotensão e hipotermia (Dinges, Orwin e Schlievert, 2000; Balaban e Rasooly, 2000; Le Loir, Baron e Gautier, 2003). Entretanto, a intensidade dos sintomas pode variar de acordo com o grau de suscetibilidade do indivíduo, com a concentração da enterotoxina presente no alimento e a quantidade de alimento ingerida. A recuperação ocorre em torno de dois dias, porém, alguns casos podem levar mais tempo ou exigir hospitalização (Jablonski e Bohach, 2001). O período de incubação oscila de 30 minutos a 8 horas, porém, na maioria dos casos, os sintomas aparecem entre 2 e 4 horas após a ingestão do alimento contaminado (Bannerman, 2003).

Em uma intoxicação estafilocócica, as enterotoxinas apresentam algumas ações no trato gastrintestinal, entre as quais incluem-se a emética e a diarréica. A ação emética é o sintoma observado com maior freqüência

em uma intoxicação estafilocócica. Os sítios desta ação parecem localizar-se no intestino. O estímulo é transferido através do nervo vago ao centro do vômito e induz a retroperistalsia do estômago e do intestino delgado provocando vômitos intensivos (Balaban e Rasooly, 2000; Dinges; e Orwin; Schlievert, 2000). A ação diarréica é o segundo sintoma mais comum na intoxicação. Embora seu mecanismo de ação ainda não seja bem conhecido, causa inflamação e irritação da mucosa do estômago e intestino delgado (Dinges; Orwin; Schlievert, 2000).

A intoxicação estafilocócica, por ser uma doença de curso rápido (24-48 horas), e os indivíduos afetados, geralmente, não necessitarem de atendimento médico, a maioria dos casos não é notificada aos órgãos de Vigilância Sanitária, o que leva à subnotificação da doença no Brasil, bem como em outros países.

A contaminação dos alimentos por espécies de Staphylococcus enterotoxigênicos representa um risco potencial para a saúde pública, uma vez que algumas espécies, incluindo coagulase positiva e negativa, quando presente nos alimentos pode produzir uma ou mais enterotoxinas estafilocócicas (SE) nos mesmos, os quais, depois de ingeridos, causam intoxicação estafilocócica aos consumidores.

Entre as espécies coagulase positiva, S. aureus é a mais relacionada a casos e surtos de intoxicação alimentar, devido à habilidade de muitas de suas cepas produzirem exotoxinas superantigênicas (PTSAg), como as enterotoxinas (Dinges, Orwin e Schlievert, 2000). Outras espécies produtoras de coagulase, como S. intermedius (Becker et al., 2001) e S. hyicus (Adesiyun, Tatini e Hoover, 1984), também produzem enterotoxinas e têm sido envolvidas em alguns surtos (Khambaty, Bennet e Shah, 1994; Bennet, 1996).

A produção de enterotoxinas por Staphylococcus não produtores de coagulase, tais como, S. capitis, S. conhnii subsp cohnii, S. epidermidis, S. haemolyticus, S. hominis, S. saprofphyticus, S. schleiferi, S. warneri, S. xylosus e S. chromogenes têm sido relatada em vários estudos, sendo a maioria sob condições de laboratório (Vernozy-Rozand et al., 1996a; Cheng-Chun; Lifen, 1997; Pereira et al., 2001). Os resultados de alguns destes estudos sugerem que Staphylococcus não produtores de coagulase (Rodriguez et al., 1996; Vernozy-Rozand et al., 1996b; Udo et al., 1999) podem ser potenciais, causadores de intoxicação alimentar. Já foram relatados surtos de intoxicação estafilocócica associados a espécies coagulase negativa (Omori e Kato, 1959; Breckinridge e Bergdoll, 1971; Carmo et al, 2002b; Veras et al., 2003).

As enterotoxinas estafilocócicas (SE) são um grupo de proteínas extracelulares de cadeia simples, com baixo peso molecular (26 a 30 kDa) e ponto isoelétrico de 7,0 a 8,6. São hidrossolúveis e resistentes à ação de enzimas proteolíticas do sistema digestivo, permanecendo ativas após a ingestão (Le Loir, Baron e Gautier, 2003). São produzidas durante toda fase do crescimento bacteriano,

mas principalmente durante a fase exponencial (Soriano et al., 2002). Outra característica importante é sua termoestabilidade, sendo capazes de resistir a tratamentos térmicos como a pasteurização e a ultrapasteurização.

As enterotoxinas estafilocócicas são nomeadas com as letras do alfabeto de acordo com a ordem cronológica de suas descobertas. Até o momento, já foram descritos 18 tipos de enterotoxinas distintas (Tabela 6), mas com similaridade na estrutura e seqüência (Balaban w Rasooly, 2000). Atualmente, com base nas características antigênicas, são reconhecidos oito tipos sorológicos de enterotoxinas: SEA, SEB, SEC, SED SEE (Dinges, Orwin e Schlievert, 2000) e as descritas recentemente SEH (Ren et al. 1994; Su; Wong, 1995; Omoe et al. 2002), SEG e SEI (Omoe et al. 2002; Jørgensen et al. 2005). Outras 12 enterotoxinas foram identificadas e caracterizadas nos últimos anos (Omoe et al. 2005).

As cadeias polipeptídicas das enterotoxinas são ricas em aminoácidos lisina, ácido aspártico e ácido glutâmico e, caracterizadas por conter somente dois resíduos de cisteína e um ou dois resíduos de triptofano. A composição de aminoácidos das enterotoxinas SEA, SED e SEE é similar, o mesmo ocorrendo entre a SEB e a SEC (Marrack; Kappler, 1990).

O seqüenciamento parcial dos aminoácidos das enterotoxinas SEA, SEB e SEC evidenciou a existência de uma região homóloga nas três moléculas, o que sugere ser esta região o sítio ativo da molécula de enterotoxina (Dinges, Orwin e Schlievert, 2000; Jablonski e Bohach, 2001). Embora as enterotoxinas sejam similares em sua composição e atividade biológica, são identificadas separadamente em função de suas diferenças antigênicas. Várias enterotoxinas sorologicamente distintas têm sido reconhecidas e classificadas de SEA até SEU e, seus genes, de sea até seu. Inicialmente, a toxina da Síndrome do Choque Tóxico foi equivocadamente identificada como SEF e por isso não existe a enterotoxina sorotipo F. Pequenas variações antigênicas da (SEC1, 2, 3) têm sido descritas (Bergdoll, 1967; Reiser et al., 1984; Becker;, Roht e Peters, 1998) assim como duas SEH distintas (Omoe et al., 2002). Normalmente, isto ocorre em cepas que secreta mais de um tipo de enterotoxinas (OmoE et al., 2005).

As enterotoxinas estafilocócicas são codificadas por bacteriófago (SEA e SEE), plasmídios como a SED (Iandolo, 1989), cromossomo como a SEH e SEP (Su e Wong, 1995; Omoe et al., 2002) ou ilhas de patogenicidade cromossomal a exemplo das enterotoxinas SEB, SEG, SEGv, SEI, SEIv, SEM, (Su e Wong, 1995; Jarraud et al., 2001; Munson et al., 1998; Blaiotta et al., 2004), entre outras.

A relação entre as novas enterotoxinas e a intoxicação estafilocócica, ainda não está completamente elucidada. Há poucos relatos na literatura sobre a ocorrência dos genes que codificam estas novas enterotoxinas, os quais

consideram principalmente amostras clínicas ou de coleções bacterianas (Jarraud et al., 1999; Abe et al., 2000; Jarraud et al., 2001; Omoe et al., 2002). Pouco se tem relatado sobre a detecção das novas enterotoxinas em cepas de Staphylococcus, principalmente S. aureus, isolados de alimentos (Mclauchlin et al., 2000; Akineden et al., 2001; Rosec e Gigaud, 2002; Blaiotta et al., 2004; Jørgensen et al., 2005). Por outro lado, os relatos sobre a ocorrência das enterotoxinas clássicas (SEA, SEB, SEC1, 2, 3, SED e SEE) em alimentos são numerosos (De Luca, Zanetti e Stampi, 1997; Rosec et al., 1997; Meyrand et al., 1999; Mclauchlin et al., 2000; Akineden et al., 2001; Rosec e Gigaud, 2002; Chapaval, 2003).

A presença de Staphylococcus enterotoxigênicos e suas enterotoxinas têm sido constatada com freqüência em produtos lácteos, principalmente em leite cru e queijos (Rosec e Gigaud, 2002; Sena, 2000; Lamaita et al., 2005; Le Loir, Baron e Gautier, 2003). O leite cru obtido de animais com infecção estafilocócica nas glândulas mamárias (mastite) é a principal fonte de cepas S. aureus enterotoxigênicos.

No Brasil têm sido realizadas muitas pesquisas para avaliar o potencial enterotoxigênico e a produção de enterotoxinas por Staphylococcus sp. isoladas de alimentos, principalmente queijo Minas frescal (Sabioni, Hirooka e Souza, 1988; Araújo et al., 2004) e queijo de coalho (Florentino e Martins, 1999; Borges et al., 2003; Feitosa et al., 2003). Cunha Neto et al (2002) isolaram Staphylococcus enterotoxigênicos em vários alimentos, incluindo queijo de coalho e leite em pó integral, comercializados em Recife – PE. As contagens de Staphylococcus coagulase

positiva variaram de <102 a 1,5 x 104 UFC/g para estes dois produtos e 100% das cepas isoladas de queijo de coalho foram positivas para enterotoxinas estafilocócicas clássicas. Em outro estudo, Sena (2000) analisou 90 amostras de queijo de coalho comercializadas em Recife – PE e isolou 377 cepas de Staphylococcus, assim distribuídas: 218 (57,8%) de S. aureus; 96 (25.5%) de S. epidermidis; 41 (10,9%) de S. hyicus; e 22 (5,8%) de S. intermedius. Pools de cepas foram testados quanto ao potencial de produção de enterotoxinas por indução sob condições laboratoriais e observou-se que dos 78 pools de cepas de S. aureus, 48 (61,5%) produziram SEB; 10 (12,5%) SEC e 2 (2,5%) SED. Dos 11 pools de Sintermedius, 7 (63,6%) produziram SEB e os pools de S. epidermidis e de S. hyicus não produziram enterotoxinas. Lima (2005) avaliou a incidência de Staphylococcus coagulase positiva em 80 amostras de queijo de coalho industrial e artesanal comercializado em Fortaleza (CE) e constatou que 54% (43) dos queijos estavam contaminados com

esta bactéria, cujas contagens oscilaram entre 4,4 x 104 a 1,7 x 107UFC/g. A presença de enterotoxinas estafilocócicas não foi observada nas amostras analisadas. Apenas 8,3% (1/12) dos pools de cepas de Staphylococcus produtores de coagulase foram

positivos para enterotoxinas estafilocócicas clássicas. Em uma avaliação de queijo de coalho comercializado nas praias de Salvador e Maceió, Rapini e outros (2002) observaram que 100% das amostras estavam contaminadas por Staphylococcus sp. e por enterotoxinas SEB e SEC.2.3. Bactérias Ácido-Lácticas (BAL)

As bactérias lácticas são bastante difundidas na natureza e capazes de se desenvolverem sob diferentes condições ambientais. São associadas a ambientes ricos em nutrientes, sendo freqüentemente encontradas em alimentos fermentados, como leite, carnes, vegetais, grãos, frutas e bebidas. Algumas delas também fazem parte da microbiota natural dos tratos respiratório eintestinal e de cavidades naturais de humanos e animais (Axelsson 1993; Pot et al., 1994). São amplamente utilizadas como fermentos lácticos devido a sua propriedade de conservar os alimentos e de fornecer uma proteção eficaz ao homem e animais contra infecções intestinais (Dellaglio et al., 1994).

O grupo das BAL compreende onze gêneros de bactérias Gram-positivo (Mogensen et al., 2003). São eles: Carnobacterium, Enterococcus, Lactococcus, Lactobacillus, Lactosphaera, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus Vagococcus e Weissella.

As BAL são encontradas em inúmeros ambientes na natureza, particularmente no leite. Elas são também habitantes dos tratos digestivo, respiratório superior e urogenital inferior dos animais (Hove et al. 1999). O grupo inclui tanto bastonetes quanto cocos não esporulados, podendo ser aeróbios, microaerófilos ou anaeróbios facultativos. A maioria delas é inativada a temperaturas superiores a 70 °C. Bactérias lácticas utilizam preferencialmente a lactose como fonte de carbono. A fermentação pode ser do tipo homofermentativa, quando produz uma intensa quantidade acido láctico, ou heterofermentativa, quando outras substâncias, além do ácido láctico, como os ácidos acéticos, dióxido de carbono e etanol, são também produzidas durante a fermentação da lactose (Salminen e Von Wright, 1993).

A capacidade de fermentação varia de acordo com as espécies. A maioria das BAL produz entre 0,5% e 1,5% de ácido láctico, mas existem bactérias capazes de produzir mais de 3% de ácido láctico. Estas bactérias precisam de compostos nitrogenados orgânicos para se desenvolver. Assim, elas utilizam a caseína do leite como fonte destes compostos. Porém, a habilidade enzimática de quebrar a caseína é variável de uma espécie para outra (Robinson, 1991).

Apesar da identificação das BAL isoladas a partir de alimentos poder ser realizada por intermédio de provas bioquímicas, novos procedimentos têm sido utilizados (Klaenhammer et al., 2002). Dentre estes, aqueles baseados em técnicas de biologia molecular apresentam-se como os mais promissores, principalmente por sua precisão e confiabilidade (Tannock et al., 1999). Estas

análises baseiam-se na extração de DNA microbiano, seguida por amplificação de genes específicos por intermédio de reação de polimerização em cadeia (“PCR”) (Batool et al., 2002;). Também são empregadas metodologias relacionadas ao polimorfismo de genes (“RFLP”) e quantificação de proteínas de superfícies (Gattim et al., 2001).

BAL podem apresentar importantes efeitos benéficos à saúde humana. Isto pode ser comprovado por um número crescente de evidências que demostram estes fatos positivos. Dentre eles, podem ser citados: imunomodulação, proteção contra infecções causadas por bactérias e vírus patogênicos, redução de níveis plasmáticos de colesterol e de incidência de câncer, além de serem utilizadas no tratamento de úlceras pépticas e de vaginites (Robinson, 1991; Fuller, 1993; Gonzalez-Martinez e Gomez-Trevino, 2001; Ouwehand et al., 2003).

2.3.1. Bactérias Ácido-Lácticas em queijos

As BAL podem ser isoladas a partir de vários alimentos, incluindo produtos de origem vegetal (como forragens, frutas e sucos), e de origem animal (como leite e derivados e carne e derivados). No caso dos queijos artesanais, sua presença está relacionada à sua origem no leite, plantas e/ou água (Hammes; Vogel, 1995). No caso dos queijos industrializados, as BAL estão presentes em decorrência da utilização de culturas lácticas utilizadas nos processos de fermentação deste alimento e, eventualmente, por cepas termodúricas.

No Brasil, a literatura apresenta alguns trabalhos que foram realizados com objetivo de isolar BAL a partir de produtos de origem animal. Oliveira e Garcia (1986) isolaram e caracterizaram BAL oriundas de leite cru e pasteurizado e de queijos provenientes de pequenos produtores, que não utilizavam fermentos lácticos na sua fabricação. Foram obtidos 400 isolados, sendo que destes, 21 foram identificados como estreptococos mesofílicos, 26 como lactobacilos e 10 como estreptococos termodúricos.

Furtado (1990) isolou BAL de leite e de soro de queijo da região do Serro, Minas Gerais. Trabalhando com o mesmo tipo de queijo, Leite et al. (1997) isolaram 1.244 colônias de microrganismos, das quais 105 foram caracterizadas como Gram positivo e catalase negativo. A maior partes destes (34) foi classificada no gênero Lactococcus, sendo o restante Enterococcus e Streptococcus. Adicionalmente, Alexandre et al. (2002) isolaram 192 cepas de BAL, do mesmo alimento.

Na África, pesquisando queijos regionais da Argélia, Boubekri e Otha (1996) isolaram 54 cepas de BAL, das quais a maioria delas (61,2%) pertenciam ao gênero Enterococcus. O restante foi classificado como: Pediococcus, Lactobacillus, Streptococcus e Leuconostoc.

A maioria das pesquisas de BAL em queijos tem sido

feita na Europa, sendo encontradas e identificadas principalmente bactérias dos gêneros Lactococcus e Lactobacillus.

Potes e Marinho (1998) estudaram a variação microbiana em dez amostras de queijo de Évora, Portugal. Os resultados demostraram haver variações na microbiota de acordo com a época do ano. Entretanto, as BAL sempre foram os microrganismos predominantes.

López-Dias et al. (2000) isolaram aproximadamente 500 cepas de microrganismos aeróbios, mesófílicos e produtores de ácido láctico, a partir de queijo Valderón. Este produto lácteo é um queijo azul artesanal típico, elaborado a partir de leite de cabra, na Espanha. Os gêneros das bactérias predominantes, de acordo com resultados de provas bioquímicas, foram Lactococcus (42,2%) e Enterococcus (40,4%), sendo também encontrados Leuconostoc (5,0%) e Lactobacillus (4,1%). A espécie de BAL dominante foi Lactococcus lactis ssp. lactis (31,1%). Outras espécies isoladas foram Lactococcus raffinolactis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei, Leuconostoc mesenteroides ssp. dextranicum, Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides e Leuonostoc paramesenteroides.

Héberta et al. (2000) estudaram cinco cepas de lactobacilos homofermentativos, isolados de queijos duros, naturalmente fermentados (queijo argentino e queijo Grana italiano). De acordo com testes bioquímicos, fisiológicos e seqüenciamento da região variável do DNA ribossomal 16S, foram identificados Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis e Lactobacillus helveticus.

Fortina et al. (2003) estudaram a população bacteriana natural de queijo Piemontês, na Itália. Foram analisados seis queijos, com 30 a 40 dias de maturação, provenientes de diferentes regiões da área queijeira de Toma, a qual produz artesanalmente queijos que recebem a inscrição de "origem de denominação protegida". Foram isolados 116 cocos e 11 lactobacilos mesofílicos. Utilizando-se análise do espaçador 16S - 23S e seqüenciamento de 16S rDNA, foram identificados os seguintes microrganismos: Lactococcus lactis, Lactococcus garviae, Streptococcus macedonicus, Streptococcus thermophilus e Enterococcus. A incidência de Lactobacillus foi baixa, sendo isolado apenas Lactobacillus paracasei.

Caridi (2003) identificou e caracterizou BAL isoladas de nove queijos Pecorino del Poro, artesanal, elaborado a partir de leite de ovelhas, na Itália. Lactobacillus paracaei ssp. paracasei e Lactobacillus cruvatus foram isolados e identificados.

Gerasi et al. (2003) realizaram um estudo microbiológico do queijo Manura. Este é considerado como queijo duro, sendo elaborado com leite de ovelha na ilha grega de Sifnos. Os isolados foram identificados por intermédio de provas bioquímicas e houve

predominância de BAL na microbiota deste queijo. Isto foi observado durante todo o período de maturação. Leuconostoc mesenteroides ssp. cremoris, Pediococcus pentosaceus e Lactobacillus paracasei ssp. paracasei foram identificados e selecionados como culturas iniciadoras para a produção deste queijo. A maturação do queijo foi significativamente influenciada pela atividade bioquímica resultante do metabolismo de Weissella paramesenteroides, Lactobacillus bifermentans e Lactobacillus brevis.

Manolopoulou et al. (2003) estudaram a microbiota de queijo Feta tradicional, na região de Peloponessa (sul da Grécia). Lactobacillus pentosus e Lactobacillus paraplantarum foram os principais microrganismos isolados durante o período de maturação deste queijo e identificados por testes bioquímicos e morfológicos. Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus e Enterococcus faecium também foram isolados. Microrganismos indesejáveis foram pesquisados, sendo isolados coliformes, incluindo Escherichia coli.

Callon et al (2004) descreveram a diversidade de BAL encontrada em queijo Salers, feito a partir de leite cru. Foram caracterizadas 381 cepas isoladas durante o processo de maturação que foram identificadas usando técnicas fisiológicas e de biologia molecular : amplificação específica por rep-PCR para identificação do gêneros e espécies seguida da análise do seqüenciamento do 16s rDNA para identificação taxonômica e tipificação das amostras isoladas.

Ouadghiri et al (2005) estudaram a diversidade microbiana encontrada em queijo macios produzidos em oito diferentes regiões do Marrocos. Um total 164 amostras de BAL foram isoladas, purificadas e identificadas através da caracterização de proteínas celulares e do padrão genômico obtido por rep-PCR. As maiorias das amostras pertenciam aos gêneros Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc and Enterococcus.

BAL de queijo Pecorino fabricado na região central da Itália foram identificadas e tipificadas para sua utilização como culturas iniciadoras ou adjuvantes na fabricação de queijos artesanais, em um estudo realizado por Aquilanti etal (2007). A caracterização preliminar realizada por provas bioquímicas e morfológicas revelou 112 amostras Gram-positivo e catalase negativo. A identificação das amostras foi obtida através da análise de restrição do gene 16s rRNA amplificado e do seqüenciamento de amplicons de 360-380 pares de base.

Veljovic et al (2007) caracterizaram e identificaram BAL isoladas durante o processo de maturação de queijo Zlatar para seleção de amostras com boas características tecnológicas. A caracterização das amostras isoladas foi realizada através de provas morfológicas, fisiologicas e bioquimicas assim como pela determinação da atividade proteolítica. A identificação das amostras foi feita através da

amplificação do DNA por rep-PCR e da análise do seqüenciamento do 16s rDNA. As principais espécies encontradas foram Lactobacillus paracasei subsp. paracasei, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis, Lactococcus lactis subsp. lactis, Enterococcus faecium e Enterococcus faecalis.

Kongo et al (2007) identificaram por métodos fenotípicos e genotípicos as espécies de BAL dominantes presente no queijo São Jorge, um queijo típico português. Os resultados indicaram que Lactobacillus seguidos pelos Enterococus foram os gêneros dominantes. As species mais frequentes foram Lactobacillus paracasei, Lactobacillus rhamnosus, Enterococcus faecalis e Enterococcus faecium.

Doci et al (2008) avaliaram a dinâmica da microbiota dominante durante o processo de fabricação e maturação do queijo Castelmagno (Denominação Protegida na Origem). Foram analisadas amostras de leite, da massa e do queijo em diferentes estágios de fabricação. A identificação das espécies foi feita através da análise de PCR-DGGE da região V1 do 16S rRNA. Lactococcus lactis subsp lactis foi a espécie mais frequentemente encontrada durante o processo de fabricação, enquanto Lactobacillus plantarum e Lactobacillus paracasei foram isolados com maior freqüência nos queijos maturados.

2.3.2. Efeitos antimicrobianos de Bactérias Ácido-Lácticas.

Muitos estudos têm demonstrado que as BAL exercem efeitos antimicrobianos e atividade antagonista contra patógenos intestinais e transmissíveis pelo alimento. As BAL são capazes de previnir a aderência, o estabelecimento, a replicação e/ou a ação patogênica de microrganismos específicos (Saavedra, 1995).

O efeito antimicrobiano das BAL pode ser atribuído a vários fatores. Entre esses fatores podem-se citar: (1) A produção de ácido lático e ácidos voláteis decorrentes da fermentação e o acúmulo de ácidos orgânicos. O ácido lático é obtido como produto final do metabolismo de carboidratos, gerados do piruvato pela ácido lático desidrogenase. O acúmulo de ácido lático e a conseqüente queda do pH do meio resulta na inibição da atividade de bactérias Gram-positivo e Gram-negativo; (2) A produção de peróxido de hidrogênio produzidos pelos lactobacilos, na presença de oxigênio, através do transporte enzimático de elétrons. Na presença do peróxido de hidrogênio, ânions superóxido formam um radical hidróxido destrutivo. Este processo pode levar a peroxidação das membranas lipídicas, e aumentar a permeabilidade da membrana. O efeito bactericida resultante desse metabolismo do oxigênio tem sido atribuído ao seu forte poder de oxidação nas células bacterianas, bem como a destruição de ácidos nucléicos e proteínas celulares; (3) A produção de dióxido de carbono. O dióxido de carbono é o principal produto final da fermentação de hexoses e seu papel é criar um ambiente anaeróbio pela substituição às

moléculas de oxigênio do meio, diminuir o pH intra e extracelular. Seus efeitos destrutivos sob a membrana celular tornam o dióxido de carbono um potente sistema inibitório contra um vasto numero de microorganismos; (4) A produção de diacetil e acetaldeído. O diacetil é o produto final do metabolismo do piruvato pelas bactérias láticas fermentadoras de citratos. O diacetil é mais eficiente contra bactérias Gram-negativo, mofos e leveduras do que contra microorganismos Gram-positivo. O diacetil interfere na utilização de arginina por reagir com a proteína ligadora de arginina das bactérias Gram-negativo. O acetaldeido é formado durante o metabolismo de carboidratos e é reduzido a etanol pela reoxidaçao de nucleotídeos, catalisados por um álcool desidrogenase NAD dependente, e seu efeito antimicrobiano tem sido relatado contra &. coli, Salmonella typhimurium e S. Aureus; (5) A produção de substâncias antimicrobianas, e proteínas bactericidas, chamadas bacteriocinas. As bacteriocinas variam quanto à atividade, modo de ação, peso molecular, origem genética e propriedades bioquímicas, e podem ser produzidas espontaneamente ou induzidas (Naidu et al 1999).

A determinante genética da maioria das bacteriocinas está localizada nos plasmídios, com poucas exceções, nas quais a codificação esta no cromossomo. Estes agentes antimicrobianos são espécie-especificos e exercem sua atividade letal através da adsorção de receptores específicos localizados sob a superfície externa de bactérias sensíveis, seguidos por alterações metabólicas, biológicas e morfológicas, que resulta na morte de tais bactérias (Naidu et al 1999). As bacteriocinas foram inicialmente descobertas em Escherichia coli, quando foram denominadas colicinas e, posteriormente, em bactérias Gram positivo (Tagg et al., 1976). Muito do que se sabe sobre as bacteriocinas foi baseado em estudos feitos sobre as colicinas (Jack et al., 1995).

A ação antagonista de espécies de BAL contra microrganismos indesejáveis em alimentos tem sido descrita em vários relatos científicos. Estes trabalhos demonstram uma importante perspectiva tecnológica de utilização destes microrganismos para a preservação de alimentos, bem como controle de patógenos.

A inibição de Listeria monocytogenes por Lactobacillus bavaricus MN em produtos cárneos sob refrigeração foi demostrada por Winkowski et al. (1993). A habilidade do Lactobacillus bavaricus, isolado de carne, para inibir o crescimento de três cepas de Listeria monocytogenes foi examinada em três sistemas: carne em cubos, carne em cubos no molho e carne em cubos no molho com adição de glicose. O patógeno foi inibido pelo Lactobacillus bavaricus MN, sendo que a 4ºC foi inibido ou morto, dependendo do nível inicial do inoculo de Lactobacillus bavaricus. A 10ºC houve uma redução de pelo menos 10 vezes da ocorrência do patógeno, exceto na carne sem molho. Foi detectada bacteriocina nas amostras e a inibição não pôde ser atribuída a acidificação. Baixas temperaturas de

refrigeração acentuaram significativamente a inibição da Listeria monocytogenes.

Vaughan et al. (1994) avaliaram o efeito inibitório de BAL isoladas de alimentos de origem animal e de vegetais. Os microrganismos isolados de queijo elaborado com leite cru e de carnes não processadas apresentaram os mais potentes efeitos contra Staphylococcus aureus (PRMM1), Listeria innocua (BL86/26) e Pseudomonas fragi (NCIMB 8987), isolado de manteiga estocada sob refrigeração.

O antagonismo de Lactobacillus e outras BAL frente a Staphylococcus aureus e Escherichia coli foi avaliado por Fang et al. (1998). Todas os microrganismos acidificantes foram repressivos contra Staphylococcus aureus e Escherichia coli no ágar. Contudo, a sua atividade supressiva foi reduzida significativamente quando o meio ágar foi tamponado a pH 7,2. No leite normal, cepas A e B de Lactobacillus acidophilus, Streptococcus thermophilus e suas combinações com Lactobacillus acidophilus A e Lactobacillus bulgaricus 6032 foram inibitórias para Staphylococcus aureus, enquanto em leite de vacas com mamite, apenas o Streptococcus thermophilus e suas combinações mostraram inibição. Lactobacillus acidophilus A e Lactobacillus bulgaricus 34104 foram repressivos ao crescimento de Escherichia coli em leite. Streptococcus thermophilus e suas combinações foram inibitórias para Escherichia coli em leite de vacas com mamite ou não. Esses resultados indicaram que a atividade antagonista das BAL sobre bactérias patogênicas variou com o tipo de meio nos quais os testes foram realizados, e que o teste de antagonismo in vitro no leite seria mais informativo do que em meios de cultura.

Um efeito inibitório bastante interessante foi demostrado por Brashears; Durre (1999) ao verificarem que Lactobacillus lactis apresentava efeito antagonista frente Salmonella spp. e Escherichia coli O157:H7, durante o armazenamento de produtos lácteos sob refrigeração. Em todos os experimentos a 37ºC, o Lactococcus lactis inibiu os patógenos, produzindo números não detectáveis após 24h de incubação. Houve aumentos significativos (P > 0,05) nos números de patógenos nas amostras controle, que não continham Lactococcus lactis. Observou-se um aumento significativo do declínio no pH das amostras inoculadas com Lactococcus lactis. O número de Salmonella spp. incubadas a 6ºC não declinou significativamente quando comparado com aquele das amostras controle ou inoculadas, o que sugeriu que esta cepa de Lactococcus lactis não inibe Salmonella spp. sob temperaturas de refrigeração. Adicionalmente, não existiram mudanças significantivas no pH ou nos números de Lactococcus lactis durante a refrigeração.

Uraz et al. (2001) verificaram efeitos inibitórios de Lactobacillus casei e Lactobacillus helveticus contra espécies de Bacillus isolados de leite cru em diversas concentrações de sal.

Yoon e Won (2002) estudaram a atividade antagonista

de 30 cepas de lactobacilos contra Helicobacter pylori. Lactobacillus helveticus CU631 foi selecionado como a cepa que apresentou melhor efeito inibitório. Lactobacillus plantarum e Lactobacillus fermentum também apresentaram atividade antagonista frente Helicobacter pylori (G88016), porém, menos intensa.

Caridi (2003) verificou importante e potente efeito antagonista de Lactobacillus paracasei ssp. paracasei e Lactobacillus curvatus, isolados de queijo Pecorino artesanal, frente à Escherichia coli.

Fayol-Messaoudi et al (2005) observaram que amostras de Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus casei, L. casei 001, and L. rhamnosus induciram uma forte redução na viabilidade Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344 devido principalmente a uma substância tipo bacteriocina responsável pela atividade bactericida.

Alvarado et al (2006) avaliaram a atividade antagonista de 94 isolados de BAL a paritr de produtos fermentados artesanais do México. 25 amostras de BAL demonstraram capacidade inibitória frente a pelo menos 1 microrganismo indicador (& coli EPEC, S aureus, L monocytogenes, & faecium). A maioria da atividade inibitória das BAL foi atribuída a redução do pH pelos ácidos orgânicos.

O efeito de BAL sobre o crescimento de &. coli O157:H7, Salmonella sorotipo Typhimurium, Staphylococcus aureus, Listeria innocua, Enterococcus faecium e Enterococcus faecalis foi avaliado por 48 horas a 37 °C. Na presença de BAL foi observado um aumento do tempo de geração de todas as bactérias Gram-positivo avaliadas. S aureus foi a amostra mais sensível, aumentando seu tempo de geração em 210%. Entretanto para bactérias Gram-negativo, nenhuma inibição ocorreu após 8 horas de fermentação. A fração sobrenadante do leite fermentado por L acidophilus e L casei foi recuperada e sua atividade antimicrobiana foi testada. A cepas mais sensiveis foram L innocua e S aureus. Após a neutralização do sobrenadante para eliminar a possivel ação de acidos organicos as cepas mais sensiveis foram L innocua e & coli O157:H7. Finalmente o sobrenadante foi neutralizado e irradiado para eliminar a ação dos acidos organicos e substancias tipo bacteriocinas. Enterococcus faecalis, & coli O157:H7 e S aureus foram as amostras mais afetadas. Os resultados obtidos nesse estudo demonstram que a ação antimicrobiana pode ser devida aos acidos organicos e substancias tipo bacteriocinas (Millet, Luquet e Lacroix, 2007).

No Brasil, algumas pesquisas também foram conduzidas com o objetivo de avaliar atividade antagonista de BAL isoladas de produtos de origem animal, frente à diferentes microrganismos indicadores.

De seis amostras de pernil desossado curado e três amostras de salame tipo italiano artesanal foram isoladas 288 cepas de bactérias lácticas. Pelo teste de inibição direta59 delas foram capazes de inibir in vitro o

desenvolvimento de cepas de Listeriamonocytogenes e de Staphylococcus aureus, o que demonstra que produzem compostos inibitórios (Dabés; Santos; Pereira, 2000).

Amostras de bactérias lácticas recuperadas de 336 colônias isoladas e selecionadas foram submetidas ao teste de atividade antimicrobiana direta, que identificou as produtoras de substâncias antimicrobianas capazes de inibir in vitro o desenvolvimento de duas cepas indicadoras de Listeria monocytogenes. As 108 cepas que inibiram diretamente pelo menos uma das cepas indicadoras receberam a denominação DTEI e foram selecionadas para o teste de atividade antimicrobiana indireta contra as mesmas cepas de L. monocytogenes, assim como frente a outras cepas de bactérias lácticas de origens diversas. Essa atividade inibidora indireta foi avaliada por meio de sobrenadantes isentos de células, esterilizados por meio de microfiltração, eliminando-se os principais compostos responsáveis por ela, como por exemplo, os ácidos orgânicos e o peróxido de hidrogênio, mediante o ajuste do pH e a liofilização dos sobrenadantes. Oito cepas de bactérias lácticas apresentaram atividade antimicrobiana indireta frente a pelo menos um dos microrganismos indicadores utilizados, sugerindo terem produzido substâncias semelhantes a bacteriocinas. Três destas cepas foram caracterizadas e identificadas como pertencentes ao gênero Lactobacillus sp (Prado et al, 2000).Alexandre et al. (2002) verificaram atividade antagonista de BAL, isoladas de queijo artesanal, frente Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Salmonella enteritidis var. Typhimurium, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes e Listeria innocua. Entretanto, nenhum dos isolados foi capaz de inibir Escherichia coli.

Garcia et al (2006) avaliaram a actividade inibitória "in vitro" de nove isolados de Lactobacillus acidophilus és da produção de bacteriocinas, ácidos orgânicos ou de peróxido de hidrogénio sobre bactérias patogénicas, tais como: Escherichia coli, Salmonella enterica. Enterica. Enteritidis e Clostridium perfringens. Para o teste de inibição foi utilizado o método de dupla camada para seleccionar os isolados com capacidade inibitória e efectuar posteriormente os testes de antagonismo "spot-on-the-lawn", exclusão de bacteriófagos líticos e sensibilidade da substância antagonística a proteases, visando caracterizar o tipo de efeito inibitório. No teste de inibição observaram-se halos variando entre 0 a 15 mm, sendo em sua maioria, classificadas como inibições fortes, apresentando halos de 10 mm de diâmetro ou superiores, excepto para o isolado C13 frente a S. Enteritidis a qual não foi capaz de inibir. Os isolados C1 e C2 apresentaram efeito inibitório sobre &. coli e C. perfringens, da mesma forma que os isolados C13 e C14 apresentaram efeito inibitório somente sobre C. Perfringens, caracterizando a provável produção de bacteriocinas. Observou-se também que as bacteriocinas produzidas por quatro isolados de L. acidophilus mostraram-se sensíveis à protease utilizada, permitindo o crescimento das culturas indicadoras. Os halos de inibição permaneceram inalterados nos testes controles

preparados com água destilada. Demonstrou-se que a inibição não ocorreu pela presença de bacteriófagos líticos em nenhum dos isolados de L. acidophilus avaliados.

Chioda et al (2007) realizaram-se ensaios “in vitro” para avaliar o grau de atividade antagonista de cinco cepas de Lactobacillus acidophilus, com capacidade probiótica sobre Escherichia coli BIA 26 (STEC) isolada de queijo "Minas Frescal". Para tanto, foi utilizado o teste de inibição através do método de dupla camada em triplicata para avaliar zonas de inibição de crescimento. Todas as cepas de Lactobacillus mostraram-se capazes de inibir &. coli com zonas de inibição variando de 12 a 15mm de diâmetro, sendo que a maioria apresentou 14mm de diâmetro, consideradas como fortes halos de inibição.

A atividade antimicrobiana de uma cultura probiótica comercial, o Lactobacillus acidophilus La5, frente ao crescimento de dois microrganismos patogênicos veiculados por alimentos, Escherichia coli e Staphylococcus aureus, foi avaliada. O antagonismo da cultura probiótica in vitro foi avaliado utilizando tanto a Metodologia de Multicamadas quanto a de Difusão em Ágar. Os resultados demonstraram que a substância inibidora presente no sobrenadante é extracelular e difusível. O período de incubação da bactéria lática em caldo MRS, a 37ºC em condições de aerobiose, onde se obteve a maior produção de ácido lático (1,08 g/%) foi 72 horas, o qual demonstrou o menor valor de pH do sobrenadante (3,90), e os melhores resultados de inibição pelo método de difusão em ágar, com halos de inibição de 14,75mm e 15,0mm de diâmetro para &. coli e S. aureus, respectivamente. O composto inibidor não foi sensível à ação de enzimas proteolíticas e ao congelamento, mas foi totalmente inativado quando o sobrenadante foi neutralizado com solução de NaOH 1N. Os resultados obtidos sugerem que atividade inibidora observada foi decorrente da concentração de ácido lático e do baixo pH do meio de cultivo do microrganismo probiótico (Pereira e Goméz, 2007).

2.3.3. O gênero Lactobacillus sp

Os lactobacilos foram isolados pela primeira vez por Moro em 1900, a partir das fezes de lactentes amamentados ao peito materno; este pesquisador atribuiulhes o nome de Bacillus acidophilus, designação genérica dos lactobacilos intestinais. São largamente utilizados na preparação de uma variedade de alimentos como culturas “starter” em queijos e outros laticínios (Bottazzi 1988). O gênero contém o maior número de espécies de bactérias ácido lácticas; é também o mais heterogêneo compreendendo espécies com uma grande variedade de propriedades bioquímicas e fisiológicas. A heterogeneidade se reflete pela extensão do teor de mol% de Guanina mais Citosina das espécies incluídas no gênero que é de 32-53%.

O gênero Lactobacillus apresenta morfologia variada. Em 1919, Orla-Jensen definiu três grupos de

Lactobacillus que consideraram importantes, de acordo com a morfologia. Posteriormente, estudos baseados em microscopia eletrônica têm permitido uma classificação mais apropriada destes microrganismos (Bottazzi, 1988).

As espécies de bactérias compreendidas pelo gênero Lactobacillus possuem características morfológicas, metabólicas e fisiológicas em comum. Elas são bastonetes Gram-positivo, catalase negativa, não móveis, não formadoras de esporos, sem citocromo, anaeróbias facultativas, aerotolerantes, nutricionalmente exigentes, tolerantes à acidez, com metabolismo estritamente fermentativo, sendo o ácido láctico o principal produto do seu metabolismo de carboidratos (Robinson, 1991; Jay, 1996).

A diferenciação entre as espécies de Lactobacillus tem sido feita baseando-se na determinação dos tipos de peptideoglicanos dos componentes celulares, na mobilidade eletroforética de algumas enzimas, análises imunológicas de enzimas homólogas a lactato desidrogenase, definição de grupos antigênicos, determinação de isômeros de ácido láctico obtidos, fermentação de carboidratos e análise molecular de seu genoma (Botazzi, 1998; Tannock, 2003).

Em relação ao metabolismo, podem ser classificados como (1) homofermentativos obrigatórios: convertem hexoses em ácido láctico via Embden-Meyerhof Parnas, sendo incapazes de utilizar as pentoses; (2) heterofermentativos facultativos: fermentam hexoses em ácido láctico, e no caso de algumas espécies e sob certas circunstâncias, em ácidos láctico, acético e fórmico e etanol; sendo capazes de fermentar pentoses em ácidos láctico e acético; (3) heterofermentativos obrigatórios: utilizam hexoses para obter ácidos láctico e acético, etanol e dióxido de carbono; e pentoses para obter ácidos láctico e acético (Jay, 1996; Salminem, 1999).

Os lactobacilos são naturalmente encontrados em habitats ricos, como vegetais, grãos e na microbiota do TGI, trato respiratório superior e urogenital inferior de espécies animais diferentes (Klender e Weiss, 1986; Salminem, 1998). Também são parte da microbiota de muitos alimentos fermentados, como queijo, iogurte, kefir, salame, polvilho, azeitonas, pickles, molhos ácidos, etc (Jay, 1996).

2.3.3.1. Efeitos probióticos e terapeuticos de Lactobacillus sp.

Atualmente, existem várias possibilidades de utilização terapêutica de Lactobacillus, e comprovação de seus efeitos benéficos como reposição de microbiota intestinal desejável após longa exposição a uma antibioticoterapia, auxilio na digestão e no tratamento de doenças imunossupressoras (Donnet-Hughes, 1999), atuação contra Helycobacter pylori no tratamento de úlceras gástricas em humanos (Michetti, et al., 1999), redução dos níveis plasmáticos de colesterol e da ocorrência de doenças cardíacas coronarianas,

biodegradação de nitrosaminas carcinogênicas no intestino e auxílio ao tratamento de câncer de intestino (Robinson, 1991), redução da ocorrência de infecções do trato urinário inferior (Hilton et al., 1992), aumento da absorção de lactose em pessoas intolerantes (Mustapha et al., 1997), tratamento de infecções e diarréias causadas por leveduras (Rani e Khetarpaul, 1998), imunomodulação em pessoas com deficiência do sistema imunológico (Donnet-Hughes, 1999) e possível auxílio ao tratamento de AIDS (Tihole, 1988).

Para que um Lactobacillus spp exerça o seu efeito benéfico desejado em humanos, além de permanecer viável durante sua passagem pelo sistema gastrointestinal, o seu nível populacional deve ser igual ou maior do que 10 milhões de células por grama de conteúdo fecal. Para isso, deve ser ingerido diariamente, para manter seus níveis artificialmente elevados no ecossistema digestivo. À exceção dos Lactobacillus rhamnosus GG e Lcr35, não se conhecem probióticos capazes de persistirem por um longo período no trato digestivo do adulto (Alander et al., 1999; De Champs et al., 2003). Entretanto vários estudos vêm demonstrando os potenciais efeitos benéficos desses microrganismos. As propriedades de adesão e colonização de três linhagens probióticas (Lactobacillus rhamosus DR20, Lactobacillus. Acidophilus HN017, e Bifidobacterium lactis DR10) foram determinadas in vitro usando células diferenciadas de intestino humano (HT-29, Caco-2, HT29-MTX) e comparadas com as propriedades L. Acidophilus LA-1 e L. Rhamanosus GG, duas linhagens probióticas comerciais. Todas as três linhagens mostraram forte adesão com as células intestinais humanas in vitro. Os índices de adesão do L. Acidophilus LA-1 e L. Rhamnosus GG foram comparáveis ao das outras três linhagens probióticas. Também foi investigado o efeito inibitório na aderência das linhagens contra monocamada de células intestinais colonizadas por uma cepa enterohemorrágica conhecida de &. Coli (linhagem O157:H7). O pré-tratamento da &. Coli O157:H7 com um sobrenadante de células livres concentrado duas vezes e meia, de L. Acidophilus HN017, L. Rhamnosus DR20, e B. Lactis DR10 reduziu numero de &. Coli cultiváveis em placas TSB e também reduziu a invasividade e a associação celular característica dessa linhagem tóxica. As moléculas inibitórias secretadas dentro do meio utilizado por estas linhagens foram parcialmente afetadas pelos tratamentos com lactato desidrogenase, tripsina e proteinase K sugerindo que a inibição total pode se dever à ação sinérgica do ácido lático e substâncias proteinaceas (GopaL et al., 2001).

Interações entre linhagens probióticas de Lactobacillus foram investigadas in vitro. Os resultados mostraram que a presença de Lactobacillus casei NY1301, aumenta significativamente a adesão de Lactobacillus gasseriNY0509 à cultura de células Caco-2 de intestino humano. Em contraste o L. gasseriNY0509 não afeta a adesão de L. caseiNY1301 (Azuma e Sato, 2001).

Um modelo de mucosa intestinal humana foi usado para comparar as propriedades de adesão de quatro linhagens

de Lactobacillus potencialmente probióticas (L. brevi, L. reuteri, L. rhamnosus &-800 e L. rhamnosus) com uma linhagem probiótica extensamente investigada de L. rhamnosus variedade GG. Também foi investigada a influência sobre a adesão das cinco linhagens ao modelo de mucosa em presença de ácido e de pepsina (para simular o ambiente estomacal) e para diferentes leites (desnatado, 1,5% de gordura e 1,6 – 1,9% de gordura, para simular as condições de processamento e crescimento sobre os diferentes meios). Os efeitos inibitórios das linhagens contra Salmonela typhimuriume &. coliforam investigados. Os resultados mostraram que L. brevisPEL1 e L. rhamnosusLC-705 exibiram intermediaria e fraca adesão, respectivamente, ao modelo de mucosa, enquanto as três linhagens restantes mostraram significantes propriedades de adesão. Com exceção do L. rhamnosus , todas as linhagens tiveram redução na adesão depois de expostas ao ácido, pepsina e leite. Nenhuma das linhagens testadas resultou em uma exclusão competitiva de S. Typhimuriume &. coli. Os resultados sugerem que o meio de crescimento e a fonte da alimentação afetam significativamente a adesão das linhagens (Ouwehand et al., 2001).Mukai et al. (2002) examinaram a competição de ligação do Lactobacillus reuterie Helicobacter pyloripela gangliotetrasilceramida (asialo–GM1) e sulfatide, os quais são supostamente moléculas glicolípides receptoras de H. pylori, e identificaram uma possível proteína de ligação com o sulfatide em linhagens de L. reuteri.Entre nove linhagens de L. reuteri, duas (JCM1081 e TM105) mostraram ter ligação para a asilo-GM1 e sulfatide, e para inibir a ligação do H. pyloripara ambos glicolípides. O extrato de células bacteriano de linhagens TM105 tratadas com diversos detergentes reteve a ligação para ambos glicolípides e também inibiu a ligação com o H. pylori, indicando que a inibição da ligação está associada à superfície celular. Essas observações sugeriram que a inibição pelas linhagens selecionadas de L. reuteripodem ajudar na prevenção de infecções num estágio inicial de colonização do H. pylorie propôs que linhagens de L. reuteri, que partilham glicolipides específicos com o H. pylorisejam utilizadas como probióticos.

Estudos em crianças têm mostrado que Lactobacillus administrados oralmente podem ter propriedades antidiarréicas. O ponto central das estimativas, realizadas por Niel et al. (2002), indicaram uma redução na duração da diarréia de 0,7 dia (95% de intervalo de confiança: 0,3 – 1,2 dia) e redução na freqüência de diarréia no segundo dia de tratamento (95% de intervalo de confiança: 0,7 – 2,6 menos fezes) nos participantes que receberam lactobacilos comparados com os que receberam placebo. O trabalho concluiu que lactobacilos são seguros e efetivos no tratamento de crianças com infecções agudas com diarréia.

Em estudo feito por Chandra (2002), 112 neonatos saudáveis de vilas da Nova Índia foram aleatoriamente distribuídos para receber placebo ou 100 milhões de Lactobacillus sporogenes diariamente por 12 meses,

com levantamentos semanais de morbidade. Infecções por Rotavirus causaram diarréia em 84% dos neonatos. O grupo que recebeu lactobacilos sofreu menos de diarréia do que o grupo placebo, os episódios de diarréia foram mais curtos, e eles adoeceram menos no período de 12 meses. O estudo mostrou que a suplementação de crianças com L. sporogenescomo uma base profilática tem um impacto significativo de prevenção na incidência e duração da diarréia.

Estudo, realizado com pacientes voluntários no Gamelli Hospital (Hospital Escola da Universidade Católica de Roma), mostra que a administração de Lactobaciluss teve um impacto positivo sobre o os efeitos colaterais relacionados ao tratamento contra Helicobacter pylori. Houve diminuição da diarréia, náuseas e distúrbios de paladar (95%, 95% e 98% de intervalo de confiança respectivamente), melhorando a tolerância ao tratamento por parte dos pacientes (Armuzzi et al., 2001).

A administração de Lactobacillus associado a Bifidobacterium e Enterococcus melhorou os sintomas da Sindrome do Intestino Irritavel em 85 pacientes estudados. Essa melhora pode ser associada as alterações benéficas da microbiota gastrintestinal (Fan et al, 2006)

O consumo regular de uma bebida probiótica contendo L. casei, L. bulgaricus e S. tthermophilus foi capaz de reduzir a incidência de diarreia associada a antibioticoterapia e diarreia causada por C difficile, alem de demonstrar o potencial de reducir a morbidade, os custos com internações e a mortalidade em pacientes com mais de 50 anos (Hickson et al 2007).

Cleusix et al (2007) estudaram a atividade da reuterina, uma substância antibacteriana producida pelo L reuteri frente a um grupo representativo de bacterias intestinais. Os resultados mostraram que a maioria das bactérias intestinais testadas forma sensíveis a ação inibitória da reuterina.

2.3.4. Métodos de isolamento e identificação de BAL

Apesar dos vários benefícios à saúde das BAL serem reconhecidos mundialmente (Bottazzi et al., 1985; Nakazawa e Hosono 1992; Wood 1992; Roissart e Luquet 1994; Cogan e Accolas 1996; Bottazzi 1997; Mustapha et al., 1997; Kailasapathy e Rybka 1997) e níveis desses micorganismos serem sugeridos nos produtos fermentados do leite por vários autores (Arroyo et al., 1994; Medina et al., 1995; Shah et al., 1995; Rybka e Kailasapathy, 1995), existem poucas recomendações metodológicas para a acurada enumeração desses microrganismos, dessa forma dificultam o controle de qualidade (Rybka e Kailasapathy, 1996) e não permitem o estabelecimento de níveis oficiais, ou metodologias oficiais para a enumeração destes microrganismos nos produtos

fermentados.

Monitorar o número de células viáveis de BAL probióticas nos alimentos em que os mesmos são incorporados é um parâmetro fundamental para assegurar a qualidade do produto que é comercializado com apelo terapêutico, entretanto, muitas vezes essa necessidade tem sido negligenciada em função da falta de padronização de métodos.

Para detectar BAL em produtos lácteos, diversos métodos podem ser empregados, tais como contagem em placa, técnicas moleculares (baseados em DNA ou rRNA), fluorescentes ou imunológicas, bem como os métodos enzimáticos (Hartemink et al., 1996; Scardovi 1986). Tanto para controle de qualidade de produtos lácteos como para grande maioria dos estudos da microbiota fecal, o método de contagem em placa ainda é o mais utilizado, portanto, o meio de cultura utilizado deve promover o crescimento seletivo da bactéria em estudo, enquanto outros microrganismos devem ser suprimidos. A enumeração diferencial de bactérias probióticas é difícil devido a presença de microrganismos similares nos produtos. Como regra no entanto, para se determinar a viabilidade e sobrevivência das bactérias probióticas, é muito importante a existência de trabalhos direcionados a métodos para a enumeração seletiva destas bactérias (Tharmaraj e Shah, 2003).

Para se isolar Lactobacillus sp que são organismos extremamente fastidiosos e adaptados a complexos substratos orgânicos, que requerem não somente carboidratos como fonte de energia e fonte de carbono, mas também nucleotídeos, aminoácidos e vitaminas, os meios de cultura devem possuir pH ácido e a carne deve ser um nutriente essencial quando o meio contém carboidratos fermentáveis, peptona, extrato de levedura e extrato de carne. A suplementação dos meios com suco de tomate, manganês, acetato e ésteres de ácido oléico, especialmente Tween 80 é estimulante ou até essencial para muitas espécies. Estes compostos estão incluídos no meio extensamente utilizado para crescimento e isolamento, formulado por Man, Rogosa e Sharp (1960), o meio MRS, sendo também utilizados nas formulações dos meios APT (Evans e Niven 1951) considerado similar ao MRS, o HHD e LA utilizados neste projeto.

De acordo com Rasic (1990), o ágar LA (Modified Bifidus Blood Agar), foi desenvolvido principalmente para a enumeração de B. bifidum e L. acidophilus em cultura starter e produtos fermentados. O ágar HHD (Homofermentative Heterofermentative Differential Medium) foi desenvolvido para a enumeração diferencial de bactérias ácido láctica hetero e homofermentativas (Lapierre 1990; McDonald et al., 1987). Embora muitas culturas de Lactobacillus sp usadas em laticínios possam ser cultivadas em microaerofilia, ou em condições aeróbicas, os isolados intestinais proliferam-se melhor em condições anaeróbias. A confirmação dos isolados pertencentes ao gênero podem ser feitos por teste de ausência de

atividade da catalase e presença de ácido lático como maior ácido produzido pela fermentação da glicose. Os ácidos acético, succínico e fórmico podem ser detectados em menores quantidades em algumas espécies (Kandler e Weiss 1986). A determinação dos isolados de lactobacilos nas categorias homo e heterofermentativos (por simples observação, por medida de tubo de Durham ou gás produzido à partir da glicose) são usuais testes fenotípicos.

Vários meios têm sido avaliados por diferentes pesquisadores para a enumeração de Bifidobacterium, Lactobacillus e Streptococcus tanto em culturas puras quanto em culturas mistas nos produtos lácteos (Ongoo e Fleet 1993; Dave e Shah 1996; Stefano et al., 2000), contudo, é crescente o consenso de que alguns meios que contêm bile e antibióticos podem também restringir o crescimento destas culturas, o que torna a contagem total obtida nestas condições, nem sempre representativa do número verdadeiro de células viáveis presentes no produto (Dave e Shah 1996).

Muitos meios seletivos para a enumeração de L. acidophilus e Bifidobacterium sp. tem sido propostos (Hunger 1986; Hull e Roberts 1984; Laroia e Martin 1991b; Dave e Shah 1996; Lankaputhra e Shah 1996; WIjsman et al., 1989; Shah 1997a, 2000). Similarmente, muitos meios são propostos para a enumeração seletiva de culturas do iogurte (Onggo e Fleet 1993; Samona e Robinson 1994), no entanto poucos trabalhos descrevem a enumeração seletiva de L. casei na presença de outras bactérias probióticas e bactérias do iogurte (Champagne et al., 1997; Ravula e Shah 1998). Vinderola e Reinheimer (1999), citam que muitos meios para a enumeração de L. acidophilus e Bifidobacterium sp., tanto em cultura pura quanto em produtos comerciais não fornecem bons resultados quando se deseja uma enumeração seletiva ou diferencial de L. acidophilus e B. bifidum na presença de S. thermophilus e L. delbruekii subsp. bulgaricus (Dave; Shah, 1996).

Segundo Lim et al. 1995, é importante que os meios propostos para a enumeração (diferencial ou seletiva) dos microrganismos não sejam complexos ou requeiram muito tempo para o preparo, e que ofereçam uma boa recuperação celular dos microrganismos, neste sentido, muitos meios não atendem este requisito de acordo com Lankaputhra e Shah 1996 devido a falta de recuperação de uma ou mais espécies, ou por falta de seletividade (Lim et al., 1995; Pacher e Kneifel, 1996), ou diferenciação entre colônias (Kneifel e Pacher, 1993; Ghoddusi e Robinson 1996; Nighswonger et al., 1996). A grande demanda de trabalho, tempo e material existente nos procedimentos convencionais para a seleção e triagem de microrganismos, dificulta a manipulação de grandes volumes de isolados. Sob esta ótica, ao longo das últimas décadas, um novo enfoque vem contínua e crescentemente orientando os procedimentos de rotina em laboratórios de microbiologia no intuito de simplificá-los com técnicas mais rápidas, práticas e automatizadas.

As características fenotípicas mais utilizadas na

identificação de lactobacilos são: forma, coloração de Gram, arranjo, motilidade, catalase, temperatura máxima e mínima de crescimento e fermentação de carboidratos (33 diferentes tipos) (Kandler e Weiss 1986). Algumas espécies são estreitamente relacionadas e só podem ser distinguidas pelo perfil eletroforético de proteínas (lactato desidrogenase e/ou proteínas totais) ou por métodos moleculares. Vários métodos tem sido usados para a identificação de lactobacilos, incluindo-se a fermentação de carboidratos pelo sistema API 50 CHL, no entanto, Schillinger (1999), em estudo de isolamento e identificação de lactobacilos de novos produtos probióticos e iogurtes (mild), o padrão de fermentação de açúcares não permitiu a diferenciação entre L. acidophilus de espécies fenotipicamente muito similares como o L. johnsonii, L. crispatus, L. gasseri, L. amylovorus e L. gallinarum. Em seu estudo, oito culturas capazes de crescer a 15ºC e produzir isômeros do ácido láctico DL ou L-enantiomeros foram identificadas como membros do grupo L. casei, que compreende as espécies L. paracasei, L. casei e L. rhamnosus. Um outro aspecto ressaltado foi que algumas culturas designadas como L. acidophilus, no entanto, foram encontradas sendo das espécies L. johnsonii ou L. crispatus.

Tannock et al. (1999), identificando lactobacilos de diferentes origens, mencionam que os métodos fenotípicos de identificação são difíceis porque requerem, em muitos casos, determinação das propriedades da bactéria além dos testes comuns de fermentação (por exemplo, análise da parede celular e mobilidade eletroforética da lactato desidrogenase) (Kandler e Weiss, 1986). Em geral, em torno de 17 testes fenotípicos são requeridos para a identificação de isolados de lactobacilos acuradamente em nível de espécie (Hammes e Vogel, 1995). A necessidades de métodos simples e rápidos de identificação são, portanto requeridos quando grande número de culturas obtidas durante os estudos de ecologia microbiana do trato intestinal, silage e produtos alimentares são requeridos.

Reque et al. (2000), estudando Lactobacillus fermentum para uso como probióticos em frangos, utilizou para a seleção das culturas além de aspectos de biossegurança, a bacterioscopia (morfologia por microscopia), o teste de Gram, iabilidade durante a estocagem a 4ºC e atividade antimicrobiana (Giraud et al., 1991; Reque 1999). A identificação das culturas foi baseada nas características dos lactobacilos como descrito no Bergey’s Manual of Determinate Bacteriology (Buchanan e Gibbsons 1974) e fermentação de diferentes fontes de carbono pelo API 50 CHL. Em publicação com seleção de culturas de Lactobacillus potencialmente probióticos Chang et al (2001), utilizaram para a identificação das culturas as características bioquímicas obtidos através dos Kits API 50CH e 32A(Bio-Merieux). Jacobsen et al. (1999), também utilizaram nos seus estudos o sistema API 50CHL para a seleção de 47 culturas de Lactobacillus sp, entretanto algumas bactérias não foram confirmadas pelos métodos moleculares (ITS-PCR). A caracterização fenotípica pelo API 50CHL mostrou ser usado

principalmente para selecionar as culturas para uma posterior caracterização, como também relatado por Johansson et al. (1993).

De acordo com Kneifel e Pacher (1993), que utilizaram uma metodologia fenotípica (API ZYM teste para atividade da #-e #-D-glucosidase), todas as culturas de L. acidophilus testadas apresentaram fraco a elevada atividade, enquanto que para as culturas L. delbrueckii subsp. bulgaricus e S. salivarius subsp. thermophilus o teste foi negativo. Foi observado ainda que bifidobacterias de diferentes espécies e outros lactobacilos tiveram diferentes reações colorimétricas para ambas enzimas. Os autores comentam que apesar do perfil obtido pelo API não ser positivo para todas as culturas de L. acidophilus testadas, estas bactérias mostraram colônias azuis quando foram re-examinadas no ágar XGLU. Este efeito foi atribuído a sensibilidade do teste. Em contraste, todas as culturas de L. delbrueckii subsp. bulgaricus testadas apresentaram colônias brancas neste meio, sendo que nenhuma cultura de S. salivarius subsp. thermophilus produziu reação colorimétrica nos ágares que contiam X-GLU. Na conclusão do trabalho os autores mencionam que quando se pretende caracterizar completamente a microflora total dos produtos fermentados, há a necessidade de se ter meios de cultura seletivos válidos para a contagem de bifidobactéria.

A classificação dos microrganismos com base em informações genéticas tem como vantagem a unificação do conceito de espécie, a estabilidade da classificação (que não fica dependente de modificações causadas por poucas mutações) e a obtenção de bons esquemas de identificação (Hagler e Hagler, 1991). Além do estudo dos ácidos nucléicos, outros critérios têm demonstrado interesse taxonômico, sendo os mais importantes, a comparação entre proteínas celulares, a composição da parede celular, a composição de lipídios e as características topográficas da ultra-estrutura celular visualizadas ao microscópio eletrônico (Goodfellow e Minnikin 1985).

Informações sobre parentesco ou similaridade genética possuem aplicações importantes em diferentes áreas da ciência, permitindo identificar linhagens ou populações que devem ser mantidas para preservar a máxima diversidade genética (Thormann e Osborn 1992). Os procedimentos clássicos de caracterização de linhagens bacterianas, que são baseados nas características bioquímicas ou nutricionais, análise de proteínas totais ou a composição das proteínas de membrana, reações imunológicas e do conteúdo plasmático não permitem, em geral, distinguir linhagens aparentemente da mesma espécie (Le Borgeois et al., 1993). A classificação e identificação das bactérias ácido lácticas utilizando-se métodos clássicos tem sido tema de muitas revisões (Hammes e Vogel, 1995; Pot et al., 1994; Sgorbati et al., 1995; Apajalahti et al., 2003). Em geral, métodos fenotípicos não são reproduzíveis e a diversidade de culturas (biotipos) destas espécies são reconhecidas (Ballongue, 1993; Hammes e Vogel, 1995; Sgorbati et al., 1995). Ácidos nucléicos são universais em biologia

celular, e a seqüência de bases de nucleotídeos das moléculas não são influenciadas pelas condições de cultivo. Análises dos ácidos nucléicos deste modo, provem a base dos métodos de identificação e possuem a vantagem da reprodutibilidade. Métodos genéticos são mais promissores para uma rápida e acurada identificação dos lactobacilos e bifidobacteria (Tannock, 1999). A diferenciação de lactobacilos termófilos, por exemplo, pode ser realizada por meio de perfil de enzimas da parede celular em gel de proteína SDS-PAGE (Lortal et al., 1992), porem, diferenças entre subespécies como lactis e bulgaricus não são possíveis de serem estabelecidas utilizando-se esta técnica eletroforética.

Os métodos que permitem medir a diversidade entre linhagens aparentadas podem ser baseados na comparação da seqüência dos seus genomas ou da seqüência do rRNA ribossomal 16S e a medida da homologia DNA/DNA. Dois métodos são suficientemente rápidos para analisar as numerosas linhagens e podem revelar as diferenças entre linhagens de uma mesma espécie: a eletroforese de grandes fragmentos de DNA em campos pulsados (PFGE) e o Randomly Amplified Polymorphic DNA-RAPD (Welsh e McClelland, 1990; Willians et al., 1990; Tailliez et al., 1996).

A filogenia de muitas bactérias são baseadas na comparação de molécula altamente conservadas que estão presentes em todos os microrganismos. No entanto, genes que codificam o RNA ribossômico (rRNA), compreendendo regiões conservadas e variadas nesta molécula, são a escolha para os estudos filogenéticos. A comparação das seqüências do rRNA é considerada a mais poderosa e a mais acurada técnica para determinação do grau de relação filogenético dos microrganismos (Woese, 1987). Inicialmente, a hibridização DNArRNA ou métodos seqüenciando o rRNA foram usados para este propósito (Axelsson, 1998; Pot et al., 1997). Técnicas de biologia molecular permitiram o sequenciamento de longas fitas de rRNA, primeiro pelo uso da transcriptase reversa e segundo pela reação da polimerase em cadeia (PCR) sequenciando as moléculas 16S ou 23S rDNA, as quais resultaram em grandes bancos de base das seqüências. Com base nas informações obtidas nas seqüências 16S/23S rRNA, árvores filogenéticas ou dendogramas foram criados. Dados do sequenciamento do 16S rRNA mostram que identificações utilizando-se somente propriedades fenotípicas como morfologia celular e tipo de fermentação, não correspondem com o conhecimento filogenético. Como conseqüência, certas espécies de bactérias ácido lácticas foram reclassificadas.

O desafio para os taxonomistas é a descoberta de determinados caracteres que correlatem com o agrupamento baseado filogeneticamente. Este tem sido extremamente importante para a nomenclatura de espécies sua tipagem e a caracterização de novas culturas probióticas. Devido a grande maioria das bactérias ácido lácticas serem similares em seus requerimentos nutricionais e de crescimento, sua

identificação usando-se métodos microbiológicos clássicos é geralmente impossível. Durante os últimos 20 anos, o uso de sondas moleculares baseadas em seqüências de rDNA para a identificação das bactérias isoladas de seus meios naturais tem sido reportadas (Tannock, 1988). “Primers” (iniciadores) espécie-específicos para PCR que marcam os sítios das regiões espaçadoras 16S-23S rRNA são disponíveis para um limitado número de espécies de Lactobacillus. Métodos moleculares para a identificação de espécies de Bifidobacterium ainda não são disponíveis. Somente a reassociação DNA-DNA provem reais medidas para a identificação das espécies deste gênero. As bifidobacteria podem ser diferenciadas de bactérias similares morfologicamente pelo uso de primers para PCR gênero-específicos ou por sondas de oligonucleotídeos (Tannock, 1999).

Marcantes mudanças têm ocorrido na classificação bacteriana desde a aplicação das tecnologias moleculares. A observação das seqüências do RNA ribossomal 16S pode ser usada como parâmetro evolutivo (Woese, 1987). Algumas regiões da molécula do rRNA 16S são conservadas inteiramente em todas as espécies bacterianas enquanto outras regiões não apresentam este padrão o que permite comparar as següências de bases dos nucleotídeos entre muitas espécies (Collins et al., 1991; Stackebrandt e Rainey, 1995; Vandamme et al., 1996). Do ponto de vista prático, as seqüências do gene 16S rRNA (rDNA) podem ser usados em identificações de muitas espécies bacterianas através de técnicas que utilizam sondas de oligonucleotídeos específicas ou reação em cadeia da polimerase (PCR) (Langendijk et al., 1995; Vandamme et al., 1996; WANG et al., 1996). Outras regiões do genoma também podem ser alvos para os procedimentos de identificação (Gurtler e Stanisich, 1996). Estas informações moleculares permitem identificar seguramente espécies de Lactobacillus (Tannock, 1999).

A comparação das seqüências do gene 16S rDNA dos lactobacilos mostra que as regiões V1, V2 e V3 contêm informações espécie específicas. No entanto, para uma identificação precisa, amplificações pelo PCR e sequenciamento de genes menores (menos de 750 bp) podem ser suficientes, mas o sequenciamento genômico total, são melhores para o estabelecimento das relações filogenéticas. Os genes rRNA 16S, 23S e 5S são arranjados dentro do operon do cromossomo bacteriano. Informações da seqüência de bases nucleotídicas tem sido determinadas para as regiões entre os genes 16S e 23S chamada de região espaçadora 16S-23S. Muitas bactérias possuem cópias múltiplas do operon rRNA por genoma e a região espaçadora pode variar de tamanho dentro dos diferentes operons. Isto relata o número e tipo dos genes tRNA (tRNAglu, tRNAile, tRNAala) localizados em algumas regiões espaçadoras. Primers para PCR que anelam-se a região conservada dos genes 16S e 23S permitem a amplificação da região espaçadora (Gurtler; Stanisich 1996). Muitas vezes, genes ausentes de tRNA e genes com presença de um ou dois tRNA nas regiões espaçadoras são detectados, e estes podem ser purificados em géis de agarose para

subsequente sequenciamento. A seqüência de nucleotídeos da região espaçadora de muitas espécies de Lactobacillus tem sido determinadas. Estas seqüências mostram que a região espaçadora é hipervariável, e espécie específica. Primers de PCR, baseados nestas regiões, tem sido derivados para a identificação dos lactobacilos de interesse em indústria alimentar (Berthier e Ehrlich, 1998; Tilsala-Timisjarvi e Alatossava, 1997). Sondas de oligonucleotídeos baseadas nas análises de domínio hipervariáveis nas moléculas de ácidos nucléicos têm sido derivadas para o propósito de identificação (Schleifer et al., 1995), no entanto, resultados específicos e consistentes são muitas vezes difíceis de serem estabelecidos com estas sondas, como o controle da temperatura e força iônica da solução de lavagem são críticos para obtenção dos resultados.

Resultados apresentados por Zavaglia et al. (2000), demonstraram que espécies identificadas como B. breve por fermentação de açúcares, quando analisadas por técnicas moleculares de PCR, apresentaram-se como B. infantis ou B. bifidum. Portanto, para confirmação da identidade desses isolados, é importante que análises moleculares como homologia de DNA ou Polymerase Chain Reaction – Random Amplified Polymorphic DNA (PCR-RAPD) ou Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) sejam realizadas.

As técnicas moleculares são as mais indicadas para discriminação entre espécies e estirpes diferentes dentro de um gênero bacteriano. A técnica de eletroforese em gel em campo pulsado (PFGE) tem sido utilizada para diferenciar estirpes, embora não apresente o mesmo poder discriminatório ao nível de espécies. Isolados que apresentam o mesmo número de fragmentos de DNA total, podem ser considerados geneticamente indistinguíveis, sugerindo que esses isolados correspondem a uma mesma estirpe. Isolados que apresentam o mesmo número total de fragmentos, mas de tamanhos diferentes, podem ser considerados estirpes relacionadas. Embora PFGE seja uma técnica genética laboriosa, apresenta alta sensibilidade e pode ser utilizada na taxonomia polifásica de bactérias, onde são combinados métodos fenotípicos e genotípicos para diferenciação de espécies fenotipicamente muito similares, mas, genotipicamente diferentes (Klein et al., 1998). Além disso, o perfil genético ou “fingerprint” de bactérias probióticas obtido por PFGE constitui uma ferramenta no estudo da modulação da microbiota por probióticos, uma vez que esta técnica pode diferenciar os organismos endógenos da microbiota de organismos exógenos administrados.

Os métodos de tipagem são baseados em duas grandes categorias: Métodos fenotípicos e genotípicos. Os métodos fenotípicos são aqueles que caracterizam os produtos da expressão gênica para a diferenciação das culturas. Propriedades como o perfil bioquímico, tipos de bacteriófagos, presença de antigenos na superfície celular, e perfil de susceptibilidade antimicrobiana são exemplos de propriedades fenotípicas que podem ser determinados em laboratório. Em decorrência deles

envolverem a expressão do gene, estas propriedades podem variar, baseado em mudanças das condições de crescimento, fase de crescimento e mutações espontâneas. Os métodos genotípicos são aqueles que são baseados na análise da estrutura genética do organismo e incluem o polimorfismo do DNA baseado em padrões de restrição que clivam o cromossomo por enzimas que cortam o DNA em muitos fragmentos (mais de 100) – corte freqüente, ou em 10 a 30 fragmentos cortes infreqüentes, e a presença ou ausência de DNA extracromossomal. Métodos genotípicos são menos sujeitos a variações naturais, apesar disto eles podem ser afetados por inserções ou deleções do DNA dentro do cromossomo, e ganhar ou perder DNA extracromossomal, ou mutações ao acaso que podem criar ou eliminar sítios endonucleases de restrição (Tenover et al.,1997).

Muitas técnicas de tipagem molecular podem ser aplicadas para as BAL como instrumento para a identificação de espécies ou diferenciação das culturas. As maiores vantagens dos métodos de tipagem molecular são em decorrência de seu poder discriminatório (Klein et al., 1998) e sua aplicabilidade universal. Culturas finamente relacionadas com aspectos fenotípicos similares podem ser atualmente discriminadas por estas técnicas. Métodos de tipagem moleculares aplicadas às bactérias ácido lácticas probióticas incluem o perfil plasmidial, análises de restrição enzimática (REA), eletroforese em gel em campo pulsante (PFGE), polimorfismo amplificado ao acaso (RAPD) e a ribotipagem.

A tipagem molecular é uma caracterização mais detalhada do microrganismo, que utiliza técnicas de biologia molecular para evidenciar uma possível relação genética entre culturas de uma mesma espécie. Esta área adquiriu muita importância nos últimos anos, pois os resultados obtidos pelas técnicas de tipagem molecular são de grande valia para a identificação dos microrganismos empregados como probióticos.

Inicialmente as técnicas de tipagem se constituíam de métodos que avaliavam as características fenotípicas. Nos últimos anos, com as facilidades da manipulação do DNA, técnicas de tipagem molecular estão sendo utilizadas, as quais permitem produzir perfis genotípicos. Como estes métodos examinam o DNA bacteriano, eles se tornaram mais reprodutíveis e discriminatórios que métodos baseados na análise de características fenotípicas (Olive; Bean 1999; Pfaller et al., 2001).

Várias técnicas que determinam o padrão genotípico de diversos microrganismos estão sendo utilizadas e todas elas caracterizam-se por produzirem fragmentos de DNA os quais, quando submetidos a algum processo eletroforético, produz um padrão (perfil) migratório característico de uma determinada cultura. Este perfil migratório do DNA bacteriano poderá ser visualizado após o gel da eletroforese ser corado com brometo de etídio, ou uando o gel é submetido à técnicas de hibridização.

O perfil migratório (análise cromossomal) pode ser feito pela restrição (clivagem) do DNA por endonucleases de restrição, que são enzimas que clivam o DNA em seqüências específicas. A ação das endonucleases origina fragmentos de DNA, os quais são separados por eletroforese. A distância migratória destes fragmentos mostra o polimorfismo do DNA (“Restriction Fragment Lenght Polymorphism - RFLP”), que pode ser específico para cada cultura. O perfil migratório também pode ser produzido pela amplificação de determinados sítios do DNA bacteriano, utilizando-se a técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR) com “primers” (iniciadores) não-específicos (aleatórios).

Os RFLPs são expressos por um perfil de bandas em gel de agarose ou em membranas e são comparados de acordo com a sua similaridade. RFLPs idênticos ou muito similares indicam culturas com mesmo conteúdo genético, ou seja, culturas idênticas (Pfaller et al., 1992; Sader et al., 1993; Denton et al., 1998; Pfaller et al., 2001).

Para a confirmação da identidade e classificação são recomendados métodos capazes de estabelecer relações filogenéticas, particularmente a hibridização DNA-DNA, o sequenciamento do gene que codifica o rRNA 16S e o sequenciamento da região espaçadora ITS (internal transcribed spacer) entre os genes do operon que codifica o rRNA. Essas técnicas são utilizadas hoje por vários laboratórios, porém, exigem uma infra-estrutura não disponível e mesmo desnecessária em laboratórios que não trabalham diretamente com a manutenção de coleções de culturas microbianas. Nesse caso há várias opções de técnicas de geração de “fingerprints”, com diferentes graus de sofisticação e capacidade discriminatória. Muitas técnicas de tipagem podem ser aplicadas para as bactérias ácido lácticas como instrumento para a identificação de espécie ou diferenciação de culturas. As maiores vantagens dos métodos de tipagem são em decorrência de seu poder discriminatório (Klein et al., 1998) e sua aplicabilidade universal. Culturas finamente relacionadas com aspectos fenotípicos similares podem ser atualmente discriminadas por estas técnicas. Métodos de tipagem moleculares aplicadas as bactérias lácticas probióticas incluem: Análises de Restrição Enzimática (REA), Restriction Fragment Lenght Polymorphism Analysis (RFLP), Eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE), Polimerase Chain Reaction (PCR), Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD), e Ribotipagem (Botelho, 2005).

2.4. Probióticos

O termo ‘probiótico’ de origem grega significa ‘para a vida’, e tem recebido diferentes definições ao longo dos últimos anos. Tal termo foi inicialmente proposto por Lilly e Stilwell em 1965 (Lilly e Stilwell 1965) como descritivo de compostos ou extratos de tecidos capazes de estimular o crescimento microbiano; posteriormente, Parker em 1974, (Parker, 1974) definiu probiótico como

relativo a organismos e substâncias que contribuem para o equilíbrio microbiano intestinal. Esta definição era, no entanto, pouco satisfatória uma vez que a palavra ‘substância’ poderia incluir suplementos tais como os antibióticos, cuja função é virtualmente oposta. Entretanto, Fuller em 1989, (Fuller, 1989) definiu os probióticos como suplemento alimentar microbiano vivo o qual afeta beneficamente o hospedeiro animal pela melhora de seu balanço intestinal.

O conceito “probiótico” não é novo, a origem de culturas de produtos do leite foram relatadas no início da civilização e menções do termo são encontradas na Bíblia e nos livros sagrados dos Hindus (Hosono, 1992). No século 20, Elie Metcnikoff, propôs cientificamente os benefícios das bactérias do iogurte, postulando, que as bactérias dos produtos fermentados com L. bulgaricus e S. thermophilus suprimiam fermentações do tipo putrefativas, mantiam um equilíbrio entre bactérias patogênicas e não patogênicas na flora intestinal e o consumo destes iogurtes tinham um papel na manutenção da saúde e na longevidade de certos grupos étnicos. Esta teoria conhecida como “O Prolongamento da Vida” (The Prolongation of Life. Optimistic Studies), foi atribuída aos Búlgaros que ingeriam continuadamente estes iogurtes. Em 1905, Elie Metcnikoff identificou o L. bulgaricus e com ele desenvolveu um fermento, que passou a ser largamente adicionado a produtos lácteos nos anos que se seguiram.

Em decorrência de vários benefícios à saúde, muitos microrganismos têm sido estudados para serem utilizados como adjuntos dietários, para melhorarem a qualidade nutricional e terapêutica dos alimentos. No entanto, alguns requerimentos são necessários para se alcançar tal propósito. Na tecnologia industrial, por exemplo, durante a fermentação dos produtos, alguns fatores devem ser observados, como o aparecimento de alguns metabólitos, incluindo-se os ácidos acético e láctico, os quais ocasionam redução do pH e podem afetar a estabilidade e as propriedades funcionais das bactérias probióticas. Algumas interferências, no entanto, podem ser controladas pois são relativas a fisiologia da cultura, mas em decorrência do longo tempo de duração do processamento e das condições de estocagem dos produtos, estas alterações podem provocar mudanças nas propriedades probióticas das culturas. Desta forma, em adição as propriedades tecnológicas, as propriedades funcionais também devem ser consideradas para as medidas de controle de qualidade dos produtos (Tuomola et al., 2001). Com relação aos microrganismos, vários requerimentos devem ser observados. Os produtos de mercado que mais comumente contém bactérias probióticas são os produtos lácteos fermentados, embora boa parte das espécies probióticas cresça pobremente em leite fermentado. Assim, é usual a prática de incorporar fermentos tradicionais nos produtos, como Streptococcus thermophilus e Lactobacillus delbrueckii subsp bulcaricus (Dave e Shah, 1996).

As evidências acumuladas até o momento parecem indicar que essas espécies são raramente isoladas em

fezes humanas e não sobrevive bem no trato intestinal (Gilliland, 1978; Goldin et al., 1992; Hoover, 1993). No entanto, várias pesquisas têm demonstrado seu efeito benéfico sobre a saúde e bem estar do organismo (Bogdanov et al.,1975; Shahani,1976; Bogdanov, 1977; Shackelford, 1983; Bodana, 1990; Beshkova, 1998; Tejada-SImon et al., 1999; Lin, 1999; Friedrich, 2000, Terahara et al., 2000), havendo ainda controvérsias sobre considerar ou não como probióticos os produtos lácteos fermentados exclusivamente com L. delbrueckii subsp. bulgaricus e S. thermophilus. Estes microrganismos não são habitantes do trato intestinal de humanos e animais mas são normalmente isolados de materiais de plantas verdes e leite, respectivamente. Estas bactérias não são altamente resistentes ao ácido e bile. Somente em torno de 15% sobrevivem a passagem através do estômago e em torno de 1% reage no intestino grosso (Pochart et al., 1989) mas não pode colonizá-lo (Rasic, 1987). De acordo Gilliland e Speck (1977a), bactérias de origem não intestinal como o L. delbrueckii ssp. bulgaricus e Lactococcus lactis são muito sensíveis a bile: concentrações menores que 0,05% são inibitórias. Por outro lado, bactérias probióticas são resistentes a 0,15-0,3% de oxgall (Goldin e Gorbach 1992). Entretanto, Garvie et al. (1984) e Kanbe (1992), em estudos com cobaias alimentadas com iogurtes, relataram alterações na flora intestinal destes animais com o crescimento de lactobacilos e bifidobactérias, os quais afetam o tempo de trânsito intestinal e oferecem um significante impacto na absorção de nutrientes. Assim, apesar das desvantagens referentes a sua sobrevivência, as bactérias do iogurte podem exercer efeito benéficos in vivo devido as enzimas intracelulares, aos receptores antigênicos na superfície celular ou a produção de metabólitos durante a fermentação. Outros fatores que têm sido citados para as bactérias do iogurte e outras bactérias ácido lácticas é a inibição de bactérias patogênicas in vitro pela produção de ácidos orgânicos e substâncias equivalentes a antibióticos, entretanto, estas interações não tem sido claramente demonstradas in vivo.

2.4.1. Definição

A partir do conhecimento de microrganismos favoráveis a saúde humana, em 1960, Richard Parker utilizou pela primeira vez o termo probiótico, com o significado de “a favor da vida”, de acordo com a origem grega do termo. Lilley e Stillwell (1965) utilizaram este termo para descreverem substâncias secretadas por um microrganismo que estimula o crescimento de outro. Posteriormente, Fuller (1989) modificou este conceito, introduzindo nova definição para probióticos, que seria “suplemento alimentar constituído de microrganismos vivos capazes de beneficiar o hospedeiro através do equilíbrio da microbiota intestinal”.

Salminem (1999) definiu probióticos como preparados de microrganismos, ou seus constituintes que têm efeito benéfico sobre a saúde e o bem estar do hospedeiro.

Atualmente, a definição de probióticos utilizada pela WHO e Organização de Agricultura e Alimentos (FAO1) é a seguinte: “microrganismos vivos, que quando administrados em quantidades adequadas, conferem benefício à saúde do hospedeiro” (Food and Agriculture Organization/ World Health Organization, 2002).

2.4.2. Características desejáveis

Para que um microrganismo seja selecionado e utilizado na preparação de produtos probióticos para humanos e animais ele precisa possuir características importantes. Estas propriedades incluem: serem produzidos em ampla escala; permanecerem estáveis e viáveis durante a estocagem; serem capazes de resistir às condições adversas do TGI (acidez gástrica e sais biliares) e nele sobreviver, preferencialmente aderindo-se à mucosa; produzir efeito benéfico ao hospedeiro (atividade antimicrobiana contra patógenos; reduzir a adesão de patógenos; atividade hidrolítica sobre sais biliares e contribuição nutricional), modulação da atividade imunológica e não ser patogênico (Fuller, 1989; Food and Agriculture Organization / World Health Organization, 2003).

De acordo com Food and Agriculture Organization/ World Health Organization, os microrganismos utilizados como probióticos apresentam relação espécie-específica com o hospedeiro; devem ser identificados genotípica e fenotipicamente, e precisa ter seus efeitos sobre a saúde investigados, a fim de se constatar a segurança do microrganismo (Food and Agriculture Organization / World Health Organization, 2002).

O interesse no uso de agentes microbianos vivos objetivando a manutenção da saúde e a prevenção da doença ou seu tratamento, explodiu nos últimos anos. Muitos destes microrganismos estão sendo propostos como verdadeiros remédios para um amplo número de condições gastrointestinais e sistêmicas, desde a doença diarréica à alergia e à preenção do câncer. Recentemente, diversos livros e revisões foram dedicados a esse tópico (Elmer et al., 1996; Naidu, 1999; Saavedra, 2000).

Resistência ao pH baixo do estômago e tolerância aos sais biliares foram observadas em sete culturas Lactobacillus spp. de várias origens (humana, leite e produtos lácteos e culturas lácteas). Lactobacillus plantarum LHI10, de origem humana, apresentou melhores resultados. As amostras apresentaram variado grau de produção e sensibilidade a bacteriocinas (Plockova et al., 1996).

Para resistir às condições do trato gastrointestinal culturas probióticas devem apresentar tolerância à bile e atividade de hidrólise de sais biliares, além de resistir a condições ácidas e ricas de proteases no estômago. Adicionalmente, devem ser capazes de competir com a microbiota normal e resistir aos metabólitos produzidos

1 Food and Agriculture Organization (FAO) cuja tradução para o

português é Organização para Agricultura e Alimentação (FAO).

por membros dessa microbiota, incluindo bacteriocinas, ácidos orgânicos e outros agentes antimicrobianos (Klaenhammer e Kullen, 1999). Bactérias probióticas variam consideravelmente em seus níveis de tolerância a bile. O mecanismo da tolerância e o nível mínimo aceitos para os candidatos a probiótico permanecem desconhecidos segundo Klaenhammer e Kullen (1999). A maioria das bactérias é destruída quando passam pelo estômago humano em função da presença do suco gástrico que é um dos nossos melhores mecanismos de defesa contra microrganismos patogênicos.

A motilidade intestinal e o efeito inibitório dos sais biliares dificultam a colonização no intestino delgado (Naidu et al., 1999). Os microganismos ingeridos são expostos durante o trânsito intestinal a sucessivos fatores de stress que influenciam na sua sobrevivência (Marteau et al., 1993a; Simon e Gorbach, 1987).

Os papéis do pH gátrico e peristaltismo gastrointestinal na prevenção da colonização bacteriana no intestino delgado são bem estabelecidos (Heatley; Sobola 1993; Simon; Gorbach 1987), entretanto, o papel da bile ainda é tópico de debate, primeiro por que a concentração de sais biliares no intestino não é estática, mas muda com o tempo e em diferentes partes do intestino delgado, e após a refeição, a concentração deste sal nitidamente aumenta no duodeno (15mmol/L) e progressivamente decresce (5mmol/L). No jejuno, a concentração é de 10mmol/L e, no íleo é menor que 4mmol/L devido a ativa absorção ileal (Northfied e McColl, 1973). Em segundo evido a formação de micelas com os fosfolipídeos (encontrados na bile total) e, portanto, tem alta atividade antibacteriana em relação a soluções artificiais do sal biliar puro (Sung et al., 1993). & finalmente, in vivo, o sucessivo stress pelo ácido gástrico e bile pode ser presumido para exercer um alto efeito antimicrobiano do que cada um destes parâmetros sozinhos.

A sobrevivência de microrganismos tem sido escassamente quantificada in vivo, exceto para algumas espécies de bactérias ácido lácticas (Berrada et al., 1991; Marteau et al., 1992; Pettersson et al., 1985; Pochart et al., 1992; Robins-Browne et al., 1981) devido a dificuldade na amostragem do estômago humano (geralmente biopsias da mucosa intestinal, pois as análises de fezes refletem somente parte da flora do intestino grosso e são pobres indicadores da flora do trato gastrointestinal (Savage, 1977; Sharpe, 1981) e devido a restrição ética, deste modo alternativas devem ser adotadas in vitro para se simular tais condições e que estas possam ser utilizadas para a verificação dos critérios de seleção relatados.

De acordo com Marteau et al. (1997), modelos de validação “in vitro” permitem um rápido “screening” das bactérias probióticas. Muitos estudos investigaram a sobrevivência de L. acidophilus e/ou Bifidobacterium spp. na presença de ácido e sais biliares (Conway et al., 1987; Berrada et al., 1991; Holcomb et al., 1991; Clark et al., 1993; Clark e Martin, 1994; Lankaputhra e Shah, 1995; Marteau et al., 1997; Chou e Weimer, 1999), neste

aspecto, a tolerância ao ácido é também importante para os probióticos sobreviverem no alimento (Lee e Salminen, 1995). O veículo alimentar dominante para os probióticos são os iogurtes e leites fermentados, ambos apresentam relativamente baixos valores de pH no meio os quais a bactéria deve sobreviver. Conseqüentemente, a tolerância ao ácido é a primeira propriedade que deve ser analisada para a seleção de culturas probióticas. Simples testes in vitro podem ser usados para se determinar esta tolerância para bactérias ácido lácticas e culturas de bifidobactérias propostas como probióticas nas indústrias de alimentos. Desta forma os resultados obtidos nestes testes podem predizer a habilidade da cultura em sobreviver em produtos ácidos.

A validação in vivo da sobrevivência através do estômago humano é mais difícil de ser obtida. Determinações in vitro examinando o efeito inibitório dos ácidos biliares no crescimento de culturas probióticas são também relativamente simples de execução, embora novamente a extrapolação quantitativa da performance in vivo seja difícil. Variações intraespécies da habilidade de crescimento em presença de bile são freqüentemente observadas entre culturas potencialmente probióticas e testes in vitro podem ser usados para a seleção das melhores culturas (Tuomola et al., 2001).

A adesão às células do hospedeiro pode ser uma característica desejável dos candidatos a probióticos, uma vez que possuindo esta habilidade, seus efeitos podem ser mantidos por longo período de tempo, sem a necessidade da contínua administração dos microrganismos, como acontece com aqueles que não permanecem no hospedeiro. A hidrofobicidade da superfície da célula microbiana é uma característica que indica seu potencial de adesão às mucosas, sendo que elevados valores indicam maior habilidade de adesão. Esta capacidade foi alta para Lactobacillus fermentum ssp. cellobiosus e menor para Lactobacillus animalis (Gusils et al., 1999).

A habilidade do Lactobacilus spp em sobreviver e reter sua viabilidade através do trato é uma das principais características desejadas para a atividade probiótica (Kos et al. 2000). A resistência ao trânsito gástrico humano tem sido demonstrada in vivo para bactérias ácido lácticas probióticas e constitui-se um importante critério de seleção in vitro para as bactérias probióticas, contudo métodos satisfatórios in vitro que simulam finamente o trânsito gástrico in vivo, não tem sido definidos. Neste propósito a água destilada acidificada com HCl, caldo e tampão tem sido usados como substituto do suco gástrico humano fresco (Suskovic et al., 1997; Conway et al., 1987). Conway et al. (1987), demonstraram que a bactéria sobrevive melhor em suco gástrico humano do que em tampão com pH equivalente indicando que os estudos usando tampões provavelmente subestimam a sobrevivência potencial in vivo.

2.4.3. Mecanismos de ação

Os probióticos utilizados para humanos ou animais têm diferentes aplicações terapêuticas ou profiláticas, como: tratamento de diversas disfunções gastrintestinais (intolerância a lactose, constipação, hipersensibilidade alimentar, gastrenterite), alergias, dermatites atópicas, infecções do sistema gênito-urinário inferior ou respiratório superior (Salminem, 1998).

Os probióticos podem suprimir a presença de microrganismos indesejáveis no trato digestivo de aves atuando pela exclusão competitiva (Nurmi e Rantala, 1973), por modular a atividade imunológica (Hoyos, 1997), por inibirem a ação de toxinas (Fuller, 1975), e diminuírem a produção de aminas tóxicas e aumentarem a disponibilidade de aminoácidos nos locais de absorção (Kozasa, 1989), por economia de energia e aumento da disponibilidade de vitaminas e enzimas (Fuller e Cole, 1988) e pela produção de metabólitos bactericidas, como ácido lático (Fuller, 1975 e Bonilla, 1992).

A competição por nutrientes e espaço e a inibição de um grupo de microrganismos por produtos de metabolismo de outro grupo, a predação e o peristaltismo contribuem para a regulação das populações no TGI. Como todos estes habitats são preenchidos por uma determinada população bacteriana que interage entre si, torna-se extremamente difícil para microrganismos alóctones (formados em outro lugar), acidentalmente ou intencionalmente introduzirem-se neste ecossistema e se estabelecerem. Este fenômeno é definido como exclusão competitiva (Alexander, 1971). A exclusão de bactérias patogênicas pode ocorrer devido a competição por sítios de adesão às células do epitélio do intestino delgado (Zuanon, 1995).

Para que um microrganismo possa exercer a sua ação probiótica em um determinado habitat, é necessário que o mesmo se encontre em nível populacional adequado. Muitos microbiologistas consideram que para que tais efeitos ocorram, deve haver pelo menos 107 ufc/grama de conteúdo intestinal, no caso do TGI (Nicoli, 1995; Guillot, 2001).

A composição da microbiota de determinada espécie animal pode ser avaliada por exames dos microrganismos existentes em suas fezes, o que normalmente é bastante estável (Tannock, 2003). Lactobacillus rhamnosus DR20 foi administrado via leite para humanos diariamente durante seis meses (Tannock et al., 2000). Logo após o término do fornecimento do probiótico, cessou sua excreção nas fezes dos voluntários. Os níveis do probióticos foram relativamente baixos (105a 106 ufc/g de fezes) e somente foram irregularmente detectados nas fezes de 40% dos voluntários que já tinham populações estáveis previas de Lactobacillus.

Os probióticos podem estimular acúmulos de sistema linfático ao longo do TGI das aves, representados pelas placas de Peyer, tonsilas cecais e Bursa de Fabricius.

Estes tecidos captam antígenos disponibilizados no trato digestório, que estimulam as células B, produtoras de IgA, e células T, colaboradoras das placas de Peyer, favorecendo o desenvolvimento de uma imunidade geral e inespecífica. Pelo estímulo imunológico da mucosa, ocorre produção de anticorpos do tipo IgA, que bloqueiam os receptores e reduzem o número de bactérias patogênicas na luz intestinal. Além disto, ocorre ativação de macrófagos e proliferação de células T (Silva, 2000; Macari e Furlam, 2005).

Um aspecto de grande interesse em relação ao estudo dos probióticos refere-se aos seus efeitos na translocação (passagem de microrganismos através de mucosas) de patógenos e no sistema imune de hospedeiros, os quais ainda não são completamente conhecidos. Alguns probióticos poderiam afetar a translocação bacteriana a partir do intestino, o que seria de grande importância para evitar as infecções de origem entérica, dentre as quais a salmonelose assume destaque na atualidade (Gil de Los Santos e Gil-Turnes, 2005).

Ewing e Cole (1994) descreveram que os lactobacilos são capazes de influenciar a atividade das enzimas dos microvilos intestinais, as quais estão envolvidas no processo de absorção de nutrientes e, desta forma, beneficiam o hospedeiro.

As substâncias produzidas durante o processo fermentativo das bactérias lácticas contribuem não somente para a conservação, como também para o desenvolvimento das características sensoriais e reológicas dos produtos (Caplice; Fitzgerald, 1999). Além dos ácidos orgânicos (ácido láctico e ácido acético), dependendo das condições de crescimento, estas bactérias produzem outras substâncias, como o peróxido de hidrogênio, diacetil, etanol, dióxido de carbono, aldeído e as bacteriocinas, que promovem o fenômeno da antibiose, inibindo o desenvolvimento de bactérias deteriorantes e/ou patogênicas em alimentos (Lindgren e Dodrogosz, 1990; De Vuyst e Vandamme, 1994a).

Bacteriocinas são polipeptídeos (simples ou complexos) antimicrobianos (Rattanachaikunsopon e Phumkhachom, 2000) sintetizados no ribossomo e secretados pela célula bacteriana (Chin et al., 2001). Seu mecanismo de ação é através da formação de poros na membrana citoplasmática, o que leva a alteração de seu equilíbrio osmótico, resultando em morte celular (Cleveland et al., 2001). Apresentam espectro de atividade amplo ou restrito contra bactérias Gram-positivo (De Vuyst e Vandamme 1994b), incluindo-se microrganismos patogênicos importantes, como por exemplo, Listeria monocytogenes, Clostridium spp. (incluindo C. botulinum), Staphylococcus aureus e Bacillus cereus. Contudo, não apresentam atividade contra microrganismos Gram-negativos (Hugas, 1998) nem contra bolores e leveduras (Coventry et al., 1995).

Além disso, essas substâncias não são consideradas tóxicas para seres humanos, uma vez que são

produzidas por bactérias naturalmente presentes em alimentos e são degradadas no trato digestivo por enzimas de origem pancreática e gástrica (De Vuyst e Vandamme 1994c). Apresentam estabilidade ao tratamento térmico, sendo que algumas delas permanecem ativas mesmo após serem expostas às temperaturas de esterilização (Schillinger, 1990). Geralmente são estáveis a pH ácido e neutro, indicando que essas substâncias são bem adaptadas ao ambiente de produção (Desmazeaud e Roissart, 1997), não afetam a qualidade sensorial do produto e são efetivas em baixa concentração, por exemplo, 10mg/kg (Rodgers, 2001).

Embora muitas bacteriocinas tenham sido isoladas e caracterizadas nesta última década, somente um número limitado tem revelado potencial comercial para efetiva aplicação como bio-conservante, sendo a nisina produzida por Lactococcus lactis subsp. lactis a única bacteriocina purificada e aprovada para alimentos em diversos países, inclusive no Brasil. Ela apresenta atividade antimicrobiana contra uma grande faixa de microrganismos Gram-positivos, incluindo as bactérias esporogênicas dos gêneros Bacillus e Clostridium (Hurst, 1983).

Outras bacteriocinas têm sido extensivamente avaliadas e exploradas comercialmente, como é o caso da pediocina PA-1, disponível, na forma de um produto fermentado (AltaTM), e usada como um conservante para aumentar a vida útil de produtos cárneos prontos para consumo e inibir o desenvolvimento de bactérias patogênicas, principalmente L. monocytogenes. Já a lacticina 3147, que é uma bacteriocina que apresenta atividade em uma maior faixa de pH do que a nisina tem expectativa para aplicação em alimentos não ácidos (Chen e Hoover, 2003; Guerra e Castro, 2002).

2.4.4. Produtos carreadores de bactérias probióticas e microrganismos empregados em sua formulação

O consumo de leites fermentados remonta à história escrita, tendo sido inclusive, citado na Bíblia como alimento usado para oferecimento de Abraão a Deus ou a visitas ilustres. No entanto, somente após a II Guerra Mundial é que os leites fermentados, principalmente o iogurte, passaram a ser produzidos em escala industrial, conquistando grande parte da população mundial. Por outro lado, entretanto, desde o início de 1907, o microbiologista Elie Metchnikoff (Metchinikoff, 1908), propôs uma teoria que o consumo diário de grandes quantidades de leites fermentados prolongaria a vida, muitos pesquisadores têm se empenhado no estudo dos microrganismos empregados na elaboração de produtos lácteos e no efeito destes sobre os homens e animais.

A manipulação da microbiota endógena do trato gastrointestinal vem sendo correntemente empregada como uma medida de introdução de novos microrganismos ao trato (Driessen; e Deboer, 1989; Hitchins e McDonough, 1989), para isto os bioprodutos alimentares tem sido empregados e são usados como

veículos carreadores destes microrganismos probióticos. Esses bioprodutos também chamados de produtos lácteos de terceira geração, incluem os leites fermentados (Tamine e Robinson, 1988; Mital e Carg, 1992), iogurtes (Reuter, 1990), iogurtes frescos (gelados) (Holcomb et al., 1991; Modler e Villa-Garcia, 1993; Richardson, 1996; Laroia e Martin, 1991a), queijo cheddar (Dinakar e Mistry, 1994; Roy et al., 1995), queijo cottage (Blanchette et al., 1995), sorvetes (Modler et al., 1990b; Hekmat e McMahon, 1992), leite de soja fermentado (Valdez eGiori 1987, 1993), leite de soja (Murti et al., 1992), entre outros.

A contribuição das bactérias do iogurte na melhora da microbiota intestinal tem sido vastamente reconhecida. A incorporação de L. acidophilus e B. bifidum nos iogurtes geram produtos de excelente valor terapêutico (Tamine; Robinson, 1985). Um consumo regular de iogurte (400 – 500g/semana) contêm 1,0 x 106 UFC/g de Bifidobacterium sp. e L. acidophilus, estes por sua vez deverão sobreviver à passagem pelo trato intestinal para que possam oferecer seus efeitos terapêuticos benéficos (Tamine et al., 1995)

As espécies mais freqüentemente empregadas na produção dos produtos probióticos do leite são de origem intestinal humana, pois geralmente são mais facilmente toleradas e mais adaptadas as necessidades fisiológicas do hospedeiro e podem mais facilmente colonizar o intestino do que culturas originárias do cólon de outros animais. As culturas natas incluem B. adolescentis, B. bifidum, B. breve, B. infantis, B. longum, L. acidophilus, L. casei subsp. rhamnosus e Enterococcus faecium (Kurmann, 1998; Hoier, 1992a). Resultados recentes com culturas de B. longum como adjunto dietético de produtos de leite com B. Adolescentis, B. infantis tem sido considerados uma alternativa adequada (Martin, 1996; Silva et al 2004).

Muitos produtos recentemente desenvolvidos em todo o mundo contêm uma mistura de culturas de bifidobactérias e bactérias acidoláticas. Estas culturas mistas são formadas pelos microrganismos Bifidobacterium bifidum, L. acidophilus e Streptococcus thermophilus, ou uma combinação de L. acidophilus e B. bifidum. Outras combinações encontradas apresentam B. infantis e B. longum. As culturas mistas que apresentam L. acidophilus e B. bifidum são as mais utilizadas, pois uma simbiose entre estes microrganismos permite uma maior velocidade de crescimento e um melhor aroma do produto terminado (Manzanares, 1997).

Os iogurtes com culturas de L. acidophilus (incluindo-se espécies relacionadas como L. crispatus e L. johnsonii), L. casei, L. paracasei e Bifidobacterium sp são predominantes (Holtzapfel et al., 1998). Propriedades funcionais e de segurança das culturas L. casei, L. rhamnosus, L. acidophilus e L. johnsonii tem sido extensivamente estudadas e documentadas na literatura (Salminen et al., 1998b).

Na Europa e Austrália, iogurtes contendo L. acidophilus

e Bifidobacterium sp. são referidos como iogurtes “AB” e a incorporação de L. casei ao produto é denominado iogurtes “ABC”. Tradicionalmente, iogurtes fabricados com S. thermophilus e L. delbrueckii subsp. bulgaricus (culturas startes), apesar de oferecerem benefícios à saúde, não são de origem natural do intestino, deste modo, para que o produto possa ser considerado probiótico, culturas de L. acidophilus e bifidobacteria (e L. casei ou ambas) devem ser incorporados como adjuntos dietéticos (Shah, 2000). Diferentes espécies e culturas são correntemente usadas nos produtos europeus (Salminen et al., 1997; Tamine e Marshall, 1997; Anon, 1997; Obermann; e Libudzisz, 1988; Knorr, 1998) incluindo L. acidophilus, L. casei, L. johnsonii, L. rhamnosus, L. reuteri, L. delbrueckii subsp. bulgaricus, L. lactis subsp. cremoris, L. lactis biovar diacetylactis, B. bifidum, B. longum, B. brevis, B. infantis, B. animalis, S. thermophilus os quais apresentam benefícios funcionais (Salminen et al., 1998c). Na Alemanha os produtos contendo L. acidophilus e B. bifidum são conhecidos como iogurtes “mild” ou bio-iogurtes. A maioria dos novos produtos probióticos contém culturas de L. acidophilus ou espécies finamente relacionadas (chamadas de grupo L. acidophilus). Culturas chamadas de grupo L. casei compreendem as espécies L. casei, L. paracasei subsp. paracasei e subsp. tolerans e L. rhamnosus têm sido utilizados na fabricação de iogurtes.

Os probióticos são comercializados na forma de preparações contendo um único ou uma combinação de microrganismos, onde deve-se apresentar viável na preparação e manter essa viabilidade no ecossistema digestivo, condição indispensável para a sua atuação (Penna et al., 2000). Podem ainda ser comercializado na forma de preparações farmacêuticas em cápsulas ou saches, pós, tabletes, suspensões líquidas e secas (Fooks et al., 1999). Em produtos liofilizados a manutenção da viabilidade durante longo período de armazenamento em temperatura ambiente são obtidos, o que não é possível para os produtos fermentados do leite, onde a refrigeração é indispensável, e o tempo de vida dos microrganismos é reduzido (Fuller ,1992).

Além dos benefícios em termos de nutrição e de saúde que proporcionam, os microrganismos probióticos podem também contribuir para melhorar o sabor do produto final, possuindo a vantagem de promover uma acidificação reduzida durante a armazenagem pós-processamento (Gomes e Malcata, 1998d).

Atualmente no mercado mundial estão disponíveis mais de 100 produtos diferentes contendo bactérias bífidas, e cerca de 50 indústrias de laticínios estão comercializando produtos bífido-acidophilus, os quais são produzidos essencialmente no Japão e Europa (Gomes e Malcata, 1998c; Ferreira, 2003). Nos mercados japonês e europeu, a tendência é utilizar novas estirpes probióticas e misturas mais complexas. Em outros mercados, como nos EUA e Brasil, a maioria dos produtos probióticos contêm estirpes de L. acidophilus e de Bifidobacterium sp. Tem-se observado, no entanto, o crescimento de produtos com outras

estirpes probióticas das espécies L. casei e L. rhamnosus.

Em qualquer um dos gêneros (Lactobacillus e Bifidobacterium), as espécies correntemente utilizadas ao nível tecnológico não são consideradas patogênicas, gozando do status de Generally Recognised As Safe (GRAS). O isolamento destes microrganismos de infecções tem sido reportados com baixa incidência, e associados com pacientes imunocomprometidos (Brook 1996; Saxelin et al. 1996).

Apesar da veemente comercialização dos produtos probióticos no Brasil e no mundo, a sobrevivência das culturas deixa dúvidas e gera muitas controvérsias, uma vez que algumas culturas desses microrganismos são extremamente sensíveis a uma série de fatores como acidez, presença de oxigênio e outras culturas. Um outro problema é a dificuldade e ausência de padronização de métodos para identificação e contagem dessas culturas. A indústria de produtos funcionais é peculiar, e a colocação desses produtos no mercado, devidamente rotulados, implica não só em domínio de tecnologia, mas de ciência. A comprovação dos benefícios desses produtos deve ser documentada, e essas informações devem estar disponíveis para as organizações governamentais, para a indústria e para os consumidores. De acordo com Short (1999a), em geral, o conhecimento dos consumidores para os alimentos potencialmente benéficos contendo bactérias viáveis/probióticas é pobre. Existem muitas barreiras de comunicação sobre probióticos e o papel da dieta na modulação da flora intestinal. Entretanto, em países com programas educacionais bem planejados entre consumidores e profissionais de saúde o grau de qualidade tem-se elevado. No futuro, as alegações de saúde podem ajudar a informar os consumidores dos potenciais benéficos, mas é crucial que uma normatização apropriada da comunicação, como a desenvolvida na União Européia, pela Confereration of the Food Industries of the European Union – CIAA, sejam adicionadas e que todas as alegações sejam cientificamente substanciais (Confereration of the Food Industries of the European Union, 1999).

2.5. O modelo animal e a avaliação de microrganismos probióticos Uma importante estratégia experimental para estudar as relações que ocorrem entre os microrganismos e seus hospedeiros é a utilização de um modelo animal isento de germes. Neste caso, deve-se, primeiro, definir as funções celulares na ausência de microrganismos e depois avaliar os efeitos da adição de um único microrganismo ou de uma população definida de microrganismos. A criação de animais sob condições isentas de germes tem desenvolvido um campo científico para este propósito, a gnotobiologia. O termo gnotobiótico foi proposto para designar o campo de investigação interessado na criação de animais e plantas que estão livres de todos os microrganismos ou associados somente a espécies conhecidas (Trexler, 1978). A palavra gnotobiologia é derivada do grego

onde, “gnotos” e “biota” significam, respectivamente, flora ou fauna e conhecida (Gustafsson, 1948). Os animais isentos de germes são, de um certo modo, uma extensão do conceito de cultura pura, permitindo o estudo das interações do hospedeiro com os microrganismos sem a interferência dos organismos associados (Gordon e Pesti, 1971; Trexler, 1978).

A tecnologia da gnotobiologia depende da habilidade de controlar a composição do ambiente no qual o organismo se desenvolve e funciona. O uso combinado de organismos geneticamente manipulados e gnotobióticos têm o potencial de fornecer novas e importantes informações sobre como uma bactéria afeta o desenvolvimento normal, o estabelecimento e a manutenção do sistema imune associado à mucosa e as funções célula-epitélio. Além do mais, a gnotobiologia pode ajudar no estudo sobre as etiologias de doenças infecciosas, condições inflamatórias agudas e crônicas (Fedorak, 1995; Sartor, 1995) e, possivelmente, em tumorigênese (Gorbach e Goldin, 1990).

Desde a década de 1950, quando a produção de ratos e camundongos isentos de germes foi estabelecida, o uso desse modelo animal nas ciências biomédicas vem se expandindo. Entretanto, o estado isento de germes dá origem a uma variedade de aspectos fisiológicos, morfológicos e imunológicos diferentes daqueles encontrados na presença da microbiota normal. Esses animais possuem um grande aumento do ceco devido, em grande parte, ao acúmulo de muco que não é degradado (Gustafsson et al., 1970). As vilosidades do intestino delgado são maiores e as criptas são mais curtas e contem menos células (Alam et al., 1994). As diferenças entre os animais convencionais e os animais isentos de germe são maiores nas regiões do trato digestivo onde as densidades microbianas são normalmente maiores (Falk et al., 1998).

Além das diferenças na arquitetura geral do trato digestivo, os animais isentos de germes apresentam diferenças na motilidade intestinal, na diferenciação epitelial e na imunologia. A distribuição espacial e temporal dos complexos motores que migram no intestino delgado desses animais é mais restrita e mais lenta que em animais convencionais (Strandberg et al., 1966). Estudos em camundongos isentos de germes mostraram que a morfogênese de unidades de vilosidades da cripta pode ser completada na ausência de microrganismos. Entretanto, comparações entre esses animais e os convencionais revelaram que componentes da microbiota podem diferenciar linhagens intestinais epiteliais durante a morfogênese (Falk et al., 1998).

Os camundongos isentos de germe representam um sistema experimental para simplificar o fenômeno de resistência à colonização e os mecanismos envolvidos nesse fenômeno e também para testar a capacidade de uma terapia à base de probióticos para prevenir ou impedir a colonização por patógenos. Muitos estudos mostram que os animais isentos de germes, quando infectados por patógenos podem, em alguns casos, se mostrarem mais resistentes e, em outros, mais

susceptíveis (Vieira et al., 1998).

O experimento gnotobiótico oferece considerável potencial como uma ferramenta no estudo das relações hospedeiro-microrganismo porque: retrata o hospedeiro quando livre de germes, ou quando modificado por microrganismos conhecidos ou outras associações; permite o estudo da relação inter-microbiana dentro do organismo do hospedeiro; pode ser usado no estudo de algum fator exógeno ou endógeno onde as ações isoladas de tais fatores, afetadas ou não pela microbiota associada no hospedeiro, é de interesse (Gordon e Pesti, 1971). Esses modelos são necessários, pois o estudo das interações entre linhagens bacterianas in vitro não pode ser sempre extrapolado ao que realmente ocorre in vivo no tubo digestivo de animais gnotoxênicos (Ducluzeau, 1989). Esses animais também são uma excelente ferramenta para avaliar quais são as mudanças anatômicas, fisiológicas e imunológicas induzidas pela microbiota autóctone e alóctone na mucosa intestinal (Nicoli, 1995).

Inúmeras tentativas vêm sendo feitas para sistematizar a terminologia usada em gnotobiologia, mas nenhum sistema é universalmente aceito. A nomenclatura usada é limitada a termos que, por uso geral, é familiar e compreendida pela maioria dos pesquisadores da área. Animal isento de germe (IG) ou axênico é um animal livre de toda forma demonstrável de vida, sendo criado e mantido continuamente em isoladores. O animal gnotobiótico (GN) ou gnotoxênico é aquele inicialmente axênico mantido em isoladores em associação intencional com um ou mais tipos microbianos conhecidos. Animal heteroxênico é um animal inicialmente isento de germes, mantido em isoladores em associação com uma microbiota complexa conhecida ou não e que não é da própria espécie. O animal holoxênico ou convencional (CV) apresenta uma microbiota complexa e desconhecida na sua totalidade e é criado sem precauções especiais desde o nascimento. O animal convencionalizado é o animal ex-isento de germes que foi associado com uma microbiota normal de animais convencionais (Andremont et al., 1985; Gordon e Pesti, 1971; Gustafsson, 1984).

Os equipamentos e procedimentos correntemente em uso que permitem a manutenção do “status” gnotobiótico em animais experimentais incluem, em essência, equipamentos para transferência do feto maduro do útero para o interior de isoladores de plástico, estéreis, supridos com filtros de ar e luvas de borracha. Procedimentos de rotina incluem criação e manutenção de animais gnotobióticos em isoladores, esterilização de dietas, água, cama e outros utensílios, por autoclavação, irradiação ou filtração, quando aplicável (Ducluzeau, 1989).

Como os animais gnotobióticos permitem o estudo e reprodução de mecanismos de interação entre microrganismos e hospedeiro, que não observados por meio de experimentos in vitro (Gordon e Pesti, 1971), eles constituem um excelente modelo na avaliação do potencial probiótico de certos microrganismos (Filho-

Lima et al., 2000; Maia et al., 2001; Nardi et al., 1991; Neumann et al., 1998; Nicoli e Raibaud, 1990; Peret Filho et al., 1998; Rodrigues et al., 1996; Rodrigues et al., 2000; Silva et al., 1999).

A capacidade de Lactobacillus acidophilus UFV-H2B20 de antagonizar Salmonella enterica subsp. enterica ser. Typhimurium, e de reduzir as conseqüências patológicas para o hospedeiro foram determinadas em animais convencionais e gnotobióticos. Camundongos NIH convencionais receberam diariamente, por via oral, 0,1

ml de uma suspensão contendo em torno de 108 ufc de

L. acidophilus UFV-H2B20 e os animais sem germes receberam uma única dose de 0,1 ml. Os grupos gnotobióticos e convencionais foram desafiados

oralmente com, respectivamente, 102

e 105 ufc de S. Typhimurium 7 dias após o início do tratamento. Os grupos controles foram tratados com salina estéril em vez do Lactobacillus. Dados de sobrevida mostraram um efeito protetor contra a bactéria patogênica em ambos os grupos convencional e gnotobiótico tratados com o Lactobacillus. L. acidophilus UFV-H2B20 colonizou o trato digestivo dos camundongos gnotobióticos e o número de células víaveis flutuou entre 109 e 1010 ufc/g de fezes. Em ambos os grupos experimental e controle, S. Typhimurium se estabeleceu rapidamente numa faixa de 108 a 1010 ufc/g de fezes e se manteve em níveis elevados até os animais morreram ou serem sacrificados. Em conclusão, o tratamento prévio de camundongos com L. acidophilus UFV-H2B20 protege os animais contra a infecção experimental com S. Typhimurium, mas essa proteção não se deve à uma redução das populações patogênicas nos intestinos (Moura et al, 2001)

A produção de substâncias antagonistas por Lactobacillus murinus contra bactérias enteropatogênicas foi avaliada in vivo assim como um possível efeito protetor contra um desafio oral com Salmonella Typhimurium utilizando um modelo animal gnotobiótico. Um maior tempo médio de sobrevida (P < 0,05) foi observado nos animais associados com L. murinus (7,89 ± 3,83 dias) quando comparado com os controles (4,44 ± 0,73 dias). Lactobacillus murinus exerceu um potente efeito antagonista in vivo contra S. sonnei e com menos intensidade contra S. Typhimurium como revelado pelos halos de inibição ao redor das fezes dos animais associados com L. murinus. Os diâmetros dos halos de inibição ao redor dos conteúdos intestinais aumentaram ao longo do trato digestivo, seguindo proporcionalmente os níveis populacionais de L. murinus nas respectivas porções intestinais. Concluindo, o presente estudo mostra que a associação com L. murinus em camundongos gnotobióticos retarda a morte após um desafio oral com S. Typhimurium e que compostos inibitórios difusíveis obtidos em ensaios in vitro foram também produzidos in vivo e podem ser responsáveis por este efeito (Vasconcelos, Nicoli e Nardi, 2003).

Randazzo e Costamagna (2005) avaliaram se a ingestão oral de Lactobacillus casei exerce uma ação antagônica

na infestação de camundongos com larvas de T. spiralis (cepa BBSC 01), protegendo o hospedeiro da invasão à mucosa intestinal das fêmeas grávidas do parasito. Foram utilizados dez camundongos BALB/c, distribuídos ao acaso em dois grupos: Grupo C ou grupo controle e Grupo T ou grupo tratados com L. casei. Ao alimento do grupo C, foram inclusos 5 mL de solução fisiológica durante sete dias antes da infestação com larvas de T. spiralis. O Grupo T recebeu alimentação normal, diariamente, acrescida de 5mL de suspensão em solução fisiológica de L. casei durante sete dias, com larvas infestantes de T. spiralis. Ao oitavo dia, ambos os grupos (C e T) foram inoculados via oral com larvas infestantes de T. spiralis. Aos cinco dias após infestação, os animais foram sacrificados para determinação da carga parasitaria presente no intestino e na mucosa intestinal (fêmeas). O número médio de parasitos adultos de T. spiralis recuperados do conteúdo intestinal no grupo controle foi de 147, enquanto que no grupo tratados foi de 189, apresentando diferenças significativas para p<0,05 entre ambos os grupos analisados. O valor promédio de fêmeas recuperadas no Grupo C foi de 81 enquanto no grupo T foi de 12 fêmeas, apresentando diferenças altamente significativas para p<0,05. Os resultados obtidos indicam que o L. casei administrado pela via oral produz um efeito antagônico sobre a penetração do parasito na mucosa intestinal.

Os efeitos de S. cerevisiae 905 na translocação de Salm. Typhimurium assim como no sistema imune foram avaliados em camundongos gnotobióticos e/ou convencionais. O tratamento com a levedura reduziu significativamente a translocação de Salm. Typhimurium para o fígado em animais gnotobioticos e em todos os orgãos testados em camundongos convencionais. O número de células Küpffer por 100 hepatocitos no fígado foi significativamente mais alto (P <0.05) em camundongos mono-associados com levedura (52.9±15.7) do que nos animais controles isentos de germes (38.1±9.0). Provavelmente como consequencia, o “clearance” de &. coli B41 da circulação sangüínea foi mais eficiente em animais mono-associados de levedura quando em comparação com animais isentos germe. Os mais altos níveis (P <0.05) de IgA no conteúdo intestinal e de IgA e IgM no soro foram observados em ratos mono-associados com levedura quando em comparação com o grupo isento de germe. A proteção contra bactérias patogenéticas observadas foi provavelmente devido a uma modulação tanto da imunidade local como de sistêmica de camundongos tratados com S. Cerevisiae 905 (Martins et al, 2007).

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. Amostragem e produção de queijo de coalho estudados

Foram realizadas visitas aos locais de produção dos queijos de coalho com a finalidade de acompanhar os

processamentos artesanais e industriais e caracterizar os seus fluxogramas de fabricação (Anexo A). Foram colhidas e analisadas seis amostras de queijo de coalho produzido no estado de Pernambuco, compreendendo diferentes municípios e marcas e levando-se em consideração o prazo de validade. Duas amostras de queijo de coalho artesanal e duas do produto industrializado serão colhidas nas respectivas fazendas e indústrias onde são processadas, logo após a produção, enquanto que as outras duas amostras de queijos artesanais, de marcas diferentes, serão colhidas no mercado varejista de Recife. Em seguida, as amostras serão acondicionadas em caixas isotérmicas e mantidas sob refrigeração com gelo, para serem transportadas, via aérea, para Belo Horizonte (Minas Gerais). Imediatamente após a recepção das amostras, as mesmas serão avaliadas quanto à preservação de sua integridade e temperatura na qual foram conservadas. Cada amostra de queijo será assepticamente dividida em cinco partes equivalentes. Logo após, uma sub-amostra de cada amostra de queijo de coalho será encaminhada para os seguintes laboratórios: Laboratório de Microbiologia e Físico-Química do Departamento de Tecnologia e Inspeção de Produtos de Origem Animal (DTIPOA) da Escola de Veterinária da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG); Laboratório de Ecologia e Fisiologia de Microrganismos do Departamento de Microbiologia, do Instituto de Ciências Biológicas (ICB) da UFMG; Laboratório de Biologia Molecular de Parasitos do Departamento de Bioquímica e Imunologia, do ICB - UFMG; Laboratório de Microbiologia de Alimentos da Fundação Ezequiel Dias e Laboratório de Enterotoxinas Estafilocócicas da Fundação Ezequiel Dias, onde serão submetidas às análises laboratoriais descritas posteriormente. Uma sub-amostra será mantida congelada a -18ºC, como medida de segurança para qualquer análise a ser substituída e/ou incluída durante a realização do experimento.

3.2. Determinação de Características e Composição Físico-Químicas de Queijo de Coalho produzido em Pernambuco

Sub-amostras dos seis queijos serão encaminhadas para o laboratório de físico-química do DTIPOA - EV - UFMG, onde serão submetidas às análises físico-químicas, descritas a seguir (Brasil, 2003).

3.2.1. Determinação da acidez titulável

Serão transferidos 10 gramas de cada sub-amostra para bécker de 150 mL, onde serão acrescentados 50 mL de água deionizada morna (40ºC), isenta de gás carbônico, sendo agitado até a máxima dissolução possível. O volume será quantitativamente transferido para balão volumétrico de 100 mL, resfriado em água corrente e completado o volume com água deionizada. Uma alíquota de 50 mL será transferida para bécker de 150 mL, acrescentadas 10 gotas de solução de fenolftaleína a 1% e titulada com solução de NaOH 0,1 N, até leve coloração rósea.

A acidez titulável, em acido láctico percentual será calculada de acordo com a seguinte fórmula: AT = V x f x 0,90 M

Onde:V= volume da solução de NaOH gasto na titulação;F= fator de correção da solução de hidróxido de sódio 0,1 N;M= massa da alíquota, em gramas 3.2.2. Determinação do extrato seco total (EST) e umidade - método gravimétrico

Cápsulas serão colocadas em estufa a 105 + 2 ºC durante 1 hora. Em seguida, serão resfriadas em dessecador e pesadas. Cinco gramas de cada sub-amostra serão preparadas e homogeneizadas e levadas à estufa a 105+ 2 ºC durante 3 horas. Logo após, será esfriada em dessecador e pesada. Esta etapa será repetida até peso constante. As operações de pesagem devem ser feitas o mais rápido possível e a secagem deve ser conduzida sem que haja escurecimento da amostra.

Determinação de lipídeos de acordo com butirômetro para queijos.

Serão pesados exatamente 3 g de cada sub-amostra, sendo homogeneizadas diretamente no copo do butirômetro, acoplando o copo do butirômetro à parte inferior de forma a ficar bem vedado. Em seguida serão adicionados cerca de 5 mL de água, 10 mL de ácido sulfúrico e 1 mL de álcool isoamílico. Os butirômetros serão transferidos para banho-maria a 65 ºC para auxiliar na dissolução da amostra. Os butirômetro serão tampados e agitados até que se dissolva toda a amostra. Realizar esta agitação cuidadosamente, envolvendo o butirômetro em uma toalha de mão para evitar acidentes. Quando as amostras apresentarem-se dissolvidas, as tampas superiores dos butirômetros serão retiradas e adicionara-se água até a última marcação destes. As bordas dos butirômetros serão secas com papel absorvente e recolocaram-se as tampa. Em seguida, os butirômetros serão centrifugados por 5 minutos e assim, serão feitas as leituras da porcentagem de gordura diretamente na escala do butirômetro.

3.3. Isolamento, Enumeração, Caracterização Fisiológica e Purificação de Bactérias Ácido-Lácticas de Queijo de Coalho Artesanal e Industrial, produzido no Estado de Pernambuco

Sub-amostras de cada queijo serão encaminhadas para a pesquisa de bactérias ácido-lácticas (MAC FADDIN, 1980; IDF, 1983), a ser realizada no laboratório de Ecologia e Fisiologia de Microrganismos do ICB - UFMG. Vinte e cinco gramas de cada sub - amostra serão pesadas, trituradas e diluídas em 225 mL de salina tamponada (0,85%), correspondendo à diluição 10-1. Em seguida, serão preparadas diluições decimais até

10-8, utilizando-se o mesmo diluente descrito anteriormente.A partir de cada uma das diluições realizadas, uma alíquota de 0,1 mL será semeada na superfície de placas de Petri contendo os meios de cultura ágar MRS (Merck) e ágar M17 (Difco), suplementado com solução de lactose (Oxoid) a 10%. Em seguida, os inóculos serão espalhados com auxílio de uma alça de Drigalski.

O meio de cultura MRS (Merck) será incubado a 37ºC, durante 48 horas, em anaerobiose, dentro da câmara anaeróbia (Forma Scientific, Marietta, USA: Atmosfera 85% N2, 10% H2 e 5% CO2), enquanto que o meio de cultura M17 (Difco) será incubado a 37ºC, durante 48 horas, em aerobiose, dentro da estufa bacteriológica.

Após a incubação, será realizada a enumeração dos microrganismos por unidades formadoras de colônias (UFC), sendo consideradas placas contendo de 20 a 200 UFC. Em seguida, será realizado o cálculo de UFC/mL, multiplicando-se o número de colônias formadas por 10 e pelo inverso da diluição.

A partir de colônias apresentando aspectos morfológicos diferentes, de cada meio de cultura, serão feitos esfregaços em lâminas para coloração pelo método Gram.

Além disto, a partir dessas mesmas colônias serão feitos testes de catalase, sendo colocada uma gota de H2O2

(30%) peróxido de hidrogênio (PA) sobre a superfície de uma lâmina. Em seguida, será colocada, sobre a gota, uma alíquota de cada colônia a ser testada. A produção de gás, sob a forma de bolhas, indica que o microrganismo é produtor da enzima catalase, que, atua sobre o peróxido de hidrogênio, convertendo-o à água e oxigênio.

As colônias que apresentaram tipos morfológicos diferentes serão repicadas em triplicata para placas de Petri contendo ágar MRS (Merck) e ágar M17 (Difco) (suplementado com lactose a 10%). As placas serão incubadas a 37 ºC por 48 horas, sob tres condições de cultivo: aerobiose, microaerofilia e anaerobiose.

Os microrganismos que cresceram nos meios de cultura iniciais serão inoculados em 5 mL de Caldo MRS (Merck), sendo em seguida incubados em anaerobiose (oriundos do ágar MRS) e aerobiose (oriundos do ágar M17), à 37ºC durante 48 horas. Após o crescimento, uma alíquota de 500 L de cada tubo será transferida para tubo eppendorf e adicionada de glicerol esterilizado (50 L), sendo em seguida congelados a – 70ºC, para posterior utilização, quando necessário. O restante dos cultivos será destinado à biologia molecular, com a finalidade de identificação das espécies isoladas.

3.4. Isolamento, Enumeração, Purificação e Identificação de Microrganismos Patógenos (Coliformes a 30ºC e 45ºC, Escherichia coli O157:H7, Salmonella spp., Listeria spp.)

presentes em Queijo de Coalho artesanal e Industrial, produzido no Estado de Pernambuco

Seis sub-amostras, sendo uma de cada queijo de coalho, serão encaminhadas, sob refrigeração, para a pesquisa de bactérias patogênicas, a ser realizada no laboratório de Microbiologia de Alimentos da Fundação Ezequiel Dias.

3.4.1. Pesquisa de coliformes a 30ºC - tubos múltiplos (APHA, 2001)

Vinte e cinco gramas de cada amostra serão pesadas e diluídas em 225 mL de água peptonada tamponada. Em seguida, serão feitas diluições decimais e inoculado 1 mL de cada uma em tubos contendo caldo lactosado bile verde brilhante (Difco). Os mesmos serão incubados a 30ºC, durante 48 horas. A presença de gás nos tubos de Duhram invertidos sugere a presença de coliformes.

A seguir, amostras do caldo anterior, onde houver produção de gás, serão repicadas em ágar EMB-LEVINE (Biobrás), sendo incubadas a 30ºC, durante 48 horas, para a confirmação do resultado anterior. O crescimento de colônias de microrganismos confirma o teste.

A determinação do Número Mais Provável (NMP) de coliformes a 30ºC será realizada utilizando-se a tabela de Hoskins (APHA, 2001).

A identificação das espécies que crescerem no ágar EMB-LEVINE (Biobrás), será feita por intermédio de provas bioquímicas, utilizando-se o meio IAL (Rugai modificado) (Merck).

3.4.2. Pesquisa de coliformes a 45ºC (APHA, 2001)

Alíquotas de caldo lactosado bile verde brilhante (Difco) dos tubos contendo microrganismos produtores de gás, serão semeadas em tubos contendo caldo EC (Merck). Os mesmos serão incubados a 45ºC, durante 48 horas. A presença de gás nos tubos de Duhram invertidos, indicará a presença de coliformes a 45ºC.

A determinação do Número Mais Provável (NMP) de coliformes a 45ºC será realizada utilizando-se a tabela de Hoskins (APHA, 2001).

A identificação das espécies que crescerem no caldo EC (Merck) e produzirem gás será feita por intermédio de provas bioquímicas, utilizando-se o meio IAL (Rugae modificado) (Merck).

3.4.3. Pesquisa de Escherichia coli O157:H7 (Food and Drugs Administration, 2001)

Vinte e cinco gramas de cada sub-amostra serão pesadas e diluídas em 225 mL de caldo TSB (caldo soja tryptcase, suplementado com novobiocina) (Merck). Em seguida, os mesmos serão incubados a 37ºC, durante 24

horas. De cada caldo incubado anteriormente, 0,1 mL será espalhado sobre a superfície de placas de Petri, contendo ágar MacConkey (Merck), adicionado de sorbitol. As placas serão incubadas a 37ºC, durante 24 horas. As colônias típicas que crescerem (transparentes) serão submetidas à identificação por provas bioquímicas, utilizando-se o cartão Vitek.

3.4.4. Pesquisa de Salmonella spp. (APHA, 2001)

Vinte e cinco gramas de cada sub-amostra serão pesadas e diluídas em 225 ml de caldo nutriente (Difco), que será incubado a 37ºC, durante 24 horas. De cada caldo anterior, 1 mL será inoculado em 10 mL de caldo selenito cistina (Merck) e 0,1 mL em 10 mL de caldo Rappaport (Difco), que serão incubados a 37ºC, durante 24 horas. Amostras destes caldos serão semeadas na superfície de placas de Petri, contendo ágar Hecktoen (Merck), ágar Ramback (Oxoid) e ágar XLD (Synth) e ágar SS (Salmonella - Shigella) (Oxoid), que serão incubados a 37ºC, durante 24 - 48 horas As colônias que crescerem nestes meios de cultura serão repicadas para ágar LIA (ágar lisina ferro) (Merck), TSI (ágar tríplice açúcar ferro) (Merck) e IAL (Rugae modificado) (Merck), sendo incubadas a 37ºC, durante 24 - 48 horas. A identificação das espécies será feita por intermédio do cartão Vitek.

3.4.5. Pesquisa de Listeria spp. (IDF 1995; SILVA, 1996).

Vinte e cinco gramas de cada sub-amostra serão pesadas e diluídas em 225 mL de caldo de enriquecimento primário para Listeria LEB 1 (“Listeria Enrichment Broth”) (Difco), sendo então, incubados a 30ºC, durante 48 horas. Em seguida, alíquotas do cultivo anterior serão semeadas, por estria, na superfície de ágar Oxford (Oxoid) e ágar Palcam (Oxoid).

A partir dos meios Oxford (Oxoid) e Palcam (Oxoid), cinco a oito colônias que apresentarem crescimento típico (colônias pequenas, cinza e ou negras, convexas e de contornos regulares) serão repicadas para ágar TSA (ágar tríplice açúcar) (Merck), adicionado de 0,6% de extrato de levedura e incubadas a 37ºC por 24 horas, para purificação. Após crescimento, colônias típicas (pequenas, regulares, com aparência azulada) serão submetidas aos testes bioquímicos para confirmação de Listeria spp.

Os testes para identificação de Listeria spp. e das diferentes espécies do gênero Listeria baseiam-se na reação de hemólise em ágar sangue de carneiro, motilidade (característica em ágar semi-sólido), utilização da esculina, hidrólise da uréia, comportamento em ágar TSI (ágar tríplice açúcar ferro) (Merck), teste da catalase, redução de nitrato a nitrito, reação de Voges-Proskauer, reação de vermelho de metila, fermentação de carboidratos (xilose, glicose, maltose, ramnose e manitol). Adicionalmente, será realizada a identificação das espécies de Listeria por

intermédio do cartão Vitek.

3.5. Isolamento, Enumeração, Purificação e Identificação de Staphylococcus spp. e suas Enterotoxinas (Carmo, 2001)

Seis sub-amostras, sendo uma de cada queijo de coalho, serão encaminhadas, sob refrigeração, para a pesquisa de Staphylococcus spp. e suas enterotoxinas, a serem realizadas no laboratório de Enterotoxinas Estafilocócicas da Fundação Ezequiel Dias.

3.5.1. Isolamento e identificação do microrganismo

Sobre a superfície do ágar Baird Parker (Oxoid) contido nas placas de Petri, será espalhado 0,1 mL de cada diluição preparada em série, para cada sub-amostra de queijo, e espalhadas, até completa absorção, com auxílio de alça de Drigalski, esterilizada ou previamente imersa em álcool e flambada. As placas serão mantidas em posição normal por alguns minutos para assegurar a absorção do inóculo, sendo então, incubadas a 35-37°C durante 48 horas.

Colônias típicas e atípicas serão selecionadas para confirmação, através da confecção de esfregaços corados pelo método de Gram, da presença de cocos Gram positivo. Serão selecionadas, de preferência, as placas que apresentaram contagens entre 25 e 250 colônias suspeitas de Staphylococcus e confirmadas pela prova do Gram. As colônias que apresentarem coloração negra brilhante, forma arredondada, convexa, com bordos regulares, puntiformes, circundados por um halo branco de lipase e um outro externo, maior, transparente, devido a ação da lecitinase, serão selecionadas como colônias típicas. As colônias que se apresentarem sem halo, ou com apenas um, negras ou cinza, mucosas com ou sem brilho serão selecionadas como atípicas. Após contagem das placas selecionadas, serão anotados separadamente os resultados obtidos para colônias típicas e atípicas. O resultado será multiplicado pelo inverso da diluição e por 10, resultando em UFC de Staphylococcus spp. por mililitro do produto (Lachica et al.; 1969; Lancette e Tatini, 1992).

3.5.2. Caracterização bioquímica

Diferente número de colônias, de preferência de diluições mais altas e representativas de cada amostra analisada, será pescado das placas contendo ágar Baird Parker (Oxoid) após a confecção do teste de Gram, e transferidas com auxílio de alça de platina previamente flambada, para tubos de hemólise contendo 1,0 mL de Caldo Infuso Cérebro Coração (BHI) (Merck) e incubados a 37°C por 24 horas. A partir de cada subcultivo, após a divisão deste em 0,5 mL em diferentes tubos de hemólise, as cepas serão submetidas às provas da coagulase livre, prova da termonuclease,

prova de fermentação da maltose, fermentação do manitol e hemólise em ágar sangue de carneiro. A partir dos resultados das provas de fermentação da maltose e fermentação do manitol, será realizada a prova da catalase, segundo metodologia proposta por Kloos (1990).

3.5.3. Prova da coagulase

A enzima pesquisada no presente estudo será a coagulase livre uma vez que esta é produzida durante o cultivo do microrganismo em caldo. A verificação da ação da enzima será realizada após 4 horas de incubação e depois deste tempo, a cada 2 horas durante período de 24 horas. Os tubos contendo subcultivos das cepas apresentando reações características, por formação de coágulo firme e organizado, serão considerados positivos para a prova.

3.5.4. Prova da termonuclease

As lâminas preparadas com os subcultivos a serem testados e utilizadas na prova serão incubadas a 37°C em câmara úmida (placa de Petri contendo papel filtro ou algodão embebido em água destilada). A leitura será feita após 4 horas de incubação, sendo a leitura refeita ao final de 24 horas de incubação. A prova será considerada positiva quando houver formação de um halo róseo contendo frações de nucleotídeos solúveis, procedentes da degradação do DNA, estendendo-se por pelo menos 1 (um) milímetro além do diâmetro da cavidade preparada no ágar.

3.5.5. Prova da fermentação da maltose e manitol

Os meios utilizados para a realização destas provas (acrescidos dos açúcares manitol e maltose a 10%), apresentarão pH alcalino e terão como indicador de coloração, o púrpura de bromocresol. Algumas espécies de estafilococos podem utilizar tais açúcares como fonte de carboidrato com conseqüente produção de ácido láctico, tornando o meio para a cor amarela, caracterizando o resultado positivo para as provas.

3.5.6. Prova da hemólise em ágar sangue

O meio utilizado nesta prova não é seletivo para o crescimento de microrganismos. Dependendo do tipo de hemolisina produzida, o ágar apresenta-se com reações de hemólise, parcial, total ou dupla hemólise, caracterizadas pela formação de halos ao redor da estria realizada no ágar à partir de subcultivos de 24 horas de incubação do microrganismo em caldo BHI, ou sem reação de hemólise.

3.5.7. Cultura estoque

Após o isolamento e caracterização das cepas, com auxílio de alça de platina ou níquel-cromo, cada inóculo das cepas originárias do crescimento em ágar sangue será transferido para tubos de ensaio contendo TSA

(Merck) inclinado e identificados segundo a diluição e o tipo de colônia (cultura estoque).

3.5.8. Indução da produção de enterotoxinas

As toxinas utilizadas como padrão neste estudo, bem como os anti-soros específicos, serão gentilmente cedidos pelo Dr. Luiz Simeão do Carmo, do Laboratório de Enterotoxinas Estafilocócicas da Fundação Ezequiel Dias.

Após finalizar a identificação das espécies de Staphylococcus pelas provas bioquímicas, uma porção das cepas oriundas da mesma amostra e que apresentarem perfil bioquímico idêntico será transferida, com auxílio de alça de platina ou níquel-cromo, para um tubo contendo 5 mL de caldo BHI e incubada a 37°C por 24 horas, fazendo-se um “pool” das culturas. As soluções-tampão utilizadas serão cuidadosamente preparadas. Placas serão preparadas com 20 mL de ágar BHI simples, acrescidas de 1% de extrato de levedura e fosfato de potássio, recobertas com disco de celofane, com diâmetro idêntico ao da placa, esterilizado. Com auxílio de alça de Drigalski flambada, após a acomodação cuidadosa do celofane sobre o ágar, 0,5 mL do pool das culturas preparado será espalhado e as placas serão incubadas a 37°C por 24 horas. Será utilizado 2,5 mL de tampão PBS (0,02 M e pH 7,4) para lavar o cultivo obtido em duas etapas, usando 1,5 mL e 1,0 mL do tampão, respectivamente. O líquido resultante será transferido com auxílio de Pipeta Pasteur para tubo de centrífuga de 10 mL e centrifugado sob refrigeração a 4°C por 10.000 g por 10 minutos. Aos sobrenadantes, serão adicionadas 2 gotas de Timerosal (1:10.000) como conservante e, estes serão analisados para a presença de enterotoxinas e TSST-1 pelo método de OSP (“Optimum Sensitivity Plate”) (Robbins et al., 1974).

Segundo Robbins et al. (1974), no método de OSP, 3 mL do ágar Nobre fundido serão adicionados a placas de Petri estéreis plásticas de 50 x 12 mm, com tampas bem ajustadas. Após solidificação do ágar, este será perfurado de modo a apresentar sete orifícios ou “wells”. O modelo para a perfuração do ágar será confeccionado pelo "Food Research Institute" (Madison, Wisconsin, EUA). O anti-soro específico na diluição (1:16) é colocado no orifício central, as toxinas padrão (4 g/mL) são colocadas nos dois orifícios menores e o fluido sobrenadante das culturas é colocado em quatro orifícios maiores nas posições laterais. As placas serão colocadas em câmara úmida fechada e incubadas por 24 horas a 37°C. Reações positivas são determinadas pela formação de linhas de precipitina entre os orifícios contendo os fluidos sobrenadantes das culturas e o orifício central contendo o anti-soro. Pode-se melhorar a visibilidade das linhas de precipitação pela adição de ácido fosfórico (H2PO4) por poucos segundos.

3.6. Identificação Molecular, ao nível de Espécies, de Bactérias Ácido-Láctico Isoladas de

Queijo de Coalho produzido no Estado de Pernambuco.

A extração do DNA total dos microrganismos isolados nos meios de cultura ágar MRS e ágar M17 serão realizadas a partir do cultivo recente em caldo MRS, incubado sob anaerobiose ou aerobiose, a 37ºC, durante 24 horas, como descrito anteriormente.

3.6.1.Extração de DNA total

3.6.1.1. Obtenção das células sem parede e sem membrana

De cada cultivo dos microrganismos que crescerem em caldo MRS, 10 mL serão centrifugados a 3.500 rpm, durante 30 minutos, à temperatura de 4ºC, para obtenção dos pellets. Os sobrenadantes serão descartados. Os pellets serão ressuspensos em 1 mL de cloreto de lítio (5 M), transferidos para tubos eppendorf e incubados sob agitação à temperatura ambiente, por uma hora, com finalidade de extrair proteínas associadas à parede bacteriana. Em seguida, os tubos serão centrifugados a 14.000 rpm, durante 5 minutos, descartando-se os sobrenadantes. Os pellets serão ressuspensos e lavados com 1 mL de água deionizada, autoclavada, para retirar o excesso de sal. Os tubos serão centrifugados a 14.000 rpm, durante 5 minutos e os sobrenadantes descartados. Os pellets serão ressuspensos em 1 mL de tampão para protoplastos (50mM Tris HCl pH 8,0; 10 mM EDTA; 10 mg de lisozima mL-1) sendo 200 L de enzima e 800 L de tampão com RNAse, e incubados por uma hora, sob agitação a 37ºC. Os tubos serão centrifugados a 14.000 rpm, durante 5 minutos e os sobrenadantes serão descartados. Em seguida, os pellets serão lisados com a adição de 2% de dodecil sulfato de sódio (SDS) em tampão TE com RNAse (para cada tubo, será utilizado 500 L de TE e 100 L de SDS a 10%).

3.6.1.2. Extração com fenol – clorofórmio

Em cada tubo, serão acrescentados 600 L de fenol, sendo agitados à temperatura ambiente, durante 5 minutos. Em seguida, os mesmos serão centrifugados a 14.000 rpm, à 20ºC, durante 10 minutos. Os sobrenadantes serão transferidos para tubos contendo

600 L de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1), sendo agitados à temperatura ambiente, durante 5 minutos. Em seguida, os mesmos serão centrifugados a 14.000 rpm, à 20ºC, durante 5 minutos. Os sobrenadantes serão transferidos para tubos contendo 600 L de clorofórmio:álcool isoamílico (24:1), sendo agitados à temperatura ambiente, durante 5 minutos. Em seguida, os mesmos serão centrifugados a 14.000 rpm, à 20ºC, durante 5 minutos. Os sobrenadantes serão transferidos para tubos contendo 600 L de isopropanol, sendo centrifugados a 14.000 rpm, durante 30 minutos, para precipitação do DNA. Os sobrenadantes serão retirados e os pelletes serão lavados com 500 L de etanol (70%), sendo centrifugados a 14.000 rpm, durante 10 minutos, a 20ºC. O álcool será retirado e o pellet será ressuspenso em 50 L de TE sem RNAse.

3.6.1.3. Eletroforese em gel de agarose

Com o objetivo de visualizar a quantidade de DNA total extraído na etapa anterior, as amostras serão submetidas à eletroforese em gel de agarose. Cinco L de cada amostra de DNA total extraído serão misturados a 1 L de tampão (glicerol adicionado de azul de bromofenol). Em seguida, será realizada a eletroforese em gel de agarose (1%), adicionado de 3 L de brometo Paralelamente, no mesmo gel será utilizado também o marcador de peso molecular. de 1 Kb. Ao término da corrida, os géis serão fotografados de áeletídeo, utilizando 100V, durante 40 minutos

3.6.1.4. Reação de Polimerização em Cadeia (PCR)

Posteriormente, as amostras de DNA total serão submetidas à reação de PCR, visando amplificar a região intergênica espaçadora entre as sub-unidades ribossomais (16S – 23S) de BAL, de acordo com metodologia proposta por Tissala-Timisjarvi ; Alatossava (1997). Esta região do DNA é bastante variável entre as espécies de microrganismos, porém, bastante conservada em microrganismos da mesma espécie, sendo então, utilizada em pesquisas de identificação microbiana, ao nível molecular.

Em seguida, os tubos eppendorf, contendo as amostras, serão colocados dentro da máquina Termocicladora “MJ Research”, sendo utilizado o seguinte programa:

Quadro 2: Programa utilizado para obtenção dos produtos da PCR

Desnaturação 95º C 2 minutos e 30 segundos94º C 30 segundos

Anelamento 55º C 1 minutoExtensão 72º C 1 minutoExtensão final 72º C 10 minutos

4º C Tempo indefinido

Posteriormente, 5 L de cada produto de PCR serão misturados com 1 L do tampão glicerol com azul de bromofenol, e então, serão submetidos à nova eletroforese em gel de agarose (1,4%), adicionado de 3 L de brometo de etídeo, utilizando 100V, durante 45 minutos. Ao final da corrida, os géis serão fotografados, para visualização das regiões amplificadas.

3.6.1.5. Digestão dos produtos de PCR 16S-23S

Após a obtenção dos produtos de PCR, os mesmos serão digeridos com enzimas de restrição, de acordo com compilação de seqüências de nucleotídeos disponíveis no “GenKank”para a identificação das espécies de BAL. As enzimas a serem utilizadas serão: Sph I, Nco I, Nhe I (que cortam o DNA dentro do gene 16S), Ssp I, Sfu I, Dra I, Vsp I, Eco RI (que cortam o DNA na região espaçadora), Hinc II ou Hpa I e Hind III (que cortam o DNA dentro do gene 23S). Também será utilizada a enzima Eco RV, que corta o DNA de Lactobacillus do grupo casei na região intergênica 16S-23S e dentro do gene 23S no grupo acidófilo. Como algumas destas enzimas necessitam de BSA (albumina sérica bovina) para sua melhor atividade, serão preparadas duas misturas diferentes (com e sem BSA).Após o preparo dos tubos, os mesmo serão mantidos à 37ºC, durante uma a seis horas, para haver a reação de digestão enzimática. Em seguida, 5 L de cada produto de digestão serão misturados com 1 L do tampão glicerol com azul de bromofenol, e então submetidos à eletroforese em gel de agarose (1,4%), adicionado de 3 L de brometo de etídeo, utilizando 100V, durante 45 minutos. Os resultados serão fotografados e o perfil de digestão de cada produto de PCR será comparado com o perfil de digestão característico de cada espécie de BAL.

3.6.1.6. Seqüenciamento dos produtos de PCR

Para melhor identificação dos microrganismos isolados, será feito também o seqüenciamento de seus DNA’s (Tannock et al., 1999), principalmente para aqueles que não forem identificados pelo perfil de digestão. Esta análise será realizada no Núcleo de Análise de Genoma e Expressão Gênica (NAGE) no ICB – UFMG.

Para obtenção do DNA purificado, as bandas dos géis de agarose, após a reação de PCR, serão cortadas, e será utilizado um kit específico (Concert Gel Extraction Kit – Gibco BRL, Life Technologies - EUA). O DNA purificado será clonado em vetor Escherichia coli XL1 "blue" competente. As células transformadas serão cultivadas em meio LB, suplementado com ampicilina. De cada placa, algumas colônias serão escolhidas e transferidas para tubos contendo caldo LB, suplementado com ampicilina. Os mesmos serão incubados à 37ºC, sob agitação (200 rpm) “overnight”, para preparo do “miniprep”. Os plasmídeos serão extraídos pelo “miniprep” e submetidos à digestão com Eco RI, para verificação das clonagens. Os clones que receberam corretamente o inserto (produto de PCR 16S - 23S dos DNA’s das BAL) serão adicionados dos

"primers" específicos, para realização da reação de seqüenciamento, em máquina “MegaBACE DNA Analysis Systems – Amersham Biosciences - EUA”, em combinação com o sistema de sequenciamento automatizado “MegaBACE 100”. Os resultados desta análise (seqüência de pares de base dos DNA’s) serão comparados com as seqüências existentes no banco de dados de DNA, utilizando o algorítmo BLAST (Altschul et al., 1990), para confirmação das espécies de BAL, isoladas dos queijos de coalho.

3.7. Pesquisa de Antagonismo In Vitro de Bactérias Ácido-Lácticas frente a Patógenos da Microbiota de Queijo de Coalho Artesanal e Industrial, produzido em Pernambuco (Tagg et al., 1976)

Para a realização dos testes de antagonismos, as bactérias isoladas dos queijos de coalho serão previamente cultivadas em seus respectivos meios de cultura. Para as BAL será utilizado caldo MRS (Merck), incubando-se a 37ºC, durante 24 horas, sob anaerobiose. Para os Staphylococcus, será utilizado caldo BHI (Merck), incubando-se a 37ºC, durante 24 horas, sob aerobiose. Após duas ativações, 5 L de cada cultivo de microrganismo serão colocados sobre a superfície de uma placa de Petri, contendo ágar MRS (Oxoid), que será incubado, sob anaerobiose, a 37ºC, durante 48 horas. Após este período, as placas serão retiradas da câmara de anaerobiose e será colocado clorofórmio nas tampas, deixando-se agir por 30 minutos. Com isto, espera eliminar os microrganismos que cresceram e possibilitar apenas a presença das supostas substâncias inibidoras. A seguir, serão colocados 3,5 mL de ágar semi-sólido, contendo as bactérias reveladoras: BAL isoladas anteriormente, Staphylococcus spp. isolados anteriormente e cepas de patógenos referência (Bacillus cereus; Staphylococcus aureus ATCC29213; Salmonella enterica var Typhimurium ATCC12228; Yersinia enterocolitica ATCC; Listeria monocytogenes ATCC15313; Salmonella enterica var Typhi ATCC14028; Shigella flexneri; Pseudomonas aeruginosa e Escherichia coli ATCC25723), recém-cultivadas em caldo MRS (Merck) e caldo BHI (Merck). Para todos os microrganismos reveladores serão feitas duas ativações. Após crescimento dos microrganismos incubados nos caldos anteriores, 10 L dos mesmos serão transferidos para o ágar semi-sólido, que será então vertido sobre as placas de ágar MRS (Oxoid), após os 30 minutos de ação do clorofórmio. As placas serão incubadas a 37ºC, durante 24 horas, sob aerobiose ou anaerobiose, dependendo da característica de cultivo da amostra reveladora. Então, a leitura dos possíveis halos de inibição será feita (Tagg et al., 1976).

3.7.1. Análise estatística

Os resultados obtidos serão submetidos à análise estatística não paramétrica, sendo que a comparação entre as médias dos diferentes tratamentos realizados será feita de acordo como teste de Kruskal-Wallis, utilizando o programa SAEG 7.0 (Sampaio, 1998).

3.8. Susceptibilidade aos Antimicrobianos de Bactérias Ácido-Lácticas e Staphylococcus spp Isolados de Queijo de Coalho Artesanal e Industrial, produzido no Estado de Pernambuco (Charteris et al., 1998; NCCLS, 2003)

O antibiograma será realizado de acordo com a técnica de susceptibilidade antimicrobiana, baseando-se na difusão da droga, utilizando-se discos contendo antimicrobianos e medindo-se o diâmetro dos halos de inibição.

As amostras de microrganismos isolados e selecionados dos queijos, serão cultivadas em ágar MRS (Oxoid) e ágar BHI (Merck), sendo posteriormente transferidas tubos contendo 3,5 mL de salina 0,85%, para obter-se concentração correspondente à 0,5 na escala Mc Farland (108 UFC/mL). Em seguida, serão feitos inóculos, utilizando zaragatoa, sobre a superfície de placas (14 cm de diâmetro), contendo ágar MRS (Oxoid) e ágar Müller-Hinton (Oxoid). Logo após, serão distribuídos os discos (Oxoid) contendo os antimicrobianos. As placas serão incubadas em aerobiose ou anaerobiose, durante 48 horas a 37ºC. Serão utilizadas drogas pertencentes aos seguintes grupos químicos: (1) inibidores de síntese de parede celular - penicilinas e cefalosporinas; (2) inibidores de síntese de proteínas - aminoglicosídeos, tetraciclinas, cloranfenicol e macrolídeos e (3) inibidores da síntese de ácidos nucleicos - quinolonas.

Após a incubação, com auxílio do paquímetro digital, serão feitas as leituras dos diâmetros dos halos de inibição. 3.9. Avaliação de Características Probióticas - Capacidade de Colonização do Trato Gastrointestinal e do Efeito de Proteção Contra Salmonelose Experimental em Camundongos Gnotobióticos e Convencionais por Bactérias Ácido-Lácticas Isoladas de Queijos de Coalho, Produzidos no Estado de Pernambuco

3.9.1. Animais de experimentação

3.9.1.1. Animais isentos de germes

Serão utilizados camundongos isentos de germes da linhagem NIH (Taconic, Germantowen, USA), de 21-24 dias de idade e de ambos os sexos. Os animais serão propagados no biotério de Gnotobiologia do Departamento de Bioquímica e Imunologia, Instituto de Ciências Biológicas (ICB) da UFMG, e mantidos em isoladores flexíveis do tipo Trexler (Standart Safety Equipment Company, Pallatine, IL, USA), de acordo com as normas tecnicas estabelecidas por Pleasants (1974), adaptadas as nossas condições (Silva, 1986). Para os experimentos os animais serão retirados dos isoladores e mantidos em microisoladores (UNO Roestvaststaal B. V., Zevenaar, The Netherlands) no biotério do Departamento de Microbiologia, ICB-

UFMG. Os animais receberão ração sólida (Nuvilab Nuvital, Curitiba, PR, Brasil) autoclavada e água esterelizada por calor umido, ad libitum.

3.9.1.2. Animais convencionaisSerão utilizados camundongos convencionais, suíços (NIH), com 21-24 dias de idade, de ambos os sexos, provinientes do biotério do ICB/UFMG. Estes camundongos serão derivados de matrizes isentas de germes inoculadas com diluição fecal filtrada (3μm) de animais convencionais sadios, sendo usados somente os camundongos a partir da segunda geração após a convencionalização. Os animais serão alimentados com ração convencional para roedores (Nuvilab Nutival, Curitiba, PR, Brasil) e água filtrada ad libitum e mantidos em biotério aberto do Departamento de Microbiologia, ICB-UFMG.

3.9.2. Manejo dos animais

A manutenção, assim como o uso dos animais nos experimentos serão conduzidos respeitando o “Guide to the care and use of experimental animal”, Canadian Council on Animal Care, vol. 1, 1993.

3.9.3. Análises dos animais isentos de germes

3.9.3.1. Obtenção dos animais gnotobióticos

A associação com os animais isentos de germes (IG) para a obtenção do modelo gnotobiótico (GN) será feita a partir da utilização de espécies de BAL isoladas dos queijos de coalho a serem selecionadas.

3.9.3.2. Tratamentos e desafios

Os animais de cada grupo experimental receberão um único inoculo intragástrico de 0,1 ml de solução salina contendo aproximadamente 109 ufc/ml das espécies de BAL, isoladas de queijo de coalho, selecionadas para essse experimento. Os animais do grupo controle receberão solução salina tamponada estéril. Após 10 dias, todos os animais dos grupos receberão 0,1 ml de solução salina tamponada contendo aproximadamente 103 ufc/ml de Salmonella enterica sorov. Typhimurium por inoculação intrgástrica.

3.9.3.3. Determinação da capacidade de espécies de BAL de colonizar o trato digestivo de camundongos isentos de germes

A determinação dos níveis populacionais das BAL a serem testadas irá mostrar a sua capacidade de sobrevivência e tolerância às condições adversas do trato digestivo e sua capacidade de colonizar o trato gastrointestinal em modelo animal, avaliando assim as características probióticas dessas BAL isoladas de queijo de coalho.

As BAL a serem testadas serão crescidas em meio MRS (Oxoid) a 37ºC por 24-48 horas, centrifugadas a 3.000 rotações por minuto (rpm) por 10 minutos para

formação de um pellet bacteriano, desprezado o sobrenadante (meio MRS), o pellet será ressuspenso em solução salina estéril e inoculado nos animais. Cada animal irá receber um inóculo único por inoculação intragástrica e a colonização será avaliada, durante 10 dias, pela contagem do número de bactérias presentes nas fezes dos animais. Nos dias 1, 2, 4, 7 e 10, após o inóculo, as fezes dos animais serão colhidas por estimulação anal. As fezes recentemente colhidas serão homogeneizadas em solução salina estéril tamponada numa diluição 10-2 (Rodrigues et al., 1996). Diluições decimais serão feitas no mesmo diluente. Uma alíquota de 0,1 ml, das diluições decimais, serão plaqueadas sobre ágar MRS (Oxoid) e incubadas a 37ºC por 48 horas, sob anaerobiose (Forma Scientific, Marietta, USA: Atmosfera 85% N2, 10% H2 e 5% CO2) para posterior contagem do número de colônias crescidas em cada placa. A quantidade de bactérias presentes nas fezes será determinada pelo número de colônias desenvolvidas nas placas (UFC/ml) multiplicadas pelo fator de diluição.

3.9.3.4. Teste de antagonismo “in vivo”

Para a avaliação da colonização do trato gastrointestinal, pelas BAL e pela Salmonella Typhimurium e para avaliar as possíveis relações de antagonismo no trato gastrintestinal de camundongos gnotoxênicos serão realizadas análises microbiológicas quantitativas nas fezes frescas dos camundongos gnotobióticos, obtidas por estimulação anal, que serão diluídas em salina esterilizada tamponada. As fezes serão coletadas no 1°, 2°, 4°, 7° e 10° dia após o desafio. Para contagem da cultura patogênica, alíquotas de 0,1 ml das diluições decimais adequadas serão plaquadas sobre ágar MacConkey (DIFICO) e incubadas a 37 °C por 24 horas, sob aerobiose. Para a contagem da cultura de BAL, as mesmas diluições, serão plaqueadas sobre agar MRS (Oxoid) a 37 °C por 48 horas em câmara de anaerobiose.3.9.3.5. Sobrevivência e sobrevida

Durante o experimento, os camundongos gnotobióticos terão registradas as mortes decorrentes da infecção experimental por Salmonella Typhimurium para posterior comparação das taxas de sobrevida e sobrevivência dos animais do grupo controle e do(s) grupo(s) experimental(is).

3.9.4. Análises dos animais convencionais

3.9.4.1. Tratamentos e desafio

Os animais do(s) grupo(s) experimental(is) receberão diariamente por via intragástrica 0,1 ml de solução salina contendo aproximadamente 109 ufc\ml de espécies de BAL a serem selecionadas. Os camundongos do grupo controle receberão diariamente 0,1 ml de solução salina tamponada. Após 10 dias todos os grupos receberão por via intragástrica 0,1 ml de solução salina tamponada contendo aproximadamente 105 ufc\ml de Salmonella Typhimurium.

3.9.4.2. Ganho de peso, sobrevida e sobrevivência

Durante o experimento, os camundongos convencionais serão pesados em dias alternados. Também serão registradas as mortes decorrentes da infecção experimental para posterior comparação das taxas de sobrevida e sobrevivência dos animais do grupo controle e do(s) grupo(s) experimental (is).

3.9.5. Análises histológicas

Todos os animais isentos de germes e convencionais que sobreviverem à infecção experimental por Salmonella Typhimurium serão sacrificados por deslocamento cervical ao final do experimento. Após o sacrifício, serão retiradas amostras de intestino delgado e grosso, baço e figado desses animais pertencentes a cada um dos grupos (controle e experimental). As amostras serão fixadas em formaldído 4% tamponado e processadas para inclusão e microtomia em parafina. Serão excecutados corte de 3 a 5 μm de espessura e os fragmentos obtidos serão corados pela hematoxilina-eosina (HE). As amostras serão analisadas em microscopia ótica convencional. A morfometria das amostras será realizada utilizando um programa de análise de imagens (KS 300-ZEISS) acoplado a um computador (Puglisi et al., 1995).

3.9.6. Análises estatísticas

Serão utilizados os seguintes métodos para o tratamento estatístico dos dados: Teste Log-Rank, para avaliação da sobrevida e comparação das curvas de sobrevivência (p ≤ 0,05); Análise de variância, para comparação dos níveis populacionais das bactérias nos experimentos dos animais gnotobióticos e dados ponderais dos animais convencionais, utilizando-se do processo de diferença mínima significativa (dms) para comparação das médias (p ≤ 0,05).

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1. Processamento dos queijos de coalho

Durante as visitas realizadas aos laticínios e fazendas produtores de queijo de coalho industrial e artesanal, respectivamente, o processamento deste alimento nestas localidades foi documentado. Os fluxogramas de fabricação foram detalhados e são apresentados no Anexo A. Foram observadas as condições de processamento dos queijos, desde a obtenção do leite nas fazendas e recepção nos laticínios até a fase de expedição.

4.1.1. Produção industrial de queijo de coalho

A produção industrial de queijo de coalho foi documentada em dois laticínios do estado de Pernambuco, localizados na regiões do Agreste (São Bento do Una) e da Zona da Mata (Água Preta).

4.1.1.1. Laticínio BL

Neste laticínio, a coleta do leite era granelizada (70%) ou em latões (30%), sendo que estes eram recebidos até às 10:30 da manhã. O volume diário de leite recebido era de 60 a 70 mil litros. O teste do alizarol a 70% era realizado para avaliar a estabilidade térmica da matéria-prima. Existiam 100 fornecedores de leite, sendo que o pagamento era realizado por volume e qualidade, avaliada somente pelo índice crioscópico. Além da fabricação de queijo de coalho, principal produto deste laticínio, também eram processados leite pasteurizado tipo “C”, queijo Prato, bebida láctea e coalhada.

Periodicamente, o controle de qualidade da matéria-prima era feito incluindo as seguintes análises: redutase, crioscopia e teor de gordura. Entretanto, não eram realizados importantes testes que são fundamentais para a indústria queijeira, como: pesquisa de resíduos de inibidores, contagem de células somáticas e determinação do teor de proteínas. Estes índices estariam relacionados com a viabilidade de utilização do leite cru para a produção de queijos, bem como auxiliaria na previsão do rendimento industrial e na remuneração mais apropriada dos fornecedores. Os produtos fabricados apresentavam 21 dias de validade, sendo comercializados na região de Garanhuns e em Recife, e, eram periodicamente analisados quanto às pesquisas de bolores e leveduras, coliformes e Staphylococcus aureus não sendo informado nenhum resultado dessas análises.

De acordo com o que foi observado neste laticínio, pode-se verificar durante visita ao local, a adoção de algumas medidas importantes do Programa de Boas Práticas de Fabricação para a elaboração de queijo de coalho. Entretanto, mais cuidados com o ambiente de fabricação dos queijos deveriam ser observados. O acúmulo de resíduos e sujeiras na recepção e o vazamento de leite neste local, conforme foi observado no local deveriam ser evitados, pois podem comprometer a qualidade microbiológica do ambiente, servindo como focos de contaminação.

O sistema de limpeza e desinfecção dos equipamentos era realizado com a utilização de detergente alcalino (soda), detergente ácido (peracético ou nítrico) e sanitizante (cloro). Somente utilizava-se o sistema “clean in place” (CIP) no pasteurizador. A água industrial poderia apresentar dureza elevada, como característica daquela região de solo árido e calcário, sendo apenas clorada. Este fato poderia comprometer a ação do detergente alcalino, pois o cálcio e o magnésio presentes neste tipo de água podem se associar ao sódio do produto de limpeza, afetando conseqüentemente, a eficiência deste processo. Foram observadas incrustações nas caldeiras, que devem ter se formado com o decorrer do tempo (Andrade e Macedo, 1996). Contudo a dureza da água não foi avaliada.

4.1.1.2. Laticínio LV

Neste laticínio, a coleta do leite de cinco fornecedores era granelizada, havendo também a utilização do leite da fazenda, onde está localizada a indústria. Este leite era canalizado diretamente da ordenha em circuito fechado, realizada por processo mecânico, anexa à unidade industrial. O volume diário de leite recebido era de 14 mil litros. Os testes do alizarol a 75% e de acidez titulável (considerado apropriado até 17ºD) eram realizados para avaliar a estabilidade térmica da matéria-prima. O pagamento do leite aos fornecedores era realizado apenas por volume. O rendimento industrial estimado da produção de queijo de coalho era de 8,5 litros por quilo de queijo. Além da fabricação de queijo de coalho, principal produto deste laticínio, eram também processados leites pasteurizados tipos “B” e “C”, manteiga e bebida láctea.

Periodicamente, era realizado o controle de qualidade da matéria-prima, incluindo as seguintes análises: crioscopia, teor de gordura, densidade a 15ºC, pesquisa de inibidores e contagem de células somáticas. O queijo de coalho apresentava 30 dias de validade, sendo comercializado na região de Água Preta e em Recife, e analisado quanto às pesquisas de bolores e leveduras, coliformes e Staphylococcus aureus. Os resultados dessas análises não foram mostrados durante as visitas.

Este laticínio informou estar em fase de implantação do programa de Boas Práticas de Fabricação, porém algumas observações foram feitas, como a intensa manipulação da massa durante os processos de salga e enformagem, sem que os funcionários utilizassem luvas. Medidas de controle de ambiente foram registradas: pédilúvio com cloro, pias com detergente e pedal, lava botas, cortinas e exaustores de ar.

O sistema de limpeza e desinfecção dos equipamentos era realizado com a utilização de detergente alcalino (soda), detergente ácido (peracético) e sanitizante (cloro). O sistema “clean in place” CIP era somente adotado para limpeza do pasteurizador. A água utilizada pelo laticínio não era dura, segundo informações dos técnicos.

4.1.2. Produção artesanal de queijo de coalho

A produção artesanal de queijo de coalho foi documentada em duas fazendas do estado de Pernambuco, localizadas nas regiões do Agreste (São Bento do Una) e da Zona da Mata (Água Preta).

4.1.2.1. Fazenda AQ

A fazenda AQ, localizada no município de São Bento do Una (PE), foi visitada. O leite utilizado para a elaboração dos queijos de coalho era oriundo exclusivamente da fazenda, sendo obtido de 31 vacas, por intermédio de ordenhadeira mecânica do tipo latão ao pé, totalizando cerca de 450 litros por dia. Os animais recebiam dieta baseada em farelos de algodão, soja, milho e arroz, além de palma. A propriedade era

assistida por uma veterinária, realizando periodicamente, no rebanho, exames de brucelose, tuberculose e mastite.

A produção era familiar e não era realizado nenhum tipo de análise do leite destinado à elaboração dos queijos, nem dos produtos acabados. O rendimento estimado era de 7 litros de leite por quilo de queijo. A produção era subordinada à inspeção estadual, porém, provisória. O soro dos queijos era destinado à pocilga. A distribuição dos queijos era feita pelo próprio produtor, em veículo particular, utilizando isopor sem gelo. Os queijos eram vendidos em feiras na cidade de Caruaru (PE) e apresentavam validade de 30 dias.

4.1.2.2. Fazenda CM

Na fazenda CM, localizada no município de Água Preta (PE), foi observado que o leite utilizado para a elaboração dos queijos de coalho era oriundo exclusivamente da fazenda, sendo obtido de 70 vacas, por intermédio de ordenha mecânica do tipo latão ao pé, totalizando cerca de 500 litros por dia. Os animais recebiam dieta baseada em cevada e pasto de Brachiaria.

A produção, embora artesanal, não era familiar, diferente da outra propriedade visitada, sendo encarregada a funcionários da fazenda. Não era realizado nenhum tipo de análise do leite destinado à elaboração dos queijos, nem dos produtos acabados. O queijo era produzido duas vezes por dia, após as ordenhas. A distribuição destes era terceirizada, sendo feita duas vezes por semana, utilizando isopor sem gelo, nos municípios de Água Preta, Ribeirão e Palmares

todos localizados na Zona da Mata pernambucana. O rendimento era de aproximadamente 7,1 litros de leite por quilo de queijo, possuindo prazo de validade de 14 dias. As embalagens dos queijos possuíam rótulo e a produção estava sob fiscalização do Serviço de Inspeção Estadual.

4.1.3. Avaliação dos sistemas de produção de queijo de coalho

4.1.3.1. Fluxogramas de produção

As fotos das visitas aos laticínios e fazendas onde eram fabricados os queijos (Anexo I) e a descrição dos respectivos fluxogramas (Anexo A) demonstraram variações quanto ao processamento, incluindo diferenças com relação às etapas, utensílios e instalações. As diferenças não se restringiam entre produção artesanal e industrial. Como foi possível observar, pelos resultados apresentados, essas variações também ocorriam entre as formas de produção de queijo artesanal, e entre as formas de produção de queijo industrial, ou seja, cada estabelecimento (industrial ou não) estabelece um fluxograma próprio e individual, com variações quanto à tecnologia e cuidados higiênico-sanitários, podendo resultar em produtos que vão apresentar características sensoriais, físico-químicas e microbiológicas distintas. Desta forma, pode ser observada falta de padronização na fabricação deste alimento.

De acordo com as descrições dos fluxogramas dos queijos de coalho, as principais diferenças relacionadas à produção deste alimento são apresentadas na Quadro 3:

Quadro 3: Principais diferenças relacionadas à produção de queijo de coalho.

Fazenda IndustriaPadronização teor de gordura Não é realizada RealizadaPasteurização Não é realizada RealizadaMexedura 5 minutos 1 horaSalga Superfície Na massaEnformagem Forma de madeira Forma de alumínioPrensagem (tempo) 5 minutos 30 minutosEmbalagem\Estocagem Manual\Freezer Vácuo\ Câmara friaComercialização Feiras Estabelecimento comercial

4.1.3.2. Ingredientes

Tecnicamente, o queijo de coalho pode ser definido como o produto obtido por coagulação enzimática, cuja coalhada pode ou não sofrer aquecimento, sendo prensado manualmente ou em pequenas prensas e salgado a seco, diretamente na massa ou na superfície (Mangueira et al., 2001). Porém, ao observar-se os fluxogramas de produção (Anexo A) dos estabelecimentos visitados, pode-se perceber que em alguns casos essa definição não seria empregada, uma vez que ocorre a adição de ingredientes como bicarbonato de sódio.

O cloreto de cálcio é utilizado pelos laticínios

para proporcionar adequada coagulação do leite após a pasteurização, pois neste processo ocorre a insolubilização de parte do cálcio livre,

o que poderia comprometer a firmeza do coágulo e o rendimento industrial. Como nas fazendas o leite não é pasteurizado, não é necessária a adição de cloreto de cálcio.

O queijo de coalho industrializado é um queijo de média a alta umidade, de massa semi-cozida ou cozida e apresentando um teor de gordura nos sólidos totais variável entre 35,0% e 60,0%. Os ingredientes obrigatórios são leite integral ou padronizado a 3% (m/m) em seu conteúdo de matéria gorda; coalho ou outras enzimas coagulantes apropriadas. Os ingredientes opcionais seriam cloreto de cálcio, cultivo de bactérias lácteas selecionadas, sólidos de origem láctea, condimentos e especiarias e cloreto de sódio (Brasil, 2001). Observou-se a não padronização do teor de gordura do leite destinado à produção de queijo de coalho artesanal e a padronização deste constituinte do leite a 3,0 ou 3,2 % na elaboração de queijo de coalho industrial. Estes fatos podem produzir variações físico-químicas que podem interferir na identidade e padronização dos produtos.

4.1.3.3. Utensílios

Outra importante observação diz respeito aos utensílios utilizados para a fabricação do queijo de coalho, especialmente naqueles produzidos de forma artesanal. O queijo de coalho artesanal ainda é feito com a utilização de utensílios de madeira, o que pode comprometer a qualidade microbiológica do produto. Por isso a legislação estadual prevê apenas a permissão para se fazer uso de utensílios de aço inox. Contudo, a utilização de utensílios de madeira é uma prática tradicional na produção artesanal de queijos, estando ligada a fatores culturais difíceis de serem modificados. Este fato esta também associado à questão econômica, pois o custo das formas de aço inox é elevado para estes produtores.

4.1.3.4. Prazo de validade

O Regulamento Técnico de Identidade e Qualidade de Queijo de Coalho (Brasil, 2001) define este produto como o queijo que se obtém por coagulação do leite por meio do coalho ou outras enzimas coagulantes apropriadas, complementada ou não pela ação de bactérias lácteas selecionadas e comercializado normalmente com até 10 (dez) dias de fabricação. Entretanto, foi observado que a comercialização dos produtos ocorria em um prazo superior a 10 dias após a fabricação. Esta prática pode comprometer a qualidade microbiológica destes queijos, principalmente, quando se leva em consideração as inadequadas condições de estocagem e comercialização, sendo feitas também sob temperaturas impróprias.

4.1.3.5. Condições higiênico-sanitáriasAs práticas de higiene para elaboração do produto devem atender o Regulamento Técnico sobre as Condições Higiênico-Sanitárias e de Boas Práticas de Fabricação para Estabelecimentos Elaboradores/ Industrializadores de Alimentos (Portaria nº 368/97 – MAPA, Brasil, 1997). Porém, apenas um dos laticínios informou ter as BPF’s implantadas, enquanto que o outro está em fase de implantação. A situação é ainda pior nos estabelecimentos de produção artesanal, onde muitas vezes cuidados mínimos de higiene são negligenciados, como a intensa manipulação do leite e da massa, a utilização de água não tratada, a higienização deficiente dos utensílios e a falta de cuidados com relação ao ambiente de produção de queijo e com a higiene pessoal e das vestimentas das pessoas envolvidas neste trabalho, comprometendo a qualidade microbiológica do produto.

Associado ao fato anterior, percebe-se um cuidado maior das práticas de higiene e desinfecção dos equipamentos industriais, em relação aos utensílios utilizados durante a fabricação artesanal dos queijos. Porém, apesar da implantação das BPF’s, em alguns casos, problemas higiênico-sanitários relacionados a questões culturais podem interferir com a qualidade microbiológica destes queijos. Isto pôde ser verificado pela intensa manipulação da massa nos processos de salga e enformagem dos queijos industriais. Desta forma, estas etapas podem ser caracterizadas como pontos críticos, associados a riscos microbiológicos, durante a fabricação do queijo de coalho industrial.

Altos índices de contaminação com coliformes totais e fecais foram verificados em amostras de queijo de coalho, produzido e comercializado no Nordeste (Leite-Júnior et al., 2000; Bastos et al., 2001; Escobar et al., 2001; Nascimento et al., 2001). Estes resultados demonstram problemas higiênico-sanitários ocorridos durante a produção deste queijo, bem como a utilização de leite cru e a falta de tratamento de água nas unidades produtoras, condições essas também observadas nos estabelecimento visitados no presente experimento, como descrito anteriormente.

4.2. Determinação de características e composição físico-químicas

Para uma avaliação mais completa dos queijos, os mesmos foram submetidos às análises físico-químicas. Os resultados destas avaliações estão demonstrados na tabela 1.

Tabela 1: Resultados de análises físico-químicas de seis amostras de queijo de coalho, produzido no Estado de Pernambuco.Amostra Gordura

(%)Gordura no EST (%)

EST (%)

Umidade (%)

BL 15,50 32,56 47,60 52,40LV 21,5 42,07 51,10 48,90

AB 23,0 49,41 46,55 53,45

AQ 19,0 44,76 42,45 57,55

CM 27,0 57,45 47,00 53,00

SM 24,0 48,44 49,55 50,45

Os resultados obtidos (Tabela 11) demonstraram grandes variações com relação ao percentual de gordura das amostras estudadas, sendo o menor percentual de 15,50% e o maior de 27%. É interessante observar que o menor percentual foi visto para uma amostra de queijo de coalho industrial, que realiza a padronização do teor de gordura do leite, enquanto que o maior percentual de gordura observado foi de uma amostra de queijo de coalho artesanal, que é feita com leite cru integral. Portanto, estas variações dos teores de gordura podem ser, em parte, causadas pela adoção da padronização deste constituinte lácteo nas indústrias, enquanto que nas fazendas esta operação não é realizada. Adicionalmente, outros fatores podem justificar a oscilação dos teores de gordura entre amostras de queijo de coalho, dentre eles podem ser citados: alimentação dos animais leiteiros, composição genética do rebanho, estágio de lactação, ordem de parição, estação do ano, etc. (Harding, 1995). As variações do teor de gordura também influenciaram as oscilações dos outros parâmetros físico-químicos avaliados (EST, umidade e gordura no EST), pois estes índices dependem do teor de gordura dos queijos.

Quanto ao teor de umidade, de acordo com os padrões oficiais de inspeção (Brasil, 1996), as amostras de queijo de coalho puderam ser classificadas como sendo de alta umidade, o que seria o exigido pela legislação oficial de queijo

de coalho (Brasil, 2001), excetuando-se apenas a amostra AQ, que foi classificada como queijo de muito alta umidade. As variações do teor de umidade e de EST dos queijos podem ser explicadas pelas diferenças observadas quanto às

tecnologias de produção, descritas nos fluxogramas de produção (Anexo A). As variações observadas durante a fabricação destes queijos relacionadas à padronização do teor de

gordura do leite, ao tamanho do grão após o corte, tempo e tipo de mexedura e dessoragem, salga na massa

ou na superfície e forma e eficiência de prensagem podem justificar as diferenças dos resultados dos parâmetros físico-químicos pesquisados. Esta falta de padronização destas características também foi relatada por Sena et al. (2000) e Araújo et al. (2002).

Quanto ao percentual de gordura no EST, as amostras de queijo de coalho puderam ser classificados como sendo semi-gordo a gordo, o que estaria de acordo com os critérios estabelecidos pelos Regulamentos Técnicos de Identidade e Qualidade de Queijo de Coalho (Brasil, 2001).

De acordo com os dados demonstrados na Tabela 12, pode-se perceber que também existe grande variação dos valores de acidez titulável dos queijos de coalho pesquisados. A oscilação foi bastante significativa, variando de 59,4 a 175,5 ºD. Este fato pode estar relacionado à microbiota específica de cada amostra, que apresentaria diferentes níveis de fermentação da lactose. Somado à isto, outros fatores tornam-se também relevantes, como as diferenças tecnológicas de fabricação, variações das embalagem (à vácuo ou não), tempo e temperatura de estocagem dos queijos, tipo de comercialização e manutenção da cadeia do frio.

As variações de acidez titulável nos queijos analisados podem determinar alterações na composição de suas microbiotas, limitando a viabilidade de bactérias mais sensíveis a ambientes de pH baixo, nos queijos com maior acidez titulável. A capacidade de fermentação varia de acordo com as espécies. A maioria das BAL produz entre 0,5% e 1,5% de ácido láctico, mas existem bactérias capazes de produzir mais de 3% de ácido láctico (Robinson, 1991). Dentro deste raciocínio, bactérias indesejáveis como as do grupo coliforme poderiam ser afetadas, porém igualmente seria prejudicada a sobrevivência de microrganismos desejáveis como Lactococcus spp. em pH inferior a 4,5 (Jay, 1996). Este fato pode explicar parcialmente a menor incidência de bactérias deste gênero nos queijos analisados e uma maior predominância de identificação de Lactobacillus spp. que são mais tolerantes ao menor pH do meio.

Tabela 2: Resultados de determinação da acidez titulável de queijo de coalho produzido no estado de Pernambuco.

Queijo Acidez titulável (º D)

BL 90,0

LV 81,2

AB 63,0

AQ 164,7

CM 59,4

SM 175,5

Adicionalmente, queijos com elevada acidez titulável podem apresentar defeitos de aparência e textura, que seriam visualizados como trincas, corpo ressecado e friável (Furtado, 1990). Estes aspectos associados ao sabor mais ácido destes produtos poderiam causar uma rejeição maior pelos consumidores.

De acordo com a análise dos dados de composição e constituição físico-química dos queijos de coalho, associando-os com as observações relacionadas aos processos de produção artesanal e industrial descritos anteriormente, ressalta-se a necessidade de melhor padronização dos processamentos deste alimento, a fim de que se possa oferecer aos

consumidores um produto mais uniforme.

4.3. Isolamento, enumeração, purificação e caracterização fisiológica de bactérias ácido-lácticas

4.3.1. Isolamento e enumeração

O isolamento dos microrganismos produtores de ácido láctico em amostras de queijo de coalho artesanal e industrial foi realizado em ágar MRS, incubado sob anaerobiose e em ágar M17, incubado sob aerobiose. Os resultados da enumeração destes microrganismos estão apresentados na tabela 3:

Tabela 3: Enumeração (UFC/g) de microrganismos produtores de ácido láctico em amostras de queijo de coalho artesanal e industrializado

QUEIJO ÁGAR MRS (UFC/g)

ÁGAR M17(UFC/g)

LV 5,1 x 106 7,5 x 107

BL 5,0 x 107 5,1 x 107

AQ 4,5 x 107 8,0 x 107

CM 3,3 x 107 1,3 x 108

AB 4,3 x 107 2,0 x 108

SM 9,0 x 107 3,3, x 108

A contagem total de microrganismos produtores de ácido láctico nos meios MRS e M17 apresentou-se ligeiramente diferente. Números discretamente mais elevados de bactérias foram verificados quando o isolamento foi realizado com o ágar M17, exceto para as amostras BL e AQ, de queijo de coalho industrial e artesanal, respectivamente, que apresentaram populações semelhantes nos dois meios de cultura utilizados (tabela 3). Uma provável explicação para este fato seria a atmosfera de incubação e a composição do ágar MRS, que é mais específico para o isolamento de Lactobacillus spp., apresentando pH inferior ao do ágar M17, o que dificulta o crescimento de microrganismos menos tolerantes à acidez e as condições de anaerobiose.

Outra importante observação que pode ser feita a partir dos resultados demonstrados na tabela 3 é que as maiores contagens de microrganismos foram observadas na amostra SM, queijo de coalho artesanal, coletado no mercado varejista da cidade de Recife (PE). Isso ocorreu tanto quando o isolamento foi feito a partir do meio M17 quanto do meio MRS. Por outro lado, as menores contagens de microrganismos foram observadas em duas amostras de queijo de coalho industrial, coletadas nas indústrias LV, em ágar MRS, e BL, em ágar M17, respectivamente. Isto, provavelmente, ocorreu devido às más condições de produção e estocagem sob temperaturas inadequadas da amostra SM, possibilitando o desenvolvimento microbiano, principalmente, quando comparadas às condições de produção e armazenamento observadas para as amostras de queijo industrializado (LV e BL).

É possível ainda observar que as contagens foram geralmente maiores para as amostras de queijo artesanal

(AQ, CM, AB e SM), independentemente do meio de cultivo, apresentando microbiota mais rica e diversificada. Provavelmente, este fato deve estar relacionado, mais uma vez, às condições observadas no processamento artesanal deste tipo de queijo, e à não pasteurização da matéria-prima utilizada na fabricação deste produto. Outro ponto a ser considerado, é que, devido à falta da pasteurização, há provavelmente uma maior ocorrência de espécies de BAL e, conseqüentemente, uma maior contagem inicial desses microrganismos no produto artesanal. Não submeter o leite ao tratamento térmico adequado não implica apenas em um maior número de microrganismos produtores de ácido láctico desejáveis, mas também de bactérias deteriorantes e/ou patogênicas, fazendo com que o queijo artesanal, feito a partir de leite cru, se torne uma fonte de infecções aos humanos e, portanto, um risco à saúde pública.

4.3.2. Caracterização fisiológica

A caracterização fisiológica dos microrganismos isolados das amostras de queijo de coalho foi realizada por intermédio da realização de teste respiratório, coloração de Gram e teste de catalase.

4.3.2.1. Isolamento em ágar M17

O teste respiratório das culturas isoladas em ágar M17 indicou que, apesar do isolamento primário das mesmas ter sido feito em condições de aerobiose, estes microrganismos comportaram-se, no geral, como microaerófilos. Este fato pode ser comprovado pelo crescimento dos mesmos em diferentes condições de ambiente: anaerobiose, microaerofilia e aerobiose (Tabela 4)

Tabela 4: Resultados de análises microbiológicas de culturas isoladas em ágar M17 a partir de queijo de coalho, produzido no estado de Pernambuco

Queijo/Morfotipo

Teste Respiratório Morfologia e Gram Catalase

Aerobiose Microaerofilia Anaerobiose

BL1 + + + + + + + + + Bastonetes G + Pos

BL2 + + + + + + + + + Cocos G + Neg

BL3 + + + + + + + + Cocos G + Neg

BL4 + + + + + + + + + Bastonetes G - Pos

LV1 + + + + + + + + + Cocos G - Pos

LV2 + + + + + + + + + Bastonetes G - Neg

LV3 + + + + + + + + + Cocos G - Pos

LV4 + + + + + + + + Cocos G + Neg

AQ1 + + + + + + + + + Cocos G + Pos

AQ2 + + + + + + + + + Cocos G + Neg

AQ3 + + + + + + + + + Cocos G + Neg

AQ4 + + + + + + + + Cocos G + Neg

CM1 + + + + + + + + + Cocos G + Pos

CM2 + + + + + + + + + Cocos G + Pos

CM3 + + + + + + + + + Bastonete G- Pos

CM4 + + + + + + + + + Cocos G + Neg

AB1 + + + + + + + + + Cocos G + Pos

AB2 + + + + + + + + + Cocos G + Neg

AB3 + + + + + + + + Cocos G + Neg

AB4 + + + + + + + + + Cocos G + Pos

SM1 + + + + + + + + + Cocos G + Pos

SM2 + + + + + + + + Cocos G+ Neg

SM3 + + + + + + + + + Cocos G + Pos

SM4 + + + + + + + + + Cocos G + Neg

A coloração de Gram destes microrganismos indicou predominância de cocos Gram positivo, sendo um resultado esperado e desejável. Isto, porque a microbiota aeróbia predominante em queijos deveria ser constituída de BAL, como Lactococcus spp. Outros pesquisadores encontraram predominância de cocos em microbiota de queijos industrializados e artesanais (Oliveira; Garcia, 1986; Leite et al., 1997).

Houve predominância de culturas caracterizadas como cocos Gram positivo, catalase positivo, sugerindo a presença de bactérias contaminantes importantes neste queijo, como é o caso de Staphylococcus spp. (Sena,

2000). Porém, também foram caracterizados microrganismos cocos Gram positivo, catalase negativo, o que seria sugestivo de bactérias dos gêneros Lactococcus, Streptococcus e Enterococcus (Tagg et al., 1976).

4.3.2.2. Isolamento em ágar MRS

O teste respiratório das culturas isoladas em ágar MRS indicou maiores restrições com relação às condições de cultivo ideais para estes microrganismos. Foram detectadas culturas anaeróbias estritas (CM4MRS), microaerófilas e anaeróbias facultativas (Tabela 5).

Tabela 5: Resultados de análises microbiológicas de culturas isoladas em ágar MRS a partir de queijo de coalho, produzido no estado de Pernambuco

Queijo/Morfotipo

Teste Respiratório Coloração de Gram Catalase

Aerobiose Microaerofilia Anaerobiose

BL1 - + + + Cocos G + NegBL2 + + + + Cocos G + NegLV1 + + + + + Cocos G + NegLV2 - + + + + Bast. G + NegLV3 + + + + + + Bast. G + NegAQ1 + + + + + + + + Bast. G + NegAQ2 + + - + Cocos G + NegCM1 + + + + + + + Bast. G + NegCM2 + + + + + + + + Bast. G + NegCM3 + + + + + Bast. G + NegCM4 - - + Cocos G + NegAB1 + + + Cocos G + NegAB2 + + + + + + + + Bast. G + NegAB3 + + + + + + Bast. G + NegSM1 - + + + Cocos G + NegSM2 - + + + + Cocos G + Neg

Os resultados da coloração de Gram demonstraram não haver predominância de um tipo morfológico, porém todos os microrganismos foram caracterizados como Gram positivo, catalase negativo.

Estes achados indicam a possibilidade do isolamento de bactérias fermentadoras da lactose, como BAL não apenas do gênero Lactobacillus, mas também dos gêneros Lactococcus, Streptococcus e Enterococcus que são Gram positivo, catalase negativo.

Os resultados encontrados foram coerentes com a literatura pesquisada. Furtado (1990) isolou BAL de leite e de soro de queijo da região do Serro, Minas Gerais, os microrganismos foram caracterizados fisiologicamente como Gram positivo, catalase negativo, preferencialmente microaerófilos. Leite et al. (1997) isolaram 1.244 colônias de microrganismos de queijo do Serro, das quais 105 foram caracterizadas como Gram positivo e catalase negativo. Entretanto, neste trabalho, a maior partes destes (34) foi classificada no gênero Lactococcus, sendo o restante Enterococcus e Streptococcus.

Pode-se observar maior seletividade do meio MRS em comparação ao meio M17 (Tabelas 4 e 5), havendo crescimento de menor número de microrganismos no ágar MRS (Tabela 3). Confrontando os dados demonstrados das tabelas 5 e quadro 4 percebe-se ainda que o cultivo em meio MRS permitiu maior definição dos microrganismos com relação ao perfil respiratório e menor variedade dos resultados de Gram e catalase. Isto ocorre em função das características específicas de cada meio, que irá determinar qual ou quais microrganismos irão se desenvolver. O meio MRS é indicado para isolamento de espécies do gênero Lactobacillus, que são bactérias microaerófilas, em sua grande maioria. O meio M17 (suplementado com lactose) é um meio que

favorece o isolamento de bactérias do gênero Lactococcus, que possuem comportamento respiratório diferente dos Lactobacillus, que são microrganismos aeróbios. Além disto, no meio M17 podem se desenvolver outras espécies de microrganismos fermentadores de lactose, como Streptococcus e Enterococcus. Portanto, as diferenças observadas entre os dados contidos nas tabelas 4 e 5 devem-se, em parte, ao meio de cultivo e também pelas características fisiológicas de cada grupo de microrganismo.

4.4. Identificação das bactérias ácido-lácticas isoladas, de acordo com técnicas de Biologia Molecular.

Alguns microrganismos possuem apenas uma cópia da região intergênica 16S – 23S em seu DNA (amplificação de apenas uma banda), como AB1MRS, BL1MRS, BL2MRS, SM1MRS, SM2MRS, BL3M17 e BL4M17. Os outros isolados apresentam mais de uma cópia desta região em seus DNA’s. Este fato pode caracterizar diferentes espécies, como Lactobacillus spp. que apresentam a amplificação típica de três bandas. Estes genes são copiados mais de uma vez no genoma destas bactérias por codificarem estruturas vitais para os microrganismos, subunidades ribossomais para síntese protéica. Entretanto, como este fato é comum entre as bactérias e esta região genômica é extremamente variável entre os microrganismos de espécies diferentes, porém bem conservada na mesma espécie, torna-se necessário à utilização de outras técnicas complementares para a identificação dos microrganismos isolados ao nível molecular.

Os resultados dos seqüenciamento confirmaram a presença de diferentes espécies de microrganismos nas amostras de queijo de coalho (Quadro 4).

Quadro 4: Microrganismos identificados por seqüenciamento de DNA isolados de amostras de queijo de coalho artesanal e industrializado.

Amostra MicrorganismoAB1MRS Streptococcus thermophilusAB2MRS Lactobacillus caseiAB3MRS Lactobacillus fermentumAQ1MRS Lactobacillus rhamnosusAQ2MRS Enterococcus faecalisBL1MRS Streptococcus thermophilusCM3MRS Weissella confusaCM4MRS Enterococcus faecalisLV1MRS Enterococcus faecalisLV3MRS Lactobacillus acidophilusAQ4M17 Lactococcus raffinolactisBL2M17 Streptococcus thermophilusCM2<M17 Lactococcus lactisCM2>M17 Escherichia coliCM3M17 Erwinia amylovoraSM4M17 Streptococcus thermophilus

Também foram identificadas duas culturas (CM1MRS E CM2MRS) como Lactobacillus rhamnosus, de acordo com o perfil de digestão idêntico ao daquele de AQ1MRS, que teve a identificação baseada no perfil de

digestão confirmada pelo seqüenciamento (Tabela 5). A cultura LV2MRS apresentou perfil de digestão sugestivo de Lactobacillus sp. do grupo acidófilo, porém o seqüenciamento não foi conclusivo, a respeito

da identificação desta espécie que se caracterizou como bastonete Gram positivo, catalase negativo, crescendo apenas em microaerofilia e anaerobiose, de acordo com os resultados descritos anteriormente (Tabela 3).

Foram identificados dezenove microrganismos, sendo seis pertencentes ao gênero Lactobacillus, quatro de Streptococcus, três de Enterococcus, dois de Lactococcus, um de Weissella, um de Escherichia e um de Erwinia. Estes dois últimos microrganismos, apesar de não pertencerem ao grupo das BAL, sendo considerados enterobactérias, conseguiram se desenvolver no meio M17, reforçando a menor seletividade do mesmo e a capacidade destas bactérias de fermentar lactose, adaptando-se neste ambiente. A presença de Escherichia coli foi observada na cultura CM2M17, mesma cultura na qual foi identificada a cepa de Lactococcus lactis, sendo detectada a ocorrência destas duas cepas em um mesmo isolado apenas após o seqüenciamento. Isto justifica o resultado encontrado na tabela 4 para a cultura CM2 no meio M17 (Cocos Gram positivo, catalase positivo).

4.4.1. Diversidade da microbiota dos queijos de coalho

Os resultados mostram uma grande diversidade de microrganismos identificados a partir das amostras de queijo de coalho produzido no estado de Pernambuco (Anexo H). Essa diversidade pode ser explicada, em parte, no caso das amostras de queijos artesanais por serem elaborados a partir de leite cru, que apresentaria uma microbiota mais variada em relação àquela do leite pasteurizado. Além disto, a microbiota dos queijos industriais seria definida pela adição de culturas lácteas ao leite pasteurizado. Entretanto, a manipulação da massa durante a fabricação do queijo, a qualidade da água utilizada durante o processamento e a não implantação correta das BPF’s pelas indústrias pode levar a contaminação do leite, após a pasteurização. Deve-se considerar ainda a existência de cepas de BAL termodúricas (Hammes e Vogel, 1995).

A presença de BAL em queijos artesanais foi descrita por Bouberikri e Otha (1996), Héberta et al. (2000), López-Dias (2000), Caridi (2003), Gerasi et al. (2003), Fortina et al. (2003) e Manolopoulou et al. (2003) em diferentes países do mundo. Entretanto, no Brasil, os dados da literatura pesquisada são escassos com relação à este tipo de estudo. Oliveira e Garcia (1986), Furtado (1990) e Leite et al. (1997) isolaram de BAL de queijo artesanal, incluindo principalmente, Lactococcus spp., Lactobacillus spp. e Streptococcus spp.

A presença de BAL em queijos pode ser explicada pela presença destes microrganismos no leite cru, ocasionalmente na água e em vegetais que poderiam contaminar o leite. No caso dos queijos industriais, estas bactérias podem estar presentes por constituir as culturas lácticas utilizadas, como seriam os casos de Lactobacillus spp., Lactococcus spp. e Streptococcus thermophilus. Este fato era esperado e desejável.

As espécies de Lactobacillus isoladas (L. acidophilus, L. casei, L. fermentum e L. rhamnosus) representam exemplos de microrganismos desejáveis à fabricação de queijos pelas características sensoriais e por serem microrganismos com importante papel probiótico (Robinson, 1991). Espécies semelhantes de Lactobacillus também foram isoladas de queijo artesanal por López Diaz (2000) e Gatto et al. (2002). Em outros trabalhos citados anteriormente, diversos pesquisadores encontraram Lactobacillus spp. neste tipo de alimento, porém, nas amostras de queijo de coalho estudadas, foi identificada maior variedade de espécies deste microrganismo.

Weissella spp. eram anteriormente classificadas como Lactobacillus., porém, com o desenvolvimento das técnicas de identificação de microrganismos e a aplicação da biologia molecular, estas bactérias foram alocadas dentro deste novo gênero. No Brasil, a literatura consultada não relatou trabalhos sobre a ocorrência deste microrganismo em queijos. A presença de Weissella spp. em queijos também pode ser relacionada aos mesmos fatores que justificam a presença de Lactobacillus spp., como descrito anteriormente.

Como no presente trabalho, pesquisas realizadas no continente Europeu relatando a presença de Weissella spp. em queijos também foram publicadas. Estes trabalhos foram conduzidos na Alemanha (Roushdy et al., 1998), Itália (Morea et al., 1998; Baruzzi et al., 2002), França (Amiel et al., 2000), Reino Unido (Williams e Banks, 1997; Williams et al., 2000), Espanha (Mas et al., 2002) e Grécia (Gerasi et al., 2003). Diferente da espécie de Weissella isolada em queijo de coalho artesanal (W. confusa), os trabalhos europeus descrevem a identificação de Weissella paramesenteroides e Weissella helenica. Microrganismos deste gênero estariam envolvidos em reações de proteólise, sendo importantes para o desenvolvimento de “flavour” característico em queijos maturados.

Normalmente, são encontradas bactérias como Lactococcus lactis em queijos, decorrentes de sua presença no leite cru, em superfícies e equipamentos de laticínios ou da utilização de culturas lácticas (Chaves et al., 1995, Perez et al., 1998, Blaiotta et al., 2002, Gatto et al., 2002 e Fortina et al., 2003). No presente trabalho, além desta espécie, também foi isolada e identificada cultura de Lactococcus raffinolactis. Perez et al. (1998) e Blaiotta et al. (2002) também isolaram Lactococcus raffinolactis a partir de amostras de queijo Idiazabal (da Espanha) e no ambiente de laticínios da Itália, respectivamente.

Outro gênero de microrganismo bastante comum de ser isolado em queijos é o Streptococcus (Amiel et al., 2000, Baruzzi et al., 2002; Gatto et al., 2002). Nos queijos de coalho pesquisados, detectou-se a presença de Streptococcus thermophilus em amostras artesanais (AB1MRS e SM4M17) e industriais (BL1MRS e BL2M17). Em ambos tipos de queijo, sua presença pode

estar relacionada à microbiota original do leite cru, pois algumas linhagens de Streptococcus thermophilus são termodúricas, podendo estar presente também na microbiota de leite pasteurizado. Adicionalmente, no caso de queijos industrializados, a presença deste microrganismo pode ser traçada à sua utilização na composição das culturas lácticas utilizadas na elaboração deste alimento, como seriam os casos de BL1MRS e BL2MRS.

A presença de Enterococcus spp. pode ser relacionada ao processamento de alimentos produzidos sem tratamento térmico, particularmente em queijos elaborados a partir de leite cru. Estes microrganismos podem contribuir nos processos de maturação de queijos, proporcionando “flavour” característico. Entretanto, determinadas linhagens de Enterococcus podem atuar como probióticos ou como patógenos, tornando sua presença neste alimento um fator de risco à saúde pública (Flair-Flow-Europe, 2003).

Diferentes espécies de Enterococcus foram isoladas e identificadas por técnicas de biologia molecular, a partir de amostras de queijo Ragusano, típico da Sicília, Itália. As principais espécies isoladas foram: E. durans, E. faecium e E. faecalis (GATTO et al., 2002).

Um resultado bastante inesperado foi a identificação de uma cultura de Erwinia amylovora (CM3M17). Esta

espécie de bactéria pertence à família Enterobacteriaceae sendo relacionada a problemas em cultivos de vegetais, causando uma doença denominada “Fire Blight of Pear”, que acomete frutas, como pêras e maçãs (Pusey, 1999). Outras espécies deste gênero foram isoladas de queijos artesanais europeus: Erwinia spp. em queijo Serra da Estrela de Portugal (Tavaria e Malcata, 2000) e Erwinia nitrifluens em queijo Valdeteja da Espanha (Alonso et al., 2002). Este resultado, bem como a presença de outras Enterobactérias (Escherichia coli – CM2>M17), demonstra prováveis problemas associados à manipulação e falta de higiene durante a elaboração dos queijos, podendo causar defeitos como estufamento precoce (FURTADO 1990). Isto pode ser comprovado por aspectos da produção dos queijos no item 7.1.

4.5. Isolamento, Enumeração, Purificação e Identificação de Microrganismos Patógenos (Coliformes a 30 °C e 45 °C, Escherichia coli O157:H7, Salmonella spp., Listeria spp.) presentes em Queijo de Coalho artesanal e Industrial, produzido no Estado de Pernambuco.

Os resultados da contagem de coliformes totais, coliformes fecais e da pesquisa de E. coli O157;H7, Lsteria sp. e Salmonella sp. nos queijos estão apresentados na tabela 6:

Tabela 6: Resultados da contagem de coliformes a 30 °C e a 45 °C e da pesquisa de E. coli O157:H7, Salmonella sp. e Listeria sp. em queijo de coalho

Amostra Coliformes (NMP/g) Pesquisa

30 °C 45 °C E. Coli O157:H7 Salmonella sp. Listeria sp.

LV > 1100 > 1100 ND ND Listeria spp

CM > 1100 > 1100 ND ND

AB > 1100 > 1100 ND ND Listeria spp

AQ > 1100 > 1100 ND ND

BL > 1100 > 1100 ND ND L. monocytogenes

SM > 1100 > 1100 ND ND

ND = Não Detectado Os queijos analisados apresentaram elevada população de bactérias do grupo coliforme 30 e 45 °C, evidenciando contaminação do produto. A presença de coliformes fecais geralmente é atribuída a deficiências nas condições higiênico-sanitárias, durante o processo de obtenção do produto e, indica contaminação de origem fecal. Além disso, estes queijos representam um risco para a saúde da população pela possibilidade de veicular cepas patogênicas de E. coli, pertencentes aos grupos EPEC, EIEC, ETEC e EHEC. Embora E.coli O157:H7 não tenha sido isolada, outras linhagens patogênicas de ETEC, VTEC e NTEC podem estar presentes. Os coliformes podem causar defeitos como o estufamento precoce, alteração do formato e do sabor nos produtos lácteos e causar à deterioração do alimento (Franco e Landgraf, 1996). O nível de coliformes (30 e 45°C) detectado nas amostras estava fora do limite

estabelecido pela legislação (Agência Nacional de Vigilância Sanitária, 2001).

A ocorrência de coliformes em queijo de coalho, principalmente os artesanais, em níveis superiores aos permitidos pela legislação, também tem sido observada em muitos trabalhos (Florentino e Martins, 1999; Paiva e Cardonha, 1999, Bruno et al., 2005). No Rio Grande do Norte, Feitosa e outros (2003) observaram que 36% (4/11) das amostras de queijo de coalho produzido no Estado apresentavam coliformes fecais em valores superiores ao estabelecido pela legislação. Borges e outros (2003) constataram que 74,4% (32/43) das amostras de queijo de coalho artesanal e industrial, produzidos em 11 municípios do Ceará, continham níveis de coliformes fecais e E. coli superiores ao padrão microbiológico.

Neste trabalho Salmonella spp. não foram detectadas nas amostras analisadas (Tabela 3). A presença de Salmonella spp. também não foi constatada em outros estudos.. Ávila e Gallo (1996) não isolaram esta bactéria em 57 (100%) amostras de produtos lácteos (leite cru, leite tipo C e queijo Minas frescal) comercializados no município de Piracicaba – SP. Em outro estudo, Pereira et. al (1999) avaliaram 168 amostras de queijos (Minas Padrão, Minas Frescal e Canastra) e constataram ausência do patógeno em 100% dos queijos. Em uma pesquisa conduzida por Cotton e White (1992), em seis indústrias beneficiadoras de leite e quatro produtoras de sorvete, Salmonella spp. estavam presentes em apenas 1,2% (4/353) das amostras ambientais.

Das amostras analisadas, Listeria spp. foi isolada em três delas, incluindo as duas amostras (BL e LV) de queijo de coalho feito a partir de leite pasteurizado. Listeria monocytogenes foi a espécie identificada na amostra BL. Entre os microrganismos patogênicos encontrados, Listeria monocytogenes pode ser considerada um dos mais sérios com relação à saúde pública, devido a gravidade da doença por ela causada e pela alta taxa de letalidade (Centers for Disease Control and Prevention, 2002).

A presença de Listeria spp. em queijos também foi relatada por Silva et al. (2003) que realizaram um estudo sobre a ocorrência desta bactéria em pontos críticos de controle do ambiente do processamento de queijo Minas frescal. Foram colhidas 218 amostras ao longo da linha de produção e do ambiente, sendo que, destas, 30 foram positivas para este microrganismo. As espécies identificadas foram: Listeria innocua, Listeria grayi e Listeria monocytogenes.

Feitosa e outros (2003) avaliaram a qualidade microbiológica de queijo de coalho artesanal produzido no Rio Grande do Norte e não constataram a presença de L. monocytogenes, embora 9% das amostras de queijos estivessem contaminadas por Listeria sp. Resultado similar foi observado por Bruno e outros (2005) quando pesquisaram esta bactéria em queijo de

coalho artesanal e industrial comercializados em Fortaleza (CE). Em pesquisa semelhante realizada por Rocha (2004) em uma linha de produção de queijo Minas frescal, a presença de L. monocytogenes também não foi constatada na linha de produção, mesmo tendo sido observada alta prevalência de outras quatro espécies de Listeria em superfícies de equipamentos e de ambientes. Nero e outros (2004) não isolaram L. monocytogenes em leite cru, proveniente de 210 propriedades leiteiras localizadas nos estados de Minas Gerais, Rio Grande do Sul, Paraná e São Paulo. Nos Estados Unidos, Canadá e Europa, apenas 3-4% do leite cru apresentou contaminação por Listeria spp. (Kozak et al., 1996). L. monocytogenes não foi detectada em 100% das amostras de leite (13) e queijo Minas frescal (25) estudadas por Rocha (2004). Em outro estudo, Cassarotti, Gallo e Camargo (1994) não detectaram L. monocytogenes em 100% (57) das amostras de leite cru, leite pasteurizado tipo C e queijos Minas frescal. Em queijo mussarela de leite de búfala pasteurizado, Listeria spp. não foi isolado nas 72 amostras analisadas (Olivieri, 2004).

A partir do método utilizado para a pesquisa de coliformes, foi possível identificar a presença de E. coli, Klebsiela sp., Enterobacter sp., Citrobacter sp.. Adicionalmente, outras bactérias Gram-negativo, não pertencentes ao grupo dos coliformes, foram isoladas e identificadas: Pseudomonas sp. e Proteus sp. (Quadro 2).

A presença desses microrganismos demonstra as condições inadequadas de processamento, manipulação e estocagem das amostras analisadas indicando a contaminação microbiana de origem fecal e a possível presença de linhagens de E. coli patogênicas para o homem e animais (Franco; Landgraf, 1996). Os coliformes podem causar defeitos nos produtos lácteos levando à deterioração do alimento, como o estufamento precoce, alteração do formato e do sabor. Além disto, indicam a probabilidade da existência de outros patógenos Gram negativo

.

Tabela 7: Espécies de microrganismos do grupo coliforme e outros Gram negativo identificados em amostras de queijo de coalho artesanal e industrial, produzidos em Pernambuco

Amostra Klebsiela sp. Enterobacter sp. Citrobacter sp. E. coli Proteus sp. Pseudomonas sp.CM + + ND + ND +AB + ND ND + ND +AQ ND + + + ND +BL ND ND + + ND +SM ND + ND ND + NDLV + ND ND ND ND ND

ND = Não Detectado

A presença de Pseudomonas sp. em quatro das seis amostras analisadas, incluindo uma amostra de queijo de coalho industrial, é preocupante devido a possibilidade de Pseudomonas aeruginosa ser a espécie envolvida, pois é a mais patogênica para o homem. Esta bactéria pode causar infecção intestinal (enterite e

enterocolite), levando a diarréia de evolução prolongada, que pode terminar em caquexia; ou diarréia aguda com comprometimento do equilíbrio hídrico e eletrolítico. Também podem ocorrer infecções auditivas, respiratórias, urinárias, nervosas, oculares, cutâneas e até septicemia.

A enumeração de E. coli por Simplate esta apresentada no quadro 3. A enumeração confirmou os dados da pesquisa de coliformes a 45ºC (pela técnica dos túbos múltiplos), sendo que nas amostras CM e AQ, contagens menores de E. coli em relação aos maiores NMP de coliformes a 45º indicam a presença de outras bactérias

Gram negativo termotolerantes, como Klebsiella sp.. Este resultado demostra problemas higiênico-sanitários ocorridos durante a produção dos queijos. A presença dessas bactérias sugere a possibilidade da presença de patógenos como Proteus sp. e Shigella sp.. Entretanto, Salmonella sp não foi detectada.

Tabela 8: Enumeração de E. coli (NMP/g) em amostras de queijo de coalho artesanal e industrial produzidos em Pernambuco

Amostras Escherichia coli (NMP/g)LV 190CM 28AB 470AQ 6BL > 738SM 440

4.6. Isolamento, enumeração, purificação e identificação de Staphylococcus spp. e suas enterotoxinas

Verificaram-se elevadas contagens deste microrganismo, tanto nas amostras de queijo artesanal quanto nas amostras de queijo industrializado. Os níveis populacionais encontrados foram superiores a 106

UFC/g (Tabela 9), sendo estes valores de grande preocupação do ponto de vista de saúde pública, pois indicam quantidades suficientes deste patógeno para a produção de enterotoxinas em quantidades suficientes

para produzirem casos de toxinfecção (Carmo et al., 1996). Este fato compromete a segurança alimentar deste produto, mesmo se consumido após receber algum tipo de tratamento térmico, pois as enterotoxinas estafilocócicas são termoestáveis, podendo, desta forma, ocasionar surtos (Carmo et al, 2002). Adicionalmente, as condições de transporte e comercialização destes queijos, realizadas de forma inadequada, sob temperaturas superiores às de refrigeração proporcionam condições para o microrganismo crescer e produzir estas enterotoxinas (BergdolL, 1989).

Tabela 9: Enumeração de Staphylococcus spp. em amostras de queijo de coalho artesanal e industrializado

QUEIJO Staphylococcus spp.(UFC/g)

LV 1,8 x 107

BL 6,7 x 106

AQ 1,1 x 106

CM 2,0 x 107

AB 2,0 x 107

SM 2,7 x 107

Os resultados demonstrados na Tabela 9 reforçam os achados na literatura que apontam o Staphylococcus como o principal patógeno envolvido em casos de toxinfecção alimentar relacionadas ao consumo de queijo (Cerqueira et al., 1994, Carmo et al., 1996, Carmo et al, 2002), em especial o queijo de coalho (Sena, 2000). Estes resultados são bastante significativos, pois, considerando-se apenas Staphylococcus spp. verificaram-se contagens semelhantes àquelas de BAL (Tabela 3), demonstrando poder não haver relação entre as populações de BAL e de Staphylococcus sp. A presença de Staphylococcus aureus produtores de enterotoxinas em queijo de coalho foi também descrita por Florentino e Martins (1999), Mendes et al. (1999), Leite-Júnior et al. (2000); Sena (2000); Bastos et al. (2001), Escobar et al. (2001) e Rapini et al. (2002).

Pode-se perceber contagens semelhantes de Staphylococcus spp. em queijos artesanais e industriais (Tabela 9), demonstrando que a pasteurização do leite não deve ser a única medida de controle da presença deste patógeno em queijos. Este resultado reforça as

conclusões de Carmo (2001), indicando que Staphylococcus spp. e suas enterotoxinas são um dos principais microrganismos de preocupação em alimentos pasteurizados.

A presença de Staphylococcus spp. nestes queijos também está relacionada à manipulação inadequada do produto. Tal fato pode ocorrer durante as várias etapas de produção dos queijos, incluindo a salga e a enformagem, como pôde ser documentada na produção artesanal e até mesmo industrial. Apesar do laticínio LV ter implantado BPF´s, a salga e a enformagem tornaram-se pontos críticos pela excessiva manipulação. A presença deste microrganismo em queijos industrializados também está associada à falta de cuidados higiênico-sanitários durante o processamento dos mesmos. Ressalta-se que o homem é a principal fonte de contaminação de Staphylococcus spp. em produtos submetidos à pasteurização, pois 30 a 50% das pessoas sadias são portadores deste microrganismo. O mesmo pode ser encontrado nas fossas nasais, nos leitos sub-ungueais, nas mãos e na garganta dos portadores, além de furúnculos e feridas supurativas da pele

(Moutinho, 2001). Além disto, água, utensílios e equipamentos mal higienizados dentro dos laticínios também podem ser fonte de contaminação deste microrganismo.A identificação das espécies de Staphylococcus foi realizada por intermédio de provas bioquímicas citadas anteriormente. Trinta e dois isolados foram identificados como Staphylococcus aureus, três como Staphylococcus cohnii e um como Staphylococcus intermedius. Resultados semelhantes foram descritos por Sena (2000), ao pesquisar a presença destes microrganismos em queijo de coalho, comercializado em Recife (PE).

De acordo com a caracterização bioquímica destas cepas (Anexo E), pode-se perceber a predominância de Staphylococcus spp. coagulase positivo, o que seria refletido em contagens destes microrganismos acima dos padrões oficiais estabelecidos para a inspeção de queijos de média e alta umidade (Brasil, 1996; Brasil, 2001) em todas as amostras de queijo de coalho pesquisadas.

A pesquisa de enterotoxinas, realizada pela técnica de OSP, revelou a produção de SEB em dois “pools”, contendo Staphylococcus aureus isolados do queijo AQ, e também da cultura de Staphylococcus cohnii, coagulase negativo, isolado do queijo LV, testada isoladamente. Detectou-se a presença de cepas potencialmente produtoras de enterotoxina em queijo artesanal e industrializado, demonstrando mais uma vez a necessidade de melhoria das condições de processamento destes alimentos. Sena (2000) e Rapini et al. (2002) também detectaram a presença de Staphylococcus spp. produtores de SEB em amostras de queijo de coalho, adquiridas no comércio varejista do Nordeste.

Como no presente trabalho, Sena (1998), Sena (2000), Carmo (2001) e Carmo et al. (2002) demonstraram a presença de cepas de Staphylococcus spp. coagulase negativo produtoras de enterotoxinas. Isto ressalta a necessidade de se rever a legislação em vigor (Brasil, 2001), que determina a pesquisa de Staphylococcus apenas coagulase positivo em queijo de coalho.

Não foram detectadas cepas produtoras de TSST-1, sendo este resultado diferente daquele obtido por Sena et al. (1998) que isolaram cepas de Staphylococcus spp. produtoras desta toxina.

4.7. Teste de antagonismo "in vitro" entre as cepas isoladas de queijo de coalho e contra microrganismos indicadores

Para realização dos testes de antagonismo “in vitro”, as amostras de BAL, isoladas dos queijo de coalho, foram testadas frente às mesmas, frente a três cepas de Staphylococcus (S. aureus, S. cohnii e S. intermedius) e uma de Escherichia coli isoladas destes queijos, e também frente à microrganismos de referência.

4.7.1. Atividade antagonista frente a BAL, isoladas de queijo de coalho

Pode-se observar, quando são comparadas as atividades antagonistas das espécies de BAL testadas frente às mesmas e à outras BAL também isoladas das mesmas amostras de queijo de coalho (Tabela 10), que houve grande variação com relação aos valores dos diâmetros dos halos de inibição. Além disto, percebe-se que nem sempre uma mesma cultura foi inibida por todas as culturas potencialmente antagonistas utilizadas. Entretanto, verificou-se que as culturas reveladoras Lactobacillus fermentum, (AB3MRS), Streptococcus thermophilus (BL1MRS) e Lactobacillus acidophilus (LV3MRS) não foram inibidas por nenhuma cultura produtora de substância(s) antagonista(s). Esta característica seria desejável para a sobrevivência destes microrganismos em ambientes que apresentam uma microbiota diversificada e complexa, como é o caso dos queijos.

A análise estatística não paramétrica destes resultados (Tabela 10) demonstrou que não houve diferença significativa (p>0,05) entre as atividades antagonistas das culturas produtoras frente às BAL reveladoras. Portanto, apesar das culturas de Lactobacillus spp. terem inibido um maior número de culturas reveladoras em relação aos Lactococcus spp. testados estatisticamente, esta diferença não foi verificada

.

Tabela 10: Atividade antagonista de culturas de BAL isoladas de queijo de coalho frente às mesmas e a outras BAL (halo de inibição em mm)

Reveladora AB2MRS AB3MRS AQ1MRS LV3MRS CM2<M17 AQ4M17AB1MRS 30,75 33,73 51,70 16,65 19,72 0AB2MRS - 0 19,14 0 0 0AB3MRS 0 - 0 0 0 0AQ1MRS 22,58 17,07 - 0 0 0AQ2MRS 9,77 0 13,95 53,72 0 0BL1MRS 0 0 0 0 0 0CM3MRS 24,05 0 33,22 0 0 0CM4MRS 41,92 33,00 37,17 27,87 21,00 0LV1MRS 33,08 38,62 39,07 17,78 17,49 27,98LV3MRS 0 0 0 - 0 0AQ4M17 25,10 23,20 22,27 28,50 18,72 0CM2<M17 0 0 0 21,40 - 23,31Média 15,60a 12,13a 18,04a 13,82a 6,41a 5,03a

aLetras minúsculas sobrescritas distintas indicam valores das médias estatisticamente diferentes (p<0,05)

AB2MRS = L. casei; AB3MRS = L. fermentum; AQ1MRS = L. rhamnosus; AQ2MRS = E. faecalis; BL1MRS = S. thermophilus; CM3MRS = W. confusa; CM4MRS = E. faecalis; LV1MRS = E. faecalis; LV3MRS = L. acidophilus; AQ4M17 = L. raffinolactis; CM2<M17 = L. lactis.

Estes resultados demonstram o potencial de antagonismo in vitro, mas não necessariamente este antagonismo ocorra in vivo. Isto porque as cepas de BAL AB1MRS, AB2MRS e AB3MRS demonstraram atividade antagonista entre elas no teste in vitro e, no entanto estão presentes no mesmo queijo (AB).

Para a seleção de BAL isoladas de queijo de coalho com a finalidade de compor culturas que poderiam melhorar a qualidade sanitária deste alimento, o ideal seria que estas não interferissem com a atividade de outras BAL desejáveis. Desta forma, de acordo com os resultados estatísticos demonstrados acima, qualquer uma das culturas isoladas de Lactobacillus spp. e Lactococcus spp. poderia ser utilizada com a finalidade anterior, mantendo as propriedades sensoriais típicas deste alimento.

4.7.2. Atividade antagonista frente a Staphylococcus spp. e Escherichia coli, isolados de queijo de coalho

De acordo com os dados demonstrados na Tabela 11, percebe-se que todos os Lactobacillus spp. testados foram capazes de inibir as cepas de Staphylococcus spp.

e Escherichia coli isoladas das mesmas amostras de queijo de coalho. Houve grande variação dos valores dos diâmetros dos halos de inibição, principalmente, porque a cultura AQ4M17 (Lactococcus raffinolactis) não apresentou nenhum tipo de antagonismo frente à estes indicadores.

Portanto, verificou-se que os Lactobacillus spp. apresentaram melhor potencial de inibição em relação aos Lactococcus spp., quando testados frente à estes patógenos. Isto foi confirmado pela avaliação estatística dos dados, demonstrando que as atividades antagonistas de Lactobacillus casei (AB2MRS) e Lactobacillus rhamnosus (AQ1MRS) foram superiores (p<0,05) às de Lactococcus lactis (CM2<M17) e Lactococcus raffinolactis (AQ4M17). Estes resultados mostram um melhor potencial de utilização destes Lactobacillus spp. para a melhoria da qualidade do queijo de coalho, em relação ao controle do desenvolvimento de bactérias indesejáveis, isoladas neste mesmo tipo de queijo. Este fato é relevante, pois Staphylococcus spp. é o principal patógeno encontrado neste alimento (SENA, 2000) e Escherichia coli também está freqüentemente presente neste queijo, quando elaborado sem adoção de medidas higiênico-sanitárias (Leite-Júnior et al., 2000; Bastos et al., 2001; Escobar et al., 2001; Nascimento et al., 2001).

Tabela 11: Atividade antagonista de culturas de BAL isoladas de queijo de coalho frente a Staphylococcus spp. e Escherichia coli (halo de inibição em mm)

Reveladora AB2MRS AB3MRS AQ1MRS LV3MRS CM2<M17 AQ4M17

CM2>M17 36,62 29,27 34,70 27,23 0 0

LVAT5 33,82 27,14 40,31 28,90 0 0

AQAT1 43,38 29,07 37,41 30,11 19,41 0

SMTP2 46,64 43,51 45,99 31,86 23,42 0

Média 40,11a 32,24abc 39,60a 43,55abd 10,70 bcd 0 bcd

aLetras minúsculas sobrescritas distintas indicam valores das médias estatisticamente diferentes (p<0,05) AB2MRS = L. casei; AB3MRS = L. fermentum; AQ1MRS = L. rhamnosus; LV3MRS = L. acidophilus; AQ4M17 = L. raffinolactis; CM2<M17 = L. lactis; CM2>M17 = E. coli; LVAT5 = S. cohnii; AQAT1 = S. intermedius; SMTP2 = S. aureus

4.7.3. Atividade antagonista frente a cepas referência de patógenos relevantes em saúde pública

Como observado nos outros testes de antagonismo, os resultados das inibições de patógenos de referência pelos microrganismos testados (Tabela 12) demonstraram grande variação com relação aos valores dos diâmetros dos halos de inibição. A única cultura que deixou de inibir algum tipo de bactéria reveladora, como ocorreu nos outros testes, foi Lactococcus raffinolactis (AQ4M17), não atuando frente a Salmonella Enteritidis typhimurium, Listeria monocytogenes e Escherichia coli.

Avaliando estes resultados à luz da estatística, percebe-se que houve diferenças significativas (P<0,05) entre as atividades antagonistas pesquisadas. Lactobacillus casei (AB2MRS), Lactobacillus fermentum (AB3MRS) e Lactobacillus rhamnosus (AQ1MRS) foram os microrganismos que apresentaram halos de inibição significativamente maiores (p<0,05) contra as bactérias de referência testadas. Mais uma vez, os Lactobacillus spp. tiveram maior potencial antagonista em relação aos Lactococcus spp., realçando ainda mais efeitos inibitórios benéficos dos primeiros, tanto contra patógenos de relevância nos queijos de coalho, quanto contra patógenos de referência.

Tabela 12: Atividade antagonista de culturas de BAL isoladas de queijo de coalho frente a patógenos de referência

Reveladora AB2MRS AB3MRS AQ1MRS LV3MRS CM2<M17 AQ4M17

BC 87,25 90,00 90,00 71,64 36,84 32,54

AS 51,88 49,54 52,61 33,17 20,16 16,61

SE 45,30 43,40 47,24 30,88 22,93 0

YE 35,33 37,39 46,50 33,73 25,09 43,28

LM 35,03 47,07 44,80 39,14 22,81 0

ST 44,98 41,89 39,87 32,61 26,07 24,09

SF 79,20 84,18 86,22 90,00 63,60 53,62

PA 89,12 81,92 86,12 34,65 74,60 41,79

EC 54,62 41,17 69,77 28,04 54,87 0

Média 58,07a 57,39a 62,57a 43,76ab 38,55 ab 23,54 b

aLetras minúsculas sobrescritas distintas indicam valores das médias estatisticamente diferentes (P < 0,05)AB2MRS = L. casei; AB3MRS = L. fermentum; AQ1MRS = L. rhamnosus; LV3MRS = L. acidophilus; AQ4M17 = L. raffinolactis; CM2<M17 = L. lactis; BC = B. cereus (ATCC); AS = S. aureus (ATCC29213); SE = S. enteritidis Typhimurium (ATCC12228); YE = Y. enterocolitica (ATCC); LM = L. monocytogenes (ATCC15313); ST = S. typhi (ATCC14028); SF = S. flexneri; PA = P. aeruginosa; EC = E. coli (ATCC25723)

Adicionalmente, analisando os resultados dos antagonismos, considerando todos os tipos de inibição pesquisados (contra bactérias desejáveis e indesejáveis), a análise estatística de Kruskal-Wallis revelou que a cultura Lactobacillus rhamnosus (AQ1MRS) foi aquela que apresentou maior média de halos de inibição, enquanto que a cultura Lactococcus raffinolactis (AQ4M17) demonstrou ser aquela com menor média de halos de inibição. Entre a s espécies de Lactobacillus a amostra L acidophilus (LV3) foi a que apresentou menores halos de inibição frente aos patógenos de referência.

Resultados semelhantes aos deste trabalho foram encontrados por outros autores que também demonstraram atividade antagonista de Lactobacillus spp. isolados de queijos artesanais frente à patógenos, como podem ser citados: Vaughan et al. (1994), por exemplo, verificaram inibição de Staphylococcus aureus, Listeria innocua e Pseudomonas fragi; Alexandre et al. (2002) detectaram atividade antagonista contra Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Listeria innocua, Salmonella Enteritidis thyphimurium. Caridi et al. (2003) observaram antagonismo frente à Escherichia coli. Estas observações indicam uma interessante perspectiva tecnológica de utilização destas culturas de BAL para o controle de patógenos em queijos artesanais, principalmente. Entretanto, é necessário se avaliar a viabilidade de utilização destes microrganismos com relação às características ligadas ao sabor e as outras propriedades organolépticas desejáveis do produto.

Adicionalmente, atividade antagonista de BAL isolada de leite frente a bactérias indesejáveis também foi

relatada por outros pesquisadores. Fang et al. (1998) verificaram atuação contra Staphylococcus aureus e Escherichia coli, Brearhers e Durre (1999) observaram ação antagonista contra Salmonella spp. e Escherichia coli O157:H7 e Uraz et al. (2001) detectaram inibição frente à Bacillus cereus.

Todas as atividades inibitórias verificadas nos itens anteriores relacionadas ao antagonismo de microrganismos indicadores desejáveis ou não podem ser justificadas pela produção de substâncias inibidoras que teriam se difundido pelo ágar e impedido o crescimento das culturas reveladoras. Dentre estas, podem ser citados: ácidos orgânicos (como ácido láctico), peróxido de hidrogênio, dióxido de carbono, diacetil, acetaldeido e substâncias antimicrobianas de natureza protéica, denominadas bacteriocinas (Naidu et al., 1999). Como as BAL isoladas e testadas apresentaram comportamento respiratório diversificado, Lactobacillus spp. e Lactococcus spp. testados no antagonismo e se comportaram como microaerófilos nos testes respiratórios (Tabelas 4 e 5), qualquer um destes mecanismos poderia estar envolvido na inibição das culturas reveladoras.

4.8. Teste de sensibilidade das bactérias ácido-lácticas isoladas frente aos antimicrobianos

A sensibilidade dos microrganismos (BAL, Escherichia coli e Staphylococcus spp.) isolados de queijo de coalho aos principais grupos de drogas antimicrobianas foi

testada, utilizando-se técnica de difusão em ágar MRS e Müller-Hinton.

O teste de sensibilidade de BAL, isoladas de queijo de coalho artesanal, frente a diversas drogas

antimicrobianas revelou um perfil de resistência indesejável da maioria destes microrganismos aos diferentes grupos de antimicrobianos testados (Tabelas 13 e 14).

Tabela 13: Perfil de resistência de microrganismos isolados de queijo de coalho em teste de difusão em ágar MRS com discos de antimicrobianos

Cultura AK KF CIP SXT CTX C E CN OX P TE VAAB2MRS R S MS R S S S R R S S RAB3MRS R S R R S S S R R S S RAQ1MRS R S S R S S S S R S S RBL1MRS R S R MS S S S R MS S S RCM2>M17 R S MS R R S S R R MS S SCM3MRS R S R R S S S S R S S R

S = sensível; MS = moderadamente sensível; R = resistenteAK=AMIKACINA; KF=CEFALOTINA; CIP=CIPROFLOXACIN; SXT=SULFA-TRIMETROPRIM; CTX=CEFOTAXIME; C=CLORANFENICOL; E=ERITROMICINA; CN=GENTAMICINA; OX=OXACILINA; P=PENICILINA; TE=TETRACICLINA; VA=VANCOMICINAAB2MRS = L. casei; AB3MRS = L. fermentum; AQ1MRS = L. rhamnosus; BL1MRS = S. thermophilus; CM2>M17 = E. coli; CM3MRS = Weissella confusa;

A maioria dos microrganismos testados mostrou-se resistente a amikacina e a oxacilina, sendo observada também menor sensibilidade dos mesmos à associação sulfa-trimetroprim e a vancomicina. A resistência de Lactobacillus spp. a vancomicina é uma característica comum, sendo associada a este gênero (Christensen; Wind, 2003), porém neste trabalho, verificou-se que a cultura Lactobacillus acidophilus (LV3MRS)apresentou-se sensível a esta droga antimicrobiana, o que pode ser interessante, inclusive do ponto de vista comercial, uma vez que não é interessante se usar culturas com propriedades de resistência aos antimicrobianos na elaboração de produtos destinados ao consumo humano e animal, afim de se previnir a transferência destes fatores de resistência a outros microrganismos, principalmente patogênicos.

Verificou-se um menor número de microrganismos isolados de queijo de coalho artesanal, sensíveis à ação do cloranfenicol. Apenas uma cepa de Enterococcus faecalis (CM4MRS) foi resistente à ação deste antimicrobiano. A sensibilidade à esta droga seria desejável, pois a utilização deste produto químico em

animais de produção é proibida (Brasil, 2003b). Tal fato se deve aos riscos da presença de seus resíduos em alimentos de origem animal, pois estes podem induzir o aparecimento de cepas de microrganismos resistentes ao cloranfenicol e causar efeitos hematotóxicos no homem, incluindo reticulocitopenia, anemia e, em alguns casos, leucopenia (granulocitopenia) e trombocitopenia (Food and Agriculture Organization / World Health Organization 1988; Yunis e Bloomberg, 1994).

Observou-se também maior sensibilidade dos microrganismos isolados frente a cefalotina, sendo resistente apenas o Lactococcus raffinolactis (AQ4M17) e moderadamente sensível, duas cepas de Enterococcus faecalis (AQ2MRS e CM4MRS).

O microrganismo, dentre aqueles isolados de queijo de coalho artesanal, que demonstrou maior resistência a um maior número de drogas foi o Enterococcus faecalis (CM4MRS). Esta cultura apresentou-se resistente à oito das doze drogas testadas, e moderadamente sensível a uma destas drogas.

Tabela 14: Perfil de resistência de microrganismos isolados de queijo de coalho em teste de difusão em ágar Müller Hinton frente a diferentes antimicrobianos

Cultura AK KF CIP SXT CTX C E CN OX P TE VA

AB1MRS S S MS S S S S S MS S S S

AQ2MRS R MS S S R S R R S R R S

AQ4M17 R R S S R S R R S R R S

BL2M17 R S S S R R R S R MS R S

CM1MRS S S S S S S S S R S S R

CM4MRS R MS S S R R R R R R R S

LV1MRS MS R S S R S S S R R S S

LV2MRS R R S S R S S S R R S S

LV3MRS S S S S S S R S MS S R S

AQAT1 S S S S R R S S S MS R S

LVAT5 S S S S S S S S S S S S

SMTP2 S S S S S S S S S S S S

S = sensível; MS = moderadamente sensível; R = resistenteAK=AMIKACINA; KF=CEFALOTINA; CIP=CIPROFLOXACIN; SXT=SULFA-TRIMETROPRIM; CTX=CEFOTAXIME; C=CLORANFENICOL; E=ERITROMICINA; CN=GENTAMICINA; OX=OXACILINA; P=PENICILINA; TE=TETRACICLINA; VA=VANCOMICINAAB1MRS = S. thermophilus; AQ2MRS = E. faecalis; BL1MRS = S. thermophilus; CM4MRS = E. faecalis; LV1MRS = E. faecalis; LV2MRS = ; LV3MRS = L. acidophilus; AQ4M17 = L. raffinolactis; LVAT5 = S. cohnii; AQAT1 = S. intermedius; SMTP2 = S. aureus; BC = B. cereus (ATCC); AS = S. aureus (ATCC29213); SE = S. enteritidis typhimurium (ATCC12228); YE = Y. enterocolitica (ATCC); LM = L. monocytogenes (ATCC15313); ST = S. typhi (ATCC14028); SF = S. flexneri; PA = P. aeruginosa; EC = E. coli (ATCC25723).

Enterococcus spp. estão amplamente distribuídos na natureza, sendo que os tratos gastro intestinais de humanos e animais são seus habitat naturais. Eles podem contaminar alimentos crus e diversos gêneros alimentícios através da água e inadequadas condições higiênicas de produção e manipulação dos mesmos. Estes microrganismos são conhecidos por terem resistência à maioria dos antimicrobianos utilizados na clínica humana e veterinária. Enterococcus spp. multi-resistentes e resistentes à vancomicina são comumente isolados de humanos, animais, habitat aquáticos e resíduos agropecuários, demonstrando a probabilidade de estarem presentes na cadeia alimentar humana (Lukasova E Sustackova, 2003). Os Enterococcus spp. resistentes à vancomicina são considerados uma ameaça à saúde pública em todo o mundo. Entretanto, no presente trabalho, apesar de terem sido identificados Enterococcus faecalis multi-resistente, não foi verificada a resistência à vancomicina.

Chingwaru et al. (2003) isolaram Enterococcus faecalis multi-resistentes à antimicrobianos em leite, carne bovina e carne de frango. A presença de Enterococcus spp. multi-resistentes que podem ser transmitidos ao homem por alimentos contaminados também tem sido relacionada à problemas na medicina humana, como em pacientes internados em centro de terapia intensiva (CTI) (Johnson et al., 2003).

Streptococcus thermophilus (AB1MRS), isolado de queijo artesanal, foi a cultura que demonstrou ser sensível a um maior número de antimicrobianos, sendo moderadamente sensível a apenas duas (oxacilina e ciprofloxacina) das doze drogas testadas. Contrariamente, a cepa Streptococcus thermophilus (BL2M17), isolada de queijo industrial, foi a que apresentou resistência a um maior número de antimicrobianos testados, inclusive ao cloranfenicol.

Este resultado é ainda mais preocupante, quando se observa que este queijo foi elaborado com adição de cultura láctica comercial, teoricamente composta por bactérias selecionadas. Desta forma, não seria desejável encontrar Streptococcus thermophilus multi-resistentes aos antimicrobianos em sua constituição.

Um importante fato a ser destacado, refere-se à possibilidade de transmissão entre microrganismos de fatores relacionados à resistência aos antimicrobianos (Danielsen e Wind, 2003). Observando as tabelas 13 e 14, vrifica-se que alguns microrganismos presentes em mesmas amostras de queijo de coalho (AB e AQ) apresentam perfis de resistência às drogas testadas praticamente idênticos. Estas bactérias seriam (AB3MRS) Lactobacillus casei e AB3MRS (Lactobacillus fermentum) no queijo AB e AQ2MRS (Enterococcus faecalis) e AQ4M17 (Lactococcus raffinolactis) no queijo AQ. Tal resultado pode levantar a hipótese de que uma cultura transmitiu estes fatores de resistência à outra, principalmente por se tratarem de espécies de microrganismos semelhantes, do ponto de vista filogenético.

A possibilidade de transmissão de fatores relacionados à resistência aos antimicrobianos pode ser observada também entre os microrganismos isolados de queijo de coalho industrial (Tabela 14). Na amostra LV duas cepas de microrganismos LV1MRS (Enterococcus faecalis) e LV2MRS (sugestivo de Lactobacillus sp. do grupo acidófilo) demonstraram perfis de sensibilidade frente aos antimicrobianos testados praticamente iguais.

Com relação ao resultado de perfil de sensibilidade frente aos antimicrobianos testados, das cepas de Staphylococcus spp. isoladas de queijo de coalho artesanal e industrial, apenas Staphylococcus intermedius (AQAT), isolada de queijo de coalho

artesanal, apresentou resistência a alguns dos antimicrobianos utilizados, entre eles o cloranfenicol. A resistência observada frente ao cloranfenicol reforça a possibilidade da utilização indevida desta droga nas propriedades produtoras de leite.

A presença de bactérias resistente à ação de antimicrobianos em queijos pode ser indicativa de que o uso indiscriminado de antimicrobianos na produção leiteira cria uma pressão seletiva sobre os microrganismos, levando à expressão de fenótipos de resistência frente a determinados grupos de drogas antimicrobianas. Associado a este fato pode ocorrer também à transmissão de fatores ligados à resistência entre microrganismos, fazendo com que aqueles que antes apresentavam sensibilidade frente a determinado antimicrobiano, passe a ser resistente a esta droga. Isto pode ter reflexos indesejáveis, tanto na medicina veterinária, quanto humana (Danielsen; Wind, 2003)

4.9. Determinação da capacidade de espécies de Lactobacilus spp de colonizar o trato digestivo de camundongos isentos de germes Para ser utilizado como probiótico, primeiramente um microrganismo deve ser resistente às condições adversas do trato gastrointestinal e chegar ao seu local de ação e permanecer em números elevados para que possa exercer seu efeito benéfico. A tabela 3 mostra a

contagem de Lactobacillus spp nas fezes de camundongos monoassociados, durante 10 dez dias, após inóculo único de 108 células das linhagens de Lactobacillus spp. Todas as amostras conseguiram colonizar os animais em níveis que variavam desde 8,15 ± 0,29 log UFC/g de fezes (L. fermentum AB3) até 9,53 ± 0,45 log UFC/g de fezes (L. acidophilus LV3) 24 horas após a inoculação. Esses níveis populacionais variaram ao longo de 10 dias e a linhagem L. acidophilus LV3 foi a que apresentou contagem populacional estatisticamente superior, entretanto a colonização foi muito semelhante entre a maioria das leveduras ao final de 10 dias.

Este primeiro experimento in vivo mostrou que todas as linhagens conseguiram se estabelecer e persistir no trato digestivo de animais isentos de germes por pelo menos 10 dias (período em que a colonização foi acompanhada). Os níveis populacionais das 4 especies nos animais monoassociados variaram de 108 a 109.

Todas as amostras foram capazes de colonizar o trato digestivo de animais isentos de germes e de se manterem em níveis elevados. No animal convencional, seriam necessárias ingestões diárias para que estes mesmos níveis fossem mantidos, pois à exceção dos Lactobacillus rhamnosus GG e Lcr35, não se conhecem probióticos capazes de persistirem por um longo período no trato digestivo do adulto (Alander et al., 1999; De Champs et al., 2003).

Tabela 15: Contagem de Bactérias Ácido-Lácticas nas fezes de camundongos monoassociados, durante 10 dias, após o inóculo inicial com 108 células.

Linhagem Tempo (dias)

Dia 1 Dia 2 Dia 5 Dia 10 Total

L. acidophilus LV3 9,53 ± 0,45 9,13 ± 0,05 9,15 ± 0,14 9,14 ± 0,06 9,24 ± 0,27 a

L. casei AB2 8,20 ± 0,17 8,03 ± 0,13 8,19 ± 0,25 8,78 ± 0,16 8,30 ± 0,34 b

L. fermentum AB3 8,15 ± 0,29 7,65 ± 0,57 8,24 ± 0,08 8,52 ± 0,24 8,14 ± 0,44 b

L. ramnhosus AQ1 8,58 ± 0,17 8,26 ± 0,46 8,50 ± 0,46 8,29 ± 0,06 8,41 ± 0,32 b

Os resultados estão expressos em log10 UFC/g de fezes. N = 5 aLetras minúsculas sobrescritas distintas indicam valores das médias estatisticamente diferentes (P < 0,05)

4.9.1. Determinação dos níveis populacionais da levedura nas diversas porções do trato gastrointestinal de camundongos gnotobióticos (GN) A Figura 1 apresenta os níveis populacionais de Lactobacillus spp no conteúdo do estomago, intestino delgado – porção distal –, ceco e cólon do trato gastrointestinal de camundongos NIH gnotobióticos monoassociados com dose única de 108 células de L. casei AB2 (A), L. fermentum AB3 (B), L. acidophilus LV3 e L. rhamnosus AQ1 (D). Os resultados mostram que os níveis populacionais da linhagens de Lactobacillus spp foram maiores na porção distal do intestino delgado. Estes resultados mostram que as linhagens atingiram níveis populacionais potencialmente funcionais nas porções do trato digestivo onde agem os enteropatógenos.

Um perfil de níveis populacionais semelhante foi encontrado por Vasconcelos et al. (2003) com a espécie L. murinus. Entretanto, nossos resultados divergem um pouco uma vez que encontramos níveis populacionais mais elevados em animais convencionais e não em animais monoassociados. Apesar dos níveis populacionais diferentes observados nas linhagens estudadas o perfil geral entre elas é semelhante, sendo que estes níveis são consideravelmente altos no estômago, decrescem ligeiramente na porção proximal do intestino delgado e, a partir daí, aumentam e atingem níveis máximos nas regiões onde o trânsito intestinal é menor, como no ceco e no cólon.

O estômago de camundongos convencionais é colonizado por espécies de Lactobacillus sp e leveduras (Savage, 1977). Este fato pode explicar porque neste

modelo os níveis populacionais deste órgão alcançaram um número tão elevado. No estômago humano, o pH mais baixo e a provável falta de receptores de adesão,

quando comparado com roedores, deve levar a resultados diferentes.

A B

C D

Figura 1. Níveis populacionais de Lactobacillus spp. no conteúdo do estômago (I), intestino delgado – porção dista (II), ceco (III) e cólon (IV) do trato gastrointestinal de camundongos NIH gnotobióticos (A) monoassociados com dose única de 108 L. casei AB2 (A); L. acidophilus LV3 (B); L. rhamnosus AQ1 (C) e L. fermentum AB3 (D). N = 5.

4.10. Determinação do efeito de Lactobacillus spp na colonização intestinal por S. Typhimurium em camundongos gnotoxênicos (GN)

As Figuras 2 a 5 mostram as populações fecais de S. Typhimurium em camundongos NIH gnotobióticos, monoassociados ou não com uma dose de 108 células viáveis das amostras de Lactobacillus acidophlus LV3; L. rhamnosus AQ1; L. casei AB2 e L. fermentum AB3, respectivamente, dez dias antes do desafio com a bactéria patogênica. A cinética de instalação das bactérias também, é mostrada nestas figuras. Nos camundongos GN monoassociados com Lactobacillus

spp, os níveis populacionais se mantiveram entre 108 e 1010 UFC/g de fezes. Após o desafio os grupos monoassociados a L acidophilus e L. casei apresentaram contagens dessas bactérias superiores às de S Typhimurium. Nos demais grupos as contagens de Lactobacillus spp e S Typhimurium foram equivalentes. Pode-se observar também a maior sobrevivência dos animais monoassociados a Lactobacillus spp em ralação aos não associados. Neste experimento, os animais previamente monoassiciados aos Lactobacillus spp tiveram menores contagens de bactérias patogênicas quando comparado ao grupo isento de germes monoassociado a S. Typhimurium.

L. rham nosus AQ 1

Porção do trato gastrointestinal

Lo

g 10 U

FC

/g

0

2

4

6

8

10

12

I II II I IV

L. ferm entum AB3

Porção do trato gastrointestinal

Lo

g 10 U

FC

/g

0

2

4

6

8

10

12

I II I I I IV

L. casei AB2

Porção do trato gastrointestinal

Lo

g 10

UF

C/g

0

2

4

6

8

10

12

I II I I I IV

L. acidophilus LV3

Porção do trato gastrointestinal

Lo

g 10 U

FC

/g

0

2

4

6

8

10

12

I II I I I IV

A produção de substâncias antagonistas por Lactobacillus murinus contra bactérias enteropatogênicas foi avaliada in vivo assim como um possível efeito protetor contra um desafio oral com Salmonella Typhimurium utilizando um modelo animal gnotobiótico. Um maior tempo médio de sobrevida (P < 0,05) foi observado nos animais associados com L. murinus (7,89 ± 3,83 dias) quando comparado com os controles (4,44 ± 0,73 dias) (Vasconcelos; Nicoli; Nardi, 2003).

Outro experimento semelhante foi conduzido por Moura et al 2001. A capacidade de Lactobacillus acidophilus UFV-H2B20 de antagonizar Salmonella enterica subsp. enterica ser. Typhimurium, e de reduzir as conseqüências patológicas para o hospedeiro foram determinadas em animais convencionais e gnotobióticos. L. acidophilus UFV-H2B20 colonizou o trato digestivo dos camundongos gnotobióticos e o

número de células víaveis flutuou entre 109 e 1010 ufc/g de fezes, número semelhante ao encontrado no nesse experimento. Assim como no atual experimento em ambos os grupos, experimental e controle, S. Typhimurium se estabeleceu rapidamente numa faixa de 108 a 1010 ufc/g de fezes e se manteve em níveis elevados até os animais morreram ou serem sacrificados. Em conclusão, o tratamento prévio de camundongos com Lactobacillus sspp estudados em ambos os experimentos protegeu os animais contra a infecção experimental com S. Typhimurium mas essa proteção não se deve à uma redução das populações patogênicas nos intestinos.

L casei AB2 foi aquela amostra que demonstrou maior capacidade de reduzir os níveis populacionais de S. Typhimurium no trato digestivo dos camundongos (P < 0,037).

Figura 2: Populações fecais de S. Typhimurium em camundongos NIH gnotobióticos, monoassociados (●) ou não (♦) com uma dose de 108 células viáveis da levedura L. rahmnosus AQ1 (■) dez dias antes do desafio com 103 células da bactéria patogênica. N = 3.

1 2 5 6 7 9 12 15 19

0

2

4

6

8

10

12

Tempo (dias)

Log

10 U

FC

/g f

ezes

Figura 3: Populações fecais de S. Typhimurium em camundongos NIH gnotobióticos, monoassociados (●) ou não (♦) com uma dose de 108 células viáveis da levedura L. casei AB2 (■) dez dias antes do desafio com 103 células da bactéria patogênica. N = 3.

Figura 4: Populações fecais de S. Typhimurium em camundongos NIH gnotobióticos, monoassociados (●) ou não (♦) com uma dose de 108 células viáveis da levedura L. fermentum AB3 (■) dez dias antes do desafio com 103 células da bactéria patogênica. N = 3.

1 2 5 6 7 9 12 15 19

0

2

4

6

8

10

12

Tempo (dias)

Log

10 U

fc/g

fez

es

1 2 5 6 7 9 12 15

0

2

4

6

8

10

12

Tempo (dias)

Log

10 U

FC

/g f

ezes

Figura 5: Populações fecais de S. Typhimurium em camundongos NIH gnotobióticos, monoassociados (●) ou não (♦) com uma dose de 108 células viáveis da levedura L. acidophilus LV3 (■) dez dias antes do desafio com 103 células da bactéria patogênica. N = 3.

A sobrevida dos camundongos de cada grupo foi medida ao longo do experimento. O grupo monoassociado ao L. fermentum AB3, previamente ao desafio com S. Typhimurium foi aquele que apresentou tempo de

sobrevida estatisticamente maior em relação aos demais grupos (P < 0,001). A figura 6 mostra o resultado de sobrevida para todos os grupos.

Figura 6. Sobrevida dos camundongos monoassociados ou não (I), antes do desafio com 103 de S Typhimurium, com dose única de 108 de L. casei AB2 (II); L. fermentum AB3 (III); L. rhamnosus AQ1 (IV) e L. acidophilus LV3 (V). N = 5.

Te

mp

o (

dia

s)

0

5

10

15

20

25

I II I I I IV V

1 2 5 6 7 9 12 15

0

2

4

6

8

10

12

Tempo (dias)

Lo

g 1

0 U

FC

/g f

ez

es

Nenhuma das amostras de Lactobacillus spp estudadas demonstraram resultados estatisticamente inferior ao do grupo de camundongos isentos de germes (controle) após o desafio intragástrico com solução salina contendo 103 de S. Typhimurium.

L rahmnosus AQ1 (13,1 ± 6,1 dias), L. casei AB2 (10 ± 3 dias) e L. fermentum AB3 (14,3 ± 4,8 dias) se mostraram capazes de aumentar a sobrevida dos camundongos, enquanto a amostra L. acidophilus LV3 (6,4 ± 1,9 dias) não demonstrou essa capacidade em relação ao grupo controle (7,3 ± 1,7 dias). Camundongos associados a L. fermentum AB3 previamente ao desafio com S. Typhimurium foi o grupo com maior sobrevida (P< 0,001).

4.10.1. Anatomopatologia

Foram analisadas lâminas histológicas dos seguintes órgãos: fígado, íleo, colon, ceco e baço, de camundongos isentos de germes infectados com Salmonella Typhimurium, previamente monoassociados com L rahmnosus AQ1, L casei AB2, L. fermentum

AB3 ou L acidophilus LV3. O grupo controle recebeu apenas o desafio com S Typhimurium. Apenas para os animais tratados com L. rahmnosus AQ1 houve alterações relevantes no figado em comparação ao grupo controle.

Houve alterações não relevantes no baço, colon e íleo de todos os grupos, não havendo diferenças significativas entre eles.

No ceco, houve a presença difusa de células inflamatórias (Figura 8) na região da submucosa, com predomínio de macrófagos e, principalmente, neutrófilos (Figura 9). Não há diferença entre os infectados não tratados ou tratados com Lactobacillus spp.No fígado, o infiltrado inflamatório se organizou de forma focal, também com predomínio de macrófagos e neutrófilos. Não houve diferença marcante entre o número e tamanho de focos inflamatórios no parênquima hepático de animais não tratados e tratados com AB2, AB3 ou LV3. Animais tratados com AQ1 mostram um número bem reduzido de células inflamatórias (Figura 7).

A

B

A

Figura 7 - Corte Histológico de fígado de camundongos isentos de germes infectados com Salmonella typhimurium não tratados (A) e tratados com AQ1 (B). Notar a presença de focos inflamatórios no parênquima hepático de fígado infectado não tratado (seta) Hematoxilina e Eosina. Barra = 100 µm.

A

Figura 8- Corte Histológico de ceco de camundongos isentos de germes infectados com Salmonella Typhimurium não tratados (A) e tratados com Lactobacillus spp (B).. Notar presença de infiltrado inflamatório (seta). Hematoxilina e Eosina. Barra = 100 µm

A análise histológica demonstrou que a monoasociação com a L. rahmnosus AQ1 reduziu o número de focos inflamatórios no figado desses animais. Porém nenhuma alteração morfológica positiva pode ser vista nos demais órgãos analisados (intestino e baço). As lesões produzidas na mucosa intestinal, principalmente no ceco e no cólon, do grupo GN desafiado com a S. Typhimurium foram caracterizadas por edema, exudato de células inflamatórias, mono e polimorfonucleares, na lâmina própria, por vezes com destruição avançada das vilosidades e criptas intestinais, que foram substituídos por tecidos granulomatosos ou apresentaram-se erodidas ou fundidas. Houve alargamento da lâmina própria e das vilosidades intestinais. Sinais de congestão e hemorragia focais na lâmina própria e serosa do órgão. O grau de lesão entre os grupos controle e experimental foi muito semelhante, não havendo evidências de proteção no grupo tratado com a levedura.

4.11. Determinação do efeito de Lactobacillus spp no desenvolvimento ponderal e na mortalidade por S. Typhimurium em camundongos convencionais (CV)

Para realização deste experimento, foram utilizadas as amostras Lactobacillus (L. casei AB2, L. fermentum AB3, L.acidophilus LV3 e L. rahmonosus AQ1) isoladas dos queijo de coalho. Foram utilizados camundongos convencionais suíços, derivados de matrizes isentas de germes inoculadas com diluição fecal filtrada de animais convencionais sadios, sendo

usados somente os camundongos a partir da segunda geração após a convencionalização.

Os animais dos grupos experimentais (N = 30) receberam diariamente por via intragástrica 0,1 mL de solução salina contendo aproximadamente 109 ufc/mL de espécies de Lactobacillus spp. (AB2, AB3, AQ1 e LV3). Os camundongos do grupo controle (N = 10) receberam diariamente 0,1 mL de solução salina tamponada. Após 10 dias todos os grupos receberam por via intragástrica 0,1 mL de solução salina tamponada contendo aproximadamente 105 ufc/mL de S. Typhimurium. Durante os experimentos, os camundongos convencionais foram pesados em dias alternados. Também foram registradas as mortes decorrentes da infecção experimental, por um período de 28 dias após a infecção experimental, para posterior comparação das taxas de sobrevida e sobrevivência dos animais do grupo controle e dos grupos experimentais. Observou-se diferença no desempenho ponderal e na mortalidade nos grupos tratados com os Lactobacillus, o que sugere um potencial probiótico dessas linhagens de lactobacilos.

A tabela 16 mostra a taxa de sobrevivência, tempo médio de sobrevida e peso médio ao fim dos experimentos dos animais tratados ou não com Lactobacillus spp após o desafio com a S. Typhimurium. Assim como foi observado em animais gnotobióticos (GN), também houve proteção contra a infecção neste modelo (animal CV).

Figura 9- Corte Histológico de ceco de camundongos isentos de germes infectados com Salmonella Typhimurium não tratados (A) e tratados com Lactobacillus spp.. Notar presença de neutrófilos na submucosa (seta). Hematoxilina e Eosina. Barra = 25 µm

B

Tabela 16: Sobrevivência, tempo médio de vida e peso médio dos camundongos CV após o desafio com Salmonella Typhimurium

Controle Grupo AB2 Grupo AB3 Grupo AQ1 Grupo LV3

Taxa de sobrevivência (%) 20%b 60%ac 50%bc 30%bc 20%b

Tempo médio de vida (dias)

14,6 ± 5,5bc 18,1 ± 4,1ac 16,7 ± 5,6bc 15,5 ± 4,7bc 13,7 ± 4,5b

Peso médio (g) 14,18 ± 4,77a 15,12 ± 5,33a 14,45 ± 3,62a 13,73 ± 3,55a 13,33 ± 4,18a

aLetras minúsculas sobrescritas distintas indicam valores das médias estatisticamente diferentes (P < 0,05).

Para a análise estatística da sobrevivência nos grupos foi utilizado o método de análise de sobrevivência de Kaplan-Meier (Log Rank). A comparação dos grupos foi feita pelo método de Holm-Sidak (P < 0,05). Os resultados mostram que o grupo AB2 (L. casei) foi aquele com sobrevivência estatisticamente superior ao grupo controle, demonstrando efeito protetor frente a infecção experimental por S Typhimurium nos camundogos testados.

A comparação dos tempos médios de sobrevida entre os grupos foi realizada através de uma análise de variância não paramétrica (Kruskal-Wallis), mesma metodologia empregada para a análise dos dados de peso. No caso do tempo médio de sobrevida o teste utilizado para comparação das médias foi o teste de Tukey. Os resultados confirmaram o observado para a sobrevivência, sendo o grupo tratado com L casei AB2 aquele com maior tempo de sobrevida. A análise do desenvolvimento ponderal mostrou não haver diferença estatisticamente significativa entre os grupos estudados.

As espécies de Salmonella são descritas como parasitas intracelulares facultativas que se multiplicam em macrófagos residentes do baço e do fígado (Salyers e Whitt, 1994) e que apresentam como sítio inicial de infecção o íleo terminal do intestino delgado (Carter e Collins, 1974). A linhagem de Salmonella utilizada nos experimentos causa uma doença extremamente invasora nos camundongos GN e CV, sendo mais grave nos primeiros, devido à ausência da microbiota. A presença da microbiota pode ter agido em sinergismo com a Lactobacillus spp para a proteção contra o desafio com a S. Typhimurium, conforme evidenciado pela diminuição na mortalidade dos animais CV previamente tratados com L casei AB2, do aumento da sobrevida nos animais GN tratados com L fermentum AB3 e pelos dados histológicos do fígado dos animais GN tratados com L rahmnosus AQ1 (Figura 2), sugerindo uma diminuição na translocação do patógeno.

Segundo a FAO/ WHO em sua norma de procedimentos para probióticos, um microrganismo, para ser classificado com probiótico, precisa passar pelos seguintes testes: 1) identificação até espécie ou, em alguns casos, até linhagem, uma vez que se sabe que muitos efeitos benéficos são linhagem-específicos; 2) deposição da linhagem em uma coleção de cultura internacional; 3) caracterização funcional através de testes in vitro, 4) avaliação da segurança através de testes em animais e fase 1 (teste de segurança e ausência de patogenicidade do microrganismo) de estudos em

seres humanos; 5) evidências de efeitos benéficos em modelos animais e mecanismos de ação; 6) estudos clínicos duplo-cego, aleatório, placebo-controlado (fase 2 de estudos em seres humanos); 7) segundo estudo clínico duplo-cego, aleatório, placebo-controlado independente, para confirmação dos resultados; 8) ensaios efetivos para comparar o tratamento com o probiótico com outros tratamentos disponíveis (fase 3 de estudos em seres humanos) e 9) comercialização em escala industrial contendo a linhagem presente no produto, número de células viáveis mínimo ao final da validade, condições de estocagem e indicações (fase 4 de estudos em seres humanos).

No presente estudo, as amostras de Lactobacillus spp. já passaram por alguns destes testes (1 e 3) e parcialmente por outros (4 e 5). É conhecido o potencial probiótico destes microrganismos que estão sendo demonstrados devido à proteção conferida contra a infecção pelo S Typhimurium. Entretanto, ainda existem vários experimentos a serem executados antes de partirmos para experimentos em seres humanos.

Uma vez evidenciada a proteção conferida pelas amostras de Lactobacillus spp. testadas, é necessário prosseguir com os estudos, verificando os mecanismos pelos quais os microorganismos exerceram seu efeito benéfico e comparar os resultados com aqueles já descritos para a Lactobacillus spp. e tentar esclarecer os mecanismos para os efeitos protetores das bactérias estudadas contra a ação de alguns patógenos.

5. CONCLUSÕES

Existem importantes diferenças entre os fluxogramas de produção dos queijos de coalho industrial e artesanal pesquisados, sendo estas relacionadas à tecnologia e cuidados higiênico-sanitários, podendo influenciar a composição e as características físico-químicas e microbiológicas dos produtos finais.

O ágar M17 apresentou maior variedade de espécies de microrganismos isolados, incluindo BAL e enterobactérias, enquanto que o ágar MRS demonstrou maior seletividade quanto ao isolamento de BAL.

Queijos de coalho artesanais e industriais podem estar contaminados com Staphylococcus spp., e microrganismos patogênicos como Listeria monocytogenes não sendo a pasteurização do leite a única medida a ser adotada para o controle destes patógenos na produção deste tipo de alimento.

Staphylococcus spp. coagulase negativo produtores de enterotoxinas podem ser encontrados em queijos de coalho, sugerindo que seja revista a legislação que estabelece critérios microbiológicos para a inspeção sanitária deste alimento, que determina a pesquisa de Staphylococcus coagulase positivo.

A atividade antagonista in vitro de Lactobacillus spp foi estatisticamente (P < 0,05) superior ao de Lactococcus spp frente a microrganismos patogênicos de referência.

Microrganismos presentes em queijos de coalho artesanal e industrial apresentam diferentes perfis de sensibilidade às drogas antimicrobianas, incluindo a presença de Enterococcus faecalis multi-resistente e Lactobacillus acidophilus sensível à vancomicina.

Microrganismos presentes em um mesmo queijo de coalho podem apresentar perfis de sensibilidade aos

antimicrobianos semelhantes, indicando provável troca de resistência por mecanismos genéticos.

Existe grande variação dos resultados de parâmetros físico-químicos (principalmente acidez titulável) entre as amostras de queijo de coalho analisadas, sendo que as mesmas classificam-se como semi-gordas a gordas e de alta ou muito alta umidade.

Lactobacillus spp isolados de queijo de coalho, avaliados nesse estudo apresentaram potencial probiótico, uma vez que foram capazes de apresentar atividade antagonista in vitro frente a diversos patógenos de interesse em saúde pública, apresentaram capacidade de sobrevivência às condições do trato gastrointestinal e capacidade de colonização e foram capazes de promover ação protetora em camundongos gnotobióticos e convencionais frente a infecção experimental por Salmonella Typhimurium.

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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7. ANEXOS

Anexo A - Fluxogramas de produção de queijo de coalho artesanal e industrial

Fluxograma 1: Fluxograma de produção de queijo de coalho do laticínio BL

Recepção da matéria prima

Padronização da gordura do leite a 3%

Pasteurização a 76C/15 a 20 segundos

Adição de ingredientes: coalho liquido 20mL/100L e cloreto de cálcio 20mL/100L

Coagulação 35C/40 minutos

Corte da massa (corte pequeno)

Mexedura de 1 hora

Dessoragem

Salga da massa 12Kg de sal para 2.800 L

Enformagem com pano

Prensagem por 30 minutos

Viragem da forma

Prensagem por 30 minutos

Câmara fria (4C) 12-24 horas

Corte

Embalagem a vácuo

Câmara fria (5-6C)

Transporte

Comercialização

Fluxograma 2: Fluxograma de produção de queijo de coalho do laticínio LV

Recepção da matéria prima

Padronização da gordura do leite a 3,2%

Pasteurização 75C/15 a 20 segundos

Adição de coalho liquido 30-50 ml para 100L

Adição de cloreto de cálcio 30-50ml para 100L

Adição de cultura mesofílica

Coagulação por 40 minutos

Corte da massa (grão pequeno)

mexedura por 20 minutos a 35C

Descanso por 20 minutos

Retirada do soro

Salga da massa

Enformagem

Prensa por 20 minutos

Viragem da forma

Prensa por 20 minutos

Embalagem a vácuo

Camara fria 5-10C

Fluxograma 3: Fluxograma de produção de queijo de coalho da fazenda AQ.

Recepção do leite ordenhado

Adição de coalho liquido

Coagulação por 40 minutos a 1 hora

Mexedura por aproximadamente 5 minutos

Repouso por 10 minutos

Retirada do soro com balde

Transferência da massa para um saco

Enformagem

Prensagem

Estocagem em “freezer” a 10C por 12 horas

Retirada da forma

Estocagem em freezer a 10C

Retirada 1 dia antes da venda

Lavagem

Embalagem

Comercialização

Fluxograma 4: Fluxograma de produção de queijo de coalho da fazenda CM.

Recepção do leite da própria fazenda

Adição de bicarbonato de sódio e coalho em pó dissolvido em água

Coagulação 40-45 minutos

Corte da massa (1cm)

Primeira mexedura 5 min. Descanso 5 min.

Segunda mexedura 5 min. Descanso 5 min.

Terceira mexedura Descanso 5 min.

Retirada do soro

Colocação da massa em formas

Pensa 5 min.

Salga

Colocação das formas em prateleiras para escorrer o soro por 12 horas

Refrigeração

Embalagem

Comercialização

Anexo B - Gram de culturas isoladas de queijo de coalho artesanal (AB e CM).

Figura 10: Gram de cultura isolada de queijo de coalho artesanal (AB), identificada como Lactobacillus fermentum.

Figura 11: Gram de cultura isolada de queijo de coalho artesanal (AB), identificada como Streptococcus thermophilus.

Figura 12: Gram de cultura isolada de queijo de coalho artesanal (CM), identificada como Weissella confusa.

Anexo C - Resultados dos seqüenciamentos dos produtos de PCR16S-23S clonados em vetor Topo.

AB1 MRS - primer 16S

GGGTGATATCCGGCCTGGTTTAATGGCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGTGAGCCAGCCGCCTAAGGTGGGATAGATGATTTGGGTGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTATCGGAAGTGTGCGTGCTGGATCACCTCCTTTCTAAGTGATAAACTGTGAAGCACGTTTGGGTATTTGTTTAGTTTTTGAGAGTGTCTTGTGTGTGTGCCTTAGCTCAAGCTGGTGAGANGCTGCCTGCTTTTGCACTGCAGTGAGTGTCAGCTGTGTTCGATCCCTGCTAGTGCTCCATTGAATCGAAAGATTCAAGTATTTGTCCATTTGAAAATTTGAATATCTATATCAAATTCCATATGTAAGTAATTACATATAGATAGTAACAAGAAAATAAACCGAAACGCTGTGAATATTTAATGAGTTAGGTCGAAAGGCCAAAAATAAGGTTAAGTTAATAAGGGCGCACGGTGGATGCCTTGGCACTAGAAGCCGATGAAGGACGTGACTAACGACGAAATGGCTTTGGGGAAGCTGTAAGTGAGCAATGATCCAGAGATGTCCGAATGGGGGAATGCGAGAATTTGNTGGAATGGAANTG

AB1 MRS - primer 16S

GGGGATATCCGGCCTGNATTACGGCCGTCACACACGAGAGTTTGTAACACCGAAGTCTGGGTGAGGTAACCTTTTAGTGAGCAGCCGCCTAAGGTGGGATAGATGATTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTATCGGAAGGGTTGGCTGTGCTGGATCACCTCCTTTCTAAGGAT

AAACGGAAGCACTGTTTTGGGTATTTGTTTAGTTTTGAGAGGTCTTGTTGGGGGCTTAGCTCAGCCTTGGGGAGGAAGCCGCCTGGTTTGGCACCGCCAGGAAGGCCGCGGGGTCTCGAACTCCCGGTTAGCGCCTCCTATGGATACTCCGAAGAAGATTCAATGTTATTTGTCCATTGAACAATTTGAATATCTATATCAAATTCCATATGTAAGTAATTACATATAGATAGTAACAAGAAAATAAACCGAAACGCTGTGAATATTTAATGAGTTAGGTCGAAAGGCCAAAAATAAGGTTAAGTTAATAAGGGCGCACGGTTGGATGCCTTGGCACTAGAAGCCGATGAAGGACGTGACTAACGACGAAATGCTTGGGGAGCTGTAAGTGAGCAATGATCCAGAGATGTCCGAATGGGGGAAANCGNAATCCNGGGAAGTCACTTGACACCATGNCCANGAGGCCATATTTGTAANAAAAATTATCGGTAAGATCTGGACCANGCTCACGGCANNAAAAGNATTATCACTAAATACACACGATATNAAGACGAGTATAATCCCGACTAANTNANNAAAGACNNGATAAACAAAANCNNTCATATATACAAACGGGGTTATTNGTGCCCNTAATCAGCCACACTNNACCACACTGNTNTCGGAGACANTNAACA

AB2 MRS - primer 16S

TNGTTCTGATGTCGGGCCTNNATTACGGCCGTCACACATGAGAGTTTGTAACACGAAGCGGTGGCGTAACCTTTTAGTGGAGCGAGCGTCTAAGTGTGGGACAAATGATTAGTGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTAGTGAGAACCTGCGTGCTGGATCACCTCCTTTCTAAGTGAAACAGACTGAAAGTCTGACGTGAAACCTGCACACACGAAACTTTGTTTAGTTTTGAGGGGATCACCCTCAAGCACCCTAACGGGTGCGACTTTGTTCTTTGAAAACTGGATATCATTGTATTAATTTGTTTTAAATTTGCCTGAGAACACAGCTGTATTTGTATGAGTTTCTGAAAAAGAAATTCGCATCGCATAACCTGCTGACGCAAGTCAGTACAGGTTAACTGTTACAAATGGGCGCACGGTGTGATGCCTTGTGCACTAGGTGAGCCGATGAAGTGACGTGAACTAATACCGATCATGCTTCGGGGAGCTATAAAGTAACGCTTTTGATCCGGAGATTTCCGAATTGGTGGTGAACCAACTCGCTACCCACAAGNCCTTACCTCCACTATGACCCCATATATAACTAATTNACAACGTAATTAAATCAACANCCTACNCGCCGCNTATATANTCGT

AB2 MRS - primer 16S

TTTTGTTTTCGAATCGGGCTTGGTTACGGCCGTCACACATGGAGAGTTTGTAACACGAAGCGGTGGCGTAACCTTTTAGTGGAGCGAGCGTCTAAGTGTGGGACAAATGATTAGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTAGGAGAACCTGCGTGCTGGATCACCTCCTTTCTAAGGAAACAGACTGAAAGTCTGACGNGAAACCTGCACACACGAAACTTTGTTAGTTTTGAGGGGATCACCCTCAAGCACCCTAACGGGTGCGACTTTGTTCTTTGAAAACTGGATATCATTTGTATTAATTGTTTTAAATTTGCCGAGAACACAGCGTATTTGTATGAGTTTCTGAAAAAGAAATTCGCATCGCATAACCGCTGACGCAAGTCAGTACAGGTTAAGTTACAAAGGGCTGCACTGGTGGATGCCTTGTGCACTAGGAGCCGATGAAGTGACTGGAACTAATACCGATATGCTTCGGGGAGCTATAATGTAAGCTTTGATCCGGAGGATTTCCGAANTGGTGGGAACCNATTNTACTCAANAGTNTTAAANTAATNNACCCCAAAAAA

AB3 MRS - primer 16S

TTTTTTTGTTTTTTTTTGTGATACTTCGGGCTGGTTAACGGCGTCACACATGAGAGTTTGTAACACCAAGTCGGTGGGGTAACTTTTAGGAGCCAGCGCTAAGGTGGGACAGATGATTAGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTAGGAGAACCTGCGTGCTGGATCACCTCCTTTCTAAGGAATTAATCGGAAACCTACACATTGTCGAAACAGTGTTCAGTTTTGAGGGGTTTACCTCTCAGCTTGTACTTTGAAAACTAAATAATATCAATTTCTAATAACAATCAAGAAAACCGAGAACACCGCGTTATGAGTTTTTAACGAATTATAATCGCATACTCAACTAACTTGACCTGATCTACGATCAGTACAGGTTACAGTTATGAAGGGCGCATGGTGACATGCCTTGGTACTAGGAGCCCGATGACAGGAACGGGAGACCTAAACCATCCCTGACTNNTTGCCTTCCGTCGCTGTGACGCTGTGATAATGCTA

A3 MRS - primer 16S

TTTTTTTGNTTTTTTTTGTATCCGGCTCGTGTTATGCCGTCNACCATGGAGCAGTTTGTGAACNCAAGTCGGTGGGGTAACTTTTAGTGAGCAGCGCTAAGTGTGGGACAGATGATTAGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCCGTAGTGAGAACCCTGCGGCTGGATCACCTCCTTTCTAAGTGAATTAATCGGAAACCTACACATTTGTCGAAACAAGTGTTCAGTTTTTGAGTGGGTTTACCTCTCAGTCTTGTACTTTGAAAACTAAATAATATCAATTTCTAATAAAATCTAATGAAAACCGAGAAAACTANCTGTGTTTATTTTGAGGTTTTTTAAACTGAAATTATAATCGCTATACTCAATTAACTTTTGACTTGAATACTANGGATACAAGT

AQ2 MRS - primer 16S

TGGGGCAAAGCTCGATATTCGGCCTTGATTAATGGCCGTCACACACGAGACGTTTGNAACACGAAGTCNGTGAGTGTAACCTTTTTTGGAGCAGCGCTAAATGTNGGATAGATGATTTGGGGTGAAGTCGTAACAATGTAGCCTGTATCGGAAGTGTGCGTGCTGGATCACCTCCTTTCTAAGTGAATATTACGTGAAATACACATTCGTCTTACCTTTATGGTTCCATGTATTTTTGGAAGATGTGTTCCTNAACCTCCTTCCAAAACACAATTTCTGCTTCCATTTTGGAAAACACCCTTGTGGACTAATTTGNACAATGCTAAATANATTAANTTCTCATTNACNCACTCCACCCCTTCNCTACCNNTCCCCCCCTNCTTTATCNAATTTCATNCNN

BL1 MRS - primer 16S

GGTACTGTGANCGTCCGGCCCTTGTTTAACGCCGGTCACACACGAGAGTTTGTACACCGAAGTCGGTGAGTGTAACCTTTTAGTGAGCCAGCCGCTAAGTGTGGGATAGATGATTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCTGTATCGGAAGTGTGCGTGCTGGATCACCTCCTTTCTAAGTGATAAACGGAAGCACGTTTGGGTATTTGTAGTTGAGAGGTCTTGTGGGGCCTTAGCTCAGCTGGTGAGAGCGCCTGCTTTGCACGCAGTGAGTGTCAGCGGTTCGATCCCGCTAGGCTCCATTGAATCGAAAGATTCAAGTATTGTCCATTGAAAATTGAATATCTATATCAAATTCCATATGTAAGTAATTACATATAGATAGTAACAAGAAAATAATACCTGANAACTGCNTGGTNATATTTTAAATTGAAGGTTCAGGGTCGAAANGTGTCCAAAAAATAAGGGTATTAAGTNTTTAAATACATNGGANGTCA

BL1 MRS - primer 16S

GGGGCCCCCCCCCGACTCNGCCTCGGTANTGTCCGTCACACCACCGACGACCTTTGGACTNAACGTCGGTACGGTACCCTTTTACGTGACGCAGCGCTAAGGTGGGATAGATGATTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTATCGGAAGGTGCGGTGGATCACCTCCTTTCTAAGTGATAAACGGAAGCACGTTTGGGTATTTGTTAGTGAGAGGTCTTGTGGGGCCTTACTCACTGGGAGAGCTGCCTGCTTTGCCACGCCAGGCAGGTCCAGCGGTTCCGCATCCCCGCTAGGCTCCCATTGCAATCGCAAAGCATTCCAAGTCATTTGTCCCATTTGCAACAATTGCAATATCTATCATCCAAATTCCCATATGTAAGTAATTCACCATCATAGATAGTCAACAAGCAAAATAAACGAAAGCTGTGAATATTAATGCAGTAGGTCAAGGGCAANATAANAGGGGTTAACGGTATACCTTAAAAGGGTGNAGCATA

CM3 MRS - primer 16S

GAAAATNAGAGAANGGACNGTNNGGGANGTGTGGANGTGGTNTGTGTGGGGGGTGGGCNGTTNCNGTATNTNCGCNNTNGTCANGATGTGANGTTGANGTTTGTGAGTTAGNNGTC

TTCANTGTTTGTAGAGNGTATGNNGTATGGTTTTGATGTACNTNTANCANTTGCGTCGGTTGTGCTTGGGNTTTTNATTATTGTGNTATGTTGTNTGTAGTTGAGNTTNGANTGTAGNGTGGGTATATTTGTTTTTATCTATTCCNTCTCCTNCATGTGTCAACNGTGNGTNCTATNNATTNATGTTCTTTCT

CM3 MRS - primer 16S

AAACTTTTTTTTTGTTTTTTTTCTGCGGACATCTGGCCTGNGATTAATGCCTGTCACACCATGCAGCCGTTTGGAACTNACCAAGCTGGTNGNTGTCAACTTCTGGGCAGCCCANCTGTCTCAATGTGGGCACAGCATGCATTCAGTGGTGAAGTCTGTGCAACGCNCATGGCAGCCTGCATGCAGCAACTGCNGTGCTGGCATCTANCCCCTTNCCATNTTTCCCTAAATGTGACANCANATCCTGTGNCANACACCCCTTAACCCATCCAATTTACCCAAATTCCTAGNAATAAAACCTTAAAAATAAATTACCNAAATAATATTATATNNCCNCNTTGCCAATTCTACAACCACNCATTCCCACATAANTCTAANATTCTATAATCACTTACTACTT

CM4 MRS - primer 16S

TTTTTTTGTTTTTTCTCGATTTCGGCCTCGGTTATGGCCGTCACACACGAGACCTTTGGAACTCGAAGTCGGTGAGTGTAACCTTTTTGGAGCAGCGCCTAAGTGTGGGATAGATGATTGGGGTGAAGTCGTAACAANGTACCTGTATCGGAATGTGCGTGTGGATCACCTCCTTTCTAAGTGAATATACGTGAAATACACATCGCTACTTTGTCAGTGAAGTGTCCTAACCTCCTCAANAAACCATTTC

LV1 MRS - primer 16S

CTTTTTTTTTGGNTTTTTTTGTGATATCCGGCCTCGTTATGCCGTCACACACGAGACTTTGTAACTACGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTTGGAGCAGCCGCCTAAGGTGGGATAGATGATTGGGGTGAAGTCTGTAACAAGGTAGCCGATACGGAAGGTGCTGGCTGGATCACCTCCTTTCTAAGTGAATATTACTGTGAGACTACACAATATTGTTTTACTTATGTTCAGTTTTTGAGAGGTTTACTCTCAAACACTATAGTGTATCATTNGAAAACTTGGATAATTTTGAAGTAAATTGTAATGTATTACAAAACNCTGGAACANCTGCTGTTGAAATTGATGTATTNTATNAAATAAAAGTATCAATTTGCATANAATANATACTTTGGATCTAAACTTACTAATCTGTNTTAGTAAAGAAATTGTGATTTCAAACAAAACCCCCC

LV1 MRS - primer 16S

CNANCNNNACCGCCGNCGCGCNGCACGNCNANNCCCGCGCGGGCAGCTGNNCGGGGCGNTTTTTTTTTTTTNTCTGTGGCCTTTCTTTNTCCCTGTCCCTGCTCGTACCTGGCCCCNGGTTTCCTGTCCTGTCACACCACCGACTGACNCNCCCTGGGTCNCTGTNTTTNGCCGTCGTGTGACGTGTACCNCCCTATCAGTTGTGCNGCCANGTCCTTGTCTCATTACACTGTGTTTGTTGTGACATATANATCATTGACATANTTGTGTGGTGTTTGACATGC

AQ4 M17 - primer 16S

CGGAAGTCGGCCCTGTCTTNCGCCGTCACACACGAGAGTTTGTAATACAAGCCGGTGAGCTAACCTTTTAGGGAGGCAGCGTCTAAGGTAGGATAGATGATTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTATCGGAAGGTGCGGCTGGATCACCTCCTTTCTAAGGAAAAATGTTGCTTAGGCAAAACATGGGATAACTGTATTGGGAATGTCTGTTATTAGTTTGAGAGGTTTATACCTAAAACTGTAAAAATCTTCTCTAACAGAAGAAGGGGCCTTAGCTCAGCTGGGAGAGCGCCTGCTTTGCACGCAGGAGGTCAGCGGTTCGATCCCGCTAGGCTCCATTGTCAACGAAGACATAAAAATAGGCTTAGGATGTTGAAAGAGGCGTTTAGCTTCTAGAAACTCAACTAGATTTGATCATTGAAAACTGAATAACAATTTCTAAAATAACAAGAAATAAACCGAGAAGTG

GCGTAGTAATACGTCACCTCAAAAAAAGCGTGAGTATGAAAATACTCAATACTTATTACCAGATACTTAAATGTATCGAATTAAAGGTTAAGTTAATAAGGGCGCACGGTGGATGCCTTGGCACTAGAAGGGGGATGAAGGACGTGACTAACTACGAAAATTCTACGGGGGGAGCTGTAAGGTAAGCATTTGATCCCGTAGGGTGTCCGATGGGGGGACACCCCAACCACGGGCTANGTCCTTACNTACCCACAGTCATACCCAAGGCGCCTCCTAA

AQ4 M17 - primer 16S

CGGCCTTGTCTTACGCCGTCACACACGAGAGTTTGTAATACAAGCGGTNAGCTAACCTTTTAGGAGGCAGCGTCTAAGGTAGGATAGATGATTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTATCGGAAGGTGCGGCTGGATCACCTCCTTTCTAAGGAAAAATGTTTGCTTAGGCAAAACATGGATACTGTATTTGGGAATGTTTCTGTTTATTTAGTTTTGAGAGGTTTATACCTAAACTGTAAAAATCTTCTCTAACAGAAGAAGGGGCCTTAGCTCAGCTGGGAGAGCGCCTGCTTTGCACGCAGGAGGTCAGCGGTTCGATCCCGCTAGGCTCCATTGTCAACGAAGACATAAAAATAGGCTTAGGATGTTGAAAGAGGCGTTTAGCTTCTAGAAACTCAACTAGATTTGATCATTGAAAACTGAATAACAATTTCTAAAATAACAAGAAATAAACCGAGAAGTGGCGTAGTAATACGTCACCTCAAAAAAAGCGTGAGTATGAAAATACTCAAATACTTATTACCAGATACTTAAATGTATCGAATTAAAGGTTAAGTTAATAAGGGCGCACGGTGGATGCCTTGGCACTAGAAGGCGATGAAGGACGTGACTAACTACGAAATTCTACGGGGAGCTGTAAGTAAGCATTGATCCGTAGTGTCCGAATGGGGGNANGCCCAACCAGGGGGGCTATGGTCATTACNTATCGCTAGATTGTCCATAGCGTTGGGGCCTACCATANTTNGCACGGGCCATTGATNCTAATAACAAATTGCATCGAAGNTTAGNTTCTTA

BL2 M17 - primer 16S

GGCTGGTTATGGCCGTACACANGAGAGTTTGTAACACGAAGTCGGTGAAGTAACCTTTTAGGAGCTACGGCTAAAGNGTGGGANAAATAATGGGGGTNAAGTGAACAAAGGTAGCGGATATGGNAAGNNGTGGTTGGATATAACTTCTTTATTAAGGATAAGGGAAGAAGTAAGTTTAGTTAGNTTGAAGTGTTTGTNGG

CM2 M17< - primer 16S

GAAAAGCTGAAGTCGGGCCTNNATACGCCGTCACACACGGGAGTTGGGAGTACGAAGTAGGTTGCTAACGAAGGGAGGGCGCTTCCTAAGGTAAGACCGATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTATCGGAAGGTGCGGCTGGATCACCTCCTTTCTAAGTGAATATATACAAAGACGTGAGCATTCAACTTTATTCAGTTGAGTGGGTAGTCATAAACCTAATGCCAAGAATCACACTTCTTGATTTGTTGTGGTGCCTTAGCTCAGCGTGGGAGATGCTGCCTGCATTATGCACGCAGGAGTGTCAGCTGGTTCTGATCCCTGCTAGTGCTCCATTGTCCAGACAATGACTGTTTAAAATCACTTTGAACACCATTTGANNAATCACTANTATAACAAATATCTAATTAACGAATNAAATTAAATCTCTAAAAAAATGGCT

CM2 M17> - primer 16S

TTTTTTNTTTTTTTTTCTGTGTCGGCCTTTNATTACGGCCGTCACACATGGAGAGTTGGTATGCNNCGAGTAGGTAACTGTAACCTTTTAGGAAGGCNCTTACCACTTTGTGATTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAANGGTAACCGNAGGGAACCTGGTGGTGGATCACTTCTTACTTAANAAAACTGCTTTGATTGTACACAGATTGTT

CM3 M17 - primer 16S

GNAATCGATCATTCGGGCTNTACNTACGGCCGGTCACACCATGGGAGGTGGGTTGGCAAGAAGTATGTAGCTTAACCTTCGGGGAGGGCGCTTACCACTTTGTGATTCNTGACTGGGG

TGAAGTCGTAACAAGGTAACCTGTAGTGGGAACCTGCGTGTTGGATCACCTCCTTACTGAAGATACCTTCCCGGAAGTGCTCACACATGGAATTTGTTCTTGACTACAGANANNAACGTTAAATTGACGCACGTGACCTGTGCATTGACCGAACAGTACAGTAAAC

CM3 M17 - primer 16S

TTCCCTTTTTTCTGATTCGGCCTTNCTTCGGCCGGTCACACCATGGGAGTGGGTTGNAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTTACACTTTGTGATTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAACCTGTAGTGGGAACCTGCGTGTTGGATCACCTCCTTACCTGAAGATACCTTCCCGCGAAGTGCTCACACAGATTGTCTGATAAAAAGTATGAGCAGACTGGCTTGCCGAAAGATCGAGTAGNCACTTTTTGTTGTCCCCCTTCCGTACTAAGNCGCGTATAGAGAACCTCCNCGNCCTCTTTTACACGGTGGTGTGCACCACAGGGGTGTTACAGAATCCCTCATTAGGGGGGCACAGCACCATTTTGCCTTTTGTGNTTGACAGTGGTAGAACNCGGGNTTGTACTNCGCASM4 M17 - primer 16S

TTTGGCCTCTGATCGTCCGGCCTTGTTTAACGCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCGAAGTCNGTGANGTAACCTTTTAGTGAGCAGCGCCTAAGGTGGGATAGATGATTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTATCGGAAGTGTGCGTGCTGGATCACCTCCTTTCTAAGTGATAAACGTGAAGCACGTTTGGGTATTTGTTTAGTTTTGAGAGTGTCTTGTGGGGCCTTAGCTCAGCTGGTGAGAGCGCCTGCTTTGCACGCAGGAGTGTCAGCTGTGTTCGATCCCTGCTAGTGCTCCATTGAATCGAAATGATTCAACGTATTTGTCCATTTGAAAATTTGAATATCTATATCAAATTCCATATGTACAGTAATTACATATAGATAGTAACCAATGAAAATAAANCTGAAAACGCTGTTGAATTATTTAACATTGAAGTTTAGGGTCTGGAAAAAGGGCCAAAAAACATAATGGGTTAANGTTAACACTAAANGNGGGCAGACAAACAGGGAGTGTGGAATGCACANTTGNGGATCGAC

SM4 M17 - primer 16S

GGCNANCCNTGATATGGCTGGTTANGCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACTACGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGTGAGCCAGCGCCTAAGGTGGGATAGATGATTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTATCGGAAGGTGCGGCTGGATCACCTCCTTTCTAAGTGATAAACTGGAAGCACGTTTGGGTATTGTTTAGTTTTGAGAGGTCTTGTGGGGCCTTAGCTCAGCTGGGAGAGCGCCTGCTTTGCACGCAGTGAGNGTCAGCTGGTTCTGATCCCTGCTAGTGCTCCATTTGAATCGAAAGATTCAAGTATTTGTCCATTGAAAATTGAATATCTATATCAAATTCCATATGTAAGTAATTACATATAGATAGTAACAATGAAAATAAACCTGAAACTGCTGTGAATATTTAATGAGTTAGGTCGAAAGGGCAAAAATAAGTGTTAAGTTAAATAAGNGGCGCACTGGTTGGGATGCCATTGGGAAACATAAGAAAAGGCCCAGATTAGAAAAAGGANTGGTTGGAAGTAAAATGAAA

AB1 MRS - primer 23S

TCATATGGCCAGGGCTCTCCCACGGNGCGCCCCTANTATAACNCTAAACCTAATTTATGGGCCTATTCGAGACCNACTTCATAACATNTATCCACAGGGGTTCCGGGTTAATTTCCTTGGTAACCAATCCTAATATTGTGTAACTACCTNNACCTTATTGGGACATTTGGCATCNTCAGACATCTTCCAATTTTCTCCCAATTGGTGCACCATTACATTTTGGACATTCCTTCCGGAATCCCCACATGGGACAGCCTTAAGCGGTGGGAACTCGGACAANCCGGTTGAACCTTCCTGGCGGTTGCANAAGCAATGGCGTGCTTCTTCCCAAAGGTTTTGATAGCTATAAAGTGTGGCCCCAACAAAGACACCTTTCTTTCCACACACATTAAACAACCGA

AB1 MRS - primer 23S

CGACCGATACTATNACGCCCCACTGGTNAGTGATGCACGCTGTCTCTAACCCGGGTCTATTTGCCACGGTATCCNCGGGGGGCCCTATATAAACTAAACCCTAATTNCTGGGCCTAANNAGACCTNAACTTCACNTAAACTNATTCACCACAGGGGGGTTCCNGGTTACTTTCCCTGGNTAACNATANTCATATTANTGGTACANTAACCTATACCTATATTGGGACACTTTGAGACTATTACGAGANTATTTCCACATTTTTCCACTTGGGACCACNTACTTTGGACNTTCCTTTCCAGACTTCCAATTGGGACGCCTATACTGNCGTGGAGATTCGAGAACCCGGGTATAGAACCTTCCTTGTGACGAGTTNGGCAAAGGCAAGTGGCGGCTATCTTCCCCCAGGGCTATTGAGGGCTATAATGTGGCCCCCACAAAGAANCCTTCTTTCAAAAACTTAAAACCAATTTACCCCCCAAAAACNGGNTTGGCTTCNCCCGGGGGTNTCACATCCCTTTTTCAGGACACACGTGGGCATCGGGTCGAAACTCCCTTAAGGNCCCGGGGCAAACCCTATTCTCCCGGNATTTANNCGTGGG

AB2 MRS - primer 23S

CNCCCACCNGCCACCNCNCCACCTNTANANCCCCACACNCTCTNACACTACACTATACATATAGTCTCCGCCCCCACGGGGGGTTTTATAGAGTANTATGNGCCCCCGANGGCCCTTAACNANTCTTGGAGGACCTCCCTATATTGCCAAGGGGCTATNNNCACTGTGTGTGNGTGCCCATTGTGGAAACTTNANCCGGTCACTTGTGNACTTTGTGCGGTCTCNANGACTGTGGGTTCACNNNTGCGCACANGTGCGCACAAATTTTCCTCTTTTTATCCACAGACACACACTCTCACTTTCACCACAACATCTCANCGGGCCTGTGGGTGTATCTCTCTCGTGGTGGCCCACATTTTAACACACCACCACACCAAATTATACACATTTNCACCACACATAGTGAGATATANACTCCACNAAGTTTATCTCACAACAACAGGTACAACA

AB2 MRS - primer 23S

GACCTGAACATAATATACGCCCNCCATAGGTTTATANTAAGCCGGGCATAAACTCTGNGCTCCTATATTGGCAAGGGGTTCCACGGGTGGCGCCCCTTGTGTACTCTTAANCCTGGTACTGGACTTGCGTACAGGGGGTANTNGNAAAGGNAGAAATTCCTTTTCACNGAGAAACTTCTTACCAAATTCCGNCTGGGGTCTCTGGCANTTTAACAACCAATTTACTTACCAATTGGATTATCCAGGTTATNCACAAGNAACCAAAGGGTCGGCACCCGGTAAGGTGGTGGCCTGGAGTGTGGTTGATTCCCCTTCAAANTTACAACAAAGGTACCGGTGGTGTGCAGTGGTTCCCGGTCAGNAACTTTCANGTCTGGTTACCTTATAGAAAAGTGGAGGGTGATCCAAAGCCGGCAGGGTCCTTCCTTAGGGGTTTATCCTATTGGGTT

AB3 MRS - primer 23S

TTATGCTCCCGCGGTCTCTTACCCCCGGTGTGCCTTTATACCACAGGGGCTATTACAACATGTGTGTGCCCCTTACANTATACACTTATAACCCTTATACCCCGCGGCTTGGATAGACANTTTTTGGCTCACACGGNTACACGTTTGTAGANCGTATATTGTGGGAGACNTAATACTACACTTCTGTGGTTCACACACACCTCTCTACACACATTTACACCGCGCGCGTGGTTGTGTTTNCTCCTCGCGGTGNTATCATCCTCTTGTGAGCACCTTTTTCACCTTACAACGACAACACATCTTTGTGGGACAACATCTTANCCTTNACACNGTATTATTTATCCACCAACNAGTGTTTTAACCCACAGCGGCCNTGTGATCCGACACGGGGGGTAACAAC

AQ1 MRS - primer 23S

AGACTCATGAGGTATGTAAGNANNTGNGTTNNNTGNTTTTTNCTTTGCTATNNTCANATCTTAGACTACANGCAAATACTATNTAAGNTNANNAATTTNTTGGATATNTANATNNAACNTANTATTTTTACTNNNNTAGTTAGNGNATGGGATTCTTNATNTNTGANNTANNCGATATAATNGGNNANANGANGGATGCAGCTTGGTGGTTGGAAGANATAGAAANGGATGNATTANANTATNNNACANGTGGTAAGTANCCAAAAATANTANACAATNATCNGTNNANNAGAAANAAATATAAGGAGTGGNNNTGCTGTATNNATAGCGTNAGTNTANTAANCAATTNGGATGNN

ACTGGGGTGGAANGTGCGGANGGGNTTTAATGTGTGACTGTNNAGTNTANNTCTGGTGGCTTGCNTGTNTNNGCGTTCTGGGTGCNTTGTNAACGTNCAAACNGCATNTAANNACNGAACAGTGCTANTGGACNAGNGTNNTGTCTGTNACTTNNTTTGNTCTTTGTTGTTGNTGGATCGGTCNTTGNGNGCNGTTNNCTTTGGTNGTGTGA

AQ1 MRS - primer 23S

ACCCTNTTGGAATTCTTATGCCCCCAGTGTTTACATTNCGAGTTCGCGGCCTATACCCGGGNTCTCTTTTGGCGGTTCCACCGTGNGGGCCTCTTGTGGACCTTANCCTCGTGNACCGGGCCTGGGGTGTCACANGGGGTATNTGGGACACTGGGGTNACACNATTTCCTCTAATTCATATTCTACGAGACACACATNCCTATACACCACAATATACAGGGCTGTGGGTGNGTCCTCTGGGGGGCACAATTTACACACACACCCTATTCNCACCCACACCAATTGTGGCNATATATTCCCACGAGGGTTATCCACAACANGGGACANACCACAAGTNGTTCGAGCACACCCTGGNCTTATCANGGGGTGGGNNGTTGGCCAATTGNGACACACGGGTGGG

AQ2 MRS - primer 23S

TTTTTCTTTATATTTATATAGCCCCTGTTAATGTAGCGGCTATACGGCTCTAGTAGCAGGCTTCCCCGGGGGCGCCTATATCTTTAACCTATTCAACCTACAGGGTGGGGCTCTGGANCCATCCTCCTAGCGAATAAAAAGGGTAAATCATTAAAGTAGGCANTTGGACTTTATTTAAAAAACTTCATTNCCAAGGCTGGTGGTCCTCGGTTGGTTGGATCCGTTGAATCATAATTCCCAGTATTTTCAATNGAANCGGANNTNGTGTGTGGAGCAGTTAAGAC

AQ2 MRS - primer 23S

CTGTCTTNTCAGCCCCCCCAGTTGTTTAGTGTTAGCCNGGCCTNNNCCTCGGTCTCCTATTGGCTGGCTATCCCCGGGGGCGCCCTATATTCCTCTTANCCCTTTATCCACCTTACGGGGTGGGGCTCTNGACCCCANTTNCTTCTCTCTCAGTCGTGNCAATGAGACAAGTGTGTTTACAACTCCAATCACGNGNTCAAGGCCAATATTGTGNACAACTTCATATTACACAACACCCTCTTCCTATACTCCCACATGGCTGNGNGTGGTCCCNCTCGGAGGACTAGGGGAAATGGGAAT

BL1 MRS - primer 23S

CCCAGTACGCCAACGCCCCACGTGAATGGTAGACGCGCNAACGCGGTATTATGGCNAGGTATCCACGTGGGGCGCCCTATTTAANTNAACCTAATTTTGGGCCTTTCGAGACCAAATTCATAAATTATTCNCAGGCGGTTCCGGGTTAATTTCCTGGTANCAATCAATATGGTANTACNTTACCTTATTGGGANTTTGGATAATAGNATANTCCATTTTCAATGGGCACANTACACTTTGGANAGTTCTNTNCGGAATCCCAGATGTGGCAGCCTTAAGCGTGGGGAAATCGGAAACCGGGTTTGAACCTTCCTGTGCGGTTGCAAAAGCATGGGGCGGCTTCTTCCCCAANTTTGAAGGCTTAAATGGCCCCCCAAAAAAAGAACCTTCTTTCAAAAATTAAAAACAATTAACCCAAAAGAGGTTGCTTTATCCCGGGTTTTAATCCCCTTTTNGACACAGGCGAGNGTGCGAATNCCCTAAAGTCCNGGGACAAACCTTTATCCCGGGATATANCCGTGTGTTTACAACCCTTTGGGTTTTCCACGCAAAGTTTTTCAACCCCCCTCAAAATTCCATCTTAAATTCCCCCCAAACCTT

Anexo D - Perfil de digestão dos fragmentos amplificados por PCR do espaçador 16S-23S rRNA de diferentes espécies de BAL

Tabela 17: Perfil de digestão dos fragmentos amplificados por PCR do espaçador 16S-23S rRNA de diferentes espécies de BAL

16S 28 74 121 215 238/414

273/527

326/352

333/384

420 420 464 544 23S

Enzimas SphI NcoI NheI SspI SfuI HindIII DraI VspI Eco RI HincII AvrII EcoRV Esp.L. casei - - - - - + + + - - - +

L. rhamnosus - - - - - + + - - - - +L. fermentum + - - - - - - + - - - -L. acidophilus - + - - - + - - + - + -

L. lactis - - - - - - + - - - + - HaeII/

PvuIIE. faecalis - - - + ? - - - - - - - PvuII

Anexo E - Perfil bioquímico de cepas de Staphylococcus spp. isolados de queijo de coalho artesanal e industrial

Tabela 18: Perfil bioquímico de cepas de Staphylococcus spp. isolados de queijo de coalho artesanal e industrial.

Linhagens Coagulase Termonuclease Maltose Manitol Hemólise Catalase Gram

AQAT1 + + + + + + CG+

AQAT2 + + + + + + CG+

AQAT3 + + + + + + CG+

AQAT4 + + + + + + CG+

AQAT5 + + + + + + CG+

AQTP1 + + + + + + CG+

AQTP2 + + + + + + CG+

AQTP3 + + + + + + CG+

AQTP4 + + + + + + CG+

AQTP5 + + + + + + CG+

CMTP1 + + + + + + CG+

CMTP2 + + + + + + CG+

CMTP3 + + + + + + CG+

CMTP4 + + + + + + CG+

CMTP5 + + + + + + CG+

LVAT1 + + + + + + CG+

LVAT2 + + + + + + CG+

LVAT3 + + + + + + CG+

LVAT4 + + + + + + CG+

LVAT5 - - + + + + CG+

SMTP1 + + + + + + CG+

SMTP2 + + + - + + CG+

SMTP3 + + + + + + CG+

SMTP4 + + + + + + CG+

SMTP5 + + + + + + CG+

ABTP1 + + + + + + CG+

ABTP2 + + + + + + CG+

ABTP3 + + + + + + CG+

ABTP4 + + + + + + CG+

ABTP5 + + + + + + CG+

BLTP1 + + + + + + CG+

BLTP2 + + + + + + CG+

BLTP3 + + + + + + CG+

BLAT1 + + + + + + CG+

BLAT2 - - + + - - CG+

BLAT3 - - + + - - CG+

Legenda: AT = colônia atípica; TP = colônia típica; CG+ = cocos Gram positivo

Anexo F - Identificação bioquímica de linhagens de Staphylococcus spp. isolados de queijo de coalho artesanal e industrial.

Quadro 5: Identificação bioquímica de linhagens de Staphylococcus spp. isolados de queijo de coalho artesanal e industrial.

Queijo Staphylococcus spp. (número de linhagens)BL S. aureus (4); S. cohnii (2)LV S. aureus (4); S. cohnii (1)AQ S. aureus (10)CM S. aureus (5)AB S. aureus (5)SM S. aureus (4); S. intermedius (1)

Anexo G - Antagonismo frente a Listeria monocytogenes e teste de sensibilidade aos antimicrobianos de Lactobacillus casei.

Figura 13: Antagonismo de Lactobacillus casei isolado de queijo de coalho artesanal frente a Listeria monocytogenes.

Figura 14: Teste de sensibilidade de Lactobacillus casei isolado de queijo de coalho artesanal frente à diversas drogas antimicrobianas.

Anexo H - Diversidade da microbiota presente em queijo de coalho artesanal e industrial, produzidos no estado de Pernambuco

Quadro 6: Diversidade da microbiota presente em queijo de coalho artesanal e industrial, produzidos no estado de Pernambuco

Amostra Microrganismos isoladosAB Streptococcus thermophilus, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus casei,

Staphylococcus aureusAQ Lactobacillus rhamnosus, Lactococcus lactis, Enterococcus faecalis,

Staphylococcus aureusBL Streptococcus thermophilus, Staphylococcus aureusCM Weissella confusa, Enterococcus faecalis, Lactococcus lactis, Erwinia

amylovora, Escherichia coli, Staphylococcus aureusLV Enterococcus faecalis, Lactobacillus acidophilus, Staphylococcus aureus,

Staphylococcus cohniiSM Streptococcus thermophilus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus

intermedius

Anexo I - Produção industrial e artesanal de queijo de coalho.

As figuras 15, 16, 17 e 18 mostram as instalações do laticínio (BL) visitado, localizado no município de São Bento do Una (PE), onde foi coletada uma amostra de queijo de coalho industrial.

Figura 15: Silos de estocagem de leite

Figura 16: Detalhe de piso e parede da área de recepção do leite

Figura 17: Vista interna da sala de processamento de queijos

Figura 18: Detalhe da sala de processamento de queijos

As figuras 19, 20, 21, 22 e 23 mostram o segundo laticínio (LV) visitado, localizado no município de Água Preta (PE), onde foi coletada amostra de queijo de coalho industrial.

Figura 19: Área de recepção do leite.

Figura 20: Tanque de fabricação de queijo de coalho

Figura 21: Processo de salga na massa do queijo de coalho

Figura 22: Enformagem do queijo de coalho

Figura 23: Sistema de ordenha mecânica da Fazenda onde está localizada a indústria LVAs figuras 24, 25, 26, 27, 28 e 29 mostram as instalações desta fazenda (AQ), onde foi coletada amostra de queijo de coalho artesanal.

Figura 24: Recepção do leite na sala de produção de queijo

Figura 25: Leite colocado no recipiente para coagulação

Figura 26: Utensílios utilizados para produção dos queijos

Figura 27: Mexedura e quebra do coágulo

Figura 28: Massa do queijo dessorando dentro de sacos de plástico

Figura 29: Enformagem dos queijos

As figuras 30, 31 e 32 mostram as instalações desta fazenda (CM), onde foi coletada amostra de queijo de coalho artesanal.

Figura 30: Vista externa do local destinado à produção de queijos

Figura 31: Utensílios utilizados para fabricação dos queijos

Figura 32: Enformagem dos queijos

Anexo J - Extração do DNA total

Após o isolamento, purificação e caracterização fisiológica dos microrganismos isolados de queijo de coalho artesanal e industrial, os mesmos foram cultivados em cinco mL de caldo MRS e caldo M17 para extração do DNA. A figuras 33, 34, 35 e 36 demonstram os DNA’s totais obtidos destas culturas, através da fotodocumentação de géis de agarose (1,0%), submetidos à eletroforese, utilizando-se 100V durante 30 minutos.

Figura 33: DNA total de amostras de microrganismos fermentadores de lactose, isolados de queijo de coalho em ágar MRS (canaletas da esquerda para a direita: 1-marcador de peso molecular; 2-AB1; 3-AB2; 4-AB3; 5-marcador de peso molecular; 6-CM1; 7-CM2; 8-CM3; 9-CM4; 10-LV1; 11-LV2 e 12-LV3).

Figura 34: DNA total de amostras de microrganismos fermentadores de lactose, isolados de queijo de coalho em ágar M17 (canaletas da esquerda para a direita: 1-AQ1; 2-AQ2; 3-AQ3; 4-AQ4; 5-CM1; 6-CM2; 7-CM3; 8-CM4; 9-SM1; 10-SM2; 11-SM3; 12-SM4).

Figura 35: DNA total de amostras de microrganismos fermentadores de lactose, isolados de queijo de coalho em ágar M17 (canaletas da esquerda para a direita: 1-marcador de peso molecular; 2-AB1; 3-AB2; 4-AB3; 5-AB4; 6-marcador de peso molecular; 7-LV1; 8-LV2; 9-LV3; 10-LV4; 11-vazia; 12-vazia).

Figura 36: DNA total de amostras de microrganismos fermentadores de lactose, isolados de queijo de coalho em ágar MRS (canaletas da esquerda para a direita:1-vazia; 2-SM1; 3-SM2; 4-BL1; 5-BL2; 6-AQ1; 7-AQ2) e M17 (amostras da esquerda para a direita: 8-BL1; 9-BL2; 10-BL3; 11-BL4 e 12-marcador de peso molecular).

Anexo L - Amplificação da região intergênica 16S-23S por PCR

Os resultados destas PCR’s são apresentados nas figuras 37, 38 e 39. Pela observação das fotos dos géis de agarose 1,4%, submetidos a 100V por 45 minutos, pode-se verificar a presença de diferentes espécies de microrganismos, evidenciado por diferentes perfis de amplificação (número de bandas amplificadas e pesos moleculares distintos).

Figura 37: PCR 16S-23S de DNA de amostras de microrganismos fermentadores de lactose, isolados de queijo de coalho, em ágar MRS (canaletas da esquerda para a direita: 1-marcador de peso molecular; 2-AB1; 3-AB2; 4-AB3; 5-CM1; 6-CM2; 7-CM3; 8-CM4; 9-LV1; 10-LV2; 11-LV3 e 12-marcador de peso molecular)

Figura 38: PCR 16S-23S de DNA de amostras de microrganismos fermentadores de lactose, isolados de queijo de coalho, em ágar MRS (canaletas da esquerda para a direita: 1-marcador de peso molecular; 2-AQ1; 3-AQ2; 4-BL1; 5-BL2; 6-SM1 e 7-SM2) e M17 (canaletas da esquerda para a direita: 8-BL1; 9-BL2; 10-BL3; 11-BL4 e 12-marcador de peso molecular).

Figura 39: PCR 16S-23S de DNA de amostras de microrganismos fermentadores de lactose, isolados de queijo de coalho, em ágar M17 (canaletas da esquerda para direita: 1-marcador de peso molecular; 2-AQ1; 3-AQ2; 4-AQ3; 5-AQ4; 6-CM4; 7-CM3; 8-CM2; 9-SM1; 10-SM2; 11-SM3 e 12-SM4) .

Anexo M - Digestão enzimática dos produtos de PCR

As figuras 40, 41, 42 e 43 ilustram alguns dos resultados das digestões enzimáticas. Através da observação das mesmas, pode-se identificar alguns microrganismos isolados ao nível de espécie, quando os perfis de digestão são comparados aos padrões.

Figura 40: Digestão de produtos de PCR 16S-23S de cultura identificada como Lactobacillus rhamnosus (canaletas/enzimas da esquerda para a direita: 1-SphI, 2-NcoI, 3-NheI, 4-SspI, 5-SfuI, 6-EcoRV, 7-DraI, 8-VspI, 9-EcoRI, 10-HpaI, 11-HindIII e 12- marcador de peso molecular).

Figura 41: Digestão de produtos de PCR 16S-23S de culturas identificadas como Lactobacillus casei e Lactobacillus fermentum (canaletas/enzimas da esquerda para a direita: 1-marcador de peso molecular, 2-SphI, 3-NcoI, 4-NheI, 5-SspI, 6-SfuI, 7-EcoRV, 8-DraI, 9-VspI, 10-EcoRI, 11-HpaI, 12-HindIII).

Figura 42: Digestão de produtos de PCR 16S-23S de culturas identificadas como Lactobacillus rhamnosus (canaletas/enzimas da esquerda para a direita: 1-marcador de peso molecular, 2-SphI, 3-NcoI, 4-NheI, 5-SspI, 6-SfuI, 7-EcoRV, 8-DraI, 9-VspI, 10-EcoRI, 11-HpaI, 12-HindIII).

Figura 43: Digestão de produto de PCR 16S-23S de cultura identificada como Lactobacillus sp. do grupo acidófilo (canaletas/enzimas da esquerda para a direita: 1-marcador de peso molecular, 2-SphI, 3-NcoI, 4-NheI, 5-SspI, 6-SfuI, 7-EcoRV, 8-DraI, 9-VspI, 10-EcoRI, 11-HpaI, 12-HindIII)