Tese Soro e Levedura e Lactase

UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLNDIA

FACULDADE DE ENGENHARIA QUMICA

PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM ENGENHARIA QUMICA

ESTUDO DA FERMENTAO SIMULTNEA HIDRLISE, DE

SORO DE QUEIJO, UTILIZANDO LACTASE E Saccharomyces

cerevisiae

AILTON CESAR DE ANDRADE

UBERLNDIA - MG

2005

UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLNDIA

FACULDADE DE ENGENHARIA QUMICA

PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM ENGENHARIA QUMICA

ESTUDO DA FERMENTAO SIMULTNEA HIDRLISE, DE SORO DE

QUEIJO, UTILIZANDO LACTASE E Saccharomyces cerevisiae

Ailton Cesar de Andrade

Engenheiro Qumico

Dissertao de Mestrado apresentada aoPrograma de Ps-Graduao em EngenhariaQumica da Universidade Federal deUberlndia como parte dos requisitosnecessrios obteno do ttulo de Mestre emEngenharia Qumica, rea de concentraoem Pesquisa e Desenvolvimento de ProcessosQumicos.

UBERLNDIA - MG

2005

FICHA CATALOGRFICA

A553e

Andrade, Ailton Cesar, 1976- Estudo da fermentao simultnea hidrlise, de soro de queijo, utilizando lactase e Saccharomyces cerevisiae / Ailton Cesar de Andrade. - Uberlndia, 2005. 110f. : il. Orientador: Eucldes Honrio de Arajo. Dissertao (mestrado) - Universidade Federal de Uberlndia, Programa de Ps-Graduao em Engenharia Qumica. Inclui bibliografia. 1. Engenharia qumica - Teses. 2. Soro de queijo - Teses. 3. Fermentao alcolica - Teses. 4. Hidrlise da lactose - Teses. I. Arajo, Eucldes Honrio de. II. Universidade Federal de Uberlndia. Programa de Ps-Graduao em Engenharia Qumica. III.Ttulo. CDU: 66.0 (043.3)

Se todos os seus esforosforem vistos com indiferena,no desanime. Tambm o sol,ao nascer, d um espetculotodo especial e, no entanto, amaioria da platia continuadormindo.

Provrbio chins

AGRADECIMENTOS

Primeiramente a Deus que me iluminou e me deu foras em todos os momentos

de dificuldades para que eu pudesse vencer as barreiras encontradas e chegar ao trmino

de mais um etapa de minha vida.

Ao CNPq pelo apoio financeiro.

Aos meus pais e irmos pelo incentivo e pela fora nos momentos difceis.

Ao orientador Professor Eucldes Honrio de Arajo, pela amizade e confiana

em mim depositado, pela orientao, esforo e dedicao durante todo o trabalho.

A todos os professores da FEQUI, principalmente aos professores Ubirajara

Coutinho e Mrcia Gonalves pela colaborao efetiva e ao professor da UEM, Jos

Eduardo Olivo, pelas sugestes que foi de grande valia.

A todos, colegas de graduao, ps-graduao e aos amigos que direta e

indiretamente, acompanharam o meu crescimento no desenvolvimento deste trabalho.

NDICE LISTA DE FIGURAS............................................................................................... ........i LISTA DE TABELAS.....................................................................................................iii RESUMO.........................................................................................................................iv ABSTRACT......................................................................................................................v TCAPTULO 1T ................................................................................................................... 1 TINTRODUO T................................................................................................................ 1 TCAPTULO 2T ................................................................................................................... 3 TREVISO BIBLIOGRFICA T ......................................................................................... 3

T2.1 LEITET .................................................................................................................. 3 T2.2 SORO DE QUEIJOT ............................................................................................. 5

T2.2.1 Poder poluente do soroT ................................................................................. 7 T2.2.2 Dificuldades para aproveitamento do soroT ................................................... 8 T2.2.3 Formas de aproveitamento do soroT............................................................... 8

T2.3 LACTOSET ........................................................................................................... 9 T2.4 HIDRLISE DA LACTOSE T ............................................................................. 11 T2.5 ENZIMA -GALACTOSIDASE T ...................................................................... 13 T2.6 INFLUNCIA DO pH NA ATIVIDADE E ESTABILIDADE DAS ENZIMAST.................................................................................................................................... 16

T2.7 INFLUNCIA DA TEMPERATURA NA ATIVIDADE E ESTABILIDADE DAS ENZIMAST ......................................................................................................... 17 T2.8 SORO COMO SUBSTRATO PARA FERMENTAOT ................................ 18 T2.9 LEVEDURAS FERMENTATIVAS T ................................................................. 20 T2.10 CINTICA DE PROCESSOS FERMENTATIVOST ...................................... 21

TCAPTULO 3T ................................................................................................................. 23 TMATERIAS E MTODOST ............................................................................................ 23

T3.1 MATERIAIST ..................................................................................................... 23 T3.1.1 Soro de queijo em p T .................................................................................. 23 T3.1.2 Enzima -GalactosidaseT ............................................................................. 23 T3.1.3 MicrorganismoT ........................................................................................... 24 T3.1.4 Unidade ExperimentalT ................................................................................ 24 T3.1.5 Centrfuga T ................................................................................................... 25 T3.1.6 Banho termostatizadoT ................................................................................. 25 T3.1.7 EspectrofotmetroT ...................................................................................... 26 T3.1.8 AutoclaveT.................................................................................................... 26 T3.1.9 Micro-destiladorT ......................................................................................... 26 T3.1.10 ReagentesT.................................................................................................. 26

T3.2 MTODOS T ........................................................................................................ 27 T3.2.1 Definio das variveisT............................................................................... 27 T3.2.2 Preparo do meio de fermentaoT ................................................................ 28 T3.2.3 Incio da fermentaoT ................................................................................. 29 T3.2.4 Clculo do Rendimento e da ProdutividadeT ............................................... 30 T3.2.5 Modelo ExperimentalT ................................................................................. 30

T2.2.7 Cintica da fermentao: parmetro k e ordem da reaoT.............................. 32

CAPTULO 4 ................................................................................................................. 34 RESULTADOS E DISCUSSES.................................................................................. 34

4.1- RESULTADOS OBTIDOS ................................................................................ 34 4.2 RESULTADOS: CONCENTRAO DE SORO = 60G/L ............................. 36 4.3 RESULTADOS: CONCENTRAO DE SORO = 90G/L ............................. 52 4.4 PRODUTIVIDADE E RENDIMENTO DOS ENSAIOS................................. 67

4.4.1 Concentrao de soro = 60g/L.................................................................... 67 4.4.2 Concentrao de soro = 90g/L.................................................................... 67

4.5 EFEITO DA AGITAO NO RENDIMENTO DA FERMENTAO......... 68 4.6 COMPARAO DO MODELO TERICO COM O MODELO EXPERIMENTAL ..................................................................................................... 69 4.7 CINTICA DA FERMENTAO: PARMETRO K E ORDEM DA REAO.................................................................................................................... 75

CAPTULO 5 ................................................................................................................. 77 CONCLUSES E SUGESTES................................................................................... 77

5.1 CONCLUSES................................................................................................. 77 5.2 SUGESTES .................................................................................................... 78

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ........................................................................... 79 ANEXO .......................................................................................................................... 83 ANEXO 1 ....................................................................................................................... 83

TCNICAS UTILIZADAS DURANTE A EXECUO DOS ENSAIOS .............. 83 ANEXO 2 ....................................................................................................................... 87

MTODO PARA O PREPARO DAS SOLUES.................................................. 87 APNDICE .................................................................................................................... 89 APNDICE 1 ................................................................................................................. 89

CURVA DE CALIBRAO: ACAR REDUTOR .............................................. 89 APNDICE 2 ................................................................................................................. 91

PARMETROS E COEFICIENTE DE CORRELAO......................................... 91 APNDICE 3 ................................................................................................................. 94

RESULTADOS DOS ENSAIOS REALIZADOS ..................................................... 94

i

NDICE DE FIGURAS Figura 2.1: Composio mdia do leite (BLOWEY, 1992) ............................................. 4 Figura 2.2: Estrutura molecular da lactose (WALSTRA & JENNESS, 1984) ................ 9 Figura 2.3: Lactase catalisando a reao (LOPEZ-LEIVA & GUZMAN, 1985) .......... 14 Figura 2.4: Representao esquemtica de variaes de concentraes em um processo

fermentativo. P, concentrao de produto; S, concentrao de substrato; X, concentrao do microrganismo (BORZANI et. al., 1975).................................... 22

Figura 3.1: Fermentador utilizado na execuo dos ensaios .......................................... 24 Figura 3.2: Centrfuga utilizada na separao das fases da fermentao ....................... 25 Figura 3.3: Banho Termostizado .................................................................................... 26 Figura 4.1: Variaes das concentraes de etanol, acar redutor e da massa seca para

Ensaio 1. Concentrao de nutrientes de 1,0 g/L, concentrao de enzima de 0,2 g/L; concentrao de inculo de 30 g/L e agitao de 500 rpm. ............................ 36

Figura 4.2: Acar redutor e Glicose para o Ensaio 1................................................... 37 Figura 4.3: Variaes das concentraes de etanol, acar redutor e da massa seca para


Figura 4.4: Acar redutor e glicose para o Ensaio 2..................................................... 40 Figura 4.5: Variaes das concentraes de etanol, acar redutor e da massa seca para






Figura 4.10: Acar redutor e glicose para o Ensaio 5................................................... 46 Figura 4.11: Variaes das concentraes de etanol, acar redutor e da massa seca para


Figura 4.12: Acar redutor e glicose para o Ensaio 6................................................... 48 Figura 4.13: Concentrao de etanol em funo dos tempos de fermentao................ 49 Figura 4.14: Acares redutores em funo dos tempos de fermentao ...................... 50 Figura 4.15: Concentrao de glicose ao longo das fermentaes ................................. 51 Figura 4.16: Variaes das concentraes de etanol, acar redutor e da massa seca para




Figura 4.19: Acar redutor e glicose para o Ensaio 8................................................... 55

ii

Figura 4.20: Variaes das concentraes de etanol, acar redutor e da massa seca para Ensaio 9. Concentrao de nutrientes de 3,0 g/L, concentrao de enzima de 0,2 g/L; concentrao de inculo de 70 g/L e agitao de 300 rpm. ............................ 56



Figura 4.23: Acar redutor e glicose para o Ensaio 10................................................. 59 Figura 4.24: Variaes das concentraes de etanol, acar redutor e da massa seca para


Figura 4.25: Acar redutor e glicose para o Ensaio 11................................................. 61 Figura 4.26: Variaes das concentraes de etanol, acar redutor e da massa seca para


Figura 4.27: Acar redutor e glicose para o Ensaio 12................................................. 63 Figura 4.28: Concentrao de etanol em funo dos tempos de fermentao................ 64 Figura 4.29: Acares redutores em funo dos tempos de fermentao ...................... 65 Figura 4.30: Concentrao de glicose ao longo das fermentaes ................................. 66 Figura 4.31: Comparao dos modelos terico e experimental para o Ensaio 1............ 69 Figura 4.32: Comparao dos modelos terico e experimental para o Ensaio 2............ 70 Figura 4.33: Comparao dos modelos terico e experimental para o Ensaio 3............ 70 Figura 4.34: Comparao dos modelos terico e experimental para o Ensaio 4............ 71 Figura 4.35: Comparao dos modelos terico e experimental para o Ensaio 5............ 71 Figura 4.36: Comparao dos modelos terico e experimental para o Ensaio 6............ 72 Figura 4.37: Comparao dos modelos terico e experimental para o Ensaio 7............ 72 Figura 4.38: Comparao dos modelos terico e experimental para o Ensaio 8............ 73 Figura 4.39: Comparao dos modelos terico e experimental para o Ensaio 9............ 73 Figura 4.40: Comparao dos modelos terico e experimental para o Ensaio 10.......... 74 Figura 4.41: Comparao dos modelos terico e experimental para o Ensaio 11.......... 74 Figura 4.42: Comparao dos modelos terico e experimental para o Ensaio 12.......... 75 Figura AP-1: Curva de calibrao para avaliar concentrao de lactose ....................... 89

iii

NDICE DE TABELAS Tabela 2.1: Composio de certos alimentos em aminocidos, expressos g/100g das

protenas de origem .................................................................................................. 6 Tabela 2.2: Composio de extrato seco .......................................................................... 7 Tabela 2.3: Poder adoante relativo e solubilidade de vrios acares.......................... 10 Tabela 2.4: Propriedades comparativas da lactose e da lactose 90% hidrolisada .......... 12 Tabela 2.5: Propriedades das lactases microbianas ........................................................ 15 Tabela 2.6: Caracterizao de lactases de varias fontes em relao ao pH timo.......... 17 Tabela 3.1: Composio do soro de queijo fornecido pela Vigor Alimentos S/A. ........ 23 Tabela 3.2: Condies das variveis avaliadas durante a realizao dos experimentos. 28 Tabela 4.1: Condies e resultados obtidos nas fermentaes....................................... 35 Tabela 4.2: Taxas para o substrato e produto para o Ensaio 1 ....................................... 38 Tabela 4.3: Taxas para o substrato e produto para o Ensaio 2 ....................................... 40 Tabela 4.4: Taxas para o substrato e produto para o Ensaio 3 ....................................... 42 Tabela 4.5: Taxas para o substrato e produto para o Ensaio 4 ....................................... 44 Tabela 4.6: Taxas para o substrato e produto para o Ensaio 5 ....................................... 47 Tabela 4.7: Taxas para o substrato e produto para o Ensaio 6 ....................................... 49 Tabela 4.8: Taxas para o substrato e produto para o Ensaio 7 ....................................... 53 Tabela 4.9: Taxas para o substrato e produto para o Ensaio 8 ....................................... 56 Tabela 4.10: Taxas para o substrato e produto para o Ensaio 9 ..................................... 58 Tabela 4.11: Taxas para o substrato e produto para o Ensaio 10 ................................... 60 Tabela 4.12: Taxas para o substrato e produto para o Ensaio 11 ................................... 62 Tabela 4.13: Taxas para o substrato e produto para o Ensaio 12 ................................... 64 Tabela 4.14: Produtividade e Rendimento obtidos nos Ensaios 1 a 6............................ 67 Tabela 4.15: Produtividade e Rendimento obtidos nos Ensaios 7 a 12.......................... 67 Tabela 4.16: Agitao e Rendimento obtidos nos Ensaios 1 a 6.................................... 68 Tabela 4.17: Agitao e Rendimento obtidos nos Ensaios 7 a 12.................................. 68 Tabela 4.18: Valores de k, n e R para todos os ensaios2 ................................................ 76

iv

RESUMO

O objetivo deste trabalho o estudo do processo de fermentao simultnea hidrlise,

de soro de queijo, utilizando uma levedura bem conhecida, Sacharomyces cerevisiae,

juntamente com uma lactase obtido do fungo, Aspergillus oryzae, capaz de hidrolisar a

lactose, nas condies de pH e temperatura respectivamente: 4,5 e 30C. Foram

utilizados como materiais: soro de queijo em p desnatado; a enzima era -Galactosidase (EC 3.2.1.23), da Sigma-Aldrich e a levedura Saccharomyces cerevisiae,

na forma de fermento da Fleischmann. A unidade experimental utilizada para conduzir a

fermentao da marca Biostat B-Braun, reator batelada, com volume til de 1,5 L.

Foram seguidas algumas metodologias, como o mtodo da Oxidao pelo Dicromato de

Potssio, para determinao do teor de lcool presente nas amostras; o Mtodo do cido

Dinitrossaliclico (DNS), para avaliar a quantidade de acares redutores presentes no

decorrer dos ensaios e o Teste Enzimtico Colorimtrico para determinao de Glicose

nas amostras. A maior produtividade e rendimento alcanados nos ensaios conduzidos a

60 g/L de soro, foram de 2,85 g/L.h e 93,06 %; e para os ensaios conduzidos a 90 g/L de

soro, foram de 3,68 g/L.h e 93,90 %.

PALAVRAS CHAVES: Soro de queijo, fermentao alcolica, hidrlise da lactose.

v

ABSTRACT

The goal of this work was to study the process of simultaneous saccharification and

fermentation of cheese whey, using a well-known yeast, Saccharomyces cerevisiae, and

a lactase obtained from Aspergillus oryzae. The conditions of pH and temperature were

4.5 and 30C, respectively. Materials used: powder skimmed cheese whey, the enzyme

-Galactosidase (EC 3.2.1.23) by Sigma-Aldrich and the yeast S. cerevisiae manufactured by Fleischmann Co. The experimental unit used to carry out the

fermentation was the Biostat B-Braun model, with net capacity of 1.5 L. The method of

oxidation by potassium dichromate was used to determine the alcohol content in the

samples, the dinitrosalicylic acid method (DNS) was used to evaluate the quantity of

reducing sugars present during the experiments and the enzymatic colorimetric test was

used to determine the glucose content in the samples. For 60 g/L of whey, the largest

productivity and yield obtained were 2.85 g/L.h and 93.06%. And for 90 g/L of whey,

they were 3.68 g/L.h and 93.90%, respectively.

Key words: cheese whey, alcoholic fermentation, lactose saccharification.

CAPTULO 1

INTRODUO

H, atualmente, no mundo, uma crescente compreenso de que os compostos

orgnicos podem ser utilizados como matria-prima para produo de alimentos,

energia e produtos qumicos, substituindo, total ou parcialmente, as fontes fsseis de

combustvel. J que, os combustveis de origem fssil so esgotveis e no se renovam,

sendo que o perodo para a sua formao no se mede em anos, mas avalia-se em

perodos geolgicos (MENEZES, 1980).

Os combustveis fsseis mais utilizados e mais conhecidos so o carvo mineral

e os derivados do petrleo, tais como: a gasolina e o leo diesel.

Um combustvel para veculos, originrio de fonte renovvel o etanol,

produzido principalmente a partir da cana-de-acar.

Com os crescentes preos dos combustveis automotores tem-se chamado a

ateno para a possibilidade de produzir etanol a partir de outras fontes renovveis.

Neste contexto, o soro de queijo vem surgindo como uma alternativa vivel na produo

de etanol (DEMOTT, et. al.,1981; CHEN & ZALL, 1982).

O soro o resduo da fabricao do queijo, que antigamente era pouco

valorizado e considerado apenas mais um poluente da indstria de alimentos.

O soro de queijo o constituinte de maior importncia, tanto pelo volume

gerado, como pela sua carga poluidora. Aproximadamente 80% do volume do leite

destinado fabricao de queijos se transforma em soro (PAOLUCCI, 1991).

A principal preocupao com relao ao soro de queijo de uma maneira global

que, na maioria dos pases, grande parte do soro incorporada s guas residurias dos

laticnios, sendo despejada em cursos dgua, muitas vezes sem o tratamento adequado

(KOSIKOWSKI, 1979). Estima-se que o potencial poluidor do soro de queijo ,

aproximadamente, cem vezes maior que o do esgoto domstico. Os nveis de DBO -

Demanda Biolgica de Oxignio - so em mdia de 55.000 mg/L de soro, contra cerca

de 500 mg/L do esgoto domstico (RALPH, 1982 apud TORRES, 1988; COELHO et.

al.,2002;FERREIRA,2003).

Captulo 1 Introduo

2

Atualmente, a legislao ambiental cada vez mais severa, assim as indstrias

de laticnios procuram alternativas para aproveitar o soro de queijo. Sendo que o

aproveitamento do soro constitui uma forma para diminuir a capacidade poluidora desse

resduo atendendo assim os rgos ambientais.

Dentre as vrias tcnicas de aproveitamento do soro de queijo, destaca-se

(MINAS AMBIENTE, 1998): na alimentao animal e como substrato para a

fermentao.

O aproveitamento do soro apresenta uma dupla vantagem (FERREIRA, 2003):

O lucro advindo da comercializao dos produtos; A economia do investimento que se obtm ao dispensar o tratamento

convencional do soro.

A produo de lcool atravs da fermentao do soro tem sido estimulada pela

crescente necessidade mundial de energia, alm de representar uma forma simples de

tratamento e disposio de grandes quantidades de soro de leite produzido pela indstria

de alimentos (KOSIKOWSKI, 1979).

O lcool produzido por fermentao do soro pode ser empregado tanto na

fabricao de vinagre e vinhos (HOLSINGER et al., 1974; KOSIKOWSKI, 1979),

quanto na produo de etanol combustvel (CHEN & ZALL, 1982; COTON, 1985).

A converso do soro de queijo em etanol pode ser uma alternativa para o

aproveitamento de seus nutrientes. Pesquisas esto sendo desenvolvidas a fim de

encontrar os melhores mtodos e condies para converso, buscando tambm melhorar

a eficincia e rendimento do produto, uma vez que a matria-prima barata, podendo,

neste contexto, alcanar retorno financeiro com a sua comercializao e diminuir a

carga poluidora do soro.

O objetivo principal deste trabalho foi o estudo do processo de fermentao

simultnea hidrlise, do soro de queijo, utilizando uma levedura bem conhecida,

Sacharomyces cerevisiae, juntamente com uma lactase produzida pelo fungo,

Aspergillus oryzae, capaz de hidrolisar a lactose em um acar mais facilmente

fermentvel, nas condies pr-fixadas de pH e temperatura, 4,5 e 30C.

CAPTULO 2

REVISO BIBLIOGRFICA

2.1 LEITE O leite uma mistura complexa, nutritiva e estvel de gordura, protenas e

outros elementos slidos, que se encontram suspensos em gua. A gordura e as

vitaminas lipossolveis, A, D, E e K, encontram-se em forma de emulso, ou seja, uma

suspenso de pequenos glbulos que no se misturam com a gua. O leite bovino tem

em mdia 4,8% de lactose, correspondendo a aproximadamente 50% dos slidos totais

do leite desnatado (VINHAL, 2001).

Pequenas quantidades de outros carboidratos so encontradas no leite,

parcialmente ligadas a fosfatos, lipdeos e/ou protenas e parcialmente livres, como por

exemplo, os monossacardeos glicose e galactose a uma concentrao de

aproximadamente 10 mg/L e os oligossacardeos a aproximadamente 100 mg/L

(RENNER, 1983).

A lactose, as protenas do soro (albumina, imunoglobulinas, hormnios e

enzimas), os minerais, as vitaminas hidrossolveis (complexo B e C) e substncias

nitrogenadas no proticas (amnia, uria, cido rico, creatina, cido hiprico e outras)

encontram-se completamente dissolvidas na gua do leite, formando uma soluo

(BLOWEY, 1992)

A principal protena do leite a casena, que apresenta uma excelente qualidade

nutricional e muito importante na fabricao de queijos. Apresenta-se na forma de

partculas de tamanho muito reduzido (0,05 a 0,5 m), que se distribuem uniformemente numa suspenso. Estas partculas so chamadas de micelas, que so

agrupamentos de vrias molculas de casena junto com sais de clcio, fsforo e outros,

e a sua disperso no leite conhecida como suspenso coloidal. (VINHAL, 2001).

A composio do leite varia entre as diferentes espcies de mamferos e mesmo

entre indivduos da mesma espcie. Dentro de uma espcie, a composio depende de

muitos fatores, tais como: raa, perodo de lactao, tipo de alimento, manejo da

alimentao, freqncia de ordenha, entre outros. Assim, difcil definir uma

composio normal do leite. Entretanto, as relaes entre os diversos constituintes do

Captulo 2 Reviso Bibliogrfica 4

leite so muito estveis e podem ser usadas para indicar se houve qualquer adulterao

na sua composio (BLOWEY, 1992). A composio mdia do leite apresentada na

Figura 2.1.

Figura 2.1: Composio mdia do leite (BLOWEY, 1992)

O leite fresco normal tem um sabor ligeiramente adocicado, devido

principalmente ao seu contedo de lactose. Entretanto, todos os elementos do leite,

inclusive as protenas que so inspidas, participam de forma direta ou indireta na

sensao de sabor. Possui uma cor definida como branco-amarelada e opaca, a qual se

LEITE

GUA (87,5%)

GORDURA (3,8%)

FRAO RESTANTE (3,3%)

LACTOSE (4,6%)

CINZAS/VITAMINAS (0,8%)

NO-PROTEICO (0,2%)

ALBUMINA E GLOBULINAS (0,5%) CASENA (2,6%)

PROTENA (3,1%)

SLIDOS NO GORDUROSOS (8,7%)

SLIDOS TOTAIS (12,5%)


deve principalmente disperso da luz pelas micelas de fosfocaseinato de clcio. Os

glbulos de gordura tambm dispersam a luz, mas contribuem muito pouco para a cor

branca do leite. O caroteno e a riboflavina contribuem para a cor amarelada (VINHAL,

2001).

O leite, sendo um alimento extremamente perecvel e sujeito a se contaminar

com microrganismos patognicos ou no, pode trazer prejuzos sade do consumidor e

causar problemas no processamento industrial. A populao de coliformes, por

exemplo, duplica a cada 20 a 30 minutos quando o leite estocado temperatura de 25C

a 40C; j, quando mantido sob temperaturas de 2C a 5C, reduzida a possibilidade de

multiplicao das bactrias capazes de transformar a lactose em cido lctico

(VINHAL, 2001).

2.2 SORO DE QUEIJO

O soro de queijo pode ser definido como a parte lquida do leite, aps a

precipitao da casena, seja para fabricao desta, seja na confeco de queijos. O soro

engloba aproximadamente metade dos slidos contidos no leite, dos quais a lactose o

constituinte presente em maior quantidade. A composio dos soros varivel, sendo

funo do leite empregado e tambm das perdas que ocorrem durante a fabricao do

queijo. No entanto, de se esperar que os componentes solveis do leite estejam

presentes nas mesmas propores que se encontravam originalmente, uma vez que os

mesmos permeiam juntos como soro durante a separao do mesmo. Deve-se levar em

conta que as quantidades desses componentes que ficaria no queijo, depende, em grande

parte, da quantidade de soro retida no mesmo (RAMOS, 1985).

O soro representa aproximadamente 85 a 95% do volume de leite e detm 55%

dos nutrientes do leite. Dentre os nutrientes mais importantes destaca-se a lactose,

protenas solveis, lipdios e sais minerais (MARWAHA & KENNEDY, 1988).

Aproximadamente 50% de produo mundial de soro de queijo passa por algum

tratamento e so transformados em vrios produtos alimentcios, sendo que 45% deste

total utilizado diretamente na sua forma lquida, 30% na forma de soro de queijo

pulverizado, 15% como lactose e subprodutos de delactosado e o restante como queijo

(MARWAHA & KENNEDY, 1988).


Com o desenvolvimento de novas tecnologias e a diversificao de uso cada vez

maior, o soro e suas fraes tornaram-se ingredientes alimentares muito valorizados.

Dos produtos que podem ser obtidos a partir do soro pode-se citar: o soro em p,

as protenas do soro, o queijo, a lactose, o cido lctico, o lcool, o vinagre e alimentos

especiais (concentrado protico, bebidas) (TORRES, 1988).

Com relao s protenas presentes no soro, o mesmo constitui-se em uma

importante fonte destas substncias, quando comparado com outros alimentos. A Tabela

2.1 compara os aminocidos presentes no soro de queijo com aqueles de outras

protenas (VIEIRA & NEVES, 1987, apud FERREIRA, 2003).

Tabela 2.1: Composio de certos alimentos em aminocidos, expressos g/100g das protenas de origem

Componentes

do polmero

Ovo Protenas do

soro

Casena Msculo de

porco

Soja

Isoleucina 6,45 6,55 5,80 5,70 5,15

Leucina 8,30 14,00 9,50 9,00 7,85

Lisina 7,05 10,90 7,60 10,00 6,20

Metionina 3,40 2,35 2,95 3,00 1,35

Cisteina 2,25 3,15 0,40 1,40 1,35

Tirosina 4,05 4,80 5,70 3,95 3,40

Treonina 5,15 6,70 4,00 5,10 4,10

Triptofano 1,50 3,20 1,30 1,20 1,25

Valina 7,15 6,85 6,80 6,20 5,30

Sub-total 51,10 62,55 49,45 50,15 41,05

Fonte: VIEIRA & NEVES (1987)

As quantidades de protenas, sais minerais, cidos graxos, lactose e cido ltico

so bastante variveis no soro de queijo, sendo afetada pelo tipo de queijo fabricado e

pelo tratamento trmico, dentre outros fatores (PONSANO et. al., 1992).

Vrios fatores influenciam na composio e, portanto, no valor nutricional do

soro. So eles a qualidade e caracterstica do leite, o tipo de queijo produzido, eventuais

tratamentos trmicos do leite ou do soro. Aditivos e fermentos, tempo de ruptura do

cogulo, valor final de acidez, desnate, adio de gua, tempo de permanncia na

Captulo 2 Reviso Bibliogrfica

7

fbrica de queijo, higiene e condies de transporte do soro (BERTOL & SANTOS

FILHO, 1996).

Segundo RICHARDS (1997), pode-se classificar os diferentes tipos de soro de

queijo da seguinte maneira:

Soro doce, a partir da fabricao de queijos tipo cheddar, suo e similares, obtidos atravs da coagulao enzimtica do leite;

Soro cido, a partir da fabricao de queijo tipo cottage ou de casena, obtidos atravs da coagulao utilizando-se cido;

Soro desproteinizado, obtido a partir da coagulao das protenas a quente.

Dos constituintes da frao slida do soro, a lactose o que se encontra em

maior quantidade, tanto no soro doce, quanto no soro cido. Contudo, a sua quantidade

no soro cido pode ser menor, devido fermentao durante a manufatura de queijos

que produzem este tipo de soro (FERREIRA, 2003).

O soro na sua forma lquida apresenta um teor em gua que varia entre 91 e

95%. A quantidade de extrato seco do soro reduzida e representa em mdia 7% do

peso total. Este extrato, no entanto, bastante rico e sua composio mdia em peso

mostrada na Tabela 2.2, (PAOLUCCI, 1991).

Tabela 2.2: Composio de extrato seco

Componente Composio (em peso) Lactose 70 a 80%

Compostos Nitrogenados 10 a 14% Sais Minerais 1,5 a 4,0%

Lipdeos 0,5 a 6% Fonte: PAOLUCCI (1991)

2.2.1 Poder poluente do soro

O soro de queijo quando lanado em cursos dgua pode produzir um efeito

poluidor pronunciado, devido ao consumo do oxignio dissolvido na gua pelos

microrganismos, diminuindo assim a concentrao deste, podendo ocorrer a mortandade

de peixes e outros seres do ecossistema aqutico (ARAJO, 2001).

Estima-se que o potencial poluidor do soro , aproximadamente, cem vezes

maior que o do esgoto domstico. Os nveis de DBO so em mdia de 55.000 mg/L de


8

soro, contra cerca de 500 mg/L do esgoto domstico (RALPH, 1982 apud TORRES,

1988; COELHO et. al., 2002; FERREIRA, 2003).

O Descarte do soro diretamente no solo, no entanto, conduz ainda a outros srios

problemas ambientais: compromete a estrutura fsico-qumica do solo e diminui o

rendimento das colheitas (PONSANO et. al., 1992).

2.2.2 Dificuldades para aproveitamento do soro De modo geral, a viso do soro como um rejeito e no como uma matria-prima

dificulta bastante o aproveitamento deste valioso produto.

Dessa viso decorre o aproveitamento inadequado que o soro recebe na maioria

dos locais onde produzido, sendo na maior parte estocado de forma inadequada at

que se realize o seu descarte.

O aproveitamento do soro encontra alguns obstculos, tais como:

A maioria das queijarias de pequeno e mdio porte, o que dificulta a implantao de uma poltica de aproveitamento ou tratamento;

Nestas unidades a gerao de soro relativamente pequena; Falta de recursos humanos qualificados na maioria das unidades produtivas; Deficiente malha viria e grandes distncias, que dificulta o rpido escoamento

deste produto (MINAS AMBIENTE, 1998).

2.2.3 Formas de aproveitamento do soro

Com vistas crescente necessidade de aproveitamento do soro, um grande

nmero de experimentos tem sido desenvolvido em todo o mundo. Os resultados tem

sido satisfatrios na indstria de panificao, confeitos e sobremesas geladas. Um uso

relativamente novo para os slidos do soro como substrato, aps enriquecimento com

substncias promotoras de crescimento, no preparo de culturas lcticas (MINAS

AMBIENTE, 1998).

Existem atualmente tecnologias disponveis para aproveitar o soro de queijo e

dentre estas pode-se, segundo MINAS AMBIENTE (1998) citar, alm do uso para

alimentao animal e como substrato para a fermentao, a fabricao de:

Queijos de soro;


9

Bebidas; Soro concentrado; Soro em p; Soro desmineralizado; Concentrados proticos por ultrafiltrao; Protenas do soro; Lactose.

2.3 LACTOSE

A lactose, cujo nome sistemtico o 4-O--D-galactopiranosil-D-glucopiranose, o principal carboidrato do leite de todos os mamferos, sendo formado nas glndulas

mamrias a partir da glicose do sangue (FERREIRA, 1978; FREYER, 1972).

A lactose, presente no soro de queijo chamada de acar do leite.

Quimicamente, a lactose, que est apresentada na Figura 2.2, um dissacardeo redutor

constituda por um radical D-glicose e outro D-galactose, unidos por uma ligao -14 glicosdica (WALSTRA & JENNESS, 1984; HOLSINGER et al., 1974).

Figura 2.2: Estrutura molecular da lactose (WALSTRA & JENNESS, 1984)

Em relao a outros acares, a lactose possui baixo poder adoante e baixa

solubilidade (HOLSINGER et al., 1974). Contudo, seus componentes monossacardeos,

glicose e galactose, possuem um alto poder adoante, alm de outras caractersticas

desejveis. Adicionando-se a esta propriedade o problema da baixa solubilidade, a

lactose no possui caractersticas para ser utilizada como adoante (ZADOW, 1984). A

Tabela 2.3 relaciona a doura de vrios acares e as suas solubilidades.


10

Tabela 2.3: Poder adoante relativo e solubilidade de vrios acares Solubilidade (%) Poder Adoante Relativo

10C 30C 50C

Sacarose 100 66 69 73

Lactose 16 13 20 30

D- Galactose 32 28 36 47

D-Glicose 74 40 54 70

D-Frutose 173 - 82 87

Fonte: ZADOW (1984)

A lactose representa cerca de 70% (m/m) dos slidos do soro, e sua extrao

pode ser economicamente vivel. O Brasil importa cerca de 120 toneladas de lactose por

ms para uso em produtos farmacuticos e em alimentos (MINAS AMBIENTE, 1998).

A lactose tambm pode ser usada como matria-prima para a produo de diversos

produtos:

Lactosil urea, que preparado pela condensao de lactose e uria, usado como alimento de ruminantes para sntese de protenas;

Lactitol, que um adoante no nutritivo semelhante ao sorbitol; Lactulose, que um ismero da lactose obtido pelo tratamento do acar do leite

em meio alcalino.

Ligante em p usado como ingrediente principal no processamento de finos de p de minrio de ferro capturado em equipamentos de controle de poluio,

reduzindo o uso de energia gasto na formao de pellets.

A utilizao fermentativa da lactose presente no permeado de soro de leite, pode

fornecer vrios produtos, de acordo com o organismo utilizado, como por exemplo:

etanol, biomassa, acetona, butanol, cido ltico, lactato de amnio, cido ctrico, cido

actico, cido mlico, gomas, aminocidos, vitaminas, antibiticos, enzimas e metano

(PONSANO et. al., 1992).

O alto nvel de lactose presente no leite restringe o consumo do mesmo por

pessoas que apresentam intolerncia a esse carboidrato, devido deficincia da enzima

lactase no intestino delgado. Essa enzima hidrolisa a lactose em dois monossacardeos, a

glicose e a galactose. Essa intolerncia lactose definida como uma sndrome clnica


de desconforto intestinal, diarria e flatulncia, aps teste com ingesto de lactose (0,2 g

de lactose por kg de massa corporal, ministrada em soluo aquosa de 20%P/V)

(MARIOTTI et al., 2000).

Um estudo apresentado pela Academia Americana de Nutrio, concluiu que

cerca de 70% da populao adulta mundial apresenta algum tipo de intolerncia

lactose (PAIGE, 1971), sendo que essa aumenta com a idade e mais acentuada nas

populaes negras e amarelas.

A intolerncia lactose um fator que tem merecido destaque na literatura

mdica h dcadas, uma vez que dietas base de leite so importantes devido ao seu

alto valor nutritivo. Nos Estados Unidos, estima-se que os produtos de laticnios,

excluindo-se a manteiga, contribuem com 11% da energia alimentar consumida

diariamente e ainda com 75% do clcio, 39% da riboflavina, 35% do fsforo, 22% do

magnsio, 20% da vitamina B12 e substancial proporo de outros nutrientes

(MARIOTTI, 2000).

2.4 HIDRLISE DA LACTOSE

A hidrlise de lactose um processo promissor nas indstrias alimentcias,

principalmente no desenvolvimento de produtos sem lactose na sua composio

(GEKAS & LPEZ-LEIVA, 1985). A hidrlise pode produzir um acar mais

digervel, pois estima-se que boa parte da populao mundial possua intolerncia

lactose, a qual atribuda a baixos nveis de lactase intestinal (RICHMOND et al.,

1981; HOLSINGER et al., 1974).

A hidrlise da lactose ocasiona modificaes fsicas e qumicas dos produtos. Na

Tabela 2.4 compara as propriedades de solues de lactose pura e hidrolisada

(VINHAL, 2001).


Tabela 2.4: Propriedades comparativas da lactose e da lactose 90% hidrolisada Propriedades Lactose Lactose

Hidrolisada

Referncia

Solubilidade (g/100mL) a 25C 17 55 Talley e Hunger

(1952)

Viscosidade (cP) de soluo a

50% a 25C

17 105 Hemme et al (1979)

Fermentabilidade Limitada Boa -

Taxa relativa de escurecimento 1 3,4 Pomeranz et al (1962)

Doura relativa soluo de

sacarose

30-40 65-90 Guy e Edmonson

(1978); Amerine et al

(1965)

Propriedades umectantes - Comparvel

sacarose

Shah e Nickerson

(1978c)

Fonte: VINHAL (2001)

De acordo com LOURSEMA (1978), a hidrlise afeta principalmente as

seguintes propriedades:

a) Solubilidade: a lactose pura apresenta solubilidade mxima de 18% em gua, a

25C. A esta temperatura, a solubilidade da D-glicose e da D-galactose ,

respectivamente, de 50% e 32%;

b) Poder adoante: conforme a Tabela 2.3 a lactose um acar de baixo poder

adoante quando comparada sacarose. J a mistura de glicose e galactose 2 a

3 vezes mais doce que a lactose;

c) Viscosidade: o produto de hidrlise da lactose mostra uma alta viscosidade, o

que permite uma alta concentrao de slidos sem problema de cristalizao.

possvel, por exemplo, concentrar o soro ou o leite em at 70-75% de slidos,

quando normalmente 50-55% seria o limite;

d) Digestabilidade: a lactose no digervel para grande nmero de indivduos. A

hidrlise da lactose torna os produtos mais digerveis, at mesmo para pessoas

intolerantes a esse acar;


13

e) Corpo, textura e paladar: estas propriedades so modificadas, por causa da

liberao da galactose, resultante da hidrlise. O sabor do produto fica mais

acentuado;

f) Escurecimento e caramelizao: a temperaturas elevadas, e em meios com pH

acima de 5, a glicose e a galactose so mais reativas que a lactose, em relao

protena, de 2,5 e 5 vezes mais, respectivamente.

A lactose pode ser hidrolisada pelo mtodo cido ou pelo mtodo enzimtico,

utilizando a enzima -galactosidase (GEKAS & LOPEZ-LEIVA, 1985; MAHONEY, 1997; LADERO et. al., 2000).

A hidrlise cida caracteriza-se por envolver solues diludas de cidos fortes

como cido sulfrico e clordrico, e condies operacionais severas de pH e temperatura

(1 < pH < 2; 100 < Temp. < 150C). Devido s suas caractersticas, a hidrlise cida

tem sua aplicao comercial na indstria alimentcia restrita, pois o uso de catalisadores

cidos acarreta alteraes no sabor e cor dos alimentos, devido s reaes paralelas de

escurecimento, produo de sub-produtos indesejveis e desnaturao de protenas

(SANTIAGO, 2002).

O mtodo enzimtico de hidrlise de lactose emprega a enzima -galactosidase, a qual hidrolisa o referido dissacardeo nos seus monossacardeos constituintes, -D-galactose e -D-glicose (GEKAS & LOPEZ-LEIVA, 1985). Realizada sob condies operacionais consideravelmente mais brandas (3,5 < pH < 8,0; 5 < Temp. < 60C),

reduz no s a possibilidade de alterao de compostos sensveis ao calor, bem como as

necessidades energticas, os efeitos de corroso do meio sobre equipamentos e a

formao de subprodutos indesejveis (GEKAS & LOPEZ-LEIVA, 1985; BAILEY &

OLLIS, 1986).

2.5 ENZIMA -GALACTOSIDASE

A enzima -Galactosidase (E.C.3.2.1.23), usualmente chamada pelo nome de Lactase, ou ainda pelo nome sistemtico -D-galactosideo-galactohidrolase, classificada como uma hidrolase, com capacidade transferase para grupos galactosil,

catalisando o resduo terminal -galactopiranosil da lactose para formar glicose e


14

galactose, alm de enriquecer o produto hidrolisado com galactoligossacardeos (Figura

2.3), (LOPEZ-LEIVA & GUZMAN, 1985).

Figura 2.3: Lactase catalisando a reao (LOPEZ-LEIVA & GUZMAN, 1985)

O uso da -Galactosidase para produzir quantidades pequenas de leite com baixo teor de lactose para alimentao de crianas e adultos foi feito durante anos em clnicas

mdicas. O interesse comercial no produto foi acentuado nos anos sessenta, estimulado

pela oportunidade de vender mais leite e pela necessidade de encontrar novas aplicaes

para o soro de queijo. O soro uma soluo bruta de lactose, que contm

aproximadamente 70 % desse acar em base seca. um problema na rea ambiental,

quando descartado nos corpos receptores, devido a sua alta demanda qumica de

oxignio (DQO) e uma opo de alimentao pouco utilizada. A hidrlise da lactose

presente nesse subproduto oferece solues potenciais a este problema (MAHONEY,

1997).

As -Galactosidases so distribudas na natureza de acordo com suas mltiplas funes. As Lactases so encontradas em animais, plantas, bactrias, fungos e

leveduras. Porm as mais utilizadas so as originrias de leveduras e fungos, as

respectivamente mais importantes so: Kluyveromyces lactis e Kluyveromyces

marxianus, Aspergillus niger e Aspergillus oryzae (COUGHLIN & CHARLES, 1980;

GKAS & LOPEZ-LEIVA, 1985; MACHADO & LINARDI, 1990).

Como j mencionado, existem vrias fontes de lactase, mas nem todas so

recomendadas como seguras, quando a enzima est sendo usada em processos


alimentcios. Preparaes enzimticas a partir de Aspergillus niger, Aspergillus oryzae e

de Kluyveromyces sp (lactis ou marxianus) so consideradas fontes seguras, porque j

tm uma histria de uso e tm sido submetidas a numerosos testes. A lactase bacteriana

de Escherichia coli, embora seja uma espcie extensivamente estudada e usada em

pesquisas, no utilizada em processos alimentcios, devido aos problemas de toxidade

com extratos brutos de coliformes (GEKAS, 1985).

A Tabela 2.5 mostra as propriedades das enzimas microbianas, que variam

consideravelmente com o microrganismo (SEGEL, 1993).

Tabela 2.5: Propriedades das lactases microbianas

Fonte pH timo pH

estabilidade

Cofatores

necessrios

Temperatura

tima (C)

Referncia

Aspergillus

niger

3,0 4,0 2,5 8,0 Nenhum 55 60 Widmer

(1979)

Aspergillus

oryzae

5,0 3,5 8,0 Nenhum 30 40 Park (1979)

Kluyveromyces

marxianus

6,6 6,5 7,5 Mn2+, K+ 37 Mahoney

(1978)

Kluyveromyces

lactis

6,9 7,3 7,0 7,5 Mn2+, Na+ 35 Dickson

(1979)

Escherichia

coli

7,2 6,0 8,0 Na+, K+ 40 Wallenfels

(1960)

Lactobacillus

thermophilus

6,2 No

calculado

No

calculado

55 Singh (1979)

Leuconostoc

citrovorum

6,5 No

calculado

nenhum 60 Singh (1979)

Fonte: SEGEL (1993)

Como mostrado na Tabela 2.5, as melhores condies operacionais de

temperatura e pH diferem de acordo com a fonte e quando a enzima encontra-se na

forma imobilizada, com a tcnica adotada na imobilizao. Geralmente as lactases

fngicas apresentam a melhor condio de operao em pH cido, sendo convenientes


para a hidrlise de soro cido. J as lactases de leveduras e bactrias apresentam melhor

condio de operao em pH neutro, sendo usadas na hidrlise do leite.

2.6 INFLUNCIA DO pH NA ATIVIDADE E ESTABILIDADE DAS

ENZIMAS

O efeito do pH nas reaes enzimticas deve-se ionizao do substrato e

resduos de aminocidos das enzimas. Esses efeitos so manifestados como mudanas

na atividade cataltica das enzimas, estabilidade, interaes com ligantes, ou mudana

no equilbrio da reao (REED, 1993).

O pH, ou faixa de pH de maior estabilidade da enzima depende de muitos

fatores, tais como: a temperatura, fora inica, natureza qumica do tampo,

concentrao de vrios preservativos, concentrao de substrato, cofatores e

concentrao de enzimas. Em muitos casos o substrato pode induzir mudana

conformacional da enzima para uma forma que mais resistente ou menos resistente ao

pH e a temperatura de desnaturao. Os stios ativos das enzimas so freqentemente

compostos por grupos ionizveis que encontram numa forma inica adequada para se

ligar ao substrato ou catalisar a reao. Os efeitos do pH na estabilidade de uma enzima

devem ser levados em conta em qualquer estudo do efeito do pH na ligao do substrato

e na catlise. A queda na atividade das enzimas pode ser devido constituio de

formas inicas imprprias do substrato ou da enzima, ou ambos, ou como conseqncia

da desativao das enzimas ou combinao desses efeitos (SEGEL, 1993).

A faixa de pH de maior atividade das enzimas pode variar de 2,0 at 10,0 e

muitas exibem o pH prximo do neutro, como no caso da lactase de Kluyveromyces

marxianus. A mesma enzima isolada, de fontes diferentes, pode exibir valores diferentes

de pH timos, provavelmente refletindo a necessidade fisiolgica do organismo de onde

a enzima foi isolada (REED, 1993). Alm disso, a tcnica pela qual as preparaes

enzimticas comerciais so elaboradas, como exemplo o tampo utilizado, pode

influenciar diretamente em suas propriedades. Um resumo geral das propriedades das

lactases em relao ao pH mostrado na Tabela 2.6.


Tabela 2.6: Caracterizao de lactases de varias fontes em relao ao pH timo Fonte Atividade mxima

Bacillus spp (stearothermophilus) pH neutro

Kluyveromyces marxianus 6,5 < pH < 7,0 a 40 45C

Kluyveromyces lactis 6,6 < pH < 6,8 a 35C

Aspergillus niger 4,0 < pH < 5,0 a 35C

Aspergillus niger e oryzae 2,5 < pH < 4,5

Fonte: REED (1993)

2.7 INFLUNCIA DA TEMPERATURA NA ATIVIDADE E ESTABILIDADE

DAS ENZIMAS

Na maioria das reaes qumicas ocorre o aumento da velocidade com a

elevao da temperatura. Um aumento na temperatura implica maior energia cintica s

molculas de reagente, ocasionando um maior nmero de colises produtivas por

unidade de tempo. As reaes catalisadas por enzimas se comportam, at certo ponto, de

forma semelhante s outras reaes (VINHAL, 2001).

O efeito da temperatura muito complexo e pode ser devido a vrias causas.

Inicialmente, com o aumento de temperatura, a atividade molecular aumentada,

contribuindo conseqentemente para a formao do complexo enzimtico; com o

aumento contnuo da temperatura, poder haver uma inativao gradativa da enzima, at

inativao total, causada pela desnaturao da protena pelo calor (BOBBIO; BOBBIO,

1989 apud VINHAL, 2001).

A melhor temperatura de operao a temperatura mxima na qual a enzima

possui uma atividade constante por um longo perodo de tempo. Essa temperatura pode

ser facilmente estabelecida pela pr-incubao da enzima em vrias temperaturas, por

uma ou duas vezes o tempo escolhido para a realizao dos testes experimentais, e a,

medindo-se a atividade a uma temperatura suficientemente baixa para no causar

desnaturao da enzima. A temperatura de estabilizao da enzima depende de outros

fatores com pH, fora inica do meio, presena ou ausncia de ligantes (SEGEL, 1993).


18

2.8 SORO COMO SUBSTRATO PARA FERMENTAO

A utilizao do soro lcteo como meio de cultura tem sido estudada h bastante

tempo. Sua composio e seu alto teor em lactose, acar fermentescvel, fazem do soro

lquido ou concentrado um substrato de fermentao bastante interessante. Acrescente-

se a estes fatores o fato que o soro pode ser disponvel em grande quantidade a custo

relativamente baixo (MINAS AMBIENTE, 1998).

As principais utilizaes do soro como substrato so (MINAS AMBIENTE,

1998):

Produo de bactrias lcticas e propinicas, para utilizao na indstria de laticnios;

Produo industrial de culturas de Penicillium rogueforti , o fungo responsvel pela produo dos chamados queijos azuis;

Produo de biomassa de leveduras. Existem em uso industrial, diversos processos para produo de leveduras, os quais empregam o soro lcteo como

substrato.

Atravs da fermentao do soro possvel obter os seguintes produtos (MINAS

AMBIENTE, 1998): beta-galactosidase; cido lctico e lactatos; cido propinico e

propionatos; etanol, vitaminas, principalmente riboflavina e vitamina B e bebidas

fermentadas, alcolicas ou no.

Nos Estados Unidos, Irlanda e particularmente na Nova Zelndia, cerca de 50%

da produo de soro de queijo utilizada para produo de etanol (MAWSON, 1994).

A utilizao do soro na fabricao de produtos por fermentao depende, em

geral, da disponibilidade de um microrganismo seguro para converter a lactose na

substncia desejada e da viabilidade do custo da fonte do carboidrato a ser fermentado,

em comparao com o do melao ou do milho (TORRES, 1988).

Na produo de etanol a partir do soro de queijo, a dificuldade est na escolha

do microrganismo capaz fermentar diretamente a lactose presente no soro (CASTILHO,

1990). Atualmente a Kluyveromyces marxianus o microrganismo mais utilizado na

fermentao direta, com um rendimento entre 80-85% (MAWSON, 1994).


19

H na literatura uma alternativa, a fermentao indireta, que consiste na hidrlise

da lactose pela enzima -Galactosidase, produzindo acares mais facilmente fermentveis e conseqentemente a fermentao dos monossacardeos pela levedura

Saccharomyces cerevisiae (RUSSEL, 1986; CASTILLO, 1990; CHAMPAGNE &

GOULET, 1988 apud SISO, 1996).

Um dos primeiros trabalhos sobre fermentao do soro de queijo foi realizado

por ROGOSA et al. (1947), utilizaram diversas leveduras lactose-fermentativas e as

fermentaes mais rpidas ocorreram a 37C, com a levedura Torula cremoris,

fornecendo um rendimento 90,73%.

BERNSTEIN et al. (1977) utilizaram a Saccharomyces marxianus

primeiramente em sistema aerbico do soro de leite para a produo de biomassa, em

seguida, sob condies anaerbicas, o sistema foi utilizado para a produo de lcool.

No final do processo, as clulas, as protenas do soro e todos resduos provenientes da

fermentao foram secos por asperso, fornecendo componentes para uso em rao

animal.

A maioria dos trabalhos pioneiros sobre produo de etanol a partir de soro de

queijo originou-se da produo de vinho e cerveja (CHEN & ZALL,1982 apud

POSANO, 1992).

PONSANO (1992) tambm produziu etanol a partir do soro, utilizando a

levedura Kluyveromyces marxianus. Durante a produo foram acompanhados os teores

de etanol, lactose e contedo celular. Os melhores resultados foram em um tempo de 21

horas, com concentrao de etanol de 14 g/L.

SILVA & CASTRO-GOMEZ (1995) cultivaram Kluyveromyces marxianus em

soro de queijo. Durante o processo fermentativo seis parmetros foram avaliados: pH,

concentrao de lactose, concentrao de protena, concentrao de etanol, nmero de

clulas de leveduras e a concentrao de massa seca. Esta fermentao apresentou-se

como um possvel meio para reduzir o potencial poluente do soro de queijo.

GHALY & EL-TAWEEL (1997) desenvolveram um modelo cintico para

fermentao contnua de etanol a partir do soro de queijo. O modelo avaliou

principalmente o consumo de substrato e a produo de etanol. Os testes foram

realizados no perodo de 18 a 42 h e com concentraes iniciais de lactose entre 50 a

150 g/L. Os dados experimentais eram utilizados para validar o modelo. De acordo com


20

o modelo, o melhor rendimento terico foi de 99,6%, em 42 horas de fermentao e

para uma concentrao inicial de lactose de 150 g/L.

FERREIRA (2003) utilizou a levedura Kluyveromyces marxianus na produo

de etanol a partir do soro. Foram avaliados durante a fermentao o consumo de

substrato, produo de etanol e massa seca. Os melhores resultados foram com um pH

de 6 e temperatura de 40C, com um tempo de 8 horas de fermentao com uma

produtividade de etanol de 2,73 g/L.h. 2.9 LEVEDURAS FERMENTATIVAS

As espcies utilizadas na fermentao para produo de etanol so eumicetos, e

exibem diversas formas de crescimento e multiplicao. Sob certas condies de

cultivo, so capazes de utilizar uma variedade de substratos, dependendo da espcie em

questo. Em geral, esses microrganismos so capazes de crescer e de produzir etanol

eficientemente em valores e pH entre 3,5 e 6,0, e de temperatura entre 28 e 35C

(KOSARIC et. al., 1983).

Dentre os microrganismos produtores de lcool, destacam-se Saccharomyces

cerevisiae, S. uvarum, Schizosaccharomyces pombe e Kluyveromyces sp (MENEZES,

1980; KOSARIC et. al., 1983). Alm desses, existe um grande nmero de organismos

obtidos a partir de manipulaes genticas das vrias linhagens dessas leveduras

(STEWART, 1981 apud KOSARIC et. al., 1983)

A escolha do organismo a ser usado na produo de etanol depende do processo

empregado, do substrato em questo e dos objetivos a serem alcanados. Por isso,

dentre as espcies de leveduras produtoras de lcool, importante a utilizao de

linhagens selecionadas e aclimatizadas para a realizao da fermentao, devendo

apresentar certos requisitos para que a eficincia do processo seja adequada

(MENEZES, 1980; KOSARIC et. al., 1983).

Assim, os organismos escolhidos devero fornecer alto rendimento do produto

por unidade de substrato assimilada, alta taxa de fermentao, apresentar substancial

tolerncia ao etanol, possuir a habilidades de permanecer vivel em altas temperaturas,

possuir estabilidade sob condies adequadas de fermentao e apresentar tolerncia a

baixos valores de pH (MENEZES, 1980; KOSARIC et. al., 1983). Existem


21

relativamente poucas leveduras capazes de fermentar a lactose rpida e eficientemente,

e que apresentem, ao mesmo tempo, uma boa tolerncia ao etanol (WOYCHIK &

HOLSINGER, 1977; CHEN & ZALL, 1982; KOSARIC & ASHER, 1982).

Uma levedura que merece destaque a Kluyveromyces marxianus, ela se mostra

uma das mais eficientes na converso da lactose do soro de leite em etanol e na

tolerncia a este produto (WOYCHIK & HOLSINGER, 1977).

Dentre as leveduras de maior importncia industrial encontram-se as linhagens

fermentativas de Saccharomyces, empregadas na produo de cerveja (Saccharomyces

cerevisiae e Saccharomyces carlsbergensis), vinho (Saccharomyces ellipsoideus),

produo industrial de etanol a partir de cana de acar (Saccharomyces cerevisiae),

alm da industria de panificao. (PARK & BARATTI, 1991). 2.10 CINTICA DE PROCESSOS FERMENTATIVOS

No estudo da cintica de processos fermentativos, necessrio lanar mo de

mtodos analticos seguros que permitam medir, com elevado grau de confiana, as

variaes de suas concentraes com o tempo (BORZANI et. al., 1975).

Durante fermentao, retira-se periodicamente uma amostra do material

fermentado e em seguida determina-se s concentraes da substncia que est sendo

consumida (S), de um produto (P) e do microrganismo (X) (BORZANI et. al., 1975). As

variaes dessas concentraes com o tempo conduzir a curvas do tipo das

representadas na Figura 2.4.

A partir dessas curvas possvel determinar, em cada instante, as velocidades de

consumo do substrato (dS/dT), de formao do produto (dP/dT) e de crescimento do

microrganismo (dX/dT) (BORZANI et. al., 1975).


Figura 2.4: Representao esquemtica de variaes de concentraes em um processo fermentativo. P, concentrao de produto; S, concentrao de substrato; X, concentrao

do microrganismo (BORZANI et. al., 1975).

S

P

Tempo

Conc.

T1

dSdT

dXdT

dPdT

X

S1

X1

P1

CAPTULO 3

MATERIAS E MTODOS

3.1 MATERIAIS

Os reagentes e equipamentos utilizados no desenvolvimento deste trabalho so

descritos a seguir.

3.1.1 Soro de queijo em p

O soro de queijo em p desnatado foi adquirido junto a Fbrica de Produtos

Alimentcios Vigor S/A, localizada na cidade de So Gonalo do Sapuca (MG), a sua

composio apresentada na Tabela 3.1:

Tabela 3.1: Composio do soro de queijo fornecido pela Vigor Alimentos S/A.

Constituinte

Mnimo

(%)*

Mximo

(%)*

Protenas 11,0 nd

Lactose 72,0 nd

Cloreto nd 5,0

Sais minerais 7,0 9,0 *A porcentagem dada em Peso/Peso nd No disponvel

3.1.2 Enzima -Galactosidase

A enzima utilizada neste trabalho foi a -Galactosidase (-D-Galactoside galactohydrolase; EC 3.2.1.23), fornecida pela Sigma-Aldrich, obtida pelo cultivo de

Aspergillus oryzae, com condies timas de estabilidade em pH e temperatura 4,5 e

30C.

Captulo 3 Materiais e Mtodos 24

3.1.3 Microrganismo

Foi utilizado como inculo, a levedura Saccharomyces cerevisiae, proveniente

do Fermento Biolgico Fresco prensado, fornecida pela Fleischmann.

3.1.4 Unidade Experimental

A unidade experimental apresentada na Figura 3.1 utilizada para conduzir a

fermentao da marca Biostat B-Braun, sendo este um fermentador, com controle de

pH, temperatura, agitao. Esse fermentador consistia em duas partes:

O tanque cilndrico com volume til de 1,5 L, onde era colocado o meio de fermentao, esse tanque era fechado com uma tampa de ao inoxidvel com

aberturas para a entrada do inculo, cido/base, retirada de amostras e um

exaustor. Na tampa do fermentador havia um motor que promovia a agitao do

meio.

A outra parte era constituda de um sistema de controle com um display onde eram apresentadas as variveis que estavam sendo controladas no processo.

Figura 3.1: Fermentador utilizado na execuo dos ensaios


3.1.5 Centrfuga Foi utilizada uma centrfuga marca Beckmann Coulter, apresentada na Figura

3.2, modelo Avanti J-25 com controles de velocidade, tempo e temperatura.

Este equipamento era utilizado logo aps a retirada das amostras do

fermentador, para que fosse possvel a separao do sobrenadante e da massa de

microrganismos.

Figura 3.2: Centrfuga utilizada na separao das fases da fermentao

3.1.6 Banho termostatizado

Foi utilizado um banho termostizado da marca Thermomix, modelo 18BU da B.

Braun Biotech International, que est apresentado na Figura 3.3, com controle de

temperatura;

Este banho foi utilizado durante as anlises da quantidade de lcool presente nas

amostras e nos ensaios para determinao de concentrao de glicose.


Figura 3.3: Banho Termostizado

3.1.7 Espectrofotmetro

Tambm foi utilizado um espectrofotmetro Genesys, modelo 10UV para a

leitura da concentrao de acar redutores e glicose.

3.1.8 Autoclave

A autoclave era da marca Fanem, utilizada para esterilizao do meio de

fermentao.

3.1.9 Micro-destilador

O micro-destilador foi utilizado durante o Mtodo da Oxidao pelo Dicromato

de Potssio, para determinao do teor de lcool presentes nas amostras;

3.1.10 Reagentes

Todos reagentes qumicos utilizados nos experimentos apresentaram grau de

pureza analtica. A seguir encontra-se a descrio destes reagentes:


Extrato de Levedura Vetec Qumica Fina Ltda; Sulfato de Amnio Labsynth Produtos para Laboratrio Ltda; D(+) Lactose P.A Vetec Qumica Fina Ltda; Glicose Anidra P.A Proqumios Ltda; Galactose P.A Vetec Qumica Fina Ltda; TDicromato de Potssio P.A TVetec Qumica Fina Ltda;T Sulfato de Amnio Ferroso Cromoline Qumica Fina Ltda; cido Sulfrico P.A F. Maia Indstria e Comrcio Ltda; Hidrxido de Sdio P.A Vetec Qumica Fina Ltda; Glicose Enzimtica Laborclin Produtos para Laboratrio Ltda; cido 3,5 Dinitrossaliclico P.A Vetec Qumica Fina Ltda; Tartarato tetrahidratado duplo de Na e K CAQ Casa da Qumica Ltda; 1, 10 Fenantrolina P. A (orto) Vetec Qumica Fina Ltda.

3.2 MTODOS

Para a execuo dos ensaios foram seguidas algumas metodologias:

Mtodo do cido Dinitrossaliclico (DNS) (MILLER, 1959), para avaliar a quantidade de acares redutores presentes no decorrer dos ensaios;

Mtodo da Oxidao pelo Dicromato de Potssio (JOSLYN, 1950), para determinao do teor de lcool presentes nas amostras;

Teste Enzimtico Colorimtrico, para avaliar a concentrao de glicose no decorrer dos ensaios.

Anlise de Massa Seca.

Os mtodos supra mencionados encontram-se detalhados no Anexo 1.

3.2.1 Definio das variveis

Durante as fermentaes foram avaliadas as seguintes variveis:

Concentrao de soro de queijo; Quantidade de suplemento fermentao;


Quantidade de inculo; Concentrao de enzima; Agitao.

Inicialmente foram feitos alguns testes preliminares, utilizando as variveis

acima citadas em condies adversas, a fim de chegar na faixa desejada de estudo.

As condies experimentais utilizados nos ensaios encontram-se na Tabela 3.2.

Tabela 3.2: Condies das variveis avaliadas durante a realizao dos experimentos. Ensaio Concentrao

Soro (g/L)

Nutrientes*

(g/L)

Enzima

(g/L)

Inculo

(g/L)

Agitao

(rpm)

1 60 1,0 0,2 30 500

2 60 1,0 0,2 50 300

3 60 1,0 0,4 30 300

4 60 1,0 0,4 50 500

5 60 3,0 0,2 30 300

6 60 3,0 0,4 70 300

7 90 1,0 0,4 70 300

8 90 1,0 0,2 30 500

9 90 3,0 0,2 70 300

10 90 3,0 0,4 30 500

11 90 3,0 0,4 70 500

12 90 3,0 0,2 50 300

*Nutrientes: Extrato de Levedura e Sulfato de amnio

3.2.2 Preparo do meio de fermentao

Para o preparo do meio de fermentao, pesava-se a quantidade de soro desejada

de acordo com o ensaio e com a Tabela 3.2, juntamente com a quantidade de nutrientes

que foram: Extrato de Levedura e Sulfato de Amnio. O soro e os nutrientes eram

dissolvidos at o volume de 1,5L, sendo este o volume til do fermentador.


A soluo preparada era ento inserida no tanque cilndrico do fermentador. O

conjunto era levado at a autoclave nas condies de 120C e 1 atm, por um perodo de

20 minutos. Esse procedimento era feito para garantir que o meio de fermentao

estivesse livre de contaminao.

3.2.3 Incio da fermentao

Logo aps o preparo do meio de fermentao e sua esterilizao, o conjunto

contendo o soro de queijo e os nutrientes eram montados na unidade experimental de

acordo com a Figura 3.1.

Aps a montagem, eram ajustadas, no sistema de controle do fermentador, a

temperatura e o pH, respectivamente: 30 C e 4,5. E a agitao era ajustada de acordo

com a Tabela 3.2.

Ajustadas as variveis, era adicionado no meio a enzima e simultaneamente o

inculo, nas quantidades pr-determinadas de acordo com cada ensaio e a Tabela 3.2.

No incio da fermentao, colhia-se uma amostra aps 10 minutos de

fermentao para avaliar a concentrao de Glicose presente no meio. Durante a

fermentao as amostras eram coletadas em intervalos de tempo de 2 em 2 horas para

avaliar os seguintes parmetros:

Concentrao de acar redutor presente no meio; Concentrao de etanol; Concentrao de glicose; Concentrao de clulas massa seca.

Para a realizao das anlises dos parmetros descritos acima, era coletada uma

alquota de 30mL do meio fermentativo, sendo a mesma centrifugada a 12.000 rpm,

durante 5 minutos.

O sobrenadante era utilizado nas anlises de etanol, acares redutores e glicose,

de acordo com os mtodos do Item 3.2 e descritos no Anexo 1. A massa seca que ficava

no fundo da cubeta da centrfuga era lavada, e em seguida avaliada o contedo seco de

acordo com Item 3.2 e descrito no Anexo 1.


Para aferio da quantidade de acar redutor presente na amostra, era

necessrio fazer uma curva de calibrao com amostras de concentraes conhecidas de

lactose de acordo com o Apndice 1.

3.2.4 Clculo do Rendimento e da Produtividade

Para o clculo da produtividade foi empregada a Equao 1.

Etanol produzidoProdutividade (g/L.h) = tempo

(1)

O rendimento da fermentao foi calculado atravs da Equao 2.

Etanol produzidoRendimento (%) = Substrato consumido * 0,5368

(2)

O valor de 0,5368 refere-se ao valor terico para a converso da lactose a etanol,

tal como apresenta a Equao 3.

12 22 11 2 5 2C H O 4C H OH + 4CO (3)

3.2.5 Modelo Experimental

Utilizando o Software TABLE CURVE 2D, foi possvel levantar o equacionamento que melhor se ajustou aos dados experimentais. As equaes de

substrato e produto so respectivamente apresentadas pelas Equaes 4 e 5. Essas

equaes foram utilizadas para todos os ensaios. As mesmas foram derivadas em

intervalo de 1 em 1 hora. Para cada intervalo foi levantado a taxa de consumo de

substrato acar redutor (dS/dt) e a taxa de produo de etanol (dP/dt). Esse

procedimento foi feito para cada ensaio.

Equao utilizada para todos os ensaio relativas ao substrato:

2y a b*x c*x d*exp(-x)= + + + (4)


Equao utilizada para todos os ensaio relativas ao produto:

2y a b*x c*x d*exp(x)= + + + (5)

Produo de etanol = dP dydt dx

= (6)

Consumo de substrato =dS dydt dx

= (7) Os valores dos parmetros (a,b,c e d) das Equaes 4 e 5 e os valores do

coeficiente de correlao de cada ensaio encontram-se no Apndice 2.

3.2.6 Modelo Terico

A fim de validar o modelo experimental, recorreu-se na literatura para buscar um

modelo terico, capaz de reproduzir o consumo de substrato.

Utilizou-se o modelo modificado de Monod (BLANCH & CLARK, 1997), que

apresentado pelas duas equaes abaixo, que representa a taxa de consumo de substrato

e crescimento de microrganismo.

m

s

SXdX XdT K S

= = + (8)

/

1 mX S s

SXdSdT Y K S

= = + (9)

Condies iniciais: X(0)=XB0B ; S(0)=S B0 B

/( ) 0X Sd X Y SdT+ = (10)

/ 0 / 0X S X SX Y S X Y S+ = + (11)


Substituindo a Eq. 10 e 11 na Eq. 9, obtemos a Eq. 12, que representa o modelo

terico para o consumo de substrato:

( )0 / 0

/

*( ) **

( )X Sm

X S s

X Y S S SdSdT Y K S

+ = + (12) Integrando analiticamente a Eq. 12 obtemos:

0 / 00 / 0 / 0 / 0

0 0

( )[ *( )]* * * *( * )*X SX S s X S m X SX Y S S SX Y S Ks Ln K Y Ln X Y S t

X S + + + = +

(13)

2.2.7 Cintica da fermentao: parmetro k e ordem da reao

A taxa de consumo de substrato dada pela Equao 14:

*[ ]ndS k Sdt

= (14) Onde:

dSdt = Taxa de consumo de substrato;

k = Constante da reao;

[S] = Concentrao de substrato;

n = Ordem da reao.

A taxa de produo de etanol dada pela equao 15:

*[ ]ndP k Sdt

= (15) Onde:

dPdt = Taxa de produo de etanol.


Utilizando o Software STATISTICAPP, Verso 5, edio 97, foi feita uma

regresso linear das Equaes 14 e 15, e aproveitando os dados das taxas de consumo de

substrato e produo de etanol e da concentrao de substrato de cada ensaio, foi

possvel fazer um levantamento da constante da reao k e da ordem da reao.

CAPTULO 4

RESULTADOS E DISCUSSES 4.1- RESULTADOS OBTIDOS

Durante a execuo deste trabalho foram realizados um total de doze

experimentos variando as quantidades de soro de queijo, quantidade de nutrientes (na

forma de extrato de levedura e sulfato de amnio), quantidade de enzima, quantidade de

inculo e agitao. As condies de temperatura e pH para todos os ensaios foram

afixadas em 30C e 4,5.

Os resultados obtidos e as condies estudadas encontram-se apresentados na

Tabela 4.1.

Tabela 4.1: Condies e resultados obtidos nas fermentaes Conc. de Acar

ART (g/L)

Ensaio Conc. de

Soro

(g/L)

Conc. de

Sulfato de

Amnio

(g/L)

Conc. de

Extrato de

Levedura

(g/L)

Conc. de

Enzima

(g/L)

Conc. de

Inculo

(g/L)

Agitao

(rpm)

Inicial Final

Conc. de

lcool

(g/L)

TBf B (h) (%)

P

(g/L.h)

1 60 1,0 1,0 0,2 30 500 46 1,06 18,65 13 77,31 1,43

2 60 1,0 1,0 0,2 50 300 44 2,40 19,04 10 85,26 1,90

3 60 1,0 1,0 0,4 30 300 43 2,33 19,15 8 87,72 2,39

4 60 1,0 1,0 0,4 50 500 44,3 1,31 18,72 8 81,12 2,34

5 60 3,0 3,0 0,2 30 300 43,4 5,19 18,48 8 90,10 2,31

6 60 3,0 3,0 0,4 70 300 43,75 9,54 17,09 6 93,06 2,85

7 90 1,0 1,0 0,4 70 300 65 3,67 29,40 8 89,30 3,68

8 90 1,0 1,0 0,2 30 500 64,3 4,77 24,31 12 76,07 2,03

9 90 3,0 3,0 0,2 70 300 65,2 10,13 25,83 10 87,38 2,58

10 90 3,0 3,0 0,4 30 500 66,2 2,54 26,58 12 77,78 2,22

11 90 3,0 3,0 0,4 70 500 63,5 8,66 27,35 8 92,91 3,42

12 90 3,0 3,0 0,2 50 300 66 5,71 30,39 10 93,90 3,04

Conc. Concentrao TBf B Tempo de Fermentao, onde se pode verificar a maior concentrao de etanol; - Rendimento da fermentao; P Produtividade da fermentao relativa ao produto. ART Acar Redutor Total

Captulo 4 Resultados e Discusses 36

De acordo com a Tabela 4.1, os Ensaios de 1 a 6 foram realizados com uma

concentrao de soro de 60 g/L e o ensaios 7 a 12 a uma concentrao de 90 g/L.

Os resultados dos itens a seguir foram divididos em dois grupos: 60 e 90 g/L de

soro, a fim de facilitar a discusso. Os resultados de cada ensaio esto apresentados em

um grfico com as variaes das concentraes de acar redutor, etanol e de massa

seca. Tambm apresentado um grfico com o comportamento da concentrao de

acar redutor e glicose.

4.2 RESULTADOS: CONCENTRAO DE SORO = 60G/L A Figura 4.1 mostra as variaes das concentraes do acar redutor, do etanol

e da massa seca ao longo do tempo para o Ensaio 1.

Figura 4.1: Variaes das concentraes de etanol, acar redutor e da massa seca para Ensaio 1. Concentrao de nutrientes de 1,0 g/L, concentrao de enzima de 0,2 g/L;

concentrao de inculo de 30 g/L e agitao de 500 rpm.

No Ensaio 1, o consumo de substrato at a 10a hora de fermentao atingiu o

valor de 2,61 g/L, sendo praticamente esgotada em 12 horas de fermentao. A

produo de etanol mostrou-se acentuada at a 8a hora, atingindo um valor de 14,85 g/L,

a partir desde instante a produo torna-se moderada, atingindo a produo mxima em


13 horas de fermentao, com um valor de 18,65 g/L. A partir desse momento nota-se

uma queda na produo de etanol.

Com relao concentrao de clulas, expressa como massa seca, o

crescimento foi moderado, a partir de um valor medido na 2a hora de 18,02 g/L e atingi

na 13a hora, 24,83 g/L.

A Figura 4.2 apresenta o comportamento da concentrao de acar redutor para

o Ensaio 1, durante toda a fermentao em comparao com a concentrao de glicose.

Figura 4.2: Acar redutor e Glicose para o Ensaio 1

Nota-se que desde o incio at a 4a hora de fermentao que a glicose

consumida rapidamente devida atuao da enzima no processo de converso da

lactose nos seus respectivos monossacardeos, acares mais facilmente fermentveis.

Da 6a a 10a hora o consumo da glicose apresenta-se moderada, at seu esgotamento em

13 horas de fermentao. A diferena entre as curvas, de acar redutor e glicose,

representa o teor remanescente de acar redutor representada por lactose mais

galactose que no passaram, respectivamente, pela hidrlise da enzima e pela

fermentao das leveduras. Essa diferena maior nas 6 primeiras horas de

fermentao.

Na Tabela 4.2 so apresentados os valores da taxa de consumo de substrato e a

taxa de produo de etanol.


Tabela 4.2: Taxas para o substrato e produto para o Ensaio 1 Taxa (g/L.h)

T(h) Substrato

dS/dt Produto

dP/dt 1 -4,828 2,300 2 -5,849 2,141 3 -5,835 1,981 4 -5,439 1,821 5 -4,903 1,661 6 -4,316 1,501 7 -3,710 1,340 8 -3,097 1,178 9 -2,482 1,012 10 -1,865 0,837 11 -1,248 0,636 12 -0,631 0,363 13 -0,014 -0,104 14 0,603 -1,099

De acordo com Tabela 4.2 observa-se que a maior velocidade de consumo de

substrato ocorreu no tempo compreendido entre 1 e 9 horas, com taxas de 4,83 a 2,48

g/L.h, a partir desse instante o consumo de substrato foi praticamente constante. A

produo de etanol teve uma maior velocidade de produo at 8a hora, a partir da 12a

hora a taxa passa pelo seu mximo.

A Figura 4.3 mostra as variaes das concentraes do acar redutor, do etanol

e da massa seca ao longo do tempo para Ensaio 2.




No Ensaio 2 observa-se que at a 8a hora de fermentao h um consumo

acentuado do substrato, pois a fermentao foi iniciada com 44 g/L e chegando a 5,68

g/L. A partir da 8a hora o substrato praticamente esgotado. A produo de etanol

apresentou uma maior crescimento at a 6a hora, 14,85 g/L. No intervalo da 6a e 10a

hora a produo de etanol teve um pequeno pico, e por volta da 10a hora houve uma

produo mxima, 19,04 g/L. J partir da 10a hora, houve uma ligeira queda da

produo de etanol.

Em relao ao Ensaio 1, um aumento na quantidade de inculo do Ensaio 2

contribuiu para uma converso mxima de etanol em 10 horas de fermentao.

A concentrao de massa seca teve um crescimento pouco significativo,

iniciando com 21,21 g/L e chegando na 10a hora com 24,04 g/L. Em comparao com o

Ensaio 1 um aumento da quantidade inculo reduziu a produo de massa seca em 30%.




Figura 4.4: Acar redutor e glicose para o Ensaio 2

O consumo da glicose foi bem gradativo durante toda a fermentao e a partir da

10a hora a glicose praticamente esgotada. A diferena entre as duas curvas maior at

a 6a hora de fermentao.



Tabela 4.3: Taxas para o substrato e produto para o Ensaio 2

Taxa (g/L.h)

T(h) Substrato

dS/dt Produto

dP/dt 1 -5,389 3,174 2 -5,995 2,804 3 -5,793 2,434 4 -5,294 2,064 5 -4,684 1,694 6 -4,035 1,323 7 -3,371 0,952 8 -2,701 0,576 9 -2,029 0,193 10 -1,357 -0,215 11 -0,684 -0,688 12 -0,011 -1,338


A velocidade de consumo de substrato foi iniciada com uma taxa de 5,39 g/L.h e

chegando a 1,36 g/L.h em 10 horas de fermentao. A partir desde instante foi

praticamente constante. A taxa de produo etanol apresentou moderada at a 6a hora,

1,32 g/L.h.. A partir da 10a hora a taxa de produo passou pelo seu mximo.

A Figura 4.5 mostra as variaes das concentraes do acar redutor, do etanol

e da massa seca ao longo do tempo para o Ensaio 3.



O Ensaio 3 mostra que a quantidade de substrato consumida de forma

gradativa at a 8a hora, tendo como concentrao inicial de substrato, 43 g/L, chegando

a 2,33 g/L. A partir deste instante ela praticamente esgotada. A produo de etanol

atingiu o mximo em 8 horas de fermentao, 19,15 g/L. A partir da 8a hora o etanol

teve uma pequena queda.

Em comparao com ensaios anteriores, um aumento da quantidade de enzima

contribuiu para o esgotamento do substrato e uma produo mxima de lcool em 8

horas de fermentao.

A concentrao de massa seca teve um crescimento em relao quantidade de

microrganismo de 63 % at a 8a hora, 18,82 g/L.




Figura 4.6: Acar redutor e glicose para o Ensaio 3

A glicose foi praticamente consumida em 8 horas de fermentao. A maior

diferena entre as curvas pode ser notado nas 4 primeiras horas de fermentao, a partir

deste instante a diferena bem menor.



Tabela 4.4: Taxas para o substrato e produto para o Ensaio 3

Taxa (g/L.h)

T(h) Substrato

dS/dt Produto

dP/dt 1 -7,004 3,967 2 -6,012 3,404 3 -5,296 2,840 4 -4,680 2,277 5 -4,102 1,713 6 -3,538 1,150 7 -2,978 0,588 8 -2,421 0,027 9 -1,864 -0,530 10 -1,308 -1,074

Tese Soro e Levedura e Lactase

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