UNIVERSIDADE DE MOGI DAS CRUZES ALEXANDRO DE LIMA SOUZA

TONINA E NOCICEPO

Mogi das Cruzes, SP 2007

UNIVERSIDADE DE MOGI DAS CRUZES ALEXANDRO DE LIMA SOUZA

TONINA E NOCICEPO Dissertao apresentada ao mestrado em Biotecnologia da Universidade de Mogi das Cruzes como parte dos requisitos para obteno do ttulo de mestre.

rea de Concentrao: Biolgica

Orientador: Prof. Dr. Jorge Luiz Pesquero

Mogi das Cruzes, SP 2007

FINANCIAMENTO

Os laboratrios de Biofsica e de Farmacologia da Inflamao da UFMG contam com toda a infra-estrutura para desenvolver o projeto proposto. Alm disso, o projeto conta com apoio financeiro da Fapesp e do CNPq.

Ficha Catalogrfica elaborada por Cntia de Azevedo Loureno Bibliotecria e Professora do Curso de Biblioteconomia da UFMG

612 S719t Souza, Alexandro de Lima

Tonina e nocicepo / Alexandro de Lima Souza. 2007.

46 f. : il. ; 30 cm.

Dissertao (mestrado) Universidade de Mogi das Cruzes, Programa de Ps-graduao em Biotecnologia, 2007.

Orientao: Prof. Dr. Jorge Luiz Pesquero.

1. Fisiologia da dor. 2. Tonina. 3. Nocicepo. 4. Angiotensina II. 5. Opiides. I. Ttulo.

DEDICATRIA

Dedico este trabalho Isabel de Lima Souza (em memria)

Em todo verdadeiro pesquisador da natureza mora uma espcie de reverncia religiosa, pois ele se d conta de que possvel imaginar-se como sendo o primeiro a ter conscincia da trama incomparavelmente delicada que une suas percepes. A manifestao de conhecimento que no havia ainda sido posta a nu produz no investigador sensao semelhante surgida na criana que procura alcanar o nvel de domnio com que os adultos manipulam as coisas.

(Albert Einstein)

AGRADECIMENTOS

Ao prof. Jorge Luiz Pesquero, pela orientao, dedicao e perseverana, por ser antes de qualquer coisa, um grande amigo, que mesmo tendo pontos de vistas diferentes, tem me apoiado nos caminhos da academia e da vida. Aos professores, estagirios e tcnicos da UFMG pelo apoio e colaborao nos momentos de dvida e necessidade de apoio. Dra. Cntia de Azevedo Loureno, por tornar menos dolorosa essa via sacra, como esposa e como amiga.

RESUMO

A angiotensina II (Ang II), o principal efetor do sistema renina-angiotensina (SRA) um peptdeo hormonal com potente atividade vasoconstritora, sendo tambm reconhecido como um peptdeo regulatrio multifuncional, com ao em diversos tecidos. As aes da Ang II no sistema nervoso central incluem: elevao da presso arterial, regulao do balano eletroltico, aumento da liberao de vasopressina, o aumento do apetite ao sdio e da ingesto de gua, a natriurese, possivelmente funes cognitivas. Tambm tem sido proposto o envolvimento do SRA no processamento central da informao sensorial. A tonina uma serina-proteinase capaz de formar Ang II a partir da angiotensina I (Ang I), a partir do angiotensinognio (AG) e de peptdeos sintticos correspondentes poro tetradecapeptdica N-terminal do (AG(1-14)). Recentemente, geramos camundongos transgnicos que apresentam superexpresso da tonina de rato [TGM(rTon)]. Este animal vem sendo estudado quanto ao fentipo em termos bioqumicos, fisiolgicos e morfolgicos. O animal apresenta pequeno, mas significativo aumento nos nveis pressricos, apesar de os nveis teciduais e circulantes de angiotensina II no serem diferentes dos nveis do animal selvagem. O TGM(rTon) provavelmente apresenta alteraes a nvel renal. Em relao ao volume urinrio no observamos diferenas significativas entre o TGM(rTon) e seu controle, porm para a gua ingerida observamos aumento na quantidade para o animal transgnico e este animal apresentou uma reduo da osmolaridade da urina. Neste trabalho estudou-se a resposta nociceptiva do animal TGM(rTon). Utilizamos para isso o teste das contores abdominais ao cido actico, teste de formalina e ainda o teste de rota-rod. Os resultados apresentam evidencias de que o animal TGM(rTon) apresenta reduo da capacidade motora, observada no teste do rota-rod. Esta reduo da capacidade motora dos animais TGM(rTon) pode, em parte, ser explicada por um possvel aumento nos nveis de opiides, uma vez que tonina capaz de hidrolisar beta-LPH e liberar peptdeos com ao opiide. No entanto, com relao a nocicepo, o TGM(rTon) apresentou significativo aumento na sensibilidade a dor, especificamente na segunda fase do teste da formalina, fase na qual so liberados os agentes inflamatrios. Em concluso, apesar do indcio da presena de opiides endgenos, percebidos atravs do estudo de motricidade, realizado pelo teste de rota rod, houve resposta hiperalgsica por parte dos animais TGM(rTon) na fase inflamatria do teste da formalina.

Palavras-chave: Tonina, Nocicepo, Angiotensina II, Opiides

ABSTRACT

Angiotesin II (Ang II), main trigger of the renin-angiotensin (SRA), is a hormonal peptide with potent vasoconstrictor activity, also being recognized as a multifunctional regulatory peptide, with action in several woven. Ang II's actions in the central nervous system include: elevation of the blood pressure, regulation of the swinging electrolytic, increase of the vasopressin liberation, the increase of sodium appetite and the increase of water ingestion, called natriurese, a process that possibly interferes in cognitive functions. There has also been proposed the involvement of SRA in the central processing of sensorial information. Tonin is a serine-proteinase capable of forming Ang II starting from angiotensin I (Ang I), or starting from angiotensinogen (AG) and of synthetic peptides corresponding to the N-terminal tetradecapeptidic portion of the (AG(1-14)). Recently we generated transgenic mice that presented super expression of the mouse tonin [TGM(rTon)]. This animal has been studied in relation to the phenotype in biochemical, physiological and morphological terms. The animal presents a small but significant increase in the pressure levels, although the tissue and circulation levels of angiotesin II are no different of the ones found in wild animals. The mouse tonin probably presents changes in the kidneys function. In relation to the urine volume we have not observed any significant changes between the TGM(rTon) and the control group, although we observed an increase in the amount of water ingested by the transgenic animal and this animals kidney presented a reduction of its filtration capacity. In this thesis we have studied the nociceptive answer of the animal TGM(rTon). For that, we used a test measuring the amount of abdominal contortion in response to acetic acid, a formalin test and a rota-rod test. The results show evidence that the TGM(rTon) animal presents a reduction of the motor skill, observed in the rota-rod test. This reduction may, in part, be explained by a possible increase of opioids, seeing that the tonine is capable of hydrolyzing beta-LPH and releasing peptides with opioid action. However, in relation to the nociceptivity, the TGM(rTon) presented a significant increase in its pain sensitivity, especially in the second fase of the formalin test, when the inflammatory agents are released. In conclusion, although there was a trace of endogenous opioids, noticed through the motricity study, realized through the rota rod test , there was an hiperalgesic response from the TGM(rTon) animals in the inflammatory fase of the formalin test.

Keywords: Tonin, Nociception, Angiotesin II, Opioids

LISTA DE ILUSTRAES

Figura 1. Sistema renina angiotensina .................................................... 12 Figura 2. Vias de formao de angiotensina II envolvendo o sistema

tonina angiotensina ................................................................

13

Figura 3. Organizao das fibras aferentes primrias envolvidas na conduo de um estmulo nociceptivo desde a superfcie cutnea (terminal perifrico) at o como dorsal da medula espinal. NE, fibra nociceptiva especfica; NP, fibra nociceptiva polimodal; no-N, fibra no nociceptiva. Adaptado de Millan (1999) por Castro (2000) ............................................................

18 Figura 4. Seqncia da construo gnica utilizada na gerao do

camundongo transgnico que expressa tonina de rato ...........

21 Figura 5. Aparelho de rota-rod da marca Ugo Basile .............................. 27 Figura 6. Caixa utilizada no experimento de contoro pelo cido

actico .....................................................................................

29 Figura 7. Camundongo TGM(rTon), aps experimento de contoro

abdominal, j disponibilizado para ser submetido ao processo de eutansia .............................................................

30 Figura 8. Tempo de permanncia, expresso em minutos, dos diferentes

grupos, Swiss, selvagem e transgnico no teste do rota-rod. *p < 0,05 vs TGM(rTon). As colunas representam a mdia epm (n = 6) ..............................................................................

32 Figura 9. Contores abdominais induzidas por cido actico em

camundongos selvagens e TGM(rTon) em sistema monocego. As colunas representam a mdia epm (n = 6) ...

33

Figura 10. Teste de formalina. Nmero de lambidas induzidas pela injeo de formalina em camundongos selvagens (S) e transgnicos (T). A primeira fase corresponde ao tempo de 0 - 5 minutos aps a injeao e a segunda fase 15 - 30 minutos. *p < 0,05. As colunas representam a mdia epm (n = 6) .....

34

LISTA DE ABREVIATURAS

AG Angiotensinognio Ang I Angiotensina I Ang II Angiotensina II Arg. Xxx Arginina + qualquer radical AT1 Receptor ligado a protena-G AT2 Receptor ligado a protena-G CD Corno distal DNA cido desoxirribonuclico ECA Enzima conversora de angiotensina FAP Promotor para insero de seqncia de gene Fen. Xxx Fenilalanina + qualquer radical IASP Associao Internacional para o Estudo da Dor Icv Intracerebroventricular RPM Rotaes por minuto SRA Sistema renina-angiotensina SV40poliA Fator de superexpresso de gene inserido TGM Transgenic mouse

LISTA DE ANEXOS

Tabela - Analise estatstica das contores abdominais em cido actico .....................................................................................

Comit de tica ........................................................................................

SUMRIO

1 INTRODUO ................................................................................... 11 1.1 Sistema renina-angiotensina ..................................................... 11 1.2 Sistema tonina-angiotensina II .................................................. 12 1.3 Dor e Nocicepo ...................................................................... 14

1.3.1 Modulao da nocicepo ............................................... 17 1.3.2 Analgesia ......................................................................... 18 1.3.3 Dor e o sistema renina-angiotensina ............................... 20

1.4 Camundongo transgnico que expressa tonina de rato ............ 21 2 OBJETIVOS ....................................................................................... 23

3 MTODOS ......................................................................................... 24 3.1 Animais ...................................................................................... 25

3.2 Mtodos para avaliar dor ........................................................... 25

3.2.1 Teste do "rota-rod ........................................................... 26

3.2.2 Teste de contoro abdominal ........................................ 27 3.2.3 Teste da formalina ........................................................... 30

3.4 Anlise dos dados ..................................................................... 30

4 RESULTADOS ................................................................................... 31

4.1 Teste de rota-rod ....................................................................... 31

4.2 Teste de contoro abdominal .................................................. 32 4.3 Teste de formalina ..................................................................... 33

5 DISCUSSO ...................................................................................... 35 6 CONCLUSES .................................................................................. 38 7 REFERNCIAS .................................................................................. 39 ANEXOS ...............................................................................................

1 INTRODUO 1.1 SISTEMA RENINA-ANGIOTENSINA

A angiotensina II (Ang II), o principal efetor do sistema renina-angiotensina (SRA, Figura 1) um peptdeo hormonal com potente atividade vasoconstritora (PEACH, 1977), sendo tambm reconhecido como um peptdeo regulatrio multifuncional, com ao em diversos tecidos incluindo o crebro, o

corao, a adrenal, o rim, e as gnadas (DZAU et al., 1986; DZAU et al., 1987; KUNAPULI et al., 1987; LINDPAINTER et al., 1987; KUMAR et al., 1989; LOPES et

al., 1997). As aes da Ang II no sistema nervoso central incluem: elevao da

presso arterial, regulao do balano eletroltico, aumento da liberao de

vasopressina, aumento do apetite ao sdio e da ingesto de gua, denominada

natriurese (FITZSIMONS, 1980; GANONG et al., 1982; OLSEN et al., 1985), e possivelmente funes cognitivas (PHILLIPS, 1987). Tambm tem sido proposto o envolvimento do SRA no processamento central da informao sensorial. Outros

trabalhos mostram que a angiotensina II es t ligada nocicepo (Guasti et al., 1998).

Pelo SRA, o angiotensinognio (AG) clivado pela renina, levando formao da angiotensina I (Ang I). A Ang I, pela ao da enzima conversora de

angiotensina (ECA), hidrolisada na ligao Fen8-His9, com conseqente liberao do octapeptdeo Ang II. Outras vias enzimticas podem contribuir para a formao

da Ang I e da Ang II (BOUCHER et al., 1974; GENEST, 1983). No se conhece ainda a importncia relativa de cada via formadora de Ang II que est presente nos

diferentes tecidos, porm, existem indcios de que, em alguns neurnios cerebrais, a

maior parte da Ang II possa ser formada por outras enzimas que no a ECA e a

renina (BUNNEMAN et al., 1993).

Figura 1: Sistema renina angiotensina e efeitos mediados pelos receptores de angiotensina

A presena do sistema renina-angiotensina j reconhecida em quase todos os tecidos (PHILLIPS et al.,1992). Isto particularmente significante no corao e na parede dos vasos sangneos, nos casos de arteriosclerose (PHILLIPS et al.,2002),( BRASIER et al.,2002), e falhas cardacas (DZAU, 1984), (NAKAMURA, M. et al.,1985),( DZAU,1986). A Ang II produzida em vrios tecidos de relevncia cardiovascular como a glndula adrenal (YOSIPIV,1996), corao e vasos sangneos (MOFFET, R. B. , BUMPUS, F. M. , HUSAIN, A.,1989), rins(CHIU, A. T. et al.,1989) e crebro (HEIN, L. et al. HEIN, L. et al.,1995). A Ang II a molcula chave do sistema, sendo um potente regulador da presso sangnea e do balano

Asp.Arg.Val.Tir.Ile.His.Pro.Fen.His.Leu.Val.Ile ... Angiotensinognio humano

Asp.Arg.Val.Tir.Ile.His.Pro.Fen.His.Leu Angiotensina I

Asp.Arg.Val.Tir.Ile.His.Pro.Fen Angiotensina II

Renina

ECA

receptor AT2

Rim reteno de sdio fibrose

Glndula adrenal liberao de aldosterona Corao

inotropia cronotropia hipertrofia fibrose

Vasos constrico hipertrofia

Crebro sede apetite ao sal ativao simptica liberao de vasopressina

de gua e eletrlitos atravs da dipsognese e ativao do sistema nervoso

simptico. Outras atividades relacionadas a Ang II incluem a modulao da liberao

de hormnios da pituitria, interferncia com a aprendizagem e a atividade motora e

regulao da temperatura corporal e analgesia. A ao da Ang II se d aps

interao com um dos dois receptores ligados a protena-G, e denominados AT1 e

AT2 (ICHIKI, T. et al.,1995),( WRIGHT, J. W. , HARDING, J. W.,1994),. Os principais efeitos da Ang II so mediados atravs do receptor AT1( MARRERO, M. B. et al.,1995). O receptor AT2 expresso durante a vida fetal em ncleos cerebrais distintos (GRADY, E. F. et al.,1991),(TSUTUMI, K. , SAAVEDRA, J. M.,1991) sugerindo possveis papis no crescimento, desenvolvimento e funes neuroniais.

Estudos em camundongo transgnico, no qual o gene do receptor AT2 foi

nocauteado, sugerem que este receptor pode estar envolvido no crescimento,

desenvolvimento e comportamento explorador(HEIN, L. et al.,1995),( ICHIKI, T. et al.1995) . Os efeitos da Ang II, resultantes de sua interao com estes receptores especficos esto mostrados na figura 1.

Enzimas semelhantes renina, proteinases como a catepsina D, a

pepsina e outras aspartil-proteinases, so capazes de produzir Ang I a partir do AG.

Alm disso, outras enzimas que no a ECA, so capazes de produzir Ang II, tanto a

partir de Ang I como diretamente do AG, entre elas a catepsina G e a tonina.

1.2 SISTEMA TONINA-ANGIOTENSINA II

Tonina uma enzima da famlia das serina-proteinases, capaz de formar

Ang II tanto a partir da Ang I, como do AG (GRIS et al., 1981) e de peptdeos sintticos correspondentes poro tetradecapeptdica N-terminal do AG (AG (1-14)) (SCHILLER et al., 1976; PESQUERO et al., 1982) (Figura 2). Alm de liberar Ang II, foi demonstrado que a tonina capaz de hidrolisar pro-opiomelanocortina

para produzir o hormnio adrenocorticotropina (ACTH) e hormnios peptdeos beta-lipotrpicos (SEIDAH et al., 1979), alm de degradar a substncia P (CHRTIEN et al., 1980, PESQUERO et al., 1982), clivando ligaes do tipo Arg. Xxx e Fen.Xxx, mostrando uma enzima com atividade trptica-quimotrptica.

Figura 2. Vias de formao de angiotensina II envolvendo o sistema tonina angiotensina.

Tonina est presente em vrios tecidos de rato, estando especialmente

concentrada na glndula submandibular, onde representa 8% do contedo total de

protena. liberada pela glndula na saliva e na corrente venosa (GARCIA et al., 1976). A atividade tonina no plasma de difcil determinao, pois a enzima encontra-se ligada a alfa2-macroglobulina, um inibidor proteico (Trembley et al., 1981). Tonina est presente em menores concentraes no pncreas, fgado, bao, partida, testculos, prstata e crebro (BOUCHER et al., 1974; JOHANSEN et al., 1987; WOODLEY-MILLER et al., 1987; ARAUJO et al., 1991).

ECA

Angiotensinognio

Angiotensina I

Angiotensina II

Renina Catepsina D

Quimase Catepsina G

TONINA

Catepsina G TONINA

Em trabalho realizado por Lopes et al. (1997), foram determinados os nveis de atividade tonina em diferentes regies do encfalo de rato. Os maiores

nveis de atividade, encontrados utilizando-se o AG(1-14) como substrato, foram no arquicerebelo (flculo nodular) e na neurohipfise e os menores nveis no hipocampo e adenohipfise. No foi detectada atividade no crtex cerebelar e no

plexo coride. Em trabalho desenvolvido por Araujo et al. (2002), foi mostrado que a injeo intracerebroventricular (icv) de tonina pode produzir efeito pressor em rato acordado. Observou-se aumento da ingesto de gua causado pela injeo icv de tonina, aumento que foi bloqueado completamente pela injeo prvia de losartan um antagonista de receptores AT1 de angiotensina.

3. Dor e nocicepo

Os antigos gregos, dentre eles Aristteles, acreditavam que a dor era um

"desgosto", sentimento oposto ao prazer experimentado no corao, e Willian

Harvey, descobridor da circulao, acreditava que o corao e no o crebro fosse o

"sensorium communum" onde a dor era sentida (BONICA, 1976). Em 1644, Descartes descreveu a conduo das sensaes, inclusive dor, via "sensores

delicados" contidos em nervos que conectava os tecidos ao crebro, onde a

sensao era produzida.

A dor um componente sintomtico de diversas desordens clnicas, afetando

grande parte da populao (BESSON e DICKENSON, 1997). De um modo geral, a sua funo operar como mecanismo de auto-preservao do corpo, ocorrendo

quando um tecido lesado quer seja por mtodos mecnicos ou por mtodos qumicos, fazendo com que o indivduo reaja com o intuito de remover a causa do

estmulo (DRAY, 1997). Segundo a Associao Internacional para o Estudo da Dor (IASP), a dor pode ser definida como uma experincia sensorial e emocional desagradvel, associada a dano tecidual ou potencial, ou descrita em termo de tal

leso (MELZACK e LOESER, 1999; ALMEIDA et al., 2004). O estmulo da dor pode ocorrer mesmo em nveis sutis, nas atividades

cotidianas onde pode ser acionado por causas muito diversas. Um exemplo que

pode ser usado para descrever esse processo o da isquemia nos squios (ossos da bacia sobre os quais o peso do corpo depositado ao se sentar, quando uma

pessoa permanece por muito tempo sentada e/ou devido a permanncia por um

tempo prolongado numa mesma posio. Este comportamento leva a diminuio do

fluxo sangneo, fazendo com que o indivduo sinta a necessidade de mudar de

posio, movendo o peso corporal inconscientemente para permanecer sentado por

um perodo mais prolongado (GUYTON, 2002; ALMEIDA et al., 2004). A dor uma experincia universal, cotidiana e quase sempre necessria.

Pessoas com doenas congnitas ou adquiridas e que devido a isso so privadas de

sensibilidade dolorosa, geralmente so acometidas por diversos tipos de ferimentos,

sem perceber, correndo srios riscos de injrias letais (MELZACK e LOESER, 1999; ALMEIDA et al., 2004).

Como exemplo de dessensibilizao dos nociceptores, podemos citar o caso

dos diabticos, os quais perdem a sensibilidade nas extremidades, sendo isto

denominado neuropatia decorrente dos nveis de glicemia alterados. Como este

um mal secundrio decorrente do diabetes, os enfermos ferem-se nos ps com

bastante freqncia sem perceberem, levando a necrose e eventualmente a uma

amputao (SCHIMID, 2007). A hansenase outro exemplo de dessensibilizao dos nociceptores e, devido a isso, ao exporem uma leso causada pela doena a

estmulos mecnicos ou trmicos e qumicos, no se observa qualquer reao

devido s leses causadas pela molstia (PEREIRA et al., 2006). Existe diferena entre os termos nocicepo e dor. O termo nocicepo

refere-se a manifestaes neurolgicas, geradas por estmulos nocivos. A dor

envolve a percepo de um estmulo aversivo e requer abstrao e elaborao do

impulso sensorial (MELZACK e LOESER, 1999; ALMEIDA et al., 2004). Em 1906, Sherrington props o termo nociceptivo, referindo-se a um estmulo

capaz de comprometer a integridade do organismo. Em animais esses estmulos

produzem respostas reflexas (aumento das atividades respiratria e cardaca, dilatao da pupila) e comportamentais (reao de escape, localizao) integradas em algum local. Em humanos, a sensao produzida por esses estmulos, algumas

vezes era considerada como dor aguda. Atualmente, a descrio da dor baseia-se

em dois tipos diferentes: dor rpida e dor lenta (GUYTON, 2002; ALMEIDA et al., 2004). A dor rpida caracterizada pelo estmulo e resposta dentro do tempo de aproximadamente 0,1 segundo, enquanto a dor lenta a resposta pode vir a partir de

um segundo ou mais. A dor rpida descrita de modos diferentes como dor sbita,

dor picada, dor aguda e dor eltrica. Geralmente esse tipo de dor sentido quando a

pele cortada, espetada por agulhas ou agudamente queimada. Importante

ressaltar que esse tipo de dor aparece geralmente de maneira superficial, no sendo

caracterstica em tecidos profundos (GUYTON, 2002; ALMEIDA et al., 2004). A dor lenta tambm chamada por nomes bastante diversos como, por exemplo, dor

surda, dor nauseante e dor crnica. Geralmente essa dor associada destruio

de tecidos, se prolongada pode se tornar insuportvel. Esse tipo de dor pode ocorrer

na pele ou em tecidos profundos (GUYTON, 2002; ALMEIDA et al., 2004).

3.1. Modulao da nocicepo

A ao pr-nociceptiva de substncias algognicas reflete a capacidade de

mobilizao das fibras aferentes primrias (FAPs) e a transmisso ortodrmica do impulso nervoso em direo ao corno dorsal (CD) da medula espinhal (figura 3). As fibras de um modo geral participam nos efeitos em cascata que transmitem os

estmulos de dor ao sistema nervoso central. De acordo com Castro (2000), as fibras aferentes primrias so:

1. Fibras C: dimetro pequeno (0,4 - 1,2 m), mielinizadas e de conjuno lenta (0,5 2,0 m/seg), localizam-se ao longo das paredes das veias desecadeando uma resposta de dor surda.

2. Fibras A: dimetro mdio (2 - 6 m), mielinizadas e de velocidade de conjuno intermediria (12 - 30 m/seg), desencadeando uma resposta de dor de natureza rpida e lancinante.

3. Fibras A: dimetro grande (>10 m), mielinizadas e de conjuno rpida (30 - 100 m/seg). Este grupo de fibras participa muito pouco de processos nociceptivos agudos, estando mais envolvidos em casos

de alodnia e em dores crnicas.

A liberao de mediadores, em tecidos inflamados pode sensibilizar fibras

nociceptivas perifricas, promovendo a facilitao central da transmisso nociceptiva

(SYRYATOWICS et al., 1999; VANEGAS, 2004), levando a uma resposta dolorosa aumentada a um estmulo nocivo, chamado de hiperalgesia (TJLSEN e HOLE, 1997; SOMER e CRESS, 2004; VANEGAS 2004; COUTAX et al., 2005). Alteraes na percepo sensorial, envolvendo sensibilizao central, pode levar alodnia,

que est relacionada a dor evocada por um estmulo no nocivo (MILLAN, 1999).

Figura 3. Organizao das fibras aferentes primrias envolvidas na conduo de um estmulo

nociceptivo desde a superfcie cutnea (terminal perifrico) at o como dorsal da medula espinal. NE, fibra nociceptiva especfica; NP, fibra nociceptiva polimodal; no-N, fibra no

nociceptiva. Adaptado de Millan (1999) por Castro (2000).

Levando em considerao as aes diretas dos diferentes fatores

relacionados nocicepo, algumas substncias agem modificando o limiar de

excitabilidade dos nociceptores, causando analgesia ou hiperalgesia como a

bradicinina e os prostanides (SHEWOOD e TOLIVER-KINSKY,2004). A infuso intradrmica de BK, sua aplicao em superfcies desepitelializadas ou a infuso

endovenosa desencadeiam dor intensa e imediata, em paralelo com a estimulao

de fibras C polimodais e mecanossensveis presentes na pela ou em outros tecidos

(KHAN, 1992; LANG,1990; MANNING,1991,).

3.2. Analgesia

A analgesia uma reduo nas percepes e no tempo de resposta do

processo nociceptivo (MILLAN, 1999). Vrios fatores podem contribuir para alterar a resposta, quer seja por ao farmacolgica, quer seja por ao de opiides endgenos.

Os hipoalgsicos so os frmacos que deprimem o sistema nervoso central

(COLLIER et al., 1961), eliminando ou reduzindo a sensao de dor, sem causar perda de conscincia. Agem complexando mltiplos receptores estereoespecficos,

em diversos locais do sistema nervoso central. So divididos entre endgenos e

exgenos.

Os principais agentes e utilizados na terapia da dor so os opiceos

(derivados do pio) e os opiides derivados sintticos com ao semelhante ao da morfina. As encefalinas (opiides endgenos), que so o grupo de opiides que envolvem os processos de analgesia produzidos fisiologicamente, so basicamente

produzidas pelo sistema nervoso central. Os representantes dessa classe,

denominados como opiceos, apresentam alta potncia analgsica, chegando em

alguns casos a ser 1000 vezes maior do que a morfina. Cerca de uma dzia dessas

substncias opiceas foram encontradas em diferentes pontos do sistema nervoso;

basicamente sendo produtos de degradao de trs grandes molculas proticas: a

pr-encefalina, a pr-opiomelacortina, a pr-dinorfina (DREY, 1997; MASOM, 1999; JULIUS e BASBAUM, 2001; VANEGAS, 2004; VANEGAS e SCHAIBLE, 2004). Mltiplas reas do crebro apresentam receptores opiceos, especialmente nas

reas do sistema de analgesia. Entre as diferentes substncias as mais importantes

so: beta-endorfina, metaencefalina, leu-encefalina e a dinorfina. As duas

encefalinas so encontradas em maior quantidade no tronco enceflico e na medula

espinhal; j a beta-endorfina est presente tanto no hipotlamo quanto na glndula hipfise. A dinorfina encontrada em quantidade muito menor, sobretudo nas

mesmas reas que as encefalinas. Todos os detalhes mais finos do sistema opiceo

no sistema cerebral no esto completamente compreendidos.

3.3. Dor e o sistema renina-angiotensina

De um modo geral os nociceptores no demonstram capacidade de se

adaptar, se adaptam to pouco ou no se adaptam aos estmulos, que em certas

condies agem de modo que a estimulao das fibras pode ser constante. Alguns

autores demonstraram que ratos espontaneamente hipertensos tm uma

sensibilidade reduzida dor (RODNEY et al., 1995). Entretanto o mecanismo que envolve as diferenas na sensibilidade a dor e a elevao da presso arterial ainda

no esto bem identificados. Administrao de renina e Ang II intracerebroventricular

(icv) exercem efeito analgsico em ratos, atravs da inibio da transmisso da informao nociceptiva trmica, produzindo desta forma, um aumento no tempo de

latncia no teste do tail-flick (GEORGIEVA et al., 1998). Esse efeito bloqueado pela saralasina que um antagonista da Ang II e pela naloxana que um

antagonista opiide, o que sugere a participao da Ang II como neuromodulador

central da nocicepo atravs da liberao de opiides endgenos (TOMA et al., 1997). A Tonina capaz de liberar opiides endgenos (SEIDAH et al., 1979), podendo desta forma participar do processamento da informao sensorial

juntamente com a Ang II como tem sido proposto por diversos autores (HAULICA et al., 1986; TOMA et al., 1997).

s diferentes terminaes nervosas distribudas anatomicamente pela pele

podem ser atribudas funes nociceptivas especficas. O conceito de uma

modalidade especfica para dor no pode ser comprovado por enquanto. A

transmisso de estmulos nociceptivos ao sistema nervoso central ocorre atravs de

fibras neuronais de pequeno dimetro no mielinizadas (C) ou finalmente que originam de pequenos neurnios bipolares dos gnglios da raiz dorsal. Em sua

maioria existem como terminaes livres na periferia. A substncia P, a angiotensina

II e a somatostatina so encontradas em seus corpos celulares (BULLINGHAM, 1985). Estas clulas projetam-se centralmente, predominantemente como dorsal da medula, sendo dividido em seis lminas que se desfazem na sinapse com

receptores especficos e /ou no especficos.

4. Camundongo transgnico que expressa tonina de rato

A tecnologia dos transgenes proporciona a oportunidade de entender in vivo o

papel de sistemas peptidrgicos. Utilizando-se do promotor gfap (protena cida fibrilar glial, 2163 pb, sequncia humana), do cDNA da tonina de glndula submandibular de rato e do SV40poliA (859 pb) (figura 4), foi gerado, aqui no Brasil, em colaborao com o Dr Bader do laboratrio de hipertenso do Max-Delbruk

Center (MDC), Berlim, Alemanha, camundongo transgnico que apresenta expresso de tonina de rato TGM(rTon).

Figura 4. Seqncia da construo gnica utilizada na gerao do camundongo transgnico

que expressa tonina de rato.

gfap ton SV40

O transgene est expresso em vrios tecidos deste animal sendo que o maior

nvel foi encontrado no encfalo, seguido do corao, rim, fgado, estmago, bao,

tecido adiposo e aorta. O animal apresenta pequeno aumento da presso arterial e

nenhuma diferena de freqncia cardaca quando comparado ao grupo controle

(selvagem). Para esta pesquisa, props-se caracterizar o animal TGM(rTon) quanto resposta nociceptiva.

II. OBJETIVOS

a) Geral Avaliar a capacidade nociceptiva dos camundongos TGM(rTon). Executar

experimentos que possam mostrar a possvel participao da tonina em processos

de nocicepo.

b) Especficos

Avaliar a resposta motricial do animal TGM(rTon) utilizando para isso os testes de rota-rod para avaliar a capacidade de

coordenao motora;

Avaliar a resposta nociceptiva dos animais TGM (rTon) atravs do nmero de contores induzidas pelo cido actico, responsvel

por resposta nociceptiva e inflamatria simultaneamente;

Avaliar as respostas nociceptiva e inflamatria em fases separadas

utilizando-se o teste de edema de pata induzido por formalina.

III. MATERIAL e MTODOS

1. Comit de tica

Conforme legislao em vigor, os procedimentos experimentais sero

submetidos a um comit de tica local, para garantir a legitimidade do projeto relacionado dor, garantindo assim que no ocorrero procedimentos que sejam eticamente inaceitveis ou cruis aos animais. Oportunamente, o documento de

aprovao ser anexado dissertao.

2. Material

Para a presente pesquisa proposta, sero utilizados os seguintes materiais e

equipamentos:

Caixa de vidro ou acrlico com suporte, equipada com espelhos;

cido actico glacial (ch2H4O2 ) P.A 99,7% marca comercial Vetec

Formaldedo 0,92%;

Aparelho de Rota-rod da marca Ugo-basile;

Pipetas de preciso;

Balana de preciso (para pesagem dos solutos);

Balana para pesar os animais;

3. Animais

Para os testes de avaliao da resposta nociceptiva foram utilizados

camundongos transgnicos que apresentam expresso da tonina de rato TGM(rTon) e camundongos controle, da linhagem C57 selvagens (S), pesando entre 25 e 30 g, mantidos em ciclo claro e escuro de 12 h, com gua comum ad libitum. Estes

animais foram provenientes do biotrio da Universidade de Mogi das Cruzes.

No dia anterior ao teste, os animais so pesados, marcados e alojados em caixas plsticas com cama de maravalha (8 animais no mximo por caixa). A rao retirada 15 horas antes dos testes, mantendo-se a gua ad libitum. No dia do

experimento os animais so levados para a sala de experimentao com

antecedncia mnima de duas horas. As condies ambientais da sala onde se

realizaram os experimentos so mantidas mais constante possvel, evitando-se

principalmente o barulho excessivo ou brusco, movimentao de pessoas na sala,

variaes de temperatura, de luminosidade e de odores. Os testes so realizados

entre 10 e 17 horas, trmino das observaes no mximo s 17h30min.

4. Mtodos para avaliar dor

Os mtodos utilizados para se estudar dor e analgesia variam, mas de um

modo geral, eles ocorrem por meios de experincias subjetivas de dor, sob condies controladas experimentais. No entanto, as diferentes manifestaes em

nocicepo, medulares ou supra-medulares, podem ser associadas dor

experimental e podem ser utilizadas na avaliao de substncias com propriedades

analgsicas.

Rotineiramente os testes nociceptivos utilizados em animais requerem algum

movimento para mostrar que um estmulo nocivo est tendo efeito. A ausncia ou

diminuio de uma resposta no pode ser tomada como evidncia de ao anti-

nociceptiva, a menos que seja excluda a possibilidade de que o animal no tenha a habilidade motora para executar o requerido movimento.

Colier (1970) preconiza a utilizao de um teste de coordenao motora em combinao com o teste nociceptivo rotineiro, a fim de comprovar que os animais

usados em testes so aptos a responder em situaes onde so requeridos

movimentos em resposta ao estmulo aplicado. Sua teoria foi mais tarde corroborada

por diversos pesquisadores do tema, como Millan (1999), Santos et al. (1999) e Le Bars et al. (2001).

4.1. Teste do "rota-rod

O mtodo de "rota-rod" foi desenvolvido por Kinnard e Carr (1957), com o objetivo de medir a atividade motora coordenada forada. De acordo com estes autores certos agentes deprimem a atividade motora de maneira que os animais so

capazes de mostrar movimentos normais quando estimulados, porm, com os

mtodos utilizados at ento, no podia se avaliar "atividade potencial" desses

animais deprimidos. Por isso, eles propuseram forar continuamente os movimentos,

fazendo com que os camundongos caminhassem sobre um eixo horizontal em

movimento (rota-rod), medindo a habilidade motora pelo tempo de permanncia no eixo girando a 30 RPMs. Os testes realizados para estudar a resposta nociceptiva

envolvem uma resposta motora, seja ela a retirada da cauda, o ato de lamber a pata

injetada, ou contores, entre outras. O teste do "rota-rod" detecta a presena de falta de coordenao motora, permitindo uma interpretao mais acurada dos

resultados obtidos nos testes de nocicepo e anti-nocicepo.

O aparelho utilizado consta de uma barra giratria horizontal, de 2,5 cm de

dimetro, revestida de plstico anti-deslizante, suspensa a uma altura de 25 cm e

com rotao constante de 32 rpm (figura 5). Os animais so pr-selecionados, sendo descartados aqueles que no permanecem na barra giratria durante pelo

menos um minuto.

Figura 5. Aparelho de rota-rod da marca Ugo Basile.

Os testes foram realizados no laboratrio da Profa Dra. Janetti Nogueira de

Francischi, do Depto de Farmacologia do Instituto de Cincias Biolgicas da

Universidade Federal de Minas Gerais.

4.2. Teste de contoro abdominal

O teste de contoro abdominal um dos mtodos nociceptivos de maior

sensibilidade, captando o possvel efeito analgsico dos opiides endgenos que

eventualmente possam ser produzidos pela tonina. A sndrome de contoro, na

qual ocorre contrao da parede abdominal, rotao do tronco e extenso dos

membros posteriores, foi primeiramente descrita por Vander-Wende e Margolin

(1956), que observaram ao injetar compostos orgnicos iodados, intraperitonealmente em ratos.

A injeo subcutnea de cido actico, via peritoneal, em camundongos, determina o aparecimento de uma gama de respostas motoras bem caracterizadas,

cuja quantificao permite que se avalie a intensidade da resposta nociceptiva. Esta resposta desenvolve-se bem caracterizada, sendo basicamente de origem

neurognica.

Foi utilizado o teste de contoro induzido por cido actico descrito por

Koster (1956), modificado por Castro (2000), no qual considerado o nmero de contores abdominais dos membros posteriores ocorridas entre 5 e 20 minutos

aps a administrao i.p (intraperitonealmente) de 10 mg/kg de cido actico 0,6%. Em cubas de vidro ou acrlico, medindo 12x12x12 cm, so observados dois animais

de cada vez, sendo considerados somente os camundongos que apresentam a

contoro abdominal imediatamente aps a injeo do cido. O cido actico injetado na regio abdominal do camundongo. Espelhos

colocados na parede posterior da caixa, em ngulo de 45, com piso transparente

permitem a visualizao do camundongo durante todo o tempo (figura 6).

Figura 6. Caixa utilizada no experimento de contoro pelo cido actico.

A soluo de cido actico 0,6% para a injeo intraperitoneal aplicada cuidadosamente atravs do abdmen com o animal imobilizado e levemente

inclinado de cabea para baixo. Esse procedimento possibilita que as vsceras do

animal, por ao gravitacional, se contraiam levemente evitando-se assim a

perfurao das mesmas. A visualizao da agulha atravs da pele permite que cido

actico seja injetado sempre na rea desejada, levando-se em considerao que a localizao da agulha deve estar sempre um pouco acima da virilha, para garantir a

insero correta da agulha na regional peritoneal.

A avaliao da resposta nociceptiva, imediatamente aps a injeo de cido actico, foi determinada computando-se o nmero de contores que o animal

apresentava, sendo as contores identificadas atravs dos movimentos de

encolhimento e de alongamento do animal na regio abdominal, seguido por

estiramento deu uma ou duas patas. Os clculos envolvendo a mdia ponderada de

cada grupo foram feitos com auxlio de programa de computador (Graph pad prism).

4.3. Teste da formalina

Neste teste foi realizada uma avaliao da resposta nociceptiva induzida

pelo formaldedo 0,92% nos camundongos. O formaldedo (20 L) foi injetado pela via subcutnea (sc) no dorso da pata direita posterior. O perodo no qual o animal lambe a pata injetada foi determinado entre 0 e 5 min (1 fase) e entre 15 e 30 min (2 fase) aps a injeo de formaldedo. Imediatamente aps o trmino desse experimento, os animais foram submetidos eutansia em cmara de

CO2.(BENSON,1999), (LE BARS,2001).

Figura 7. Camundongo TGM(rTon), aps experimento de contoro abdominal, j disponibilizado para ser submetido ao processo de eutansia.

5. Anlise dos dados

Os resultados foram apresentados como a mdia erro padro da mdia.

As comparaes estatsticas entre vrios grupos foram feitas por ANOVA one way

seguida de Newman-Keuls. Para comparaes entre dois grupos foi utilizado o teste

t de student. O nvel de significncia adotado foi de p < 0,05.

O processamento dos dados coletados e anlises estatsticas foram realizados

atravs do programa GRAPH PAD PRISM 4 for Windows.

IV. RESULTADOS

Um dos desafios da transgenia garantir que o animal que recebe genes de

outro animal que no de sua linhagem ir apresentar comportamento e reaes

diferenciadas dos outros de sua espcie. Entretanto, comportamentos e reaes

podem ser dos mais diversos e diferentes tipos, sendo necessrio que se teste cada

possibilidade antes de garantir a eficcia da transgenia no melhoramento gentico

das espcies. Desta forma, na presente pesquisa, o objetivo foi testar se a presena da tonina, protena existente no rato, altera ou no significativamente a resistncia a

dor.

Levando-se em considerao que os camundongos transgnicos

expressam tonina em nveis maiores que os do animal selvagem, foram realizados

testes de rota-rod, para determinar se estes animais apresentam comportamento

matricial diferenciado. Tambm foram feito testes de contoro abdominal para

identificar possveis modificaes nas respostas a dor nesses camundongos. E

finalmente foi realizado o teste de formalina para avaliar possveis modificaes nas

respostas nociceptivas em fase inflamatria.

1. Teste de rota-rod

O teste de rota-rod mede o tempo de permanncia na haste giratria a 32

RPM, ou seja, a capacidade motora dos camundongos. Inicialmente foram feitos testes de rota-rod com camundongos Swiss. Os camundongos Swiss so os

modelos mais freqentes para esse tipo de teste, portanto, so os animais que

serviram de parmetro controle para fins de validao do mtodo.

Ao considerar a mdia de permanncia, em minutos, os camundongos

com maior capacidade e coordenao motora foram os selvagens com uma mdia

de permanncia de 4,28 minutos. Os camundongos transgnicos apresentaram uma

mdia de permanncia de 4,12 minutos enquanto os camundongos Swiss

apresentaram uma mdia de permanncia de 3,23 minutos, como mostra a Figura 8.

Swiss Selvagem TGM (rTon)0

1

2

3

4

5

Tem

po de

pe

rman

nci

a

Figura 8. Tempo de permanncia, expresso em minutos, dos diferentes grupos, Swiss,

selvagem e transgnico no teste do rota-rod. *p < 0,05 vs TGM(rTon). As colunas representam a mdia epm (n = 6).

Observou-se uma reduo na capacidade motora dos camundongos

transgnicos quando comparados ao grupo selvagem.

2. Teste de contoro abdominal

O teste com os camundongos foi realizado em esquema monocego, ou seja,

o pesquisador no sabia de ante mo quais eram os animais selvagem e quais eram

TGM(rTon). Os animais foram marcados previamente por outra pessoa, que s revelou as identificaes aps o teste ter sido realizado. Nossos resultados mostram

que o TGM(rTon) apresentou tendncia de maior sensibilidade embora esta diferena no seja estatisticamente significante (figura 9).

Selvagem TGM (rTon)0

10

20

30

Nm

ero

de

co

nto

re

s

Figura 9. Contores abdominais induzidas por cido actico em camundongos selvagens e

TGM(rTon) em perodo de 20 minutos.A contagem feita em 4 tempos de 5 minutos consecutivos e em sistema monocego. As colunas representam a mdia epm Mann

Whitney test (n = 6).

3. Teste de formalina

Nesse teste foi observado o comportamento de lambida nas duas fases que

so desenvolvidas, sendo que na primeira fase temos a resposta nociceptiva, ligada

aos efeitos em cascata que so desencadeados por ao da formalina, que provoca

mobilizao e edema de pata. J na segunda fase tem-se como resposta uma

somatria de processo inflamatrio e nocicepo (Figura 10).

Figura 10. Teste de formalina. Nmero de lambidas induzidas pela injeo de formalina em camundongos selvagens (S) e transgnicos (T). A primeira fase corresponde ao tempo de 0 - 5 minutos aps a injeao e a segunda fase 15 - 30 minutos. *p < 0,05. As colunas representam a mdia epm (n = 6).

S T S T0

50

100

150

200

250

1 fase 2 fase

n de

la

mbi

das

V. DISCUSSO

Antes de analizar os resultados obtidos devemos considerar que segundo

Guasti et al. (1997), pacientes hipertensos so menos sensveis estmulos

nociceptivos, independente do mtodo de aplicao do estmulo. Neste mesmo

trabalho apresentado um dado interessante, que diz que com a administrao

de anti-hipertensivos a pacientes, quer sejam humanos ou animais, os nveis

de sensibilidade dor foram restabelecidos, o que sugere que a angiotensina II

participa no processo de nocicepo.

Estes dados no fornecem evidencia direta da participao da

angiotensina II, que seriam obtidas utilizando-se antagonistas especficos de

receptores. Existe a possibilidade de que alteraes na sensibilidade em

individuo hipertenso seja desencadeado pelos pressoreceptores mais do que

pela interao angiotensina II-receptor. Considerando que tonina uma enzima

capaz de liberar angiotensina II, ela tambm pode estar envolvida neste

processo.

O TGM(rTon) apresenta ligeiro aumento nos nveis pressricos quando

comparado com o seu controle, o WT, no entanto nenhuma diferena entre os

dois grupos foi observada nos nveis de angiotensina II tanto as nvel

plasmtico como em diversos tecidos de importncia cardiovascular. Desta

forma, conclumos que o aumento nos nveis pressricos observados para o

TGM(rTon) deve se dar por algum mecanismo que no envolve a angiotensina

II.

Analisando os dados do teste de rota-rod observamos que, os

camundongos selvagens apresentaram resposta motricial superior. Certamente

esta diferena no est relacionada aos nveis de angiotensina II. Outros

possveis mecanismos precisam ser pesquisados. J no teste de contoro

abdominal, nenhuma diferena significativa foi observada entre o TGM(rTon) e

seu controle, o WT. Entretanto, os resultados mostram uma tendncia de os

animais transgnicos serem mais susceptveis a dor. Acreditamos que com um

numero maior de animais poderemos demonstrar definitivamente esta

diferena entre o TGM(rTon) e o WT.

A injeo intraperitoneal de cido actico provoca reao de

nocicepo e inflamao simultaneamente. Considerando que tonina pode

hidrolisar beta-lipotropina e liberar peptdeos com ao opiide (Seidah et al.,

1979), seria de se esperar que o TGM(rTon) apresentasse menor sensibilidade

a dor. Pelo fato de o teste de contoro ao cido actico avaliar aspectos

nociceptivos e inflamatrios, torna-se um modelo menos preciso, porm mais

sensvel e com respostas mais claras. No nosso caso, alm de se fazer

necessrio aumentar o numero de animais neste modelo de estudo, faz-se

necessrio um segundo modelo a fim de confirmar os resultados obtidos.

O teste da formalina serve de salvaguarda para cobrir pelo menos

dois aspectos de nocicepo, sendo que na primeira fase a resposta est

ligada cascata nociceptiva, e na segunda fase ao processo nociceptivo e

inflamatrio. Os dados obtidos mostram que na primeira fase do teste no

houve diferena entre os dois grupos. Por outro lado, os dados referentes

segunda fase do teste mostram que os animais transgnicos mostraram ser

mais sensveis dor, concordando com a tendncia apontada pelos dados

obtidos com o cido actico.

O processo inflamatrio resulta na liberao de vrios mediadores,

alguns deles podendo ativar ou sensibilizar nociceptores locais das fibras

aferentes. Como j comentamos, a possvel liberao de opiides pela tonina

poderia levar a uma reduo da sensibilidade a dor. No temos no momento

uma explicao para o fato. Ao momento em que aumenta a circulao

perifrica, opiides endgenos tem sua atividade reduzida a nveis subclnicos,

no sendo suficientes para reduzir a resposta nociceptiva e consequentemente

de dor (LEVINE et al., 1993; DRAY, 1994; BESSON e DICKENSON, 1997;

BARROS et al., 2004; COUTAUX et al., 2005).

No temos ainda informaes a respeito do mecanismo pelo qual

tonina est interferindo na fisiologia do animal, por qual mecanismo estaria

envolvida, no s no aumento da presso sistmica, mas tambm na

sensibilidade a dor do animal. Certamente, estes dados abrem novas

possibilidades de estudos com esta enzima, para a qual inicialmente foi

atribudo como principal papel o de liberar angiotensina II.

VI. CONCLUSES

1. A introduo de transgene no camundongo levou a reduo da capacidade

motora do animal, conforme observado pelo teste de rota-rod indicando uma

possvel presena dos opiides endgenos;

2. A introduo de transgene no camundongo, diferentemente do esperado,

parece aumentar a sensibilidade do animal dor, conforme observado pelo

teste de contoro abdominal induzida pelo cido actico. Este dado dever

ser confirmado em experimento envolvendo nmero maior de animais, uma

vez que a diferena na sensibilidade no foi diferente estatisticamente;

3. Tonina pode estar envolvida no processo de nocicepo, uma vez que, no

teste da formalina, os animais mostraram diferena significativa na

sensibilidade dor, sendo esta sensibilidade aumentada na segunda fase do

processo, que envolve dor e inflamao, desta maneira sendo necessrios

maiores estudos sobre o tema, utilizando uma diversidade maior de modelos

e uma anlise com grupos maiores.

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ANEXO 1 TABELAS

Analise estatstica das contores abdominais em c. Actico

( Graph Pad Prism)

Anlise estatstica no teste de formalina ( Graph Pad Prism)