Trabalho de Concluso de Curso Carlos Alexandre Breyer 2009

UNIVERSIDADE DO OESTE DE SANTA CATARINA

ÁREA DE CIÊNCIAS EXATAS E DA TERRA

CURSO DE BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL

CARLOS ALEXANDRE BREYER

UTILIZAÇÃO DE TÉC�ICAS MOLECULARES PARA CARACTERIZAÇÃO DE

SOROTIPOS DE SALMO�ELLA ORIGI�ÁRIOS DE ABATEDOUROS E DA

CADEIA PRODUTIVA DE AVES DA REGIÃO DE VIDEIRA/SC

Videira - SC 2009

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CARLOS ALEXANDRE BREYER




Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao curso de Biotecnologia Industrial da Universidade do Oeste de Santa Catarina como requisito parcial à obtenção do grau de Bacharel em Biotecnologia Industrial

Orientador: Prof. Dr. César Milton Baratto

Videira – SC

2009

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BREYER, CARLOS ALEXANDRE




Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao curso de Biotecnologia Industrial da Universidade do Oeste de Santa Catarina como requisito parcial à obtenção do grau de Bacharel em Biotecnologia Industrial

Aprovado em: _____/_____/_____

BANCA EXAMINADORA

____________________________________ Prof. Dr. César Milton Baratto (Orientador) Universidade do Oeste de Santa Catarina

Nota atribuída .......

________________________________________ Prof. Dra. Jane Mary Lafayette Neves Gelinski

Universidade do Oeste de Santa Catarina Nota atribuída ...

____________________________ Prof. Dr. Marco Antônio Balbó

Universidade do Oeste de Santa Catarina

Nota atribuída

Profº. Msc. Rodrigo G. Nogueira. (Coordenador do Curso de Biotecnologia Industrial)

3

“A todos que estiveram presentes

durante esses anos de graduação”.

4

AGRADECIME�TOS

Agradeço primeiramente a Deus, por ter iluminado meu caminho durante, esses anos

de graduação;

A minha família pelo apoio financeiro e pela força nos momentos difíceis;

Ao Dr. Márcio Voss, por ter acreditado em mim, e possibilitado meu primeiro estágio

na Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (Embrapa);

Aos pesquisadores da Embrapa que me orientaram em meus estágios Dr. Ana Cristina

Sagebin Albuquerque (Embrapa Trigo, Passo Fundo/RS), Dr. Andréa Penãloza (Embrapa –

Centro Nacional de Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília/DF), Dr. João Batista

Ribeiro (Embrapa Suínos e Aves, Concórdia/SC);

Ao professor Dr. Marcelo Fossa da Paz, por ter me orientado em trabalhos de iniciação

cientifica, nos projetos de cultivo e análise bromatólogica de cogumelos;

Ao professor Dr. Marcos Dalbó, por ter me dado a oportunidade de realizar estágio na

Epagri;

Ao professor Dr. César Milton Baratto pela orientação e amizade durante realização

deste trabalho;

Aos técnicos de laboratório Clairton, Isabel, Denise, Fernanda e Rosane, que foram

fundamentais para realização destes trabalhos durante esses anos de estágio na Unoesc;

Ao professor da Universidade Estadual Paulista, Dr. Marcos Antonio de Oliveira, por

ter doado a enzima Taq polimerase utilizada neste trabalho;

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“Bom mesmo é ir à luta com determinação abraçar a vida e viver com paixão

perder com classe e vencer com ousadia porque o MUNDO pertence a que se atreve e

A VIDA É MUITO para ser insignificante”

Charles Chaplin

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RESUMO

Salmonella é um micro-organismo amplamente difundido na natureza, é encontrado no solo,

águas residuais, equipamentos, seu habitat natural é o trato intestinal do ser humano e

animais. Este trabalho objetivou-se na caracterização molecular de diferentes sorotipos de

Salmonella. Os microorganismos analisadas pertencem ao banco de cepas da UNOESC e são

originários de abatedouros de aves e suínos e da cadeia produtiva de aves da região de

Videira/SC. Para a caracterização molecular foram utilizadas as técnicas de PCR-RFLP

(ARDRA), baseadas nos polimorfimos da região do rDNA 16S e da região intergênica entre o

rDNA 16S e rDNA 23S , também foram testados os iniciadores de RAPD : H15, H16, H17,

H18, H19 e H20. Dentre as técnicas utilizadas a baseada no polimorfismo da região

intergênica entre o rDNA 16S e rDNA 23S apresentou um resultado mais relevante

mostrando-se mais discriminatória se comparada a outras técnicas. Dos iniciadores de RAPD,

apenas H15, H17 e H18 apresentaram-se promissores para caracterização e diferenciação de

Salmonella.

Palavras-chave: Salmonella. Técnicas Moleculares. Caracterização.

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ABSTRACT

Salmonella is thoroughly a microorganism diffused in the nature, it is found in the soil,

residual waters, equipments, its natural habitat is the human being intestinal treatment and

you encourage. This work was objectified in the molecular characterization of different

serotypes of Salmonella. The analyzed microorganisms belong to the bank of stumps of

UNOESC and they are original of frigorific of birds and pigs and of the productive chain of

birds of the area of Videira/SC. For the molecular characterization the techniques of PCR-

RFLP were used (ARDRA), based on the polymorphism of the area of the rDNA 16S and of

the area intergenic between the rDNA 16S and rDNA 23S, the initiators of RAPD were also

tested: H15, H16, H17, H18, H19 and H20. Among the used techniques the set in the

polimorfismo of the area intergenic between the rDNA 16S and rDNA 23S presented a more

important result being shown more discriminatory if compared the other techniques. Of the

initiators of RAPD, just H15, H17 and H18 came promising for characterization and

differentiation of Salmonella.

Keywords: Salmonella. Molecular. Techniques. Characterization.

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LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1: Funcionalidade da PCR - ciclos de uma reação ................................................... 22

Figura 2: Regiões do rD�A amplificadas. ......................................................................... 28

Fotografia 1: Fotografia - Extração de D�A Genômico. ....................................................... 31

Fotografia 2: Amplificação da região rD�A16S ..................................................................... 32

Fotografia 3: Reação de PCR-RFLP região 16S Enzima Alu1.............................................. 33

Fotografia 4: Reação de PCR-RFLP região 16S rD�A Enzima Hinf I................................... 34

Fotografia 5: Amplificação da região intergênica 16S-23S. .................................................... 35

Fotografia 6: Reação de PCR-RFLP região 16S-23S D�A enzima Alu I ........................... 36

Fotografia 7: Reação de PCR-RFLP região 16S-23S D�A enzima Hinf I............................. 37

Fotografia 8: PCR – RAPD Iniciador H15 .......................................................................... 38

Fotografia 9: PCR – RAPD Iniciador H17 ............................................................................. 39

Fotografia 10: PCR – RAPD Iniciador H18 ............................................................................. 30

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LISTA DE QUADROS

Quadro 1: Espécies de Salmonella, subsespécies. ....................................................... 16

Quadro2: Principais vantagens e desvantagens de métodos de detecção de Salmonella ... 19

Quadro 3: Componentes das reações de amplificação de D�A por PCR-RFLP. Indicação dos componentes e quantidades utilizadas na reação ..........................................

29

Quadro 4: Componentes das reações de amplificação de D�A por PCR-RAPD. Indicação dos componentes e quantidades utilizadas na reação ..........................................

29

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SUMÁRIO

1I�TRODUÇÃO ............................................................................................................. 12

1.1 OBJETIVOS ............................................................................................................... 13

1.1.1 Objetivo geral ........................................................................................................ 13

1.1.2 Objetivos específicos .............................................................................................. 13

2 REVISÃO ..................................................................................................................... 15

2.1 O GÊNERO SALMO�ELLA..................................................................................... 15

2.1.1 Taxonomia do gênero Salmonella ......................................................................... 16

2.1.2 Identificação de sorotipos ..................................................................................... 17

2.2 INFECÇOES CAUSADAS POR SALMO�ELLA................................................... 17

2.3 DIAGNÓSTICO ........................................................................................................ 19

2.3.1 Diagnósticos baseados em PCR (Polimerase Chain Reaction) ......................... 21

2.3.1.1 PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms) …………………. 23

2.3.1.2 PCR – RAPD (amplificação ao acaso de DNA polimórfico) .............................. 24

3 METODOLOGIA ....................................................................................................... 26

3.1 ISOLADOS BACTERIANOS ................................................................................... 26

3.2 CONDIÇÕES DE CULTIVO E MEIOS DE CULTURA PARA SALMO�ELLA .... 26

3.3 EXTRAÇÃO DE DNA BACTERIANO .................................................................... 26

3.4 INICIADORES DE PCR PARA A AMPLIFICAÇÃO DO rDNA 16S E INTERGÊNICA ENTRE OS RDNAS 16S e 23S ..........................................................

27

3.5 INICIADORES E PCR-RAPD .................................................................................. 29

3.6 CLIVAGEM DOS PRODUTOS DE AMPLIFICAÇÃO DE DNA BACTERIANO 29

3.6.1 Eletroforese em Gel de Agarose ........................................................................... 29

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................ 31

4.1 CARACTERIZAÇÃO DE SALMO�ELLA BASEADA NA TÉCNICA DE PCR-RFLP .................................................................................................................................

33

4.2 CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE SOROTIPOS DE SALMO�ELLA ATRAVÉS DA TÉCNICA DE PCR-RAPD ..................................................................

38

5 CO�CLUSÕES ........................................................................................................... 40

REFERÊ�CIAS ............................................................................................................ 41

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LISTA DE ABREVIATURAS

ARDRA Análise da Restrição do DNA Ribossomal Amplificado

BHI Infusão Cérebro e Coração

CDC Center for Disease Control

D�A Ácido Desoxirribonucleico

EDTA Ácido Etilenodiaminotetracético

ERIC Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus (Seqüências de consenso

repetitivas intergênicas de enterobactérias)

FRLP Restriction Fragment Length Polymorphisms (Polimorfismo por Cumprimento

de Fragmentos de Restrição)

LB Luria Betrani

OMS Organização Mundial de Saúde

PCR Polimerase Chain Reaction (Reação em cadeia da Polimerase)

RAPD Random Amplified Polymorphic DNA (Polimorfismo da Amplificação do DNA

ao Acaso)

R�A Ácido Ribonucléico

SDS Dodecil Sulfato de Sódio

TE Tris EDTA

UFC Unidade Formadora de Colônias

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1I�TRODUÇÃO

O Meio Oeste do Estado de Santa Catarina tem sua econômica basicamente voltada

para agroindústria, uma forte aptidão para o setor primário de produção de alimentos e na sua

industrialização. Entre os tipos alimentícios que se destacam estão os produtos cárneos, onde

todas as etapas da produção são alvos de possíveis fontes de contaminação, dentre os quais e

com maior importância, está o microrganismo identificado como Salmonella, que se apresenta

como um dos principais entraves para a boa qualidade dos alimentos, sendo portanto, um fator

de risco econômico-social e de saúde pública. Sua transmissão aos humanos ocorre através da

ingestão de água ou alimentos de origem animal, crus ou mal cozidos, como carne de frango e

ovos contaminados. As bactérias entéricas classificadas como Salmonella tem sido isoladas

em todos os setores de abatedouro de aves e suínos incluindo os manipuladores, carcaças,

equipamentos e ambiente. Este patógeno constitui-se em um dos principais microrganismos

associados às enfermidades causadas por alimentos contaminados durante o processamento da

matéria prima, potencializados pelas más condições de higienização do ambiente relacionado

(SILVA, 2002).

Diversos estudos têm priorizado a análise de sorotipos específicos de Salmonella

isolados de fontes variadas. Particularmente os sorototipos Salmonella enterica subsp.

enterica Enteritidis e S. enterica Typhimurium, uma vez que estes se constituem nos

principais patógenos associados a infecções humanas. Neste sentido, o conhecimento da

diversidade fenotípica e genotípica de sorotipos de Salmonella de ocorrência em ambientes

específicos pode se constituir em dados essenciais em estudos epidemiológicos e de

rastreabilidade da origem dos patógenos, de tal forma, que se possa determinar a trajetória de

contaminação em etapas da industrialização ou preparo da matéria prima, além de propiciar a

diferenciação entre linhagens, fazer relações filogenéticas e diagnóstico precoce e rápido

(GROISMAN e cols.,, 1993; SILVA, 2002). Para tal, métodos moleculares baseados em

análise de amplificação e/ou restrição de ácido desoxiribonucléico (DNA) são utilizados para

discriminar as linhagens envolvidas em infecções humanas com melhor precisão que os

métodos fenotípicos (QUINTAES, e cols., 2002; FARBER, 1996). Visto que, para a

sorotipagem fenotípica da Salmonella, fazem-se necessários vários testes metabólicos e

biológicos de triagem para a posterior definição de sua estrutura antigênica. Embora esses

métodos sejam valiosos para a caracterização de isolados eles apresentam alguns problemas

como o custo e o tempo (FARBER, 1996; BOPP, e cols., 1999).

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Com a disseminação dos métodos para análise de DNA, técnicas genotípicas têm sido

aplicadas à tipagem ou subtipagem de isolados bacterianos (ARBEIT, 1999; TOZETTO,

2006). Esses métodos moleculares apresentam muitas vantagens sobre as técnicas

convencionais. Uma das mais importantes é que como o DNA sempre pode ser extraído das

bactérias, todas são tipáveis pelo método; outra é que o poder discriminatório dos métodos

baseados em análise de DNA é maior que o dos procedimentos fenotípicos (FARBER, 1996).

Entretanto nenhuma abordagem molecular combina reprodutibilidade e poder discriminatório

com rapidez e simplicidade, principalmente sem um estudo básico e extenuante para a

otimização dos processos (FARBER, 1996; ARBEIT, 1999).

O estudo parte da necessidade de saber a real dimensão da diversidade e distribuição

dos sorotipos de Salmonella predominantes no ambiente de abatedouros de suínos e aves,

permitindo contribuir para estudos epidemiológicos e genéticos deste patógeno, o principal

causador de toxinfecções alimentares.

1.1 OBJETIVOS

1.1.1 Objetivo geral

Utilizar técnicas moleculares de PCR-RFLP e PCR-RAPD para análise dos sorotipos

de Salmonella mais encontrados em alimentos, especialmente oriundo da cadeia produtiva de

aves de corte e abatedouros de suínos, a partir de padrões obtidos para diferenciação

genotípica entre os sorotipos.

1.1.2 Objetivos específicos

• Utilizar técnicas moleculares baseadas na amplificação e clivagem da região do rDNA 16S

e da região intergênica (ITS) entre os genes rDNAs 16S e 23S para identificação dos

diferentes sorotipos de Salmonella;

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• Identificar novos iniciadores para a técnica de PCR-RAPD úteis para diferenciação de

sorotipos;

• Utilizar a técnica de PCR-RAPD para identificação de padrões moleculares dos sorotipos

analisados;

• Analisar o polimorfismo genético de sorotipos de Salmonellas a partir dos padrões de

fragmentos específicos obtidos pelas técnicas moleculares.

2 REVISÃO

Nos últimos anos houve o envolvimento da indústria e dos governos na produção de

alimentos de origem animal, garantindo sua qualidade e segurança para consumo humano. A

qualidade e segurança dos alimentos tornaram-se essenciais aos processos de produção para

diminuir as fortes reações negativas dos consumidores e de organizações nas crises recentes

do setor de alimentos de origem animal. Programas que visam à segurança alimentar vêm

proporcionando um controle efetivo em toda a cadeia produtiva, desde a produção primária

até o consumo do alimento in natura ou processado. Sendo que estes programas têm como

objetivo aumentar a segurança e qualidade dos alimentos produzidos, levando a um

crescimento nas exportações, através da preparação do setor produtivo brasileiro para atender

às exigências dos exportadores (CARDOSO; TESSARI, 2008).

As toxinfecções são um grave problema enfrentado pela indústria de alimentos, dentre

estas, as causadas por Salmonella é considerada uma das mais freqüentes. Segundo Cardoso e

Tessari (2008) a salmonelose é um desafio para a saúde publica, no Brasil e no mundo, pois a

partir da década de 70 tem ocorrido um aumento acentuado e continuo no número de casos

vinculados a determinados sorotipos, os quais variam geograficamente.

São vários os relatos da presença de salmonelose veiculada a ovos e carne de aves, em

países como Brasil, Estados Unidos e países europeus. Levantamentos têm mostrado que

cerca de 30 a 50% das carcaças de frango congeladas ou resfriadas estão contaminadas por

Salmonella. No Brasil a relatos de carcaças de frango com contaminações variando entre 9,15

e 86,7% (CARDOSO; TESSARI, 2008).

2.1 O GÊNERO SALMONELLA

Bactérias do gênero Salmonella, pertencem à família das Enterobacteriacea, foram

primeiramente descritas por Eberth em 1880 e cultivadas por Gaffkey em 1884. São

Bastonetes Gram-negativos, não formadores de esporos, anaeróbios facultativos, fermentam

glicose e reduzem nitratos a nitritos, sua temperatura ótima de crescimento é entre 35-37oC e

pH 6,5-7,5 (PELCZAR e cols., 1996).

Atualmente são descritos mais de 2500 sorotipos de Salmonella (CDC,2006). A

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Salmonella é classificada em espécies sendo que a classificação antigênica determina os

diferentes sorovares. A classificação antigênica dos sorotipos de Salmonella é definida e

mantida pela Organização Mundial de Saúde (OMS), em colaboração com o Centro de

Referência e Pesquisa em Salmonella, localizado junto ao instituto Pasteur, em Paris na

França. Anualmente a lista de sorotipos é atualizada e publicada (BREMMER e cols., 2000).

A nomenclatura da Salmonella é considerada complexa e cientistas usam diferentes

sistemas para se referir e classificar este gênero. Porém é necessária uma uniformidade da

nomenclatura para uma melhor comunicação entre cientistas, funcionários de saúde e o

público (BREMMER e cols., 2000).

2.1.1 Taxonomia do gênero Salmonella

De acordo com o sistema da CDC (Center of Disease Control na Prevention) o gênero

Salmonella contém duas espécies, S. enterica e S. bongori. A espécie S. enterica é

subdividida em seis subespécies que são designadas por nomes ou números romanos (quadro

1). A designação taxomica por nomes é considerada a mais correta, mas a com números

romanos é mais simples e mais comumente utilizadas para a designação dos sorotipos.

Salmonella bongori, foi originalmente designada como S. enterica subespécie enterica V, mas

posteriormente passou a ser considerada uma espécie separada. Porém, para simplicidade e

conveniência, a espécie Salmonella bongori, às vezes é ainda e designada “subespécie V”

com finalidade de designação de sorotipo (BREMMER e cols., 2000; CDC, 2006).

Quadro 1: Espécies de Salmonella, subsespécies. Salmonella enterica subspecies

I Salmonella enterica subsp. enterica

II Salmonella enterica subsp. salamae

IIIa Salmonella enterica subsp. arizonae

IIIb Salmonella enterica subsp. diarizonae

IV Salmonella enterica subsp. houtenae

VI Salmonella enterica subsp. indica Fonte: CDC, 2006

Assim, a nomenclatura do sorotipo Enteritidis é descrita como, Salmonella enterica

subspécie enterica sorovar Enteritidis, sendo abreviada como Salmonella Enteritidis

(BREMMER e cols., 2000).

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2.1.2 Identificação de sorotipos

Os sorotipos de Salmonella são identificados por uma variedade de testes.

Primeiramente um isolado é identificado e a subespécie é determinada, na maioria das vezes

através de testes bioquímicos. A classificação em diferentes sorovares é realizada através da

determinação dos antígenos somáticos ou de parede celular (O), flagelares (H) e o antígeno de

virulência (Vi). Os antígenos O e H são identificados através de ensaios de aglutinação

independentes que utilizam antisoros, que reagem com um grupo de antígenos relacionados

ou com um único antígeno. Em culturas mais velhas ou isolados antigos podem ser detectados

mais o antígeno H. Quando apenas o antígeno H é detectado, o isolado é inoculado em meio

que contém antisoro para o antígeno H, que já foi identificado. Os organismos que expressam

o antígeno H, previamente descoberto são imobilizados pelo antisoro e crescem perto do

ponto de inoculação. Já os organismos que expressam o segundo antígeno de H podem se

mover para longe do ponto de inoculação (BREMMER, 2000; CDC, 2006).

2.2 INFECÇOES CAUSADAS POR SALMONELLA

Atualmente a Salmonelose é considerada uma das principais zoonoses para a saúde

pública em todo o mundo, principalmente pela dificuldade de adoção de medidas de controle.

O controle da ocorrência de infecções causadas por Salmonella não e considerado apenas um

problema de saúde pública, mas também um problema econômico. Nos últimos anos os

Estados Unidos obtiveram um gasto estimado entre 1,3 e 4 bilhões de dólares em decorrência

de despesas médicas, faltas no trabalho e quebras de produtividade. O Brasil vem atribuindo

inúmeras medidas de controle sanitário, por ser um dos maiores produtores mundiais de carne

de aves e bovinos, evitando assim grandes perdas econômicas (SHINOHARA, e cols., 2008).

O microrganismo Salmonella está amplamente difundido na natureza, podendo estar

presente no solo, no ar, nas águas residuais, nos equipamentos, mas seu habitat natural é o

trato intestinal dos seres humanos e animais. Este patógeno está envolvido em diversos casos

de surtos e contaminações de origem alimentar em diversos países.

As bactérias do gênero Salmonella estão entre as principais causadoras de

enfermidades em humanos vinculadas a alimentos. A sua transmissão ocorre através da

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ingestão de carnes mal cozidas, leite, ovos e outros alimentos que sofreram contaminação

cruzada. Os produtos de origem animal são os principais responsáveis pelas ocorrências de

salmoneloses em todo o mundo (CONCEIÇÃO e cols., 2007).

A salmonelose é uma infecção autolimitante, que na maioria das vezes não exige

tratamento. Mas infecções invasivas ocorrem entre 5 e 10% dos casos podendo resultar em

septicemia e meningite, principalmente entre crianças, idosos e pacientes com sistema imune

comprometido (CONCEIÇÃO e cols., 2007).

A patogenia das infecções causadas por Salmonella é considerada complexa, sendo o

primeiro passo no processo da doença, a transmissão da bactéria para um hospedeiro

susceptível. Para haver uma infecção são necessários 105 a 1010 UFC, variando conforme a

cepa e o estado do hospedeiro. Essa quantidade de inoculo é necessária para que os micro-

organismos possam superar a barreira da acidez do estômago e também competir com a

microbiota intestinal. Mas essa dose pode ser reduzida quando a bactéria é ingerida com

alimentos que atravessam rapidamente o estomago, ou também com líquido ou alimentos que

neutralizam a acidez do estômago (DARWIN; MILLER, 1999 apud ZUNCAN, 2008 p.23).

Em países em desenvolvimento, como é o caso do Brasil, as doenças como a diarréia

assumem maior importância devido a fatores como o consumo de água não tratada, falta de

saneamento básico, desnutrição e falta de diagnóstico, o sistema de notificação de doenças

transmitidas por alimentos é precária e os números de infecções por Salmonella são

desconhecidos. Cerca de apenas 10% dos casos de infecções causada por alimentos são

notificados no Brasil, devido principalmente a falta de fiscalização das autoridades

(SHINOHARA e cols., 2008).

A maioria dos sorotipos de Salmonella apresenta-se patogênicos para o homem, sendo

que seus sintomas clínicos podem ser divididos em: febre tifóide, febre entérica e infecções

entéricas causadas por outros tipos de Salmonella (SHINOHARA e cols., 2008).

A febre tifóide só ocorre no ser humano e é causada pela S. Thyphi. Sua forma de

contaminação ocorre de forma interpessoal através da ingestão de alimentos contaminados por

fases humanas. Os indivíduos podem desenvolver a doença ou se tornar portador por meses

ou até mesmo anos. Apresenta sintomas graves, como febre alta, diarréia e vômitos. O

período de incubação dura normalmente de 7 a 21 dias e doença pode durar ate oito semanas.

Em alguns casos a febre tifóide pode levar a morte, sendo caracterizada por septicemia, febre

contínua, cefaléia e diarréia (SHINOHARA e cols., 2008).

Quando o agente etiológico é a Salmonella Paratyphi A, B, e C, ocorre a febre

entérica. Seus sintomas são mais leves, se comparados febre tifóide, podendo ocorrer

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septicemia, gastroenterite, febre e vomito. Os principais meios de contaminação são o

consumo água ou alimentos como ovos, mariscos, leite e vegetais contaminados. Seu período

de incubação é de 6 a 48 horas e a duração da doença é em média de três semanas

(SHINOHARA e cols., 2008).

Infecções entéricas causadas por outros tipos de salmonelas são também conhecidas

como salmoneloses. Causam infecção gastro intestinal, ocasionando dores abdominais,

diarréia, vômito e febre baixa, sendo raros casos de morte ocasionados por esse tipo infecção.

Alimentos como carne bovina, aves, suínos e ovos crus são os principais meios de

contaminação (SHINOHARA e cols., 2008).

2.3 DIAGNÓSTICO

Vários são os métodos utilizados para detecção de Salmonella, normalmente são

utilizados testes bioquímicos, cultura fecal, sorologia por ELISA e técnicas baseadas em PCR

(Reação da Polimerase em Cadeia). A quadro 2 aponta as principais vantagem e desvantagens

de cada método (SMITH e cols., 2002).

Quadro2: Principais vantagens e desvantagens de métodos de detecção de Salmonella.

Teste Vantagens Desvantagens

Cultura fecal Baixo custo Não permite estimativa da prevalência na população, resultado demorado, flutuação da população bacteriana

ELISA Precisão Alto custo PCR Precisão, resultado rápido,

permite identificação de sorotipos Alto custo

Fonte: Explorando Questões Globais em Medicina Veterinária - Brasil.

Para a sorotipagem fenotípica da Salmonella, fazem-se necessários vários testes

bioquímicos para a definição de sua estrutura antigênica. Embora esses métodos sejam

valiosos para a caracterização de isolados, eles apresentam vários problemas como o uso de

um conjunto adequado de reagentes e procedimentos para cada organismo. A sorotipagem e a

fagotipagem requerem reagentes especializados como antisoros, fagos e estirpes bacterianas

para propagar os fagos, disponíveis somente em laboratórios de referência, além do sistema

não estar apto a todas as espécies, pois alguns isolados não podem ser tipáveis. Outro fator

20

determinante está na difícil e complexa classificação deste grupo de micro-organismo, que

também dificulta a padronização inclusive de sua nomenclatura (FARBER 1996; BOPP, e

cols., 1999).

A identificação e subtipagem dos micro-organismos são importantes ferramentas

laboratóriais, podendo auxiliar na identificação de fontes de contaminação, no controle de

surtos e levar a uma redução nas taxas de transmissão. Técnicas moleculares estão sendo cada

vês mais utilizadas na caracterização e identificação de sorotipos de micro-organismos,

apresentando algumas vantagens sobre técnicas convencionais, como precisão e rapidez nos

resultados.

O micro-organismo Salmonella é amplamente difundido na natureza, e pode ser

encontrado numa variedade muito grande de hospedeiros. No estudo realizado por Zuncan

(2008) foram isolados sorotipos de Salmonella de carcaças de suínos, provenientes de

diferentes frigoríficos, onde prevaleceu a ocorrência dos sorotipos S. Typhimurium,

S.Enteritidis . Em estudo realizado por Weiss e cols., (2002) foram isolados sorotipos de

Salmonella de 25 suínos através de amostras de fezes, e foram identificados os sorotipos

S.Agona, S. Bredeney, S. Derbi, S. Panama e Salmonella sp. Rocha e cols., (2003) estudaram

a ocorrência de Salmonella em pintos de corte de um dia e 55,6% dos lotes analisados

apresentaram contaminação, sendo isolados os sorotipos S.Enteritidis e S. Heidelberg. Já um

estudo realizado por Tiollie e Costa, 2005, onde foram avaliados carcaças de frango vendidas

em feiras livres da cidade de Manus/AM apontou uma contaminação de 50% das amostras

analisadas, sendo que o sorótipo S. Panama obteve uma ocorrência maior, estando presente

em 22,4% das amostras.

Os dados apresentados acima demostram a real dimensão da ocorrência de

contaminação por Salmonella em todas as etapas da cadeia produtiva de carnes e produtos

derivados. Neste contexto este trabalho procurou desenvolver metodologias simples, baratas e

precisas para caracterização e diferenciação de sorotipos de Salmonella, isoladas da região de

Videira/SC, sendo que os sorotipos utilizados neste estudo são os mais frequentemente

isolados nos diferentes estágios da cadeia produtiva.

Santos e cols., (2001) demostraram com sucesso a utilização da reação de PCR para a

detecção de Salmonella atravês da amplificação do gene invA, que é responsável pela

penetração deste micro-organismo no hospedeiro, mas por outro lado a amplificação deste

gene, detecta a presença de Salmonella, mas não consegue distinguir um sorotipo de outro.

Um ponto central para realização deste trabalho veio da necessidade do desenvolvimento de

técnicas mais eficientes e de alta reprodutibilidade, que possibiltam a discriminação de

21

sorotipos de Salmonella de maneira rápida e precisa. Neste contexto as técnicas baseadas na

amplificação e clivagem do 16S rDNA e região intergênica 16S-23S rDNA apresentaram

grande poder discriminatório, o que faz com que estas metodologias tenham um futuro

promissor.

2.3.1 Diagnósticos baseados em PCR (Polimerase Chain Reaction)

A reação em cadeia da polimerase foi desenvolvida por Kary Mullis em meados da

década de 80 (MULLIS e FALOONA, 1987). Essa técnica desde sua criação causou uma

grande revolução na biologia, tanto na pesquisa, para o entendimento dos processos

biológicos fundamentais, como nas áreas de diagnósticos, e melhoramento genético vegetal e

animal. A importância da técnica desenvolvida por Mullis concedeu-lhe o prêmio Nobel de

medicina no inicio dos anos 90.

PCR é uma técnica que envolve a síntese in vitro de milhões de cópias de um

segmento específico de DNA, na presença da enzima DNA polimerase (Figura1). A reação se

baseia no anelamento e extensão enzimática de um par de oligonucleotídeos (pequenas

moléculas de DNA de fita simples) utilizadas como iniciadores (primers), que delimitam a

seqüência de DNA de fita dupla alvo da amplificação. Esses iniciadores são sintetizados

artificialmente, de maneira que suas seqüências sejam complementares as seqüências que se

deseja amplificar (MULLIS e FALOONA, 1987).

Uma reação de PCR é dividida em três etapas: desnaturação, anelamento e extensão. A

fita dupla de DNA é desnaturada por meio do aumento da temperatura para 92 a 95°C. Na

etapa de anelamento, a temperatura é diminuída para 35 a 60°C, dependendo essencialmente

do tamanho e seqüência do iniciador a ser utilizado, permitindo a hibridização DNA-DNA de

cada iniciador com a seqüência que se deseja amplificar. Na terceira etapa, a temperatura é

elevada para 72°C para que a enzima DNA polimerase realize a extensão da nova fita de

DNA a partir de uma fita molde. Esta extensão envolve a adição de nucleotídeos, utilizando

como molde a seqüência- alvo, de modo que uma cópia desta seqüência é feita no processo

(MULLIS e FALOONA, 1987).

Este ciclo é repetido dezenas de vezes, sendo que a quantidade de DNA dobra a cada

ciclo. A amplificação segue uma progressão geométrica, de maneira que no vigésimo ciclo, é

produzido mais de um milhão de cópias. Esta escala permite começarmos a reação com

quantidades mínimas de DNA e terminá

DNA específica (MULLIS e FALOONA,

Figura 1: Funcionalidade da PCR Fonte: O autor (2009).

No início da década de 80, nos experimentos iniciais da PCR, utilizava

DNA polimerase termo lábil extraída de

37°C. Esta era adicionada manualmente a cada ciclo de amplificação, uma vez que,

termo lábil, era destruída toda vez que a temperatura atingisse 95°C para ocorrer à

desnaturação da fita. No de 1988, Saiki

DNA polimerase) da bactéria

de polimerização é a 72°C, mantendo assim sua atividade a 95°C. Isso possibilitou a completa

automatização do processo de PCR, através da utilização de aparelhos chamados de

termocicladores (SAIKI e cols.,

A reação de PCR pode ser util

uma amostra clínica. Neste caso verifica

complementaridade entre os iniciadores e o DNA presente na amostra. Mas esse método de

análise pode ser de grande auxilio na id

empregada em vários métodos de genotipagem ou caracterização molecular (

2001).

Varias técnicas baseadas em PCR tem sido utilizadas para a detecção e caracterização

de microorganismos dentre e

altamente conservados, conhecido como rep

quantidades mínimas de DNA e terminá-la com grandes quantidades de uma seqüência de

MULLIS e FALOONA, 1987).

Funcionalidade da PCR - ciclos de uma reação.

No início da década de 80, nos experimentos iniciais da PCR, utilizava

DNA polimerase termo lábil extraída de E.coli, cuja temperatura ótima de polimerização é de

37°C. Esta era adicionada manualmente a cada ciclo de amplificação, uma vez que,


desnaturação da fita. No de 1988, Saiki e cols., (1988) isolaram uma DNA polimerase (Taq

polimerase) da bactéria Thermus aquaticus que vive em fontes térmicas, e

a 72°C, mantendo assim sua atividade a 95°C. Isso possibilitou a completa


e cols., 1988).

A reação de PCR pode ser utilizada na detecção direta da presença de um agente em

uma amostra clínica. Neste caso verifica-se a presença do agente através da


análise pode ser de grande auxilio na identificação do gênero Salmonella

empregada em vários métodos de genotipagem ou caracterização molecular (


de microorganismos dentre estas destacamos a amplificação de elementos de DNA repetitivo

altamente conservados, conhecido como rep-PCR. As principais seqüências repetitivas

22

andes quantidades de uma seqüência de

No início da década de 80, nos experimentos iniciais da PCR, utilizava-se a enzima

, cuja temperatura ótima de polimerização é de

37°C. Esta era adicionada manualmente a cada ciclo de amplificação, uma vez que, sendo


(1988) isolaram uma DNA polimerase (Taq

que vive em fontes térmicas, e a temperatura

a 72°C, mantendo assim sua atividade a 95°C. Isso possibilitou a completa


izada na detecção direta da presença de um agente em

se a presença do agente através da


Salmonella em isolados e é

empregada em vários métodos de genotipagem ou caracterização molecular (SANTOS e cols.,


stas destacamos a amplificação de elementos de DNA repetitivo

PCR. As principais seqüências repetitivas

23

incluem a seqüência REP (Repetitive Sequence Extragenic Palindromic) que possui de 35-

40pb, a seqüência ERIC (Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus) que possui de

124-127pb e a seqüência BOX com 154 pb (ALVES e cols., 2003).

Alcocer e cols., (2006) utilizaram a técnica de REP- PCR e ERIC-PCR para

diferenciação de sorotipos de Salmonella. Neste estudo a técnica de REP-PCR apresentou

resultados positivos, sendo possível diferenciar os sorotipos estudos, os quais apresentando

padrões diferentes de bandas, já a técnica de ERIC-PCR apresentou-se pouco discriminativa.

Dentre as técnicas que apresentam grande potencial para diferenciação e

caracterização de micro-organismo estão a PCR-RAPD e a PCR-RFLP, que foram utilizadas

neste estudo. A descrição destas técnicas e mostrada a seguir.

2.3.1.1 PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms)

Grande parte dos estudos das relações filogenéticas de bactérias é baseada na analise

dos genes ribossomais 16S, 5S e 23S. Dentre estes o 16S rDNA tem sido mais amplamente

utilizado para delinear as relações entre famílias, gêneros e espécies (SERAFINI e cols.,

2002). A análise comparativa das seqüências de nucleotídeos, de organismos próximos,

mostra que estas regiões do genoma são altamente conservadas em diferentes níveis

taxonômicos, mas possuem algumas regiões altamente variáveis, as quais podem ser

utilizadas para fazer uma diferenciação em nível especifico e infra-específico (SERAFINI e

cols., 2002).

A utilização do gene 16S tem adquirido grande importância na taxonomia bacteriana,

aumentando consideravelmente o número de espécies. Assim propõem que a utilização da

análise da seqüência do 16S rDNA possam vir a substituir em parte a hibridização de DNA na

descrição de novas espécies bacteriana (SERAFINI e cols., 2002).

Além do gene 16S, a região espaçadora entre 16S e 23S vem se revelando promissora

para caracterização bacteriana, por apresentar uma variação significativa para esse tipo de

análise, esta região apresenta diferenças em sua seqüência e no seu tamanho (SERAFINI e

cols., 2002).

Para a análise das variabilidades destas seqüências são utilizadas técnicas baseadas em

PCR, como é o caso do RFLP, Nesta técnica essas regiões são amplificadas por PCR e o

produto da amplificação é digerido por enzimas de restrição (AMANN e cols., 1995).

24

Alguns trabalhos baseiam-se apenas amplificação, clonagem e seqüenciamento desta

região para a posterior comparação entre as seqüências para a obtenção dos resultados, o que,

entretanto, reflete na necessidade de uma estrutura adequada e no maior gasto com a obtenção

da seqüência do rDNA 16S de cada organismo. Por outro lado, apenas com a amplificação e

clivagem com endonucleases de restrição também é possível obter resultados reproduzíveis e

satisfatórios na sorotipagem e na caracterização dos isolados de maneira rápida e menos

dispendiosa (BORZANI e cols.,, 2001; SAMBROOK E RUSSEL, 2001)

Uma técnica que vem apresentando resultados satisfatórios para caracterização de

micro-organismos é a análise da restrição do DNA ribossomal amplificado (ARDRA). Junior

e cols., (2004) demonstraram com sucesso a utilização desta técnica na caracterização e

diferenciação a de isolados Azospirillum através da amplificação e clivagem das regiões 16S

rDNA, 23S rDNA e região intergênica 16S-23S rDNA. Neste estudo foi possível determinar o

padrão de restrição de estipes de Azospirillum relacionadas, evidenciando seu sítio de origem

e as espécies de Brachiaria que colonizam.

Além dessas técnicas de identificação de polimorfismos por amplificação e clivagem

de seqüência amplificada de DNA ribossômico, é necessária a utilização de técnicas para a

análise de DNA tais como: eletroforese em gel de agarose; separação de fragmentos de DNA

por tamanho em pares de base e estimativa do mesmo; eletroforese em gel de poliacrilamida.

Além da extração de ácidos nucléicos totais e de DNA dos diferentes sorotipos e

isolados, para utilização como molde na reação. Métodos estes, utilizados para a

discriminação de linhagens de grupos bacterianos de diferentes origens, podem ser

desenvolvidos no laboratório de genética e biologia molecular da Unoesc/Videira/SC. No

presente estudo terão prioridades as técnicas de amplificação de DNA baseadas em PCR que

têm sido mais freqüentemente utilizadas em estudos desta natureza (CANHOS e cols., 1999;

SAMBROOK e RUSSEL, 2001; JIN e cols., 2006).

2.3.1.2 PCR – RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)

Umas das técnicas mais utilizadas para a diferenciação de microorganismos e a técnica

de RAPD. Os primeiros estudos que utilizaram esses métodos foram feitos em 1990 e a partir

de então tem sido amplamente utilizados na diferenciação de micro-organismos, estudos de

diversidade genética e resolução de grupos taxonômicos. Esta técnica é baseada em uma

25

reação de PCR, na qual se utiliza iniciadores de seqüências aleatórias com cerca de 10

nucleotídeos. A grande vantagem desta técnica é que ela pode ser utilizada em qualquer tipo

de bactéria e não há necessidade de conhecimento prévio do genoma (SERAFINI e cols.,

2002).

O resultado da PCR pode então ser visualizado por eletroforese, permitindo a

comparação de diferentes isolados bacterianos através da identificação do tamanho dos

fragmentos. O peso molecular e o número de bandas variam de acordo com a amostra

utilizada e a uniformidade de bandas em organismos relacionados. Assim, podem-se comparar

os perfis obtidos para diferenciar linhagens ou espécies, sendo que há bandas presentes em

uma determinada espécie ou grupo, mas está ausente em espécies relacionadas (SERAFINI e

cols., 2002).

Vários trabalhos têm utilizado a técnica de RAPD na diferenciação de sorotipos de

Salmonella, apresentado resultados bastante significativos, quando comparados e métodos

tradicionais de detecção (QUINTAES e cols., 2004; MALORNY e cols., 2000; BETANCOR

e cols., 2004; QUINTAES e cols., 2002).

26

3 METODOLOGIA

Este trabalho foi realizado na forma de projeto de pesquisa visando à utilização de

técnicas moleculares baseadas no polimorfismo do DNA para caracterização e diferenciação

de sorotipos de Salmonella.

3.1 ISOLADOS BACTERIANOS

As cepas de Salmonella analisadas pertencem ao banco de cepas da Universidade do

Oeste de Santa Catarina. A maioria cepas foram obtidas através de um projeto de pesquisa

que determinou a ocorrência de enterobactérias, com ênfase em bactérias patogênicas, em

abatedouros de suínos e na cadeia produtiva de aves.

3.2 CONDIÇÕES DE CULTIVO E MEIOS DE CULTURA PARA SALMO�ELLA

Os isolados de Salmonella foram previamente cultivados em meio de Infusão Cérebro

e Coração (BHI), incubados 35-370C/24h. Posteriormente as células foram repicadas em

placas com Luria Betrani (LB) sólido; compondo-se basicamente de: cloreto de sódio, triptona

e extrato de levedura; e incubadas a 35-37oC/ 24 h para isolamento. As colônias isoladas

foram replicadas em meio LB liquido e incubadas a 35-37oC/ 24h.

3.3 EXTRAÇÃO DE DNA BACTERIANO

A extração do DNA foi realizada seguindo-se o método descrito por Sambrok e cols.,

(2001). Culturas bacterianas foram transferidas para um microtubo de centrifuga, e

centrifugada a 10000rpm durante 2 minutos. O sobrenadante foi descartado e as bactérias

foram ressuspendidas em 1000uL de solução salina-EDTA. A solução foi centrifugada a

10000rpm durante 2 minutos, o sobrenadante foi desprezado e as células foram ressuspensas

27

em 450ul de solução salina-EDTA. Foram adicionados 5uL de lisozima (20mg/mL) e a

suspensão foi incubada a temperatura ambiente por 10 minutos. Transcorrido esse período

foram adicionados 10uL de proteinase K (60mg/mL), mistura foi então incubada a 370C por

12 horas. Foram então adicionados 100uL de fenol-clorofórmio-álcool isoamilíco (25:24:1),

as amostras foram homogeneizadas suavemente por inversão e centrifugados a 1000rpm por

20 minutos. O sobrenadante foi recolhido em um novo tubo, foram adicionados 100uL de

clorofórmio-álcool isoamílico (24:1) e novamente centrifugados a 10000rpm por 20 minutos.

O sobrenadante foi recolhido em um novo tubo, foram adicionados 5uL de RNase (20mg/dL)

e a mistura foi incubada por 1 hora a 37oC. O DNA foi precipitado com 1,5V de isopropanol e

centrifugado a 10000rpm por 20 minutos. O sobrenadante foi desprezado, e foram adicionado

1mL de etanol 80% e centrifugado a 10000rpm por 20 minutos. O sobrenadante foi

desprezado, o precipitado foi seco a temperatura ambiente e ressuspenso em 50uL de solução

salina-EDTA.O DNA foi então quantificado em gel de agarose 2% e a visualização do DNA

extraído foi realizada sob iluminação ultra violeta em sistema de foto documentação Vilber

Lourmat. O material foi então armazenado a -20oC para a utilização no decorrer dos

experimentos.

3.4 INICIADORES DE PCR PARA A AMPLIFICAÇÃO DO rDNA 16S E INTERGÊNICA ENTRE OS RDNAS 16S e 23S

Os iniciadores para a amplificação do rDNA 16S anelarão em seqüências conservadas

nas regiões flanqueadoras do gene sendo a seqüência dos iniciadores: FD1 (5’ –

AGAGTTTGATCCTGGGTCAG – 3’) e RP2 (5’ –GGCTACCTTGTTACGACTT -3’),

previamente descritos por Woo e colaboradores (2001). E para a amplificação da região

intergênica entre os rDNAs 16S e 23S foram os iniciadores: 16-1A (5’ -

GTCGGAATCGCTAGTAATCG -3’) e 23-1B (5’ – GGGTTCCCCCATTCGGA – 3’),

previamente descrita por Baudart e colaboradores (2000). Os iniciadores foram sintetizados

pela empresa especializada K & M QUÍMICA LTDA.

A figura 2 demonstra as regiões do DNA que foram amplificadas. Indicando o local de

anelamento dos iniciadores.

Figura 2: Regiões do rD�A amplificadas23S rDNA. Regiões em preto representam tRNAs expressos na região intergênicas da maioria das bactérias Gram-negativas. Fonte: Copilado de Serafini e cols

A reação de PCR foi realizada em termociclador marca Thermo Eletron mod

HBSP02110. Os componentes da reação podem ser observados no quadro 3.

utilizado para a reação de amplificação de DNA (PCR) com os oligonucleotídeos

(iniciadores) da região 16S rDNA e a região intergênica 16S

condições: 960C por 5 minutos , 94

minutos , repetindo a partir do passo dois 30 vezes, 72

minutos, de acordo com a metodologia previamente publicada (

WOO e cols., 2000).

Regiões do rD�A amplificadas. Representação das regiões 16S rD23S rDNA. Regiões em preto representam tRNAs expressos na região intergênicas da maioria das

lado de Serafini e cols, 2002.

A reação de PCR foi realizada em termociclador marca Thermo Eletron mod

Os componentes da reação podem ser observados no quadro 3.


(iniciadores) da região 16S rDNA e a região intergênica 16S-23S rDNA teve as seguintes

C por 5 minutos , 940C por 40 s, 500C por 1 minutos, 72

minutos , repetindo a partir do passo dois 30 vezes, 720C por 10 minutos e 4

minutos, de acordo com a metodologia previamente publicada (BAUDART

28

. Representação das regiões 16S rDNA e intergênica 16S-23S rDNA. Regiões em preto representam tRNAs expressos na região intergênicas da maioria das

A reação de PCR foi realizada em termociclador marca Thermo Eletron modelo

Os componentes da reação podem ser observados no quadro 3. O programa


23S rDNA teve as seguintes

C por 1 minutos, 720C durante 1: 30

C por 10 minutos e 40C por 10

BAUDART e cols., 2000;

29

Quadro 3: Componentes das reações de amplificação de D�A por PCR-RFLP. Indicação dos componentes e quantidades utilizadas na reação.

Fonte: O autor (2009)

3.5 INICIADORES E PCR-RAPD

Foram também utilizados no estudo iniciadores RAPD: H15, H16, H17, H18, H19 e

H20, gentilmente cedidos pelo pesquisador da Epagri, Dr. Marco Antonio Dalbó. Os

componentes da reação de PCR-RAPD podem ser visualizados no quadro 4.

Quadro 4: Componentes das reações de amplificação de D�A por PCR-RAPD. Indicação dos componentes e quantidades utilizadas na reação

Fonte: O autor (2009)

O programa utilizado para reação de PCR-RAD teve as seguintes condições: 94°C por

5 minutos, 37°C por 1 minutos, 72°C por 1:30 minutos, repetindo a partir do passo 2 por 35

vezes, 72 °C por 10:00 minutos e 4°C por 10 minutos (PAGNO, 2008).

3.6 CLIVAGEM DOS PRODUTOS DE AMPLIFICAÇÃO DE DNA BACTERIANO

A clivagem dos produtos de amplificação da região 16S rDNA e da região intergênica

Componentes Volume/µl Concentração Tampão de reação 2,5 10x

DNTPs 2,0 1Mm DNA molde 3,0 100 ng/µl # Direto 1,0 50 pmol # Reverso 1,0 50 pmol

Taq DNA-polimerase 0,5 2,5 U/µl H2O Mili-Q (pura) 13,5

Final 25

Componentes Volume/µµµµl Concentração Tampão de reação 2,5 10x

MgCl2 1,5 50mM DNTPs 2,0 1mM

DNA molde 2,0 100 ng/µl Iniciador 1,0 50 pmol

Taq DNA-polimerase 0,5 2,5 U/µl H2O Mili-Q (pura) 15,5

Final 25

30

16S rDNA e 23S rDNa foram realizadas com as seguintes endonucleases de restrição: Alu I

(AGCT); Hinf I (GANT) segundo procedimento sugerido pelos fabricantes (Jena Bioscience).

O produto final foi analisado em gel de agarose 3%.

3.6.1 Eletroforese em Gel de Agarose

A agarose, na concentração de 1,0 a 3,0%, foi fundida em TAE 1x (tampão),

adicionando brometo de etídio, para a concentração final de 0,5 µg/ml. A eletroforese foi

realizada em tampão TAE 1x. Sendo adicionado ao DNA, a ser analisado, tampão de amostra

numa concentração final de 1x. Após a eletroforese, o DNA foi visualizado em

transiluminador de UV com comprimento de onda curto. O tamanho dos fragmentos de DNA

foi estimado com base nos padrões do marcador Ladder 100pb (SAMBROOK e RUSSEL,

2001). A comparação dos padrões de bandas obtidos entre os diversos sorotipos e isolados

para as diferentes técnicas foi realizada sob iluminação ultravioleta em sistema de foto

documentação Vilber Lourmat, as fotografias obtidas foram analisadas no programa

Microsoft Office Picture Manager.

31

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Um ponto fundamental na análise nas técnicas moleculares para identificação e

caracterização de micro-organismos é o DNA molde utilizado na reação de PCR. Em nosso

trabalho encontramos muitas dificuldades para obter um DNA limpo e em quantidade

suficiente para gerar uma amplificação de qualidade. As metodologias testadas para extração

de DNA foram todas variações da metodologia descrita por Sambrock, 2001. A metodologia

que obteve melhores resultados está descrita no item metodologia e o resultado pode ser

observado na fotografia 1.

Fotografia 1: - Extração de D�A Genômico. Eletroforese em gel de agarose 1,5%, amostras de DNA genômico. Fonte: O Autor (2009)

Segundo Quintaes e cols., (2004), a qualidade do DNA é um fator determinante o

sucesso da reação de amplificação. No estudo realizado por estes os autores observou-se que

em reações de RAPD, a concentração de DNA utilizado influencia concideravelemente o

resultado da reação, quando foram utilizados 20ng/uL de DNA obteve-se um perfil de

amplificação considerálvel, mas quando a concentração de DNA foi aumentada para 40ng/uL,

algumas bandas não amplificaram, já quando foi aumentado a concentração dos iniciadores de

20ng/uL para 40ng/uL as amplificações foram idênticas. Já Tyler e cols., (1997) demostraram

que são inúmeros os fatores que afetam a reprodutividade da técnica de PCR para detecção de

mico-organismos, dificultando a interpretação dos resultados por diferentes laboratórios.

Segundo estes mesmos autores existem vários fatores que efetam a reprodutividade destas

técnicas, como a concentração de MgCl2, o fornecedor e a concentração de Taq polimerase, o

lote dos iniciadores, o método de extração do DNA e até mesmo o modelo do termociclador

32

utilizado.

4.1 CARACTERIZAÇÃO DE SALMO�ELLA BASEADA NA TÉCNICA DE PCR-RFLP

Vários trabalhos de caracterização bacteriana tem utilizado como base o gene

ribossomal 16S e a região espassadora entre 16S e 23S também conhecida como ITS

(CHANG e cols., 1997; CHRISTENSEN e cols., 2000; LUZ e cols., 1998; LAGATOLLA, e

cols., 1996; CHRISTENSEN, e cols., 2000 ). Essas regiões do genoma bacteriano apresentam

além de partes conservadas que são importantes para investigações taxonomicas alguns

fragamentos altamente variáveis que podem ser utilizados para caracterização e distinção de

sorotipos de microorganismos (SERAFINI e cols., 2002) .

A técnica de PCR-RFLP é amplamente utilizada na caracterização e diferenciação

molecular de várias especies. Uma etapa fundamental para o sucesso de uma desta técnica, é a

amplificação da sequência que será clivada pelas enzimas de restrição. A região 16S rDNA

contém aproximandamente 1550pb, sendo compostas por regiões altamente conservadas e

regiões polimorficas, sendo que essas podem ser utilizadas para promover a caracterização de

micro-organismos (CLARRIDGE, 2004). Geralmente o gene 16S rDNA é universal em

bacterias e pode ser utilizado para medir relações entre esses micro-organismos, a comparação

desta sequencia permite a diferenciação a nível de gênero, espécies e até mesmo em nível de

sub-espécies (CLARRIDGE, 2004). A fotografia 2, demonstra amplificação da região 16S

rDNA realizada neste estudo.

Fotografia 4: Amplificação. da região rD�A16S . 1. S. Typhi, 2. S. Typhimurium, 3. S. Enteritidis , 4. S. Arizonae, 5. Salmonella sp., 6. S. Panama, 7. S. Moraelia, 8. S. Heidelberg, 9. S. Derby. Fonte: O Autor (2009).

A análise de restrição da região do 16S rDNA com a enzima de restrição Alu I

1 2 3 4 5 6 7 8 9

33

(fotografia 3) apresentou a formação de quatro diferentes perfis. O perfil A, foi encontardo

para os sorotipos de S. Typhi, S. Typhimurium, S. Enteritidis e Salmonella sp. com a

formação de fragmentos com 250 pb, 350pb , 380pb e 600pb. O perfil B foi encontrado

apenas para S. Arizonae com 200pb e 250 pb. O percil C foi encontrado apenas para

Salmonella sp. com a formação de fragmentos de aproximadamente 350pb, 500pb e 600pb. E

o perfil D foi encontrado para os sorotipos S. Panama, . S. Moraelia, S. Heidelberg. S. Derby.

Fotografia 3 : Reação de PCR-RFLP região 16S Enzima Alu I. Eletroforese em gel de agarose 2%. M. marcador Ladder 100pb., 1. S. Typhi, 2. S. Typhimurium, 3. S. Enteritidis , 4. S. Arizonae, 5. Salmonella sp., 6. S. Panama, 7. S. Moraelia, 8. S. Heidelberg, 9. S. Derby. Fonte: O Autor (2009).

Atravês da análise de restrição da região 16S DNA de Salmonella com a enzima Hinf1

(fotografia 4) foram encontrado 8 perfis distintos dentre os nove analisados. A S. Typhi

apresentou 6 perfis com 350pb, 700pb, 900pb, 1000pb, 1400pb e 1550pb. S. Typhimurium e

S. Enteritidis apresentaram apenas duas bandas com 350 e 700pb. S. Arizonae apresentou

umm perfil diferentes dos outros sorotipos analisados com bandas de aproximadamente

110pb, 200pb, 280pb, 320pb.

1500pb 1000pb 900pb 800pb 700pb 600pb 500pb 400pb 300pb 200pb 100pb

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9

A A A B A C D D D

34

Fotografia 4: Reação de PCR-RFLP região 16S rD�A Enzima Hinf I. Eletroforese em gel de agarose 2%. M. marcador Ladder 100pb. 1. S. Typhi, 2. S. Typhimurium, 3. S. Enteritidis , 4. S. Arizonae, 5. Salmonella sp., 6. S. Panama, 7. S. Moraelia, 8. S. Heidelberg, 9. S. Derby. Fonte: O Autor (2009).

Outra importante região utilizada na caracterização e diferenciação de

microorganismos está baseada na amplificação da região intergênica entre o DNA 16S e 23S.

Alguns trabalhos já se basearam nesta técnica para diferenciação de Salmonella a nível de

sorotipo e até mesmo para determinar diferenças dentro de um mesmo sorotipo (Lagattola, e

cols., 1996). A região intergênica 16S-23S é uma região altamente polimórfica e pode ser

encontrada mais de uma cópia no cromossomo bacteriano (LAGATOLLA, e cols., 1996;

CHRISTENSEN, e cols., 2000).

A fotografia 5 representa a amplificação da região 16S-23S , podem ser observados

diferentes perfis de amplificação, sendo que para alguns dos sorotipos analisados foram

observados mais de um produto de amplificação. Outros trabalhos relatam a formação de mais

de um produto de amplificação (LAGATOLLA, e cols., 1996; CHRISTENSEN, e cols.,

2000). No trabalho realizado por Lagotta e cols., (1996) foram estudados 218 isolados

pertencentes a 10 sorotipos. Neste estudo os sorotipos S. enteretide, S. Panama, S. Goldcoast,

S. London e S. Heidelberg apresentaram perfis idênticos e mais de um produto de

amplificação. Isso é explicado pelo alto grau de polimorfismos desta região e pela alta

quantidade de cópias dos genes que codificam para o rRNA 16S e rRNA 23S.

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1500pb 1000pb 900pb 800pb 700pb 600pb 500pb 400pb 300pb 200pb 100pb

A B B C D E F G H

35

Em nosso estudo S. Tyhi, S. Typhimurium, S. Enteritidis , apresentaram perfil

identico, com a formção de duas bandas com cerca de 700pb e 750pb. Os sorotipos S.

Moraelia e S. Derby também apresentaram padrões de bandas idênticos, com cerca de 500pb,

600pb e 650pb. Já os sorotipos S. Arizonae (700pb) , S. Panama (650pb) e Salmonella sp.(

650pb, 700pb e 750pb) apresentaram padrões únicos de amplificação.

Fotografia 5: Amplificação da região intergênica 16S-23S . 1. S. Typhi, 2. S. Typhimurium, 3. S.

Enteritidis , 4. S. Arizonae, 5. Salmonella sp., 6. S. Panama, 7. S. Moraelia, 8. S. Salmonella sp, 8. S. Derby. Fonte: O Autor (2009).

Os estudos relatados na literatura baseam-se somente na amplificação da região 16S-

23S. Em nosso trabalho os produtos da amplificação também foram clivados com enzimas de

restrição para aumentar a capacidade descriminatória do método. O produto da reação de

clivagem com a enzima Alu I pode ser visualizado na fotografia 6. Foram obtidos atráves da

clivagem com esta enzima quatro diferentes perfis. S. Typhi, S. Arizonae e Salmonella sp.

obtiveram o mesmo padrão de bandas com 100pb, 230pb, 250pb e 380pb. S. Typhimurium e

S. Enteritidis apresentaram bandas de 100pb, 180pb, 250pb, 300pb, 380pb. S. Moraelia e S.

Derby apresentaram bandas de 250pb, 300pb e 500pb. S. Heidelberg apresentou bandas de

130pb, 200pb, 250pb, 380pb e 450pb.

M 1 2 3 4 5 6 7 5 8

587pb

458pb 260pb 100pb 20pb

36

Fotografia 6: Reação de PCR-RFLP região 16S-23S D�A enzima Alu I Eletroforese em gel de agarose 3%. M. marcador Ladder 100pb. 1. S. Typhi, 2. S. Typhimurium, 3. S. Enteritidis , 4. S. Arizonae, 5. Salmonella sp., 6. S. Moraelia, 7. S. Heidelberg, 8. S. Derby. Fonte: O Autor (2009).

A fotografia 7 representa a clivagem do produto de amplificação da região 16S-23S

pela enzima Hinf I. Todos os sorotipos análisados, exceto S. Moraelia e S. Derby

apresentaram perfis diferentes para essa enzima de restrição. S. Typhi apresentou bandas com

100pb, 500pb, 600pb, 750pb e 800pb. S. Typhimurium apresentou bandas com 100pb, 300pb,

400pb, 550pb, 600pb, 750pb e 800pb. S. Enteritidis apresentou bandas com 100pb, 250pb,

300pb, 400pb e 600pb. S. Arizonae apresentou bandas 580pb, 600pb,700pb. Salmonella sp.

apresentou bandas de 100pb, 250pb, 350pb e 500pb. S. Panama 100pb, 300pb, 350pb, 480pb,

550pb. S. Moraelia e S. Derby apresentaram bandas de 350pb e 450pb. S. Heidelberg

apresentou bandas com 100pb, 400pb, 450pb, 600pb, 650pb.

M 1 2 3 4 5 6 7 8

1500pb 1000pb 900pb 800pb 700pb 600pb 500pb 400pb 300pb 200pb 100pb

A B B A A C D C

37

Fotografia 7: Reação de PCR-RFLP região 16S-23S D�A enzima Hinf 1. Eletroforese em gel de agarose 2%. M. Marcador E 840. 1. S. Typhi, 2. S. Typhimurium, 3. S. Enteritidis , 4. S. Arizonae, 5. Salmonella sp., 6. S. Panama, 7. S. Moraelia, 8. S. Heidelberg, 9. S. Derby. Fonte: O Autor (2009).

4.2 CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE SOROTIPOS DE SALMO�ELLA ATRAVÉS DA TÉCNICA DE PCR-RAPD

A técnica de PCR–RAPD, tem sido amplamente utilizada em estudos de

caracterização e diferenciação molecular de Salmonella (SANTOS, 2003; JIN e cols., 2006;

MALORNY e cols., 2000; BETANCOR e cols., 2003; QUINTAES e cols., 2002; ZUCON,

2008; TOZZETO, 2006). Neste trabalho foram testados 6 iniciadores de RAPD, não descritos

na literatura para identificação e caracterização de Salmonella. Sendo estes H15, H16, H17,

H18, H19 e H20.

Os iniciadores H16, H19 e H20 não apresentaram resultados significativos, para

estudos de caracterização de Salmonella. Entretando os iniciadores H15, H17 e H18

apresentaram resultados bastante significativos para estudos futuros. Para os iniciadores H17

e H18, serão necessários mais testes para determinar a melhor temperatura de anelamento,

pois utilizando-se da temperatura de 37oC verificou-se diferença nos padrões de amplificação

formados, mas não foi possivel determinar a real dimensão da diferença entre os sorotipos

analisados. Já iniciador H15 apresentou resultado significativo há uma temperatura de

anelamento 37oC.

Com a utilização do iniciador H15, foram obtidos quatro diferentes perfis entre os

1 2 3 4 5 6 7 8 9 6 M

A B C D E F G H G I

587pb 446pb 298pb 262pb 107pb

80pb

38

sorotipos utilizados neste estudo, variando de 200pb a 700pb (fotografia 8).O perfil A

apresentou a formação de três fragmentos com 250pb, 300pb e 600pb, para S. Typhi, S.

Enteritidis . O perfil B foi encontrado para S. Typhimurium e S. Enteritidis , com fragmentos

de 200pb, 300pb e 450pb. O perfil C foi encontrado para Salmonella sp. e S. Panama,

apresentando a formação de três fragmentos com 230pb, 300pb e 550pb. O perfil D, foi

encontrado para os S. Moraelia, S. Heidelberg e S. Derbi, apresentando fragmentos de 230pb,

300pb e 400 pb. Todos os sorotipos de Salmonella utilizados neste estudo apresentaram com

iniciador H15 uma banda com aproximadamente 300pb.

Fotografia 8: PCR – RAPD Iniciador H15. Eletroforese em gel de agarose 2%. M. marcador Ladder 100pb.1. S. Typhi, 2. S. Typhimurium, 3. S. Enteritidis , 4. S. Arizonae, 5. Salmonella sp., 6. S. Panama, 7. S. Moraelia, 8. S. Heidelberg, 9. S. Derby. Fonte: O Autor (2009).

Para o iniciador para PCR-RAPD H17 serão necessários mais testes, pois até o

momento não se conseguiu uma qualidade de amplificação satisfatória, para determinar um

perfil molecular. Mas apesar da baixa qualidade da amplificação podem ser observadas

(fotografia 9) diferenças entre os sorotipos utilizados neste estudo, o que indica que este

iniciador pode ser utilizado em estudos futuros para determinação de sorotipos de Salmonella.

Para se obter um melhor resultado pode-se aumentar a concentração de MgCl2 para que o

iniciador se anele em regiões menos específicas, ocasionando assim uma maior quantidade e

qualidade de amplificações.

1500 pb

1000 pb 900 pb 800 bp 700 pb 600 pb 500 pb

400 pb

300 pb 200 pb

100 pb

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9

A B B A C C D D D

39

Fotografia 9: PCR – RAPD Iniciador H17. Eletroforese em gel de agarose 2%. M. marcador Ladder 100pb, 1. S. Typhi, 2. S. Typhimurium, 3. S. Enteritidis , 4. S. Arizonae, 5. Salmonella sp., 6. S. Panama, 7. S. Moraelia, 8. S. Heidelberg, 9. S. Derby. Fonte: O Autor (2009)

Para o iniciador de RAPD H18 (fotografia 10) serão necessários mais testes de

amplificação, mas notam-se diferenças significativas entre os padrões de bandas formados.

Fotografia 10 : PCR – RAPD Iniciador H18. Eletroforese em gel de agarose 2%. M. marcador Ladder 100pb. 1. S. Typhi, 2. S. Enteritidis , 3. S. Arizonae, 4. Salmonella sp., 5. S. Panama, 6. S. Moraelia, 7. S. Heidelberg, 8. S. Derby. Fonte: O Autor (2009).

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9

1500 pb 1000 pb 900 pb 800 pb 700 bp 600 bp 500 bp 400 bp 300 pb 200 pb 100 pb

M 1 2 3 4 5 6 7 8

587pb

458pb

260pb

100pb

20pb

40

5 CO�CLUSÕES

• Através da amplificação e clivagem da região rDNA 16S foi possível diferenciar os

sorotipos de Salmonella estudos.

• Através da amplificação e clivagem da região integênica entre o rDNA 16S e rDNA 23S

foi possível diferenciar os sorotipos de Salmonella estudados. Sendo que esta técnica é

altamente promissora e ainda pouco explorada na caracterização de diferenciação de

Salmonella.

• Os iniciadores de RAPD H15, H17 e H18, apresentam-se com potencial para estudos de

diferenciação molecular de Salmonella, entretanto serão necessários mais alguns testes

para os iniciadores H17 e H18 melhorando assim a qualidade das amplificações.

• Os resultados obtidos trazem a perspectiva da utilização das técnicas baseadas na

amplificação e clivagem da região rDNA 16S e região intergênica entre rDNA 16S e

rDNA 23S em novos estudos de caracterização de Salmonella e também para detectar

polimorfismos dentro de um mesmo sorotipo.

41

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Trabalho de Concluso de Curso Carlos Alexandre Breyer 2009

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