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UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM IMUNOLOGIA

TRABALHO DE DISSERTAÇÃO

VANESSA DA SILVA BRITO

FREQUÊNCIA DE SUBTIPOS LINFOCITÁRIOS

PERIFÉRICOS E EXPRESSÃO DE FOXP3 NA INFECÇÃO

PELO VÍRUS LINFOTRÓPICO DE CÉLULAS T HUMANAS

TIPO 1 (HTLV-1).

Salvador, BA

2013

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VANESSA DA SILVA BRITO

FREQUÊNCIA DE SUBTIPOS LINFOCITÁRIOS

PERIFÉRICOS E EXPRESSÃO DE FOXP3 NA INFECÇÃO

PELO VÍRUS LINFOTRÓPICO DE CÉLULAS T HUMANAS

TIPO 1 (HTLV-1).

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em

Imunologia, da Universidade Federal da Bahia como requisito

parcial para obtenção do título de Mestre em Imunologia.

Orientadora: Profa. Dra. Songeli Menezes Freire Co-Orientadora: Profa. Dra.

Maria Fernanda Rios Grassi

Salvador, BA

2013

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Dedico esse trabalho a minha família, pois

sem o apoio delas a minha vida não seria

tão maravilhosa.

4

AGRADECIMENTOS

A minha família, fonte de amor e força para lutar pelos meus objetivos, e por caminharem sempre ao meu lado.

À Dra. Songeli Menezes Freire, pela oportunidade de fazer parte do seu grupo de

pesquisa, pelos conhecimentos compartilhados, pelos anos de orientação pessoal e profissional.

Á Dra. Fernanda Grassi, por ter sido tão atenciosa, pelo exemplo de profissional,

pela importante colaboração e orientação.

Ao Dr. Bernardo Galvão e ao seu grupo de pesquisa, por permitir o desenvolvimento deste projeto em colaboração.

Ao Dr. Roberto Meyer, por conduzir de forma tão humana as atividades do

Labimuno.

Ao querido colega Geraldo Pedral, por todos esses anos de amizade, me ensinando a executar e entender muitas técnicas em imunologia, com inesgotável tranqüilidade.

Às minhas companheiras de projetos Bruna Mattos, Taís Gardênia e Clécia Caribé

por todo o apoio prestado e pela amizade.

À todos os colegas do Labimuno, do PPGIm, e do ADAB, pelo auxílio na execução do projeto, na compreensão dos dados e, principalmente, pelas sábias palavras de

força dadas na reta final.

A todos os docentes do Programa de Pós-graduação em Imunologia.

Aos meus amados amigos pelos infinitos momentos de alegrias.

Ao suporte financeiro dado pelo CNPq, CAPES e PRONEX.

Na certeza de que todos contribuíram para a realização deste estudo, agradeço imensamente.

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RESUMO

Introdução: O vírus linfotrópico de células T humanas tipo 1 (HTLV-1) é um

retrovírus linfotrópico, descrito como agente causador da leucemia/linfoma de

células T do adulto (ATL) e paraparesia espástica tropical/mielopatia associada ao

HTLV-1 (HAM/TSP). Mesmo nos portadores aparentemente assintomáticos existem

evidências de comprometimento funcional da resposta imune celular. Os objetivos

do presente trabalho foram avaliar as subpopulações linfocitárias e células T

regulatórias em indivíduos infectados pelo HTLV-1 e comparar as populações de

células T (CD4+, CD8+), por dois kits comerciais diferentes disponíveis. Material e

Métodos: Este estudo foi aprovado pelo CEP-207/2009CPqGM/FIOCRUZ. Em

amostras de sangue periférico de 55 indivíduos infectados com HTLV-1

(soropositivos) e 80 controles (não infectados / HTLV soronegativos), foram

quantificados com os reagentes e kits Lymphogram (Cytognos-Espanha) e Tritest

(BD-USA), linfócitos T (CD4+, CD8+, CD25+), células NK e linfócitos B, por reagentes

de marcação simultânea, e avaliada a expressão de Foxp3 nas células T

CD4+CD25+. Resultado: Com os dados analisados, os indivíduos infectados pelo

HTLV-1 apresentam valores mais elevados de células T CD4+ e CD8+, redução na

frequência de células NK (p<0,05), sem diferença nas células B, quando

comparados aos controles. Observa-se uma menor expressão da proteína Foxp3 em

células T CD3+CD4+CD25+ de indivíduos infectados pelo HTLV quando comparados

aos não infectados/soronegativos (p<0,05). Discussão: Com base nos resultados,

pode-se concluir que o Lymphogram® é um método confiável, rápido e de baixo

custo para o diagnóstico e monitoramento de linfopatias como a infecção pelo HTLV-

1. Conclusão: As análises quantitativas mostraram que indivíduos infectados pelo

HTLV-1 apresentam uma contagem de células T CD4+ e CD8+ maior, mantendo a

proporcionalidade nas duas células, e valores menores de células NK, quando

comparados aos controles não infectados.

Palavras-chave: Vírus linfotrópico de células T humanas tipo 1 (HTLV-1);

imunofenotipagem; Foxp3. Lymphogram, TCD4+, TCD8+, Tritest.

6

ABSTRACT

Introduction : The human T lymphotropic virus type 1 ( HTLV - 1 ) is a cell

lymphotropic retroviruses described to cause leukemia / lymphoma adult T-cell ( ATL

) and tropical spastic paraparesis / HTLV-associated myelopathy - 1 ( HAM / TSP ) .

Even in apparently asymptomatic patients there is evidence of functional impairment

of the cellular immune response . The objectives of this study were to evaluate the

lymphocyte subsets and regulatory T cells in individuals infected with HTLV - 1 and

compare the populations of T (CD4+ , CD8+ ) by two different commercially available

kits . Material and Methods: This study was approved by CEP-

207/2009CPqGM/FIOCRUZ. In peripheral blood samples of 55 individuals infected

with HTLV -1 ( HIV + ) and 80 controls, non-infected ( HTLV seronegative ) were

measured with the reagents and kits Lymphogram ( Cytognos , Spain) and Tritest

(BD , USA ) , T lymphocytes (CD4+, CD8+, CD25+) , NK cells and B lymphocytes by

simultaneous marking reagents , and measured the expression of Foxp3 in CD4+

CD25+ . Results: With the data analyzed , individuals infected with HTLV - 1 show

higher values of CD4 and CD8 cells , reduction in the frequency of NK ( p < 0.05 ) ,

with no difference in cell B cells , when compared to controls . Observed a lower

expression of Foxp3 protein in T cells CD3+CD4+CD25+ HTLV -infected individuals

compared to uninfected / seronegative (p < 0.05) . Discussion: Based on the results

, we can conclude that the Lymphogram® is a reliable, fast and cost effective for the

diagnosis and monitoring of lymphopathies method as HTLV – 1. Conclusion : The

quantitative analysis showed that patients infected by HTLV - 1 show a count of

CD4+ and CD8+ cells greater , however proporcinal in two cells , NK cells and lower

values when compared to uninfected controls .

Keywords: Human T lymphotropic virus type 1 (HTLV-1) cells, immunophenotyping;

Foxp3. Lymphogram, CD4+, CD8+, Tritest.

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LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

ADAB Ambulatório Docente Assistencial da Bahiana

Ag Antígeno

AgHBs Antígeno de Superfície da Hepatite B

AIDS Acquired Immune Deficiency Syndrome (Síndrome da Imunodeficiência Adquirida)

APC Allophycocyanin (Aloficocianina)

APCs Antigen Presenting Cells (células apresentadoras de antígeno)

ATL Adults T-cell lymphoma (Linfoma de células T do adulto)

CD Cluster of differentation (marcador de diferenciação de grupo)

CREB cAMP response element-binding protein (proteína de resposta de ligação a

cAMP)

CTL Cytotoxic T Lymphocytes (células T citolíticas ou citotóxica)

DNA Deoxyribonucleic Acid (ácido desoxirribolucléico)

DST Doença Sexualmente Transmissível

EDTA Ethylene Diamine Tetracetic Acid (ácido etilenodiamino tetra-acético)

ELISA Enzyme-Linked-Immunosorbent Assay (ensaio imuno-enzimático)

EUA Estados Unidos da América

FITC Fluorescein Isothiocyanate (isotiocianato de fluoresceína)

Foxp3 Forkhead box P3 ( “suporte de forquilha” proteína intracelular)

FSC Forward scatter (dispersão frontal)

GITR Glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor (Receptor do fator de

necrose tumoral induzida por glucocorticóides)

GLUT-1 Glucose transporter 1 (transportador de glicose-1)

GM-CSF Granulocyte macrophage colony-stimulating factor (Fator estimulador de

colônia de macrófagos e granulócitos )

gp Glicoproteína

HAM HTLV-I associated myelopathy (mielopatia associada ao HTLV-I)

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HAM/TSP Human T-lymphotropic virus type-I-associated myelopathy / tropical spastic

paraparesis (Mielopatia humana associada as Víirus T-linfotrópico tipo I /

paraparesia espástica tropical)

HBZ HBZ (HTLV-I bZIP factor) - HTLV-1 basic leucine-zipper (bZIP) factor

HCV Hepatitis C vírus (vírus da Hepatite C)

HIV Human immunodeficiency vírus (vírus da imunodeficiência humana)

HLA Human Leukocyte Antigen (antígeno leucocitário humano)

HSPGs Heparan Sulfate Proteoglycans (proteoglicanos de sulfato de heparano)

HTLV-1 Human T lymphotropic virus type 1 (vírus linfotrópico de células humanas tipo1)

IFN Interferon (interferon)

IgG Imunoglobulina de classe G

IL-1 Interleucina-1

IL-2 Interleucina-2

IL-6 Interleucina-6

IL-15 Interleucina-15

IL-2R Receptor de Interleucina-2

LCR Líquido céfalo-raquidiano

LLTA Leukemia / lymphoma, adult T-cell (Leucemia / linfoma de células T de adulto)

LTR Long Terminal Repeat (terminal de longa repetição nucleotídica)

MoAb Monoclonal antibodies (anticorpos monoclonais)

mRNA Ribonucleic Acid messenger (ácido ribonucléico mensageiro)

MS Ministério da Saúde

NF-κB Factor nuclear kappa B

NK Natural killer (Células assassinas naturais ou celulas NK)

NKT Natural killer T cells (células NKT)

NRP-1 neuropilina-1

OMS Organização Mundial de Saúde

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ORFs Open reading frames (quadros de leitura aberta)

pb Pares de bases

PBMC Peripheral blood mononuclear cells (células mononucleares do sangue

periférico)

PCR Polimerase chain reaction (reação em cadeia da polimerase)

PE Phycoerythrin (ficoeritrina)

PECy5 Phycoerythrin cyanine 5 (ficoeritrina cianina 5)

PerCP Peridinin chlorophyll protein (proteina clorofila peridinina)

PET Paraparesia espástica tropical

rgp Recombinant glicoprotein (glicoproteína recombinante)

RNA Ribonucleic Acid (ácido ribonucléico)

RT-PCR Real time PCR (reação em cadeia da polimerase em tempo real)

SNC Sistema nervoso central

SRF serum response factor (fator de resposta sérica)

SSC Side scatter (dispersão lateral)

T reg Célula T regulatória

Th Célula T helper

TNF Tumor necrosis factor (fator de necrose tumoral)

TNF-α Tumor necrosis factor-alpha (fator de necrose tumoral)

TSP Tropical spastic paraparesis (paraparesia espástica tropical)

WB Western-Blotting

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LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1: Representação esquemática da estrutura de uma partícula viral

do HTLV-1 e da estrutura genômica do vírus.

16

Figura 2: Critério de análise das subpopulações linfocitárias pelo kit

Lymphogram®. A-seleção por gate da população de linfócitos totais para o

estudo (tamanho-FSC versus granulosidade-SSC); B-Dot plot de

purificação/identificação (FL-FITC versus FL-PE); C- identificação de CD3+

através da análise de FSC versus padrão de fluorescência (CD56/CD3PE);

D- identificação de CD3+ através da análise do padrão de fluorescência

CD56/CD3PE versus CD4/PECy5; E- identificação de CD8+, CD56+ e

CD19+ através da análise do padrão de fluorescência CD56/CD3PE versus

CD8/CD19FITC. A distribuição das células é avaliada de acordo com

intensidades de fluorescência emitidas pela ligação dos anticorpos

monoclonais específicos, em ambos os eixos.

28

Figura 3: Critério de análise das subpopulações linfocitárias pelo kit

Tritest®. A população de linfócitos totais para o estudo (CD3PerCP) versus

granulosidade-SSC); B os subtipos de linfócitos CD3+ (CD4FITC versus

CD8PE).

29

Figura 4: Representação gráfica das médias±DP dos valores absolutos

(gráfico da esquerda) e relativos (gráfico da direita) de linfócitos T totais

(CD3+) em indivíduos infectados pelo HTLV e controles (não

infectados/soronegativos). Amostras de 55 pacientes infectados e 80

controles foram quantificadas utilizando os reagentes para teste de

imunofluorescendia direta Lymphogram® e Perfect Count® (ambos

Cytognos) por citometria de fluxo. (Significância estatística p<0,05; test t).

32

Figura 5: Representação gráfica das médias±DP dos valores absolutos

(gráfico a esquerda) e relativos (gráfico á direita) de de linfócitos T CD4+ em

indivíduos infectados pelo HTLV e controles não infectados. Amostras de

55 pacientes infectados e 80 controles foram quantificadas utilizando os

reagentes para teste de imunofluorescendia direta Lymphogram® e Perfect

33

11

Count® (ambos Cytognos) citometria de fluxo. (Significância estatística

p<0,05; test t).

Figura 6: Representação gráfica das médias±DP dos valores absolutos

(gráfico a esquerda) e relativos (gráfico a direita) de linfócitos T CD8+ em

indivíduos infectados pelo HTLV e controles não infectados. Amostras de

55 pacientes infectados e 80 controles foram quantificadas utilizando os

reagentes para teste de imunofluorescendia direta Lymphogram® e Perfect

Count® (ambos Cytognos) por citometria de fluxo. (Significância estatística

p<0,05; test t).

34

Figura 7: Representação gráfica das médias±DP da razão entre linfócitos T

CD4+/CD8+ em indivíduos infectados e controles negativos. Amostras de 55

pacientes infectados e 80 controles foram quantificadas utilizando os

reagentes para teste de imunofluorescendia direta Lymphogram® e Perfect

Count® (ambos Cytognos) por citometria de fluxo. (Significância estatística

p<0,05; test t).

35

Figura 8: Representação gráfica das médias±DP dos valores absolutos

(gráfico a esquerda) e relativos (gráfico a direita) de células NK em

indivíduos infectados e controles negativos. Amostras de 55 pacientes

infectados e 80 controles foram quantificadas utilizando os reagentes para

teste de imunofluorescendia direta Lymphogram® e Perfect Count® (ambos

Cytognos) por citometria de fluxo. (Significância estatística p<0,05; test t).

36

Figura 9: Representação gráfica das médias±DP dos valores absolutos e

relativos de linfócitos B em indivíduos infectados e controles negativos.

Amostras de 55 pacientes infectados e 80 controles foram quantificadas

utilizando os reagentes para teste de imunofluorescendia direta

Lymphogram® e Perfect Count® (ambos Cytognos) por citometria de fluxo.

(Significância estatística p<0,05; test t).

37

Figura 10: Representação gráfica das médias±DP dos valores relativos de

de linfócitos T CD3+CD4+CD25+ e análise da expressão de Foxp3 nesta

subpopulação linfocitária em infectados pelo HTLV-1 e controles negativos.

Amostras de 46 pacientes infectados e 64 controles foram quantificadas

utilizando os reagentes para teste de imunofluorescendia direta por

38

12

citometria de fluxo. (Significância estatística p<0,0001; test t).

Figura 11: Valores absolutos de células CD3+, CD4+ e CD8+ por citometria

de fluxo utilizando Lymphogram®/ (Cytognos) e Tritest®(BD) em 36

indivíduos infectados pelo HTLV-1, e 70 indivíduos controles. (Correlação

por Spearman e Significância por Wilcoxon test).

40

13

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Composição dos anticorpos monoclonais e fluorocromos utilizados

como reagentes de kits para quantificação de subpopulações linfocitárias.

27

Tabela 2: Características clínicas e epidemiológicas da população estudada. 30

Tabela 3: Aspectos leucometricos dos participantes voluntários soropositivos

para HTLV e soronegativos

31

Tabela 4: Valores de linfócitos T totais (CD3+), representado em Média± Desvio

Padrão, e o valor de p.

32

Tabela 5: Valores de linfócitos T CD4+, representado em Média± Desvio Padrão,

e o valor de p.

33

Tabela 6: Valores de linfócitos T CD8+, representado em Média± Desvio Padrão,

e o valor de p.

34

Tabela 7: Valores de células Natural Killer, representando em média±DP, valor

de p.

36

Tabela 8: Valores de linfócitos B, representando em média±DP, valor de p. 37

Tabela 9: Média±DP dos valores relativos das células T regulatórias. 38

14

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO GERAL 15 2. REVISÃO DE LITERATURA 16

2.1 ASPECTOS DO VÍRUS LINFOTRÓPICO DE CÉLULAS T HUMANAS 16 2.1.1 Estrutura e Genoma Viral 16

2.1.2 Aspectos Epidemiológicos da infecção pelo HTLV 18 2.1.3 Replicação Viral 19

2.2 CARACTERÍSTICAS DA INFECÇÃO PELO HTLV-1 20 2.2.1 Manifestações clínicas relacionadas a Infecção 19

2.2.2 Patogênese 20 2.2.2.1 PAPEL DOS LINFÓCITOS NA INFECÇÃO PELO HTLV 21

3. OBJETIVOS 22 4. Capítulo 1: artigo científico 1 : Frequência de subtipos linfocitários

periféricos e expressão de Foxp3 na infecção pelo vírus linfotrópico de células T humanas tipo 1 (HTLV-1).

23

4.1 INTRODUÇÃO 24 4.2 MATERIAIS E MÉTODOS 25

POPULAÇÃO DE ESTUDO 25

IMUNOFENOTIPAGEM LINFOCITÁRIA 26 Análises das aquisições por Lymphogram® 27

Análises das aquisições por Tritest® 28 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS 29

ANÁLISE ESTATÍSTICA 29 4.3 RESULTADOS 30

CARACTERÍSTICAS DA POPULAÇÃO ESTUDADA 30 ANÁLISE DAS SUBPOPULAÇÕES LINFOCITÁRIAS 32

4.4 DISCUSSÃO 41 4.5 CONCLUSÃO 44

4.6 REFERÊNCIAS 45 5 CONCLUSÃO GERAL 53

6 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 54 APÊNDICES (A, B, C e D) 61

ANEXOS (A e B) 64

15

1. INTRODUÇÃO GERAL

O vírus linfotrópico de células T humanas tipo 1 (HTLV-1) foi isolado em 1980

em células de sangue periférico de um doente que sofria de uma doença

linfoproliferativa de células T (POIESZ et al., 1980). Em 1981, foi relacionado com a

Leucemia das Células T do Adulto (ATL) pela demonstração de partículas de

anticorpos anti-HTLV-1 no soro de pacientes com ATL (HINUMA et al., 1981), a

partir daí assumiu-se a designação de vírus do Linfoma de células T do adulto

(ATLV). Em 1983, investigações levaram à descoberta da associação entre este

retrovírus e uma neuromielopatia crônica, e em 1985, na Martinica, houve a

constatação da presença de anticorpos anti-HTLV-1 no soro de mais de 60% dos

pacientes com paraparesia espástica tropical–TSP. Em 1986, foi descrita com a

denominação de mielopatia associada ao HTLV-I - HAM (OSAME et al., 1986). Em

1988, a Organização Mundial de Saúde (OMS), determinou que se tratavam da

mesma doença, denominando-a de HAM/TSP. Este vírus foi mais tarde associado

com outras condições clínicas, além da leucemia de células T do adulto e da

HAM/TSP, como a uveíte, dermatite infecciosa, miosite e poliartrites (FENG YU,

1991; PARKER, 1992).

Aproximadamente 10 a 20 milhões de pessoas estão infectadas pelo HTLV-1

em todo o mundo (EDLICH et al., 2000). Estimativas baseadas nas prevalências

conhecidas apontam 2,5 milhões de pessoas estão infectadas no Brasil (PROIETTI

et al., 2005). No estado da Bahia foi estimado que aproximadamente 40 mil pessoas

estejam infectadas (DOURADO et al., 2003; SANTOS et al., 2009). Na cidade de

Salvador Bahia -Brasil foi registrada uma taxa de 1,8% da população local,

infectados pelo HTLV-1 (GALVÃO-CASTRO et al., 2009)

Diversos fatores estão associados ao desenvolvimento da patologia

associada ao HTLV-1, porém a resposta imunológica do hospedeiro parece ter

importante influência na evolução da infecção. Embora as células T CD4+ sejam as

células alvo primárias para transformação por este vírus, aproximadamente 10%

dele é transportado por células T CD8+, com maior carga proviral do que células T

CD4+, em pacientes HAM/TSP e portadores assintomáticos (MATSUOKA, 2011;

KANNIAN, 2012). Assim as células T CD8+, células B, células dendríticas e células

16

Natural Killer podem ser reservatórios adicionais para o vírus in vivo (GESSAIN &

MAHIEUX, 2012).

Aspectos da celularidade e da distribuição dos subtipos celulares linfocitários

podem ser interessantes na observação do paciente portador do vírus, na condição

de assintomático ou sintomático para estudos futuros prognósticos ou de aspectos

clínicos associados à resposta imune.

2. REVISÃO DA LITERATURA

2.1 . ASPECTOS DO VÍRUS LINFOTRÓPICO DE CÉLULAS T HUMANAS

2.1.1 Estrutura e Genoma Viral

O HTLV-1 pertence à família Retroviridae, a subfamília Orthoretrovirinae e ao

género Deltaretrovirus. Apresenta-se numa conformação esférica, com 100nm de

diâmetros, composto de core central, envelope gliocoproteíco e duas fitas simples de

RNA, que necessitam de transcriptase reversa para se multiplicar.

O genoma proviral de HTLV-1 possui genes estruturais (gag, pol e env)

delimitados por sequências de repetições terminais longas (LTR). A LTR 5' serve

como o promotor viral para a transcrição. O gene pol codifica a transcriptase reversa,

endonuclease e protease. O gene gag (codifica (p19, p24) fornece as proteínas do

core do virion, e env (codifica gp46 e gp21) é utilizado para a infectividade viral. O

genoma do vírus tem uma região pX, que contém sequências reguladoras de fatores

virais (Tax, Rex, p12, p13, p30 e HBZ). (Figura 1) (GAUDRAY et al., 2002;

CAVANAGHET et al., 2006; KANNIAN, 2012; GESSAIN & MAHIEUX, 2012).

Figura 1: Representação esquemática da estrutura de uma partícula viral do HTLV-1 e da estrutura genômica do vírus. Fonte: adaptado de: LAIRMORE et al., “Mechanisms of human T-lymphotropic vírus

17

type 1 transmission and disease. Current opinion in virology, 2012; Adaptado de Matsuoka, et al. “Human T-cell leukemia virus type 1 (HTLV-1) and leukemic transformation: viral infectivity, Tax, HBZ and therapy”. Oncogene 2011.

Embora as proteínas acessórias p12, p30, p13 e HBZ sejam importantes para

a infectividade viral e replicação, não são necessários para a imortalização de

linfócitos, mas existem relatos de que a proteína viral p12, interage com cadeias

pesadas do complexo de histocompatibilidade de classe-I do humano, levando a

degradação deste último, e esse processo facilita o escape viral do sistema imune

do hospedeiro, e que a proteína HBZ parece ser indispensável para a proliferação e

sobrevivência de células ATL (LAIRMORE, 2012).

As proteínas reguladoras Tax e Rex, são essenciais para a replicação viral.

Enquanto Tax aumenta a síntese de mRNA viral pela transativação do promotor de

HTLV-1-LTR 5’, Rex controla a síntese das proteínas estruturais, a nível pós-

transcricional (JOHNSON et al., 2001).

A proteína Tax é um cofator de transcrição, que sequestra muitas vias de

sinalização relacionada à anti-apoptoses ou proliferação celular. Esta proteína viral

estimula e regula a expressão de genes virais e celulares interagindo com fatores de

transcrição celular e moléculas de sinalização que induzem a proliferação

espontânea dos linfócitos T e conseqüente produção de várias citocinas e

aumentam a expressão constitutiva de IL-2R. Mas, ao mesmo tempo, é conhecido

como um alvo principal do sistema imune do hospedeiro (YOSHIDA, 2001).

Por muito tempo, a investigação da patogênese mediada pelo HTLV-1 tem

sido focada em Tax, desde que foi vista como crítica para leucemogênese por causa

de seus efeitos pleiotrópicos, tanto viral como em genes celulares responsáveis para

a proliferação celular, instabilidade genética, a desregulação do ciclo celular e

apoptose. No entanto, a expressão de Tax não é detectada em cerca de 60% dos

casos de ATL (leucemia de Células T do Adulto) (SAITO, 2011).

Acredita-se que existe uma relação importante entre as células T CD8+ e a

proteína Tax, pois estas células parecem reconhecer diretamente a proteína Tax. Os

fatores que confirmam essa afirmação são que quando há depleção dos linfócitos T

CD8+, aumenta a expressão da Tax in vivo (HANON et al., 2000;), e quando o

inibidor de histonas, é usado na ativação da transcrição da Tax, a carga proviral do

HTLV-1 em individuos com HAM/TSP tornam-se reduzidos, assim a replicação do

18

vírus parece resultar na supressão in vivo da expressão da Tax. O resultado é que

células CTLs (células T citolíticas/linfócitos T CD8+) do hospedeiro, ativadas por

expressão a Tax, reduzem o número de células infectadas in vivo (LEZIN et al.,

2007).

2.1.2. Aspectos Epidemiológicos da infecção pelo HTLV

O tipo 1 do HTLV é o mais frequentimente observado em portadores deste

vírus, e mesmo quando isolados de regiões geográficas diversas, mantêm grande

homologia dentre os tipos (FERREIRA et al., 1997).

Essa estabilidade genética é uma característica incomum para um retrovírus.

A amplificação viral através da expansão clonal de células infectadas é a razão para

esta estabilidade genética notável. (MAHIEUX et al., 1997; VERDONCK et al.,

2007). Porém as poucas substituições de nucleotídeos observadas entre cepas do

vírus são específicas para a origem geográfica dos portadores, e não relacionada

com a patologia. Quatro principais subtipos geográficos (genótipos) têm sido

relatados, nestes incluem o: subtipo A: Cosmopolitan; subtipo B: Central African;

subtipo C: Melanesian; e subtipo D: Central African/Pygmies (GESSAIN. &

MAHIEUX, 2012).

Encontra-se maior soroprevalencia de mais elevadas no sul do Japão (18%

da população com anticorpos anti-HTLV-I circulantes) (OSAME et al., 1986) porém

está presente na região sudeste dos Estados Unidos nas ilhas do Caribe, na

América Central e na do Sul (EDLICH et al., 2003). No Brasil estima-se que 2,5

milhões de pessoas estão infectadas (PROIETTI et al., 2005).

As principais vias de transmissão do HTLV-1 são: contato sexual, transmissão

vertical e transfusão sanguínea e produtos hemoderivados. Apesar da infecção pelo

vírus se instalar principalmente na infância, o desenvolvimento da doença ocorre em

adultos após a quarta década de vida (SAGY et al., 1990).

19

2.1.3. Replicação Viral

O HTLV-1 tem sido descrito como capaz de infectar, tanto in vitro como in

vivo, um grande número de tipos celulares. Embora as células T CD4+ sejam as

células alvo primárias para transformação pelo HTLV-1, sabe-se que o este vírus

pode infectar uma grande variedade de tipos de células, incluindo células T, células

B, macrófagos, fibroblastos e células dendríticas (JONES et al., 2008).

O vírus entra em contato com as células do sistema imune,

preferencialmente, linfócitos T CD 4+ e CD8+, ligam-se ao receptor de membrana

celular, e inicia o ciclo de replicação (TAKENOUCHI et al., 2007).

Consequentemente ocorre a fusão da membrana do vírus com uma proteína

transmembrana celular, e o cerne viral é introduzido no citoplasma da célula

infectada. A transcrição do RNA viral para DNA ocorre com o auxilio da transcriptase

reversa viral, quando a transcrição estiver concluída , o core se rompe, permitindo a

entrada do DNA viral no núcleo celular e sua subsequente interação com o DNA da

célula hospedeira (LAIRMORE, 2012).

O genoma viral integrado passa a ser denominado DNA proviral, e é passível

a replicação quando a célula hospedeira sofrer mitose. A partir deste momento, no

núcleo celular, começa a síntese do RNA viral com auxilio da maquinaria celular,

utilizando como molde o provirus integrado. Então o RNA transcrito é processado

em RNAm e finalmente em genoma viral, assim as proteínas virais são sintetizadas

e ocorre o início da montagem e brotamento dos virions, que é posteriormente

direcionado a membrana celular para formação dos envelopes virais (MATSUOKA &

JEANG, 2011).

O principal mecanismo de disseminação deste retrovírus no hospedeiro é a

transmissão célula a célula, a partir de células infectadas. Isso é possível devido a

proteína viral Tax favorecer uma reprogramação na célula infectada, promovendo a

expressão de proteínas de adesão celular e produção de imunomoduladores na

célula infectada para a não infectada. Após o encontro da molécula de adesão, as

proteínas virais são transportadas por microtubos, e partículas do core viral, infectam

a nova célula (Figura 5) (JASSAL et al. 2001; DELAMARRE, et al., 1997; DERSE &

HEIDECKER, 2003).

20

2.2. CARACTERÍSTICAS DA INFECÇÃO PELO HTLV-1

2.2.1. Manifestações clínicas relacionadas à Infecção

O vírus linfotrópico de células T humanas tipo 1 (HTLV-1) é o agente

etiológico da Leucemia de células T do adulto (ATL) (HINUMA et al., 1981), da

mielopatia associada ao HTLV-I/paraparesia espástica tropical (HAM/TSP)

(GESSAIN et al, 1985; OSAME et al., 1986), da uveíte associada ao HTLV-1

(MOCHIZUKI, 1992) e de dermatites infecciosas (LA GRENADE, 1995). Atualmente

tem sido associado a uma série de manifestações clínicas, como artrites (IJICHI et

al., 1990) e polimiosites (MORGAN et al., 1989), ceratoconjutivite seca (MERLE, et

al., 1996) e doenças infecciosas como tuberculose, estrongiloidíase e escabiose

(MARINHO, et al., 2005; PORTO, et al., 2002; BRITES, et al., 2002; PEDRAL-

SAMPAIO, et al., 1997), demonstrando o caráter sistêmico desta infecção.

Relatos indicam que a infecção pode também estar associada à indução de

imunodeficiência, doenças inflamatórias crônicas persistentes e infecções

oportunistas como uveítes, artropatias inflamatórias, poliartrite, polimiosites e

pneumonia intersticial linfocítica (MOCHIZUKI et al.,1992; MOCHIZUKI et al.,1994;

MORGAN et al.,1989, NISHIOKA et al.,1992,; SANTOS et al., 2009). Tem sido

associado igualmente a uma maior prevalência de outras doenças infecciosas, como

a tuberculose, estrongiloidíase (PEDRAL-SAMPAIO et al., 1997;MARINHO et al.,

2005; PORTO, 2002), escabiose, e dermatite infecciosa em crianças (LAGRENADE

et al., 1990).

2.2.2. Patogênese

A patogenese da infecção pelo HTLV depende em parte da expansão clonal

persistente de células infectadas, que dependem principalmente do ciclo celular de

células CD4+ infectadas, e na prevenção da morte de células T CD8+. A expansão

clonal permite o armazenamento, persistência, e disseminação do vírus (ZANE,

2012).

21

Apesar de não estar totalmente definido o mecanismo patogênico desta

doença, admitem-se três hipóteses para explicar o papel do HTLV-1 no

desenvolvimento da HAM/TSP: a primeira hipótese aponta para um mecanismo de

citotoxicidade direta, onde células T citotóxicas CD8+, específicas para antígenos do

vírus, cruzariam a barreira hematoencefálica e destruiriam, por mecanismos

citotóxicos diretos ou via produção de citocinas, as células da glia infectadas pelo

HTLV-1; a segunda hipótese, denominada de autoimune, aponta para um processo

de mimetismo molecular no qual a semelhança entre uma proteína neuronal

(ribonucleoproteina nuclear heterogênea, hnRNP-A1) do hospedeiro e a mais

importante proteína do vírus, o antígeno Tax, acarretaria um processo inflamatório

de auto-imunidade com lesão neuronal; e a terceira e última hipótese, e a mais

aceita, também denominada de dano circundante ou “by stander” envolveria os

linfócitos T CD4+ infectados e os linfócitos T CD8+ específicos para a proteína viral

Tax, que juntos atravessariam a barreira hematoencefálica e produziriam grande

quantidade de citocinas pró-inflamatórias levando a um processo de intensa

inflamação e destruição tecidual. (ITOYAMA Y.,1988; LEVIN M.C., 2002; NDHLOVU

L.C., 2009; SANTOS B.S., et al, 2009).

A natureza desses fatores, e os mecanismos pelos quais eles se manifestam

precisam ficar claros. Alguns parâmetros como alta carga proviral, elevada

linfoproliferação espontânea in vitro, altos títulos de anticorpos e de linfócitos T CD8+

específicos para antígenos do HTLV-1 tanto no soro quanto no fluido cerebrospinal

parecem estar associados com a presença da manifestação neurológica (HAM/TSP).

No entanto com relação ao processo de progressão da forma clínica assintomática

para HAM/TSP, pouco se sabe, porém acredita-se ser conseqüência do

estabelecimento de mecanismos imunoprotetores, os quais de alguma maneira

conseguem criar um equilíbrio nas interações vírus-hospedeiro (PORTO et al.,

2002).

2.3. PAPEL DOS LINFÓCITOS NA INFECÇÃO PELO HTLV

Em portadores que desenvolvem HAM/TSP foi relatado um aumento da

produção de IFN-, TNF-α, GM-CSF e IL-1 (NISHIURA, Y., et al., 1996; WATANABE,

22

H., et al.,1995) e o aumento de células T CD4+ (GOON, P. K., E., et al, 2002;

GOON, P. K., E., et al, 2004; WU, et al., 2000; IWASAKI et al., 1992) e células T

CD8+ (JACOBSON, et al., 1990; ELOVAARA, et al., 1993; KUBOTA, et al., 1998;

NAGAI, et al., 2001; YAMANO, et al., 2002). Também são observados valores

reduzidos de células NK (Yu, et al., 1991; SAITO, et al., 2003; KITAJIMA, et al.,

1988) e células B (BRITO-MELO, et al., 2002). Nos indivíduos infectados com

Linfoma de Células T do Adulto (ATL) é observado um predomínio de células T

CD4+ maduras (TAKATSUKI, 2005; KARUBE, et al, 2004). Em portadores que

desenvolveram cerotoconjutivite seca (KCS) relacionado ao HTLV-1, foi relatado um

maior número de células T CD8+ em sangue periférico (PINHEIRO, et al., 2006).

Pacientes com Uveíte associada ao HTLV-1 exibem uma porcentagem elevada de

células T, tanto CD4+ quanto CD8+, em sangue periférico (MOCHIZUKI, et al.,

1992), porém apresentam um número elevado do subtipo CD4+ no olho (KIMITAKA,

et al, 1995).

3. OBJETIVOS

3.1 Geral

Avaliar entre os linfócitos periféricos, as subpopulações linfocitárias e células T

regulatórias de indivíduos infectados pelo HTLV-1.

2.2 Específicos

Quantificar subpupulações de linfócitos T (CD4+, CD8+ e CD4+CD25+Foxp3+),

linfócitos B, células NK;

Avaliar a expressão de Foxp3+ em células T CD4+CD25+

Comparar os valores de linfócitos T CD4+ e CD8+ analisados por dois reagentes de

marcação simultânea para imunofluorescência direta.

23

CAPÍTULO 1: Artigo Científico 1 :

Frequência de subtipos linfocitários periféricos e

expressão de Foxp3 na infecção pelo vírus linfotrópico de

células T humanas tipo 1 (HTLV-1).

24

4.1 INTRODUÇÃO

O vírus linfotrópico de células T humanas tipo 1 (HTLV-1) é o agente

etiológico da Leucemia de células T do adulto (ATL) (HINUMA et al., 1981), da

mielopatia associada ao HTLV-I/paraparesia espástica tropical (HAM/TSP)

(GESSAIN et al, 1985; OSAME et al., 1986), da uveíte associada ao HTLV-1

(MOCHIZUKI, 1992) e de dermatites infecciosas (LA GRENADE, 1995). Atualmente

tem sido associado a uma série de manifestações clínicas, como artrites (IJICHI et

al., 1990) e polimiosites (MORGAN et al., 1989), ceratoconjutivite seca (MERLE, et

al., 1996) e doenças infecciosas como tuberculose, estrongiloidíase e escabiose

(MARINHO, et al., 2005; PORTO, et al., 2002; BRITES, et al., 2002; PEDRAL-

SAMPAIO, et al., 1997), demonstrando o caráter sistêmico desta infecção.

O HTLV infecta cerca de 20 milhões de pessoas no mundo (EDLICH et al.,

2000), principalmente Nigéria, República Democrática do Congo, Japão, Gana,

África do Sul, Moçambique, Brasil e Peru (GERSSAIN & CASSAR 2012). O Brasil

representa uma das maiores áreas endêmicas para HTLV-1 e doenças associadas,

apresentando uma soroprevalência de 0.04 a 1%, dependendo da localização

geográfica (CATALAN-SOARES et al., 2005), com uma estimativa de 300 a 800 mil

infectados (GERSSAIN & CASSAR, 2012). No Brasil, a cidade brasileira com maior

prevalência mundial, Salvador em Bahia, apresenta uma soroprevalência de cerca

de 1,3% entre os doadores de sangue, e 1,8 % na população geral (GALVÃO-

CASTRO et al., 1997 e 2009; DOURADO, et al., 2003).

A principal célula alvo da infecção é o linfócito T CD4+ (RICHARDSON,

1990), em menor proporção os linfócitos T CD8+ (NAGAI M, et al., 2001), e células

dendríticas, (JONES, K. S., et al., 2008). Uma vez infectadas pelo HTLV-I as células

T proliferam intensamente, mesmo na ausência de estímulos exógenos, e

aumentam a expressão de IL-2R, consequentemente ocorre uma alta produção de

citocinas envolvidas na manutenção e proliferação celular como IFN-, TNF-α, IL-15

e IL-2 (YOSHIDA M., 2001; HOLLSBERG, 1999; CARVALHO, 2001). O vírus induz

25

ativação do sistema imunológico com expansão clonal de subpopulações

linfocitárias por isso possui um papel importante na regulação da resposta imune.

Em portadores que desenvolvem HAM/TSP foi relatado um aumento da

produção de IFN-, TNF-α, GM-CSF e IL-1 (Nishiura Y, et al., 1996; Watanabe H, et

al.,1995) e o aumento de células T CD4+ (GOON, P. K., E., et al, 2002; GOON, P. K.,

E., et al, 2004; WU, et al., 2000; IWASAKI et al., 1992) e células T CD8+

(JACOBSON, et al., 1990; ELOVAARA, et al., 1993; KUBOTA, et al., 1998; NAGAI,

et al., 2001; YAMANO, et al., 2002). Também são observados valores reduzidos de

células NK (Yu, et al., 1991; SAITO, et al., 2003; KITAJIMA, et al., 1988) e células B

(BRITO-MELO, et al., 2002). Nos infectados com Linfoma de Células T do Adulto

(ATL) é observado um predomínio de células T CD4+ maduras (TAKATSUKI, 2005;

KARUBE, et al, 2004). Em portadores que desenvolveram cerotoconjutivite seca

(KCS) relacionado ao HTLV-1, foi relatado um maior número de células T CD8+ em

sangue periférico (PINHEIRO, et al., 2006). Pacientes com Uveíte associada ao

HTLV-1 exibem uma porcentagem elevada de células T, tanto CD4+ quanto CD8+,

em sangue periférico (MOCHIZUKI, et al., 1992), porém apresentam um número

elevado do subtipo CD4+ no olho (KIMITAKA, et al, 1995).

A quantificação de linfócitos e suas subpopulações no sangue periférico por

citometria de fluxo tem sido utilizados no diagnóstico e acompanhamento clínico de

pacientes infectados pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV). No contexto da

infecção pelo HTLV esses biomarcadores não são utilizados na prática clínica. Os

objetivos do presente trabalho foram avaliar as subpopulações linfocitárias e células

T regulatórias em indivíduos infectados pelo HTLV-1.

4.2 MATERIAIS E MÉTODOS

4.2.1 POPULAÇÃO DE ESTUDO

Cinquenta e cinco indivíduos infectados com HTLV-1 (diagnosticados por

ELISA anti HTLV I/II+ e confirmados por Western Blot para HTLV+) do Centro de

HTLV do Ambulatório Docente Assistencial da Bahiana (ADAB) foram incluídos no

26

estudo. Os pacientes foram incluídos sequencialmente, no momento da consulta

médica, independente dos sintomas de doença. Amostras de sangue de 80

indivíduos soronegativos para HTLV do Laboratório de Patologia Clínica do ADAB

foram incluídos no grupo controle. Foram excluídos os participantes que

apresentaram soropositividade para HIV, HCV ou HBV. Este subprojeto faz parte de

um projeto maior, realizado pelo grupo de HTLV da ADAB, com aprovação no CEP-

207/2009 – CPqGM/FIOCRUZ (ANEXO A). Todos os participantes voluntários

assinaram previamente o termo de consentimento livre e esclarecido (ANEXO B).

4.2.2 IMUNOFENOTIPAGEM LINFOCITÁRIA

Amostras de sangue foram coletadas em tubo contendo EDTA, e dentro de 24

horas, foram marcadas com anticorpos monoclonais conjugados a fluorocromos

para identificação dos antígenos de superfície celular da linhagem de linfócitos B

(CD19+), linhagem linfócitos T totais (CD3+), linfócitos T CD4+ (CD3+CD4+CD8-),

linfócitos T CD8+ (CD3+CD8+CD4-), células NK (CD56+CD3-), de acordo com

recomendações dos kits Lymphogram® (Cytognos) e Tritest® (BD Biosciences)

(Tabela 1). Foi utilizado solução de lise Excellyse® (Exbio) para a remoção de

eritrócitos.

Para quantificação de Linfócitos T regulatórios utilizou-se anticorpos anti-CD3,

anti-CD4, anti-CD25 e anti-Foxp3 (todos BD Biosciences) conjugados a

fluorocromos, juntamente com solução fixadora e solução permeabilizante (ADG –

Andergrub & FixPerm).

As amostras marcadas foram adquiridas imediatamente após a marcação no

citômetro FACSCalibur (BD Biosciences- Immunocytometry Systems, San Diego,

CA, USA) utilizando-se o programa FACScomp (BD). A aquisição de cada amostra,

pelo software CellQuest (BD), foi finalizada após 20000 eventos terem sido

processados. As análises das aquisições foram feitas pelo software CellQuest (BD) e

pelo Summit (Dako).

27

Tabela 1: Composição dos anticorpos monoclonais e fluorocromos utilizados como reagentes de kits para quantificação de subpopulações linfocitárias.

Anticorpo Monoclonal X Fluorocromo

Lymphogram Tritest Linf. T Regulatórios Anti-CD3PE Anti-CD3PerCP Anti-CD25APC

Anti-CD4PECy5 Anti-CD4FITC Anti-CD3PECy5 Anti-CD8FITC Anti-CD8PE Anti-CD4FITC Anti-CD56PE Anti-Foxp3PE

Anti-CD19FITC

R-ficoeritrina (PE), R-ficoeritrina - cianina 5 (PECy5), isotiocianato de fluoresceína (FITC), proteina clorofila peridinina (PerCP), Aloficocianina (APC)

4.2.2.1 Análises das aquisições das células marcadas com kit

Lymphogram®

As análises das aquisições foram realizadas de acordo com Figura 2. Para

seleção da população de interesse, realiza-se seleção denominada “estratégia de

gate”, considerando-se tamanho e estrutura dos eventos, bem como a expressão de

moléculas de superfície. O kit Lymphogram® foi utilizado para quantificação relativa

das subpopulações linfocitárias.

Para o cálculo dos valores absolutos das subpopulações por microlitro de

sangue, indicado pelo fabricante, foi utilizado o reagente PerfectCount

Microspheres™ (Cytognos, Salamanca, Espanha), considerando-se o número de

microesferas por microlitro, fornecido pelo fabricante, conforme formula abaixo:

Fonte: bula do kit Lymphogram (Cytognos)

28

Figura 2: Critério de análise das subpopulações linfocitárias pelo kit Lymphogram®. A-seleção por

gate da população de linfócitos totais para o estudo (tamanho-FSC versus granulosidade-SSC); B-

Dot plot de purificação/identificação (FL-FITC versus FL-PE); C- identificação de CD3+ através da

análise de FSC versus padrão de fluorescência (CD56/CD3PE

); D- identificação de CD3+ através da

análise do padrão de fluorescência CD56/CD3PE versus CD4/PECy5; E- identificação de CD8+,

CD56+ e CD19

+ através da análise do padrão de fluorescência CD56/CD3PE versus CD8/CD19FITC.

A distribuição das células é avaliada de acordo com intensidades de fluorescência emitidas pela

ligação dos anticorpos monoclonais específicos, em ambos os eixos.

4.2.2.2 Análises das aquisições das células marcadas com kit Tritest®

Reagente de imunofluorescência composto por anticorpos monoclonais usado

com tubos de contagem absoluta contendo microesferas, para identificar e

determinar contagem absoluta de célula/µL de linfócitos T maduros humanos. As

análises das aquisições foram realizadas de acordo com Figura 3.

29

Figura 3: Critério de análise das subpopulações linfocitárias pelo kit Tritest®. A observa-se a

população de linfócitos totais para o estudo (CD3PerCP

versus granulosidade-SSC); B os subtipos de

linfócitos CD3+ (CD4

FITC versus CD8

PE).

4.2.3 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS

O projeto foi aprovado no CEP-207/2009CPqGM/FIOCRUZ. (Anexo A) Os

pacientes foram convidados a participar do estudo, sendo informados sobre o

objetivo desta pesquisa e assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

(Anexo B). A coleta da amostra de sangue, realizada na rotina durante o seu

atendimento e exames realizados no setor de coleta do laboratório, não implicou em

riscos adicionais à saúde dos pacientes.

Todas as informações coletadas foram mantidas sob sigílo, e armazenadas

em bancos de dados protegidos, acessíveis apenas aos investigadores. Os

resultados obtidos serão publicados sob a forma de artigos científicos em revistas

especializadas e comunicações em congressos. A identidade dos participantes será

preservada.

4.2.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Foi realizada a análise estatística descritiva. Para verificação de normalidade

dos dados, foram aplicados os testes de Kolmogorov-Smirnov, e teste t para

comparar os grupos. Para correlação dos reagentes de imunofluorescência, foi

30

aplicado teste de Spearman. Todas as análises/gráficos foram feitas com o software

GraphPad Prism 6.0 para Windows. Todos os dados estão apresentados em média

e desvio padrão. O intervalo de confiança para os testes estatísticos foi definido em

95% (p<0,05).

4.3 RESULTADOS

CARACTERÍSTICAS DA POPULAÇÃO ESTUDADA

Foram incluídos 135 indivíduos, dos quais 55 soropositivos para HTLV-1, sendo

84% do sexo feminino, com idade média de 43 ±13 anos; e 80 indivíduos

soronegativos para HTLV-1, sendo 79% do sexo feminino, com idade média de 47

±12 anos. Quarenta e sete por cento dos pacientes infectados pelo HTLV-1, eram

recém-matriculados (1ª consulta) no centro de HTLV/ADAB-EBMSP, e 53% já

realizavam acompanhamento por mais de 1 ano (Tabela 2).

Os resultados de leucócitos totais, neutrófilos e linfócitos dos dois grupos de

estudo estão representados na tabela 3. Observou-se um valor menor do número de

neutrófilos em pacientes infectados pelo HTLV-1: 3662±1743 céls/µl, comparado aos

valores obtidos em indivíduos não infectados: 4637±2250 céls/ul (p = 0,0117).

Tabela 2: Características clínicas e epidemiológicas da população estudada.

Infectados pelo HTLV Controles não infectados

N=55 N=80

Idade (MÉDIA±DP) 44 (±13) 47 (±12)

Sexo 16% Sexo Masculino 21% Sexo Masculino 84% Sexo Feminino 79% Sexo Feminino

* Primeira consulta; DP=Desvio Padrão.

31

Tabela 3: Aspectos leucometricos dos participantes voluntários soropositivos para HTLV e

soronegativos.

Infectados pelo HTLV Controles não infectados

N=55 N=80

Leucócitos Totais* (cél/µL) 6464 ±2464

7618 ±2528

Neutrófilos* (cél/µL) 3662 ±1743

4637 ±2250

(%) 54 ±10 57 ±12

Linfócitos Totais (cél/µL) 2306 ±903 2377 ±660

(%) 36 ±9 33 ±10

Nota: Os resultados estão representados em média±desvio padrão. * Estatísticamente significante

p<0,05 (teste t).

32

ANÁLISE DAS SUBPOPULAÇÕES LINFOCITÁRIAS

Observou-se um aumento estatisticamente significante na média de linfócitos

T totais (CD3+) (1708±795 células/µL) nos indivíduos infectados, comparado ao

grupo controle (1440±531 células/µL) (p = 0,0221). Na análise dos valores relativos,

verificou-se média de 75±9% da frequência de linfócitos T CD3+ em infectados e

67±8% nos controles (p<0,0001) (Figura 4 e Tabela 4). Todos os resultados deste

estudo encontram-se representados em tabela no Apêndice C.

Figura 4: Representação gráfica das médias±DP dos valores absolutos (gráfico da esquerda) e

relativos (gráfico da direita) de linfócitos T totais (CD3+) em indivíduos infectados pelo HTLV e

controles (não infectados/soronegativos). Amostras de 55 pacientes infectados e 80 controles foram

quantificadas utilizando os reagentes para teste de imunofluorescendia direta Lymphogram® e

Perfect Count® (ambos Cytognos) por citometria de fluxo. (Significância estatística p<0,05; test t).

Tabela 4: Valores de linfócitos T totais (CD3

+), representado em Média± Desvio Padrão, e o valor de

p.

33

A média de linfócitos T CD4+ foi 1103±665 células/µL + em indivíduos

infectados, e 882±354 células/µL nos controles (p= 0,0138). O mesmo aumento foi

observado nos valores relativos, a média de porcentagem de linfócitos T CD4+ foi

47±10% em infectados e 42±8% nos controles, (p = 0,0006) (Figura 5 e Tabela 5).

Figura 5: Representação gráfica das médias±DP dos valores absolutos (gráfico a esquerda) e relativos (gráfico á direita) de de linfócitos T CD4

+ em indivíduos infectados pelo HTLV e controles

não infectados. Amostras de 55 pacientes infectados e 80 controles foram quantificadas utilizando os reagentes para teste de imunofluorescendia direta Lymphogram® e Perfect Count® (ambos Cytognos) por citometria de fluxo. (Significância estatística p<0,05; test t). Tabela 5: Valores de linfócitos T CD4+, representado em Média± Desvio Padrão, e o valor de p.

34

Na quantificação de linfócitos T CD8+ foi observado um maior número de

células (média de 548±261 células/µL) nos infectados pelo HTLV-1, comparados aos

soronegativos (467±205 células/µL) (p= 0,0476). Na análise dos valores relativos

observou-se uma presença de 24±8% de linfócitos T CD8+ nos infectados, e 21± 6%

nos controles (p=0,0196) (Figura 6 e Tabela 6).

Figura 6: Representação gráfica das médias±DP dos valores absolutos (gráfico a esquerda) e relativos

(gráfico a direita) de linfócitos T CD8+ em indivíduos infectados pelo HTLV e controles não infectados.

Amostras de 55 pacientes infectados e 80 controles foram quantificadas utilizando os reagentes para teste de imunofluorescendia direta Lymphogram® e Perfect Count® (ambos Cytognos) por citometria de fluxo. (Significância estatística p<0,05; test t).

Tabela 6: Valores de linfócitos T CD8+,

representado em Média± Desvio Padrão, e o valor de p.

35

A razão entre linfócitos CD4+/CD8+ não apresentou diferença nos grupos

infectado pelo HTLV-1 (2,2±1,2) e controle (2,0±0,7) (p= 0,2629) (Figura 7).

Figura 7: Representação gráfica das médias±DP da razão entre linfócitos T CD4+/CD8

+ em indivíduos

infectados e controles negativos. Amostras de 55 pacientes infectados e 80 controles foram quantificadas utilizando os reagentes para teste de imunofluorescendia direta Lymphogram® e Perfect Count® (ambos Cytognos) por citometria de fluxo. (Significância estatística p<0,05; test t).

36

A contagem média de células NK nos indivíduos infectados pelo HTLV-1 (308±204

células/µL) foi inferior à média dos controles não infectados (383±216 células/µL)

(p=0,0463). Na análise dos valores relativos, verificou-se uma contagem de 14±8%

dessas células em infectados e 18±8% nos controles (p=0,0012) (Figura 8).

Figura 8: Representação gráfica das médias±DP dos valores absolutos (gráfico a esquerda) e

relativos (gráfico a direita) de células NK em indivíduos infectados e controles negativos. Amostras de

55 pacientes infectados e 80 controles foram quantificadas utilizando os reagentes para teste de

imunofluorescendia direta Lymphogram® e Perfect Count® (ambos Cytognos) por citometria de fluxo.

(Significância estatística p<0,05; test t).

Tabela 7: Valores de células Natural Killer, representado em Média± Desvio Padrão, e o valor de p.

37

Não foram observadas diferenças do número absoluto de linfócitos B entre os

indivíduos infectados pelo HTLV-1 (237±122 células/µL) e os controles não

infectados (276±157 células/µL) (p=0,1291). No entanto, uma diferença significante

foi obtida nos valores relativos de linfócitos B. Observou-se uma média de 11±5% de

linfócitos B nos indivíduos infectados e 14±7% nos controles não infectados

(p=0,0565) (Figura 9 Tabela 8).

Figura 9: Representação gráfica das médias±DP dos valores absolutos e relativos de linfócitos B em

indivíduos infectados e controles negativos. Amostras de 55 pacientes infectados e 80 controles

foram quantificadas utilizando os reagentes para teste de imunofluorescendia direta Lymphogram® e

Perfect Count® (ambos Cytognos) por citometria de fluxo. (Significância estatística p<0,05; test t).

Tabela 8: Valores de linfócitos B, representado em Média± Desvio Padrão, e o valor de p.

38

Na avaliação da subpopulação de células T CD4+ foram quantificadas células

com fenótipo CD3+CD4+CD25+ e dessas, as que expressavam Foxp3+, em 34

indivíduos infectados e 64 controles. Observou-se uma maior contagem de células T

CD3+CD4+CD25+ em indivíduos infectados pelo HTLV-1 (7,2±6,1%) comparados à

média (3,7±1,3%) em controles não infectados (p< 0,0001). A expressão de Foxp3

nesta subpopulação foi inferior nos pacientes infectados pelo HTLV-1 (18,2±19,6%)

comparados aos controles não infectados (44,3±30,5%) (p< 0,0001) (Figura 10).

Figura 10: Representação gráfica das médias±DP dos valores relativos de de linfócitos T

CD3+CD4+CD25+ e análise da expressão de Foxp3 nesta subpopulação linfocitária em infectados

pelo HTLV-1 e controles negativos. Amostras de 46 pacientes infectados e 64 controles foram

quantificadas utilizando os reagentes para teste de imunofluorescendia direta por citometria de fluxo.

(Significância estatística p<0,0001; test t).

Tabela 9: Médias±DP dos valores relativos das células T regulatórias.

Infectados pelo

HTLV-1

Controles Não

infectados

Valor de P

N=46 N=64

CD3+CD4+CD25+ 7,2±6,1 3,7±1,3 p< 0,0001

CD3+CD4+CD25+Foxp3+ 18,2±19,6 44,3±30,5 p< 0,0001

Média da porcentagem. Significância estatística p<0,0001; test t

39

Foram feitas análises de 36 dos indivíduos infectados e 70 dos indivíduos

controles pelo método Tritest®. A média de valores de linfócitos CD3+, linfócitos

CD4+ e linfócitos CD8+ obtida com o Lymphogram® desses 36 indivíduos infectados

foi semelhante à obtida pelo Tritest® (Tabela 10). Houve uma boa correlação de

Spearman entre a contagem de linfócitos Tpelo Lymphogram® e Tritest® (Figura

11).

Tabela 10: Dados (médias±DP) dos valores absolutos (cél/μL) e relativos (%) dos linfócitos T CD3+, CD4+, CD8+,

de indivíduos infectados pelo HTLV-1 e não infectados, quantificados por citometria de fluxo utilizando Lymphogram® e Triste®, seus respectivos valores de P (significância) e r (Correlação). E médias±DP dos valores

absolutos (cél/μL) e relativos (%) de células NK e linfócitos B, de indivíduos infectados pelo HTLV-1 e não infectados, quantificados por citometria de fluxo utilizando Lymphogram, seus respectivos valores de P (significância).

LYMPHOGRAM TRITEST

Infectados pelo HTLV-1

N=36

Controles Não

infectados N=70

Valor de P Infectados pelo HTLV-1

N=36

Controles Não

infectados N=70

Valor de P

Linfócitos CD3+ Cél/µL 1642±647 1576±569 P = 0,0221 1322±625 1404±566 P<0,0001

% 73±9 68±8 P < 0,0001 58±13 60±9 -

Linfócitos CD3+CD4+ Cél/µL 1027±428 940±359 P = 0,0138 802±406 788±323 P<0,0001

% 46±10 41±7 P = 0,0006 60±9 56±9 -

Linfócitos CD3+CD8+ Cél/µL 532±237 535±250 P = 0,0476 433±233 505±266 P<0,0001

% 24±6 23±6 P = 0,0196 33±8 35±8 -

Células NK (CD56+CD3-) Cél/µL 414±247 456±257 P = 0,0463 - - -

% 18±7 20±8 P = 0,0012 - - -

Linfócitos B (CD19+CD3-) Cél/µL 228±117 298±153 P = 0,1291 - - -

% 10±5 13±4 P = 0,0565 - - -

40

Figura 11: Valores absolutos de células CD3+, CD4

+ e CD8

+ por citometria de fluxo utilizando Lymphogram®/

(Cytognos) e Tritest®(BD) em 36 indivíduos infectados pelo HTLV-1, e 70 indivíduos controles. (Correlação por

Spearman e Significância por Wilcoxon test).

41

4.4 DISCUSSÃO

Os valores de linfócitos T obtidos do grupo controle no presente estudo foram

semelhantes aos valores descritos em populações de doadores de sangue e de

laboratório de hematologia quantificados com Lymphogram (GIUSTOLISI, et al.,

2001; e BELLIDO, et al., 1998) e aos valores em doadores de sangue descrito com o

Tristet (TORRES et al., 2013) (Apendice A). Nossas análises mostraram que

indivíduos infectados pelo HTLV-1 apresentam uma contagem de células T CD4+ e

CD8+ elevada e valores menores de células NK, quando comparados aos controles

não infectados. A razão entre linfócitos CD4+/CD8+ foi semelhante nos dois grupos,

indicando que os indivíduos infectados apresentam valores proporcionalmente

elevados de células T CD4+ e CD8+ nos portadores de HTLV. Os valores obtidos no

presente estudo forama semelhantes aos encontrados por Brito-Mello e col. (2002),

que avaliaram 74 indivíduos infectados pelo HTLV-1 utilizando diferentes paines

para quantificação das subpopulações celulares. Diferindo em parte do resultado

obtido por Sóuza e col. (2003), que observou uma relação CD4/CD8 menor no grupo

soropositivo sintomático, porém sem significância estatística. No entanto devemos

levar em consideração que o grupo de indivíduos infectados do presente estudo é

heterogêneo no que se refere a sintomatologia.

Copeland e Heeney (1996) sugerem que frequências mais elevadas de células

T CD8+ em pacientes HAM/TSP estejam relacionadas com a carga proviral elevada,

o que não é observado em pacientes com ATL. Resultados de Ndhlovu e col.

(2011), entre indivíduos infectados pelo HTLV-1, na população brasileira, mostraram

uma proporção significativamente elevada de células T CD4+, e níveis

significativamente baixos de células T CD8+ em indivíduos que desenvolveram

HAM/TSP, quando comparados a infectados sem HAM/TSP e não infectados. Porto

e col. (2002) sugerem também que células T CD8+ estão elevadas em indivíduos

infectados pelo HTLV-1 (com HAM/TSP e em assintomáticos), levando a uma razão

CD4+/CD8+<1,0. Essas observações apontam que a razão CD4+/CD8+ está

diretamente relacionada à manifestação clínica da infecção e a carga proviral. Para

esclarecer os resultados conflitantes de análise imunofenotípica de células T de

indivíduos soropositivos para HTLV são necessários análises dessas células

42

relacionando as manifestações clínicas e carga proviral, e adicionalmente estudos

qualitativos dessas subpopulações.

No presente estudo as médias das contagens de células NK de indivíduos

infectados pelo HTLV foram menores que a média do grupo controle. O estudo de

Brito-Mello e col. (2002) mostram também uma contagem de células NK (fenótipo

CD16+CD3-) menor em indivíduos infectados pelo HTLV-1 com HAM/TSP quando

comparado aos grupos assintomático, oligosintomático e não infectado. Norris e col.

mostram que além de células T, as células NK, também sofrem proliferação

espontânea significativa em indivíduos infectados pelo HTLV-1, e sugerem que a

proliferação espontânea de células NK está positivamente correlacionada com a

carga proviral (Apendice D).

Os valores delinfócitos B dos indivíduos infectados pelo HTLV-1 do presente

estudo foram menores que o intervalo de referência do Lymphogram®, observou-se

que as médias de células B de indivíduos infectados do nosso estudo foram

menores que os valores dos não infectados e dos valores indicados pelo kit. Porém

sem significância estatística. Morbach e col. (2010) numa população de 32

indivíduos com idades entre 26 e 50 anos, da Würzburg (Alemanha), sugerem como

valor de referência para linfócitos B (CD19+) a mediana dos valores absolutos 199

(169–271) cél/µL, dos valores relativos 9,2 (7,2–11,2)%. Portanto estes dados não

são indicados como referência para a população brasileira, visto que os valores

médios dessas células em indivíduos controles também são mais baixos que os

valores propostos por Morbach e col. (2010). Para ser aplicado clinicamente são

necessários maiores estudos a respeito dos valores de referencia desta célula na

população brasileira.

Com o Lymphogram® pode-se indenficar e quantificar os linfócitos T CD3+

pelo perfil de intensidade de fluorescência, que se observa na graficação dos

resultados, de acordo com a expressão dessa molécula nas células, por este

reagente pode-se identificar duas moléculas em único canal, observando a diferença

da intensidade de fluorescência entre as células. Algumas células NK expressam a

molécula CD3+, sendo denominadas células NKT. No Lymphogram® as células NKT

são localizadas no gate de células que apresentam CD56, sendo incluídas no grupo

de células NK, possibilitando uma determinação do valor de CD3+ mais exato. Por

43

outro lado, com o Tritest não se pode diferenciar as células NKT, é identificado CD3

total sem considerar a coexpressão de CD56.

No presente estudo, os indivíduos infectados pelo HTLV-1 apresentaram

menor número de leucócitos totais e neutrófilos em relação aos controles não

infectados, porém os valores médios da contagem absoluta e relativa de linfócitos

totais no sangue periférico não diferiram de forma significativa entre os grupos,

estando os dois grupos dentro dos limites de normalidade. Sóuza e col. (2003) em

população de doadores de sangue, no Ceará, com 35 indivíduos soropositivos para

HTLV e 26 controles observou uma contagem média maior de neutrófilos no grupo

soropositivo sintomático, embora sem neutrofilia, comparado aos grupos

assintomático e não infectado, assim como os valores médios da contagem de

linfócitos, porém ambos não alcançaram diferença significativa entre os grupos.

Porém Brito-Mello e col. (2002) anteriormente não observaram diferença significativa

no número de leucócitos totais, neutrófilos e linfócitos totais entre indivíduos

infectados e não infectados.

Estudos têm demonstrado uma redução significante na expressão de Foxp3

nas células T em várias doenças auto-imunes (SAKAGUCHI et al., 2006). Nossos

resultados mostram uma menor expressão da proteína Foxp3 em células T

CD3+CD4+CD25+ em indivíduos infectados pelo HTLV quando comparados aos

não infectados, mesmo apresentando uma frequência significativamente maior de

células T CD3+CD4+CD25+ nos infectados. Yamano e col. (2005) demonstraram a

redução da expressão de Foxp3 e outros biomarcadores em células T CD4+CD25+

de indivíduos infectados pelo HTLV-1 com HAM/TSP. Em 2009, os mesmos autores,

sugerem que o aumento da expressão do gene viral tax estaria associado à

diminuição da expressão de Foxp3+ em células T CD4+CD25+ em infectados com

HAM/TSP.

Adicionalmente, Sakaguchi e col. (2008) atentam que em indivíduos sadios,

as células T regulatórias são capazes, entre outras funções, de suprimir a

proliferação e produção de citocinas tanto de células T CD4+ quanto de células T

CD8+. Yamano e col. mostraram que células T CD4+CD25+ de pacientes HAM/TSP

mostraram baixa expressão de CD38, CD62L, CD69, CTLA-4, e GITR comparado a

células de indivíduos saudáveis, e diminuição na expressão de CD45RA, e um

44

aumento na expressão de CD45RO em células T CD4+CD25+ de pacientes

HAM/TSP, sugerindo que há alguma relação entre a redução dessas moléculas, em

particular GITR e CTLA-4, e a função de células T regulatórias em pacientes com

HAM/TSP. Sendo assim, mais estudos são necessários para pesquisa desses

subtipos celulares com biomarcadores de função, correlacionado a carga proviral,

expressão de Tax e manifestações clínicas.

4.5 CONCLUSÃO

Com base nos resultados, observamos que indivíduos infectados pelo HTLV-1

apresentam uma contagem de células T CD4+ e CD8+ maior, e valores menores de

células NK, quando comparados aos controles não infectados. Apesar de não

apresentar diferenças estatísticas nos valores de linfócitos B entre os dois grupos,

fica a indicação da a necessidade de estudos de padronização quantitativa dessas

células, bem como de células NK, na população brasileira. No presente estudo, a

observação da baixa expressão do regulador da transcrição gênica (Foxp3) em

células com fenótipo CD3+CD4+CD25+, pode-se inferir necessidade de estudos

voltados para este grupo de células, que pode estar relacionada em um mecanismo

fundamental para a compreensão da patogenicidade celular pelo HTLV-1.

45

4.6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS BELLIDO, M. et al. Rapid and simple immunophenotypic characterization of lymphocytes using a new test. Haematologica; vol.83:681-685, 1998. BIDDISON, W.E., KUBOTA, R., KAWANISHI, T., TAUB, D.D., CRUIKSHANK, W.W., CENTER, D.M., CONNOR, E.W., UTZ, U., JACOBSON, S. Human T cell leukemia virus type I (HTLV-I)-specific CD8+ CTL clones from patients with HTLV-I-associated neurologic disease secrete proinflammatory cytokines, chemokines and matrix metalloproteinase. J.Immunol., v.159, n.4, aug. p2018-25. 1997. BRITO-MELLO, G.E.A., et al. Phenotypic Study of Peripheral Blood Leucocytes in HTLV-I-Infected Individuals from Minas Gerais, Brazil. Scand. J. Immunol. v.55, p. 621 – 628, 2002. CARVALHO, E. M., BACELLAR, O., et al. Cytokine profile and immunomodulation in asymptomatic human T-lymphotropic virus type 1-infected blood donors. J Acquir Immune Defic Syndr 27(1): 1-6, 2001. CASTRO, B. HTLV-I in the general population of Salvador, Brazil: a city with African ethnic and sociodemographic characteristics. J. Acquir. Immune. Defic. Syndr., v.34, n.5, Dec, p. 527-31. 2003. CASTRO-COSTA, C. M; et al. Proposal for Diagnostic Criteria of Tropical Spastic Paraparesis/HTLV-I-Associated Myelopathy (TSP/HAM). Aids Research And Human Retroviruses, v. 22, n. 10, pp. 931–935, 2006. COPELAND, K.F. T; HEENEY, J. L. T Helper Cell Activation and Human Retroviral Pathogenesis. Microbiological Reviews, v. 60, n. 4, p. 722–742, 1996. DELAMARRE, L., ROSENBERG, A.R., et al. A novel human T-leukemia virus type 1 cell-to-cell transmission assay permits definition of SU glycoprotein amino acids important for infectivity. J. Virol. v.71, 1997. DOURADO I., et al. HTLV-I in the general population of Salvador, Brazil\: a city with African ethnic and sociodemographic characteristics. J Acquir Immune Defic Syndr 34: 527–531, 2003. DOURADO, I., ALCANTARA, L.C., BARRETO, M.L., DA GLORIA TEIXEIRA, M., GALVÃO- DUYNE, R. V; et al. Localization and Sub-Cellular Shuttling of HTLV-1 Tax with the miRNA Machinery. PLoS ONE, v. 7 | Issue 7 | e40662; July 2012. EDLICH, R.F., ARNETTE, J.A., WILLIAMS, F.M. Global epidemic of human T-Cell lymphotropic virus type-I (HTLV-I). J. Emerg. Med., v. 18, n.1, Jan, p.109-19, 2000.

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5. CONCLUSÃO GERAL

Nossas análises quantitativas mostraram que indivíduos infectados pelo

HTLV-1 apresentam uma contagem de células T CD4+ e CD8+ maior, porém

proporcinal nas duas células, e valores menores de células NK, quando comparados

aos controles não infectados. Apesar de não apresentar diferenças estatísticas nos

valores de linfócitos B entre os dois grupos, atentamos para a necessidade de

estudos de padronização quantitativa dessas células, bem como de células NK, na

população brasileira.

Destacamos a observação da baixa expressão do regulador da transcrição

gênica (Foxp3) em células com fenótipo CD3+CD4+CD25+, atentando para

necessidades de estudos voltados para este grupo células, que pode estar

relacionada em um mecanismo fundamental para a compreensão celular HTLV-1

patogenicidade.

Nossos resultados indicam que o Lymphogram® pode ser utilizado em

diferentes contextos de investigação, como o diagnóstico e monitoramento na

infecção pelo HTLV-1. A investigação de biomarcadores por citometria de fluxo é

uma técnica estabelecida na enumeração das subpopulações de linfócitos T para a

monitorização de pacientes com vírus da imunodeficiência humana (HIV). As

vantagens na utilização deste reagente é identificação simultânea, rápida e de baixo

custo das quatro principais subpopulações linfocitárias, porém é uma limitação do

reagente a dificuldade de identificação das células NKT, pois o anticorpo anti-CD3+

e o anti-CD56+ utilizam o mesmo fluorocromo, o R-ficoeritrina (PE). Essa limitação

pode ser solucionada, adicionanda anti-CD3+ conjugado ao fluorocromo

Aloficocianina (APC), para detecção intracelular de CD3+. Nossos resultados

corroboram com Giustolisi e col. e Bellido e col., que ao comparar imunofenotipagem

linfocitária realizada por painel de citometria de fluxo convencional e o

Lymphogram®, também mostraram que não haviam discrepâncias na

imunofenotipagem entre dois métodos.

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61

APÊNDICE A

Médianas dos valores absolutos de células T totais, T CD4+ e T CD8+ de indivíduos infectados pelo HTLV e controles não-infectados do presente estudo, e medianas encontradas por Torres e col. em 2013, incluindo no estudo 645 doadores adultos e 280 crianças saudáveis de 280 voluntários (148 na Bahia e 132 no Rio de Janeiro), utilizando o kit Multitest (Becton Dickinson Immunocytometry Systems,)+Trucount tubes, e analisando os anticorpos anti-CD3+, anti-CD8+, anti-CD45+ e anti-CD4+.

HTLV-1 Controles TORRES 2013 Não

infectados

Lymphogram Tritest Lymphogram Tritest Multitest

CD3+ 1642 1322 1576 1404 1585 CD4+ 1027 802 940 788 931 CD8+ 532 433 535 505 541

APÊNDICE B

Médias [mínimo e máximo] dos valores relativos de células T totais, T CD4+, TCD8+, células NK e linfócitos B de indivíduos infectados pelo HTLV-1 do presente estudo (segunda e terceira colunas), médias [mínimo e máximo] dos valores relativos de linfócitos T descritos por Torres e col. (quarta coluna) e médias [mínimo e máximo] dos valores relativos do intervalo de referência indicado Lymphogram® (última coluna).

Infectados HTLV

Não infectados HTLV

Torres et al.

Intervalo de Referencia Lymphogram®

CD3 74,88 [39,6-92,0] 67,75 [42,5-86,3] 77,9 76.6 [50,8-88,7]

CD3+CD4+CD8- 47,24 [21,3-76,6] 41,68 [28,0-64,1] 42,2 48.1 [24,4-67,1]

CD3+CD4-CD8+ 24,47 [9,6 - 51,0] 21,75 [11,0-34,0] 25,4 23.7 [12,6-53,6]

CD56+CD3- 13,83 [3,2 - 35,9] 18,43 [4,3 - 43,4] ----- 9.7 [2,07-24,4]

CD19+CD3- 10,8 [3,2 - 23,6] 13,8 [4,0 – 57,0] ----- 13.0 [4,98-25,5]

62

APÊNDICE C

63

Médias±DP dos valores relativos células T totais, T CD4+, TCD8

+, células NK e linfócitos B de

indivíduos infectados pelo HTLV-1 do presente estudo (primeira e segunda colunas), E médias±DP dos valores relativos de linfócitos T, NK e B descritos por Brito-Mello e col. (2002) (terceira, quarta, quinta e sextacolunas), em 74 indivíduos infectados pelo HTLV-1(18 assintomáticos,14 oligossintomáticos e 42 HAM/TSP definido) com 32 controles.

APÊNDICE D

64

ANEXO

65

ANEXO B

Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

Projeto de Investigação:

Biomarcadores imunológicos no monitoramento da infecção pelo HTLV-1

Pesquisadores Responsáveis: Dra Maria Fernanda Rios Grassi

Médico Responsável: Dr. Bernardo Galvão

Prezado paciente:

O Sr(a) está sendo convidado para participar desta pesquisa que pretende verificar se pacientes

infectados pelo HTLV apresentam alguma diferença na atividade das células do sangue. A infecção pelo

vírus chamado HTLV-1 pode causar dois tipo de doença: uma leucemia (câncer de glóbulos brancos do

sangue) ou uma doença do sistema nervoso, que causa paralisia, porém muitas pessoas não apresentam

nenhuma doença. Este estudo pretende buscar diferenças nos exames das pessoas que são infectadas

por esse vírus e tem manifestações diferentes (tem doença ou não tem nenhum sintoma). Nesse

sentido, acreditamos que esse estudo poderá ser contribuir para que no futuro os pacientes possam ser

tratados antes de manifestarem a doença.

Para que isso seja possível realizar esta pesquisa pedimos a doação de uma amostra de sangue para

realizar exames de laboratório, sorologia (HIV, virus das hepatites C e B) e para ensaios de pesquisa das

células de defesa. Essas amostras serão obtidas no momento em que exames de sangue forem

necessários para o seu próprio acompanhamento clínico. Aproveitaremos o pedido de coleta de sangue

para o exame de rotina, e solicitaremos ao laboratório que retire um pouco a mais (25ml, cerca de 5

colheres de sopa) para esta pesquisa. Esta doação ocorrerá apenas uma vez. Assim sendo, o número de

vezes que o sangue será retirado não será maior do que o realmente necessário para o

acompanhamento de rotina e não será necessário vir ao Centro médico apenas com o objetivo de

participar da pesquisa.

A coleta de sangue será realizada por um profissional treinado, entretanto pode ocorrer uma dor ligeira

e um pequeno sangramento no local da picada, ficando o braço roxo. Esta mancha desaparece dentro

de 1 a 2 dias. Será realizada igualmente a coleta do líquido da coluna por um médico experiente. Para o

exame, o Sr (a) estará deitado (a) de lado, com o pescoço para baixo e as pernas encolhidas. O médico

limpa a coluna e anestesia o local e coloca a agulha de punção entre a quarta e a quinta vértebras

lombares. O líquido drenado é colocado nos tubos de ensaio e enviado para o laboratório para análise.

Após o exame, o médico comprime o local com as mãos e coloca um bandaid. Depois do exame a pessoa

pode ter dor de cabeça, 12 horas a 2 dias depois. Pode haver também dor na nuca e coluna, dormência

nas pernas, rigidez do pescoço, vômitos e náuseas, visão turva, tonturas, vertigem ou zumbido. TODOS

esses sintomas melhoram com medidas simples como ficar em deitar e beber muito líquido. Este exame

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só será realizado se o médico detectar alterações no sistema nervoso qu precise ser diagnosticada com

este exame.

A sua participação neste estudo é voluntária e espontânea. A sua assistência médica não será

modificada em função da sua aceitação ou não em participar deste estudo. Também não envolverá

nenhum custo adicional. Caso necessite regressar ao hospital por razões ligadas ao estudo, suas

despesas com transporte e alimentação serão pagas pelos responsáveis pela pesquisa.

Além disso, você poderá desistir de participar a qualquer momento sem que isto interfira no tratamento

futuro neste hospital. O material obtido de sua amostra de sangue (plasma e células) será utilizado

apenas neste estudo. Toda a informação obtida ou disponibilizada neste estudo será considerada como

sigilosa de modo a garantir confidencialidade e não será divulgada sem a sua permissão.

Para que outros médicos possam no futuro ampliar seus conhecimentos sobre esta doença, gostaríamos

de mostrar os resultados obtidos neste projeto em congressos (pôster ou apresentação oral) e em

publicações em revistas científicas.

Por outro lado, nos comprometemos a não dizer seu nome e a utilizar os resultados obtidos apenas com

finalidade científica.

A equipe de pesquisadores (Dr Bernardo Galvão, Dra Fernanda Grassi) está disponível a qualquer

momento para qualquer esclarecimento no número 3176-2213.

Caso queira, o Sr (a) poderá entrar em contato com o Comitê de Ética em Pesquisas da Fiocruz pelo

telefone 3176-2285.

Eu _________________________________________________ aceito fazer parte do grupo de estudo

“Biomarcadores imunológicos no monitoramento da infecção pelo HTLV-1”

Recebi todas as orientações sobre este trabalho. Entendi o propósito do estudo, e compreendo que o

objetivo deste estudo é uma melhor compreensão dos mecanismos envolvidos na infecção causada pelo

vírus HTLV-1. Sei que este trabalho foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa

Humana.

Estou recebendo uma cópia deste documento datada e assinada, e não estou abdicando de nenhum dos

meus direitos legais.

Salvador, ____ / ____ / ______.

Assinatura: _____________________________________________________

Assinatura da Testemunha: _________________________________________

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ANEXO C

Figura: Intervalo de referência indicado pelo Lymphogram. Fonte: Prospecto do kit Lymphogram

Figura: Intervalo de referência indicado pelo Tritest. Fonte: Prospecto do kit Tritest.