Transcripción en eucariontes

Los organismos eucariontes tienen diferentes tipos de RNA polimerasas

RNA Polimerasa I (NRPA)

RNA Polimerasa II (NRPB)

RNA Polimerasa III (NRPC)

RNA Polimerasa IV (NRPD)

RNA Polimerasa V (NRPE)

RNA ribosomal (rRNA) 5.8S, 18S y 28S.

RNAs mensajeros (mRNA), RNAs pequeñosnucleolares (snoRNA), micro RNAs (miRNA),RNAs pequeños interferentes (siRNA) y lamayoría de RNAs pequeños nucleares(snRNA).RNAs de transferencia (tRNAs), rRNA 5S yalgunos RNAs pequeños nucleares (snRNAs)

Involucradas en la síntesis de ciertos siRNAs ysilenciamiento epigenético

En plantas:

Ȧȕ ȕ� Į, Į,,

Núcleo RNA polimerasa E.coli

RNA polimerasas eucariontes, ,, ,,,

Subunidades WLSR�ȕ�\�ȕ�

Subunidades WLSR�ĮSubunidades WLSR�Ȧ

Subunidadescomunes

Subunidades adicionales

1 2 1 2 1 2

+5 +3 +7

CTD

Las RNA polimerasas eucariontes tienen cierta homología con la polimerasa bacteriana

RNA Pol I RNAr

RNA Pol II RNAm

RNA Pol III RNAt

Similar a la

polimerasa bacteriana

La RNA polimerasa II eucarionte

- 12 subunidades formando un complejo de mas de 500 kDa

RNA pol bacteriana

cola que se fosforila (CTD)

La subunidad mayor (1) de la RNA pol II contiene un dominio carboxilo terminal (CTD) esencial.

La fosforilación del CTD es importante para la elongación de la transcripción y el procesamiento del RNAm.

En bacterias sólo se requiere Sigma parael reconocimiento eficiente del promotor.Cajas TATA (-10) y caja -35

Recononocimiento del promotor : Factores Generales o basales de la Transcripción (TFII)

Sitio de inicio transcripción-30 nt (TATA)

TFIIATFIID

TBPTFIIB

TFIIHTFIIE

TFIIFSitio de inicio transcripción

BacteriasEucariontes

Promotor para la RNA pol II eucarionte

DNA

Unidad Transcripcional

5’UTR 3’UTR

E1 E2 E3 E4+1

TSSsitio de inicio de la transcripción

PromotorCore

5’ 3’

Modulos de regulacióna distantia

Elementos CIS

PromotorDistal

Enhancers TF

GTF-II

TSS

PromotorCore

RNApolII

Nucleosomasdeslizados

Remodeladorescromatina

PromotorDistal

Loops

Nucleosomasdeslizados

TF

TF

Co-TF

TAFs

GGGCCACGCC TATA

A A AT T

CCTT AN TCC

ATTA A GG T

CGTG

BRE TATA Inr DPE

Elemento Secuencia consenso GTF

BRE

TATA

INR

DPE

G/C G/C G/A CGCC

TATA A/T A/T

C/T C/T AN A/T C/T C/T

A/G A/T CGTG

TFIIB

TBP

TFIID

TFIID

TFIIB TBP TFIID TFIID

GGGCCACGCC TATA

A A AT T

CCTT AN TCC

ATTA A GG T

CGTG

BRE TATA Inr DPE

Elemento Secuencia consenso GTF

BRE

TATA

INR

DPE

G/C G/C G/A CGCC

TATA A/T A/T

C/T C/T AN A/T C/T C/T

A/G A/T CGTG

TFIIB

TBP

TFIID

TFIID

TFIIB TBP TFIID TFIID

Genes and Development 16:2583 - 2592

-37 -32 -31 -26 -2 +4 +28 +32

Promotor basal para la RNA pol II eucarionte

Factores generales de la transcripción Clase II (TFII)

Dominio β plegado

TBP

Surco menoren TATA

TBP se une al DNA en la caja TATAprovocando una conformación másaplanada.

La unión de TBP a un sitio TATAdistorsiona la cadena y permiteel reconocimiento del sitio +1

TFIID

TBPTATA Binding

Protein

TAFsTBP associated

factors

+

TATA

TFIID es un complejo multiproteico

Factores generales de la transcripción Clase II (TFII)

TBP se une al DNA en la caja TATAprovocando una conformación másaplanada.

La unión de TBP a un sitio TATA distorsionala cadena y permite el reconocimiento delsitio +1 por las tres polimerasas eucariontes

TFIID

TBPTATA Binding

Protein

TAFsTBP associated

factors

+

TATA

TFIID es un complejo multiproteico

TATABRE

TFIIDTBP TAFs

TFIID

TFIIA TFIIB

BRETFIIA: Estabiliza la unión de TFIID-DNA.

TFIIB: Ayuda a posicionar alcomplejo de factores y la RNA pol IIsobre el promotor.

-Interacción TFIIB-TFIID y TFIIB-DNA(mediante elemento BRE)

- Se relaciona con la selección delsitio de inicio de la transcripción

TFIIF

RNA pol II

TFIIF: Se une fuertemente a la RNA polIIAfecta la topología del DNA.

Tiene actividad de helicasa para ayudar aabrir la doble cadena en el sitio +1

TFIIE: Recluta a TFIIH y regula susactividades de helicasa y cinasa

TFIIH: Complejo de 9subunidades:

Poseé 3 actividades:

Helicasa dependiente de ATP para abrir ladoble hélice e iniciar transcripción.

Actividad de cinasa para fosforilar elDominio Carboxilo Terminal (CTD) de laRNA pol II y permitir escape del promotor.

Actividad de exonucleasa para repararerrores en MMR.

TFIIE

TFIIH

NTPATPADP

Escape del promotor en eucariontes

A diferencia de bacterias la apertura delpromotor y la formación de la burbujapara el inicio de la transcripción requierela hidrólisis de ATP y es mediada porTFIIH mediante su actividad de helicasa.

El escape del promotorrequiere de la fosforilación delCTD de la subunidad mayorde RNA pol II

El CTD está conformado porvarias repetidas delheptapéptido: Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser(52 en humano)

Además de promover el escape del promotorLa (P) del CTD está involucrada en otros procesos

BacteriaEucariontes

Comparación del Inicio de la transcripción Eucarionte y Bacteria

Complejo cerrado

Unión Holoenzima

Complejo abierto

Síntesis de RNA

Escape del promotor

Unión TBP

Cambio conformacional

Unión TFIIB

Unión RNA pol II y TFIIF

Complejo de pre-inicio

Unión TFIIE y TFIIH

Complejo de inicio

Escape del promotor

Liberación de Sigma

Fosforilación de CTD de RNA pol II y liberaciónde varios factores TFII

Síntesis de RNA

TFIID

TFIIA TFIIB

BRE

TFIIE

TFIIH

TFIIF

RNA pol II

TATABRE

TBP

TAFs

NTPATPADP

Inhibidores de la Transcripción eucarionte

La Actinomicina D es producida por Streptomyces y es potente inhibidor de transcripción y replicación.

Se intercala entre G-C en la doble hélice de ADN e inhibe elongación.

La α-Amanitina es un octapéptido bicíclico que se obtiene del hongo Amanita phalloides.

Inhibe la transcripción de la RNA polimerasa II eucarionte a nivel de inicio y elongación.

Inhibidores de la Transcripción Eucarionte

Específico para la RNA pol II

Modificación del extremo 5’ del RNA

Modificación del extremo 3’ del RNARemoción de intrones

Elongación del RNAm por la RNA pol II

PROCARIONTESRNA pol II

1. Capping

1) La fosfatasa remueve unfosfato del 5´

2) Una guanil transferasa agrega GMP

3) Una metil transferasa agrega el grupo metilo

Adición de “cap” (7mGpppN) en el extremo 5’

¿Para qué añadir el 5’ Cap?

1. Le da estabilidad al mRNA en el extremo 5’ (evita corte por exonucleasas de RNA).

2. Permite la exportación nuclear del mRNA, o en su caso la retención en el núcleo.

3. Posibilita el inicio de la traducción en mRNAs eucariontes.

4. Promueve la degradación de mRNAs cuando están las señales celulares apropiadas.

2. Remoción de intrones (Splicing)

ORF: marco abiertode lectura; codificantepara la proteína

Intrón: secuencia que NO está presente en el RNA mensajeromaduro.

Exón: secuencia que SI permanece en el RNA mensajeromaduro (puede incluir secuencias no codificantes de proteínacomo las regiones 5’UTR y 3’ UTR).

Exon Exon

Existen secuencias específicas en los límites exón-intrón (sitio 5’ y sitio 3’ para el splicing); así como una Adenina en contexto de secuencia (sitio de la rama) que promueve la catálisis.

Secuencias NECESARIAS para el Splicing

Splicing: ACTIVIDAD RIBOZIMA (catalisis realizada por RNA)

Primera reacción de trans-esterificación

Segunda reacción de trans-esterificación

EstructuraLARIAT (intron)

Exon:Exon

Sólo el RNA tiene 2’OH

SPLICEOSOMA ACTIVIDAD RIBOZIMA

El Spliceosomacontiene U1-U6: snRNAs unidos a proteínas (RNPs)

La catálisis del 2’OH de la adenina en la Rama es promovida por U2 y U6 snRNA

El apareamiento “aisla” a la adenina promoviendo su reactividad

El acercamiento al borde Exón/Intrón es promovido por U1

Splicing alternativo

Permite obtener DIFERENTES proteínas a partir de un mismo gen

Consecuencias de mutaciones en INTRONES

Creación de nuevos sitios 5’ splice

3. Poliadenilación en extremo 3’ TERMINACIÓN

RNAm5’ ……….. 3’

Secuencia de poliadenilación

Corte por endonucleasa

Degradación de esta porciónAdición de

adeninas

5’ ………..

Cap

Cap Cola poliA

3’

La enzima Poli-A polimerasa (PAP) agrega Adeninas (50-250) en el extremo 3’ del RNAm

TERMINACIÓN

Proteínas de unión a poli A (PABP) se unen y protegen el extremo 3’ del RNAm

TERMINACIÓN

El receptor de exporte nuclear dirige la salida del mRNA del núcleo al citoplasma

La salida del mRNA es coordinada por proteínas unidas a la molécula:

Complejo de proteínas de unión al “5’ Cap” (CBC)Complejo de “splicing” de intrones (EJC)Proteínas de unión a cola de poli A (PABP)

Procariontes Eucariontes1. Todas las especies de RNA son sintetizadas por la misma especie de RNA polimerasa.

1. Hay 3 diferentes RNA polimerasas responsables de la transcripción de diferentes moléculas de RNA

2. El mRNA se traduce durante la transcripción.

2. El mRNA es procesado antes de ser transportado a citoplasma (adición de CAP, cola de poliA, splicing

3. Los genes son segmentos contiguos de DNA alineados ininterrumpidamente con el RNA traducido a proteína.

3. Los genes frecuentemente se interrumpen por intrones.

4. Los mRNAs son frecuentemente policistrónicos (operones)

4. Los mRNAs son monocistrónicos

5. La RNA polimerasa solo requiere a sigma para reconocer el promotor

5. Las RNA polimerasas requieren múltiples factores de transcripción adicionales para reconocer el promotor.

6. No hay procesamiento co-transcripcional del mRNA.

6. El mRNA sufre procesamiento extenso durante la transcripción.

Diferencias clave entre Transcripción eucarionte y bacteriana