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UNIVERSIDADE BANDEIRANTE DE SÃO PAULO CRISTINE ROSE MIYAZAKI AVALIAÇÃO PSICOFARMACOLÓGICA DE CROTON ECHIOIDES BAILL. (EUPHORBIACEAE) SÃO PAULO 2011
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UNIVERSIDADE BANDEIRANTE DE SÃO PAULO CRISTINE ROSE MIYAZAKI
AVALIAÇÃO PSICOFARMACOLÓGICA DE CROTON ECHIOIDES BAILL. (EUPHORBIACEAE)
SÃO PAULO 2011
CRISTINE ROSE MIYAZAKI MESTRADO PROFISSIONAL EM FARMÁCIA
AVALIAÇÃO PSICOFARMACOLÓGICA DE CROTON ECHIOIDES BAILL. (EUPHORBIACEAE)
Dissertação apresentada ao Programa de Mestrado Profissional em Farmácia da Universidade Bandeirante de São Paulo, como requisito para a obtenção do Título de Mestre.
Orientador: Prof. Dr. Luis Carlos Marques
SÃO PAULO 2011
M68a Miyazaki, Cristine Rose
Avaliação psicofarmacológica de Croton echioides Baill. (Euphorbiaceae)/ Cristine Rose Miyazaki. - São Paulo: [s.n], 2011. 81 f ; il. ; 30 cm. Dissertação de Mestrado – Universidade Bandeirante de São Paulo - Programa de Farmácia. Orientador: Prof. Dr. Luis Carlos Marques 1 Croton echioides 2 Marapuama nordestina 3 Avaliação psicofarmacológico I Título CDD: 615.78
À minha mãe pelo exemplo de vida,
amor, dedicação, presença e incansável apoio ao longo período de elaboração deste trabalho e em todos os momentos da minha vida;
Ao meu querido marido pelo amor,
admiração, companheirismo e incentivo em todos os momentos;
Vocês sempre foram à base de tudo.
Obrigada!
AGRADECIMENTOS
À Deus toda a honra deste trabalho, por todos os momentos de desabafo e
súplicas de ajuda e direcionamento, porque sem Ele nada seria feito.
Muitas pessoas contribuíram para que esse trabalho fosse concluído. Porém, algumas em especial foram indispensáveis. E não posso deixar de mencioná-las neste breve agradecimento.
A minha mãe, Maria José pelo esforço de toda uma vida para me fazer chegar até aqui, pela dedicação incondicional.
Ao meu irmão William pelo companheirismo; admiração e carinho ao longo do período de elaboração deste trabalho.
Ao meu marido João Paulo, pelo amor, cuidado, pela ação ansiolítica e antidepressiva, por todos os momentos científicos e construtivos que tivemos... Pela paciência que teve em todos eles.
Ao meu orientador, Prof. Dr. Luis Carlos Marques, por não me deixar desistir, pela mente sempre cheia de idéias, por estar sempre de bom humor, pelas horas de leitura, correção e compreensão.
Ao novo amigo e parceiro Ivair D. Gonçalves, pelo apoio, força, paciência e por não me deixar trabalhar sozinha, excedendo sempre sua carga horária.
Ao novo amigo Cláudio Novello, por ceder o liofilizado, sempre participar do trabalho e por ser sempre tão gentil.
Aos amigos que fiz durante o curso, Ana Regina Alpiovezza, Marcelo Pinto, Oseraldo Rocha, Priscila Vautier, pela ajuda recebida durante as disciplinas e pela excelente companhia.
Aos meus eternos amigos Mario Giorgi, Alexsander Galhardi, Tatiana Caldas, Flávia Siqueira, Fernanda Bettarello, Elida Giorgino, Wagner Lee, Irineu Rosseti, Juliane Silva, Andréia Oliveira, Hélio Zanata por serem pessoas com quem eu posso contar nos bons e maus momentos e que me suportaram em momentos de angústia, de fraqueza e finalmente de alegria.
A todos que contribuíram para a concretização deste trabalho, meus sinceros agradecimentos.
“Da Perfeição da Vida Por que prender a vida em conceitos e normas?
O Belo e o Feio... O Bom e o Mau... Dor e Prazer... Tudo, afinal, são formas E não degraus do Ser !“
Mário Quintana
RESUMO
MIYAZAKI, C.R. Avaliação psicofarmacológica de Croton echioides Baill. (Euphorbiaceae). 2011. 81 f. Dissertação (Mestrado) – Universidade Bandeirante de São Paulo, São Paulo, 2011.
Caules de uma espécie do gênero Croton têm sido amplamente comercializados no
Brasil com reputadas atividades tônicas do sistema nervoso central em substituição a
marapuama amazônica, sem dados científicos a respeito e nem mesmo confirmação de
sua identificação botânica, o que motivou a presente pesquisa. Assim buscou-se a
identificação botânica da espécie e avaliou-se o extrato liofilizado dos caules comerciais
em roedores em modelos experimentais de sistema nervoso central. Foram utilizados
os modelos labirinto em cruz elevado; caixa claro-escuro; nado forçado; hipotermia
induzida por apomorfina; esquiva-passiva; analgesia e atividade anticolinesterásica in
vitro. Confirmou-se a identidade da espécie como Croton echioides Baill. –
Euphorbiaceae, e encontrou-se positividade em alguns parâmetros do teste do labirinto
em cruz elevado e no teste da caixa claro-escuro, evidenciando atividade ansiolítica.
Nenhum efeito significante foi observado nos testes do nado forçado e da hipotermia
induzida por apomorfina, no teste de analgesia pela formalina e no modelo de esquiva-
passiva com escopolamina. O teste de atividade anticolinesterásica in vitro apresentou
inibição da atividade enzimática através do surgimento de manchas esbranquiçadas
sob um fundo amarelado. Os dados significantes obtidos sinalizam possível efeito
ansiolítico nos modelos de labirinto em cruz elevado e caixa claro–escuro, não
apresenta ação antinoceptiva de origem neurogênica e inflamatória, ausência de
potencial antidepressivo ou de reversão dos efeitos amnésicos da escopolamina, e
positividade no modelo in vitro de atividade anticolinesterásica. Outros testes
necessitam serem realizados de modo a confirmar ou não os usos populares dessa
droga vegetal, mas os presentes resultados mostram perfil distinto da marapuama
amazônica.
Palavras-chave: Croton echioides. Marapuama nordestina. Avaliação
psicofarmacológica.
ABSTRACT
MIYAZAKI, C.R. Evaluation of psychopharmacological Croton echioides Baill. (Euphorbiaceae) 2011. 81 f. Dissertação (Mestrado) – Universidade Bandeirante de São Paulo, São Paulo, 2011.
Stems of a species of the genus Croton have been widely marketed in Brazil with
reputable tonic activity of the central nervous system to replace marapuama Amazon, no
scientific data about or even confirmation of its botanical identification, which motivated
this research. So we sought to identification the botanical species and evaluated
the lyophilized extract of the stems in commercial rodent experimental models of central
nervous system. Models were used elevated plus maze, light dark box, forced
swimming, apomorphine -induced hypothermia, passive avoidance,
analgesia and anticholinesterase activity in vitro. Confirmed the identity of the species
as Croton echioides Baill. - Euphorbiaceae, and is positive in some test parameters of
the elevated plus maze test and light-dark box, indicating anxiolytic
activity. No significant effects were observed in the forced swimming
test and apomorphine-induced hypothermia, analgesia in the formalin test and passive-
avoidance model with scopolamine. The test of anticholinesterase activity in vitro
showed inhibition of enzyme activity through the appearance of white spots on a yellow
background. The data obtained indicate possible significant anxiolytic effect in models of
elevated plus maze and light-dark box, has no action antinoceptiva of neurogenic
originand inflammatory, antidepressant or no potencial for reversing
the amnesic effects of scopolamine, and positivity in the in vitro
model anticholinesterase activity. Other tests need to be performed to confirm or not the
popular uses of this drug plant, but the present results show a distinct
profile of marapuama Amazon.
Keywords: Croton echioides. Northeastern marapuama. Psychopharmacological
evaluation.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 - Clerodanos isolados da casca Ptychopetalum olacoides Benth........ 19
Figura 2 - Clerodanos isolados de Croton cajucara............................................ 21
Figura 3 - Compostos isolados de C. moritibensis ............................................ 23
Figura 4 - Caules de Croton echioides Baill. ...................................................... 34
Figura 5 - Identificação da planta adquirida para extração ................................ 35
Figura 6 - Labirinto em cruz elevado ................................................................. 39
Figura 7 - Aparato da caixa claro/escuro ........................................................... 40
Figura 8 - Ilustração representativa do tanque cilíndrico para indução do nado
forçado ................................................................................................................
42
Figura 9 - Lambedura da pata posterior do camundongo .................................. 43
Figura 10 - Sequência de reações para detecção de atividade
anticolinesterásica pelo método de Ellman ........................................................
45
Figura 11 - Permanência na área central .......................................................... 48
Figura 12 - Número de ameaças de entrada ..................................................... 48
Figura 13 - Permanência nos lados claro e escuro ........................................... 51
Figura 14 - Lambedura das patas nas duas fases do teste de analgesia ......... 57
Figura 15 - Fotos das placas de CCD de extrato de guaraná e de extrato de C.
echioides ........................................................................................................
60
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Esquema de tratamento do teste de esquiva passiva .......................
44
Tabela 2 - Parâmetros comportamentais registrados em camundongos no
teste do labirinto em cruz elevado (TLCE) .........................................................
47
Tabela 3 - Parâmetros comportamentais registrados em camundongos no
teste da caixa claro/escuro (TCCE) ....................................................................
51
Tabela 4 - Parâmetros comportamentais registrados em camundongos no
teste da hipotermia induzida pela apomorfina (THIA) ........................................
54
Tabela 5 - Parâmetros comportamentais registrados em camundongos no
teste do nado forçado (TNF) ...............................................................................
55
Tabela 6 - Parâmetros comportamentais registrados em ratos no teste da
esquiva passiva (TEP) ........................................................................................
58
LISTA DE ABREVIATURAS
ACh Acetilcolina
AChE Acetilcolinesterase
ACTI Iodeto de acetiltiocolina
ANOVA Análise de variância
BSA Soro albumina bovino
CCD Cromatografia de camada delgada
CCE Caixa claro escuro
c-CJC-B cis-cajucarina B
CEDEME Centro de Desenvolvimento de Modelos Experimentais – UNIFESP
CEMIB Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência em Animais de Laboratório - UNICAMP
CTN trans-crotonina
DA Doença de Alzheimer
DCM Diclorometano
DCTN trans-desidrocotonina
DP Desvio padrão
DTNB Ácido 5,5’-ditiobis-2-nitrobenzóico
EPM Erro padrão da média
EtOAc Acetato de etila
FA Fração acetato de etila
Head dip Comportamento de mergulhar a cabeça
i.p Intraperitoneal
IC50 Concentração inibitória requerida para inibir 50% da meta em questão
LAFE Laboratório Experimental de Farmacologia da UNIBAN
LCE Labirinto de cruz elevada
OMS Organização Mundial de Saúde
Rearing Levantamentos
SNC Sistema nervoso central
TA Teste da analgesia
TAG Transtorno da ansiedade generalizada
TCCE Teste da caixa claro/escuro
t-CJC-B trans-cajucarina B
TEP Teste da esquiva-passiva
THIA Teste da hipotermia induzida por aporformina
TLCE Teste do labirinto em cruz elevado
TNF Teste do nado forçado
Tris tris(hidroximetil) aminometano
UNIBAN Universidade Bandeirante de São Paulo
UNICAMP Universidade Estadual de Campinas
UNIFESP Universidade Federal de São Paulo
UV Ultravioleta
VIS Visível
WHO World Health Organization
LISTA DE SÍMBOLOS
(NH4)2SO4 Sulfato de amônio
°C graus Celsius
KH2PO4 Fosfato de potássio
MgCl2.6H2O Cloreto de magnésio hexahidratado
NaCl Cloreto de sódio
NaH2PO4 Fosfato de sódio
T temperatura
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................... 17
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............................................................................. 20
2.1 GÊNERO Croton ............................................................................................ 20
2.2 DOENÇAS DO SISTEMA NERVOSO CENTRAL .......................................... 24
2.3 FITOTERÁPICOS USADOS EM DOENÇAS DO SISTEMA NERVOSO
CENTRAL .............................................................................................................
28
3 OBJETIVO ......................................................................................................... 32
3.1 OBJETIVO GERAL ......................................................................................... 32
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................... 32
4 MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................. 33
4.1 ANIMAIS ......................................................................................................... 33
4.2 COLETA DO MATERIAL VEGETAL ............................................................... 33
4.3 EXTRATO ....................................................................................................... 34
4.4 REAGENTES, SOLVENTES E FÁRMACOS DE REFERÊNCIA ................... 36
4.4.1 Enzimas ....................................................................................................... 36
4.4.2 Substrato ...................................................................................................... 36
4.4.3 Reagente colorimétrico ................................................................................ 36
4.4.4 Placas de cromatografia de camada delgada .............................................. 37
4.5 TRATAMENTOS ............................................................................................. 37
4.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA ................................................................................. 38
5 MÉTODOS EXPERIMENTAIS ........................................................................... 39
5.1 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANSIOLÍTICA .................................................. 39
5.1.1 Teste do labirinto em cruz elevado .............................................................. 39
5.1.2 Teste da caixa claro-escuro ......................................................................... 40
5.2 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIDEPRESSIVA .......................................... 41
5.2.1 Teste da hipotermia induzida por apomorfina .............................................. 41
5.2.2 Teste do nado forçado ................................................................................. 41
5.3 AVALIAÇÃO DA ANALGESIA......................................................................... 42
5.3.1 Teste da formalina ...................................................................................... 42
5.4 AVALIAÇÃO DA REVERSÃO DOS EFEITOS AMMÉSICOS DA
ESCOPOLAMINA .................................................................................................
43
5.4.1 Teste de esquiva passiva ............................................................................ 43
5.5 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTICOLINESTERÁSICA ............................... 44
6 RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................................... 46
6.1 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANSIOLÍTICA .................................................. 46
6.1.1Teste do labirinto em cruz elevado ............................................................... 46
6.1.2 Teste da caixa claro-escuro ......................................................................... 50
6.2 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIDEPRESSIVA .......................................... 53
6.2.1 Teste da hipotermia induzida por apomorfina .............................................. 53
6.2.2 Teste do nado forçado ................................................................................. 54
6.3 AVALIAÇÃO DA ANALGESIA ........................................................................ 56
6.3.1 Teste da formalina ...................................................................................... 56
6.4 AVALIAÇÃO DA REVERSÃO DO EFEITO AMNÉSICO DA
ESCOPOLAMINA...................................................................................................
58
6.4.1 Teste de esquiva passiva ............................................................................. 58
6.5 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTICOLINESTERÁSICA ............................... 59
7 CONCLUSÃO .................................................................................................... 62
REFERÊNCIAS .................................................................................................... 63
ANEXOS ............................................................................................................... 80
1 INTRODUÇÃO
A procura por novos medicamentos é uma atividade clássica em todo o mundo.
Decorre principalmente da busca de soluções a questões como a baixa eficácia dos
produtos existentes, níveis de toxicidade e efeitos colaterais bem como a aspectos
relacionados à autonomia do país e sua necessária independência em termos de
obtenção de matérias-primas para medicamentos essenciais ou relevantes à
terapêutica no país.
A utilização de plantas com fins medicinais, para tratamento, cura e prevenção
de doenças, é uma das mais antigas formas de prática medicinal da humanidade. No
início da década de 1990, a Organização Mundial de Saúde (OMS) divulgou que 65-
80% da população dos países em desenvolvimento dependiam das plantas medicinais
como única forma de acesso aos cuidados básicos de saúde (AKERELE,1993).
Ao longo do tempo têm sido registrados variados procedimentos clínicos
tradicionais utilizando plantas medicinais. Apesar da grande evolução da medicina
alopática a partir da segunda metade do século XX, existem obstáculos básicos na sua
utilização pelas populações carentes, que vão desde o acesso aos centros de
atendimento hospitalares à obtenção de exames e medicamentos. Estes motivos,
associados com a fácil obtenção e a grande tradição do uso de plantas medicinais,
contribuem para sua utilização pelas populações dos países em desenvolvimento
(AKERELE, 1993).
A segurança e a eficácia dos produtos dependem de diversos fatores, dentre
estes se pode destacar a qualidade do produto comercializado. Segundo Farias (2001),
a eficácia é dada pela comprovação, por meio de ensaios farmacológicos pré-clínicos e
clínicos, dos efeitos biológicos preconizados para esses recursos terapêuticos, e a
segurança é determinada pelos ensaios que comprovem a ausência de efeitos tóxicos.
Melo e colaboradores (2004) enfatizam que a fraude e a má qualidade em fitoterápicos
são motivos de preocupação por parte dos profissionais da área de saúde e da
comunidade científica, pois interferem na eficácia e segurança do produto. Assim, a má
qualidade de produto fitoterápico pode vir a anular a sua eficácia e trazer riscos à saúde
do consumidor. Atualmente, muitas plantas que estão sendo estudadas são capazes de
atuar no comportamento, humor, pensamento e sensações, o entendimento de seus
mecanismos de ação, segurança e eficácia, é um desafio para os pesquisadores
(CARLINI, 2003; CARLINI et al., 2006).
Parâmetros como segurança de fármacos, efeitos colaterais, tolerabilidade e
potencial para interação entre drogas devem ser levados em consideração, pelo fato
dessas variáveis afetarem a aderência ao tratamento (HALFIN, 2007).
Os modelos animais representam uma ferramenta imprescindível na busca de
novos fármacos, já que o estudo pré-clínico indispensavelmente precede o teste de
novas substâncias em humanos. No entanto, para o estudo da ansiedade e da
depressão os modelos animais representam um fator limitante, já que estas patologias
não podem ser reproduzidas plenamente em animais, pois são estados característicos
da espécie humana. Assim, a ansiedade e a depressão são apenas modeladas e não
reproduzidas em procedimentos utilizando animais de experimentação (GEYER;
MARKOU, 1995; ANDREATINI et al., 2001).
Entre as espécies vegetais da biodiversidade brasileira com interesse popular e
comercial pelo potencial que representa para um possível medicamento fitoterápico e
também com foco econômico, encontra-se a droga conhecida como marapuama,
envolvendo as cascas das raízes de Ptychopetalum olacoides Benth., família
Olacaceae. Diversos estudos estão disponíveis evidenciando ações no sistema nervoso
central que validam os efeitos popularmente atribuídos de tônico geral para aliviar a
fadiga física e mental como por seus efeitos afrodisíacos (TOYOTA et al., 1979; PAIVA
et al., 1998).
Essa espécie, originária da flora amazônica, vem sendo comercializada há mais
de um século, havendo relatos de exportação de grandes quantidades da mesma ao
exterior. Assim, seu interesse comercial evidente vem mantendo uma situação de
exploração contínua ao longo dos anos. De forma complementar, sua ocorrência
especifica na flora amazônica, a parte usada (raízes) e a falta de investimentos de
cultivo, com certeza devem ter levado a espécie P. olacoides a uma situação de quase
extinção, ou no mínimo, à sua redução expressiva em termos de ocorrência na
natureza.
Quando essa situação se configura, geralmente o mercado busca alternativas de
fornecimento, acabando por desencadear uma substituição da parte usada ou, de modo
mais radical, da espécie verdadeira por outra com as mesmas indicações, embora nem
sempre similares quimicamente. No caso de P. olacoides, a substituição comercial
levou à exploração de caules ofertados como sendo da mesma espécie, e a falta de
especificações dificultou a contraposição a esse posicionamento. Posteriormente
verificou-se serem caules de uma espécie de Croton (Euphorbiaceae), originária do
interior da Bahia, bioma totalmente distinto do amazônico. Tal situação de
adulteração/substituição permanece atualmente, sem a adequada identificação da
espécie realmente comercializada bem como sua distribuição como caules de P.
olacoides, confirmando, infelizmente, os problemas de qualidade que o mercado
fitoterápico enfrenta, levando à população prejuízos diversos desde possíveis efeitos
colaterais até a ausência dos efeitos benéficos pretendidos com o seu uso (TOBIAS et.
al., 2007). Mesmo artigos internacionais, que adquirem material botânico comercial,
podem estar incorrendo nesse erro, o que coloca em dúvida alguns resultados, como
por exemplo, a publicação de estruturas químicas como diterpenos clerodanos em
marapuama amazônica (Figura 1), classe química comum em Croton nunca antes
citada para o gênero Ptychopetalum, que apresenta a marapuamina, ácidos graxos de
cadeia longa, cumarina, alcalóides, saponinas, flavonóides, campesterol, β-sitosterol e
óleos essenciais (MAUL et al., 2002; SIQUEIRA et al., 2003).
Figura 1 – Clerodanos isolados da casca de Ptychopetalum olacoides Benth.
Fonte: Tang e colaboradores (2011)
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 GÊNERO Croton
Croton é um dos maiores gêneros das Euphorbiaceae, abrangendo um número
considerável de espécies no mundo (750-1000) (WEBSTER, 1994), das quais 400 são
reportadas na América tropical e subtropical, desde o sul do México, adentrando pela
América Central, Colômbia, Venezuela, Equador, Peru, Bolívia, Brasil, Paraguai,
Uruguai e Argentina (PINEDO et al., 1997) e cerca de 300 delas abrigadas no Brasil.
As espécies do gênero Croton chamam a atenção pela diversidade de uso
popular e de atividade biológica, explicado pela grande diversidade de compostos
ativos encontrados nelas. Estas espécies são promissoras segundo a perspectiva
química e medicinal e tem atraído grande interesse no seu estudo.
Na medicina popular, plantas do gênero Croton têm sido empregadas em
diversas situações como diarréia, úlceras intestinais e estomacais, faringite, vírus da
herpes, hemorróidas, brotoeja e câncer e, usadas como anti-inflamatório, anti-reumático
e em fraturas (CHEN et al., 1994; PERSINO-PURDUE et al., 1979, BETOLLO;
SCARPATI, 1979; PIETERS et al., 1995).
Os principais compostos que são encontrados no gênero Croton são os
diterpenos do tipo clerodano (CRAVEIRO et al., 1981). Estruturalmente são diterpenos
com a presença de anéis furano, sendo que mais de 800 já foram isolados, com um
número significante deles apresentando atividade biológica como antibiótica,
antitumoral, antiinflamatória, antinociceptiva, hipoglicêmica, antiúlcera, cardiovascular,
além de ação inseticida (MACIEL et al., 1998; SILVA et al., 2005). O gênero Croton
também é rico em alcalóides de diversas classes, o que é de grande importância sob a
ótica medicinal. Substâncias fenólicas como flavonóides, lignóides e
protoantocianidinas também têm suas ocorrências registradas neste gênero
(SALATINO et al., 2007).
Estudos diversos com várias espécies de Croton têm demonstrado atividades
biológicas relevantes tanto em extrato bruto como em compostos puros, comprovando o
uso destas plantas na medicina popular.
Croton lechleri Müll. Arg., conhecido como sangue de grado, sangue de dragão,
sangue de galo ou sangue de pau, é uma das espécies de Croton usadas como
purgativo e tônico (AZEVEDO et al., 2008). Esta espécie tem uma longa história de
utilização como planta medicinal, principalmente como cicatrizante, antiinflamatório,
tratamento de problemas no sistema digestivo (PIETERS et al., 1993; UBILLAS, 1994) e
anticâncer (LOPES e LOPES et al., 2004).
C. cajucara Benth, conhecido popularmente como sacaca, é uma planta
medicinal encontrada na região amazônica brasileira. Os caules e folhas são usados na
forma de chá ou pílulas para o tratamento do diabetes, nível de colesterol alto no
sangue, inflamação do fígado, rins e bexiga e distúrbios gastro-intestinais (MACIEL et
al., 2000). De Paula e colaboradores (2008) comprovaram o efeito antiúlcera do óleo
essencial de C. cajucara em experimento com tratamento crônico em ratos.
Estudo realizado com as raízes, caules e folhas separadamente de C. cajucara
demonstrou que o caule é a fonte mais rica em diterpenos clerodano (Figura 2).
Figura 2 - Clerodanos isolados de Croton cajucara: trans-desidrocotonina (DCTN);
trans-crotonina (CTN), cis-cajucarina B (c-CJC-B) e trans-cajucarina B(t-CJC-B).
Fonte: MACIEL e colaboradores (1998)
C. urucurana Baill., tanto a resina como a casca, é utilizada pelos índios da
região amazônica para estancar sangramento e cicatrizar ferimentos. Na medicina
popular a utilização estende-se para atividades antiinflamatória, anti-séptica, antiviral e
no tratamento de úlceras de estômago e intestino (PERES et al., 1997; SALATINO et
al., 2007; RAO et al., 2007).
Rao e colaboradores (2007) demonstraram a ação antinociceptiva do látex de C.
urucurana e Gurgel e colaboradores (2005) comprovaram a atividade antifúngica. Já
Esmeraldino e colaboradores (2005) demonstraram a ação anti-hemorrágica do extrato
aquoso e frações semipurificadas desta espécie, sugerindo que a fração butanólica é
um promissor antídoto para os efeitos do veneno da cobra da espécie Bothrops
jararaca.
Croton sonderianus Müll Arg., popularmente conhecido como marmeleiro-preto
ou marmeleiro, é um arbusto encontrado na região nordeste do Brasil. Os dados
etnofarmacológicos registram o uso das cascas e folhas para combater problemas
estomacais, no tratamento de hemorróidas inflamadas, distúrbios gastro-intestinais,
reumatismo e nos casos de hemorragia uterina (SANTOS et al., 2005).
Santos e colaboradores (2005) comprovaram a ação antinociceptiva do óleo
essencial de C. sonderianus e, recentemente, Pinho-da-Silva e colaboradores (2010)
demonstraram o efeito brônquio-dilatador do óleo essencial sugerindo que este pode
ser um potencial agente terapêutico para o tratamento da asma.
Croton zehntneri Pax. & K. Hoffm., é uma planta aromática nativa da região
nordeste do Brasil popularmente conhecida como “canela-de-cunhã”. De forma
semelhante ao C. urucurana, tem os mesmos usos populares, mas também é
empregada como calmante, estimuladora de apetite, indutora do sono (SALATINO et
al., 2007) e distúrbios nervosos como irritabilidade e convulsões (BATATINHA et al.,
1995).
Bernardi e colaboradores (1991) demostraram que o chá preparado com as
folhas e galhos de C. zehntneri apresenta propriedades estimulantes em ratos.
Entretanto, o extrato liofilizado possui um ou mais princípios ativos com ação
característica depressora do sistema nervoso central (SNC). Batatinha e colaboradores
(1995) pesquisaram a ação do óleo essencial da folhas de C. zenhtneri em
experimentos de avaliação comportamental em ratos e camundongos. Foi observado,
em geral, um decréscimo de atividade dos animais, sugerindo um efeito depressor do
SNC. Os autores sugerem que talvez o óleo essencial possa ser o responsável pela
ação da planta em distúrbios nervosos.
Croton celtidifolius Baill. é conhecida como sangue de adave, pau de andrade ou
pau-sangue (NARDI et al. 2003 e 2006). A infusão do caule e das folhas é utilizada na
medicina popular como antiinflamatório, para o tratamento da leucemia, úlcera e
reumatismo (SALATINO et al., 2007; NARDI et al., 2003).
Nardi e colaboradores (2003 e 2007) demonstraram que o caule de C.
celtidifolius possui significante atividade antiinflamatória e antioxidante. Encontram
efeito antinociceptivo para as cascas, numa fração rica em protoantocianidinas (NARDI
et al., 2006).
C. campestris St Hill, conhecido como velame do campo é utilizado na medicina
popular em preparações de uso interno e externo como um potente purgativo, no
tratamento da sífilis e infecções do canal da bile (colédoco). Das partes aéreas de
Croton moritibensis Baill., popularmente conhecida como velame-preto, Araújo-Júnior e
colaboradores (2004) isolaram quatro alcaloides (harmana, tetrahidroharmana, 2-
etoxicarbonil tetrahidroharmana e 6-hidroxi-2-metiltetrahidroharmana) e três diterpenos
(sonderianol, 12-hidroxi-13-metil-8,11,13-podocarpatrien-3-ona e 12-hidroxi-13-metil-
1,8,11,13-podocarpatrien-3-ona) (Figura 3).
Figura 3 - Compostos isolados de C. moritibensis
Fonte: ARAÚJO-JÚNIOR e colaboradores (2004)
NH
N
Me O
Me
OH
Me Me
Me
H
harmana 12-hidroxi-13-metil-1,8,11,13-podocarpatrien-3-ona
C. nepetaefolius Baill. é uma planta aromática, rica em óleo essencial, endêmica
da região nordeste brasileira. Conhecida popularmente com marmeleiro sabiá ou
marmeleiro vermelho é utilizada na medicina popular para distúrbios gastro-intestinais,
como carminativa e tratamento de cólica intestinal (ABDON et al., 2002).
Magalhães e colaboradores (1998 e 2004) comprovaram as propriedades
antiespasmódica e miorelaxante do óleo essencial de C. nepetaefolius. Em outros
estudos com o óleo essencial, Abdon e colaboradores (2002) avaliaram a atividade
antinociceptiva encontrando resultados promissores e Lahlou e colaboradores (2000)
encontraram efeitos cardiovasculares sugerindo que o óleo essencial pode ser um
agente vasorelaxante direto.
Partes da espécie Croton moritibensis Baill. são citados em associação com
outros extratos em formulação indicada como medicação estimulante no tratamento das
estafas mentais e físicas (astenia); além disso, novas descobertas levaram a pedido de
patente para as indicações de fibrilação ventricular e ou prevenção para fibrilação
ventricular (SILVA FILHO et al., 2006).
Assim, estudos diversos com várias espécies de Croton tem demonstrado
atividades biológicas relevantes, comprovando o uso destas plantas na medicina
popular.
2.2 DOENÇAS DO SISTEMA NERVOSO CENTRAL
A depressão e a ansiedade são desordens mentais de grande prevalência na
população geral e, na maioria das vezes, coexistem num mesmo paciente (BULLER;
LEGRAND, 2001). De acordo com a Organização Mundial da Saúde (World Health
Organization, WHO), a depressão, tornar-se-á a segunda causa de morte ou
incapacidade no ano 2020 (WHO, 2005). Embora este dado seja alarmante, somente
cerca de 60-70% dos pacientes respondem aos tratamentos atualmente disponíveis,
observando-se que nem sempre o resultado é satisfatório (BULLER; LEGRAND, 2001).
Assim, a busca por tratamentos mais eficazes, com menos efeitos colaterais é
justificada. O uso de fitoterápicos pode representar uma boa perspectiva para o
tratamento dos distúrbios afetivos.
Historicamente, ansiedade e depressão são consideradas na clínica desordens
separadas e distintas, predominantemente devido aos diferentes tratamentos utilizados
para essas desordens, usualmente os antidepressivos e os benzodiazepínicos.
Entretanto, muitos estudos clínicos têm demonstrado uma grande sobreposição entre
esses dois estados (ANDREATINI; BACELLAR, 1999; CRYAN; HOLMES, 2005).
Entretanto, mesmo com a existência de múltiplas classes farmacológicas, menos
de 50% dos pacientes apresentam remissão total após o tratamento inicial da
depressão e a terapêutica efetiva leva algumas semanas para manifestar seus efeitos
os quais são muitas vezes acompanhados por efeitos não desejados (WONG; LICINIO,
2004; TAYLOR et al., 2005; BERTON; NESTLER, 2006; HALFIN, 2007).
Nesse sentido, Gomes (1992) confirmou a alta frequência das doenças do
sistema nervoso central no Brasil tomando como base as internações em hospitais
conveniados com o sistema público, declarações de óbito e benefícios, representando
8,2% de todos os pacientes internados e 19,0% dos custos hospitalares. Mais
recentemente, a OMS afirmou que as doenças neurológicas afetam cerca de 1 bilhão
de pessoas em todo o mundo, com quadros desde enxaqueca a mal de Alzheimer
(DOENÇAS, 2007).
Atualmente verifica-se a ocorrência progressiva das doenças crônico-
degenerativas nas sociedades modernas decorrentes de vários aspectos, mas também
pelo aumento na expectativa de vida das populações em todo o mundo. Segundo
projeções das Nações Unidas, a população idosa aumentará de 3,1% em 1970 para
19% em 2050; já ao avaliar-se a transição demográfica no Brasil, estima-se que a
população idosa com idade acima dos 65 anos aumentará em velocidade acelerada (2-
4% ao ano), enquanto a população jovem diminuirá, prevendo-se termos cerca de 32
milhões de pessoas com mais de 60 anos em 2025, a sexta maior do mundo (NASRI,
2008).
Isso leva à preocupação quanto ao impacto desse contingente populacional nos
serviços de saúde, atualmente despreparados para essa mudança demográfica,
estimulando esforços e investimentos visando o desenvolvimento de tecnologias e
produtos para tal situação. Como o idoso apresenta características fisiológicas próprias,
tem havido estímulos a pesquisas nessa área, buscando-se o desenvolvimento de
processos que auxiliem essa expressiva parcela da população e contribuam ao
planejamento e preparação dos serviços de saúde para esse atendimento (WHO,
1988).
O processo do envelhecimento provoca uma série de alterações fisiológicas e
anatômicas nas pessoas, responsáveis pelo aparecimento de limitações cotidianas e
problemas de saúde específicos. Desse conjunto, destacam-se os problemas
neuropsicológicos como depressão, ansiedade, perda gradativa da memória, das
funções cognitivas (atenção, concentração), de funções neuro endócrinos e
modificações do sono (DAVIES, 1989).
O uso de medicamentos nessas condições tem crescido substancialmente nas
últimas décadas como ocorreu, por exemplo, com a classe dos antidepressivos que
atingiu níveis quase ‘epidêmicos’, no mundo e também no Brasil (BRASIL, 2008).
Nas últimas décadas, com os avanços tecnológicos e de serviços de saúde, tem
ocorrido o envelhecimento populacional, com a idade média das pessoas aumentando
progressivamente. Nesse cenário aumentam, também, as doenças ligadas ao
envelhecimento, como a doença de Parkinson e particularmente as demências, como a
de Alzheimer (YAFFE, 2010).
Em vista disso, tem aumentado igualmente as pesquisas para novos
medicamentos que contribuam à prevenção ou tratamento das demências, com
destaque às substâncias anticolinesterásicas que melhoram o quadro sintomático dos
pacientes, permitindo recuperação parcial das atividades cotidianas prejudicadas pela
doença (LARNER, 2010).
Para esta finalidade destaca-se a pesquisa com produtos naturais que ainda
guarda grande potencial para fornecer compostos ativos sobre o Sistema Nervoso
Central. A busca de novas terapias farmacológicas a partir de plantas medicinais para
doenças psiquiátricas tem progredido significantemente na última década. Isto é
refletido num grande número de preparações de plantas para as quais o potencial
psicoterapêutico tem sido avaliado em uma variedade de modelos animais (ZHANG,
2004).
Alguns critérios devem ser estabelecidos para que um modelo animal seja aceito
como modelo de uma desordem psiquiátrica, ou seja, os modelos animais devem ter
validade preditiva, validade de face e validade de construção (CRYAN; HOLMES, 2005;
PETIT-DEMOULIERE et al., 2005). No estudo da ansiedade e depressão, os modelos
animais possuem alto grau de validade preditiva; ou seja, identifica-se como um modelo
o procedimento que é sensível a drogas utilizadas na clínica para o tratamento do
transtorno a ser modelado. O grau de validade de face e de construção é bastante
limitado e não é facilmente identificável.
Dentre os diferentes procedimentos experimentais para o estudo da depressão,
teste do nado forçado é o modelo mais frequentemente utilizado. É um modelo de baixo
custo, rápido e que possui uma grande sensibilidade a todas as classes de
antidepressivos (BORSOI, 2010). O teste da suspensão pela cauda, de modo
semelhante ao do nado forçado, baseia-se no desenvolvimento de uma postura imóvel
pelos animais após movimentos inicias de escapatória quando submetidos a uma
situação de estresse inescapável (CRYAN; HOLMES, 2005).
Por outro lado, as desordens de ansiedade podem ser representadas em mais
de trinta modelos animais (RODGERS et al., 1997), muitos deles baseados no
comportamento exploratório dos roedores, com procedimentos que exploram a
tendência ao conflito entre se aproximar e se esquivar de uma área potencialmente
perigosa (CRYAN; HOLMES, 2005).
Dentre os diferentes procedimentos experimentais para o estudo da ansiedade, o
Labirinto em cruz elevado parece ser adequado para detecção de substâncias ativas no
tratamento dos transtornos de ansiedade generalizada (FILE, 1990), enquanto o teste
de esconder esferas parece ser mais sensível a substâncias utilizadas para o
tratamento do transtorno obsessivo compulsivo (NJUNG’E; HANDLEY, 1991).
Testes de esquiva têm sido amplamente empregados em pesquisas sobre as
bases neurofisiológicas da memória em animais de laboratório. Na esquiva passiva o
animal penetra em um compartimento ou desce de uma plataforma e então recebe o
choque (descarga elétrica); por conseqüência, o animal aprende a não ir mais ao
compartimento a fim de evitar aquela resposta, ou seja, é um procedimento
experimental que utiliza o choque elétrico como estímulo aversivo e o resultado é
interpretado como indicativo de emocionalidade (ansiedade e medo) (ALMEIDA et al.,
1996).
A Doença de Alzheimer (DA) é uma desordem neurodegenerativa progressiva
manifestada por deterioração da memória associada a declínio neurofuncional,
distúrbios comportamentais e sintomas psíquicos. O tratamento sintomático da doença
de Alzheimer envolve primariamente a restauração colinérgica. Sugere-se, portanto,
que uma elevação no nível da acetilcolina poderia ser útil para melhorar um dos sinais
da doença, a deficiência de aprendizagem. Atualmente, o único tratamento clínico
eficaz para a DA é a utilização de inibidores da acetilcolinesterase (AChE), sendo a
acetilcolinesterase a enzima responsável pela degradação da acetilcolina no SNC.
Desse modo, bioensaios utilizando acetilcolina ou moléculas afins como substrato à
enzima aceticolinesterase têm sido amplamente promovidos, como modelos rápidos e
acessíveis para triagem de fármacos ou extratos potenciais para desenvolvimento de
novos medicamentos a esta área (TREVISAN, 2003).
2.3 FITOTERÁPICOS USADOS EM DOENÇAS DO SISTEMA NERVOSO CENTRAL
A área de doenças do sistema nervoso central é uma das mais marcantes em
termos da presença e comercialização de produtos oriundos da biodiversidade. Por
exemplo, dentro dos vinte principais produtos fitoterápicos comercializados no Brasil
nas últimas décadas incluem-se 9 produtos com ações no SNC (Pasalix®,
Passiflorine®, Maracugina®, Serenus®, Valeriane®, dentre outros), cerca de 22% dos
mais vendidos e representando um faturamento de cerca de R$ 117 milhões de reais
por ano (FREITAS, 2007).
A classe mais destacada por certo é a de ansiolíticos, envolvendo produtos à
base das espécies Valeriana officinalis, Erythrina mulungu, Passiflora incarnata, Melissa
officinalis, dentre outras de menor expressão. A espécie Ginkgo biloba, de ação
estimulante da circulação cerebral e periférica, é outra amplamente presente na
terapêutica com ações destacadas em quadros de labirintite, zumbidos, problemas de
memória, dentro outras ações (BLUMENTHAL et al., 1998).
Fitoterápicos de ação antidepressiva são também presentes na terapêutica
moderna através da espécie Hypericum perforatum, a qual, por apresentar interações
medicamentosas importantes, teve boa presença em mercado até o ano de 2002
decaindo após em função da restrição de comercialização, com retenção de receitas
(TUROLLA; NASCIMENTO, 2006). Apesar disso, ainda continua presente na
terapêutica fitoterápica, agora em produtos preparados com extratos diferenciados e
com menor possibilidade de interações (AROLD et al., 2005).
Outro segmento muito estudado e procurado terapeuticamente se refere aos
produtos com potencial estimulante não relacionado à cafeína e derivados, que possam
ser úteis em quadros de debilidade orgânica, estresse, depressão, com ausência ou
menores efeitos colaterais que as metil-xantinas. A espécie modelo nessa categoria
sem dúvida é o ginseng coreano (raízes de Panax ginseng C.A. Meyer), a mais
intensamente estudada, sendo conhecidos seus efeitos benéficos em animais e
humanos, particularmente no aumento da atividade física, sobre aprendizagem e
memória e sobre parâmetros cognitivos, dentre vários outros efeitos (XIANG et al.,
2008; CHRISTENSEN, 2009). A partir do ginseng coreano desenvolveu-se um
arcabouço teórico de uma nova categoria de produtos estimulantes, os chamados
adaptógenos. Esse termo foi inicialmente estabelecido por Lazarev em 1947, após
verificar a ação do dibazol (2-benzil-benzimidazol) em experimentos destinados a
estimular a resistência não específica em humanos; Lazarev definiu adaptógenos como
as substâncias que aumentam um estado de resistência não específica dos organismos
após contato com fatores estressantes diversos, promovendo um estado de adaptação
à situação excepcional (PANOSSIAN; WAGNER, 2005). Tais produtos exigem
administração prolongada para exercerem seus efeitos, pois se baseiam na adaptação
e flexibilização da fisiologia da homeostase, ampliando as capacidades adaptativas do
ser humano frente a fatores estressantes diversos.
Adaptógenos são, essencialmente prescritos para fins profiláticos. No entanto,
eles também podem ser usados por indivíduos saudáveis para melhorar o seu
desempenho cognitivo e físico, caso que a sua eficácia é questionável (MENDES,
2011).
Em termos de plantas brasileiras, o pioneiro a abordar o conceito de
adaptógenos foi Carlini (2003), estabelecendo a ponte teórica entre os usos e
propriedades do ginseng coreano e espécies afins com plantas nativas utilizadas com
propriedades tônicas, para melhorar a memória, atenção e o raciocínio e como
estimulantes físicos.
No Brasil, a população desenvolveu o costume de uso com outras espécies, mas
com as mesmas finalidades terapêuticas, isto é, como tônicos gerais aumentando o
estado de ânimo físico e mental, inclusive na área sexual. Algumas dessas espécies
brasileiras popularmente relatadas com tais usos são o guaraná (Paullinia cupana
HBK), o ginseng brasileiro Pfaffia glomerata (Spreng.) Pedersen, a catuaba (Trichilia
catigua Adr. Juss.), a marapuama (Ptychopetalum olacoides Benth.), dentre outras
(MARQUES, 1998).
Considerada a espécie estimulante mais tradicional do Brasil, a marapuama ou
muirapuama é muito presente na medicina popular há mais de um século (SILVA,
1935). Dentre seus usos tradicionais podemos citar, dentre outros: emprego em
reumatismo, nevralgias, paralisias, fraqueza do estômago e dos intestinos, combate a
ataxia locomotora e a impotência sexual masculina (VIEIRA, 1992). Esse perfil amplo
de indicações remete claramente ao conceito de adaptógeno anteriormente citado. Em
outro aspecto, é a espécie que mais tem despertado interesse internacional, conforme
estudos de Auterhoff e Pankow (1968) e Toyota et al. (1979), que avaliaram a espécie
quanto à composição química encontrando a presença de esteróis, cumarina e ácidos
graxos livres. Os resultados apresentados conforme estudos de Silva (2006) estão de
acordo com as alegações terapêuticas feitas por usuários de marapuama, usada
prevalentemente por idosos, convalescentes de doenças do SNC e/ou períodos de
grande estresse físico ou mental, sugerindo forte potencial da espécie Ptychopetalum
olacoides Benth. para o desenvolvimento de medicamento útil a condições que
apresentam déficit cognitivo, tais como envelhecimento e mal de Alzheimer.
Apesar dessa tradicionalidade, a marapuama tem sido pouco investigada
cientificamente em relação aos seus efeitos biológicos. Siqueira (1997) demonstrou que
extrato hidroalcoólico dessa espécie potencializa letalidade induzida por ioimbina,
reverte ptose induzida por reserpina e previne estereotipia induzida por apomorfina, três
modelos indicativos de atividade antidepressiva. Em outro estudo do mesmo grupo,
Piato e colaboradores (2004) demonstraram que extratos da planta potencializam os
tremores induzidos por oxotremorina, confirmando potenciação do efeito
anticolinesterásico da planta, com benefícios sobre a transmissão colinérgica e
facilitação da evocação de memória. Outro grupo avaliou a marapuama no
comportamento de camundongos no teste de nado forçado e campo aberto; obteve-se
diminuição na atividade motora no campo aberto e uma redução da imobilidade no teste
do nado forçado (PAIVA et al., 1998).
O trabalho inicial com a espécie Croton echioides Baill. foi realizado por Novello
e colaboradores (2010) com realização dos testes screening farmacológico (doses de 1,
10, 100 e 500 mg/Kg via intraperitoneal (via i.p.); 500 mg/kg via oral); movimentação
espontânea, coordenação motora e tempo de sono barbitúrico (via i.p.). Os dados
obtidos mostraram sinais de toxicidade e ação depressora para doses superiores a 100
mg/Kg e indicaram as melhores doses a serem utilizadas em outros testes mais
específicos. Foi determinada a capacidade antioxidante do extrato bruto, das frações
obtidas da partição líquido/líquido e dos compostos isolados da fração acetato de etila
(FA). O valor de IC50 calculado para o extrato bruto frente ao padrao Trolox® foi de
167,6 µg/mL e 48,9 µg/mL para a fração FA, a mais ativa. Os alcalóides indólicos
isolados da fração FA foram testados frente a linhagem de células tumorais de cólon
humanas HCT-116 pelo ensaio da sulforhodamina, destacando-se o N-trans-7-
metóxicinamoil-5-hidroxitriptamina com IC50 de 29,3 µg/mL e destruição de 90% das
células tumorais na concentração de 72 µg/mL (NOVELLO et al., 2010).
3 OBJETIVO
3.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar o efeito do Croton echioides Baill. em modelos experimentais sensíveis a
fármacos de ação central.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Avaliar possíveis propriedades ansiolíticas do extrato de C. echioides,
administrado em animais e submetidos ao teste do labirinto em cruz elevado (TLCE) e
ao teste da caixa claro-escuro (TCCE);
Avaliar possíveis propriedades antidepressivas do extrato de C. echioides,
administrado em animais e submetidos ao teste do nado forçado (TNF) e ao teste da
hipotermia induzida por apomorfina (THIA);
Avaliar possíveis efeitos do extrato de C. echioides, administrado em animais e
submetido ao teste da esquiva passiva (TEP) modelo para memória;
Avaliar possíveis efeitos do extrato de C. echioides, administrado em animais e
submetido ao teste da formalina (TF) modelo experimental de dor/analgesia;
Avaliar possível atividade do extrato de C. echioides a teste in vitro de atividade
anticolinesterásica.
Avaliar, com base nos resultados, se de fato o extrato de C. echioides, é uma
fonte alternativa à marapuama amazônica clássica.
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 ANIMAIS
Foram utilizados 131 camundongos Swiss (suíço) machos com idade entre 2 a 3
meses e pesos variando de 30 a 40 g provenientes do Centro de Desenvolvimento de
Modelos Experimentais (CEDEME) – UNIFESP e 60 ratos Wistar pesando 350 a 550 g
provenientes do Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência
em Animais de Laboratório (CEMIB) – UNICAMP.
Os animais foram mantidos por no mínimo uma semana antes dos
procedimentos experimentais no Laboratório Experimental de Farmacologia da UNIBAN
(LAFE) reunidos em grupos de 10 animais por caixa, em sala com temperatura de
24°C, com ciclo claro/escuro (12h) controlados, com água fresca e comida ad libitum
até 60 minutos antes do início dos procedimentos experimentais.
No dia do teste os animais foram transportados para sala de testes
comportamentais, isolada com controle de temperatura, luminosidade, onde nenhuma
outra atividade foi realizada durante os experimentos.
Todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com os
Princípios Éticos na Experimentação Animal adotado pela Uniban, cujo protocolo nº
20090161 foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal
da Universidade Bandeirante de São Paulo, solicitado inicialmente pelo orientador
conforme anexo I do parecer final em 26 de maio de 2009.
4.2 COLETA DO MATERIAL VEGETAL
Foram coletadas as partes aéreas floridas de Croton echioides (Figura 4) no
município de Lagoa Real – BA (autorização de coleta nº 11995-3 de 02/11/2010,
registro no IBAMA nº 1844493, responsável, João Carlos Palazzo de Mello), conforme
anexo II do comprovante de registro para coleta de material botânico, fúngico e
microbiológico. A orientação que levou a essa localidade veio de informação de um dos
distribuidores de São Paulo, que adquire os caules do produtor baiano e os oferta ao
mercado nacional e mesmo internacional, rotulados como marapuama “Ptychopetalum
olacoides”.
Figura 4 - Caules de Croton echioides Baill.
Fonte: NOVELLO, 2010
As exsicatas foram montadas e identificadas pela profª Drª. Daniela Santos
Carneiro Torres como Croton echioides e depositadas no herbário da Universidade
Estadual de Feira de Santana sob tombo (Novello, C.R 01 – HUEFES 1390149) –
(MIYAZAKI et al, 2010).
4.3 EXTRATO
O material botânico do estudo foi adquirido do distribuidor de São Paulo, Nutri
Ervas Ervanaria e Especiarias, apresentando na sua identificação a nomenclatura
marapuama - Ptychopetalum sp. (Figura 5).
O material adquirido foi comparado, em termos de controle de qualidade por
cromatografia em camada delgada, ao material coletado e identificado pela profª Drª.
Daniela Santos Carneiro Torres como Croton echioides Baill. depositado no herbário da
Universidade Estadual de Feira de Santana, confirmando-se a relação entre o lote
comercial e os caules de espécime botanicamente identificada.
Figura 5 - Identificação da planta adquirida para extração
Fonte: Acervo pessoal
Os caules foram moídos em moinho de martelos e submetidos à extração Ultra-
turrax com solvente hidroalcoólico 70% (p/p) por um período de 48 horas, sendo 5
minutos de agitação seguidos por repouso de 2 horas.
Após o período de repouso, o extrato foi filtrado, concentrado em evaporador
rotatório e liofilizado.
Essa produção foi realizada pelo doutorando Cláudio Novello da Universidade
Estadual de Maringá, em 2009, lote nº 04, o qual foi enviado a Uniban, armazenado em
freezer e utilizado como lote único para todas as avaliações.
4.4 REAGENTES, SOLVENTES E FÁRMACOS DE REFERÊNCIA
Para os experimentos farmacológicos foram utilizados os seguintes fármacos
e/ou reagentes: Tween 80 (monooleato de sorbitan etoxilado); escopolamina, formalina,
imipramina e apomorfina (Sigma Chemical Company®), diclofenaco sódico (Novartis®,
lote: S1443); guaraná pó (Purifarma®, lote 104); tampão A: Tris 50 mM, pH 8,0; tampão
B: Tris 50 mM, pH 8,0 contendo 0,1 % de soro albumina bovina (BSA).
4.4.1 Enzimas
Acetilcolinesterase de peixe elétrico (Tipo VI-S, pó liofilizado, 292 U/mg sólido,
394 U/mg proteína, Sigma-Aldrich®, lote: 087K7002).
4.4.2 Substrato
Iodeto de acetiltiocolina (ACTI) (Sigma-Aldrich®).
4.4.3 Reagente colorimétrico
Ácido 5,5’-ditiobis-2-nitrobenzóico (DTNB) (Sigma-Aldrich®), também conhecido
como reagente de Ellman.
4.4.4 Placas de cromatografia de camada delgada
Placas de alumínio para cromatografia de sílica Gel 60 F254, 0,2 mm de
espessura foram adquiridas da Merck (Darmstadt, Alemanha).
4.5 TRATAMENTOS
Todas as soluções foram preparadas momentos antes do início de cada
procedimento experimental.
O extrato de Croton echioides Baill. foi dissolvido em água com gotas de Tween
80 no momento dos testes. As demais substâncias (imipramina, escopolamina,
apomorfina e formalina) foram diluídas somente com água.
Em relação ao tempo de tratamento, todos os experimentos foram agudos com
os animais recebendo a administração dos extratos 1 hora antes do início dos testes. A
exceção a esse esquema deu-se no labirinto em cruz elevado, onde os animais foram
tratados cronicamente por uma semana (7 dias), antes do teste.
As doses administradas do extrato de Croton echioides Baill. nos animais foram:
- Labirinto em cruz elevado = 10 mg/Kg e 50 mg/Kg do liofilizado, administrados
aos animais por via oral (gavage), utilizando água no grupo controle;
- Caixa claro-escuro = 1mg e 50 mg/Kg do liofilizado, administrados aos animais
por via oral (gavage), utilizando água no grupo controle;
- Hipotermia induzida por apomorfina = 10 mg/Kg do liofilizado e 3mg/Kg de
apomorfina, e 10 mg/Kg do liofilizado e 16 mg/Kg de apomorfina, administrados aos
animais por via oral (gavage) e via intraperitonial (via i.p.), utilizando no grupo controle
água e 16 mg/Kg de apomorfina;
- Nado forçado = 10mg e 50 mg/Kg do liofilizado, administrados aos animais por
via oral (gavage) utilizando água no grupo controle e imipramina 30mg/Kg no grupo
controle positivo administrado via intraperitonial (via i.p.);
- Esquiva passiva = 100 mg/Kg do liofilizado e 1 mg/Kg de escopolamina
administrados aos animais por via oral (gavage) e via intraperitonial (via i.p.), utilizando
água no grupo controle e água e 1 mg/Kg de escopolamina no grupo controle positivo;
- Analgesia= 100 mg/Kg do liofilizado administrados aos animais por via oral
(gavage), utilizando água no grupo controle e 25 mg/Kg de diclofenaco sódico no grupo
controle positivo por via intraperitonial (via i.p.).
4.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA
A análise estatística realizada foi feita pelo GraphPad Software In Stat 3.05,
sendo que os testes foram a ANOVA de uma via. Nos casos de significância, a análise
foi seguida pelo teste de comparações múltiplas de Tukey. Adotou-se p < 0,05 como
nível mínimo de significância e os resultados estão expressos em média e erro padrão
da média.
5 MÉTODOS EXPERIMENTAIS
5.1 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANSIOLÍTICA
5.1.1 Teste do labirinto em cruz elevado
O labirinto em cruz elevado (LCE) é baseado no modelo proposto, em ratos, por
Pellow e colaboradores (1985) e validado por Lister (1987) para camundongos, e
consiste de dois braços abertos opostos (30 x 5 x 25 cm) e dois fechados (30 x 5 x 25
cm), também opostos, em forma de cruz grega. Os braços abertos e fechados estão
conectados por uma plataforma central (5 x 5 cm). O suporte é confeccionado em
madeira e as paredes laterais dos braços fechados e o chão são confeccionados em
madeira. O aparelho fica elevado a uma altura de 45 cm do nível do chão (Figura 6).
Figura 6 - Labirinto em cruz elevado
Fonte: Laboratório Experimental de Farmacologia da UNIBAN (LAFE)
Os animais foram tratados via oral durante uma semana (água; C. echioides 10
mg/Kg e C. echioides 50 mg/Kg); após cerca de uma hora depois da ultima
administração, os animais foram colocados individualmente no centro do aparelho com
a cabeça voltada para um dos braços fechados e os seus comportamentos registrados
por 5 minutos. As medidas comportamentais registradas no LCE foram: número de
entradas e o tempo despendido nos braços abertos e nos braços fechados; número de
cruzamentos e tempo no centro e números de vezes que executou o comportamento de
mergulhar a cabeça (“head dipping”) e defecação.
Assim, animais tratados com fármacos ansiolíticos tendem a aumentar o número
de entradas e o tempo de permanência nos braços abertos, enquanto animais tratados
com fármacos ansiogênicos tendem a ficar mais tempo nos braços fechados.
5.1.2 Teste da caixa claro-escuro
A CCE é composta por uma arena em acrílico (46 x 27 x 30 cm de altura)
dividida em dois compartimentos: o menor (15 x 27 x 30 cm) é preto e dotado de tampa,
e o maior (31 x 27 x 30 cm) é branco e iluminado diretamente por uma lâmpada
fluorescente (fria) de 20 W. Os dois compartimentos são separados por uma placa de
acrílico preta de 27 x 30 cm (base x altura) com uma abertura de 7,5 x 7,5 cm localizada
no centro da divisão, ao nível do chão (Figura 7).
Figura 7 – Aparato da caixa claro/escuro
Fonte: Laboratório Experimental de Farmacologia da UNIBAN (LAFE)
Cerca de uma hora após o tratamento via oral (água; C. echioides 1 mg/Kg e C.
echioides 10 mg/Kg), os animais foram colocados individualmente no centro da parte
iluminada de frente para a abertura que leva ao lado escuro da caixa. Os
comportamentos executados durante 5 minutos após a sua primeira entrada no lado
escuro foram registrados os seguintes parâmetros comportamentais: número de
transições entre os dois compartimentos; tempo gasto em cada compartimento claro; e
número de levantamentos (“rearing”) realizados no compartimento claro.
5.2 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIDEPRESSIVA
5.2.1 Teste da hipotermia induzida por apomorfina
Antes do início de cada tratamento via oral (água; C. echioides 10 mg/Kg), a
temperatura basal retal dos animais foi registrada, utilizando-se um termômetro digital
introduzido a cerca de 1,5 cm dentro do reto até a estabilização da temperatura
(aproximadamente 30 segundos). A temperatura retal foi mensurada duas vezes, antes
(T1) com o tratamento 10 mg/Kg e 1 hora após os diferentes tratamentos (T2) via
intraperitonial (via i.p.) 3mg/Kg de apomorfina e 16 mg/kg de apomorfina. A variação da
temperatura foi estimada como T = T2-T1, para cada animal (CARLINI et al. 1986;
DUARTE et al., 2007). Este teste tem sido utilizado regularmente nos últimos anos
(MOREIRA, 2010).
5.2.2 Teste do nado forçado
O procedimento experimental consistiu em colocar camundongos,
individualmente, em um cilindro de acrílico com 25 cm de diâmetro, 30 cm de altura e
com 15 cm de água mantida a 24°C, após tratamento via oral (água; C. echioides 10
mg/Kg e C. echioides 50 mg/Kg) e via intraperitonial (imipramina 30 mg/Kg). Cada
animal foi colocado por cinco minutos no cilindro e o tempo de imobilidade foi
registrado. Os animais são considerados imóveis quando reduzem os seus movimentos
ao mínimo necessário para fazê-lo flutuar na água (SAKINA et al., 1990; PAIVA et
al.,1998). Este teste tem sido utilizado regularmente nos últimos anos (ESTANISLAU,
2011).
A B C
Figura 8 - Ilustração representativa do tanque cilíndrico para indução do nado forçado.
A) Comportamento de Imobilidade; B) Comportamento de Nadar; C) Comportamento de
Escalar
Fonte: CRYAN et al., 2005
5.3 AVALIAÇÃO DA ANALGESIA
5.3.1 Teste da formalina
Cerca de uma hora após o tratamento via oral (água; C. echioides 100 mg/Kg) e
via intraperitonial (diclofenaco sódico 25 mg/Kg). Os animais recebem 20µl da solução
de formalina (1%) via intraperitonial, utilizando-se seringa. Logo após a injeção, os
animais são colocados sob campânulas de vidro e observados individualmente. O
tempo que o animal passa lambendo (Figura 9), mordendo ou agitando vigorosamente
a pata são cronometrados nos primeiros cinco minutos seguintes à injeção e a partir do
20.º até o 30.º minuto. Os resultados obtidos a partir dos grupos tratados são
comparados com os grupos controles.
Figura 9 – Lambedura da pata posterior do camundongo
Fonte: GUIMARÃES et al., 2010.
5.4 AVALIAÇÃO DA REVERSÃO DOS EFEITOS AMNÉSICOS DA ESCOPOLAMINA
5.4.1 Teste de esquiva passiva
Utilizam-se duas caixas acrílicas, uma clara e outra escura, ambas medindo 30 x
21 x 30 cm, interligadas por uma pequena porta retangular. Todo o assoalho da caixa é
feito em grades metálicas que ficam conectadas a um gerador de choque elétrico que
permite a aplicação de choques de diversas intensidades por tempos variáveis, sendo
aplicado apenas no lado da caixa escura.
Primeira exposição (treino) – nesta exposição à esquiva inibitória os animais
foram distribuídos aleatoriamente em 3 grupos (Tabela 1). Após 60 minutos do
tratamento de cada animal (água; água + escopolamina 1mg/Kg e C. echioides 100
mg/Kg + escopolamina 1mg/Kg), cada animal foi colocado individualmente na parte
clara, e tempo de permanência na mesma foi registrado, em segundos (latência 1).
Assim que o animal colocou as quatro patas na parte escura, recebeu 2 choques (0,8
mA por 1 segundo) com intervalo de 15 segundos. Em seguida os animais foram
retirados do aparato, alojados nas caixas coletivas e mantidos por 24 horas.
Segunda exposição (teste) – nesta exposição à esquiva passiva após 24 horas,
os mesmos animais dos três grupos (água, água + escopolamina 1mg/Kg e C.
echioides 100 mg/Kg + escopolamina 1mg/Kg) foram reexpostos individualmente ao
aparato (sem administração do choque) para avaliação do tempo (segundos) de
permanência na mesma (latência 2). Após o período de teste, entre as sessões, o
aparato foi limpo com pano descartável e solução hidroalcoólica a 5%.
Tabela 1 - Esquema de tratamento do teste de esquiva passiva
Grupos Número de animais (n)
Água 10
Água + escopolamina 1mg/Kg 10
C. echioides 100 mg/Kg + escopolamina 1 mg/Kg 10
5.5 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTICOLINESTERÁSICA
O ensaio foi realizado conforme Rhee e colaboradores (2001). Resumidamente,
as amostras foram aplicadas em placas de CCD e após o desenvolvimento com o
solvente adequado, as placas foram completamente secas. Aplicou-se sobre as placas
a solução de substrato iodeto de acetiltiocolina 1 mM com tampão Tris HCl pH 8, em
seguida o reagente de Ellman 1 mM com tampão Tris HCl pH 8. Após completa
secagem da placa uma solução de enzima AChE 3 UI/mL foi borrifada e alguns minutos
se passaram até o desenvolvimento de manchas brancas sob um fundo amarelo
indicando a presença de compostos inibidores da enzima acetilcolinesterase (RHEE et
al., 2001). Correu-se, em paralelo e com sistema eluente proprio, extrato de sementes
de Paullinia cupana (guaraná em pó), aplicando-se sobre esta placa a mesma
sequencia de reagentes citada acima.
Resultados falsos positivos foram eliminados pelo método descrito (Figura 10)
por Rhee e colaboradores (2003). As mesmas amostras foram aplicadas em placas de
CCD e desenvolvidas com o mesmo sistema de solvente para o teste positivo. Após
secagem, a placa foi borrifada com uma sequência diferente dos mesmos reagentes do
teste positivo. Primeiro foi borrifado a solução de reagente de Ellman e, após secagem,
uma solução de substrato (ACTI) e da enzima AChE a 37 °C (RHEE et al., 2003).
Figura 10 - Sequência de reações para detecção de atividade anticolinesterásica pelo
método de Ellman
Fonte: RHEE et al., 2003
6 RESULTADOS e DISCUSSÃO
6.1 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANSIOLÍTICA
6.1.1 Teste do labirinto em cruz elevado
A funcionalidade deste teste como modelo animal de ansiedade baseia-se na
atividade exploratória espontânea e na aversão natural dos roedores por espaços
abertos. O número de entradas e o tempo gasto nos braços abertos são indicadores
inversamente relacionados à ansiedade (PELLOW et al., 1985). Este teste tem sido
utilizado regularmente nos últimos anos (LIMA, 2010).
Os resultados obtidos após o tratamento estão representados na tabela 2.
Observa-se nesses dados o aumento no tempo de permanência nos braços abertos e
diminuição nos braços fechados para os animais tratados com C. echioides dose de 10
mg/kg, perfil de dados que relaciona-se a efeito ansiolítico. Apesar desse indicativo, os
dados não apresentam significância estatística, contradição que provavelmente está
relacionada ao alto erro padrão dos grupos.
Outros parâmetros desse teste estão expressos nas figuras 11 e 12, as quais
mostram o tempo de permanência na área central e o número de ameaças de entrada.
Em ambos ocorreu significância estatística, seja entre grupo controle (água) e tratados
com C. echioides (doses 10 e 50 mg/kg) no tempo na área central, ou entre controle e
dose de 10 mg/kg no parâmetro ameaças de entrada.
Outro aspecto verificável nos resultados do LCE é o menor número de bolos
fecais nos animais tratados com ambas as doses de C. echioides (10 e 50 mg/Kg)
frente ao controle (água), os quais, embora também sem significância estatística,
parecem relacionar-se a um estado de menor ansiedade dos animais no modelo
utilizado.
Esses dois resultados positivos somados ao aumento no tempo de permanência
na área aberta e diminuição na fechada ocorridos com a dose de 10 mg/kg, sem
significância, sugerem possível atividade ansiolítica ao extrato de C. echioides.
Tabela 2 - Parâmetros comportamentais registrados em camundongos no TLCE
Grupos Controle (Água) (n=10)
C. echioides 10 mg/Kg
(n=9)
C. echioides 50 mg/Kg
(n=10)
Nº entradas 3,7±0,7 2,7±0,5 2,7±0,9 Braços abertos Tempo (s) 67,2±13,4 85,5±10,2 60,5±15,9
Nº entradas 6,2±1,2 4,4±0,6 4,1±0,8 Braços fechados Tempo (s) 232,8±13,4 214,5±10,2 239,5±15,9
Cruzamentos Nº 4,1±0,7 3,3±0,6 3,9±0,9
Tempo na área central (s) 39,4±6,2 11,7±1,5** 7,4±2,5**
Ameaças de entrada (nº) 10,8±1,8 18,6±1,7* 13,5±2,3
Head dip 11,8±2,3 14,9±1,5 11,8±2,8
Defecação (nº) 1,2±0,4 0,4±0,2 0,4±0,2
Efeito da administração oral após 60 minutos do tratamento com doses de C. echioides
10 mg/Kg, 50 mg/Kg em relação ao grupo controle (água). Os números representam as
médias ± EP dos grupos. n=número de animais por grupo. Os dados foram submetidos
a análise de variância ANOVA seguido do teste de Tukey. Asteriscos indicam
diferenças significantes comparadas com o grupo controle (*p<0,05; **p<0,01).
Figura 11 – Tempo de permanência na área central apresentado em relação ao tempo
de permanência total no labirinto, após 60 minutos do tratamento oral com doses de C.
echioides 10 mg/kg, 50 mg/kg em relação ao grupo controle (água). Os números
representam as médias ± EP dos grupos. N= 9 e 10;
** p < 0,01 comparado ao grupo controle pela Anova seguida do teste de Tukey.
Figura 12 – Número de ameaças de entrada apresentado em relação ao tempo de
permanência total no labirinto, após 60 minutos do tratamento oral com doses de C.
echioides 10 mg/kg, 50 mg/kg, em relação ao grupo controle (água). Os números
representam as médias ± EP dos grupos. N= 9 e 10;
* p < 0,05 comparado ao grupo controle pela Anova seguida do teste de Tukey.
Os diferentes parâmetros avaliados no labirinto em cruz elevado são
correlacionados tanto com a atividade ansiolítica quanto com a atividade motora e
exploratória, com a possibilidade de diferentes interpretações dos comportamentos
(RODGERS et al., 1997). Este é um modelo baseado em respostas incondicionadas a
ambientes potencialmente perigosos, e os roedores tendem a evitar locais
desprotegidos e elevados (GRAEFF; GUIMARÃES, 2000), aqui representados pelos
braços abertos.
Assim, segundo Rodgers e colaboradores (1997), os principais parâmetros no
labirinto em cruz elevado associados à ansiedade são o número de entradas e o tempo
de permanência nos braços abertos, considerados de modo relativo ao total de
entradas e ao tempo total de permanência no labirinto. Os outros parâmetros como
área central e ameaças de entrada são pouco explorados nesse teste, sendo medidas
do comportamento de avaliação de risco, que se correlaciona com uma tomada de
decisão e o número de bolos fecais, emocionalidade (LAPA, 2008).
A existência da plataforma central no labirinto é a oportunidade de escolha que
este aparelho oferece entre as áreas protegidas e desprotegidas, sendo
frequentemente associada à tomada de decisão de escolha por uma das entradas;
assim, o tempo gasto na plataforma central seria indicativo do conflito associado à
situação e a avaliação de risco (RODGERS et al., 1997), e quanto maior esse tempo
mais indefinição estaria configurada. A avaliação de risco representa uma antecipação
de um perigo potencial, sendo um comportamento defensivo de grande valor
adaptativo; ainda assim, indivíduos ansiosos parecem mais freqüentemente tentar
antecipar tal ameaça no intuito de lidar melhor com isto, o que acaba por dificultar as
decisões. O parâmetro ameaça de entrada teria relação com tal contexto de indecisão.
6.1.2 Teste da caixa claro-escuro
O procedimento experimental do teste da caixa claro/escuro (TCCE) foi
elaborado por Crawley e Goddwin em 1980. Este modelo experimental apresenta um
alto grau de homologia para o transtorno da ansiedade generalizada (TAG) que
caracteriza-se por uma ansiedade ou preocupação excessiva (ZANGROSSI Jr.;
GRAEFF, 2004), e é baseado no conflito natural que ocorre quando os animais são
expostos a um ambiente não familiar. Tal conflito é gerado devido à tendência
exploratória natural dos roedores e a tendência de evitar o desconhecido – neofobia. A
atividade exploratória reflete o resultado combinado destas tendências na nova
situação. Assim, na caixa claro/escuro, os fármacos ansiolíticos induzem um aumento
nos comportamentos executados na parte clara. Um aumento na transição entre o
ambiente claro e escuro, sem um aumento na locomoção espontânea, é considerado
reflexo da atividade ansiolítica (BOURIN; HASCÖET, 2003). Este teste tem sido
utilizado regularmente nos últimos anos (MOYSÉS, 2010).
Os resultados obtidos na avaliação dos animais na passagem da caixa claro-
escuro após o tratamento estão representados na tabela 3. Assim pode-se observar o
aumento no tempo de permanência no lado claro e diminuição no lado escuro (Figura
13) dos animais tratados com a dose de 10 mg/kg, de modo estatisticamente
significante. Em complemento, nota-se também um aumento importante na latência de
passagem ao lado escuro dos animais também tratados com a dose de 10 mg/kg, dado
que, embora sem significância estatística, evidencia um estado de menor ansiedade
dos animais tratados nesse ambiente claro, geralmente considerado aversivo ou pouco
agradável aos roedores.
Tabela 3 - Parâmetros comportamentais registrados em camundongos no TCCE
Grupos n=10
Controle (Água)
C. echioides 1mg/Kg
C. echioides 10 mg/Kg
Latência de passagem para o lado escuro (s) 36±6,5 27±5,6 68,6±26
Tempo no lado claro (s) 103±7,8 109±9,8 144±17*
Tempo no lado escuro (s) 197±7,8 191±9,8 156±17*
Ameaças de entradas (nº) 10±0,8 11±1,4 9,6±1,3
Defecação (nº) 0,5±0,4 0,9±0,5 0,4±0,3
Entradas no lado claro (nº) 5,3±0,5 6,2±0,6 6,1±1,0
Entradas no lado escuro (nº) 6,3±0,7 7,4±0,7 7,1±1,1
Efeito da administração oral após 60 minutos do tratamento com doses de C. echioides 1 mg/Kg, 10 mg/Kg em relação ao grupo controle (água). Os números representam as médias ± EP dos grupos. n=número de animais por grupo. Os dados foram submetidos a análise de variância ANOVA seguido do teste de Tukey. Asteriscos indicam diferenças significantes comparadas com o grupo controle (*p<0,05).
Figura 13 – Tempo de permanência no lado claro e escuro apresentado em porcentagem em relação ao tempo de permanência total na caixa, após 60 minutos do tratamento oral com doses de C. echioides 1mg/kg, 10 mg/kg, em relação ao grupo controle (água). Os números representam as médias ± EP dos grupos. N = 10 * p < 0,05 comparado ao grupo controle pela Anova seguida do teste de Tukey.
Crawley e Goodwin (1980) utilizaram o número de transições feitas por
camundongos entre os dois compartimentos de uma caixa, como índice de ansiedade.
Estes compartimentos consistem em uma câmara grande e fortemente iluminada
contínua com outra menor e escura. Neste teste, a luz funciona como um estímulo
ansiogênico, e existe um aparente conflito entre a motivação de explorar e a de evitar o
compartimento claro do aparelho. Fármacos que aumentam o número de transições
claro-escuro bem como que aumentam a latência de passagem e tempo de
permanência no lado claro, em doses que não elevam a atividade motora, são
considerados ansiolíticos (YOUNG; JOHNSON, 1991).
Portanto, em conjunto, os dados dos testes no LCE e na CCE apontam à
existência de potencial ansiolítico ao extrato de C. echioides, principalmente na dose de
10 mg/kg. Tal efeito não encontra relação imediata com o emprego popular dessa droga
vegetal, mais direcionado a possíveis efeitos adaptógenos, expressos em maior
resistência, menor fadiga e maior atividade física e sexual.
Em relação à espécie Ptychopetalum olacoides, a marapuama amazônica que
comercialmente é substituída por C. echioides, curiosamente esta demonstrou efeitos
ansiogênicos, isto é, geradores de estados ansiosos, conforme estudos de Silva e
colaboradores (2002). Empregando extrato etanólico das raízes nas doses de 30, 100 e
300 mg/kg, os autores encontraram diminuição do comportamento exploratório no hole-
board test, sem interferência na atividade ou coordenação motora, sugerindo-se assim
um possível efeito ansiogênico a esse extrato.
Indubitavelmente, o sistema GABAérgico está envolvido na neuroquímica da
ansiedade. A hipótese GABAérgica prediz que durante os estados de ansiedade há
uma sobreposição do sistema glutamatérgico (excitatório) ao GABAérgico (inibitório)
(KIM; GORMAN, 2005). É também bastante conhecido e aceito como verdadeiro que
drogas ansiolíticas tipo benzodiazepínicos atuam clinicamente via aumento do efeito do
GABA no receptor GABAA. Agonistas clássicos do receptor GABAA aumentam a
afinidade do neurotransmissor GABA com o receptor, favorecendo então a
neurotransmissão inibitória central (KIM; GORMAN, 2005).
6.2 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIDEPRESSIVA
6.2.1 Teste da hipotermia induzida por apomorfina
Camundongos tratados com apomorfina apresentam redução da temperatura
retal e este efeito é prevenido por fármacos conhecidamente antidepressivos, como a
imipramina (PUECH et al., 1981). Substâncias com ação antidepressiva bloqueiam a
hipotermia induzida pela dose alta de apomorfina, mas não a induzida pela menor dose
desse agonista dopaminérgico (LAPA et al., 2008). A fim de investigar uma possível
atividade antidepressiva de C. echioides foram testados os efeitos da apomorfina sobre
a temperatura retal de camundongos tratados com o extrato dessa planta.
Os dados obtidos neste teste estão expressos na tabela 4 a seguir. Conforme
sugerido na literatura (LAPA et al., 2008), foram utilizadas duas doses de apomorfina,
posto que os fármacos antidepressivos tem a propriedade de antagonizar a diminuição
da temperatura promovida pela maior dose, mas não pela menor.
No entanto, nenhum efeito significante foi obtido nos animais tratados com
extrato de C. echioides na diminuição da temperatura promovida pela apomorfina em
duas doses, demonstrando que esse fitoterápico não parece promover tais efeitos,
embora atividade antidepressiva possa ser relacionada ao uso popular afrodisíaco,
como ocorre com a catuaba Trichilia catigua (CAMPOS et al., 2005).
Tabela 4 - Parâmetros comportamentais registrados em camundongos no THIA
Grupos (n=10)
Controle (Água)
+ 16 mg/Kg
apomorfina
C. echioides 10 mg/Kg
+ 3 mg/Kg
apomorfina
C. echioides 10 mg/Kg
+ 16 mg/Kg
apomorfina
Temperatura inicial ºC 36,8±0,3 37,7±0,3 37,4±0,2
Temperatura após adm. da apomorfina ºC 32,1±0,08 32,8±0,3 32,1±0,1
Diferenças entre as temperaturas ºC 4,7±0,3 4,9±0,4 5,2±0,2
Efeito da administração após 60 minutos do tratamento com doses de C. echioides 10
mg/Kg (v.o) e apomorfina 3 mg/Kg (i.p) e C. echioides 10 mg/Kg (v.o) e apomorfina 16
mg/Kg (i.p) em relação ao grupo controle água (v.o) e apomorfina 16 mg/Kg (i.p). Os
números representam as médias ± EP dos grupos. n=número de animais por grupo. Os
dados foram submetidos a análise de variância ANOVA seguido do teste de Tukey.
6.2.2 Teste do nado forçado
Os resultados do teste de nado forçado estão expressos na tabela 5 a seguir. De
modo coerente com os obtidos no teste anterior, nenhum efeito significante foi obtido
nos animais tratados com extrato de C. echioides, mas obtendo-se positividade no
grupo controle positivo tratado com o fármaco antidepressivo imipramina 30 mg/kg.
Tabela 5 - Parâmetros comportamentais registrados em camundongos no TNF.
Grupos (N=10) Controle (Água) Imipramina 30 mg/Kg
C. echioides 10 mg/Kg
C. echioides 50 mg/kg
Tempo de imobilidade (s) 142,7±17,7 59,2±14,8* 98,5±20,2 113±11,3
Efeito da administração após 60 minutos do tratamento com doses de C. echioides 10
mg/Kg e 50 mg/Kg (v.o), imipramina 30 mg/Kg (i.p.) em relação ao grupo controle
(água). Os números representam as médias ± EP dos grupos. n=número de animais
por grupo. Os dados foram submetidos a análise de variância ANOVA seguido do teste
de Tukey. Asteriscos indicam diferenças significantes comparadas com o grupo controle
(*p<0,05).
Alguns modelos para se avaliar a ação antidepressiva buscam uma semelhança
comportamental entre homem e animais, e neste sentido certos modelos de estresse
são utilizados amplamente no estudo de substâncias com propriedades
antidepressivas.
O teste do nado forçado foi desenvolvido por Porsolt e colaboradores (1977) para
avaliar possíveis ações antidepressivas, com as vantagens de não requerer
treinamento sofisticado e ser barato. No presente estudo, o controle positivo utilizado foi
a imipramina, um antidepressivo tricíclico usado na terapia da depressão (SULCER,
1983). A dose utilizada foi de 30 mg/Kg, conforme usualmente empregado na literatura.
Em conjunto, os dois testes de atividade antidepressiva confirmam a inexistência,
dentro das condições testadas, do potencial efeito antidepressivo do extrato de C.
echioides.
Comparativamente à espécie que pretende substituir, a marapuama amazônica
(raízes de Ptychopetalum olacoides), por sua vez, foi avaliada em modelos animais de
natação forçada e teste de suspensão pela cauda, obtendo-se um efeito anti-
imobilidade positivo e dose-dependente ao tratamento com extrato nas doses de 15-
100 mg/kg i.p. e 300 mg/kg via oral. Os mecanismos desse efeito parecem
possivelmente estar mediados por receptores beta-adrenérgicos e dopaminérgicos D1
(PIATO et al., 2009).
O sistema dopaminérgico também está implicado na regulação do humor
(DAILLY et al., 2004). Algumas evidências bioquímicas originadas de estudos clínicos
mostram que níveis plasmáticos do ácido homovanílico e do ácido 3,4-
dihidroxifenilacético, dois metabólitos da dopamina, estão diminuídos em pacientes
deprimidos, indicado uma diminuição no “turnover” da dopamina (MITANI et al., 2006;
SHER et al., 2006).
Tem sido considerado que a potencialização da neurotransmissão
dopaminérgica induzida pelo tratamento crônico com antidepressivo pode contribuir
para sua eficácia terapêutica (D´AQUILA et al., 2000) e há também uma considerável
evidência farmacológica associada a eficácia terapêutica dos antidepressivos com
efeitos dopaminérgicos no tratamento da depressão (PAPAKOSTAS, 2006).
6.3 AVALIAÇÃO DA ANALGESIA
6.3.1 Teste da formalina
Com o objetivo de caracterizar a atividade antinociceptiva, foi utilizado o teste da
formalina em ratos, um modelo químico de nocicepção que fornece uma resposta mais
específica em comparação com o modelo do ácido acético (SHIBATA, 1989), além de
ser considerado atualmente o modelo que mais se aproxima da dor clínica (TJÖLSEN;
HOLE, 1997).
A principal característica deste teste é o fato de que o animal apresenta duas
fases diferentes de nocicepção, que parece envolver estímulos distintos. A primeira fase
inicia-se imediatamente após a injeção de formalina e estende-se pelos primeiros 15
minutos (dor neurogênica ou aguda). A segunda fase ocorre entre 20 - 30 minutos (dor
inflamatória) após a injeção de formalina e está relacionada com a liberação de vários
mediadores pró-inflamatórios, como a bradicinina, prostaglandinas e serotonina, entre
outros (HUNSKAAR; HOLE, 1987).
Os resultados do teste mostram negatividade da antinocicepção na primeira fase
(0- 15 minutos) induzida por formalina, pois o tratamento por via oral com C. echioides
(100 mg/kg) não alterou significativamente o tempo de sensibilidade, expressos na
lambedura das patas, dos animais quando comparado ao grupo controle (água) e ao
grupo diclofenaco sódico (25 mg/Kg). Na segunda fase (15-30 minutos), encontrou-se
um aumento no tempo de lambedura das patas após o tratamento com C. echioides
quando comparado ao grupo controle (água) e ao grupo diclofenaco sódico; tal
aumento, no entanto, não apresentou significância estatística (Figura 14).
Figura 14 – Tempo de lambedura das patas apresentado em porcentagem em relação
ao tempo de permanência durante as duas fases do teste de analgesia com tratamento
de dose de C. echioides 100 mg/kg (v.o), em relação ao grupo controle (água) e ao
grupo diclofenaco sódico 25 mg/Kg (i.p). Os números representam as médias ± EP dos
grupos.
A atividade inflamatória é bastante conhecida por ativos presentes nesse gênero,
como por exemplo, os ésteres de forbol que mobilizam fosfolipídeos, liberando ácido
araquidônico e causando a secreção de prostaglandinas, levando a uma resposta
inflamatória dos tecidos (EVANS; EDWARDS, 1987).
6.4 AVALIAÇÃO DA REVERSÃO DO EFEITO AMNÉSICO DA ESCOPOLAMINA
6.4.1 Teste de esquiva passiva
A tabela 6 mostra os resultados obtidos no teste de esquiva passiva, um modelo
usual para verificação de efeitos sobre aprendizagem e memória. Observamos que não
ocorreu diferença significativa entre os grupos, não havendo reversão dos efeitos
amnésicos induzidos pela escopolamina.
Tabela 6 - Parâmetros comportamentais registrados em ratos no TEP
Grupos (n=10) Água
Água + escopolamina
1mg/Kg
C. echioides 100 mg/Kg +
escopolamina 1mg/Kg
Latência de retenção 207,8±39,6 132,2±32 87,5±32
Efeito da administração oral após 60 minutos do tratamento com dose de C. echioides
100 mg/Kg (v.o) e escopolamina 1mg/Kg (i.p) em relação ao grupo controle água e
escopolamina 1 mg/Kg. Os números representam as médias ± EP dos grupos.
n=número de animais por grupo. Os dados foram submetidos a análise de variância
ANOVA seguido do teste de Tukey.
Embora os resultados não tenham sido significantes, vale comentar que o
comportamento dos animais, mesmo dos grupos controle (água) e escopolamina (água
+ escopolamina) não foram os usuais e esperados para esse tipo de teste. Geralmente
os animais controle (água) lembram dos efeitos aversivos do choque aplicado no
primeiro dia, permanecendo na parte clara do equipamento por um tempo longo,
normalmente maior que os 207 segundos de média encontrados. Já os animais
tratados com escopolamina ficam bloqueados na sua capacidade de lembrança do
choque aversivo e mostram baixa latência de entrada na parte escura do equipamento,
ou seja o resultado esperado deveria ser menor do que os 132 segundos encontrados
neste caso.
Ao grupo em avaliação (C. echioides + escopolamina) não haveria o que esperar
a priori, obtendo-se um valor (87,5 segundos) que fica totalmente sem contexto posto
que os controles não desempenharam de modo padrão, impossibilitando qualquer
interpretação mais conclusiva sobre os efeitos desse extrato sobre aprendizagem e
memória.
Por outro lado, como esse teste é agudo e artificial, sua relação total com estado
biológico alterado é difícil, sendo um modelo prático, mas de questionável relação com
as patologias que se pretende buscar novos medicamentos. Esse aspecto tem levado à
realização de modelos com roedores envelhecidos, os quais apresentam déficits de
aprendizagem e memória mais afins às patologias humanas, mas são de difícil
execução, além de demandarem maior tempo e custo (MARQUES, 1998).
Outra opção tem sido os modelos in vitro e in vivo de atividade
anticolinesterásica, os quais apontam diretamente a mecanismos relacionados ao
neutransmissor acetilcolina, o mais diretamente envolvido nos déficits cognitivos
encontrados em patologias neurodegenerativas como a doença de Alzheimer (LIAPI et
al., 2009).
6.5 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTICOLINESTERÁSICA
A figura 15 elucida a relação existente entre o extrato obtido e a avaliação da
atividade anticolinesterásica do mesmo. A enzima acetilcolinesterase hidrolisa o
substrato de acetiltiocolina gerando como produto a tiocolina que após reagir com o
ácido 5,5'-ditiobis-[2-nitrobenzóico] produz o 2-nitrobenzoato-5-mercaptotiocolina e o 5-
tio-2-nitrobenzoato gerando uma coloração amarela. A formação de halos brancos
indica inativação da enzima acetilcolinesterase pelo extrato de Croton echioides, não
gerando o produto de degradação citado.
Figura 15 - Fotos das placas de CCD de extrato de guaraná à esquerda (quatro
aplicações do extrato seguido de cafeina) e de extrato de C. echioides (à direita)
evidenciando a positividade do teste preliminar de ação anticolinesterásica.
Esta área de fármacos anticolinesterásicos tem sido uma das mais destacadas
nos últimos anos, pois as doenças neurodegenerativas vêm crescendo
progressivamente em todos os países do mundo. Como os principais medicamentos
para a doença de Alzheimer são anticolinesterásicos, à exceção do fármaco memantina
de ação antiglutamatérgica, o desenvolvimento de novos fármacos ou extratos vegetais
com essa propriedade são muito oportunos e interessantes.
Desse modo, embora o extrato de C. echioides não tenha promovido efeitos no
modelo de esquiva passiva, o qual é por demais artificial frente às patologias humanas,
a positividade obtida neste teste em CCD é auspiciosa, pois evidencia um efeito
relevante, ainda mais para uma droga vegetal amplamente comercializada e utilizada
para problemas do sistema nervoso central.
De modo coerente, neste caso, também a marapuama amazônica demonstra
efeitos anticolinesterásicos positivos, conforme estudos de Figueiró e colaboradores
(2010), os quais avaliaram administração oral de extrato da planta em modelos
histoquímicos em áreas cerebrais relacionadas à atividade colinérgica, demonstrando
efetivamente que a marapuama amazônica tem efeitos anticolinesterásicos e seus
ativos são oralmente biodisponíveis.
No caso de C. echioides, novos experimentos in vitro e principalmente in vivo são
oportunos para aprofundar o efeito ora evidenciado e aprofundar seu potencial de
substituição ou alternativa às raízes da marapuama amazônica, droga vegetal de difícil
acesso e obtenção.
Destaque-se como um aspecto não citado na literatura, o fato, verificado na
placa de CCD com guaraná, que alguns sistemas eluentes interferem com a geração de
coloração amarela típica do reagente de Ellmann, por influências não devidamente
esclarecidas.
7 CONCLUSÃO
Os resultados em conjunto sobre a avaliação dos efeitos do C. echioides
permitem sugerir como conclusões:
a) dos vários experimentos utilizados, destacam-se os resultados positivos no
LCE e CCE, com pelo menos quatro parâmetros significantes que apontam à existência
da ação ansiolítica deste extrato, cujas doses e outros aspectos necessitam ser ainda
melhor avaliados para a adequada definição a respeito;
b) com base nos dois modelos de atividade antidepressiva, ambos negativos, o
extrato de C. echioides parece de fato não ter potencial nessa área;
c) em termos de avaliação da reversão do efeito amnésico da escopolamina não
houve positividade no teste da esquiva passiva, embora o método e o comportamento
dos animais não permita conclusão definitiva sobre estes efeitos; como houve clara
positividade no teste anticolinesterásico em CCD, sugere-se a busca de outros modelos
mais pertinentes e afins aos déficits cognitivos humanos, visando-se confirmar o
potencial da planta em tais patologias;
d) sem significância em termos de analgesia.
Através dos resultados obtidos, reforça-se a hipótese de que os caules de C.
echioides apresentam, de fato, perfil distinto da marapuama amazônica em termos
farmacológicos, com apenas alguma relação em termos do efeito anticolinesterásico e
oposto em termos de efeitos ansiolíticos.
Novas pesquisas são oportunas para aprofundar os dados aqui expostos.
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ANEXO I
ANEXO II
