UNIVERSIDADE DE CUIABÁ

Programa de Pós-Graduação em Biociência Animal Àrea de Concentração Saúde Animal

ROBERTO MOREIRA

ASPECTO RADIOLÓGICO E MACROSCÓPICO DE MATRIZ ÓSSEA MINERALIZADA HETERÓLOGA FRAGMENTADA E POLIMETILMETACRILATO

AUTOCLAVADOS EM FALHA ÓSSEA DE TÍBIA DE COELHO

Cuiabá, 2013

ROBERTO MOREIRA

ASPECTO RADIOLÓGICO E MACROSCÓPICO DE MATRIZ ÓSSEA MINERALIZADA HETERÓLOGA FRAGMENTADA E POLIMETILMETACRILATO

AUTOCLAVADOS EM FALHA ÓSSEA DE TÍBIA DE COELHO

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Biociência Animal, da Universidade de Cuiabá – UNIC, como requisito parcial para obtenção do Título de Mestre em Biocência Animal. Área de Concentração Saúde Animal. Orientador: Prof. Dr. Silvio Henrique Freitas.

Cuiabá, 2013

FICHA CATALOGRÁFICA CIP - Catalogação na Publicação

Bibliotecária Valéria Oliveira dos Anjos / CRB1-1713

M838a Moreira, Roberto.

Aspecto radiológico e macroscópico de matriz óssea mineralizada heteróloga fragmentada e polimetilmetacrilato autoclavados em falha óssea de tíbia de coelho. / Roberto Moreira. – Cuiabá, 2013.

33 f. : il. Dissertação apresentada à Universidade de Cuiabá, para obtenção do

título de Mestre em Biociência Animal. Orientador: Prof. Dr. Silvio Henrique Freitas 1. Veterinária. 2. Cirurgia. 3. Implante Ósseo. 4. Enxerto. I. Título. II.

Universidade de Cuiabá.

CDU 619:617

ROBERTO MOREIRA

ASPECTO RADIOLÓGICO E MACROSCÓPICO DE MATRIZ ÓSSEA MINERALIZADA HETERÓLOGA FRAGMENTADA E POLIMETILMETACRILATO

AUTOCLAVADOS EM FALHA ÓSSEA DE TÍBIA DE COELHO

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Biociência Animal, da Universidade de Cuiabá – UNIC como requisito parcial para obtenção do Título de Mestre em Biociência Animal – Área de Concentração Saúde Animal. Orientador Prof. Dr. Silvio Henrique Freitas

BANCA EXAMINADORA

______________________________________ Orientador: Prof. Dr. Silvio Henrique Freitas

________________________________________ Membro Titular Prof. Dr. Bruno Watanabe Minto

___________________________________________ Membro Titular Prof. Dr. Marcelo Diniz Dos Santos

Cuiabá, _____ de ___________________ de 2013.

Conceito Final: __________________

À minha esposa, filha, meus pais, irmãos e amigos que torcem por cada vitória na

minha vida.

AGRADECIMENTOS

A Deus que me deu força para vencer esta jornada;

Ao meu orientador prof. Dr. Sílvio Henrique Freitas que me ajudou muito durante esses dois anos de pesquisa;

Aos professores que nos mostraram os caminhos do aprendizado e da pesquisa.

O Senhor firma os passos do homem bom e no seu caminho se compraz; se cair, não ficará prostado, porque o Senhor o segura pela mão.

Salmos 37-23

RESUMO

MOREIRA, Roberto. aspecto radiológico e macroscópico de matriz óssea mineralizada heteróloga fragmentada e polimetilmetacrilato autoclavados em falha óssea de tíbia de coelho. 2013. 33 f. Dissertação (Mestrado em Biociência Animal) – Coordenação de Pós-Graduação e Pesquisa, Universidade de Cuiabá, Cuiabá, 2013. Foi realizada falha segmentar de 6mm de diâmetro na região metafisária medial de tíbias de 12 coelhos, onde foi implantado uma associação de micro e macrofragmentos de matriz óssea cortical heteróloga fragmentada conservada em glicerina (98%) e polimetilmetacrilato autoclavados, para a sua reconstrução, e avaliados radiológica e macroscopicamente aos 30, 60, 90 e 120 dias. Houve adesão, em relação ao tempo, dos micro e macrocompósitos ao leito receptor, em 100% dos casos, mostrando ser biologicamente biocompatível, pois promoveram a reparação de falhas ósseas, sem sinais de infecção, migração e/ou rejeição, podendo, dessa forma, ser mais uma opção como substituto para preencher grandes defeitos ósseos. Palavras-chave: Biomateriais. Coelhos. Osteocondução. Polimetilmetacrilato.

ABSTRACT MOREIRA, Roberto. Radiological and macroscopic aspects of autoclaved heterologous and fragmented mineralized bone matrix and polymethylmethacrylate in bone defect of rabbits’ tibia. 2013. 33 f. Dissertation (Masters in Animal Bioscience) – Postgraduate Program in Animal Bioscience, Universidade de Cuiabá, Cuiabá, 2013. It was performed a segmental defect with 6mm of diameter in the medial metaphyseal region of the tibia of 12 rabbits, where was implanted a combination of micro and macro fragments of heterologous fragmented cortical bone matrix preserved in glycerin (98%) and polymethylmethacrylate both autoclaved for bone defect reconstruction, and radiological and macroscopic evaluation was performed at 30, 60, 90 and 120 days. It was observed adhesion, in relation to time, of the micro and macro composites to the recipient bed in 100% of cases, showing that this implant is biologically biocompatible since promoted the repair of bone defects, with no signs of infection, migration and / or rejection, being classified in this way as one more option of substitute to fill large bone defects. Keywords: Biomaterials. Rabbits. Osteoconductive. Polymethylmethacrylate.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Imagem radiográfica lateromedial do terço proximal de tíbia de coelho no pós-operatório imediato. Note microcompósito no leito receptor da tíbia direita com áreas radiopacas (MOMHF: seta preta) e radioluscentes (polimetilmetacrilato: seta branca) – (A). Note macrocompósito no leito receptor da tíbia esquerda com áreas radiopacas (MOMHF: seta preta) e radioluscentes (polimetilmetacrilato: seta branca) – (B). Observe acentuada diferença de densidade entre os compósitos e tecido ósseo adjacente. ...................................................... 29

Figura 2 - Imagem radiográfica lateromedial do terço proximal de tíbia de coelho. Observe microcompósito no leito receptor: note áreas radiopacas (MOMHF), radioluscentes (polimetilmetacrilato) e linha radiopaca bem definida caracterizando osteocondução e/ou fibro e osteointegração (seta), aos 30 (A), 60 (B) e 90 (C) dias. Aos 120 (D) dias: note áreas radiopacas, radioluscentes, linha radiopacida com irregularidade (seta) e semelhança a C. Observe macrocompósito no leito receptor: note áreas radiopacas (MOMHF), radioluscentes (polimetilmetacrilato) e linha radiopaca bem definida caracterizando osteocondução e/ou fibro e osteointegração (seta), aos 30 (E), 60 dias (F) e 90 (G) dias. Aos 120 (H) dias: note áreas radiopacas, radioluscentes e linha com radiopacidade mais intença que G (seta). Observe diferença de densidade entre os compósito e tecido ósseo adjacente. ......................... 30

Figura 3 - Imagem fotográfica de corte transversal de tíbia de coelho direita. Observe microcompósitos seccionados localizado no leito receptor (seta preta), contendo fragmentos de MOMHF (cor branca) envolvidos por polimetilmetacrilato (cor âmbar), aos 30 (A), 60 (B), 90 (C) e 120 dias (D). ..................................................................................................... 31

Figura 4 - Imagem fotográfica de corte transversal de tíbia de coelho esquerda. Observe macrocompósitos seccionados localizado no leito receptor (seta preta), contendo fragmentos de MOMHF (cor branca) envolvidos por polimetilmetacrilato (cor âmbar), aos 30 (A), 60 (B), 90 (C) e 120 dias (D). ..................................................................................................... 31

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ................................................................................................ 11

2 REVISÃO DE LITERATURA .......................................................................... 14

REFERÊNCIAS .............................................................................................. 17

3 OBJETIVOS.................................................................................................20

3.1 OBJETIVO GERAL......................................................................................20

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS........................................................................20

4 ARTIGO .......................................................................................................... 21

4.1 INTRODUÇÃO .............................................................................................. 23

4.2 MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................. 25

4.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................... 27

4.4 CONCLUSÕES ............................................................................................. 32

REFERÊNCIAS .............................................................................................. 32  

5 CONCLUSÃO GERAL........................................................................................35

11

1 INTRODUÇÃO

Quando o tecido ósseo é lesionado, imediatamente os mecanismos

reparadores ósseos próprios são ativados para restaurar o tecido injuriado. Nas

pequenas falhas ósseas, o próprio organismo se encarrega de reparar o defeito

ósseo. Porém, nas grandes falhas ósseas como em fraturas cominutivas e/ou

afecções como osteomielite, não-uniões, neoplasias ósseas, o tratamentos

ortopédicos reconstrutivo com reposição de substituto ósseo torna-se necessário

(RANZANI et al., 1996; REZENDE et al., 1998; ALIEVI et al., 2007; OLIVEIRA;

LEME JUNIOR; CASTRO, 2012).

O uso do autoenxerto esponjoso é a opção mais viável para reparar as falhas

ósseas, pois é biologicamente compatível ao tecido que vai substituir e acelerar a

reparação óssea. Porém, essa técnica tem o inconveniente ser realizada em dois

tempos cirúrgicos, o que aumenta a morbidade, pois lesa estruturas normais,

intensifica a dor e, também, o tempo anestésico e cirúrgico, além de não fornecer

volume suficiente para reparar grandes falhas ósseas (FRIEDLAENDER, 1982;

MELO et al., 1998; ALIEVI et al., 2007; FREITAS et al., 2008).

Têm sido constantemente pesquisados em nível mundial os substitutos

ósseos biocompatíveis de origem biológica e/ou sintética, que promovem a

reparação de tecidos vivos lesionados, visando o rápido restabelecimento de suas

funções mecânicas e fisiológicas (GUTIERRES et al., 2006; TURRER; FERREIRA,

2008; RAPOSO-DO-AMARAL et al., 2010; FREITAS et al., 2012). Os tecidos ósseos

obtidos a partir de animais da mesma espécie, ou seja, aloimplantes, ou de espécies

diferentes, heteroimplantes, são materiais biocompatíveis e amplamente

empregados na reparação de falhas ósseas com resultados satisfatórios (LANE;

SANDHU, 1987; RANZANI et al., 1996; DASSO; FERNANDEZ; ARIAS, 1998; MELO

et al., 1998; SILVA et al., 2003; MORAIS et al., 2004; SILVA; MAZZONETO, 2006;

FREITAS et al., 2006; ALIEVI et al., 2007).

Os heteroimplantes devem promover a osteoindução, que se dá pela

formação de osso a partir de células osteoprogenitoras, oriundas das células

mesenquimatosas primitivas sob a influência de um ou mais agentes indutores da

matriz óssea e, também, a osteocondução que se caracteriza pelo crescimento

12

ósseo por meio de aposição de tecido ósseo subjacente na presença de osso ou

células mesenquimatosas indiferenciadas. Além disso, eles têm que ser

biocompatíveis, não carcinogênicos, atóxicos, não antigênicos e, principalmente, não

estimular processos inflamatórios e nem contribuir com a infecção (ALEXANDER,

1987; MELO et al., 1998; AKAMOTO; TRENTO, 2002; IAMAGUTI et al., 1995;

ALIEVI et al., 2007).

Além dos materiais biocompatíveis biológicos, as falhas ósseas também

podem ser eficientemente preenchidos por materiais biocompatíveis sintéticos, como

o cimento de fosfato de cálcio, a hidroxiapatita, o copolímero lacticoglicólico, o

polimetilmetacrilato, entre outros (REZENDE et al., 1998; WEINFELD;

MAGALHÃES; VILA,1999; YACUBIAN-FERNANDES et al., 2004; MORAES et al.,

2004; TURRER; FERREIRA, 2008; SANTOS, 2010; ALVES et al., 2010; DE

MARVAL et al., 2011; SPADETO JR. et al., 2011).

O polimetilmetacrilato por apresentar características biotoleráveis,

biomoldáveis e conferir adesão ao leito receptor, está sendo amplamente utilizado

no reparo de falhas ósseas extensas, tanto na medicina humana quanto na medicina

veterinária (BAUER; MUSCHLER, 2000; YACUBIAN-FERNANDES et al., 2004;

GUTIERRES et al., 2006; RAPOSO-DO-AMARAL et al., 2010).

Uma nova opção para reparar grandes falhas ósseas seria o emprego de um

compósito constituído pela associação de materiais biocompatíveis biológico (tecido

ósseo heterólogo) e sintético (polimetilmetacrilato), com propriedades osteogênicas,

osteoindutoras e osteocondutoras, que não favorecesse infecção nem colonização

bacteriana, que proporcionasse sustentação mecânica, que fosse biomodelado, de

fácil aquisição e baixo custo, que não necessitasse de meio especializado para sua

preservação, que preenchesse completamente a falha óssea, eliminando, com isso,

problemas inerentes ao enxerto autógeno (FRIEDLAENDER, 1982; MELO et al.,

1998; KHAN, 2000; ALIEVI et al., 2007; TURRER; FERREIRA, 2008).

Este estudo propõe-se comparar radiológica e macroscopicamente o

comportamento de compósitos constituídos por micro e macrofragmentos de matriz

óssea mineralizada heteróloga fragmentada (MOMHF) associados ao

polimetilmetacrilato em falhas ósseas segmentar, utilizando o coelho como modelo

experimental.

13

Tendo em vista a necessidade constante de reparar grandes perdas ósseas

com o uso de substituto ósseo adequado, espera-se que os resultados obtidos com

esse estudo possa contribuir com o tratamento ortopédico reconstrutivo do tecido

ósseo, tanto da medicina veterinária quanto da humana.

14

2 REVISÃO DE LITERATURA

O alto índice de afecções ortopédicas, em especial as que envolvem

procedimentos cirúrgicos reparadores com reconstrução óssea, observado tanto em

humanos quanto em animais, tem aumentado o interesse no desenvolvimento de

pesquisas envolvendo os substitutos ósseos, com o objetivo de acelerar a reparação

de fraturas (GUTIERRES et al., 2006; FREITAS et al., 2012).

Quando há soluções de continuidade no tecido ósseo, imediatamente os

mecanismos reparadores ósseos próprios são ativados para restaurar o tecido

injuriado. Nas pequenas falhas ósseas, a própria biologia celular é suficiente para

reparar o defeito ósseo. Já, nas grandes falhas ósseas como em fraturas

cominutivas e/ou afecções como osteomielite, não-uniões, cistos ou neoplasias,

osteotomias corretivas e também nas artodeses, o tratamentos ortopédicos

reconstrutivos com reposição de substituto ósseo torna-se imperativo (PINTO JR.,

1995; COSTA, 1996; RANZANI et al., 1996; REZENDE et al., 1998; ALIEVI et al.,

2007; ROCHA et al., 2011; OLIVEIRA; LEME JUNIOR. CASTRO, 2012).

Imunologicamente os tecidos ósseos são classificados em autólogo, que é

tecido ósseo retirado do próprio indivíduo; alógeno, tecido ósseo de outro indivíduo

da mesma espécie, porém geneticamente diferentes e; heterólogo, tecido ósseo de

outro indivíduo de espécie deferente (GUTIERRES et al., 2006; FREITAS et al.,

2008). O uso do autoenxerto esponjoso é a opção mais viável para reparar as falhas

ósseas, pois é biologicamente compatível ao tecido que vai substituir, e acelera a

reparação óssea. Ele possui células que estimulam a formação de tecido ósseo

(osteogênese), que aderem e crescem sobre tecidos presentes na falha óssea

(osteocondução) e possui fatores que estimulam a diferenciação fenotípica e o

crescimento ósseo (osteoindução) (GUTIERRES et al., 2006). Porém, essa técnica

tem o inconveniente ser realizada em dois tempos cirúrgicos, o que aumenta a

morbidade, pois lesa estruturas normais, intensifica a dor e, também, o tempo

anestésico e cirúrgico, além de não fornecer volume suficiente para reparar grandes

falhas ósseas (FRIEDLAENDER, 1982; MELO et al., 1998; ALIEVI et al., 2007;

FREITAS et al., 2008).

Têm sido constantemente pesquisados em nível mundial os substitutos

15

ósseos biocompatíveis de origem biológica e/ou sintética, que promovem a

reparação de tecidos vivos lesionados visando o rápido restabelecimento de suas

funções mecânicas e fisiológicas (GUTIERRES et al., 2006; TURRER; FERREIRA,

2008; RAPOSO-DO-AMARAL et al., 2010; FREITAS et al., 2012).

Os tecidos ósseos obtidos a partir de animais da mesma espécie, ou seja,

aloimplantes, ou de espécies diferentes, heteroimplantes, são materiais

biocompatíveis e amplamente empregados na reparação de falhas ósseas com

resultados satisfatórios (LANE; SANDHU, 1987; RANZANI et al., 1996; DASSO;

FERNANDEZ; ARIAS, 1998; MELO et al.; 1998; SILVA et al., 2003; MORAIS et al.,

2004; SILVA; MAZZONETO, 2006; FREITAS et al., 2006; ALIEVI et al., 2007).

Os heteroimplantes devem promover a osteoindução, que se dá pela

formação de osso a partir de células osteoprogenitoras, oriundas das células

mesenquimatosas primitivas sob a influência de um ou mais agentes indutores da

matriz óssea e, também, a osteocondução que se caracteriza pelo crescimento

ósseo por meio de aposição de tecido ósseo subjacente na presença de osso ou

células mesenquimatosas indiferenciadas. Além disso, eles têm que ser

biocompatíveis, não carcinogênicos, atóxicos, não antigênicos e, principalmente, não

estimular processos inflamatórios e nem contribuir com a infecção (ALEXANDER,

1987; IAMAGUTI et al., 1995; MELO et al., 1998; AKAMOTO; TRENTO, 2002;

ALIEVI et al., 2007).

Um banco de ossos torna os procedimentos ortopédicos reparadores mais

eficientes, pois disponibiliza grande quantidade de tecidos, além de atender mais de

um paciente ao mesmo tempo (MELO et al., 1988; FREITAS et al., 2008; FREITAS

et al., 2012). Para armazenamento, os tecidos ósseos devem ser coletados

assepticamente, acondicionados e preservados em meio adequados, a fim de que

suas propriedades osteoindutoras e/ou osteocondutoras sejam mantidas, impedindo

assim sua degeneração. As técnicas de preservação mais empregadas em banco de

ossos são o congelamento com nitrogênio, resfriamento em freezer, liofilização,

autoclavagem, óxido de etileno, álcool 70%, glicerina 98%, entre outros (MELO et

al., 1998; SILVA et al., 2003; VILELA et al., 2010; FREITAS et al., 2012).

Além dos materiais biocompatíveis biológicos, as falhas ósseas também

podem ser eficientemente preenchidas por materiais biocompatíveis sintéticos, como

o cimento de fosfato de cálcio, a hidroxiapatita, o copolímero lacticoglicólico, o

16

polimetilmetacrilato, entre outros (SUOMINEN et al., 1995; REZENDE et al., 1998;

WEINFELD; MAGALHÃES; VILA, 1999; YACUBIAN-FERNANDES et al., 2004;

MORAES et al., 2004; TURRER; FERREIRA, 2008; SANTOS, 2010; ALVES et al.,

2010; DE MARVAL et al., 2011; SPADETO JR. et al., 2011). Atualmente, o

polimetilmetacrilato, por apresentar características biotoleráveis, biomoldáveis e

conferir adesão ao leito receptor, está sendo vastamente utilizado no reparo de

falhas ósseas extensas, tanto na medicina humana quanto na medicina veterinária

(BAUER; MUSCHLER, 2000; YACUBIAN-FERNANDES et al., 2004; GUTIERRES et

al., 2006; RAPOSO-DO-AMARAL et al., 2010).

Uma nova opção para reparar grandes falhas ósseas seria o emprego de um

compósito constituído pela associação de materiais biocompatíveis biológico (tecido

ósseo heterólogo) e sintético (polimetilmetacrilato), com propriedades osteogênicas,

osteoindutoras e osteocondutoras, que não favorecesse infecção e nem a

colonização bacteriana, que proporcionasse sustentação mecânica, que seja

biomodelado, de fácil aquisição e baixo custo, que não necessitasse de meio

especializado para sua preservação, que preenchesse completamente a falha

óssea, eliminando, com isso, problemas inerentes ao enxerto autógeno

(FRIEDLAENDER, 1982; MELO et al., 1998; KHAN, 2000; ALIEVI et al., 2007;

TURRER; FERREIRA, 2008).

O método de diagnóstico por imagem, por meio da radiologia, é amplamente

empregado na medicina humana e veterinária, para avaliar com precisão o

comportamento dos substitutos ósseos no leito receptor, sua remodelação óssea e,

também, quantificar a reação local (MURILO et al., 1999; FREITAS et al., 2006;

TURRER; FERREIRA, 2008; SILVEIRA; WASSALL, 2009; MISH, 2009; ZAMUNÉR,

1993; RAPOSO-DO-AMARAL et al., 2010).

17

REFERÊNCIAS

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19

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20

3 OBJETIVOS 3.1 OBJETIVO GERAL Avaliar os compósitos constituídos por micro e macrofragmentos de matriz óssea

mineralizada heteróloga fragmentada (MOMHF) associada ao polimetilmetacrilato

em falhas ósseas segmentares em tíbias de coelho.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

- Avaliar clínica e radiologicamente os compósitos em falhas ósseas

segmentares em tíbia de coelho;

- - Avaliar macroscopicamente os compósitos em falhas ósseas segmentares

em tíbias de coelhos

- Comparar o comportamento dos compósitos em falhas ósseas segmentares

em tíbia de coelhos

4 ARTIGO

22

Aspecto radiológico e macroscópico de matriz óssea mineralizada

heteróloga fragmentada e polimetilmetacrilato autoclavados em falha óssea

de tíbia de coelho

Radiological and macroscopic aspects of autoclaved heterologous and

fragmented mineralized bone matrix and polymethylmethacrylate in bone defect

of rabbits tibia

R. Moreira1, R.G.S. Dória2, F.S. Mendonça3, L.M. Camargo4, M.D. Santos5, W.B. Rocha6,

C.I. Presser7, C.E. Ambrósio8 e S. H. Freitas9

RESUMO Foi realizada falha segmentar de 6mm de diâmetro na região metafisária medial de tíbias de 12 coelhos, onde foi

implantado uma associação de micro e macrofragmentos de matriz óssea cortical heteróloga fragmentada

conservada em glicerina (98%) e polimetilmetacrilato autoclavados, para a sua reconstrução, e avaliados

radiológica e macroscopicamente aos 30, 60, 90 e 120 dias. Houve adesão, em relação ao tempo, dos micro e

macrocompósitos ao leito receptor, em 100% dos casos, mostrando ser biologicamente biocompatível, pois

promoveram a reparação de falhas ósseas, sem sinais de infecção, migração e/ou rejeição, podendo, dessa forma,

ser mais uma opção como substituto para preencher grandes defeitos ósseos.

Palavras-chave: biomateriais, coelhos, osteocondução, polimetilmetacrilato.

ABSTRACT It was performed a segmental defect with 6mm of diameter in the medial metaphyseal region of the tibia of 12

rabbits, where was implanted a combination of micro and macro fragments of heterologous fragmented cortical

bone matrix preserved in glycerin (98%) and polymethylmethacrylate both autoclaved for bone defect

reconstruction, and radiological and macroscopic evaluation was performed at 30, 60, 90 and 120 days. It was 1 Mestrando do Programa de Pós-graduação em biociência Animal da Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade de Cuiabá - UNIC 2 Professora da Disciplina de Clínica e Cirurgia de Equinos do Curso de Medicina Veterinária da Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos - FZEA, da Universidade de São Paulo - USP 3 Professor do Departamento de Morfologia e Fisiologia da Universidade Federal Rural de Pernambuco-UFRPE 4 Professor do Departamento de Clínica de Pequenos Animais da Faculdade de Medicina Veterinária - UNIC 5 Professor do Departamento de Reprodução da Faculdade de Medicina Veterinária – UNIC

6 Aluno de Graduação da Faculdade de Medicina Veterinária - UNIC 7 Residente de Clínica Cirúrgica e Anestesiologia da Faculdade de Medicina Veterinária da UNIC 8 Departamento de Medicina Veterinária do Curso de Medicina Veterinária da Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos (FZEA), da Universidade de São Paulo (USP). 9 Professor do Departamento de Clínica e Cirurgia Veterinária da Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade de Cuiabá - UNIC. Avenida Antártica, 788. Casa 26. Bairro: Ribeirão da Ponte. CEP: 78040-500, Cuiabá – MT. Telefone: (65) 36261220/(19) 98795297, e-mail: shfreitas@terra.com.br.

23

observed adhesion, in relation to time, of the micro and macro composites to the recipient bed in 100% of cases,

showing that this implant is biologically biocompatible since promoted the repair of bone defects, with no signs

of infection, migration and / or rejection, being classified in this way as one more option of substitute to fill large

bone defects.

Keywords: biomaterials, rabbits, osteoconductive, polymethylmethacrylate.

4.1. INTRODUÇÃO

Quando há soluções de continuidade no tecido ósseo, imediatamente os mecanismos

reparadores ósseos próprios são ativados para restaurar o tecido injuriado. Nas pequenas

falhas ósseas, a própria biologia celular é suficiente para reparar o defeito ósseo. Porém, nas

grandes falhas ósseas como em fraturas cominutivas e/ou afecções como osteomielite, não-

uniões, neoplasias ósseas, o tratamentos ortopédicos reconstrutivos com reposição de

substituto ósseo torna-se imperativo (Ranzani et al., 1996; Rezende et al., 1998; Alievi et al.,

2007; Oliveira et al., 2012). O uso do autoenxerto esponjoso, ou seja, tecidos ósseos retirados

do próprio paciente, é a opção mais viável para reparar as falhas ósseas, pois é biologicamente

compatível ao tecido que vai substituir, e acelera a reparação óssea. Porém, essa técnica tem o

inconveniente ser realizada em dois tempos cirúrgicos, o que aumenta a morbidade, pois lesa

estruturas normais, intensifica a dor e, também, o tempo anestésico e cirúrgico, além de não

fornecer volume suficiente para reparar grandes falhas ósseas (Friedlaender, 1982; Melo et

al., 1998; Alievi et al., 2007; Freitas et al., 2008).

Os substitutos ósseos biocompatíveis de origem biológica e/ou sintética, que promovam a

reparação de tecidos vivos lesionados visando o rápido restabelecimento de suas funções

mecânicas e fisiológicas, têm sido constantemente pesquisados em nível mundial (Gutierres et

al., 2006; Turrer e Ferreira, 2008; Raposo-Do-Amaral, 2010; Freitas et al., 2012). Os tecidos

ósseos obtidos a partir de animais da mesma espécie, ou seja, aloimplantes, ou de espécies

diferentes, heteroimplantes, são materiais biocompatíveis e amplamente empregados na

reparação de falhas ósseas com resultados satisfatórios (Lane e Sandhu, 1987; Ranzani, 1996;

Dasso et al., 1998; Melo et al., 1998; Silva et al., 2003; Morais et al., 2004; Silva e

Mazzoneto, 2006; Freitas et al., 2006; Alievi et al., 2007).

Os heteroimplantes devem promover a osteoindução, que se dá pela formação de osso a partir

de células osteoprogenitoras, oriundas das células mesenquimatosas primitivas sob a

influência de um ou mais agentes indutores da matriz óssea e, também, a osteocondução que

se caracteriza pelo crescimento ósseo por meio de aposição de tecido ósseo subjacente na

24

presença de osso ou células mesenquimatosas indiferenciadas. Além disso, eles têm que ser

biocompatíveis, não carcinogênicos, atóxicos, não antigênicos e, principalmente, não

estimular processos inflamatórios e nem contribuir com a infecção (Alexander, 1987; Melo et

al., 1998; Akamoto e Trento, 2002; Iamaguti et al., 1995; Alievi et al., 2007).

Um banco de ossos torna os procedimentos ortopédicos reparadores mais eficientes, pois

disponibiliza grande quantidade de tecidos, além de atender mais de um paciente ao mesmo

tempo (Melo et al., 1988; Freitas et al., 2008, Freitas et al., 2012). Para estoque, os tecidos

ósseos devem ser coletados assepticamente, acondicionados e preservados em meio

adequados, a fim de que suas propriedades osteoindutoras e/ou osteocondutoras sejam

mantidas, para que não se degenere. As técnicas de preservação mais empregadas em banco

de ossos são o congelamento com nitrogênio, resfriamento em freezer, liofilização,

autoclavagem, óxido de etileno, álcool 70%, glicerina 98%, entre outros (Melo et al., 1998;

Silva et al., 2003; Vilela et al., 2010; Freitas et al., 2012).

Além dos materiais biocompatíveis biológicos, as falhas ósseas também podem ser

eficientemente preenchidos por materiais biocompatíveis sintéticos, como o cimento de

fosfato de cálcio, a hidroxiapatita, o copolímero lacticoglicólico, o polimetilmetacrilato, entre

outros (Rezende et al., 1998; Weinfeld et al.,1999; Yacubian-Fernandes et al., 2004; Moraes

et al., 2004; Turrer et al., 2008; Santos, 2010; Alves et al., 2010; De Marval et al., 2011;

Spadeto JR et al., 2011). Atualmente, o polimetilmetacrilato, por apresentar características

biotoleráveis, biomoldáveis e conferir adesão ao leito receptor, está sendo vastamente

utilizado no reparo de falhas ósseas extensas, tanto na medicina humana quanto na medicina

veterinária (Bauer e Muschler, 2000; Yacubian-Fernandes et al., 2004; Gutierres et al., 2006;

Raposo-Do-Amaral et al., 2010).

Uma nova opção para reparar grandes falhas ósseas seria o emprego de um compósito

constituído pela associação de materiais biocompatíveis biológico (tecido ósseo heterólogo) e

sintético (polimetilmetacrilato), com propriedades osteogênicas, osteoindutoras e

osteocondutoras, que não favorecesse infecção nem a colonização bacteriana, que

proporcionasse sustentação mecânica, que seja biomodelado, de fácil aquisição e baixo custo,

que não necessitasse de meio especializado para sua preservação, que preenchesse

completamente a falha óssea, eliminando, com isso, problemas inerentes ao enxerto autógeno

(Friedlaender, 1982; Melo et al., 1998; Khan, 2000; Alievi et al., 2007; Turrer e Ferreira,

2008).

O método de diagnóstico por imagem, por meio da radiologia, é amplamente empregado na

medicina humana e veterinária, para avaliar com precisão o comportamento dos substitutos

25

ósseos no leito receptor, sua remodelação óssea e, também, quantificar a reação local (Mish,

2009; Zamunér, 1993; Murilo et al., 1999; Turrer e Ferreira, 2008; Freitas et al., 2006;

Silveira e Wassall, 2009; Raposo-Do-Amaral et al., 2010).

Tendo em vista a necessidade constante de reparar grandes perdas ósseas com o uso de

substituto ósseo adequado, propõe-se com este trabalho, comparar radiológica e

macroscopicamente o comportamento de compósitos constituídos por micro e

macrofragmentos de matriz óssea mineralizada heteróloga fragmentada (MOMHF) associados

ao polimetilmetacrilato em falhas ósseas segmentar em tíbia em coelhos em diferentes

tempos.

4.2 MATERIAL E MÉTODOS

Os compósitos utilizados neste estudo foram preparados com micro e macrofragmentos de

matriz óssea mineralizada heteróloga fragmentada (MOMHF) e polimetilmetacrilato (Vipi

Flash – Vipi Industria, Comércio, Exportação e Importação, Pirassununga, SP) em proporções

iguais. O heteroimplante foi coletado assepticamente a partir de diáfise de tíbia de canino,

clinicamente hígido, que veio a óbito por trauma. Além disso, foram removidos os tecidos

moles adjacentes à tíbia, as epífises e a medula óssea, sendo, na sequência, a diáfise lavada

com solução salina 0,9% (Solução salina – JP Indústria Famacêutica SA, Ribeirão Preto, SP)

e acondicionada em glicerina a 98% (Glicerina – VIC Pharma Indústria e Comércio Ltda,

Taquaritinga, SP), em recipiente de vidro esterilizado em temperatura ambiente. Para uso, a

diáfise da tíbia preservada em glicerina, foi hidratado com solução salina 0,9% por 10

minutos, fragmentada em partículas de aproximadamente 2mm (macrofragmentos) e de 1mm

(microfragmentos) com o uso de um triturador manual (pilão de bronze) e, posteriormente,

desidratados em temperatura ambiente. Em ato contínuo, os macrofragmentos de MOMHF

foram misturados, na mesma proporção, ao polímero de polimetilmetacrilato (pó), aos quais

foram adicionado o monômero de polimetilmetacrilato (líquido), até atingir a forma

emborrachóide, quando foram moldados em um cilindro de 6mm de diâmetro. Com o uso de

uma serra manual, o cilindro foi seccionado em discos de 2mm de espessura, dando

originando ao macrocompósito, que foi acondicionado em grau cirúrgico (Papel grau

cirúrgico – Baumer, Mogi Mirim, SP) e esterilizado em autoclave (1210C/15minutos de

esterilização/15 de secagem). A confecção do microcompósito seguiu o mesmo protocolo,

porém com o uso de microfragmentos de MOMHF.

26

Como receptores, foram utilizados doze coelhos adultos, da raça Nova Zelândia, com peso

médio de 3kg, distribuídos em quatro grupos de três animais: E1 (30 dias), E2 (60 dias), E3

(90 dias) e E4 (120 dias). Após tricotomia da região proximal medial das tíbias esquerda e

direita e anestesia dissociativa, os coelhos foram anestesiados com uma associação de

acepromazina (Acepran 0,2% – Univet S/A, São Paulo, SP) (0,1mg/kg) e

tiletamina/zolazepam (Zoletil 50 – Virbac do Brasil Indústria e Comércio Ltda, São Paulo,

SP) (20mg/kg) pela via intramuscular, seguido de bloqueio anestésico local infiltrativo com

lidocaína sem vasoconstrictor no local da ostectomia 2,0% (Lidovet – Bravet, Rio de Janeiro,

RJ) (0,4ml).

Os animais foram posicionados em decúbito dorsal em calha metálica acolchoada e a

antissepsia realizada com iodo povidona (Riodeine tópico – Indústria Farmacêutica

Rioquímica Ltda, São Paulo, SP), proteção do campo operatório com panos de campo,

seguido de incisão sobre a pele, divulsão do subcutâneo e exposição do córtex próximo-

medial das tíbias direita e esquerda. Com o uso de uma broca trefina (Broca trefina – Dental

Aragão, São Paulo, SP) acoplada a uma furadeira elétrica de baixa rotação autoclavável

(Furadeira elétrica autoclavável – Caomédica, SP), criou-se falhas ósseas nas tíbias dos

coelhos, pela remoção de um segmento corticoperiosteal de 6,0mm. Os defeitos ósseos

previamente criados nas tíbias direita e esquerda foram preenchidos com micro e

macrocompósitos, respectivamentes, e o periósteo e o tecido subcutâneo aproximados com

ácido poliglicólico 3-0 (Medcryl – Med Goldman, Manaus, AM), utilizando padrão de sutura

contínua simples, e a pele aproximada com poliamida 3-0 (Nylon – Brasmédica, São Paulo,

SP), utilizando padrão de sutura simples separada. Cada animal recebeu cinco aplicações, a

cada 24h, de enrofloxacina (Flotril 2,5% - Intervet – Schering-Plough, Rio de Janeiro, RJ)

(10mg/kg), por via subcutânea; três aplicações, a cada 24h, de fenixin meglumine (Banamine

pet – Intervet – Schering-Plough, Rio de Janeiro, RJ) (1,1mg/kg), tramadol e dois curativos

diários com rifamicina (Rifocina – Sanofi-Aventis, São Paulo, SP) sobre a ferida, até a

retirada dos pontos que ocorreu no décimo dia. No pós-operatório, os animais foram alojados

individualmente em gaiolas, alimentados com ração comercial para coelho (Ração Labina –

Purina, São Paulo, SP) e água ad libitum.

Os animais foram avaliados diariamente em relação ao apoio dos membros, e as falhas ósseas

implantadas com micro e macrocompósito, radiografadas (50mA, 0,04s e 40KV), na posição

mediolateral, imediatamente após a cirurgia, aos 30, 60, 90 e 120 dias do pós-operatório. Ao

final de cada período de avaliação, os animais foram submetidos a eutanásia ativa, por

27

sobredose anestésica com o mesmo protocolo anestésico, e os fragmentos ósseos

correspondentes ao leito receptor coletado para avaliação macroscópica.

Esta pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade de Cuiabá-

CEP/UNIC, sob registro n0 185, protocolo n0 0307-185, de 29 de fevereiro de 2008.

4.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO

O uso de glicerina a 98% em temperatura ambiente é um excelente meio de conservação de

material biológico, que pode ser seguramente utilizada para preservar tecidos ósseos (Silva et

al., 2003; Freitas et al., 2008). Com isso, torna simples e exequível a implantação de banco de

ossos em centros cirúrgicos, em especial os veterinários, para uso em procedimentos

ortopédicos corretivos (Freitas et al., 2012).

Para o preparo dos macro e microcompósito, os instrumentos, cubas metálicas e luvas,

utilizados para manipular a MOMHF e o polimetilmetacrilato, eram todos esterilizados. Para

uso, os compósitos foram submetidos ao processo de esterilização por meio de autoclave, que

para Vilela et al. (2010) e Freitas et al. (2012) é decisivo para o sucesso da cirurgia, já que

previne a infecção local e também a lise óssea, o que poderia levar a migração do compósito

da falha óssea tibial

Embora não tenha consenso quanto ao tempo mínimo e máximo de permanência do tecido

ósseo em glicerina a 98%, a MOMHF utilizada na confecção dos macro e microcompósito foi

mantida nesse meio por um período não inferior a 30 dias que, segundo Melo et al. (1998);

Freitas et al. (2008) e Vilela et al. (2010), é um período suficiente para que o tecidos possam

ser usados com segurança. Mesmo tendo conhecimento das propriedades conservadora e

bactericida da glicerina a 98%, para uso, os macro e microcompósitos foram esterilizados em

autoclave, o que garantiu a ausência total de patógenos no leito receptor preenchido com os

compósitos, primando pela excelência da técnica.

A epífese proximal medial da tíbia de coelhos foi selecionada para ser o leito receptor, por ser

de fácil acesso e, também, por possuir pouco tecido mole adjacente, o que tornou o

procedimento cirúrgico rápido e exequível (Piermattei e Greeley, 1988; Rezende et al., 1998;

Freitas et al., 2012). Além disso, essa região também é sede de reabsorção e de propriedades

osteogênicas, sendo, inclusive, metabolicamente, a mais ativa desse osso. Essas características

são almejadas e favorecem uma resposta celular mais eficiente entre os compósitos em estudo

e o sítio receptor (Suominen et al., 1995; Rezende et al., 1998; Turrer e Ferreira., 2008).

28

No pós-operatório imediato, todos os animais apoiaram os membros operados, mostrando que

a estrutura da tíbia não foi comprometida pela confecção da falha óssea, corroborando com os

mesmos resultados encontrados por Melo et al. (1998) e Freitas et al. (2012). Todos os

animais tiveram as feridas cirúrgicas cicatrizadas num período de 13 dias, com ausência de

infecção e/ou reação tecidual local que caracterizasse rejeição dos compósitos ao leito

receptor, mostrando que a antissepsia e assepsia, a antibioticoterapia e o manejo das feridas

foram adequados (Iamaguti et al., 1995; Pinto JR, 1995; Costa, 1996).

A alta temperatura atingida durante a polimerização do pometilmetacrilato, caso os

compósitos fossem preparados e aplicados diretamente no leito receptor, poderia causar

necrose térmica óssea. De acordo com Turrer e Ferreira (2008), essa reação exotérmica

promoveria lise óssea na interface implante e leito receptor e, consequentemente,

afrouxamento e instabilidade, permitindo a migração do compósito a partir do leito receptor

na tíbia. Para prevenir essa complicação, os compósitos foram previamente confeccionados,

esterilizados e, somente após, encaixado no leito receptor, eliminando dessa forma a elevada

temperatura como fator complicador da técnica.

As reações entre os compósitos e o sítio receptor, como por exemplo, proliferações, lise

ósseas e/ou infecção, não foram notadas neste estudo (Fig. 2, 3 e 4). Isso se deve

provavelmente ao emprego adequado da técnica cirúrgica e, também, ao uso apropriado de

método de esterilização, manejo das feridas, que para Dipisa et al. (1976), Yacubian-

Fernandes et al. (2004) e Freitas et al. (2012) são fatores decisivos para incorporação e/ou

integração dos compósitos ao leito receptor.

Além disso, os resultados promissores quanto ao uso dos compósitos na reparação de falhas

ósseas podem ser esperados já que, em todos os animais estudados, permaneceram no leito

receptor (Fig. 2), que para Silva, et al. (2003), Gutierres et al. (2006) e Turrer e Ferreira

(2008) é um evento indicativo de ausência de rejeição, que pode estar relacionado com

fibrointegração, mediada pelo polimetilmetacrilato, e pela osteointegração, promovida pela

MOMHF, e também pela osteocondução, caracterizada pela neoformação vascular e invasão

tissular de fibroblastos com deposição gradativa de tecido fibrocartilaginoso e de ósseo, o que

caracteriza a sua integração.

O uso da técnica radiológica neste estudo foi decisivo, pois permitiu acompanhar com

exatidão o comportamento dos compósitos nos leitos receptores de tíbias de coelhos,

mostrando ser está técnica segura e eficiente para avaliar enxertos e/ou implantes em falhas

ósseas em diferentes momentos (Iamaguti et al., 1995; Silva et al., 2003; Freitas et al., 2008;

Rocha et al., 2011).

29

Dessa forma, neste estudo, as avaliações radiográficas realizadas nas tíbias dos coelhos no

pós-operatório imediato (Fig. 1), nos grupos E1 (Fig. 2A e E), E2 (Fig. 2B e F), E3 (Fig. 2C e

G) e E4 (Fig. 2D e H), mostraram que todos os compósitos permaneceram em seus leitos

receptores, sem sinal de proliferação e/ou lise óssea ou reações que caracterizassem infecção

e/ou rejeição.

Figura 1 - Imagem radiográfica lateromedial do terço proximal de tíbia de coelho no pós-operatório imediato.

Note microcompósito no leito receptor da tíbia direita com áreas radiopacas (MOMHF: seta preta) e

radioluscentes (polimetilmetacrilato: seta branca) – (A). Note macrocompósito no leito receptor da tíbia esquerda

com áreas radiopacas (MOMHF: seta preta) e radioluscentes (polimetilmetacrilato: seta branca) – (B). Observe

acentuada diferença de densidade entre os compósitos e tecido ósseo adjacente.

As densidades heterogêneas de todos os microcompósitos, constituídos por áreas

radioluscentes, correspondentes ao metilmetacrilato, e áreas radiopacas, referentes à

MOMHF, permaneceram desde sua implantação até aos 90 dias (Fig. 2A, B e C). No entanto,

aos 120 dias (Figura 2D), notou-se redução da radiopacidade e também da radioluscência,

provavelmente devido à ação das células ósseas ativas atuando na incorporação e

remodelação dos compósitos ao leito receptor conforme observado por Gutierres et al., 2006;

Turrer e Ferreira, 2008). Já as densidades heterogêneas de todos os macrocompósitos,

constituídos por áreas radioluscentes, correspondentes ao metilmetacrilato, e áreas radiopacas,

referentes à MOMHF, permaneceram desde sua implantação até aos 120 dias (Fig. 2E, F, G E

H). Isso, possivelmente foi devido à característica física dos macrocompósitos apresentarem

maior concentração de polimetilmetacrilato.

30

Figura 2 - Imagem radiográfica lateromedial do terço proximal de tíbia de coelho. Observe microcompósito no

leito receptor: note áreas radiopacas (MOMHF), radioluscentes (polimetilmetacrilato) e linha radiopaca bem

definida caracterizando osteocondução e/ou fibro e osteointegração (seta), aos 30 (A), 60 (B) e 90 (C) dias. Aos

120 (D) dias: note áreas radiopacas, radioluscentes, linha radiopacida com irregularidade (seta) e semelhança a

C. Observe macrocompósito no leito receptor: note áreas radiopacas (MOMHF), radioluscentes

(polimetilmetacrilato) e linha radiopaca bem definida caracterizando osteocondução e/ou fibro e osteointegração

(seta), aos 30 (E), 60 dias (F) e 90 (G) dias. Aos 120 (H) dias: note áreas radiopacas, radioluscentes e linha com

radiopacidade mais intença que G (seta). Observe diferença de densidade entre os compósito e tecido ósseo

adjacente.

Aos 30 dias (Fig. 2 A e E), os micro e macrocompósitos já apresentavam diferenças de

densidade na interface com o leito receptor quando comparados aos do pós-operatório

imediato (Fig. 1A e B), mostrando, com isso, haver reações detectáveis nas avaliações

radiográficas. Já aos 60 dias (Fig. 2B e F), houve aumento da radiopacidade na interface dos

compósitos/leito receptor, provavelmente devido a osteocondução, sendo esta observada com

maior intensidade aos 90 dias (Fig. 2C e G, Fig. 4A). Já aos 120 dias houve incorporação e/ou

integração do microcompósito ao leito receptor com redução de áreas radiopacas e

radioluscentes, caracterizando osteocondução e remodelação óssea e densidade bastante

semelhante ao osso adjacente (Fig. 2D e H, Fig. 4B). Essa fibro e/ou osteointegração

provavelmente está relacionada com a neoformação vascular e invasão tissular de fibroblastos

seguida por deposição de tecido fibrocartilaginoso e ósseo novo, caracterizando a

osteocondução do compósito (Silva et al., 2003; Gutierres et al., 2006; Turrer et al., 2008).

31

Figura 3 - Imagem fotográfica de corte transversal de tíbia de coelho direita. Observe microcompósitos

seccionados localizado no leito receptor (seta preta), contendo fragmentos de MOMHF (cor branca) envolvidos

por polimetilmetacrilato (cor âmbar), aos 30 (A), 60 (B), 90 (C) e 120 dias (D).

Figura 4 - Imagem fotográfica de corte transversal de tíbia de coelho esquerda. Observe macrocompósitos

seccionados localizado no leito receptor (seta preta), contendo fragmentos de MOMHF (cor branca) envolvidos

por polimetilmetacrilato (cor âmbar), aos 30 (A), 60 (B), 90 (C) e 120 dias (D).

As pesquisas realizadas por Weinfeld et al. (1999) Gutierres et al. (2006) e Freitas et al.

(2008), utilizando biomateriais biológicos, mostraram que o heteroimplante ósseo cortical

(MOMHF) conservado em glicerina a 98% podem ser utilizados na reparação de falha óssea.

Somando-se a esses, Yacubian-Fernandes et al. (2004), Raposo-Do-Amaral et al. (2010) e

Freitas et al. (2012), divulgaram em seus estudos que os biomateriais sintéticos, como o

metilmetacrilato, também é uma opção que podem ser empregados com sucesso na correção

de defeitos ósseos. Já Turrer e Ferreira (2008) preconizam que a associação de dois ou mais

32

materiais de classes diferentes, denominado compósito, confere melhor performance, pois a

adição das propriedades individuais desejáveis de cada um, tornando-o mais biocompatíveis,

com menor possibilidade de falha e com propriedades superiores às dos componentes

isolados. Assim sendo, com o presente trabalho surge mais uma opção de substituto ósseo,

biologicamente compatível, confeccionado a partir de dois biomateriais, sendo um biológico

(matriz óssea mineralizada heteróloga fragmentada) e o outro sintético (metilmetacrilato),

para corrigir falhas ósseas em cirurgias ortopédicas reparadoras.

4.4 CONCLUSÕES

Houve incorporação, em relação ao tempo, dos micro e macrocompósitos ao leito receptor em

100% dos casos, mostrando ser biologicamente biocompatível, pois promoveram a reparação

de falhas ósseas, sem sinais de infecção, migração e/ou rejeição, podendo, dessa forma, ser

mais uma opção como substitutos para preencher grandes defeitos ósseos.

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5. CONCLUSÃO GERAL

O compósito testado demonstrou ser biologicamente biocompatível, pois promoveu reparação

de falhas ósseas, sem sinais de infecção, migração e/ou rejeição, podendo, dessa forma, ser

mais uma opção como substituto para preencher grandes defeitos ósseos.