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1 Universidade de Lisboa Faculdade de Ciências Departamento de Biologia Animal Influência dos antioxidantes na qualidade do sémen de homens em tratamento de fertilidade Filipa Ferreira da Silva Barbosa Mestrado em Biologia Humana e Ambiente 2009
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Universidade de Lisboa
Faculdade de Ciências
Departamento de Biologia Animal
Influência dos antioxidantes na qualidade do sémen
de homens em tratamento de fertilidade
Filipa Ferreira da Silva Barbosa
Mestrado em Biologia Humana e Ambiente
2009
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Universidade de Lisboa
Faculdade de Ciências
Departamento de Biologia Animal
Dissertação
Influência dos antioxidantes na qualidade do sémen
de homens em tratamento de fertilidade
Instituto Valenciano de Infertilidad – Lisboa
Filipa Ferreira da Silva Barbosa
Mestrado em Biologia Humana e Ambiente
Tese de Dissertação orientada por:
- Doutora Sofia Nunes - Instituto Valenciano de Infertilidad (IVI) – Lisboa
- Professora Doutora Deodália Dias – Departamento de Biologia Animal – FCUL
2009
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Sumário
O presente trabalho visa estudar a influência do tratamento oral de antioxidantes
(vitamina E, L-carnitina e pentoxifilina) na qualidade seminal de homens inférteis numa
clínica de reprodução em Portugal (IVI Lisboa). O stress oxidativo (SO) é o resultado
do desequilíbrio entre as espécies reactivas de oxigénio e os antioxidantes no corpo, o
que pode levar ao dano e disfunção dos espermatozóides e eventualmente à infertilidade
masculina. Todos os componentes celulares, incluindo lípidos, proteínas, ácidos
nucleicos e açúcares, são potenciais alvos do SO. Neste estudo foram incluídos 30
homens inférteis com idade inferior a 45 anos, índice de massa corporal (IMC) menor
que 30, concentração espermática de 5 - 19 x 106 espermatozóides/ml e mobilidade
espermática progressiva entre 10 - 49%. Cada paciente realizou três espermogramas;
dois antes e um depois do tratamento com antioxidantes (n = 10) ou sem qualquer
tratamento (n = 20), sendo o intervalo mínimo entre o segundo e o terceiro
espermograma de 72 dias. Todas as amostras de sémen cumpriram abstinência sexual
entre 2 e 7 dias. Ao fim deste intervalo, foram registados os dados aos quais foi aplicado
um cálculo estatístico e analisaram-se os parâmetros do espermograma.
Após o tratamento de dados, verificou-se uma melhoria estatisticamente
significativa em apenas um dos parâmetros seminais após o tratamento com
antioxidantes, nomeadamente na morfologia espermática normal. É um resultado
interessante, visto que se pensa estar relacionado com a fragmentação de DNA
espermático. Apesar de se esperar melhorias significativas em mais parâmetros
seminais, conseguimos verificar melhores resultados no grupo com tratamento e ainda
uma melhor taxa de implantação. Estes resultados podem não ser significativos devido
ao reduzido tamanho amostral. Concluindo, este tratamento com antioxidantes pode ser
uma terapia promissora da infertilidade masculina.
Palavras-chave: Infertilidade masculina / Espermatozóides / Stress oxidativo /
Antioxidantes
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Abstract
This study, performed at an infertility centre in Portugal (IVI Lisbon), seeks to
investigate whether oral antioxidant treatment (vitamin E, L-carnitine and pentoxifilina)
is able to improve infertile men’s semen quality. Oxidative stress (OS) results from the
unbalance between reactive oxygen species and antioxidants in the body, which can
lead to sperm damage, deformity, and eventually male infertility. All cellular
components, including lipids, proteins, nucleic acids and sugars, are potential targets of
OS. This study included 30 infertile men younger than 45 years old, with a body mass
index (BMI) under 30, sperm concentration between 5-19x106 spermatozoa/ml and
progressive sperm motility between 10-49%. Each patient delivered 3 semen samples: 2
before and 1 after the antioxidant treatment (n=10) or without any treatment (n=20).
The interval between the second and the third deliver was, at least, 72 days. All semen
samples respected sexual abstinence between 2 to 7 days. At the end of the treatment
with antioxidants, semen parameters were statistically analyzed.
After statistical analysis, we only achieved one significant improvement of the
seminal parameters, after the antioxidant treatment, namely the normal sperm
morphology. It is an interesting result once it is believed that sperm morphology is
related to sperm DNA fragmentation. Although more significant improvements were
expected, we could verify better results in the antioxidant treated group, as well as a
better implantation rate. These results may not be significant due to the reduced size of
the sample. In conclusion, this antioxidant treatment could be a promising therapy for
male infertility.
Keywords: Male infertility / Spermatozoa / Oxidative stress / Antioxidants
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Agradecimentos
Agradeço a todos que tornaram este estudo possível. Queria agradecer muito
especialmente às minhas orientadoras que me apoiaram sempre e estiveram sempre
presentes. À Doutora Sofia Nunes agradeço muito especialmente por me ter encorajado
desde o início, pela compreensão e por me ter conduzido da melhor forma ao longo de
todo o processo. À Professora Deodália por ter tornado tudo possível, pela sua
disponibilidade e compreensão desde o início.
O meu sincero agradecimento ao Doutor Sérgio Soares e Doutora Catarina
Godinho pela colaboração e ajuda no delineamento do projecto. Um agradecimento
muito especial à Susana Alves e João Gonçalves do Laboratório de Andrologia pela
imensa colaboração e disponibilidade. Sem eles não teria sido possível realizar este
trabalho.
Não podia deixar de agradecer aos meus colegas do Laboratório de FIV, David
Moreno, Carlos Coreia e Ângela Gama, pelo apoio, carinho e compreensão, sobretudo
naqueles dias de maior stress (não oxidativo).
Agradeço profundamente aos meus pais e à minha irmã pela força e carinho. Um
agradecimento muito especial ao Cristóvão pelo carinho e apoio, mesmo nos momentos
mais difíceis. Sem eles não teria sido possível realizar este sonho!
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ÍNDICE
Parte I – Introdução 8
1. Apresentação do tema 8
2. Estado de Arte 92.1. A Espermatogénese 10
2.2. As Espécies Reactivas de oxigénio e o stress oxidativo 112.2.1. Fontes de espécies reactivas de oxigénio 15
2.3. As espécies reactivas de oxigénio na Mulher 172.4. Os Antioxidantes 17
2.4.1. Antioxidantes enzimáticos 182.4.2. Antioxidantes não-enzimáticos 19
2.4.3. Suplementação oral de antioxidantes 21
2.5. O estilo de vida e a infertilidade masculina 22
2.5.1. Tabaco 222.5.2. Álcool 23
2.5.3. Obesidade 23
2.5.4. Factores ambientais 23
2.6. O stress oxidativo e as técnicas de procriação medicamente assistida 242.6.1. Testes directos 262.6.2. Testes indirectos 26
3. Objectivos 27
Parte II – Metodologia 28
1. Grupo de estudo 28
2. Protocolo do estudo 28
3. Análise do sémen 29
3.1. Exame macroscópico 293.2. Exame microscópico 30
3.3. Morfologia espermática 313.3.1. Protocolo para a morfologia espermática 33
4. Tratamento de dados 34
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Parte III – Apresentação de resultados 35
1. Análise estatística das diferenças entre os dois grupos 36
A. Comparação dos grupos antes do tratamento (primeiras medições) 36B. Comparação dos grupos após o tratamento (segundas medições) 38C. Comparação das diferenças pré e pós-tratamento 39
2. Análise das respostas ao tratamento 44
3. Influência da idade 46
Parte IV – Discussão 47
Parte IV – Considerações finais 61
Bibliografia 62
ANEXOS 69
A. Resultados do teste Kolmogorov-Smirnov 69
B. Glossário de abreviaturas 70
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Parte I - Introdução
1. Apresentação do tema
Um crescente conhecimento da literatura mostra uma grande variedade de
substâncias que afectam negativamente a qualidade do sémen e podem prejudicar a
fertilidade masculina (Desai, et al., 2009).
O sémen é um indicador sensível das exposições ambientais, ocupacionais e de
estilo de vida que podem exercer efeitos tóxicos directos e perturbações hormonais. Os
danos podem ocorrer em qualquer fase da vida. Contudo, enquanto algumas exposições
podem produzir alterações reversíveis, outras, especialmente danos nas células
germinativas no útero ou durante a pré-puberdade, podem provocar sequelas
permanentes (Mendiola, et al., 2008). O sémen é constituído essencialmente por
espermatozóides e o plasma seminal, onde se encontram os leucócitos, as células
redondas, eventuais células epiteliais, entre outras.
A etiologia da qualidade seminal sub-óptima devida ao stress oxidativo está a
ficar cada vez mais esclarecida e o nosso conhecimento sobre o papel das espécies
reactivas de oxigénio (ERO) na fertilidade masculina continua a crescer graças ao
número de estudos realizados. A origem da produção das espécies reactivas de oxigénio
e as etiologias exacerbadas em homens com qualidade seminal sub-óptima estão
bastante mais claras, oferecendo múltiplas vias para potenciais terapias (Kefer, et al.,
2009).
Sabemos que o plasma seminal contém tanto antioxidantes enzimáticos
(superóxido dismutase, catalase e glutationa peroxidase) assim como um conjunto de
antioxidantes não enzimáticos (por exemplo, ascorbato, urato, vitamina E, vitamina A,
piruvato, glutationa, albumina, uniquinol, taurina e hipotaurina) (Agarwal, et al., 2005).
Porém, por vezes ocorre um desequilíbrio entre as espécies reactivas de oxigénio e os
antioxidantes, originando o estado de stress oxidativo, bastante comum nos organismos
aeróbios.
Os factores relativos ao ambiente e ao estilo de vida implicados na subfertilidade
são de particular interesse porque, ao contrário das causas genéticas, estes podem ser
apontados para medidas preventivas e curativas. Um factor do estilo de vida largamente
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negligenciado mas muito importante é a alimentação. A alimentação é importante para a
síntese de DNA, já que a maioria dos seus compostos essenciais são derivados da
alimentação. Além disso, a alimentação é uma fonte de antioxidantes exógenos
(carnitina e vitaminas E e C) (Ebisch, et al., 2007). Contudo serão necessários estudos
randomizados bem estruturados para avaliar o potencial destes tratamentos com
antioxidantes. Sem mais estudos para testar os tratamentos com melhor eficácia, é difícil
criar linhas orientativas sólidas para terapias (Kefer, et al., 2009).
Nos últimos anos, prestou-se especial atenção a factores como o tabaco, o álcool
e a obesidade, conhecidos por serem nocivos para a saúde. Outros factores também
considerados pela literatura incluem o uso de drogas, o stress do calor genital, o stress
psicológico e os telemóveis (Mendiola, et al., 2008). A exposição à poluição ambiental
foi também relacionada com o aumento da produção de ERO. Embora haja cada vez
mais informação sobre os efeitos de substâncias específicas na qualidade do sémen, a
relação entre a exposição química ambiental e a infertilidade masculina não está sempre
clara (Makker, et al., 2009).
O stress oxidativo afecta tanto a fecundação natural como a procriação
medicamente assistida. Assim, compreender como as ERO são produzidas e como
afectam diversas funções torna-se bastante importante. Será necessário desenvolver
estratégias que ajudem a reduzir o stress oxidativo nos laboratórios de fertilização in
vitro (Agarwal, et al., 2008a).
2. Estado de Arte
A Organização Mundial de Saúde define infertilidade como a incapacidade de
um casal conseguir uma gravidez a termo ao fim de pelo menos 1 ano de relações
sexuais regulares e não protegidas (Rowe, et al., 2000). A infertilidade é uma grande
preocupação clínica, que afecta 15% de todos os casais em idade reprodutiva, e os
factores masculinos, incluindo baixa qualidade seminal, são responsáveis por 25%
destes casos.
Em Portugal, calcula-se que cerca de 500.000 indivíduos em idade de procriação
sofram de infertilidade e que 10.000 novos casais por ano tenham problemas de
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reprodução (Sociedade Portuguesa de Medicina da Reprodução). De facto, o número de
problemas relacionados com a esfera da fecundidade encontra-se em ascensão. A
infertilidade tem aumentado nos países industrializados devido ao adiamento da idade
de concepção, à existência de múltiplos parceiros sexuais, aos hábitos sedentários e de
consumo excessivo de gorduras, tabaco, álcool e drogas, bem como aos químicos
utilizados nos produtos alimentares e aos libertados na atmosfera.
Apenas nos últimos 15 anos houve um aumento significativo do conhecimento
sobre a infertilidade masculina, graças aos avanços relativos à compreensão da
fisiologia masculina. Há a necessidade de decifrar a origem multifactorial da
subfertilidade na qual muitos factores genéticos e ambientais actuam em conjunto
(Ebisch, et al., 2007).
2.1. A espermatogénese
O sémen do homem é uma mistura complexa de células contidas no plasma
seminal, uma secreção que consiste numa combinação de diversos produtos sintetizados
ao longo de todo o tracto genital masculino, incluindo os túbulos seminíferos e
glândulas acessórias. As células seminais incluem espermatozóides maduros e imaturos,
células redondas de diferentes estados do processo de espermatogénese, leucócitos e
outros tipos de células ocasionais, como células epiteliais (Garrido, et al., 2004).
As células germinativas masculinas desenvolvem-se nos túbulos seminíferos dos
testículos, a partir de células estaminais que se auto-renovam, ao longo da vida desde a
puberdade até à idade adulta. O processo completo do desenvolvimento das células
germinativas designa-se espermatogénese e tem a duração de aproximadamente 72 dias.
Os produtos finais da espermatogénese são os gâmetas masculinos maduros,
nomeadamente os espermatozóides. Os espermatozóides são células altamente
diferenciadas, especializadas e condensadas, que não crescem, nem se dividem e que
estão unicamente destinados a desempenhar a sua função especial, a fecundação do
ovócito. São tipicamente divididos em três partes: cabeça, que contém o núcleo (DNA e
proteínas) e o acrossoma (várias enzimas hidrolíticas); parte intermédia (com
mitocôndrias) e a cauda.
A observação microscópica do ejaculado permite a avaliação do número, da
forma e da mobilidade dos espermatozóides e a detecção de outros componentes
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celulares. Tudo isto permite a primeira informação sobre o sucesso da espermatogénese.
Contudo, a avaliação comum do ejaculado não providencia em muitos casos informação
suficiente sobre os defeitos da espermatogénese.
A espermatogénese é um processo de baixa eficiência: a perda de células
germinativas durante este processo e o número de espermatozóides mal formados no
ejaculado são extremamente elevados. Estima-se que apenas 12% do potencial
espermatogénico esteja disponível para a reprodução (Holstein, et al., 2003).
A apoptose de certos tipos de células germinativas é um aspecto normal da
espermatogénese em diversas espécies de mamíferos, incluindo o ser humano, e pode
ser importante na regulação da libertação do sémen (Barroso, et al., 2000). A apoptose é
uma das causas da fragmentação de DNA. As espécies reactivas de oxigénio (ERO) são
conhecidas por causar dano oxidativo no DNA de espermatozóides e de provavelmente
levarem um maior número de espermatozóides a sofrer apoptose (Twigg, et al., 1998).
Esta apoptose induzida pelas ERO pode ser inibida por vários antioxidantes, sugerindo
um papel importante do stress oxidativo assim como da actividade dos antioxidantes a
induzir ou inibir a apoptose (Ebisch et al, 2007).
2.2. As espécies reactivas de oxigénio e o stress oxidativo
Frequentemente, a etiologia da qualidade seminal sub-óptima é pouco
compreendida e muitos factores psicológicos, ambientais e genéticos, incluindo o stress
oxidativo, têm sido implicados (Sharlip, et al., 2002). A origem da produção das
espécies reactivas de oxigénio e as etiologias de níveis elevados em homens com
qualidade seminal sub-óptima apenas recentemente têm sido esclarecidas, oferecendo
múltiplas opções para potenciais terapias (Kefer, et al., 2009).
As ERO são produtos do metabolismo celular normal. São formadas como
subprodutos necessários das reacções enzimáticas normais da sinalização inter e
intracelular (Agarwal, et al., 2006). Durante a redução enzimática do oxigénio para
produzir energia, formam-se os radicais livres como subprodutos (Tremellen, 2008). Os
radicais mais comuns com potenciais implicações na biologia reprodutiva incluem o
anião superóxido (O2-)., peróxido de hidrogénio (H2O2), radical peroxilo (ROO-). e o
extremamente reactivo radical hidroxilo (OH-). (Maneesh and Jayalekshmi, 2006). Os
radicais livres são um grupo de moléculas químicas altamente reactivas que têm um ou
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mais electrões desemparelhados e que podem modificar biomoléculas oxidando-as. Esta
estrutura electrónica dos radicais faz com que reajam quase instantaneamente com
qualquer substância que se encontre por perto (Agarwal, et al., 2008a). Normalmente, o
oxigénio molecular tem 2 electrões desemparelhados e este facto torna-o especialmente
susceptível à formação de radical. Por exemplo, a adição de um electrão extra à
molécula de oxigénio (O2) forma o radical anião superóxido (O2-)., a forma primária das
ERO. Este anião superóxido pode depois ser convertido directa ou indirectamente em
ERO secundárias, tal como o radical hidroxilo (OH-)., radical peroxilo (ROO-). ou
peróxido de hidrogénio (H2O2) (Maneesh and Jayalekshmi, 2006). Uma vez iniciado o
processo, dá-se uma reacção em cascata que leva, por fim, a danos nas células vivas.
(Agarwal et al, 2008a).
Apesar disso, as espécies reactivas de oxigénio exercem muitos efeitos benéficos
nos espermatozóides, que estão sumarizados na Tabela I. Desta tabela podemos concluir
que a presença de ERO parece ser muito importante no processo de fecundação de
ovócitos (Ebisch et al, 2007).
Tabela I – Efeitos das espécies reactivas de oxigénio (ERO) nosespermatozóides.
As espécies reactivas de oxigénio regulam Referências
Maturação epididimal e concentraçõesespermáticas fisiológicas
Cornwall et al (1988)
Taxa de hiperactivação De Lamirande and Gagnon (1993)Capacidade de sofrer reacção acrossómica Burkman (1990), De Lamirande et al
(1993)Ligação a ovócitos Aitken et al (1989, 1993)
(Adaptado de Ebisch et al, 2007)
Enquanto as ERO são necessárias para a capacitação espermática, hiperactivação
e fusão ovócito-espermatozóide, um nível excessivo destes radicais pode afectar
negativamente a qualidade do sémen (Kefer, et al., 2009). Elevados níveis de ERO
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foram relacionados com uma diminuição da mobilidade espermática, aumento dos
danos do DNA espermático, peroxidação lípidica da membrana celular do
espermatozóide e diminuição da eficácia da fusão ovócito-espermatozóide (Agarwal, et
al., 2007).
Quando o nível de oxidantes ultrapassa o nível de antioxidantes estamos perante
uma situação de stress oxidativo (SO), há portanto uma ruptura do equilíbrio (Pons-
Rejraji, et al., 2009). É uma situação comum provocada pelos sistemas biológicos em
condições aeróbias, em que os antioxidantes não conseguem eliminar os radicais livres
(Agarwal, et al., 2008b). A sobreprodução de ERO pode ser induzida através de
mecanismos fisiológicos ou patológicos, incluindo a formação de ERO por leucócitos
como um mecanismo citotóxico de defesa do hospedeiro, durante estados de hipoxia
levando a grandes quantidades de ERO, assim como um vasto conjunto de drogas com
efeitos oxidativos nas células (Kefer, et al., 2009). A Figura 1 representa resumidamente
um esquema do stress oxidativo.
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Figura 1. Resumo do equilíbrio entre a produção de espécies reactivas de oxigénio(ERO) e os sistemas antioxidantes. A balança oxidante/antioxidante esquematiza oequilíbrio no sémen entre a produção de ERO e os sistemas de defesa antioxidantes.
(Adaptado de Pons-Rejraji et al, 2009)
Os efeitos patológicos das ERO incluem a perda da fluidez da membrana
plasmática devido à peroxidação lipídica pelas ERO nos espermatozóides.
Consequentemente, diminui a fosforilação das proteínas do axonema e pode levar a uma
diminuição do vigor da mobilidade e, finalmente, provocar a imobilização espermática
(Agarwal, et al., 2003). Os radicais livres podem também levar a danos no DNA dos
espermatozóides (Aitken and Krausz, 2001). Na maioria dos casos, os danos induzidos
pelos radicais livres podem ser reparados. Infelizmente, os espermatozóides não são
capazes de reparar estes danos porque lhes falta o sistema enzimático citoplasmático
necessário para o fazer (Agarwal. et al., 2008b). De facto, durante a espermatogénese, o
citoplasma é geralmente expelido do espermatozóide antes da libertação do epitélio
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germinal. Assim, a estrutura celular única dos espermatozóides torna-os particularmente
sensíveis ao stress oxidativo. As membranas plasmáticas contêm grandes quantidades
de ácidos gordos polinsaturados. A elevada concentração de ácidos gordos
polinsaturados nas membranas celulares dos espermatozóides torna-os mais susceptíveis
à peroxidação lipídica do que as outras células germinativas (Aitken, et al., 1995). Esta
combinação da susceptibilidade à peroxidação lipídica com a relativa falta de vigorosos
mecanismos de defesa intracelular é exacerbada pela produção de ERO pelos
espermatozóides (Kefer, et al., 2009).
Elevados níveis de ERO estão também correlacionados negativamente com o
potencial da membrana mitocondrial. Uma diminuição no potencial da membrana
mitocondrial é conhecida por ser um dos acontecimentos que iniciam a cascada da
apoptose e demonstrou-se que níveis elevados de ERO seminal aumentam a apoptose
nos espermatozóides de pacientes com factor masculino de infertilidade (Wang, et al.,
2003).
2.2.1. Fontes de espécies reactivas de oxigénio
O sémen humano consiste em diferentes tipos de células tais como
espermatozóides maduros e imaturos, células redondas de diferentes estados do
processo de espermatogénese, leucócitos e células epiteliais. Destes, os leucócitos
(neutrófilos e macrófagos) e os espermatozóides imaturos são as duas principais fontes
de ERO (Agarwal, et al., 2008a). Os neutrófilos produzem e libertam elevadas
concentrações de espécies reactivas de oxigénio junto de células e patogéneos para
formar reacções citotóxicas (Saleh and Agarwal, 2002). Pensa-se que a síntese de ERO
em resposta a uma infecção seja a 1ª linha de defesa contra microorganimos intrusos
(Garrido, et al., 2004).
A leucocitospermia é já há muito associada com a diminuição da concentração
espermática, mobilidade e morfologia, assim como reduzida hiperactivação e
fertilização defeituosa (Kefer, et al., 2009). Estudos sugerem que a reacção
colorimétrica da peroxidase seja um indicador preciso de ERO excessivas, mesmo em
concentrações abaixo do que a Organização Mundial de Saúde estabeleceu como sendo
leucocitospermia (concentração> 1x106 leucócitos/mL) (Agarwal et al, 2008b).
Enquanto a relevância da leucocitospermia no potencial da fecundação do paciente
permanece difícil de quantificar, esta pode todavia ser considerada um marcador de
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inflamação urológica ou sistémica e de possível disfunção espermática (Kefer, et al.,
2009).
Verificou-se que os espermatozóides formavam as ERO independentemente dos
leucócitos e que esta capacidade depende do nível de maturação do espermatozóide. A
retenção de excessivo citoplasma residual é a ligação entre a fraca qualidade seminal e
elevada concentração de ERO. Pensa-se que os espermatozóides que possuem gotas
citoplasmáticas sejam imaturos e funcionalmente defeituosos (Agarwal, et al., 2008a).
Níveis elevados de ERO no sémen estão correlacionados negativamente com a
morfologia normal (Gil-Guzman, et al., 2001) e positivamente correlacionados com o
índice de malformação dos espermatozóides (Agarwal, et al., 2004). Os resíduos
citoplasmáticos contêm elevados níveis de enzima glucose-6-fosfato diidrogenase, que
forma o NADPH. O NADPH depois forma espécies reactivas de oxigénio via NADPH
oxidase na membrana espermática (Said, et al., 2005). Além disso, à medida que a
concentração de espermatozóides imaturos aumenta no ejaculado, aumenta também a
concentração de espermatozóides maduros com DNA danificado (Agarwal, et al.,
2008a).
Embora tanto os leucócitos como os espermatozóides produzam ERO, a
concentração destas gerada por cada tipo de célula varia bastante. Foi demonstrado que
os leucócitos produzem 1000 vezes mais ERO que os espermatozóides após a
capacitação (Kefer, et al., 2009). Estes níveis díspares parecem implicar os leucócitos
como os agentes ofensivos dos danos oxidativos, mas outros estudos sugerem que os
danos espermáticos pelo stress oxidativo estão também mais relacionados com o local
do que com a concentração. Por exemplo, investigaram-se os efeitos das ERO
produzidas pelos leucócitos e pelos espermatozóides na qualidade seminal. Os níveis de
produção de ERO pelos leucócitos seminais foram designados ERO extrínsecas e as
produzidas pelos espermatozóides de produção intrínseca. Estes dados sugerem que
locais específicos de danos e funcionamento espermático estão não só relacionados com
os níveis de ERO produzidas, mas também com o local de produção destas. Baixas
concentrações de ERO produzidas intrinsecamente podem danificar substancialmente o
DNA espermático, enquanto que a produção extrínseca de ERO é mais prejudicial para
estruturas espermáticas externas, afectando por conseguinte a mobilidade, contagem e
morfologia (Kefer et al, 2009). Supõe-se que este stress oxidativo que induz o dano
espermático contribua em 30 a 80% de todos os casos de infertilidade masculina
(Agarwal, et al., 2006).
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2.3. Espécies reactivas de oxigénio na mulher
O papel das ERO ao nível do ovócito e da infertilidade feminina ainda não está
esclarecido. Ao contrário dos gâmetas masculinos e do plasma seminal no qual são
transportados, existe muito pouca informação relacionada com o meio envolvente do
ovócito e dos folículos ováricos (Taylor, 2001).
Os níveis de ERO dentro de certos limites fisiológicos podem ser necessários
para o desenvolvimento normal do ovócito e subsequente crescimento do embrião;
contudo, como em muitos outros sistemas, elevadas quantidades podem indicar stress
oxidativo (Ebisch, et al., 2007).
2.4. Antioxidantes
Para contrariar a possibilidade de um significativo dano celular devido à
excessiva produção de espécies reactivas de oxigénio, antioxidantes enzimáticos e
antioxidantes não-enzimáticos suprimem o excesso de ERO e permitem atingir um
equilíbrio entre formação de oxidantes benéfica e stress oxidativo prejudicial (Kefer et
al, 2009). O plasma seminal está dotado de um conjunto de antioxidantes que protegem
os espermatozóides dos agentes oxidantes (Sikka, 1996). Os mecanismos de defesa dos
antioxidantes compreendem três níveis de protecção: prevenção, intercepção e
reparação. A prevenção da formação de ERO é a primeira linha de defesa contra a
ofensa oxidativa (Agarwal et al, 2008b). As ERO têm de ser continuamente inactivadas,
ficando apenas uma pequena quantidade necessária para manter a função celular normal
(Sikka, 1996). Os níveis patológicos de ERO detectadas no sémen de homens inférteis
são mais provavelmente causados pela maior produção de ERO do que pela reduzida
capacidade antioxidante do plasma seminal (Agarwal et al, 2008a).
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2.4.1. Antioxidantes enzimáticos
Quanto aos antioxidantes enzimáticos, podemos falar de três grupos de enzimas
que desempenham um papel importante como “supressores” oxidativos (Tremellen,
2008). As superóxido dismutases (SOD) são enzimas que contêm metal e que catalisam
a conversão de dois superóxidos em oxigénio e peróxido de hidrogénio, que é menos
tóxico que o superóxido. A catalase (CAT), uma enzima que se localiza nos
peroxissomas, degrada o peróxido de hidrogénio em água e oxigénio, completando
assim a reacção iniciada pela SOD, de acordo com as seguintes equações:
2 (O2-) + 2H+ SOD H2O2 + O2
H2O2CAT H2O + ½ O2
A glutationa peroxidase actua também na degradação do peróxido de hidrogénio
removendo os radicais peroxilo, originando água e a forma oxidada da GSH (GSSG), de
acordo com a equação:
2GSH + H2O2glutationa peroxidase GSSG + 2H2O
Outras enzimas, como a glutationa transferase, ceroplasmina ou hemoxigenase,
podem também participar no controlo enzimático dos radicais de oxigénio e dos seus
produtos (Tremellen, 2008).
Desde 1980 que diferentes estudos demonstraram a presença de superóxido
dismutase (SOD) no plasma seminal e nos espermatozóides humanos (Mennella and
Jones, 1980 in Garrido, et al., 2004). Pesquisas prévias demonstraram que as
quantidades de superóxido dismutase, catalase e glutationa peroxidase do plasma
seminal são significativamente mais baixas em pacientes inférteis do que em grupos
controlos, indicando portanto claramente a sua implicação directa na fertilidade
masculina (Nakamura, et al., 2002).
19
2.4.2. Antioxidantes não-enzimáticos
As vitaminas E e C e a glutationa desempenham papéis importantes como
antioxidantes não-enzimáticos (Agarwal et al, 2007). O -tocoferol (vitamina E) é
lipossolúvel e actua sobretudo ao nível das membranas celulares (Ford and Whittington,
1998), protegendo-as contra os danos oxidativos, capturando e eliminando radicais
livres dentro das membranas celulares. A vitamina E inibe a peroxidação lipídica
eliminando os radicais peroxilo (RO.) e alcoxilo (ROO.). A capacidade do alfa-tocoferol
para manter um nível estável de radical peroxilo na membrana plasmática depende da
sua reciclagem através de agentes redutores externos, como o ascorbato e os tióis. Desta
forma, o alfa-tocoferol é capaz de funcionar como antioxidante quebrando a cadeia dos
radicais livres, apesar de a concentração ser baixa. A concentração da vitamina E nos
espermatozóides não está significativamente relacionada com a concentração desta no
plasma seminal, embora a percentagem de espermatozóides móveis esteja intimamente
relacionada com o teor de vitamina E nos espermatozóides (Therond, et al., 1996).
Verificou-se que a utilização de vitamina E in vitro melhorava a mobilidade espermática
e a viabilidade (Aitken, et al., 1989).
A vitamina C (ácido ascórbico) é um antioxidante hidrossolúvel que reduz os
radicais desde uma grande variedade de fontes e também recicla vitamina E oxidada
(Kefer, et al., 2009). A vitamina C é conhecida por remover eficazmente o radical
hidroxilo, o superóxido e o peróxido de hidrogénio (Patel and Sigman, 2008). Foi
demonstrado que a vitamina C se encontrava presente em pequenas quantidades no
plasma seminal de homens inférteis (Lewis, et al., 1997).
Num estudo randomizado e controlado com placebo, Greco e colegas (2005)
verificaram que o tratamento de homens com infertilidade inexplicada associada a uma
elevada fragmentação do DNA espermático ( 15 %) com vitamina C e E, levava a uma
diminuição da fragmentação do DNA sem qualquer alteração nos parâmetros seminais
(Greco, et al., 2005a). É importante notar que os estudos não escolhem os pacientes
baseados nos níveis anormais de ERO. Um estudo não-controlado de 38 homens com
elevada percentagem de fragmentação do DNA espermático ( 15 %) e com uma
tentativa falhada com a microinjecção intracitoplasmática de espermatozóide (ICSI)
submeteram-se a um tratamento oral de vitamina E e C e demonstraram uma melhoria
significativa na taxa de gravidez (48,2% vs 6,9%) e de implantação (19,6% vs 2,2%)
quando comparado com a sua primeira tentativa com ICSI (Greco, et al., 2005b).
20
Nenhum ensaio randomizado e controlado actual mostra uma melhoria nos parâmetros
seminais ou nas taxas de gravidez de homens inférteis com a administração oral
individual de vitamina C.
A glutationa, antioxidante não-enzimático, pode ser a defesa intracelular mais
importante contra as ERO. A glutationa é um tripeptídeo composto por glutamato,
cisteína e glicina. A subunidade de cisteína providencia um grupo livre de sulfidrilo
(SH) exposto que elimina directamente os radicais livres. Uma vez oxidada, a glutationa
é depois regenerada ou reduzida pela glutationa redutase e pela nicotinamida adenina
dinucleotido fosfato (NADPH) para completar o ciclo (Agarwal et al., 2007). Um
estudo de Kodama e o seu grupo de pesquisa (1997) demonstrou que um tratamento
com a combinação de 400mg de GSH, 200 mg de vitamina C e 200 mg de vitamina E
durante 2 meses melhorou significativamente a concentração espermática e reduzia o
nível de danos oxidativos no DNA espermático (Kodama, et al., 1997). Porém,
Ochsendorf e colaboradores (1998) não conseguiram encontrar qualquer diferença na
concentração de GSH no plasma seminal entre azoospérmicos, oligozoospérmico e
normozoospérmicos (Ochsendorf, 1999).
A carnitina é um antioxidante alimentar que diminui as ERO removendo a
acetil-CoA tóxica extracelular que é responsável pelas ERO mitocondriais (Agarwal and
Said, 2004). Aproximadamente 75% da carnitina presente nos humanos é derivada da
sua alimentação. A concentração mais elevada de carnitina ocorre no epidídimo, com
concentrações aproximadamente 2000 vezes mais elevadas do que no plasma (Patel and
Sigman, 2008). Um estudo clínico não controlado de Costa e colegas (1994) mostrou
que a administração oral da L-carnitina (3g/dia durante um período de 4 meses) em 134
pacientes com astenozoospermia conduzia a uma melhoria significativa na mobilidade
espermática, no índice de linearidade, na progressão rápida linear e na velocidade média
(Costa, et al., 1994).
A pentoxifilina é um derivado da metilxantina e aumenta os níveis de cAMP
intracelular, inibindo a fosfodiesterase (Shen, et al., 1991). Segundo alguns estudos, a
pentoxifilina prolonga a duração da actividade dos espermatozóides do ejaculado. O
efeito estimulante da pentoxifilina na mobilidade espermática pode ser devida à sua
acção farmacológica no metabolismo do cAMP. Quando administrada oralmente e
secretada no fluido seminal, a pentoxifilina e os seus metabolitos aparecem no sémen.
Inibem a fosfodiesterase e aumentam as concentrações de cAMP nos espermatozóides
do ejaculado, melhorando assim a sua mobilidade (Shen, et al., 1991). No estudo de
21
Shen e o seu grupo de investigação (1991) a suplementação oral de pentoxifilina em
homens oligo e/ou astenozoospérmicos melhorou a mobilidade espermática, mas não a
concentração (Shen, et al., 1991). Verificou-se que a pentoxifilina in vitro tinha um
efeito benéfico na mobilidade espermática e na reacção acrossómica e reduz a libertação
de O2- pelos espermatozóides humanos (McKinney, et al., 1996). Além disso, Parinaud
e o seu grupo de pesquisa (1997) verificaram que a pentoxifilina pode reduzir
significativamente os efeitos embriotóxicos do H2O2 em embriões de ratinho com duas
células (Parinaud, et al., 1997).
Enquanto os antioxidantes catalase, SOD e glutationa peroxidase encontram-se
em elevadas concentrações no citoplasma da maioria das células, as células
espermáticas carecem de citoplasma e portanto contêm apenas quantidades mínimas
destas vias de eliminação de ERO. A maioria da capacidade antioxidante enzimática
está contida no fluido seminal, assim como os antioxidantes não-enzimáticos vitamina E
e C, taurina e hipotaurina, entre outros (Agarwal, et al., 2007).
Sob condições normais, estes antioxidantes enzimáticos e não-enzimáticos
actuam para manter um nível total baixo de stress oxidativo no sémen, permitindo os
processos normais de sinalização e normal funcionamento espermático, enquanto
evitam concomitantemente os danos celulares oxidativos. Por outro lado, os efeitos
patológicos do stress oxidativo surgem em condições onde os níveis de ERO não
eliminadas aumentam ou a capacidade de neutralização dos antioxidantes do sistema
diminui, perturbando assim o delicado equilíbrio oxidante/antioxidante (Kefer, et al.,
2009).
2.4.3. Suplementação oral de antioxidantes
Os antioxidantes alimentares estão presentes na fruta, nos vegetais e nos
suplementos alimentares (Lenzi, et al., 1998). O caso da suplementação oral em homens
é bastante especulativa e depende se conseguirá de facto aumentar os níveis de
antioxidantes no tracto reprodutor e nos próprios gâmetas. Alguns ensaios afirmaram
que a administração oral de antioxidantes pode melhorar a qualidade espermática de
grandes fumadores (Dawson, et al., 1992) e pacientes com factor masculino de
infertilidade (Agarwal and Allameneni, 2004), enquanto outros não encontraram
qualquer benefício ou alteração nos parâmetros seminais em homens sub-férteis tratados
com vitamina C e E (Rolf, et al., 1999).
22
O mecanismo de acção dos antioxidantes alimentares inclui capturar os radicais
livres e interferir com a cadeia de reacções químicas que levam à peroxidação lipídica
(Patel and Sigman, 2008). Os antioxidantes, como a vitamina E (alfa-tocoferol),
vitamina C (ácido ascórbico) e vitamina A (carotenóides), presentes na alimentação são
importantes para restabelecer e manter o equilíbrio oxidante-antioxidante nos tecidos
(Rolf, et al., 1999).
2.5. O estilo de vida e a infertilidade masculina
Existem bastantes evidências de que a qualidade e capacidade de fecundação do
sémen humano têm sofrido um grande declínio nas últimas décadas, pelo menos em
várias regiões dos Estados Unidos e da Europa (Skakkebok, et al., 2006). Porém, estas
alterações podem não ter ocorrido homogeneamente. As variações geográficas na
qualidade seminal apoiam a ideia de que factores específicos, presentes nalgumas áreas
mas não noutras, possam ser responsáveis pelo declínio da qualidade do sémen
(Jorgensen, et al., 2001). Os poluentes ambientais, as exposições ocupacionais e os
estilos de vida têm sido explorados como possíveis contribuintes para estas alterações.
O mau funcionamento do sistema reprodutivo masculino parece ser um bom marcador
da poluição ambiental (Homan, et al., 2007).
2.5.1. Tabaco
Os efeitos do tabaco podem ser observados tanto a nível microscópico como a
nível molecular. Os homens fumadores possuem menor qualidade seminal, reflectindo-
se na contagem, mobilidade e morfologia normal espermática diminuídas (Ramlau-
Hansen, et al., 2007). A exposição ao fumo do cigarro gera elevados níveis de stress
oxidativo, aumentando directamente tanto a concentração seminal de leucócitos como a
formação de ERO seminal, e diminuindo a quantidade da enzima antioxidante SOD no
sémen (Pasquallotto, et al., 2008).
23
2.5.2. Álcool
O alcoolismo tem sido sempre associado a perturbações da saúde reprodutiva, tal
como a impotência ou atrofia testicular (Mendiola, et al., 2008). Como se esperava, o
consumo de grandes quantidades de álcool também aumenta os níveis sistémicos do
stress oxidativo e o efeito deste stress oxidativo pode ser depois exacerbado pela
alimentação fraca em nutrientes, que geralmente acompanha o elevado consumo de
álcool (Koch, et al., 2004).
2.5.3. Obesidade
Uma observação comum no mundo ocidental é o aumento do índice de massa
corporal (IMC) na população em geral que resultou numa maior prevalência de
obesidade. Vários estudos associaram baixos níveis seminais a homens com IMC acima
ou abaixo dos valores normais (Mendiola, et al., 2008).
2.5.4. Factores ambientais
Recentemente, estudos sugerem que as toxinas ambientais alteram a integridade
do DNA espermático (Aitken and De Luliis, 2007). A fragmentação do DNA pode ser
um excelente marcador da exposição aos agentes tóxicos e uma ferramenta de
diagnóstico para a potencial infertilidade masculina. A exposição a metais
(principalmente chumbo e cádmio) tem sido há muito associada a baixa mobilidade
espermática e densidade, aumento de anomalias morfológicas e infertilidade masculina
(Ozmen, et al., 2007). A maior presença destes produtos industriais no meio ambiente
levanta uma séria ameaça relativamente à saúde reprodutiva dos humanos (Kefer et al,
2009).
24
2.6. O stress oxidativo e as técnicas de procriação medicamente assistida
Desde o nascimento do primeiro bebé conseguido por fertilização in vitro, em
1978, as técnicas de reprodução assistida têm-se tornado o tratamento de escolha para
muitos casos de infertilidade masculina e feminina. Estes métodos inevitavelmente
requerem manipulação de gâmetas e embriões in vitro, expondo estas células a um
stress oxidativo adicional (Taylor, 2001). Muitos factores, por exemplo, o choque de
pH, choque osmótico, flutuações de temperatura, danos de luz UV, desequilíbrio de
nutrientes e a ausência de factores de crescimento podem influenciar o resultado das
técnicas de procriação medicamente assistida (PMA). Porém, recentemente o SO tem
sido apontado como um dos factores mais importantes que afectam negativamente estas
técnicas (Agarwal and Said, 2003). Demonstrou-se que níveis patológicos de ERO
tinham um impacto negativo na qualidade embrionária e podem também levar a um
bloqueio embrionário precoce e atraso no desenvolvimento. Bedaiwy e o seu grupo de
pesquisa (2006) verificaram que o desenvolvimento lento, a fragmentação e a menor
capacidade de formação de blastocistos morfologicamente normais estão associados ao
aumento de ERO durante a cultura embrionária, conduzindo a menores taxas de
gravidez clínica (Bedaiwy, et al., 2006). Foi colocada a hipótese que isto se deve
predominantemente a uma falta de protecção in vitro dos gâmetas e do embrião através
de eliminadores de radicais de oxigénio (Taylor, et al., 2001).
Tem de se ter em conta que os espermatozóides são separados do plasma
seminal e os ovócitos do fluido folicular durante as técnicas de PMA, removendo
portanto os gâmetas dos meios que os ajudam a proteger dos efeitos prejudiciais das
ERO. Na maioria dos tratamentos de FIV, se não pelo menos 50%, os espermatozóides
seleccionados para as técnicas de PMA provêm de um ambiente com SO (Saleh, et al.,
2003).
Dois dos principais factores que contribuem para a acumulação de ERO in vitro
são a falta de mecanismos de defesa endógenos e a exposição dos gâmetas e embriões a
várias manipulações, assim como um ambiente que possa levar à formação de SO. As
ERO, portanto, podem ser produzidas quer por fontes internas (por exemplo, produção
endógena por gâmetas e embriões) ou fontes externas (por exemplo, meios de cultura)
no laboratório de FIV (du Plessis, et al., 2008). A Figura 2 esquematiza a situação de
stress oxidativo no laboratório de FIV.
25
Figura 2. Efeitos dos níveis patológicos das espécies reactivas de oxigénio (ERO)durante a fertilização in vitro.
(Adaptado de du Plessis et al., 2008)
Vários antioxidantes foram adicionados com êxito durante a preparação do
sémen com a intenção de eliminar as ERO, por exemplo, a pentoxifilina, a glutationa, a
N-acetil-cisteína e a albumina. Estes neutralizam as ERO produzidas pelos leucócitos e
pelos espermatozóides imaturos e melhoram a fusão ovócito-espermatozóide (Patel and
Sigman, 2008).
Uma pesquisa de Agarwal e colegas (2005) mostrou que os níveis de ERO
estavam significativamente relacionados com a taxa de fertilização in vitro; portanto, a
medição dos níveis de ERO no sémen antes da fertilização in vitro pode ser útil para
prever o resultado do ciclo (Agarwal, et al., 2005). Actualmente, a avaliação
estandardizada de homens inférteis não inclui a medição dos níveis de stress oxidativo.
O custo excessivo, incómodo e principalmente a falta de uma medida estandardizada
para o stress oxidativo contribuem para a não utilização clínica destes testes. Até hoje já
26
foram descritos mais de 30 testes. Estes podem ser considerados em 2 grupos distintos:
os testes directos e os indirectos (Kefer, et al., 2009).
2.6.1. Testes directos
Os testes directos de stress oxidativo medem a soma da rede oxidativa deste
equilíbrio, medindo a oxidação da membrana celular espermática. A análise mais
utilizada mede o malondialdeído (MDA), um dos produtos finais da peroxidação
lipídica da membrana celular espermática (Aitken, et al., 1995).
A quantificação dos danos do DNA espermático tem sido também utilizado
como teste directo dos danos intracelulares induzidos pelas ERO (Kefer, et al., 2009).
2.6.2. Testes indirectos
O método mais comum de medir as ERO seminais é através do teste de
quimioluminescência indirecta. O luminol (5-amino-2,3,diidro 1,4, ftalazinediona) ou os
ensaios de lucigénio podem ser usados para a quantificação das actividades redox dos
espermatozóides. O lucigénio mede apenas os radicais superóxido extracelulares e,
portanto, o luminol é geralmente mais utilizado já que mede os níveis de ERO tanto ao
nível extra como intracelular (Agarwal, et al., 2008b).
Os níveis de antioxidantes no sémen também podem ser determinados através do
teste de quimioluminescência optimizado ou através de um teste colorimétrico.
Estes testes, tanto directos como indirectos, foram desenvolvidos para
quantificar o nível de stress oxidativo de homens que sofrem de infertilidade, com o
objectivo de traçar um plano terapêutico que diminua o stress oxidativo e melhore
globalmente a qualidade seminal. Apesar de cada teste oferecer vantagens, o custo e o
tempo de dedicação destes instrumentos impedem a sua vasta difusão pelos laboratórios
(Kefer, et al., 2009).
27
3. Objectivos
O objectivo fundamental deste estudo consistiu em testar a eficácia do
tratamento de antioxidantes combinados em homens inférteis, nomeadamente ao nível
dos parâmetros seminais, numa tentativa de melhorar a qualidade seminal. Os
objectivos deste estudo incluíam:
1) Analisar o sémen de homens inférteis em tratamento de fertilidade antes e
após administração oral de antioxidantes;
2) Avaliar parâmetros seminais do espermograma;
3) Avaliar a influência da idade;
4) Identificar parâmetros do espermograma que sofram melhorias significativas
e aqueles que não sofram qualquer efeito.
Face a estes objectivos colocaram-se as seguintes hipóteses:
A - Existirão melhorias significativas na qualidade do sémen após tratamento
com antioxidantes?
B - Será o factor tempo determinante no resultado do tratamento?
C - Existirão parâmetros da qualidade seminal que sobressaiam pela positiva ou
pela negativa?
D - Deverá o tratamento com antioxidantes ser implantado nas clínicas de
infertilidade indiscriminadamente?
28
Parte II - Metodologia
1. Grupo de estudo
O estudo apenas inclui homens em tratamento de fertilidade cujo desejo
reprodutivo persistia há mais de 1 ano. O principal critério de inclusão a nível seminal
foi diagnosticar astenozoospermia (<50% espermatozóides móveis progressivos) e
oligozoospermia (<20x106 espermatozóides/mL). Os pacientes com inflamações ou
infecções genito-urinárias foram excluídos. O grupo de estudo incluiu homens com
idade inferior a 45 anos, índice de massa corporal (IMC) inferior a 30 e que não
tivessem consumo abusivo de qualquer substância considerada tóxica (café, drogas,
álcool). Foram incluídos fumadores e não fumadores em ambos os grupos, e pretende-se
avaliar qual a importância do tabaco relativamente à qualidade seminal.
Inicialmente, a população do estudo consistia de 57 pacientes que cumpriam
todos os requisitos de inclusão na primeira fase. Porém, 27 pacientes foram excluídos
por razões diversas: desistência ou adiamento do tratamento de infertilidade (n=13),
incumprimento na administração de antioxidantes (n=10), gestação espontânea (n=1)
ou causas desconhecidas (n=3). O estudo contou com trinta pacientes que realizaram o
protocolo do estudo com sucesso, formando um grupo que realizou o tratamento com
antioxidantes (n=11) e outro grupo sem tratamento, ou seja, o grupo controlo (n=19).
2. Protocolo do estudo
De forma a avaliar a influência do armazenamento do sémen no epidídimo e
confirmar o diagnóstico, foi pedido aos pacientes que facultassem 2 amostras de sémen
com um tempo de abstinência entre 2 e 7 dias (o tempo máximo e mínimo de
abstinência sexual recomendado pela OMS, 1992), com um intervalo médio de 1 mês.
Os potenciais participantes foram assim avaliados 2 vezes antes do recrutamento no
estudo.
29
Após deixarem a 2ª amostra de sémen, os pacientes fariam o tratamento com
antioxidantes ou não, formando neste caso o grupo controlo. O tratamento com
antioxidantes consistia na administração combinada de vitamina E 1g/dia (Vitamina E
1000®), L-carnitina 1g/dia (Disocor®) e pentoxifilina 800 mg/dia (Trental®) e tinha
uma duração de aproximadamente 72 dias (10-11 semanas). Esta medicação está
disponível comercialmente. Não foram permitidas medicações concomitantes durante o
tratamento. Os pacientes foram avisados que não tomassem quaisquer vitaminas
adicionais e que não alterassem os seus hábitos alimentares durante este período.
Os pacientes foram orientados para o tratamento com antioxidantes ou para o
grupo controlo de acordo com as avaliações do médico relativamente ao casal,
nomeadamente quanto à planificação do tratamento, disponibilidade do casal, entre
outros. Após os 72 dias, era recolhida uma 3ª amostra de sémen, cumprindo abstinência
de 2 a 7 dias.
3. Análise do sémen
As amostras de sémen foram obtidas por masturbação e colocadas em frascos de
plástico estéreis. As amostras foram mantidas na incubadora a 37ºC durante, pelo
menos, 15 minutos até se obter a liquefacção completa. A análise do ejaculado foi
processada segundo as directivas da Organização Mundial de Saúde (OMS, 1992).
A contagem total de espermatozóides foi calculada multiplicando o volume
seminal pela concentração espermática. A mobilidade espermática progressiva total foi
definida como o produto da contagem total de espermatozóides e da percentagem de
mobilidade progressiva.
3.1. Exame macroscópico
As características macroscópicas que se deve analisar no exame de uma amostra
seminal em fresco são o aspecto, liquefacção e viscosidade, volume e pH.
- Aspecto: cor, opacidade, transparência, presença de corpos mucosos ou gelatinosos;
30
- Liquefacção e viscosidade: uma amostra normal de sémen liquefaz-se desde 15 a 60
minutos;
- Volume: medição num tubo graduado;
- pH: com tiras de papel, como pH-indicator strips non-bleeding de Merck, Alemanha;
ao fim de 1-3 segundos lê-se o pH, comparando com a tira de calibração; deve ser igual
ou superior a 7,2.
3.2. Exame microscópico
No estudo microscópico da amostra avalia-se a concentração, mobilidade,
morfologia, aglutinação de espermatozóides e presença de outros elementos celulares,
como leucócitos ou células germinativas imaturas. Coloca-se 10 µl da amostra bem
homogeneizada e liquefeita numa câmara especializada para a análise de sémen, a
câmara de Makler (Sefi Medical Instruments, Haifa, Israel). Esta câmara consta de uma
quadrícula de 1 mm2 dividida em 100 quadrados, com uma profundidade de 10 m.
Figura 3. Imagem de câmara de Makler (Sefi Medical Instruments, Haifa,Israel). É a câmara mais utilizada em Laboratórios de Andrologia.
(Fonte: www.sepalreproductivedevices.com)
31
- Concentração: contagem na câmara de Makler.
- Mobilidade: só se conta os espermatozóides livres e deve contar-se pelo menos 100.
Agrupa-se os espermatozóides em 4 categorias, em função da mobilidade que
apresentam:
Tipo A: Móveis progressivos rápidos. Deslocam-se de forma rectilínea e rápida.
Tipo B: Móveis progressivos lentos. Deslocam-se mais lentamente, de forma
rectilínea ou em curvas.
Tipo C: Móveis não progressivos. Movem-se mas não saem do mesmo sítio.
Tipo D: Imóveis. Não se movem.
- Aglutinação: quando os espermatozóides móveis estão unidos entre si tanto pela
cabeça como pela cauda. Esta definição não inclui os espermatozóides imóveis unidos a
células ou detritos. Nestes casos fala-se em seudoaglutinação ou agregação.
3.3. Morfologia Espermática
A morfologia do espermatozóide é um dos parâmetros habitualmente avaliado
no espermograma, segundo a OMS. Implica a análise da normalidade estrutural do
espermatozóide. Estabeleceram-se os critérios de normalidade espermática através do
estudo dos espermatozóides localizados no orifício cervical interno do colo uterino após
uma relação sexual normal de casais férteis. Depois do coito depositam-se milhões de
espermatozóides no interior da vagina, mas apenas alguns são capazes de atravessar o
muco cervical. São estes espermatozóides, com umas características morfológicas e de
mobilidade bem definidas, os que são capazes de fecundar o ovócito, o que foi
corroborado pela análise de espermatozóides capazes de se unir e penetrar a zona
pelúcida do ovócito (Remohí et al, 2008).
Um espermatozóide normal possui uma cabeça oval, com um contorno normal e
uma capa acrossómica que cubra mais de um terço da superfície da cabeça. Na Figura 2
está representado um espermatozóide humano considerado morfologicamente normal.
32
Figura 4. O espermatozóide humano. (A) Aspecto microscópico; (B) Imagem virtualdo espermatozóide mostrando o acrossoma, o núcleo e os invólucros nucleares, asmitocôndrias da peça principal. Entre as duas imagens, estão represntadas secçõestransversais do espermatozóide humano em níveis diferentes indicados na secçãolongitudinal do espermatozóide.
(Adaptado de Holstein et al, 2003)
Os espermatozóides humanos apresentam uma grande variedade de anomalias
estruturais, sendo a teratozoospermia (ejaculado com uma percentagem de
espermatozóides com morfologia normal inferior a 15%, de acordo com os critérios da
OMS de 1999) a anomalia seminal mais frequente em homens que procuram tratamento
de fertilidade. Na Figura 3 estão representadas algumas dessas anomalias.
A morfologia anormal de um espermatozóide é classificada quanto a defeitos na
cabeça, peça intermédia ou na cauda (Sun, et al., 2006). Um exemplo de defeito na
cabeça é a globozoospermia. A globozoospermia é uma forma severa de
teratozoospermia, caracterizada por uma forma redonda da cabeça do espermatozóide
associada à ausência do acrossoma. Esta anomalia morfológica pode diminuir a taxa de
fecundação (Barrière, 2005).
33
Figura 5. Exemplos de anomalias morfológicas dos espermatozóides humanos. Estárepresentado um espermatozóide normal de perfil (A) e de face (B), espermatozóidecom cabeça gigante (C), micro-espermatozóide (D), com duas cabeças (E), com doiscorpos (F), cabeça alongada (G), cabeça amorfa (H) e peça intermédia defeituosa (I).
(Fonte: www.malefertility.md)
3.3.1. Protocolo para a morfologia espermática
Uma vez liquefeita a amostra do ejaculado fresco, coloca-se 10 L numa lâmina
perfeitamente limpa. A extensão realiza-se com a ajuda de outra lâmina de cantos
polidos. Deixa-se secar a extensão ao ar. Tinge-se utilizando o método de coloração
com pan-óptico rápido tipo Diff-Quick (Panreac Quimica, S.A.U., Barcelona, Espanha)
Este método de tinção diferencial é um sistema que alia a policromía e a qualidade que
proporcionam os métodos clássicos (Giemsa e Wright) com uma rápida execução.
Consiste em três passos fundamentais: fixação com metanol Z 50% (Pan-óptico N° 1) e
duas tinturas rápidas, sendo a eosina a primeira (Pan-óptico N° 2) e de seguida o azul
(Pan-óptico N° 3). Estas tinturas são ambas soluções aquosas-tampodas, com corante.
Mais uma vez deixa-se secar a extensão ao ar. No final coloca-se uma lamela
com uma gota de óleo de imersão e observa-se ao microscópio com uma objectiva de
Espermatozóides
A B C D E F G H I
Normal
34
100x. A morfologia espermática foi avaliada de acordo com os critérios estritos de
Kruger.
4. Tratamento de dados
Os dados foram tratados utilizando o programa estatístico SPSS (v.15.0; SPSS
Inc, Chicago, IL) e o programa Excel (Microsoft Office).
35
Parte III – Apresentação de resultados
A comparação de parâmetros populacionais (média, variância, mediana) a partir
de amostras aleatórias é uma das necessidades mais frequentes em análise estatística.
Este tipo de inferência estatística é particularmente útil para testar a significância de
tratamentos ou factores que são capazes de influenciar a resposta da variável de medida
e em que se pretende testar se o tratamento teve ou não um efeito significativo. Existem
basicamente duas metodologias para fazer este tipo de testes: os testes paramétricos e os
testes não-paramétricos (Maroco, 2007).
Para verificar se a distribuição amostral é normal, utilizámos o teste estatístico
de Kolmogorov-Smirnov (K-S) e observámos que, na sua maioria, o conjunto de dados
não segue uma distribuição normal (Anexo A). Desta forma, foram aplicados testes
estatísticos não-paramétricos. O teste de Mann-Whitney é o teste não paramétrico
adequado para comparar as funções de distribuição de uma variável pelo menos ordinal
medida em duas amostras independentes. O teste de Wilcoxon é também um teste não-
paramétrico que é utilizado para comparar populações a partir de duas amostras
emparelhadas. Foram considerados resultados estatisticamente significativos para p
value <0,05.
Com o objectivo de simplificar os dados e de coerência, considerámos os dados
do 2º espermograma (confirmação de diagnóstico) como os dados da 1ª medição. Os
dados da 2ª medição referem-se aos dados obtidos do 3º espermograma, que é o
espermograma realizado ao fim do tratamento ou do grupo controlo, tendo ambos o
mesmo intervalo de tempo.
De modo a facilitar a interpretação dos resultados, as diferentes medições dos
parâmetros seminais foram introduzidas da seguinte forma na base de dados:
- 1ª CONC: 1ª medição da concentração espermática;
- 2ª CONC: 2ª medição da concentração espermática;
- 1ª MEP: 1ª medição da mobilidade espermática progressiva (A+B);
36
- 2ª MEP: 2ª medição da mobilidade espermática progressiva (A+B);
- 1ª MET: 1ª medição da mobilidade espermática total (A+B+C);
- 2ª MET: 2ª medição da mobilidade espermática total (A+B+C);
- 1ª VOL: 1ª medição volume;
- 2ª VOL: 2ª medição volume;
- 1ª NOR: 1ª medição da percentagem de espermatozóides morfologicamente normais;
- 2ª NOR: 2ª medição da percentagem de espermatozóides morfologicamente normais;
- 1ª CTOTAL: 1ª medição da contagem total de espermatozóides;
- 2ª CTOTAL: 2ª medição da contagem total de espermatozóides;
- 1ª MEPT: 1ª medição da mobilidade espermática progressiva total;
- 2ª MEPT: 2ª medição da mobilidade espermática progressiva total.
Quanto aos grupos, designamos de “Grupo Sem AOX” o grupo sem tratamento
de antioxidantes ou grupo controlo, e de “Grupo Com AOX” o grupo com tratamento de
antioxidantes.
1. Análise estatística das diferenças entre os dois grupos
A. Comparação dos grupos antes do tratamento (primeiras medições)
Aplicando o teste de Mann-Whitney para comparar os dois grupos antes do
tratamento, verificámos os seguintes resultados, como se pode ver pelo output anexo do
teste:
37
Tabela II. Resultados da aplicação do teste de Mann-Whitney (SPSS 15.0),comparando as primeiras medições dos dois grupos em estudo, ou seja, do grupocontrolo e do grupo com tratamento de antioxidantes.
Test Statistics (b) Mann-Whitney
a Not corrected for ties.b Grouping Variable: grupos
De acordo com os dados obtidos, verificámos que não existem diferenças
significativas entre as medições pré-tratamento dos dois grupos. Podemos considerar
assim que partimos de amostras homogéneas.
Mann-WhitneyU Z
Asymp.Sig. (2-tailed)
Exact Sig.[2*(1-tailed
Sig.)]
ExactSig. (2-tailed)
ExactSig. (1-tailed)
PointProbability
1ª CONC 80,500 -1,034 0,301 0,307(a) 0,311 0,156 0,005
1ª MEP 75,500 -1,249 0,212 0,216(a) 0,220 0,110 0,004
1ª MET 71,000 -1,443 0,149 0,158(a) 0,155 0,077 0,003
1ª VOL 83,000 -0,927 0,354 0,372(a) 0,366 0,183 0,006
1ª NOR 99,500 -0,218 0,828 0,832(a) 0,840 0,420 0,008
1ª CTOTAL 76,000 -1,227 0,220 0,232(a) 0,228 0,114 0,004
1ª MEPT 69,000 -1,528 0,127 0,134(a) 0,134 0,067 0,006
38
B. Comparação dos grupos após o tratamento (segundas medições)
Da mesma forma, comparámos as segundas medições dos dois grupos.
Aplicando o teste de Mann-Whitney, verificámos os seguintes resultados, como se pode
ver pelo output anexo do teste:
Tabela III. Resultados da aplicação do teste de Mann-Whitney (SPSS 15.0)comparando as segundas medições dos dois grupos em estudo, ou seja, o grupo controloe o grupo com tratamento de antioxidantes.
Test Statistics (b) Mann-Whitney
Mann-Whitney
UZ
Asymp.Sig. (2-tailed)
Exact Sig.[2*(1-tailed
Sig.)]
ExactSig. (2-tailed)
ExactSig. (1-tailed)
PointProbability
2ª COM 103,000 -0,065 0,948 0,966(a) 0,958 0,479 0,008
2ª MEP 100,500 -0,172 0,863 0,866(a) 0,874 0,437 0,008
2ª MET 100,500 -0,172 0,863 0,866(a) 0,874 0,437 0,008
2ª VOL 97,500 -0,302 0,763 0,767(a) 0,775 0,387 0,008
2ª NOR 57,500 -2,050 0,040 0,042(a) 0,040 0,020 0,001
2ª CTOTAL 103,000 -0,065 0,949 0,966(a) 0,966 0,483 0,017
2ª MEPT 104,500 0,000 1,000 1,000(a) 1,000 0,504 0,008
a Not corrected for ties.b Grouping Variable: grupos
De acordo com os dados obtidos, verificámos que existe apenas uma diferença
significativa entre as medições pós-tratamento dos dois grupos, que é referente ao
parâmetro seminal morfologia espermática normal (U = 57.5; W = 247.5; p = 0.020).
Estes dados demonstram que os grupos não seguiram, neste parâmetro, a mesma
significância de resposta, nomeadamente quanto à morfologia normal.
39
C. Comparação das diferenças pré e pós-tratamento
Para avaliar o resultado do tratamento com antioxidantes, recorreu-se ao teste
não-paramétrico de Wilcoxon. Este teste pode ser utilizado como alternativa não-
paramétrica ao teste t-student quando o pressuposto de distribuição normal da variável
nas duas medições não se verifica e/ou não é possível (caso de amostras pequenas) ou
desejável defender a robustez dos métodos paramétricos quando este pressuposto não é
válido. Pretendemos calcular as diferenças entre a primeira medição e a segunda, para
verificarmos se houve alguma diferença significativa. A análise estatística foi efectuada
com = 0.05. Obteve-se o seguinte output deste teste para o grupo com tratamento de
antioxidantes:
Tabela IV. Resultados da aplicação do teste de Wilcoxon (SPSS 15.0), comparando asmedições (antes e depois) do grupo com tratamento de antioxidantes. O primeiro quadroapresenta o número de ordens negativas, positivas e empates (N), a médias das ordens(mean rank) e a soma das ordens (sum of ranks). O segundo quadro apresenta osresultados do teste estatístico: a estatística Z e o seu p-value bilateral [Asymp.Sig. (2-tailed)], bem como os p-values exacto unilateral [Exact.Sig. (1-tailed)] e bilateral[Exact.Sig. (2-tailed)] e o p-value pontual (point probability).
Grupo com AOX Teste de Wilcoxon (c)
Depois-Antes N Mean Rank Sum of Ranks
CONC Negative Ranks 3a 5,67 17,00Positive Ranks 7b 5,43 38,00Ties 1c
Total 11MEP Negative Ranks 4d 7,25 29,00
Positive Ranks 7e 5,29 37,00Ties 0f
Total 11MET Negative Ranks 5g 4,90 24,50
Positive Ranks 6h 6,92 41,50Ties 0i
Total 11VOL Negative Ranks 6j 6,33 38,00
Positive Ranks 5k 5,60 28,00Ties 0l
Total 11
40
NOR Negative Ranks 2m 1,75 3,50Positive Ranks 5n 4,90 24,50Ties 4o
Total 11CTOTAL Negative Ranks 5p 5,20 26,00
Positive Ranks 6q 6,67 40,00Ties 0r
Total 11MEPT Negative Ranks 5s 5,20 26,00
Positive Ranks 6t 6,67 40,00Ties 0u
Total 11
a 2ª CONC < 1ª CONC m 2ª NOR < 1ª NORb 2ª CONC > 1ª CONC n 2ª NOR > 1ª NORc 2ª CONC = 1ª CONC o 2ª NOR = 1ª NORd 2ª MEP < 1ª MEP p 2ª CTOTAL < 1ª CTOTALe 2ª MEP > 1ª MEP q 2ª CTOTAL > 1ª CTOTALf 2ª MEP = 1ª MEP r 2ª CTOTAL = 1ª CTOTALg 2ª MET < 1ª MET s 2ª MEPT < 1ª MEPTh 2ª MET > 1ª MET t 2ª MEPT > 1ª MEPTi 2ª MET = 1ª MET u 2ª MEPT = 1ª MEPTj 2ª VOL < 1ª VOLk 2ª VOL > 1ª VOLl 2ª VOL = 1ª VOL
Antes-Depois Z Asymp. Sig.(2-tailed)
Exact Sig. (2-tailed)
Exact Sig. (1-tailed)
PointProbability
CONC -1,070a 0,285 0,322 0,161 0,023MEP -0,357a 0,721 0,746 0,373 0,015MET -0,756a 0,450 0,479 0,240 0,015VOL -0,446b 0,656 0,677 0,338 0,015NOR -1,781a 0,075 0,094 0,047 0,016
CTOTAL -0,622a 0,534 0,577 0,289 0,029MEPT -0,622a 0,534 0,577 0,289 0,029
a Based on negative ranks.b Based on positive ranks.c Wilcoxon Signed Ranks Test
41
Observou-se apenas uma diferença estatística (pUE = 0.047 < = 0.05) entre o
momento pré e o momento pós-tratamento do grupo com antioxidantes e esta diferença
refere-se ao parâmetro da morfologia espermática normal (S+ = 4.9: S -= 1,75; Z = -
1.78; pUE = 0.047; N = 11). Nos outros parâmetros seminais não observamos diferenças
com valor estatístico.
Verificámos por fim se existem diferenças estatísticas entre a primeira e a
segunda medição no grupo controlo. Aplicámos portanto de novo o teste de Wilcoxon
para este grupo e obtivemos os seguintes dados:
Tabela V. Resultados da aplicação do teste de Wilcoxon (SPSS 15.0), comparando asmedições (antes e depois) do grupo sem tratamento de antioxidantes. A estrutura dooutput é semelhante à do exemplo anterior.
Grupo sem AOX - Teste de Wilcoxon (b)
Antes-Depois
N Mean Rank Sum ofRanks
CONC Negative Ranks 9ª 10,17 91,50Positive Ranks 8b 7,69 61,50Ties 2cTotal 19
MEP Negative Ranks 10d 10,05 100,50Positive Ranks 7e 7,50 52,50Ties 2fTotal 19
MET Negative Ranks 12g 8,92 107,00Positive Ranks 5h 9,20 46,00Ties 2iTotal 19
VOL Negative Ranks 11j 12,32 135,50Positive Ranks 7k 5,07 35,50Ties 1lTotal 19
NOR Negative Ranks 8m 4,69 37,50Positive Ranks 2n 8,75 17,50Ties 9ºTotal 19
42
CTOTAL Negative Ranks 12p 9,33 112,00Positive Ranks 7q 11,14 78,00Ties 0rTotal 19
MEPT Negative Ranks 12s 9,67 116,00Positive Ranks 7t 10,57 74,00Ties 0uTotal 19
a 2ª CONC < 1ª CONC m 2ª NOR < 1ª NORb 2ª CONC > 1ª CONC n 2ª NOR > 1ª NORc 2ª CONC = 1ª CONC o 2ª NOR = 1ª NORd 2ª MEP < 1ª MEP p 2ª CTOTAL < 1ª CTOTALe 2ª MEP > 1ª MEP q 2ª CTOTAL > 1ª CTOTALf 2ª MEP = 1ª MEP r 2ª CTOTAL = 1ª CTOTALg 2ª MET < 1ª MET s 2ª MEPT < 1ª MEPTh 2ª MET > 1ª MET t 2ª MEPT > 1ª MEPTi 2ª MET = 1ª MET u 2ª MEPT = 1ª MEPTj 2ª VOL < 1ª VOLk 2ª VOL > 1ª VOLl 2ª VOL = 1ª VOL
Antes -Depois Z
Asymp.Sig. (2-tailed)
Exact Sig.(2-tailed)
Exact Sig.(1-tailed)
PointProbability
CONC -0,710a 0,478 0,495 0,248 0,008
MEP -1,137a 0,255 0,268 0,134 0,005
MET -1,445a 0,149 0,156 0,078 0,004
VOL -2,182a 0,029 0,027 0,014 0,001
NOR -1,025a 0,305 0,336 0,168 0,008
CTOTAL -0,684a 0,494 0,515 0,258 0,013
MEPT -0,845a 0,398 0,418 0,209 0,011a Based on positive ranks.b Wilcoxon Signed Ranks Test.
A partir destes quadros, verificámos que existe uma diferença estatística
relativamente ao volume, entre a primeira medição e a segunda (S+ = 5.07: S -= 12.32; Z
= - 2.18; pUE = 0.014; N = 19) uma vez que pUE = 0.014 < = 0.05.
Quanto aos restantes parâmetros analisados, não foram verificadas diferenças
estatísticas.
43
Observando a distribuição dos resultados da Figura 2, verificamos que existem
alguns outliers. Os parâmetros contagem total e mobilidade espermática progressiva
total não estão representados por uma questão de simplificar a interpretação dos
diagramas, visto terem valores consideravelmente superiores aos restantes parâmetros.
Figura 6. Diagramas referentes aos resultados obtidos no teste Mann-Whitney.2A: Resultados para o Grupo Controlo; 2B: Resultados para o Grupo comAntioxidantes. Podemos notar a presença de outliers em ambos os gráficos.
Foram realizados novos testes sem os outliers aqui determinados, mas não foram
obtidos diferentes resultados com valor estatístico.
44
2. Análise das respostas ao tratamento
Apesar da ausência de diferenças estatísticas na maior parte dos dados
analisados, verificamos melhorias na maioria dos parâmetros seminais do grupo com
tratamento de antioxidantes. Ao nível da concentração, a maioria dos pacientes (64%)
obteve um aumento da concentração espermática após o tratamento. Entre estes, o
aumento médio foi de 11,1 milhões espermatozóides/mL, o que se considera ser uma
melhoria aceitável. O mesmo se verificou relativamente à mobilidade espermática
progressiva, em que houve uma ligeira melhoria por parte da maioria dos pacientes
(64%), tendo-se verificado um aumento médio de 9,6%. Da mesma forma, a mobilidade
espermática total aumentou após o período de tratamento. Houve uma resposta positiva
por parte de pouco mais da maioria dos pacientes (55%) e neste grupo observou-se um
aumento médio de 15,7%. Pelo contrário, o volume foi o único parâmetro seminal que
não sofreu qualquer melhoria com este tratamento, chegando mesmo a diminuir um
pouco (0,92 mL) e apenas 45% dos pacientes aumentou o volume seminal após o
tratamento. Quanto à morfologia espermática normal, verificou-se uma melhoria no
pós-tratamento (4,2%), apesar de apenas 45% dos pacientes terem demonstrado
melhorias. Isto significa que, embora poucos pacientes tenham aumentado a
percentagem de espermatozóides normais, aqueles que o conseguiram tiveram
melhorias acentuadas.
Reunindo todos estes resultados, comparando as médias dos grupos verificamos
ligeiras diferenças na evolução das variáveis entre o Grupo Controlo e o Grupo com
Antioxidantes. No Grupo Controlo (Figura 7), as variáveis ou mantêm-se ou decrescem.
Por outro lado, podemos ver que as variáveis do Grupo com Antioxidantes (Figura 8)
apresentam melhoria entre a medição pré-tratamento e a medição pós-tratamento. De
facto, com excepção do volume, podemos observar uma melhoria dos parâmetros
seminais. Por uma questão de escala, os parâmetros da contagem total e da mobilidade
espermática progressiva total estão representados separadamente.
45
Figura 7. Evolução das médias dos parâmetros seminais concentração, mobilidadeespermática progressiva, mobilidade espermática total, volume e morfologiaespermática normal para o Grupo Controlo.
Figura 8. Evolução das médias dos parâmetros seminais concentração, mobilidadeespermática progressiva, mobilidade espermática total, volume e morfologiaespermática normal para o Grupo com Tratamento de Antioxidantes.
46
3. Influência da idade
Por fim, verificámos se o factor idade influencia de algum modo a resposta ao
tratamento (Teste de Mann-Whitney). Sub-dividimos a idade dos pacientes em duas
categorias: a) até aos 34 anos (n = 5) e b) dos 35 aos 45 (n = 6).
Tabela VII. Resultados da aplicação do teste de Mann-Whitney (SPSS 15.0),comparando a distribuição dos resultados segundo duas categorias de idade: a) pacientesaté aos 34 anos; b) pacientes dos 35 aos 45.
Test Statistics (b) Mann-Whitney
Mann-Whitney
UZ
Asymp.Sig. (2-tailed)
Exact Sig.[2*(1-tailedSig.)]
Exact Sig.(2-tailed)
ExactSig. (1-tailed)
PointProbability
1ª CONC 13,000 -0,365 0,715 0,792 0,792(a) 0,396 0,065
2ª CONC 10,000 -0,917 0,359 0,429 0,387(a) 0,193 0,017
1ª MEP 13,500 -0,274 0,784 0,792 0,840(a) 0,420 0,048
2ª MEP 13,000 -0,367 0,714 0,792 0,762(a) 0,390 0,050
1ª MET 12,000 -0,550 0,582 0,662 0,628(a) 0,318 0,041
2ª MET 14,000 -0,183 0,855 0,931 0,931(a) 0,465 0,069
1ª VOL 10,000 -0,917 0,359 0,429 0,405(a) 0,208 0,039
2ª VOL 9,000 -1,100 0,271 0,329 0,310(a) 0,154 0,024
1ª NOR 13,500 -0,280 0,780 0,792 0,835(a) 0,416 0,043
2ª NOR 9,000 -1,111 0,267 0,329 0,301(a) 0,156 0,026
1ª CTOTAL 14,000 -0,183 0,855 0,931 0,931(a) 0,465 0,069
2ª CTOTAL 9,000 -1,095 0,273 0,329 0,329(a) 0,165 0,041
1ª MEPT 14,000 -0,183 0,855 0,931 0,931(a) 0,465 0,069
2ª MEPT 8,000 -1,278 0,201 0,247 0,247(a) 0,123 0,035
a Not corrected for tiesb Grouping Variable: idade
De acordo com a Tabela VII, verificamos que não existem diferenças
significativas entre as diferentes idades nos dois grupos.
47
Parte IV - Discussão
Com base nos resultados do presente estudo, o tratamento com os antioxidantes
vitamina E, L-carnitina e pentoxifilina durante 11 semanas não melhorou
significativamente os parâmetros seminais, com excepção da morfologia espermática.
Estes resultados vão ao encontro dos resultados de trabalhos prévios. Há, contudo, na
literatura outros estudos que verificaram resultados opostos.
De todos os parâmetros seminais habitualmente avaliados, a morfologia
espermática é a mais debatida na literatura. Um grande número de sistemas de
classificação tem sido utilizado para descrever qual o aspecto celular de um
espermatozóide normal ou anormal (Patel and Sigman, 2008). Um espermatozóide é
basicamente um conjunto racionalizado de informação genética. Instintivamente pensa-
se que alterações no conteúdo cromossómico sejam reflectidas por alterações no
tamanho e forma do espermatozóide. Logo espera-se observar uma relação entre a
morfologia espermática e anomalias genéticas (Sun, et al., 2006). A esmagadora
maioria dos homens em tratamento de fertilidade sofre de teratozoospermia. Por este
motivo, publicaram-se vários estudos nos últimos anos que investigaram a relação entre
a morfologia espermática, as taxas de fecundação e as anomalias cromossómicas. De
acordo com um trabalho de Sun e o seu grupo de investigação (2006), a
teratozoospermia está associada a um aumento na frequência de anomalias
cromossómicas nos espermatozóides. Efectuaram estudos, com a técnica de
hibridização de fluorescência in situ (FISH) em homens inférteis, que sugerem que
determinados tipos de espermatozóides morfologicamente anormais, tal como
espermatozóides macrocéfalos e multiflagelados, estão associados a um aumento
significativo da frequência de aneuploidias. Haverá, portanto, uma associação entre a
morfologia espermática e a aneuploidia em homens inférteis com anomalias específicas
(Sun, et al, 2006).
Um estudo recente de Colagar e Marzony (2009), em que avaliavam homens
férteis (fumadores e não-fumadores) versus homens inférteis (fumadores e não-
fumadores), detectou uma clara relação positiva entre a percentagem de
espermatozóides morfologicamente normais e a concentração seminal de ácido
48
ascórbico (vitamina C). Além disso, verificaram, sem surpresas, que os homens férteis
possuíam níveis seminais de ácido ascórbico significativamente superiores aos dos
homens inférteis (Colagar and Marzony, 2009). Foi realizado um estudo por Shamsi e
colegas (2009) que pretendiam avaliar o impacto do stress oxidativo (SO) na
integridade do DNA nos espermatozóides em homens inférteis, tendo um grupo de
homens férteis como grupo controlo. Verificaram níveis superiores de malondealdeído
(MDA), de espermatozóides com morfologia anormal e maiores danos do DNA no
grupo dos homens inférteis. Os antioxidantes superóxido dismutase (SOD), catalase
(CAT) e glutationa estavam positivamente associados com a contagem espermática e
com a mobilidade, enquanto apresentavam uma relação negativa com a percentagem de
espermatozóides mortos e morfologia anormal (Shamsi, et al., 2009).
Outros autores sugerem ainda existir uma clara relação entre a morfologia
espermática e a subfertilidade masculina, nomeadamente ao nível da taxa de gravidez
(Girsh, et al., 2008), da fragmentação do DNA e do desenvolvimento embrionário
(Junca, et al., 2009).
Pelo contrário, outros estudos não verificaram qualquer relação entre a
morfologia espermática e danos no DNA ou nas taxas de gravidez. No estudo publicado
por Avendaño e o seu grupo de investigação (2009), estes autores demonstraram que,
em homens inférteis, espermatozóides com aparente morfologia normal após a
capacitação do sémen utilizando a técnica de swim-up, podiam conter fragmentação
elevada no DNA (Avendaño, et al., 2009). Também Keegan e colaboradores (2008)
verificaram que a teratozoospermia (<5% espermatozóides normais) não tinha qualquer
impacto nas taxas de fecundação, gravidez e de recém-nascidos vivos, chegando mesmo
a propor que estes pacientes não devem ser submetidos a ICSI por ser uma técnica mais
cara e mais invasiva, devendo optar pelo FIV convencional (Keegan, et al., 2008).
Assim sendo, apesar de a morfologia espermática ser um parâmetro controverso,
é um resultado importante relativamente à fertilidade de homens que realizaram o
tratamento com antioxidantes.
Quanto aos resultados obtidos para os outros parâmetros seminais, a ausência de
significância pode dever-se à reduzida dimensão da amostra, e por outro lado, à
magnitude das diferenças que são relativamente pequenas. De acordo com a
interpretação feita a partir dos gráficos, podemos observar uma melhoria na maioria dos
indivíduos que realizou o tratamento com antioxidantes, nomeadamente ao nível da
concentração, mobilidade espermática total e morfologia espermática normal. Pelo
49
contrário, os indivíduos do grupo controlo não obtiveram melhorias (excepto um
pequeno aumento ao nível da concentração) e alguns parâmetros até pioraram, como foi
o caso do volume, sendo estatisticamente significativo. Podendo haver uma relação
directa entre estes dois parâmetros, isto é, uma diminuição do volume poderá conduzir a
um aumento da concentração.
Embora vários estudos tenham verificado benefícios com o tratamento de
antioxidantes em homens inférteis, outros não conseguiram verificar qualquer efeito.
Apesar das preparações comerciais conterem geralmente uma mistura de antioxidantes,
faltam estudos destas combinações. A maioria dos estudos na literatura não é
randomizada, controlada por placebo ou double-blinded, o que torna difícil diferenciar
os efeitos verdadeiramente positivos dos tratamentos. As amostras pequenas de
pacientes e a variação da população masculina (desde homens férteis a vários níveis de
infertilidade) também aumentam a dificuldade na comparação dos estudos. A
combinação de diferentes antioxidantes em diferentes dosagens durante períodos
variáveis complica ainda mais o panorama (Rolf, et al., 1999). As melhorias detectadas
com as terapias de antioxidantes ainda não são totalmente claras, pois elevadas doses de
certos antioxidantes, como a vitamina A, podem ter efeitos embriotóxicos ou
teratogénicos (Tarin, et al., 1998). A utilização de antioxidantes, como a vitamina C
pode, contudo, induzir paradoxalmente o dano do DNA (Menezo, et al., 2007). Doses
de vitamina E inferiores a 3200 mg/dia e doses de vitamina C inferiores a 4000 mg/dia
são consideradas seguras (Rolf et al, 1999).
Foram detectados elevados níveis de espécies reactivas de oxigénio seminais em
30 a 80% dos homens inférteis (Aitken, et al., 1995). Verificou-se ainda que os níveis
de malondealdeído (MDA), um marcador da peroxidação lipídica, e da actividade da
superóxido dismutase (SOD) no plasma seminal eram significativamente mais elevados
em homens oligo e astenozoospérmicos, comparando com homens normozoospérmicos
(Abdallah, et al., 2009). A pouca quantidade de citoplasma dos espermatozóides reduz a
sua capacidade de reter adequadas quantidades de moléculas protectoras, que por sua
vez protegem a célula de ataques das espécies reactivas de oxigénio (ERO). Assim, a
protecção é providenciada pelo meio extracelular (Garrido, et al., 2004). Estes radicais
livres induzem lesões celulares no sémen através de diversas vias, e podem afectar
significativamente tanto a qualidade como o funcionamento seminal (Agarwal, et al.,
2006). Os danos no DNA podem levar a um aumento do risco de aborto e anomalias
cromossómicas (Geva, et al., 1998). Após exposição às espécies reactivas de oxigénio
50
(ERO), as membranas dos espermatozóides tornam-se mais frágeis e o tratamento com
antioxidantes pode prevenir a peroxidação lipídica das membranas (Lenzi, et al., 1998).
Os antioxidantes -tocoferol (vitamina E), ácido ascórbico (vitamina C), os
retinóides (vitamina A), a L-carnitina e a pentoxifilina são poderosos protectores contra
as espécies reactivas de oxigénio. Estes antioxidantes protegem o DNA e outras
moléculas importantes da oxidação e dos danos, que poderiam de outro modo induzir a
apoptose (Ebisch, et al., 2007). Muitos estudos investigaram o papel destes e de outros
antioxidantes na melhoria de parâmetros seminais.
Nalguns estudos prévios, foram feitas tentativas para melhorar os parâmetros do
sémen de homens inférteis utilizando doses aproximadas de vitamina C (1 g/dia)
(Dawson, et al., 1992) e de vitamina E (600 mg/dia) (Kessopoulou, et al., 1995),
enquanto outros estudos usaram doses inferiores de vitamina E, tal como 300 mg/dia
(Moilanen, et al., 1993) ou 200 mg/dia (Suleiman, et al., 1996). Após uma
administração oral de vitamina E com doses de 300 a 1200 mg por dia durante 3
semanas, as concentrações no plasma seminal tornam-se ligeiramente mais elevadas em
homens inférteis (Moilanen et al, 1993). Pelo contrário, Ford e Whittington (1998) não
detectaram qualquer aumento das concentrações de vitamina E no plasma seminal após
3 meses de tratamento com 400 mg de vitamina E por dia (Ford and Whittington, 1998).
De facto, muitos estudos que avaliam os efeitos da suplementação oral de vitamina E,
mostram resultados contraditórios quando o objectivo é a melhoria dos parâmetros
seminais, como podemos verificar com os exemplos da Tabela VIII.
Silver e colaboradores (2005) estudaram 97 homens saudáveis não fumadores
com idades entre os 20 e os 80 anos em relação ao seu consumo de antioxidantes
(vitamina E, vitamina C e -caroteno), utilizando um questionário e examinando
subsequentemente amostras de sémen. Aqueles com um consumo diário elevado de
antioxidantes destacaram-se por terem melhorado a qualidade seminal comparando com
os homens com consumo moderado ou baixo, demonstrando assim alguma correlação
entre o maior consumo de antioxidantes e parâmetros seminais melhorados (Silver, et
al., 2005). Keskes-Ammar e colegas (2003) examinaram a eficácia terapêutica de maior
consumo de antioxidante quanto aos parâmetros seminais. Randomizaram 54 homens e
distribuiram um grupo com vitamina E e selénio e outro com vitamina B, durante 3
meses. Eram realizadas amostras de sémen e quantificado um marcador da peroxidação
lípidica, o malondealdeído (MDA), sendo também medidos os níveis de vitamina E no
soro. Embora apenas 20 pacientes tenham completado o protocolo do estudo, os
51
resultados indicam que a suplementação de vitamina E e selénio leva a uma diminuição
significativa na concentração de MDA com aumento da mobilidade espermática,
enquanto com a vitamina B não se verificou qualquer impacto (Keskes-Ammar, et al.,
2003). Suleiman e colaboradores randomizaram a sua cohort de homens
astenozoospérmicos com companheiras saudáveis e formaram um grupo com vitamina
E e o outro grupo placebo durante 6 meses, verificando menores níveis de MDA e
maior mobilidade, assim como melhores taxas de gravidez, no grupo com vitamina E
(Suleiman, et al, 1996). Por outro lado, Rolf e colegas (1999) randomizaram 31 homens
com astenozoospermia formando um grupo com elevadas doses de vitaminas E e C e
outro placebo durante 2 meses e analisaram os parâmetros seminais. Os autores não
verificaram alterações nos parâmetros do sémen durante o tratamento e não foi iniciada
nenhuma gravidez durante este período (Rolf et al, 1999).
Relativamente às carnitinas, um estudo controlado com placebo, double-blind de
86 homens inférteis mostrou que a suplementação de L-carnitina (2g/dia durante um
período de 2 meses) conduzia a um aumento significativo na mobilidade (aumento de
11%) versus placebo (aumento de 8,8%), mas apenas após a exclusão de 5 pacientes
considerados outliers. Incluindo estes 5 pacientes, não se observa um aumento
significativo na mobilidade (Lenzi, et al., 2003). Curiosamente, o mesmo grupo de
investigadores realizou um outro estudo controlado com placebo, double-blinded e
randomizado com administração da L-carnitina (2g/dia) e, desta vez, também de L-
acetil-carnitina (1g/dia), durante um período de 2 meses em 56 homens com
astenozoospermia. Contudo, não verificaram qualquer melhoria estatisticamente
significativa na concentração espermática ou na mobilidade (Lenzi, et al., 2004). Da
mesma forma, um estudo randomizado, mais pequeno, controlado com placebo e
double-blinded, de Sigman e colegas (2006) demonstrou que a suplementação oral de
carnitinas (2g de L-carnitina e 1g de L-acetil-carnitina diariamente) em homens com
astenozoospermia idiopática não obtinha qualquer efeito clinicamente ou
estatisticamente significativo na mobilidade espermática ou na contagem de móveis
totais (Sigman, et al., 2006). Deve-se notar que a terapia oral de carnitina não
demonstrou um aumento dos níveis de carnitina ou de acetil-carnitina no plasma
seminal ou nos espermatozóides. Pelo contrário, Cheng e Chen (2008) verificaram
melhorias significativas na vitalidade, mobilidade e contagem total de espermatozóides,
após tratamento combinado de L-carnitina e L-acetil-carnitina, durante 3 meses (Cheng
and Chen, 2008). Numa revisão realizada por Zhou e colegas (2007), estes autores
52
concluíram que a administração de L-carnitina e/ou L-acetil-carnitina pode ser benéfica
quanto à melhoria da taxa de gravidez, contudo a eficácia exacta das carnitinas na
infertilidade masculina precisa de ser confirmada com mais pesquisas (Zhou, et al.,
2007). A Tabela IX reúne uma pequena compilação de estudos realizados com
suplementação oral de carnitinas no tratamento da fertilidade masculina.
Assim como no nosso estudo, também Oliva e colaboradores (2009) verificaram
apenas uma melhoria na morfologia espermática após suplementação oral de
antioxidantes (pentoxifilina, zinco e ácido fólico) durante 4 semanas, em 36 homens
com varicocele (Oliva, et al., 2009). Podemos deduzir a possível influência da
pentoxifilina na melhoria da morfologia espermática visto ser o único denominador
comum entre os dois estudos. Porém, existem muitos factores envolvidos, o que nos
impossibilita de fazer qualquer relação clara. Shen e colaboradores (1991) investigaram
qual o papel da pentoxifilina em homens astenozoospérmicos e normozoospérmicos,
tanto in vitro como in vivo, segundo uma administração oral de pentoxifilina com uma
dose de 800 a 1200 mg/dia, durante 3 meses. Observaram um aumento da mobilidade in
vitro dos espermatozóides do ejaculado e também após o tratamento oral, mas não um
aumento da concentração espermática (Shen, et al., 1991). A pentoxifilina é um
conhecido estimulante na mobilidade espermática, aumentando a proporção de
hiperactivação nos espermatozóides (Yovich, 1993). A estimulação metabólica tornou-
se um dos principais temas na área da reprodução assistida (Tournaye, et al., 1995). No
laboratório, é aplicada directamente nos meios de cultura onde estão os
espermatozóides, dotando de mobilidade os espermatozóides vivos. A diminuição do
tempo de procura e a selecção dos espermatozóides para a ICSI são as grandes
vantagens que a pentoxifilina oferece in vitro. A sua utilidade é direccionada para
amostras de sémen com mobilidade muito baixa, como casos de biopsia testicular
(Kovacic, et al., 2006) ou em amostras descongeladas (Huang, et al., 2003) (Griveau, et
al., 2006). Stanic e colegas (2002) verificaram que a pentoxifilina melhorava a
mobilidade de espermatozóides humanos quando adicionada após a descongelação da
amostra de sémen, mas não observaram qualquer melhoria se fosse adicionada durante a
congelação (Stanic, et al., 2002).
Embora estes dados de diferentes centros sejam potencialmente conflituosos, é
difícil fazer uma comparação directa destes resultados dada a variada natureza da dose,
duração do tratamento e conclusões de cada um destes estudos. Estes estudos
providenciam, todavia, óptimas provas quanto à eficácia dos antioxidantes vitamínicos
53
na melhoria global da qualidade do sémen e do possível aumento da taxa de gravidez
após ICSI (Kefer, et al., 2009). Neste estudo, a idade foi um aspecto analisado. Não
conseguimos encontrar diferenças formando sub-categorias de idade: a) até aos 34 e b)
dos 35 aos 45 anos. Pelo contrário, Moskovtev e colaboradores (2009) verificaram
diferenças quanto ao efeito de um tratamento oral de antioxidantes de acordo com a
idade dos pacientes. Estes investigadores observaram que homens com mais de 40 anos
não apresentavam qualquer melhoria após o tratamento, enquanto pacientes com idades
inferiores a 40 anos mostraram melhorias significativas na fragmentação do DNA
(Moskovtsev, et al., 2009).
Outros estudos verificaram que o tabaco diminui as concentrações de
antioxidantes do plasma seminal vitamina E e C, reduzindo então a capacidade
antioxidante dos espermatozóides e do fluido seminal (Mostafa, et al., 2006). A nível
molecular, foram documentados riscos aumentados de aneuploidias espermáticas
(Robbins, et al., 2005), elevados níveis de stress oxidativo seminal (Saleh, et al., 2002),
alteração na assimetria dos fosfolípidos da membrana plasmática dos espermatozóides
(Belcheva, et al., 2004) e fragmentação do DNA espermático (Potts, et al., 1999). Num
estudo placebo e controlado sobre a qualidade do sémen de fumadores, apenas os
grupos que receberam uma dose de 200 ou 1000 mg/dia de ácido ascórbico melhoraram
a qualidade seminal e a melhoria mais significativa foi observada no grupo que recebia
a dose mais elevada durante 4 semanas (Dawson, et al, 1992). Contudo, Lenzi e
colaboradores (1998) demonstraram que 4 semanas de tratamento antioxidante com a
glutationa era suficiente para melhorar a mobilidade espermática (Lenzi, et al, 1998)
enquanto Dawson e colegas (1992) observaram melhorias da qualidade espermática
poucos dias após a administração de ácido ascórbico (Dawson, et al, 1992).
Uma preocupação adicional prende-se com o possível efeito sinergético entre
hábitos tóxicos concorrentes na reprodução masculina. Foi descrito um efeito
sinergético entre o consumo de álcool e tabaco relativamente aos parâmetros
espermáticos, mas é necessária maior investigação para explorar outras associações com
outros estilos de vida e exposições ocupacionais e ambientais (Martini, et al., 2004).
Neste estudo conseguimos ainda obter uma melhor taxa de implantação no grupo
com tratamento de antioxidantes relativamente ao grupo controlo. De facto, embora sem
diferenças com valor estatístico, verificou-se que 6 de 7 pacientes alcançaram uma
gravidez, atingindo uma taxa de implantação de 86%, enquanto o grupo controlo
apresentou uma taxa de implantação de 67%. Esta melhoria não tem valor estatístico,
54
mas tal pode dever-se ao tamanho amostral. Os pacientes de ambos os grupos possuíam
um historial bastante semelhante em termos de ciclos prévios, já que a maioria já tinha
realizado uma tentativa de ICSI falhada. Na literatura científica existem estudos que
verificaram o mesmo, ou seja, não observaram qualquer melhoria nos parâmetros
seminais avaliados habitualmente, mas as taxas de implantação e gravidez sofreram
melhorias após tratamento com antioxidantes. Os trabalhos de Comhaire e
colaboradores (2000) e de Lamond e colegas (2003) comprovaram que há efeitos
positivos dos antioxidantes quanto aos danos de DNA espermático e no resultado da
gravidez (Comhaire, 2000) (Lamond, et al., 2003). Mais recentemente, Greco e
colaboradores (2005), com um estudo provido de uma estrutura notável, examinaram o
impacto de um maior consumo de antioxidantes de um modo randomizado e
prospectivo. Um conjunto de 64 homens inférteis com mais de 15% de fragmentação de
DNA espermático foram randomizados em 2 grupos recebendo um grupo vitamina C e
E (1g/dia de cada) e o outro placebo durante 2 meses. Embora não se tenham notado
diferenças nos parâmetros seminais básicos, o grupo com antioxidante demonstrou uma
percentagem de fragmentação do DNA significativamente menor (Greco, et al., 2005a).
Os autores demonstraram depois que a suplementação com as vitaminas E e C
aumentou significativamente as taxas de gravidez clínica e a implantação após a
microinjecção intracitoplasmática de espermatozóide (ICSI) (Greco, et al., 2005b).
Finalmente, também Tunc e colaboradores (2009) verificaram melhorias significativas
no DNA espermático, redução na produção de ERO e de apoptose, porém não
observaram qualquer melhoria nos parâmetros seminais analisados por rotina (Tunc, et
al., 2009).
Os efeitos das espécies reactivas de oxigénio no DNA espermático foram
correlacionados com fracos resultados das técnicas de PMA (Agarwal and Said, 2003) e
a utilização de espermatozóides com DNA anormal durante estes procedimentos leva a
uma pior qualidade embrionária (Sakkas, et al., 1998). As consequências de uma maior
quantidade de ERO no embrião incluem alterações mitocondriais, bloqueio celular,
esgotamento de ATP e apoptose (du Plessis, et al., 2008). Os embriões fragmentados
têm um potencial de desenvolvimento limitado e raramente implantam (Erenus, et al.,
1991). Se os danos no DNA prejudicam o desenvolvimento embrionário, é lógico
deduzir que a subsequente implantação será também adversamente afectada. Tal foi
demonstrado por Duran e colaboradores (2002) que mostraram que a fragmentação de
DNA estava negativamente correlacionada com a gravidez (Duran, et al., 2002).
55
As técnicas de procriação medicamente assistida (PMA) estão implicadas
nalguns casos de malformações e anomalias nos recém-nascidos. Das muitas causas que
podem conduzir a efeitos adversos nos bebés, o stress oxidativo e os danos que induz no
DNA são os mais vulgarmente implicados. O embrião é um organismo de
desenvolvimento rápido com elevadas necessidades energéticas que são conseguidas,
como noutras células vivas aeróbias, produzindo ATP através da fosforilação oxidativa
nas mitocôndrias e da glicólise. À medida que o embrião se desenvolve desde o estado
de zigoto, o seu estado redox é modulado pelas suas constantes alterações das
necessidades e pelo metabolismo. Ocorre a produção excessiva de ERO em
determinados pontos críticos devido a necessidades energéticas acrescidas, tal como a
activação genómica embrionária, compactação embrionária e eclosão (Ollero, et al.,
2001). Sob condições fisiológicas normais, as ERO devem ser neutralizadas
continuamente, enquanto deve ser preservada uma pequena quantidade necessária para
manter o funcionamento normal da célula (du Plessis et al, 2008). Goto e colaboradores
(1993) demonstraram que a produção de ERO era superior em embriões em cultura in
vitro comparada com aqueles em cultura in vivo (Goto, et al., 1993). Apesar dos rápidos
avanços nos tratamentos de infertilidade que levaram ao desenvolvimento de novas e
melhores técnicas, nos laboratórios de fertilização in vitro ainda se luta por criar as
condições fisiológicas dos microambientes do sistema in vivo (du Plessis et al, 2008).
Suplementações de antioxidantes in vitro são possibilidades para minimizar o
stress oxidativo durante as técnicas de procriação medicamente assistida. Um
considerável conjunto de provas indica que a suplementação do meio de cultura com
antioxidantes, vitaminas C e E, aminoácidos e eliminadores de ERO podem reduzir o
stress oxidativo e beneficiarem a sobrevivência embrionária e as taxas de blastulação
em estudos com animais (Taylor, 2001). O meio de cultura e as condições evoluíram de
monocultura para co-cultura e actualmente para cultura sequencial com o propósito de
superar o SO (Agarwal, et al., 2006). Será ainda necessário desenvolver outras
estratégias que ajudem a minimizar o stress oxidativo (Agarwal, et al., 2008a).
Reduzir o manuseamento e a centrifugação dos gâmetas e o tempo de
inseminação durante a fertilização in vitro (FIV) convencional, assim como a exposição
a meios que produzem ERO, podem resultar num aumento tanto da formação como da
qualidade dos embriões (Kattera and Chen, 2003). Danos espermáticos provocados
pelas ERO produzidas pelos leucócitos podem ocorrer quando o plasma seminal é
removido durante a preparação espermática para a reprodução assistida ou quando a
56
concentração de leucócitos é anormalmente elevada, como na leucocitospermia
(Agarwal, et al., 2008b).
Igualmente importante é a capacidade para medir com precisão as espécies
reactivas de oxigénio e estabelecer valores de referência. A medição dos níveis de ERO
no sémen antes das técnicas de FIV pode ser utilizada para determinar o tratamento
específico da amostra, assim como para prever o resultado, já que se pensa que as ERO
afectam a taxa de fecundação pós-FIV (Greco, et al., 2005).
57
Tabela VIII. Estudos que utilizaram vitamina E e vitamina C no tratamento da fertilidademasculina. Abreviações: B, cego; C, controlado; MDA, malondialdeído; NB, não cego; NC, nãocontrolado; NR, não randomizado; R, randomizado.
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Tabela IX. Estudos que utilizaram carnitina no tratamento da fertilidade masculina.Abreviações: B, cego; C, controlado; MDA, malondialdeído; NB, não cego; NC, nãocontrolado; NR, não randomizado; R, randomizado.
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008)
61
Parte V – Considerações finais
O stress oxidativo é uma ameaça real para gâmetas e embriões in vitro já que
estas células são removidas do seu ambiente natural que lhes proporciona mecanismos
de defesa contra os radicais livres. Consequentemente, o stress oxidativo tem um
significado importante no resultado das técnicas de fertilização in vitro. Tratamentos
profiláticos orais de antioxidantes, assim como suplementações do meio de cultura com
antioxidantes, em princípio, podem favorecer a obtenção de gâmetas de melhor
qualidade e beneficiar o desenvolvimento embrionário. Os adequados compostos
antioxidantes e as suas concentrações precisam de ser determinadas e esta continua a ser
uma área de interesse.
Com o objectivo de poder tirar conclusões mais significativas, pretende-se
prolongar este estudo no tempo para se obter um tamanho amostral mais adequado
podendo assim conseguir resultados mais consistentes. Idealmente deveria ser possível
obter uma taxa de gravidez igualmente significativa e acompanhar, sempre que possível,
o desenvolvimento embrionário.
Embora o nosso conhecimento esteja a aumentar relativamente ao efeito único
de produtos individuais, a realidade é mais complexa. A exposição única não acontece e
muito poucos estudos tratam as consequências para a qualidade seminal considerando a
complexa exposição a compostos do meio ambiente, como aditivos alimentares, tóxicos
ou contaminantes, poluentes ambientais e substâncias perigosas. Além disso, a literatura
científica apresenta descobertas contraditórias e é necessário realizar mais estudos para
identificar todos os mecanismos envolvidos no stress oxidativo do ejaculado, de forma a
desenvolver novos sistemas de diagnóstico e estratégias terapêuticas para combater o
desequilíbrio prejudicial de radicais livres no sémen. Contudo, a estrutura dos estudos
nem sempre facilita a interpretação dos resultados. Para serem úteis, os estudos devem
ser projectados de forma que os factores envolventes possam ser controlados. A taxa de
gravidez, o parâmetro final mais relevante, é raramente comunicada.
62
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69
Anexo A. Resultados do teste Kolmogorov-Smirnov
Testes de Normalidade
Kolmogorov-Smirnov(a)
Grupos Statistic df Sig.1ª CONC Sem AOX 0,164 19 0,190(*)
Com AOX 0,146 11 0,200(*)
2ª CONC Sem AOX 0,199 19 0,047Com AOX 0,263 11 0,033
1ª MEP Sem AOX 0,178 19 0,113(*)
Com AOX 0,228 11 0,116(*)
2ª MEP Sem AOX 0,163 19 0,197(*)
Com AOX 0,203 11 0,200(*)
1ª MET Sem AOX 0,127 19 0,200(*)
Com AOX 0,154 11 0,200(*)
2ª MET Sem AOX 0,142 19 0,200(*)
Com AOX 0,120 11 0,200(*)
1ª VOL Sem AOX 0,098 19 0,200(*)
Com AOX 0,144 11 0,200(*)
2ª VOL Sem AOX 0,139 19 0,200(*)
Com AOX 0,171 11 0,200(*)
1ª NOR Sem AOX 0,151 19 0,200(*)
Com AOX 0,147 11 0,200(*)
2ª NOR Sem AOX 0,231 19 0,009Com AOX 0,211 11 0,183(*)
1ª CTOTAL Sem AOX 0,168 19 0,163(*)
Com AOX 0,138 11 0,200(*)
2ª CTOTAL Sem AOX 0,240 19 0,005Com AOX 0,272 11 0,023
1ª TPMS Sem AOX 0,244 19 0,004Com AOX 0,202 11 0,200(*)
2ª TPMS Sem AOX 0,252 19 0,003Com AOX 0,247 11 0,060(*)
(*) This is a lower bound of the true significance.a Lilliefors Significance Correction
70
Anexo B. Glossário de abreviaturas
ERO – Espécies reactivas de oxigénio
SO – Stress oxidativo
CONC – Concentração espermática
MEP – Mobilidade espermática progressiva
MET – Mobilidade espermática total
VOL – Volume
NOR – Morfologia espermática normal
CTOTAL – Contagem total
MEPT – Mobilidade espermática progressiva total
