Universidade de Lisboa Faculdade de...

1

Universidade de Lisboa

Faculdade de Farmácia

Prevalência das infecções do trato

urinário em duas áreas populacionais

distintas

Sandra Dinora Malheiro Alves

Orientadores: Profª Doutora Maria Aida Costa Silva Conceição

Duarte e Drª Maria Beatriz Godinho Tomaz dos Santos

Mestrado em Análises Clínicas

Monografia/Relatório de Estágio

Lisboa 2017

2



Monografia

Prevalência das infecções do trato urinário em duas áreas

populacionais distintas

Orientadora: Profª Doutora Maria Aida Costa Silva Conceição

Duarte

Relatório de Estágio

Labeto, Central de Análises Bioquímicas SA

Orientadora: Drª Maria Beatriz Godinho Tomaz dos Santos



Lisboa 2017

3

Resumo

Este é o relatório de estágio como parte integrante do Mestrado em Análises Clínicas da

Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa.

Na primeira parte do relatório é apresentada uma monografia tendo como tema:

“Prevalência das infecções do trato urinário em duas áreas populacionais distintas”. Foram

estudadas 783 uroculturas positivas em 2014 de Porto de Mós (população A) e Pombal

(população B). Alguns dados obtidos eram já previstos: são prevalentes no sexo feminino

(82% e 79%) e na população mais idosa (71 a 90 anos de idade) e têm Escherichia coli

como o agente etiológico mais frequente, seguido de Klebsiella spp. e Proteus spp.. As E.

coli em estudo das duas populações apresentam maior resistência à amoxicilina e, nos

lugares seguintes mas por ordens diversas nas duas populações, encontram-se os

antibióticos amoxicilina + ácido clavulâmico, cefalotina e ciprofloxacina. Comparando com

dados de anos anteriores, verifica-se um aumento da resistência da E. coli à fosfomicina e à

associação amoxicilina + ácido clavulâmico e, uma diminuição de resistências ao

cotrimoxazol.

O estágio profissionalizante foi realizado no laboratório de análises clínicas Labeto, Central

de Análises Bioquímicas SA, Leiria, nas áreas de Bioquímica Clínica, Imunologia e

Microbiologia sob a orientação da Drª Maria Beatriz Godinho Tomaz dos Santos. O relatório

deste estágio pretende resumir as actividades realizadas durante o estágio compreendendo

a fase pré-analítica (aplicação de técnicas de colheita adequadas a cada determinação), a

fase analítica (com especial ênfase na metodologia aplicada nas determinações analíticas e

na aplicação dos conhecimentos nas actividades diárias do laboratório) e o controlo de

qualidade (aplicação dos princípios do controlo e garantia da qualidade).

Palavras-chave: infecções urinárias; agentes etiológicos; resistência aos antibióticos;

análises clínicas; metodologia.

Abstract

This is the report of the internship part of the Master´s degree program in Clinical Analysis

from Faculty of Pharmacy of University of Lisbon.

On the first part of the report it is presented a monograph with the theme: “Prevalence of

urinary tract infections in two distinct population areas”. 783 positive cultures were studied

from 2014 regarding Porto de Mós (population A) and Pombal (population B). Some obtained

data was already predicted: they are prevalent in the feminine sex (82% and 79%) and in the

elderly (71 to 90 years old) and they have E. coli as the most frequent etiological agent

followed by Klebsiella spp. and Proteus spp.. The E. coli studied from both populations had

biggest resistance to amoxicillin and, in the following places but by diverse order in the two

populations, was found amoxicillin + clavulamic acid, cefalotin and ciprofloxacin. Compared

with results from years before, we can verify an increase in resistance of E. coli to fosfomicin

and the association amoxicillin + clavulamic acid and, a decrease in resistance to

cotrimoxazol.

4

The supervised practical training was performed in the clinical analysis laboratory Labeto,

Centro de Análises bioquímicas SA, Leiria, comprising the areas of Biochemistry,

Immunology and Microbiology under the orientation of Drª Maria Beatriz Godinho Tomaz dos

Santos. The report on this internship pretends to summarize the activities performed during

the internship comprehending pre-analytical phase (blood withdraw techniques suited for

each determination), analytical phase (with special emphasis on the methodology used in

analytical determinations and applying knowledge in daily laboratory activities) and quality

control (applying control and quality assurance principles).

Keywords: urinary infections; etiological agents; antibiotic resistance; clinical analysis;

methodology.

Agradecimentos

A autora agradece à Profª Doutora Aida Duarte como orientadora da monografia pela

paciência demonstrada e pela ajuda e conhecimento transmitido. Á Drª Maria Beatriz Santos

como orientadora do estágio no laboratório Labeto pela ajuda prestada na recolha de dados

para a monografia e pela orientação no estágio. Também à Drª Cláudia Gomes pela ajuda

no tratamento dos dados para a monografia. Á minha família e amigos pelo apoio moral

prestado.

A todos, os meus sinceros agradecimentos.

5

Índice geral

Resumo/Abstract....................................................................................................3

Agradecimentos.....................................................................................................4

Índice geral.............................................................................................................5

Índice de Tabelas e Figuras...................................................................................8

Lista de Abreviaturas............................................................................................10

Monografia: Prevalência das infecções do trato urinário em duas áreas

populacionais distintas.........................................................................................12

ÍndiceMonografia........................................................................................................14

Introdução...................................................................................................................14

Material e métodos.....................................................................................................15

Resultados..................................................................................................................16

Discussão....................................................................................................................24

Conclusão...................................................................................................................26

Bibliografia Monografia...............................................................................................27

Relatório de estágio............................................................................................28

Índice Relatório Estágio.......................................................................................................29

Fase pré analítica...........................................................................................31

Colheita de sangue.....................................................................................................31

Colheita de urina.........................................................................................................32

Colheita de exsudados para exame bacteriológico e micológico...............................32

exsudado vaginal, uretral, nasal, auricular, faríngeo/amigdalino, ocular, purulento e

rectal

Colheita de fezes........................................................................................................36

Colheita de expectoração...........................................................................................36

Colheita de esperma...................................................................................................36

Colheita de amostras para exames micológicos........................................................36

Valência de Microbiologia.............................................................................37

Meios de cultura usados no departamento de microbiologia......................................37

Meios não selectivos (gelose Columbia + 5% Sangue Carneiro, gelose nutritiva e

Hemoline Performance Difásico)................................................................................38

Meios selectivos (gelose Manitol, Campylosel, chocolate, Sabouraud Cloranfenicol

Actidiona, Sabouraud Gentamicina Cloranfenicol, Sabouraud líquido, Mueller Hinton

Sangue Carneiro, malte, caldo Tetrationato + Iodeto potássio + Novobiocina e caldo

Todd Hewitt + antibióticos)..........................................................................................40

6

Meios diferenciais (chromID™ CPS®Elite, gelose SS, chromID Salmonella, Hektoen,

MacConkey, Candida ID2, chromID™ Strepto B, Granada e Löwenstein-Jensen)....43

Colorações..................................................................................................................47

Gram, Ziehl-Neelsen modificada, eosina-nigrosina

Testes bioquímicos complementares.........................................................................49

catalase, oxidase, coagulase, indol, teste para estreptococos, Slidex Pneumo kit,

teste EPEC E. coli enteropatogénica, anti Shigella, anti Salmonella, galeria

antibiograma de Haemophilus e Moraxella (Branhamella), galeria antibiograma de

estreptococos e pneumococos, teste para Mycoplasma hominis/Ureaplasma spp,

testes semi automáticos de identificação e sensibilidade aos antibióticos e testes

manuais de identificação e sensibilidade aos antibióticos

Esquemas laboratoriais..............................................................................................54

urina, exsudado vaginal, uretral, nasal, orofaríngeo, auricular, ocular e purulento,

fezes, expectoração e esperma

Pesquisa de fungos não leveduriformes.....................................................................63

Pesquisa de ovos, quistos e parasitas........................................................................64

pesquisa nas fezes e pesquisa de Schistosoma haematobium na urina

Controlo de qualidade.................................................................................................65

Valência de Bioquímica Clínica.....................................................................66

Tipo de amostra biológica e sua separação e armazenamento consoante a

manipulação................................................................................................................66

Metodologias para avaliação de metabolitos..............................................................67

Glúcidos (glicose)........................................................................................................68

Lípidos (colesterol total, triglicerídeos, colesterol HDL e colesterol LDL)...................69

Proteínas (proteínas totais, albumina, microalbumina, imunoglobulinas, β2

microglobulina, proteína C reactiva, α1 antitripsina, proteínas do complemento,

electroforese das proteínas).......................................................................................70

Iões (cálcio, fósforo, magnésio)..................................................................................74

Equilíbrio Ácido-Base (sódio, potássio, cloro)............................................................76

Drogas terapêuticas (lítio, ácido valpróico, carbamazepina, fenitoína, digoxina)......77

Drogas de abuso (opiáceos, anfetaminas, benzodiazepinas, cocaína,

canabinóides)..............................................................................................................79

Exame sumário de urina.............................................................................................80

Metodologias para avaliação das funções fisiológicas e endócrinas..........................83

Função renal (ácido úrico, creatinina, ureia)...............................................................83

Função hepática e biliar (AST, ALT, fosfatase alcalina, GGT, bilirrubina total e

directa)........................................................................................................................85

Função pancreática (amílase, lípase).........................................................................87

Função muscular (CK, LDH).......................................................................................87

Marcadores cardíacos (troponina I, CK-MB)..............................................................88

Metabolismo do ferro e marcadores de anemia (ferro, transferrina, TIBC (capacidade

total de fixação do ferro), ferritina, ácido fólico, vitamina B12)...................................89

Função tiroideia (T3, T3 livre, T4, T4 livre, TSH)........................................................91

Função fertilidade (FSH, LH, progesterona, prolactina, estradiol, testosterona)........93

Função adrenal (cortisol, ACTH)................................................................................96


7

Valência de Imunologia.................................................................................97


manipulação................................................................................................................98

Patologias infecciosas................................................................................................98

Waaler Rose, antigénios febris, RPR, mononucleose infecciosa

Patologias autoimunes..............................................................................................101

Anticorpos antitiroideus

Patologias alérgicas..................................................................................................101

IgE total e IgE específica

Patologias virais........................................................................................................103

VIH, VHC, VHA, VHB, CMV, rubéola

Toxoplasma gondii....................................................................................................108

Patologias oncológicas.............................................................................................108

PSA total e livre, CEA, CA 15.3, CA 125, CA19.9, alfa-fetoproteína, beta-HCG

Controlo de qualidade...............................................................................................112

Bibliografia Relatório de Estágio...............................................................................113

8

Índice de Tabelas e Figuras

Tabela 1 - Distribuição segundo a idade da População A e População B...........................................16

Tabela 2 – Factores de risco da População A e B...........................................................................18

Tabela 3 – Distribuição das estirpes de E. coli resistentes aos antibióticos, de acordo com a

População A e População B..........................................................................................................20

Figura 1 – Localização da População A e da População B...................................................................15

Figura 2 - Distribuição segundo a idade da População A e População B...........................................17

Figura 3 – Distribuição pela idade e sexo da População A e B.........................................................17

Figura 4 – Incidência de bactérias Gram negativo identificadas na População A e B.........................19

Figura 5 – Incidência de bactérias de Gram positivo identificadas na População A e B......................19

Figura 6 – Distribuição das estirpes de E. coli resistentes aos antibióticos, de acordo com a

População A e População B..........................................................................................................20

Figura 7 – Distribuição das estirpes de E. coli resistentes aos antibióticos da População com factores

de risco A e B...............................................................................................................................21

Figura 8 – Incidência de bactérias Gram negativo nas populações com factores de risco.................22

Figura 9 – Incidência de bactérias Gram positivo nas populações com factores de risco...................23

Figura 10 – Microorganismos alerta da População A e B.................................................................23

Figura 11 – Evolução da etiologia das infecções do tracto urinário...................................................25

Figura 12 – Evolução das susceptibilidades aos antibióticos de estirpes E. coli.................................25

Figura 13 – Hemólise em gelose sangue........................................................................................38

Figura 14 – Hemoline Diphase da bioMérieux.................................................................................39

Figura 15 – Campylosel agar da bioMérieux............................................................................40

Figura 16 – N. gonorrohoeae e H. parainfluenzae em gelose chocolate...........................................41

Figura 17 – Gelose Sabouraud Gentamicina Cloranfenicol 2 da bioMérieux.....................................41

Figura 18 – chromIDTM CPS®Elite da bioMérieux.....................................................................43/44

Figura 19 – Gelose SS da bioMérieux............................................................................................44

Figura 20 – chromID Salmonella Elite da bioMérieux.......................................................................45

Figura 21 – chromID Candida da bioMérieux....................................................................................46

Figura 22 – chromID™ Strepto B da bioMérieux..............................................................................46

Figura 23 – Gelose Granada da bioMérieux....................................................................................47

9

Figura 24 – Coloração de Gram.........................................................................................................48

Figura 25 – Coloração de eosina/nigrosina...........................................................................................49

Figura 26 – Reacção da catalase....................................................................................................49

Figura 27 – Reacção da oxidase......................................................................................................50

Figura 28 – Reacção da coagulase.................................................................................................50

Figura 29 – Vitek 2 XL...................................................................................................................53

Figura 30 – Contagem UFC...........................................................................................................54

Figura 31 – Dimension VISTA 1500...............................................................................................67

Figura 32 – Capillarys 2.................................................................................................................74

Figura 33 – VIDAS........................................................................................................................78

Figura 34 – Aution Max AU 4280 e Sedimax...................................................................................80

Figura 35 – Advia Centaur XP........................................................................................................92

Figura 36 – Immulite 2000..............................................................................................................94

Figura 37 – ImmunoCAP 250.......................................................................................................101

10

Lista de Abreviaturas

ACTH – hormona adrenocorticotrófica

ALT – aminotransferase da alanina

AST – aminotransferase da aspartato

BAAR – bacilos álcool-ácido resistentes

CA – antigénio carcino

CEA – antigénio carcino embrionário

CK – creatina cínase

CLSI – clinical and laboratory standards institute

CMI – concentração minima inibitória

CMV – cytomegalovirus

DGS – direcção geral de saúde

EDTA – ácido etilenodiamino tetra-acético

EPEC – Escherichia coli enteropatogénica

FSH – hormona folículo estimulante

GGT – gama glutamiltransferase

HCG – gonadotrofina coriónica humana

HDL – lipoproteína alta densidade

IMT – integrated multi sensor

INSA – instituto saúde Dr. Ricardo Jorge

LDH – lactato desidrogenase

LDL – lipoproteína baixa densidade

LH – hormona luteínica

LOCI – luminescent oxygen channeling immunoassay

PSA – antigénio prostático específico

RPR – rapid plasma reagin

T3 – triiodotironina

T4 – tetraiodotironina

11

TDA – triptofano desaminase

TIBC – total iron binding capacity

TPO – peroxidase tiróide

TSH – hormona estimulante tiróide

UFC – unidades formadoras de colónias

VHA – vírus hepatite A

VHB – vírus hepatite B

VHC – vírus hepatite C

VIH – vírus imunodeficiência humana

12



Monografia

Prevalência das infecções do trato


distintas

Orientadora: Profª Doutora Maria Aida Costa Silva Conceição

Duarte



Lisboa 2017

13

Índice Monografia

Monografia: Prevalência das infecções do trato urinário em duas áreas

populacionais distintas..........................................................................................

Introdução.....................................................................................................................

Material e métodos.......................................................................................................

Resultados..................................................................................................................

Discussão....................................................................................................................

Conclusão...................................................................................................................

Bibliografia Monografia..............................................................................................

14

Monografia de estágio

Prevalência das infecções do tracto


distintas

Introdução

As infecções do tracto urinário são entre as doenças infecciosas as mais prevalentes no

meio hospitalar e também na comunidade principalmente na mulher. Em termos de saúde

pública estão associadas a significativa morbilidade, principalmente em indivíduos com

factores de risco e podem ter consequências graves 1,2.

A presença de bactérias predominantemente de Gram negativo na região periuretral, que

poderão ascender à bexiga e causar sintomas clinicamente conhecidos por cistites ou

infecções não complicadas do tracto urinário. Um dos agentes etiológicos mais frequente é a

Escherichia coli e o conhecimento dos perfis de susceptibilidade aos antibióticos é muito

importante, dado que os sintomas agudos, que caracterizam este tipo de infecção, levam os

clínicos a praticarem uma terapêutica empírica.

A elevada prevalência de infecção nas mulheres em relação aos homens advém de

características como o tamanho da uretra, mais pequena na mulher, maior proximidade da

região perianal e alteração da microbióta vaginal. As cistites consideradas infecções não

complicadas do tracto urinário são as mais frequentes em mulheres saudáveis, geralmente

na ausência de anomalias anatómicas do tracto urinário. Estima-se que 20-25% da

população feminina tenha infecções recorrentes (definidas pela existência de pelo menos

três episódios em 12 meses) 2.

A diferenciação entre cistite não complicada e complicada tem implicações a vários níveis,

nomeadamente aos factores de risco associados que incluem a presença de anormalidades

funcionais ou anatómicas (cálculos renais, bexiga neurogénica), presença de corpos

estranhos como cateteres, imunossupressão, ser homem, criança ou grávida, doente

urológico ou renal. Em indivíduos algaliados, os cateteres urinários permitem a entrada de

bactérias e a formação de biofilmes, criando um ambiente no qual é muito difícil ou até

mesmo impossível erradicar microorganismos com agentes antimicrobianos. Também em

certas condições que alteram as defesas do hospedeiro, como é o caso da diabetes, existe

a probabilidade de ocorrência de complicações e consequências sérias 1.

15

O nível elevado de prescrição de determinados antibióticos pode estar na origem de

elevadas taxas de resistência aos mesmos (nomeadamente quinolonas e associação

sulfometoxazol e trimetoprim) 3. Tem sido vulgarizado o uso da fosfomicina talvez devido ao

largo espectro e às vantagens de dosagem única: maior adesão à antibioterapia e menor

alteração da flora gastrointestinal 4.

Material e Métodos

Estirpes bacterianas

Neste estudo foram utilizados os dados de 783 uroculturas positivas processadas no

laboratório Labeto, Central de Análises Bioquímicas SA, durante o ano de 2014. Estas

amostras eram provenientes de duas zonas populacionais distintas: Porto de Mós (447

amostras) referida como População A e Pombal (336 amostras) referida como População B.

Figura 1 – Localização da População A e da População B

Dado que este estudo foi realizado a posteriori os dados disponíveis de cada amostra eram

o sexo e a idade. Em alguns doentes foi possível ter a informação de alguns factores de

risco como o estado de gravidez, de imobilidade (acamado), de algaliação e diabetes. A

análise dos resultados da análise citobacteriológica da urina de cada doente permitiu

verificar se o doente tinha infecções recorrentes.

Análise citobacteriológica da urina

As amostras foram semeadas em meio CPS bioMérieux com ansa calibrada e incubação a

37ºC durante 24h. Uma cultura pura foi considerada positiva em número ≥105 UFC

(unidades formadoras de colónias). As colónias com aspecto característico de acordo com

as indicações do meio CPS foram presuntivamente identificadas como E. coli. As colónias

com características de bactérias Gram negativo foram identificadas usando a carta GN no

sistema automatizado Vitek 2 XL bioMérieux. As colónias suspeitas de estafilococos ou

16

estreptococos/enterococos foram diferenciadas pelo teste da catalase e identificadas com a

carta GP no sistema automatizado Vitek 2 XL bioMérieux.

Estudo da susceptibilidade aos antibióticos

O teste da susceptibilidade aos antibióticos foi efectuado com as cartas do sistema Vitek 2

XL: AST-222 (para bactérias não fermentadoras), AST-244 (para enterobactérias Gram

negativas), AST-619 (para Staphylococcus), AST-586 (para Enterococcus), e AST-01 (para

Streptococcus grupo B e A). Os valores de CMI de Intermédio foram considerados como

Resistente.

Os dados retirados do sistema Vitek 2 XL foram complementados com informações retiradas

do sistema informático eDeia do laboratório e toda a informação obtida foi usada como base

para este estudo.

Resultados

Estudo demográfico

Distribuição segundo a idade

Tabela 1 - Distribuição segundo a idade da População A e População B

IDADE Pop A n Pop B n

0-10 4 4

11 20 7 7

21-30 20 23

31-40 39 35

41-50 48 29

51-60 49 36

61-70 51 51

71-80 97 69

81-90 124 65

91-100 8 17

17

Figura 2 - Distribuição segundo a idade da População A e População B

População A

Dos 447 casos estudados foi encontrada uma distribuição demográfica que se concentra no

sector etário dos 71 aos 100 anos de idade, com incidência no escalão 81 a 90 anos de

idade.

População B

Dos 336 casos estudados foi encontrada uma distribuição demográfica que se concentra no

sector etário dos 21 aos 70 anos de idade, embora com incidência no escalão 71 a 80 anos

de idade.

Distribuição segundo o sexo

De acordo com a Fig 2, o sexo feminino foi prevalente, relativamente ao sexo masculino,

nas duas populações.

Figura 3 – Distribuição pela idade e sexo da População A e B

Na População A as mulheres representam 365 dos 447 casos e na População B

representam 266 dos 336 casos.

18

Factores de risco

Mediante a informação disponível dos casos estudados, foram considerados como factores

de risco a gravidez, a imobilidade, a algaliação, a diabetes e infecções recorrentes.

Tabela 2 – Factores de risco da População A e B

Factores de risco Pop A n Pop B n

Gravidez 7 9

Imobilidade 5 7

Algaliação 19 20

Diabetes 104 50

Inf. recorrentes 54 38

População A

Os dados recolhidos do sistema informático permitem dizer que 147 dos 447 doentes da

População A possuem pelo menos um factor de risco: gravidez, imobilidade, algaliação e/ou

diabetes, sendo que com infecções recorrentes surgem 54 doentes.

Alguns doentes apresentam mais do que um factor de risco: 14% acumulam dois.

População B

Os dados recolhidos do sistema informático permitem dizer que 129 dos 336 doentes

possuem pelo menos um factor de risco: gravidez, imobilidade, algaliação e/ou diabetes,

sendo que com infecções recorrentes surgem 38 doentes.

Alguns doentes apresentam mais do que um factor de risco: 20% acumulam dois e 3%

acumulam três factores.

Identificação das estirpes bacterianas nas duas populações

Bactérias de Gram negativo

Na população A a espécie Escherichia coli foi a encontrada em maior percentagem (275

casos/61,5%), seguida de Klebsiella spp. (63 casos/14,1%) e de Proteus spp. (30

casos/6,7%).

Na população B a espécie Escherichia coli também foi a mais frequente (223 casos/66,4%),

seguida de Klebsiella spp. (39 casos/11,6%) e de Proteus spp. (24 casos/7,1%).

19

Figura 4 – Incidência de bactérias Gram negativo identificadas na População A e B

Bactérias de Gram positivo

Na população A dentro dos Gram positivo a predominante foi Enterococcus spp. (24

casos/5,4%).

Na população B dentro dos Gram positivo também a mais predominante foi Enterococcus

spp. (8 casos/2,4%).

Figura 5 – Incidência de bactérias de Gram positivo identificadas na População A e B

20

Estudo da susceptibilidade aos antibióticos em Escherichia coli

Tabela 3 – Distribuição das estirpes de E. coli resistentes aos antibióticos, de acordo com a

População A e População B

E. coli Pop A % Pop B %

Amoxicilina 61,8 58,3

Cefalotina 34,9 28,7

Ciprofloxacina 26,5 23,8

Amox+Ác Clav 26,2 35

ÁC. Nalidíxico 16,4 11,7

Nitrofurantoína 13,1 9,9

Cotrimoxazol 12,4 11,2

Cefuroxima 12,4 10,8

Cefepima 6,9 3,6

Imipenemo 6,5 5,8

Fosfomicina 5,8 5,4

Gentamicina 3,3 3,6

Figura 6 – Distribuição das estirpes de E. coli resistentes aos antibióticos, de acordo com a

População A e População B

População A

No caso da bactéria predominante, Escherichia coli, a maior percentagem de resistência aos

antibióticos foi encontrada no caso da amoxicilina (61,8%). Em seguida para a Cefalotina

(34,9%), Ciprofloxacina (26,5%) e depois para a Amoxicilina + Ácido clavulâmico (26,2%). A

resistência à fosfomicina foi de 12,9%.

21

População B

No caso da bactéria predominante, Escherichia coli, a maior percentagem de resistência aos

antibióticos foi encontrada no caso da amoxicilina (58,3%). Em seguida para a Amoxicilina +

Ácido clavulâmico (35,0%), Cefalotina (28,7%) e depois para a Ciprofloxacina (23,8%). A

resistência à fosfomicina foi de 5,4%.

Susceptibilidade aos antibióticos da E. coli nas populações com factores de risco

Figura 7 – Distribuição das estirpes de E. coli resistentes aos antibióticos da População com factores

de risco A e B

População A

No caso da bactéria predominante, Escherichia coli, e dentro da população com factores de

risco, a maior percentagem de resistência aos antibióticos foi encontrada no caso da

amoxicilina (65,2%). Em seguida para a Ciprofloxacina (31,5%) e depois para o

Cotrimoxazol (13%).

População B

No caso da bactéria predominante, Escherichia coli, e dentro da população com factores de

risco, a maior percentagem de resistência aos antibióticos foi encontrada no caso da

amoxicilina (60,7%). Em seguida para a Ciprofloxacina (22,5%) e depois para a

Nitrofurantoína (9%).

22

Identificação das estirpes bacterianas dentro das populações com factores de risco

Bactérias Gram negativo

Dentro da população A e nos doentes com pelo menos um factor de risco foi encontrada

uma prevalência de agentes causadores de infecção urinária semelhante aos doentes em

geral.

Nos doentes com pelo menos um factor de risco da população B foi encontrada uma

prevalência de agentes causadores de infecção urinária semelhante aos doentes em geral

mas apenas para o agente mais predominante: E. coli. Em seguida encontramos Proteus

spp. e só depois Klebsiella spp..

Figura 8 – Incidência de bactérias Gram negativo nas populações com factores de risco

Bactérias Gram positivo

Nos doentes com pelo menos um factor de risco das duas populações foi encontrada uma

prevalência de agentes causadores de infecção urinária semelhante aos doentes em geral.

23

Figura 9 – Incidência de bactérias Gram positivo nas populações com factores de risco

Microorganismos alerta

A Norma da Direcção Geral da Saúde número 004/2013 com data de 08/08/2013 e

actualizada a 13/11/2015 define os microorganismos alerta 5. Desta lista, apenas alguns

foram identificados neste estudo.

Figura 10 – Microorganismos alerta da População A e B

24

População A

Neste estudo e para a população A foram identificados um total de 50 microorganismos

alerta.

36 dos casos foram encontrados no sexo feminino e 14 no sexo masculino. Acima dos 70

anos de idade estavam 26 casos e apenas 9 tinham menos de 50 anos. Dos 50 casos, 20

apresentavam um factor de risco (14 com diabetes, 1 grávida, 1 algaliado e 4 com infecção

recorrente).

População B

Neste estudo e para a população B foram identificados um total de 42 microorganismos

alerta.

31 dos casos foram encontrados no sexo feminino e 11 no sexo masculino. Acima dos 70

anos de idade estavam 19 casos e 15 tinham menos de 50 anos. Dos 42 casos, apenas 12

apresentavam um ou mais factores de risco (4 com diabetes dos quais dois com infecção

recorrente, 2 grávidas, 1 algaliado e 5 com infecção recorrente).

Discussão

As duas populações estudadas são muito semelhantes em termos de demografia. Como

pontos comuns, a maioria das infecções urinárias provém de mulheres e o escalão etário

mais afectado é o de 71 a 90 anos. As infecções surgem em indivíduos com um ou mais

factores de risco em percentagem razoável.

Em termos de prevalência de agentes etiológicos de infecções urinárias foi encontrado o

esperado: dentro dos Gram negativo a bactéria Escherichia coli continua prevalente. Em

segundo lugar surge a Klebsiella spp. e só depois a Proteus spp.. Dentro dos Gram positivo,

Enterococcus spp. é prevalente seguida de Staphylococcus saprophyticus.

No grupo dos isolados de E. coli a resistência aos antibióticos é a mesma para as duas

populações: amoxicilina em primeiro lugar. A seguir, surgem os mesmos três antibióticos

nas duas populações embora em posições diferentes: amoxicilina + ácido clavulâmico

(26,2% e 35%), cefalotina (34,9% e 28,7%) e ciprofloxacina (26,5% e 23,8%).

Nos doentes com um ou mais factores de risco o sector etário com maior número de

infecções urinárias é o de 71 a 100 anos de idade em ambas populações. A ordem de

isolados permanece igual na população A (E. coli, Klebsiella spp. e depois Proteus spp.)

mas, na população B, há uma inversão entre Klebsiella spp. e Proteus spp. (E. coli, Proteus

spp. e depois Klebsiella spp.). Nas resistências aos antibióticos dentro dos isolados de E.

coli a sequência da população A é: amoxicilina, ciprofloxacina e depois cotrimoxazol. Na

população B: amoxicilina, ciprofloxacina e depois a nitrofurantoína.

Relativamente aos microorganismos alerta, a população B tem uma maior percentagem

relativamente à população A e apresenta também bactérias com mais resistências ao

imipenemo. Estes microorganismos são prevalentes no sexo feminino nas duas populações.

25

No geral, comparando estes dados de 2014 com dados obtidos em 2008 e 2010 podem ser

tirados alguns dados interessantes, especialmente no que se refere às susceptibilidades aos

antibióticos.

Se, por um lado a prevalência da Escherichia coli desceu ligeiramente, a da Klebsiella spp. e

da Proteus spp. aumentou.

Figura 11 – Evolução da etiologia das infecções do tracto urinário

O aumento da resistência à amoxicilina, ciprofloxacina e nitrofurantoína tem sido gradual

desde 2008. No entanto, a resistência ao cotrimoxazol tem vindo a diminuir.

De salientar neste estudo é, o aumento notável da resistência à associação amoxicilina +

ácido clavulâmico. Estes resultados podem reflectir as orientações terapêuticas dos últimos

anos, embora não se possam retirar conclusões definitivas.

Figura 12 – Evolução das susceptibilidades aos antibióticos de estirpes E. coli

26

Conclusão

As duas populações estudadas são semelhantes entre si e espelham as estatísticas

nacionais.

Embora este estudo não tenha em conta os dados clínicos das populações, o conhecimento

da prevalência das estirpes bacterianas e da sua sensibilidade aos antibióticos torna-se

importante para optimizar a terapêutica empírica das infecções do tracto urinário.

A prevalência dos agentes etiológicos de infecções do tracto urinário segue com a mesma

tendência: Escherichia coli em primeiro, em segundo lugar aparece a Klebsiella spp. e

depois a Proteus spp.. Dentro dos Gram positivo surge em primeiro lugar a Enterococcus

spp. e depois a Staphylococcus saprophyticus.

De salientar, o aumento da resistência da E. coli à associação amoxicilina + ácido

clavulâmico. Esta opção de antibioterapia deve ser pensada responsavelmente no caso de

tratamento empírico de cistites agudas.

A nitrofurantoína e a fosfomicina (mesmo tendo em conta a diminuição das susceptibilidades

da E. coli à fosfomicina) continuam boas opções terapêuticas no caso de antibioterapia

empírica de infecções do tracto urinário.

27

Bibliografia Monografia

1. Narciso A, Fonseca F, Cerqueira SA, Duarte A, Susceptibilidade aos antibióticos de

bactérias responsáveis por cistites não complicadas: estudo comparativo dos isolados de

2008 e 2010. Acta Urol Março de 2011, 1: 16–21

2. Dason S, Dason JT, Kapoor A. Guidelines for the diagnosis and management of recurrent

urinary tract infection in women. Can Urol Assoc J. 2011 October; 5(5): 316–322.

3. Direcção Geral de Saúde. Terapêutica de infecções do aparelho urinário (comunidade).

Departamento da Qualidade na Saúde. 2011 (Norma 15/2011). Lisboa: DGS; 2011

4. Reeves DS (1994). Fosfomycin trometamol. J Antimicrob Chemother 34: 853-858.

5. Direcção Geral de Saúde. Vigilância epidemiológica das resistências aos antimicrobianos.

Departamento da Qualidade na Saúde. 2015 (Norma 04/2013 actualizada a 13/11/2015).

Lisboa: DGS; 2015

28




Labeto, Central de Análises

Bioquímicas SA

Orientadora: Drª Maria Beatriz Godinho

Tomaz dos Santos



Lisboa 2017

29

Índice Relatório de Estágio.......................................................................

Relatório de estágio............................................................................................21

Fase pré analítica...........................................................................................21

Colheita de sangue.....................................................................................................21

Colheita de urina.........................................................................................................23

Colheita de exsudados para exame bacteriológico e micológico...............................23

exsudado vaginal, uretral, nasal, auricular, faríngeo/amigdalino, ocular, purulento e

rectal

Colheita de fezes........................................................................................................26

Colheita de expectoração...........................................................................................26

Colheita de esperma...................................................................................................26

Colheita de amostras para exames micológicos........................................................26

Valência de Microbiologia.............................................................................27

Meios de cultura usados no departamento de microbiologia......................................27

Meios não selectivos (gelose Columbia + 5% Sangue Carneiro, gelose nutritiva e

Hemoline Performance Difásico)................................................................................28

Meios selectivos (gelose Manitol, Campylosel, chocolate, Sabouraud Cloranfenicol

Actidiona, Sabouraud Gentamicina Cloranfenicol, Sabouraud líquido, Mueller Hinton

Sangue Carneiro, malte, caldo Tetrationato + Iodeto potássio + Novobiocina e caldo

Todd Hewitt + antibióticos)..........................................................................................29

Meios diferenciais (chromID™ CPS®Elite, gelose SS, chromID Salmonella, Hektoen,

MacConkey, Candida ID2, chromID™ Strepto B, Granada e Löwenstein-Jensen)....32

Colorações..................................................................................................................36

Gram, Ziehl-Neelsen modificada, eosina-nigrosina

Testes bioquímicos complementares.........................................................................38

catalase, oxidase, coagulase, indol, teste para estreptococos, Slidex Pneumo kit,

teste EPEC E. coli enteropatogénica, anti Shigella, anti Salmonella, galeria

antibiograma de Haemophilus e Moraxella (Branhamella), galeria antibiograma de

estreptococos e pneumococos, teste para Mycoplasma hominis/Ureaplasma spp,

testes semi automáticos de identificação e sensibilidade aos antibióticos e testes

manuais de identificação e sensibilidade aos antibióticos

Esquemas laboratoriais..............................................................................................43

urina, exsudado vaginal, uretral, nasal, orofaríngeo, auricular, ocular e purulento,

fezes, expectoração e esperma

Pesquisa de fungos não leveduriformes.....................................................................52

Pesquisa de ovos, quistos e parasitas........................................................................53

pesquisa nas fezes e pesquisa de Schistosoma haematobium na urina


Valência de Bioquímica Clínica.....................................................................55


manipulação................................................................................................................55

Metodologias para avaliação de metabolitos..............................................................55

30

Glúcidos (glicose)........................................................................................................57

Lípidos (colesterol total, triglicerídeos, colesterol HDL e colesterol LDL)........... .....58

Proteínas (proteínas totais, albumina, microalbumina, imunoglobulinas, β2

microglobulina, proteína C reactiva, α1 antitripsina, proteínas do complemento,

electroforese das proteínas).......................................................................................59

Iões (cálcio, fósforo, magnésio)..................................................................................64

Ácido-Base (sódio, potássio, cloro)............................................................................65

Drogas terapêuticas (lítio, ácido valpróico, carbamazepina, fenitoína, digoxina)......66

Drogas de abuso (opiáceos, anfetaminas, benzodiazepinas, cocaína,

canabinóides)..............................................................................................................68

Exame sumário de urina.............................................................................................69

Metodologias para avaliação das funções fisiológicas e endócrinas..........................72

Função renal (ácido úrico, creatinina, ureia)...............................................................72

Função hepática e biliar (AST, ALT, fosfatase alcalina, GGT, bilirrubina total e

directa)........................................................................................................................74

Função pancreática (amílase, lípase).........................................................................76

Função muscular (CK, LDH).......................................................................................76

Marcadores cardíacos (troponina I, CK-MB)..............................................................77

Metabolismo do ferro e marcadores de anemia (ferro, transferrina, TIBC (capacidade

total de fixação do ferro), ferritina, ácido fólico, vitamina B12)...................................78

Função tiroideia (T3, T3 livre, T4, T4 livre, TSH)........................................................80

Função fertilidade (FSH, LH, progesterona, prolactina, estradiol, testosterona)........82

Função adrenal (cortisol, ACTH)................................................................................85


Valência de Imunologia.................................................................................86


manipulação................................................................................................................86

Patologias infecciosas................................................................................................87

Waaler Rose, antigénios febris, RPR, mononucleose infecciosa

Patologias autoimunes................................................................................................89

Anticorpos antitiroideus

Patologias alérgicas....................................................................................................90

IgE total e IgE específica

Patologias virais..........................................................................................................91

VIH, VHC, VHA, VHB, CMV, rubéola

Toxoplasma gondii......................................................................................................96

Patologias oncológicas...............................................................................................97

PSA total e livre, CEA, CA 15.3, CA 125, CA19.9, alfa-fetoproteína, beta-HCG

Controlo de qualidade...............................................................................................101

Bibliografia Relatório Estágio.........................................................................102

31


Fase pré analítica

O meu estágio integrado no Mestrado em Análises Clínicas (MAC) foi realizado no

laboratório de análises clínicas Labeto, Centro de Análises Bioquímicas SA, situado em

Leiria. Este laboratório foi criado em 1975 e pertence ao Grupo Beatriz Godinho, estando,

desde janeiro 2004, o seu Sistema de Gestão da Qualidade certificado conforme a norma

NP EN ISO 9001:2000 e cumprindo as normas do Laboratório Clínico da Ordem dos

Farmacêuticos. Tem uma média diária de 1000 utentes distribuídos por vários postos de

colheita.

O estágio da fase pré analítica foi realizado no posto de colheitas da Batalha, pertencente

ao laboratório, das 08h00 às 11h00 da manhã durante cerca de 37 dias. Dentro deste

horário procedi à instrução de colheita e à colheita propriamente dita de variados tipos de

amostra: sangue, urina, fezes, exsudados vários (vaginal, uretral, auricular, faríngeo, nasal,

purulento) e material biológico diverso.

Colheita de sangue

Para a maioria das determinações analíticas no soro ou plasma é aconselhável que o utente

esteja em jejum desde a noite anterior (mínimo 8 horas): permite assim a comparação dos

resultados em diferentes ocasiões devido à uniformidade das condições de colheita. No

caso da determinação de certos analitos é obrigatório o utente ter um jejum de 8 a 12 horas

(glicose, ferro, TIBC, folatos, insulina, peptídeo C, renina, triglicerídeos, aldosterona). Há

ainda o caso da interferência da hora do dia da colheita em determinados analitos: ACTH,

cortisol, hormona crescimento, prolactina e testosterona.

Assim, no atendimento administrativo do utente prévio à colheita, deve ser feita uma série

de perguntas com o objectivo de assegurar as condições óptimas de colheita e a existência

de factores condicionantes do resultado das análises: patologias crónicas e agudas,

terapêutica medicamentosa regular e excepcional, objectivo da prescrição médica (caso

exista), etc.

Casos especiais pré colheita:

Há situações muito específicas em que o médico assistente aconselha períodos de jejum

mais curtos consoante as particularidades do utente (por exemplo em situações de

gravidez). Nestes casos é sempre incluída uma anotação no boletim de resultados. Quando

é pedida a Prova de Tolerância Oral à Glicose, insulina ou peptídeo C é sempre

determinado o valor base de glicémia antes de ser ingerida a sobrecarga de glicose. Caso

este valor seja superior a 140 mg/dL, a prova não é realizada e o facto é comunicado no

boletim de resultados.

32

Para a determinação da prolactina, catecolaminas e da hormona de crescimento é

aconselhável um repouso de 20 ou 30 minutos antes da colheita de sangue: elimina o factor

stress que pode interferir no resultado, aumentando o seu valor.

Para a determinação de drogas terapêuticas (lítio, ácido valpróico, carbamazepina, fenitoína

e digoxina), a colheita de sangue deve ser efectuada antes da próxima toma do

medicamento.

Colheita propriamente dita:

O procedimento de colheita de sangue através de punção venosa com agulha e seringa

pode ser um evento stressante ou traumático para alguns utentes. Devemos conversar

calmamente com o utente de maneira a identificar estas situações e tentar minimizar os

receios que possa ter.

A observação da zona do braço a puncionar deve dar orientações acerca do tipo de agulha

a usar. O número de analitos e suas especificidades orienta no volume de sangue a colher e

na escolha dos tubos de amostra (sem ou com anticoagulante e qual). Alguns analitos

implicam que os tubos de amostra estejam a determinada temperatura (refrigerados ou

aquecidos) antes de serem cheios com o sangue.

Após a punção devemos premir o local da picada, ao de leve, para permitir o normal

estancamento do fluxo sanguíneo. Deve ser dada atenção especial aos utentes

hipocoagulados.

O utente deve sair da sala de colheitas apenas se estiver bem e recuperado do

procedimento de colheita.

Casos especiais pós colheita:

Determinados analitos sofrem degradação da sua estrutura muito rapidamente e devem ser

tomados cuidados especiais no que toca à conservação da amostra até que se proceda à

sua análise.

Há compostos que se degradam após exposição à luz solar (é o caso do ácido fólico e da

vitamina B12) pelo que os tubos de amostra devem ser envoltos em papel de alumínio.

Noutros casos, logo depois de recolhida a amostra devemos centrifugar e separar o soro

(neste caso devemos deixar ocorrer a formação do coágulo antes) ou o plasma para tubo de

plástico e manter congelado ou junto a uma cuvete de gelo. É o caso do ACTH, CH100,

CH50, aldosterona, entre outros. Há compostos que devem ser centrifugados e separados e

depois mantidos à temperatura ambiente (por exemplo renina) ou mantidos refrigerados (é o

caso da insulina).

Estas condições especiais devem ser mantidas desde a colheita e durante o transporte das

amostras até ao local de realização da análise. Na generalidade dos casos, as amostras são

mantidas refrigeradas em malas térmicas.

33

Colheita de urina

A colheita de amostra de urina, seja para exame sumário ou determinação bioquímica de

analitos, deve ser feita pelo utente usando para tal um recipiente próprio esterilizado

fornecido pelo laboratório. De preferência será recolhida a primeira urina da manhã, após

higiene íntima e após rejeitar o primeiro jacto da micção.

Em casos especiais é preferido o primeiro jacto da micção (proteína de Bence Jones) ou

toda a primeira micção (pesquisa de BAAR).

A colheita de urina de 24 horas é também um procedimento muito comum. Neste caso, o

recipiente é maior, tem uma escala de medição de volume, é opaco e pode ou não conter

um conservante, consoante o objectivo da análise. O utente deve desprezar toda a primeira

micção do dia e depois recolher todo o volume de urina produzido até 24 horas precisas

depois. Durante esta recolha, o utente deve manter a sua vida normal, não sendo

necessário qualquer restricção alimentar ou de ingestão de líquidos. Excepção feita quando

se destina a análises em que se deve respeitar uma dieta alimentar antes e durante a

colheita: por exemplo ácido homovanílico (dieta de vegetais, banana, baunilha, chocolate,

café, chá e nozes na véspera e no dia da colheita), metanefrinas (dieta de bananas, ananáz,

café e nozes), etc.

A colheita de urina asséptica para exame microbiológico deve respeitar algumas condições

de maneira a permitir um resultado de análise conclusivo e eficaz. De preferência será

usada a primeira urina da manhã ou, caso não seja possível, o utente deverá estar sem

urinar durante 3 a 4 horas. Este tempo permite uma maior concentração da urina dentro da

bexiga e melhorar as hipóteses de obtenção de uma cultura positiva caso exista bacteriúria.

Em todos os casos, é essencial que o utente tenha procedido a uma correcta higienização

dos órgãos genitais e tenha desprezado o primeiro jacto da micção, recolhendo o jacto

médio. Será sempre usado recipiente estéril. Estas amostras deverão ser entregues ao

laboratório num espaço de tempo máximo de 2 horas.

No caso de crianças ainda sem controlo dos esfíncteres, deve ser usado um saco colector

de urina próprio. Este será colocado após correcta higienização da criança e mantido até um

máximo de 30 minutos. Se não se conseguir obter uma amostra de urina neste espaço de

tempo, o saco será trocado por um novo, após nova higienização.

Nos utentes com algaliação, a amostra de urina deve ser recolhida directamente do tubo

colector de silicone através de punção com agulha e seringa acima do local de derivação,

desinfectando previamente o local a puncionar com álcool a 70º.

Colheita de exsudados para exame bacteriológico e micológico

Exsudado vaginal

Salvo indicação médica em contrário, no caso de estar a tomar terapêutica antimicrobiana

ou antimicótica a utente deve aguardar um intervalo de pelo menos 5 dias para fazer a

recolha. Para evitar outras interferências a utente não deve estar menstruada, ter relações

34

sexuais 24 horas antes da colheita e aplicar óvulos ou pomadas locais. Pode sempre fazer a

higiene matinal, evitando irrigações. Para a colheita devemos avaliar a utilização ou não de

espéculo vaginal. É de evitar tanto em crianças e mulheres virgens como no caso de

mulheres grávidas.

A colheita é feita primeiro com uma zaragatoa em meio de carvão e depois uma zaragatoa

simples. Usamos a zaragatoa simples para fazer duas lâminas (coloração Gram e azul de

metileno), medição de pH e depois adicionamos uma gota de soro fisiológico e mantemos

em estufa a 37ºC. Esta zaragatoa será usada para o exame directo (pesquisa de

Trichomonas). A zaragatoa em meio de carvão será usada para sementeira nos meios

adequados. Conservar a 361C.

Quando a análise pedida inclui pesquisa de Mycoplasma hominis/Ureaplasma spp ou

Chlamydia é necessário fazer raspagem na zona do endocolo para recolher o maior número

de células possível. No caso da pesquisa de Mycoplasma hominis/Ureaplasma spp a

zaragatoa é colocada no tubo contendo o meio de transporte e no caso da Chlamydia

usamos uma zaragatoa seca específica. O envio ao laboratório deve demorar, no máximo, 6

horas. Na mulher grávida este tipo de colheita deve ser feita pelo médico

ginecologista/obstetra devido ao risco de aborto.

Exsudado uretral

Se possível, a colheita deve ser efectuada antes da primeira micção do dia ou então o

utente deve estar sem urinar há pelo menos 3 horas, não deve fazer a higiene matinal, não

pode ter relações sexuais antes da colheita nem aplicar pomadas locais (sejam antibióticos

ou antimicóticos). No caso de utentes do sexo masculino, o técnico de colheitas deve

começar por pressionar a uretra de modo a estimular a saída de corrimento para colher a

"gota matinal" com uma zaragatoa estéril. A partir desta zaragatoa preparar 2 lâminas

(coloração Gram e azul de metileno) com a amostra recolhida. Para utentes do sexo

masculino e feminino, devemos introduzir duas zaragatoas finas e flexíveis com um

movimento de rotação de cerca de 1 cm dentro da uretra, uma sem meio de cultura e outra

em meio de carvão. A zaragatoa seca será usada para fazer duas lâminas (coloração Gram

e azul de metileno) no caso de utentes do sexo feminino e para o exame directo (com gota

de soro fisiológico colocada em estufa a 361C) para pesquisa de parasitas (Trichomonas)

e para observação semiquantitativa de células (leucócitos, eritrócitos e células epiteliais). A

outra zaragatoa em meio de carvão será usada para sementeira nos meios de cultura

adequados. Conservar a 361 C.

Exsudado nasal

É colhida uma amostra de secreção nasal direita e/ou esquerda com zaragatoas finas e

estéreis, uma para cada narina, em meio de transporte, devidamente identificadas com o

número do paciente e lado da narina. A zaragatoa é inserida em cada narina até encontrar

resistência (mais ou menos a nível dos cornetos) e devemos rodar contra a mucosa nasal.

35

Deve evitar-se a toma de antibióticos/antimicóticos nos 5 dias precedentes à colheita, assim

como uso de pomadas, inalação de sprays nasais ou ter lavado a zona afectada

recentemente.

Exsudado faríngeo/amigdalino

Antes da colheita, o utente não deve ter comido ou feito a higiene oral. Deve ser evitada a

toma de antibióticos/antimicóticos nos últimos 5 dias. Com a zaragatoa (em meio de

transporte) devemos raspar em toda a superfície da faringe posterior e amígdalas com

aspecto patológico. Deverá ser evitado o contacto da zaragatoa com a língua, úvula,

gengivas ou saliva.

Exsudado auricular

A amostra é colhida do canal auricular externo com zaragatoa estéril em meio de cultura.

Esta é usada para espalhar um pouco de exsudado numa lâmina para proceder à coloração

de Gram e sementeira nos meios adequados. No canal auricular médio e interno as

amostras são colhidas apenas pelo médico.


como lavagens de ouvidos e uso de gotas auriculares.

Exsudado ocular

A amostra de exsudado ocular é colhida com zaragatoa estéril em meio de transporte,

usando zaragatoas diferentes para cada olho, estando os dois afectados. No caso de recém

nascidos colher também com zaragatoa com meio de carvão para pesquisa de Neisseria

gonorrhoeae.


como lavagens da zona afectada e uso de pomadas.

Exsudados purulentos

Para colheita de amostras de exsudados de feridas e/ou secreções usamos uma zaragatoa

estéril com meio de transporte, que será usada para esfregaço para coloração de Gram e

para sementeira nos meios de cultura adequados.

Exsudado rectal

Para a pesquisa de parasitas e microorganismos, devemos usar uma zaragatoa seca e uma

em meio de carvão. Devem ser introduzidas cerca de 2,5 cm no esfíncter anal e rodar contra

36

as criptas rectais deixando alguns segundos para fixar os microorganismos. Se ocorrer

contaminação com fezes, devemos colher uma nova amostra.

No caso específico da detecção de grávidas portadoras de estreptococos beta hemolíticos

do grupo B, devemos usar uma zaragatoa com meio para colheita na zona vaginal e outra

zaragatoa com meio para a zona anorectal (1/3 externo da vagina e anorectal).

Colheita de fezes

A colheita deste tipo de amostra é sempre realizada pelo utente ou por alguém responsável

pelo utente no seu domicílio. Os contentores são estéreis e possuem uma tampa com

espátula associada que facilita a recolha da amostra. O utente deve fazer a recolha por

amostragem do início e do fim do evacuado, devendo o tamanho da amostra não exceder o

tamanho de uma noz e tentando evitar zonas contaminadas com urina. As amostras devem

ser refrigeradas e entregues ao laboratório no próprio dia da dejecção.

Durante o processo não devem manusear papel higiénico, uma vez que pode interferir em

determinadas análises (coprocultura). Para a pesquisa de sangue oculto nas fezes há outras

condições a cumprir: evitar alturas em que haja hemorragia visível devido a pólipos ou

hemorroidas ou durante o período menstrual da mulher.

Colheita de expectoração

A recolha de expectoração deve ser feita de manhã e em jejum. O utente deve bochechar

com água recentemente fervida e arrefecida sem gargarejar. Depois tem que recolher a

expectoração para contentor estéril após tosse profunda, desprezando saliva e rinorreia

posterior.

Colheita de esperma

A recolha de esperma deve ser feita para recipiente estéril fornecido pelo laboratório, não

deve usar lubrificantes e, de preferência, por masturbação, após higiene. Deve ser recolhido

todo o sémen ejaculado. O utente deve ter, no mínimo, 72 horas de abstinência sexual mas

não mais de 7 dias. Nos casos em que a recolha é feita em casa, a amostra deve ser

transportada ao laboratório o mais rápido possível (máximo 30 minutos) mantendo a

temperatura entre 20º a 37ºC durante o transporte. Este pormenor é essencial quando a

amostra se destina à análise espermograma. Nos casos em que se destina a

espermocultura não é necessário abstinência e a amostra deve manter-se à temperatura

ambiente. Em qualquer dos casos, não deve ocorrer contaminação com urina.

Colheita de amostras para exames micológicos

Deve ser feita a colheita do tecido queratinoso (unhas, cabelo, pele, barba, etc) e raspagem

da zona periférica para recipiente estéril não rolhado (exemplo: caixa de Petri) para melhorar

37

a hipótese de crescimento de fungos saprófitos. Devem ser transportadas sem meio de

transporte e a uma temperatura entre 15 e 30ºC.

Cabelos/pelos: devem ser arrancados da periferia da lesão com auxílio de uma pinça

esterilizada e recolhidos para o interior de uma caixa de Petri esterilizada. Os cabelos

devem ser retirados pela raíz já que a colonização fúngica pode ocorrer apenas junto a esta

zona. Posteriormente passa-se com uma zaragatoa seca embebida em soro fisiológico de

forma a agarrar alguns esporos ou leveduras que possam existir.

Unhas: Antes da amostra ser retirada deve passar-se a zona com álcool a 70º. Com um

bisturí faz-se um raspado de unha, principalmente entre o tecido saudável e o infectado

(observar o aspecto da unha, zonas esbranquiçadas, lascadas). Cortar a unha e raspar junto

à pele. O produto é colhido para uma caixa de Petri esterilizada. Posteriormente passa-se

com uma zaragatoa seca embebida em soro fisiológico de forma a agarrar alguns esporos

ou leveduras que possam existir.

Pele: Antes da amostra ser retirada deve passar-se a zona com álcool a 70º, para remover

vestígios de pomadas ou unguentos. Nas infecções de pele, o material biológico deve ser

colhido a partir da fronteira entre o tecido doente e o saudável. Com o auxílio do bisturi

devem ser raspadas escamas da pele da lesão para o interior de uma caixa de Petri

esterilizada. No fim, passar com uma zaragatoa embebida em soro fisiológico de forma a

agarrar alguns esporos ou leveduras que possam existir. Quando há suspeita de Pitiríase

versicolor (alterações da pigmentação da pele) além do procedimento anterior recorre-se

também ao uso da fita-cola que se aplica sobre as áreas hipopigmentadas ou

hiperpigmentadas e coloca-se entre duas lâminas.

Valência de Microbiologia

O estágio na valência de microbiologia foi realizado no Labeto, Centro de Análises

Bioquímicas SA das 08h00 ou 11h00 até às 17h00 durante 55 dias, sob a supervisão da Drª

Maria Beatriz Tomaz dos Santos.

No departamento de microbiologia, a fase pré analítica é muito importante: é crucial que

sejam seguidas as boas práticas de laboratório para que se consiga chegar ao melhor

resultado possível.

Meios de cultura usados no departamento de microbiologia

Todos os meios de cultura devem atingir a temperatura ambiente (18-25ºC) antes de serem

semeados.

38

São usados alguns meios de transporte cujo objectivo é garantir a viabilidade dos

microorganismos presentes nas amostras biológicas até que estas sejam processadas

(normalmente 24 a 48 horas): meio Stuart, Amies com ou sem carvão. Os microorganismos

são mantidos viáveis (contêm hidratos de carbono que fornecem energia), mas não crescem

devido à falta de compostos nitrogenados neste tipo de meios. Caso se coloque a hipótese

da presença de Neisseria gonorrohoeae (uretral, vaginal, ocular) deve ser usado meio com

carvão, para neutralizar substâncias inibidoras.

Outros meios de cultura são usados para o isolamento e identificação dos vários

microorganismos. Podem ser líquidos, sólidos ou semi-sólidos e podem também ser

selectivos, não selectivos e diferenciais. No Labeto são usados principalmente meios sólidos

e alguns meios líquidos para enriquecimento.

Embora a maioria dos meios usados seja de fabrico da responsabilidade de fornecedores

externos reconhecidos, o Labeto utiliza também meios fabricados por uma empresa do

mesmo grupo empresarial: Laboratório Tomaz. Esta é uma empresa acreditada para mais

de 100 parâmetros na área das análises de água, alimentos, ambiente e veterinária.

Meios não selectivos

Gelose Columbia + 5% Sangue Carneiro

No Labeto é usado o meio da bioMérieux COS.

Genericamente chamado Gelose de Sangue, este meio de isolamento é usado para facilitar

o crescimento de microorganismos exigentes (Streptococcus, Listeria, etc) devido à mistura

de peptonas que contém. É um meio nutritivo muito rico adaptado ao crescimento da maioria

das bactérias, independentemente do seu metabolismo. Permite a expressão de hemólise

devido à presença de sangue de carneiro, característica que orienta na identificação da

bactéria: hemólise α com coloração esverdeada à volta da colónia (Streptococcus

pneumoniae), hemólise β com zona transparente à volta ou por baixo da colónia

(Streptococcus pyogenes, S. agalactiae) e hemólise , ou seja, ausência de hemólise.

Hemólise α Hemólise β Hemólise

Figura 13 – Hemólise em gelose sangue

39

Gelose Nutritiva

No Labeto usamos o meio Gelose nutritiva produzido pelo Laboratório Tomaz.

Genericamente chamado Gelose Nutritiva este é um meio de isolamento para bactérias que

não tenham exigências específicas para o seu crescimento. É usado para repicagem de

estirpes suspeitas de Salmonella, Shigella e E.coli enteropatogénica antes de proceder ao

uso de antisoros e identificação.

Hemoline Performance Difásico

No Labeto usamos o Hemoline Diphase da bioMérieux.

Figura 14 – Hemoline Diphase da bioMérieux

Este meio em frasco é usado nas hemoculturas (culturas de colheitas de sangue) para

pesquisa de microorganismos aeróbios responsáveis por septicémias. Contém dois meios

de cultura: um caldo enriquecido em factores de crescimento e uma gelose cobrindo uma

das faces do frasco.

A presença de peptonas, de extracto de levedura, de hemina, de NAD e de vitaminas

permite um crescimento satisfatório dos principais microrganismos aeróbios encontrados

nas septicémias (bactérias e leveduras) e particularmente das espécies exigentes. Estirpes

com exigências mais específicas podem não se desenvolver. O caldo contém um

anticoagulante (SPS: Sódio Polianetol Sulfonato). A atmosfera contida no frasco,

enriquecida em CO2, é mantida em baixa pressão para facilitar a colheita. A presença de

uma tampa de borracha e de uma cápsula de rosca permite a sementeira directa com uma

agulha assim como a abertura fácil do frasco para o tratamento dos frascos positivos.

Um frasco tem crescimento considerado positivo quando na gelose há presença de colónias

ou produção de gás ou no caldo aparece turvação, depósito ou hemólise. Faz-se então uma

repicagem para os meios adequados. O crescimento bacteriano pode ser facilitado quando

a colheita de sangue tem volume entre 5 a 10 ml por frasco.

40

Meios selectivos

Gelose Manitol

No Labeto usamos a gelose manitol do Laboratório Tomaz.

Este meio destina-se ao isolamento selectivo de Staphylococcus spp. em amostras de

origem humana. A maioria das bactérias Gram negativo são inibidas devido ao elevado teor

em cloreto de sódio do meio. S. aureus é presuntivamente identificado devido à sua

fermentação do manitol dando origem a colónias amarelas (confirmação com Pastorex

Staph Plus da Biorad).

Gelose Campylosel

No Labeto usamos o meio Campylosel agar da bioMérieux.

Figura 15 – Campylosel agar da bioMérieux

Este é um meio selectivo para isolamento de Campylobacter intestinais (C. jejuni e C. coli) a

partir de amostras fecais (fezes líquidas ou suspensão de fezes em soro fisiológico estéril).

O crescimento destas bactérias é facilitado pela presença de sangue de carneiro e a

presença de antibióticos e antifúngicos inibe outras bactérias e fungos contaminantes.

A incubação deste meio faz-se em atmosfera de microaerofilia a 42ºC por 48 a 72 horas

surgindo colónias pequenas e cinzentas que devem ser posteriormente confirmadas para

identificação: exame directo para observação de motilidade característica e testes

bioquímicos.

Gelose Chocolate

No Labeto usamos o meio Gelose Chocolate Agar PolyViteX VCAT3 e Gelose Haemophilus

Chocolate 2, ambos da bioMérieux. Ambos contêm factor X (hemina) e factor V (NAD)

assim como uma associação de antibióticos e antifúngicos.

A gelose chocolate com PolyViteX e com V.C.A.T. (vancomicina, colistina, anfotericina e

trimetropim) é selectiva para o isolamento de Neisseria gonorrhoeae e Neisseria

meningitidis.

41

A gelose chocolate com PolyViteX e com bacitracina favorece o isolamento de Haemophilus

spp., inibindo as bactérias Gram positivo e a maioria das Neisseria.

N. gonorrohoeae H. parainfluenzae

Figura 16 – N. gonorrohoeae e H. parainfluenzae em gelose chocolate

Gelose Sabouraud Cloranfenicol Actidiona

No Labeto usamos o meio gelose sabouraud cloranfenicol actidiona da bioMérieux.

É um meio selectivo sólido em tubo para cultura de algumas espécies de fungos

filamentosos, em especial dermatófitos, devido à presença de peptonas e glucose,

cloranfenicol (inibe a maioria das bactérias) e actidiona (inibe fungos contaminantes como

Penicillium).

A incubação pode ir desde as 24 a 72 horas até aos 30 dias (dermatófitos). A identificação

do ou dos microrganismos isolados deve ser efectuada por exame directo (macro e

microscópico) ou por testes complementares (bioquímicos ou imunológicos).

Gelose Sabouraud Gentamicina Cloranfenicol

Figura 17 – Gelose Sabouraud Gentamicina Cloranfenicol 2 da bioMérieux

No Labeto usamos a Gelose Sabouraud Gentamicina Cloranfenicol 2 da bioMérieux.

É um meio selectivo sólido em tubo para cultura de algumas espécies de fungos

leveduriformes e filamentosos, devido à presença de peptonas e glucose, gentamicina (inibe

a maioria das bactérias Gram positivas e negativas) e cloranfenicol (aumenta a selectividade

das espécies resistentes à gentamicina). O crescimento dos fungos também é favorecido

pelo pH ligeiramente ácido do meio.

42

A incubação pode ser feita a 25ºC ou a 361C, com a tampa ligeiramente desenroscada. O

crescimento de leveduras dá-se às 24 horas quando a 361C ou às 48 a 72 horas quando

a 25ºC. No caso de fungos filamentosos o crescimento pode acontecer entre o 3º dia e o 30º

dia. A identificação do ou dos microrganismos isolados deve ser efectuada por exame

directo (macro e microscópico) ou por testes complementares (bioquímicos ou

imunológicos).

Meio Sabouraud Líquido

No Labeto usamos o meio Sabouraud líquido da bioMérieux.

Contém peptonas que favorecem o crescimento de leveduras e fungos.

Meio Mueller Hinton com Sangue de Carneiro

No Labeto usamos o meio Mueller Hinton 2 + 5% sangue carneiro da bioMérieux.

Este meio destina-se ao teste de sensibilidade aos antibióticos por difusão manual para

pneumococos e estreptococos (necessitam de sangue de carneiro). A presença de baixo

teor de timina diminui os fenómenos de crescimento à volta dos discos e permite uma

melhor determinação dos halos de inibição.

Gelose Malte

No Labeto usamos a gelose de extrato de malte produzida pelo Laboratório Tomaz.

É um meio usado para repicagem e identificação de fungos leveduriformes e outros.

Caldo Tetrationato

No Labeto usamos o caldo tetrationato produzido pelo Laboratório Tomaz.

É um caldo de enriquecimento selectivo de Salmonella spp.. Contém sais biliares e

tiossulfato de sódio que inibem o crescimento de coliformes e outras bactérias da flora

intestinal, apenas permitindo que as bactérias redutoras de tetrationato se multipliquem

(inclui Proteus spp.).

Para o enriquecimento a incubação deve ser de 18-24 horas a 361C e depois semear em

meios entéricos adequados.

Caldo Todd Hewitt com antibióticos

No Labeto usamos o caldo Todd Hewitt com antibióticos da bioMérieux.

43

Este caldo torna-se um meio de enriquecimento selectivo de estreptococos do grupo A

(exsudado faríngeo) e B (S. agalactie, exsudado vaginal na mulher grávida) assim como de

S. aureus, rastreio dos S. aureus resistentes à meticilina (MRSA). A sua selectividade deve-

se à presença de antibióticos (ácido nalidíxico e colistina) que inibem o crescimento de

bactérias Gram negativas.

Após a incubação (18-24 horas a 361C) deve ser feita sementeira em meios de

isolamento adequados.

Meios diferenciais

chromIDTM CPS®Elite Este meio da bioMérieux é usado para isolar e identificar bactérias provenientes de amostras urinárias, nomeadamente: Escherichia coli, Enterococcus, KESC (Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Citrobacter), Proteus, Providencia e Morganella (Proteeae). Contém dois substratos cromogénicos que permitem revelar a actividade enzimática bacteriana existente e a revelação do indol pelo triptofano. A invasão do meio pelo Proteus é impedida pela concentração de agár no meio. A identificação directa, quando possível, deve-se a : - E. coli com coloração vermelha a carmim pelas estirpes produtoras de ß-glucuronidase (ß-GUR) e/ou ß-galactosidase (ß-GAL). Há estirpes de E.coli que não produzindo actividade ß-GUR ou ß-GAL dão origem a colónias rosa claro a rosa. - Enterococcus com coloração turquesa ou azul claro a verde pelas estirpes que exprimem uma ß-glucosidase (ß-GLU) e observação de cocos Gram positivo no exame directo. - KESC com coloração azul a verde ou castanha esverdeada pelas estirpes que exprimem uma ß-glucosidase (ß-GLU) e observação de bacilos Gram negativo no exame directo (prosseguir para a identificação do microorganismo). - Proteeae com coloração castanha escura a castanha das estirpes que exprimem uma desaminase, efectuando a pesquisa de indol com o reagente ID Indol-TDA (prosseguir para a identificação do microorganismo caso necessário). - Streptococcus agalactiae com coloração violeta (prosseguir para a identificação do microorganismo). - Staphylococcus saprophyticus dá colónias pequenas em tom rosa claro.

E. coli / P. mirabilis K. pneumoniae / E. faecalis Pseudomonas spp.

44

S. agalactiae Candida spp. Figura 18 – chromIDTM CPS®Elite da bioMérieux

O aparecimento de outras cores deve sempre levar à identificação do microorganismo isolado por outros métodos. Casos há, em que as estirpes nem sempre produzem as enzimas que dão origem às cores características necessárias à identificação da bactéria ou outras estirpes dão origem às cores características de bactérias diferentes. É o caso de pelo menos 5% das E. coli que originam colónias incolores ou alguns Staphylococcus que dão colónias rosa. Colónias turquesa podem ser, além de Enterococcus, de Staphylococcus, Streptococcus ou até de algumas leveduras. Algumas estirpes de Citrobacter podem dar colónias incolores a castanhas escuras, enquanto que outras estirpes de Pseudomonas podem ter colónias castanho escuro (diferenciação de Proteeae com teste da oxidase). Ocasionalmente, algumas estirpes de enterobactérias que não E. coli (Citrobacter freundii, Enterobacter cloacae, Salmonella spp...). Podem apresentar colónias de cor rosa a vermelha escura. Podem ser diferenciadas pelo teste do indol com reagente ID Indol TDA: reacção positiva azul confirma E. coli e uma reacção negativa leva a mais testes de identificação. Colónias castanhas com teste indol negativo está associado a P. mirabilis. As pequenas colónias de enterococos podem nem sempre ser visualizadas no caso de culturas polimicrobianas. Algumas estirpes com exigências de crescimento mais específicas podem não crescer neste meio de cultura.

Gelose SS

No Labeto usamos o meio gelose SS da bioMérieux.

Figura 19 – Gelose SS da bioMérieux

Este é um meio selectivo de isolamento e diferenciação para estirpes de Salmonella e

Shigella a partir de amostras fecais. Bactérias que fermentam a lactose e reduzem o

tiosulfato (com produção de H2S) do meio dão origem a colónias rosa e incolores. A

produção de H2S leva a colónias com centro negro. A presença no meio de sais biliares e

corantes (verde brilhante para os coliformes) inibe o crescimento de bactérias Gram positivo.

Assim, colónias incolores ou levemente coloridas com ou sem centro negro dão forte

indicação de Salmonella ou Shigella.

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Gelose chromID Salmonella

No Labeto usamos o meio chromID Salmonella Elite da bioMérieux.

Figura 20 – chromID Salmonella Elite da bioMérieux

Este é um meio selectivo de isolamento e identificação para estirpes de Salmonella a partir

de amostras fecais. Contém uma base nutritiva de peptonas e cromogénios que permite o

crescimento de todas as estirpes de Salmonella com revelação da actividade enzimática:

coloração malva pálida a malva das colónias. Tem ainda inibidores de bactérias Gram

positivo, de algumas Gram negativo, leveduras e fungos.

Gelose Hektoen

No Labeto usamos a gelose Hektoen produzida pelo Laboratório Tomaz.

Este meio é selectivo de isolamento e diferenciação para Salmonella e Shigella a partir de

amostras fecais. Dão origem a colónias verdes ou azuis esverdeadas com ou sem centro

negro.

As outras bactérias que também fermentam os açúcares deste meio dão colónias amarelas

ou salmão. Este meio inibe o crescimento de bactérias Gram positivas devido à presença de

sais biliares e corantes, assim como de algumas enterobactérias.

Gelose MacConkey

No Labeto usamos a gelose MacConkey produzida pelo Laboratório Tomaz.

Este meio contém cristal violeta e sais biliares, o que permite que seja um meio selectivo de

isolamento e diferenciação para bactérias Gram negativo: Enterobacteriaceae,

Pseudomonas spp., etc. A fermentação da lactose pelas bactérias leva a formação de

colónias vermelhas com precipitado à volta (halo de sais biliares) pela viragem do vermelho

neutro. As estirpes não fermentadoras de lactose dão colónias incolores ou beges.

Gelose Candida ID2

No Labeto usamos o meio chromID Candida da bioMérieux.

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Figura 21 – chromID Candida da bioMérieux

Este é um meio selectivo de isolamento e diferencial de leveduras, permitindo a identificação

directa de Candida albicans e presuntiva de C. tropicalis, C. lusitaneae e C. kefyr. O meio

contém um substracto cromogénio de hexosaminidase que sofrendo hidrólise na presença

de um indutor de enzima leva à coloração de azul das colónias de C. albicans. A hidrólise de

outro substrato do meio origina colónias rosa (C. tropicalis, C. lusitaniae e C. kefyr). A maior

parte das bactérias têm o crescimento inibido neste meio.

Este meio exibe fotossensibilidade pelo que não deve ser exposto à luz

desnecessariamente. A incubação pode ir desde as 24 até 72 horas, dependendo do tipo de

microorganismo em causa, não devendo ser usado para pesquisa de dermatófitos.

Gelose chromID™ Strepto B

No Labeto usamos o meio chromID™ Strepto B da bioMérieux.

Figura 22 – chromID™ Strepto B da bioMérieux

Este é um meio selectivo para detecção de S. agalactiae em amostras de mulheres grávidas

e de recém-nascidos (onde pode ser responsável por infecções graves). Contém várias

peptonas, 3 substractos cromogénios e antibióticos que permitem diferenciar as colónias de

S. agalactiae pela sua cor rosa pálido a vermelho. Todas as outras bactérias formam

colónias de outra cor ou não se desenvolvem.

As amostras (exsudado ano vaginal, urina da mulher) são semeadas primeiro em caldo

Todd Hewitt e após 24 horas de incubação é que são semeadas neste meio. Tem

fotossensibilidade pelo que não deve ser exposto à luz desnecessariamente. Após

incubação de 24 horas e não havendo colónias características de S. agalactiae, o meio deve

ser reincubado mais 24 horas. As colónias rosa pálido a vermelho devem ser confirmadas

com testes bioquímicos ou imunológicos (ex: Slidex® Strepto B). As colónias de outras

bactérias são inibidas ou aparecem de cor não característica: violeta, azul, etc.

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Gelose Granada

No Labeto usamos a gelose Granada da bioMérieux.

Figura 23 – Gelose Granada da bioMérieux

Este é um meio selectivo para detecção e identificação directa de Streptococcus agalactiae

nas mulheres grávidas e recém nascidos e também nas uroculturas. Contém uma base

nutritiva e também metotrexato, soro de cavalo e amido que permitem a produção de um

pigmento cor de laranja a vermelho específico das colónias de estreptococos do grupo B

hemolíticos. Uma mistura de antibióticos inibe a maioria das bactérias Gram negativo e

leveduras. Pode ser usado em alternativa ao meio chromID™ Strepto B.

Meio Löwenstein-Jensen

No Labeto usamos o meio Löwenstein-Jensen da bioMérieux.

Este meio, devido à presença de ovo, asparagina e fécula, favorece o crescimento de

micobactérias. As colónias de Mycobacterium tuberculosis têm um aspecto característico

tipo couve-flor.

Antes de fazer a sementeira neste meio é necessário proceder à fluidificação e

descontaminação da expectoração. Este tratamento destina-se a eliminar a flora comensal

com vista a favorecer o crescimento de Mycobacterium spp..

No início da incubação a 361C o tubo deve estar inclinado e a rolha ligeiramente

enroscada para evaporação dos líquidos, e só depois se mantém o tubo na vertical com

tampa rolhada, até um máximo de 60 dias. O aparecimento de colónias típicas deve ser

seguido de testes suplementares de confirmação.

Colorações

No departamento de microbiologia são usados, principalmente, dois tipos de colorações

para analisar preparações biológicas em lâmina: coloração de Gram e coloração de Ziehl-

Neelsen modificada. Estas colorações são efectuadas no equipamento Mirastainer da

Merck.

48

Coloração de Gram

Faz parte do esquema laboratorial de todos os produtos biológicos de origem humana.

Permite avaliar a presença de bactérias Gram negativo e Gram positivo assim como de

outros componentes como leveduras, células epiteliais, leucócitos e outros. A distinção

entre bactérias Gram positivo e negativo permite orientar o esquema laboratorial e facilitar

ou até ditar o diagnóstico laboratorial.

No fundamento desta técnica estão as características estruturais da parede bacteriana: nas

bactérias Gram positivo o complexo violeta de genciana e lugol não consegue sair da

bactéria (descorando com álcool acetona) devido à parede bacteriana com peptidoglicanos

e nas bactérias Gram negativo esse complexo é eliminado e substituído por fucsina diluída.

Ou seja, as bactérias Gram positivo aparecem violetas e as Gram negativo vermelhas.

Embora uma bactéria Gram negativo nunca possa corar positivamente pelo Gram, uma

bactéria estruturalmente Gram positivo pode corar negativamente se a sua parede de

peptidoglicano for destruída ou danificada (ex. envelhecimento celular ou acção de

lisozimas).

Gram positivo Gram negativo

Figura 24 – Coloração de Gram

Coloração de Ziehl-Neelsen modificada

Este tipo de coloração pode ser usado no esquema laboratorial de preparações biológicas

de várias origens. Permite evidenciar a presença de bactérias álcool ácido resistentes (ex:

bacilo de Koch – tuberculose) assim como de outros componentes (células, leveduras,

leucócitos e outros). A presença deste tipo de bactérias orienta o diagnóstico laboratorial.

O fundamento desta técnica reside no facto de a parede destas bactérias serem pouco

permeáveis a corantes simples: conseguem reter o corante carbol-fucsina e resistem à sua

descoloração por álcool e ácidos fortes. Todas as outras estruturas são coradas com azul de

metileno. Assim, as bactérias álcool ácido resistentes aparecem vermelhas e o resto da

preparação azul.

Coloração eosina/nigrosina

Esta coloração usa uma solução de eosina/nigrosina a 10% e é usada para a determinação

do índice de vitalidade dos espermatozoides. Os espermatozoides vivos aparecem com a

cabeça branca e os mortos aparecem com a cabeça vermelha: apenas as células mortas

incorporam a eosina.

49

Figura 25 – Coloração de eosina/nigrosina

Testes bioquímicos complementares

Para além do crescimento e isolamento de bactérias em meios de cultura selectivos e

cromogénios, é necessário proceder a alguns testes complementares para identificação das

estirpes: testes bioquímicos e de identificação de enzimas ou testes de identificação directa

da bactéria.

Teste da Catalase

No Labeto usamos o Reagente ID Color Catalase (ID-ASE) da bioMérieux.

Este teste revela a produção de catalase pela bactéria em presença de água oxigenada pela

observação de libertação de bolhas de oxigénio cuja reacção é mais estável e visível devido

à presença de um agente espessante. Um teste positivo revela bactérias catalase positivo

(ex: estafilococos) e um teste negativo bactérias catalase negativo (ex: estreptococos).

Devemos evitar colónias em gelose sangue para evitar falsos positivos.

Figura 26 – Reacção da catalase

Teste da Oxidase

No Labeto usamos o teste da oxidase da bioMérieux.

Este teste revela a produção da enzima oxidase na presença de oxigénio da atmosfera e

citocromo C pela oxidação da fenilenodiamina, formando um composto violeta (indofenol). O

ácido ascórbico presente no reagente limita a auto oxidação e melhora a estabilidade. Não

devemos usar ansa metálica para evitar falsos positivos.

Bactérias com teste oxidase positivo: géneros Neisseria, Aeromonas, Pseudomonas (com

excepção de Stenotrophomonas maltophilia) e Flavobacterium. As reacções tardias ou a

50

ausência de cor indicam bactérias oxidase negativo (ex: enterobactérias, Acinetobacter,

Xanthomonas).

Figura 27 – Reacção da oxidase

Teste da Coagulase

No Labeto usamos o teste Slidex® Staph Plus da bioMérieux.

Este teste evidencia a presença da enzima coagulase usando anticorpos monoclonais

dirigidos contra as estruturas periféricas específicas de Staphylococcus aureus. É um teste

rápido de aglutinação de partículas de látex azul sensibilizadas com fibrinogénio humano e

anticorpos monoclonais. Na presença de bactérias de Staphylococcus (assegurado com

morfologia, Gram e catalase) observa-se uma aglutinação a olho nú com o reagente R1 e

sem aglutinação com reagente R2 (controlo negativo) em 30 segundos. Num teste negativo,

não aparece qualquer aglutinação.

R1 R2.

Figura 28 – Reacção da coagulase

Teste do Indol

No Labeto usamos o teste ID Indol TDA da bioMérieux.

Este teste detecta a presença de indol e da triptofano desaminase (TDA) permitindo

diferenciar as enterobactérias presuntivamente (colónias castanho a castanho escuro em

meio chromIDTM CPS®). As bactérias que degradam o triptofano libertam indol que origina

uma coloração azul quando adicionadas de reagente R1 (Proteus indologénio, Providencia

ou Morganella). As bactérias em meio ureia indol que contêm triptofano desaminase

degradam o triptofano libertando ácido indol pirúvico que origina coloração castanha com o

reagente R2 (Proteus mirabilis se teste de oxidase é negativo).

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Teste para Estreptococos

No Labeto usamos dois testes para estreptococos: SLIDEX® Strepto Plus A e SLIDEX®

Strepto Plus B, ambos da bioMérieux.

São testes rápidos de aglutinação de micropartículas de poliestireno para a grupagem de

bactérias estreptococos do grupo A (sendo o mais importante o Streptococcus pyogenes

beta hemolítico) e do grupo B (como por exemplo o Streptococcus agalactiae beta ou gama

hemolítico) segundo a classificação de Lancefield. As partículas de látex dos reagentes

estão sensibilizadas com anticorpos dirigidos contra os antigénios do grupo bacteriano e, em

contacto com os antigénios extraídos da bactéria correspondente, provoca aglutinação

visível. Devemos sempre assegurar-nos previamente que se trata de um Streptococcus

pelas reacções clássicas (morfologia, Gram, catalase, hemólise).

Teste Slidex® Pneumo-Kit

No Labeto usamos este teste da bioMérieux.

É um teste rápido de aglutinação de partículas de latex para a identificação de estirpes de

Streptococcus pneumoniae (alfa hemólise). Devemos sempre assegurar-nos previamente

que se trata de um Streptococcus pelas reacções clássicas (morfologia, Gram, catalase,

hemólise). Um resultado positivo obtém-se quando há aglutinação das bactérias com as

partículas de látex anti S. pneumoniae do reagente R1 e ausência de aglutinação com o

reagente R2 (controlo negativo).

Teste EPEC- E. coli enteropatogénica

No Labeto usamos o teste Antiserum Escherichia coli Nonavalent da BioRad.

É um teste de aglutinação rápido para detecção de antigénios somáticos O da EPEC,

responsável por diarreias nas crianças até 2 anos. Partimos de colónias suspeitas de EPEC

(normalmente culturas puras ou predomínio de Gram negativos) com repicagem para gelose

nutritiva e na junção com o reagente em lâmina obtemos aglutinação imediata.

Teste anti Shigella

No Labeto usamos o teste Shigella Antiserum Poly da BD - DifcoTM.

Este teste é um antisoro polimicrobiano para identificação de espécies de Shigella por

aglutinação. As colónias suspeitas de Shigella a partir de meios de diferenciação selectivos

(ex: Hektoen ou SS) são repicadas para meio não selectivo (gelose Nutritiva). Eliminar o

factor autoaglutinação através de emulsão da colónia com solução salina estéril: se aglutina,

devemos reisolar a bactéria novamente. Se não aglutinar, prosseguir para mistura com

reagente antisoro. Se com o reagente não aglutinar ou houver aglutinação fraca, podem

existir antigénios interferentes: eliminar com aquecimento da suspensão bacteriana a 100ºC

por 15-60 minutos. Centrifugar e usar o sobrenadante para novo teste de aglutinação.

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Teste anti Salmonella

No Labeto usamos o teste Salmonella Antiserum O e VI da Difco TM.

Este teste é um antisoro polimicrobiano para identificação de espécies de Salmonella por

aglutinação. O procedimento é semelhante ao teste anti Shigella.

Teste para antibiograma de Haemophilus e Moraxella (Branhamella)

No Labeto usamos a galeria ATBTMHaemo EU da bioMérieux.

Esta galeria contém cúpulas com meio semi sólido com antibióticos adequados (ampicilina,

amoxicilina, cefalotina, tetraciclina, ofloxacina, “cotrimoxazol” - trimetoprim-sulfametoxazol,

cloranfenicol, cefuroxima, rifampicina, cefotaxima e ofloxaxina) em várias concentrações às

que se adiciona uma suspensão da bactéria a analisar. Após incubação (18-24 horas a

361C em aerobiose), a leitura do crescimento é feita visualmente pela turvação,

classificando a estirpe como sensível, intermédia ou resistente, comparando com a cúpula

de crescimento padrão.

O teste CFT (cefalotina) presente na galeria ATB HAEMO permite facilitar a detecção das

estirpes de Haemophilus influenzae de sensibilidade diminuída às ß-lactaminas e não

produtoras de ß-lactamase, embora este resultado e classificação não deva ser reportado

ao clínico uma vez que não permite prever o sucesso ou insucesso terapêutico. É

aconselhado verificar a ausência de ß-lactamase com um teste cromogénio (ex. CefinaseTM

da bioMérieux) para as estirpes que parecem sensíveis à ampicilina (AMP). Em caso de

positividade do teste, o resultado da ampicilina deve ser interpretado como resistente. No

Haemophilus influenzae de sensibilidade diminuída às ß-lactaminas e não produtores de ß-

lactamases, um resultado R ou I em vez de S pode ser obtido com esta galeria para os

antibióticos tendo uma actividade diminuída face a este mecanismo de resistência: cefaclor

(CEC) e cefuroxima (CXM).

Teste para antibiograma de estreptococos e pneumococos

No Labeto usamos a galeria ATBTM STREP 5 da bioMérieux.

Esta galeria contém cúpulas com meio semi sólido com antibióticos adequados (penicilina

pneumo, penicilina strepto, amoxicilina pneumo, cefotaxima pneumo, cefotaxime strepto,

eritromicina, quinupristina-dalfopristina, clindamicina, tetraciclina, levofloxacina,

cloranfenicol, vancomicina, cotrimoxazol) em várias concentrações às que se adiciona uma

suspensão da bactéria a analisar. Após incubação (18-24 horas a 361C em aerobiose), a

leitura do crescimento é feita visualmente pela turvação, classificando a estirpe como

sensível, intermédia ou resistente, comparando com a cúpula de crescimento padrão. O

resultado obtido permite classificar a estirpe como sensível, intermédia ou resistente ou

fornecer uma CMI para os S. pneumoniae (penicilina, cefotaxima): a CMI corresponde à

mais baixa concentração sem cultura visível.

53

Teste para Mycoplasma hominis/Ureaplasma spp

No Labeto usamos a galeria Mycoplasma IST2 da bioMérieux.

Este teste permite a cultura, identificação, contagem indicativa e a determinação de

sensibilidade aos antibióticos (doxiciclina, josamicina, ofloxacina, eritromicina, tetraciclina,

ciprofloxacina, azitromicina, claritromicina e pristinamicina) de Ureaplasma spp. e de

Mycoplasma hominis. A espécie Ureaplasma urealyticum foi dividida em 2 novas espécies

designadas por Ureaplasma parvum e Ureaplasma urealyticum. Ao utilizar a galeria, são

consideradas as duas como Ureaplasma spp. A zaragatoa com a amostra vaginal ou uretral

é agitada no reagente R1 (meio transporte selectivo) e depois introduzida no R2 (caldo de

inoculação com ureia para U. urealyticum e arginina para M. hominis). Este caldo é

inoculado na galeria, os poços são fechados com parafina e tanto a galeria como o frasco

vão a incubar durante 24 e 48 horas a 361C. A leitura é feita, seguindo as instruções do

teste, às 24 horas e às 48 horas.

Testes semi automáticos de identificação e sensibilidade aos antibióticos

Figura 29 – Vitek 2 XL

No Labeto usamos o equipamento Vitek 2 XL da bioMérieux.

É um equipamento semi automático que utiliza cartas com vários substratos que

desencadeiam reacções bioquímicas detectadas por colorimetria para identificação de

bactérias. Para a sensibilidade aos antibióticos, as bactérias são colocadas em contacto

com os vários antibióticos e o crescimento é monitorizado ao longo do tempo pelo

equipamento, usando cartas com diferentes antibióticos consoante a bactéria em causa. O

equipamento dispõe de um sistema AES (Advanced Expert System) que incorpora um

conjunto de regras de acordo com a metodologia do Clinical and Laboratory Standards

Institute (CLSI) e fenótipos conhecidos de mecanismos de resistência permitindo uma leitura

interpretativa do antibiograma.

As cartas que utiliza para identificação são GN (para bactérias Gram negativas), GP (para

bactérias Gram positivas), NH (para a identificação de Neisseria, Haemophilus e Moraxella)

e YST (para a identificação de leveduras). As cartas disponíveis para antibiograma são AST-

222 (para Pseudomonas ou outras bactérias com mais resistências), AST-244 (para

enterobactérias Gram negativas), AST-192 (para bactérias Gram negativas de produtos

54

biológicos que não urina), AST-619 (para Staphylococcus), AST-586 (para Enterococcus), e

AST-01 (para Streptococcus grupo A e B).

Testes manuais de identificação e sensibilidade aos antibióticos

No Labeto usamos o meio de Mueller Hinton com sangue de carneiro com discos de

antibióticos: aminopenicilinas com e sem inibidores de β-lactamases, cefalosporinas de

várias gerações, aminoglicosídeos, carboxipenicilinas com e sem inibidores de β-

lactamases, ureiodopenicilinas com e sem inibidores de β-lactamases, monobactâmicos,

tetraciclinas, polipeptídeos, macrólidos, oxazolidona, glicopeptídeos, quinolonas,

fluoroquinolonas, furanos, fosfomicina e trimetropim/sulfamidas. A classificação em sensível,

intermédio e resistente depende da medida dos halos de inibição de crescimento obtidos

usando as regras CLSI e fenótipos conhecidos de mecanismos de resistência.

Esquemas laboratoriais

Urina

A pesquisa de bactérias presentes nas amostras de urina consiste em fazer inicialmente um

exame directo do sedimento urinário (quantificação de células epiteliais, leucócitos,

eritrócitos, bactérias, fungos, etc realizado no equipamento AutionMax e SediMax da

Menarini) e sementeira em meio de cultura chromID CPS Elite. Consoante o sedimento e a

cultura seja positiva ou negativa ou em caso de dúvida, faz-se uma coloração de Gram e/ou

Ziehl-Neelsen a partir do sedimento urinário.

O agente etiológico mais frequente das infecções do tracto urinário é Escherichia coli.

Outros microrganismos responsáveis por estas infecções são Klebsiella spp., Proteus spp. e

Staphylococcus spp.. Na urocultura de rotina não se faz a pesquisa de Chlamydia

trachomatis, Mycobacterium tuberculosis (faz-se coloração Ziehl-Neelsen quando há muitos

leucócitos e/ou eritrócitos sem bacteriúria), Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum

ou anaeróbios.

O meio de cultura inoculado é incubado durante 18 a 24 horas a 361ºC, sendo depois

observado e quantificado o crescimento de colónias seguindo o esquema seguinte:

Figura 30 – Contagem UFC

103 104 105 106 107

Contaminação

provável

Infecção

provável

55

Com um número de colónias <104 consideramos contaminação (confirmar com Gram e

Ziehl-Neelsen se sedimento positivo) e terminamos a análise. Entre 104 e <105

consideramos duvidoso e teremos que analisar o resultado do sedimento e outras

informações para prosseguir o esquema laboratorial. Pode ser necessário a repetição da

colheita para confirmação. Com colónias acima ou de 105 de uma cultura pura,

consideramos infecção urinária.

Seguimos as orientações do meio de cultura chromID CPS Elite:

E. coli - colónias rosas a vermelho escuro (não necessita identificação no Vitek) e teste indol

positivo prossegue com carta AST-244 para antibiograma.

Género Proteus - colónias castanho claro a castanho escuro podendo exibir algum

“swarming”. Se teste indol for negativo é identificado Proteus mirabilis presuntivamente, não

sendo necessário carta de identificação, prosseguindo com carta AST-244 para

antibiograma. Com teste indol positivo (Proteus indol +, Morganella, Providencia) fazer teste

de identificação com carta GN e carta AST-244 para antibiograma.

Grupo KESC (Klebsiella, Enterobacter, Serratia e Citrobacter) - colónias verde acastanhado,

grandes e mucóides. Fazer teste de identificação com carta GN e carta AST-244 para

antibiograma.

Pseudomonas aeruginosa - colónias pigmentadas, esbranquiçadas com odor característico

(sabão azul e branco), podendo ficar o meio esverdeado. São positivas no teste da oxidase

e segue com carta GN para identificação e AST-222 para antibiograma.

Enterococcus spp - colónias pequenas azul turquesa a esverdeadas com pequeno halo.

Fazer carta GP para identificação de cocos Gram positivo e carta AST-586 para

antibiograma.

Staphylococcus spp. - colónias amarelas (Staphylococcus aureus) ou brancas

(Staphylococcus coagulase negativa). São catalase positivo e podemos prosseguir para

teste Pastorex Staph Plus ou carta GP para identificação e depois carta AST-619 para

antibiograma.

Streptococcus agalactiae - colónias violeta, azul pálido, rosas ou brancas. As colónias

violeta presuntivamente identificam S. agalactiae podendo ser confirmado com teste Slidex

Strepto ou cultura em meio Granada. Prosseguir com carta GP para identificação (se

necessário) e depois carta AST-01 ou galeria ATBTM Strep 5 para antibiograma.

Candida spp. - colónias brancas com presença de leveduras no exame directo. Prosseguir

com carta YST para identificação.

Exsudado vaginal

O exame bacteriológico do exsudado vaginal começa com um exame directo em lâmina a

partir da zaragatoa seca com soro fisiológico para determinar a presença de células

epiteliais, leucócitos, eritrócitos, bactérias, leveduras e Trichomonas vaginalis e com dois

esfregaços corados por Gram e azul de metileno. A sementeira de meios de cultura está

56

orientada para a pesquisa de Neisseria gonorrhoeae, Streptococcus β-hemolítico do Grupo

B (na grávida) e Candida spp. podendo ser usados outros meios consoante a orientação

clínica (Chlamydia trachomatis, Mycoplasma spp, Haemophilus ducreyi, Ureaplasma spp.,

Listeria monocytogenes e anaeróbios).

Usualmente semeamos para: meio de gelose sangue (pesquisa de Streptococcus), meio

chromID Candida (pesquisa de leveduras), meio de gelose chocolate (pesquisa de

gonococos) e meio manitol (pesquisa de Staphylococcus).

O diagnóstico de Gardnerella vaginalis pode ser confirmado pela presença de 3 dos 4

critérios: corrimento vaginal branco-acinzentado, homogéneo e não inflamatório; presença

de “clue-cells” no exame microscópico; pH do exsudado vaginal > 4,5 e teste da amina

positivo (cheiro a peixe após adição de soluto de potassa cáustica KOH 10%). Não se faz

antibiograma: tratamento com metronidazol.

Para o diagnóstico de Mycoplasma spp e Ureaplasma spp. usamos o líquido R1 do kit (onde

foi agitada a zaragatoa na altura da colheita) e passa-se para o caldo de inoculação R2 do

kit. Este caldo é usado para inoculação da galeria que vai a incubar e é lida às 24 horas e às

48 horas.

No geral, os meios de cultura inoculados são lidos após incubação de 24, 48 ou 72 horas.

Neisseria gonorrhoeae – exame microscópico com diplococos Gram negativo, crescimento

puro em meio gelose chocolate (às 24, 48 ou 72 horas de incubação), oxidase positivo e

confirmação de identificação com carta NH no Vitek. Não necessita antibiograma:

tratamento empírico.

Streptococcus agalactiae – inocular caldo Todd Hewitt e após 24 horas de incubação passar

para meio chromID Strepto B. Leitura às 24 e 48 horas: colónias rosa pálido a vermelho,

grupagem positiva com teste Slidex Strepto B e antibiograma com carta AST-01 no Vitek ou

galeria ATB Strep 5.

Candida spp – obtenção de colónias verdes a azuladas em chromID Candida identifica

presuntivamente Candida albicans. Obtendo colónias brancas, seja às 24 ou 48 horas de

incubação, devemos prosseguir com identificação com carta YST no Vitek. O antifungigrama

só é feito se pedido pelo clínico.

Exsudado Uretral

O exame bacteriológico do exsudado uretral começa com um exame directo em lâmina a

partir da zaragatoa seca com soro fisiológico para determinar a presença de células

epiteliais, leucócitos, eritrócitos, bactérias, leveduras e Trichomonas vaginalis e com dois

esfregaços corados por Gram e azul de metileno. A sementeira de meios de cultura está

orientada para a pesquisa de Neisseria gonorrhoeae, Enterobacteriaceae, Pseudomonas

spp. e Candida spp. podendo ser usados outros meios consoante a orientação clínica

(Chlamydia trachomatis, Mycoplasma spp, Haemophilus ducreyi, Ureaplasma spp., Listeria

monocytogenes e anaeróbios).

57


chromID Candida (pesquisa de leveduras), meio de gelose chocolate (pesquisa de

gonococos), meio manitol (pesquisa de Staphylococcus) e meio MacConkey (pesquisa de

Enterobacteriaceae e Pseudomonas spp.).

O diagnóstico de Gardnerella vaginalis e de Mycoplasma spp e Ureaplasma spp. é feito

como para o exsudado vaginal.

No geral, os meios de cultura inoculados são lidos após incubação de 24, 48 ou 72 horas.


puro em meio gelose chocolate (às 24, 48 ou 72 horas de incubação), oxidase positivo e



Enterobacteriaceae – obtenção de cultura pura em MacConkey, identificação com carta GN

e antibiograma com carta AST-244 no Vitek.

Pseudomonas spp. – obtenção de cultura pura em MacConkey, oxidase positivo,

identificação com carta GN e antibiograma com carta AST-222 no Vitek.





Exsudado nasal

O exame bacteriológico do exsudado nasal começa com esfregaço corado por Gram. A

sementeira de meios de cultura está orientada para a pesquisa de Staphylococcus aureus

(especialmente Staphylococcus aureus meticilina resistente), Streptococcus -hemolítico do

grupo A de Lancefield, Streptococcus pneumoniae, Moraxella spp., podendo ser usados

outros meios consoante a orientação clínica.

Usualmente semeamos para: meio de gelose sangue (pesquisa de Streptococcus) incubado

em atmosfera de CO2, meio chromID Candida (pesquisa de leveduras) e meio manitol

(pesquisa de Staphylococcus). No geral, os meios de cultura inoculados são lidos após

incubação de 24 ou 48 horas.

Staphylococcus aureus – obtendo bastantes colónias amarelas, grupagem positiva com

teste Pastorex Staph Plus e antibiograma com carta AST-619 no Vitek.

Moraxella spp. – cocobacilos Gram negativo, oxidase positiva e identificação com carta NH

no Vitek. Não necessita antibiograma: tratamento empírico.

Streptococcus β-hemolítico – colónias com hemólise beta, grupagem positiva com teste

Slidex Strepto A e antibiograma com carta AST-01 no Vitek ou galeria ATB Strep.

Streptococcus pneumoniae – colónias com hemólise alfa, grupagem positiva com teste

Slidex pneumokit e antibiograma com galeria ATBTM Strep 5.

58

Candida spp - obtenção de colónias verdes a azuladas em chromID Candida identifica




Exsudado orofaríngeo

O exame bacteriológico do exsudado orofaríngeo começa com esfregaço corado por Gram.

A sementeira de meios de cultura está orientada para a pesquisa de Streptococcus -

hemolítico do grupo A de Lancefield, podendo ser usados outros meios consoante a

orientação clínica (Neisseria gonorrhoeae, Bordetella pertussis e Corynebacterium

diphtheriae).

Usualmente semeamos para: meio de gelose sangue (pesquisa de Streptococcus) incubado

em atmosfera de CO2, meio chromID Candida (pesquisa de leveduras), meio manitol

(pesquisa de Staphylococcus) e meio Todd Hewitt para subcultura para gelose sangue às 24

horas. No geral, os meios de cultura inoculados são lidos após incubação de 24 ou 48

horas.

Streptococcus β-hemolítico - colónias com hemólise beta, grupagem positiva com teste


Staphylococcus aureus - obtendo bastantes colónias amarelas, grupagem positiva com teste

Pastorex Staph Plus e antibiograma com carta AST-619 no Vitek.

Moraxella spp. - cocobacilos Gram negativo, oxidase positiva e identificação com carta NH


Streptococcus pneumoniae - colónias com hemólise alfa, grupagem positiva com teste






Exsudado auricular

O exame bacteriológico do exsudado auricular começa com esfregaço corado por Gram. A

sementeira de meios de cultura está orientada para a pesquisa de Streptococcus

pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Haemophilus influenzae e leveduras, podendo ser

usados outros meios consoante a orientação clínica (S. aureus, Moraxella spp.,

Enterobacteriaceae).

Usualmente semeamos para: meio de gelose sangue (pesquisa de estreptococos), meio

chromID Candida (pesquisa de leveduras), meio Sabouraud Gentamicina Cloranfenicol em

tubo (pesquisa de fungos), meio manitol (pesquisa de estafilococos), meio MacConkey e

59

meio gelose chocolate (incubação em atmosfera CO2). No geral, os meios de cultura

inoculados são lidos após incubação de 24, 48 horas e 5 dias.



Streptococcus β-hemolítico - colónias com hemólise beta, grupagem positiva com teste


Haemophilus influenzae – colónias transparentes na gelose chocolate, identificação com a

carta NH no Vitek e antibiograma na galeria ATBTMHaemo.





Pseudomonas spp. – oxidase positiva, identificação com a carta GN no Vitek e antibiograma

com carta AST-222 no Vitek.





Fungos filamentosos - fazer a identificação através de observação microscópica. O

antifungigrama só é feito se pedido pelo clínico.

Exsudado ocular

O exame bacteriológico do exsudado ocular começa com esfregaço corado por Gram. A

sementeira de meios de cultura está orientada para a pesquisa de Staphylococcus aureus,

Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Neisseria

gonorrhoeae, Moraxella spp., Klebsiella pneumoniae e outras Enterobacteriaceae,

Pseudomonas aeruginosa, podendo ser usados outros meios consoante a orientação

clínica.

Usualmente semeamos para: meio de gelose sangue (pesquisa de Streptococcus spp),

meio chromID Candida (pesquisa de leveduras), meio manitol (pesquisa de Staphylococcus

spp), meio MacConkey (Enterobacteriaceae) e meio gelose chocolate Haemo e VCAT (para

pesquisa de gonococos nos recém nascidos) ambos com incubação em atmosfera CO2. No

geral, os meios de cultura inoculados são lidos após incubação de 24, 48 e 72 horas.


Slidex Staph Plus e antibiograma com carta AST-619 no Vitek.

Haemophilus influenzae - colónias transparentes na gelose chocolate, identificação com a


60



Streptococcus pyogenes – colónias com hemólise beta, grupagem positiva com teste Slidex

Strepto Kit e antibiograma com galeria ATBTM Strep 5.

Neisseria gonorrhoeae - exame microscópico com diplococos Gram negativo, crescimento

puro em meio gelose chocolate (ás 24, 48 ou 72 horas de incubação), oxidase positivo e





Pseudomonas spp. - oxidase positiva, identificação com a carta GN no Vitek e antibiograma


Klebsiella pneumoniae e eventualmente outros Gram negativos - identificação com a carta

GN no Vitek e antibiograma com carta AST-244.





Exsudado purulento

O exame bacteriológico de exsudados purulentos (feridas e secreções) começa com

esfregaço corado por Gram. A sementeira de meios de cultura está orientada para a

pesquisa de Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Enterobacteriaceae,

Candida spp. e Pseudomonas spp., podendo ser usados outros meios consoante a

orientação clínica (Haemophilus ducreyi, Treponema pallidum, dermatófitos).


chromID Candida (pesquisa de leveduras), meio manitol (pesquisa de Staphylococcus) e

meio MacConkey (Enterobacteriaceae). No geral, os meios de cultura inoculados são lidos

após incubação de 24 e 48 horas.



Streptococcus pyogenes – colónias com hemólise beta, grupagem positiva com teste Slidex

Strepto Kit e antibiograma com galeria ATBTM Strep 5.





61



Fezes

Para o exame bacteriológico de amostras de fezes começamos por fazer um exame directo

com coloração de Gram para avaliação da flora predominante (Gram positivos e negativos

além de leveduras). Com a sementeira da amostra em vários meios de cultura pretendemos

detectar os microrganismos patogénicos causadores de infecções do tracto gastrointestinal:

Salmonella, Shigella, Campylobacter spp., E. coli enteropatogénica (crianças<2 anos), S.

aureus e leveduras. Na coprocultura de rotina não se faz a pesquisa de anaeróbios.

A partir das amostras de fezes, colher se possível na parte com muco, pus ou sangue, fazer

uma suspensão em soro fisiológico estéril e semear nos meios Hektoen ou SS (pesquisa de

Salmonella e Shigella), Campylosel (pesquisa de Campylobacter), Manitol Salt Agar

(pesquisa de Staphylococcus aureus) e inocular também o meio Tetrationato (com 2-3 gotas

de Lugol). Tratando-se de uma criança com idade inferior ou igual a dois anos semeia-se

também em meio de gelose para bacilos Gram negativos (Mac Conkey para pesquisa de

Escherichia coli enteropatogénica O157-H7). Se pedido, devemos semear em meio chromID

Candida para pesquisa de leveduras. Os meios devem incubar na estufa a 361C durante

18 (SS, Hektoen e MacConkey) a 48 horas (chromID Candida) e Campylosel a 42ºC entre

48 a 72h em microaerofilia. Devemos sempre semear para isolamento a partir do meio

incubado de enriquecimento tetrationato para os meios SS ou Hektoen e reincubar 24 horas

a 361C para maiores hipóteses de isolamento.

Se existirem colónias suspeitas no meio SS ou Hektoen fazer o teste ureia-indol. Se urease

negativo, repicar as colónias suspeitas para o meio de gelose nutritiva. A partir da gelose

nutritiva fazer reacções de aglutinação para Salmonella (Difco TM Salmonella O Antisoro),

Shigella (Difco Shigella Antisoro Poly). Se der positivo usar carta de identificação e

antibiograma no Vitek.

Com colónias suspeitas de E. coli enteropatogénica na gelose MacConkey, devemos repicar

para gelose nutritiva. Incubar 24 horas a 361C e fazer teste com antisoro de despiste. As

E. coli enteropatogénicas estão normalmente em culturas puras e no Gram das fezes é

observado um predomínio de Gram negativos. Não é feito antibiograma, porque bactéria

liberta uma toxina que torna necessário a ida para o hospital para hidratação. Se positivo

comunicar de imediato ao clínico e/ou utente.

Se no meio de Campylosel obtivermos colónias suspeitas de Campylobacter devemos fazer

o teste da oxidase e confirmar identificação com carta no Vitek.

Nas colónias de Staphylococcus aureus obtidas só devemos fazer antibiograma se o

número for significativo.

62

Expectoração

O exame bacteriológico da expectoração começa com esfregaços corados por Gram e Ziehl

Neelsen. A coloração de Ziehl Neelsen é o exame directo usado para a pesquisa de bacilos

álcool ácido resistentes (BAAR), nomeadamente micobactérias como o Bacilo de Koch (BK).

A sementeira de meios de cultura está orientada para a pesquisa de Staphylococcus aureus,

Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Moraxella spp., Klebsiella pneumoniae

e eventualmente outros Gram negativos, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter

baumannii, fungos, podendo ser usados outros meios consoante a orientação clínica.

Usualmente semeamos para: meio de gelose sangue (pesquisa de estreptococos) incubado

em atmosfera de CO2, meio chromID Candida (pesquisa de leveduras), meio Sabouraud

Gentamicina Cloranfenicol 2 (em tubo), meio Manitol (pesquisa de estafilococos), meio

MacConkey (Enterobacteriaceae) e meio chocolate Haemophilus também incubado em

atmosfera de CO2. Toda a manipulação da amostra deve ser feita em câmara de fluxo

laminar. No geral, os meios de cultura inoculados são lidos após incubação de 24, 48 e 72

horas e 5 dias (para meio SGC).



Haemophilus influenzae - colónias transparentes na gelose chocolate, identificação com a








Klebsiella pneumoniae e eventualmente outros Gram negativos - identificação com a carta

GN no Vitek e antibiograma com carta AST-244.

Candida spp. - obtenção de colónias verdes a azuladas em chromID Candida identifica




Fungos filamentosos - fazer a identificação através de observação microscópica e

macroscópica. O antifungigrama só é feito se pedido pelo clínico.

BK - no caso de ser pedido exame cultural de BK semeamos para meio de Lowenstein

Jensen, após a amostra ter sido fluidificada e descontaminada. O meio é incubado durante

60 dias (oito semanas) na estufa a 361C. Durante este tempo, ir observando o

crescimento das colónias e ir arejando os tubos. Para tal, deve-se aliviar a rosca sem, no

entanto, abrir o tubo, e voltar a enroscar (semianaerobiose). Quando se observar

crescimento de colónias suspeitas, geralmente “excrecentes”, rugosas, secas, cor de couro,

63

com aspecto de “couve flor” fazer um esfregaço em lâmina nova (sempre na câmara de

fluxo laminar) e corar pelo Ziehl Neelsen para confirmação.

Esperma

O exame bacteriológico do esperma começa com esfregaços corados por Gram e Ziehl

Neelsen. A sementeira de meios de cultura está orientada para a pesquisa de Neisseria

gonorrhoeae, Enterococcus spp., Staphylococcus aureus, Enterobacteriaceae, podendo

ser usados outros meios consoante a orientação clínica.

Usualmente semeamos para: meio de gelose sangue (pesquisa de Enterococcus) incubado

em atmosfera de CO2, meio chromID Candida (pesquisa de leveduras), meio de gelose

chocolate (pesquisa de gonococos) também incubado em atmosfera de CO2, meio manitol

(pesquisa de Staphylococcus) e meio MacConkey (pesquisa de Enterobacteriaceae). No

geral, os meios de cultura inoculados são lidos após incubação de 24, 48 ou 72 horas.


puro em meio gelose chocolate (ás 24, 48 ou 72 horas de incubação), oxidase positivo e



Enterobacteriaceae – obtenção de cultura pura em MacConkey, identificação com carta GN

e antibiograma com carta AST-244 no Vitek.



Enterococcus spp - colónias pequenas azul turquesa a esverdeadas com pequeno halo.

Fazer carta GP para identificação de cocos Gram positivo e carta AST-586 para

antibiograma.





Pesquisa de fungos não leveduriformes ou filamentosos

A procura de infecções provocadas por Dermatófitos é mais comum no caso de pele e

faneras (cabelo, pelo, unhas) e por Aspergillus no caso de expectorações e exsudados

auriculares.

A pesquisa de Dermatófitos engloba dois tipos de exames: exame directo e exame cultural.

Para o exame directo, observam-se ao microscópico preparações do tecido queratinoso

parcialmente digerido e tornado transparente com uma solução de hidróxido de potássio a

30% aquecidas ligeiramente, sem ferver, à chama e actuando por 10 a 20 minutos (para os

cabelos esperar cerca de 10 min, para escamas de pele e fragmentos de unhas 20 minutos,

para as unhas, esperar várias horas se necessário). Na pele com suspeita de pitiríase

64

versicolor – Malassezia furfur (áreas hipo ou hiperpigmentadas) o exame directo usa o

raspado da pele em lâmina com gota de KOH 30% (deixar actuar 20 minutos ou mais) ou a

fita cola directamente entre lâmina e lamela procurando a presença de esporos em cachos

associados a hifas encurvadas, espessas e curtas – “esparguete com almôndegas”. Neste

caso a sementeira em meios de cultura será negativa porque é preciso um meio especial

não usual, com azeite, para este fungo se desenvolver. Sendo assim o exame directo é

conclusivo.

A outra parte da amostra é usada para a sementeira em meio Sabouraud com os

antibióticos gentamicina e cloranfenicol para inibirem o crescimento de bactérias e em

gelose Sabouraud Cloranfenicol Actidiona. A actidiona inibe algumas espécies de leveduras

e fungos filamentosos (inibe principalmente fungos contaminantes ex: Penicillium). As

zaragatoas são agitadas no meio de sabouraud líquido: caso haja crescimento é depois

repicado para meio sólido. Os meios devem ser incubados à temperatura ambiente (18-25

C) durante 3 semanas a um mês. Observar o crescimento de colónias de 5 em 5 dias.

Caso haja crescimento, fazer a identificação dos microrganismos pela velocidade de

crescimento e pela morfologia macro (textura da superfície e produção de pigmentos) e

microscópica (elementos micelianos, frutificações e ornamentações), onde se observa ao

microscópico uma preparação em lâmina com uma gota de azul de lactofenol e um pouco

da colónia isolada com uma ansa estéril ou usar fita cola para colher o micélio aéreo onde

se encontram macroconídeos. Se houver dificuldade em observar estruturas, repica-se para

o meio de Malte: consegue-se obter melhores frutificações dos fungos.

Para a pesquisa de Aspergillus devemos semear um tubo de Sabouraud simples e aguardar

até 5 dias e fazer a identificação pela velocidade de crescimento e pela morfologia

macroscópica (textura e pigmentação) e microscópica (observação das estruturas típicas de

Aspergillus).

Pesquisa de ovos, quistos e parasitas

A pesquisa de parasitas na área da mibrobiologia pode ser feita em várias amostras

biológicas: urina e fezes. Na urina pesquisamos Schistosoma haematobium e nas fezes são

vários os parasitas pesquisados, embora os mais frequentes sejam quistos de Giardia

lamblia, quistos de Entamoeba coli e Entamoeba hartmanni, ovos de Enterobius vermicularis

e ovos de Ascaris lumbricoides.

Pesquisa de parasitas nas fezes

A pesquisa de parasitas nas fezes começa pelo exame macroscópico em relação à

consistência das fezes e à visualização macroscópica de parasitas.

O exame microscópico incide sobre uma montagem directa das fezes em solução salina e

sobre um sedimento de fezes obtido por uma técnica de concentração: uma parte das fezes

é adicionada de solução tampão de ácido acético, misturada e filtrada através de palha de

aço. Ao filtrado adiciona-se igual volume de éter, agita-se e é centrifugado 5 minutos a 2500

65

rpm. Obtemos três camadas, mas eliminamos todo o sobrenadante. O sedimento é então

observado ao microscópio em objectiva de 10x e 40x.

Este procedimento não se aplica à pesquisa de Cryptosporidium ou Microsporidia pois

requerem o uso de técnicas de coloração apropriadas.

Para a pesquisa orientada de Enterobius vermicularis podemos usar a técnica da fita cola: a

face adesiva da fita é aplicada na margem anal do utente quando este acorda pela manhã

(as fêmeas depositam os ovos no ânus durante a noite). Esta fita é então colada numa

lâmina e observada ao microscópio.

Pesquisa de Schistosoma haematobium na urina

Uma vez que a hora mais provável de expulsão deste parasita é entre as 12 e 15 horas do

dia, a urina para esta pesquisa deve ser colhida neste tempo, após esforço físico de mais ou

menos 1 hora, podendo ser conservada a 53ºC por 2 ou 3 dias.

A urina obtida na micção após esforço é homogeneizada e centrifugada (5 minutos a 2500

rpm) em vários tubos. Os sedimentos obtidos vão juntar-se num só tubo, sofrem

homogeneização e nova centrifugação. Este último sedimento é que é observado ao

microscópio para pesquisa dos ovos de Schistosoma em toda a lâmina.

Controlo de qualidade

Controlo de qualidade interno

Os corantes são controlados fazendo comparação com esfregaços feitos de material com

comportamento conhecido para cada coloração (estirpes S. aureus ATCC 29213 para Gram

positivo e estirpes E. coli ATCC 25922 para Gram negativo). Se possível, com as devidas

precauções, podemos também utilizar colónias de BAAR para controlar os corantes de Ziehl

Neelsen.

Os meios de cultura preparados comercialmente não requerem um controlo interno tão

rigoroso como os meios preparados no laboratório. Apenas é feito o exame macroscópico

(desidratação, cor e transparência). Nos meios selectivos preparados pelo Laboratório

Tomaz usamos as estirpes ATCC.

O soro fisiológico usado para as diluições bacterianas para o Vitek é inoculado

semanalmente em meio gelose sangue e incubado. Se der algum crescimento tem que se

autoclavar o dispensador e o soro que está a ser usado.

As estirpes ATCC são usadas para controlar as cartas do Vitek: E. coli ATCC 25922 para

carta GN, AST 244 e AST 192; S. aureus ATCC 29213 para GP, AST 619; P. aeruginosa

ATCC 27853 para GN e AST 222; E. faecalis ATCC 29212 para GP e AST586.

Os kits de identificação contêm controlos internos inclusos ou então são usadas as estirpes

ATCC em cada lote: reagente ID color Catalase - S. aureus ATCC 29213, teste da oxidase -

P. aeruginosa ATCC 27853.

66

O ambiente na secção de microbiologia é controlado semanalmente usando uma placa de

meio PCA (plate count agar) exposta 20 minutos com o ar condicionado em funcionamento.

Após incubação por 3 dias a 361C não deve apresentar mais do que 10 colónias. Este

meio também é usado para controlar o ambiente dentro da câmara de fluxo laminar: aqui o

limite de colónias passa a um.

Controlo de qualidade externo

A secção microbiologia do Labeto participa no Programa de Avaliação Externa da Qualidade

do Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge (INSA), de Microbiologia, Micologia e

Parasitologia e no Programa de Evaluación Externa de Calidad da AEFA/AEBM de sémen.

Os ensaios devem realizar-se como se de uma amostra de rotina se tratasse.

Valência de Bioquímica Clínica

O estágio na valência de bioquímica foi realizado no Labeto, Centro de Análises

Bioquímicas SA das 08h00 até às 17h00 durante 45 dias, sob a supervisão da Drª Maria

Beatriz Godinho Tomaz dos Santos.


manipulação

Para a maioria das análises da valência de bioquímica a amostra biológica é o soro obtido

após formação de coágulo e centrifugação a 4000 rpm por 12 minutos. Pode também ser

usado o plasma de EDTA ou até urina sumária ou de 24 horas em alguns casos.

As amostras podem chegar ao laboratório por centrifugar, já centrifugadas ou até já

separadas para tubo secundário. A formação e retracção do coágulo deve estar completa

antes de centrifugar. Devemos evitar a presença de fibrina, células sanguíneas, hemólise e

lipémia uma vez que podem interferir no processo de análise de alguns analitos.

As amostras, em tubo primário ou secundário, são então processadas nos vários

equipamentos. Findo o processo de análise as amostras são armazenadas refrigeradas

durante 7 dias

67

Metodologias para avaliação de metabolitos

A maioria das análises da valência de bioquímica são processadas nos dois equipamentos

Dimension VISTA 1500 da Siemens.

Figura 31 – Dimension VISTA 1500

Este equipamento incorpora várias metodologias diferentes:

Fotometria

A quantidade de luz absorvida a determinado comprimento de onda por uma determinada

substância é directamente proporcional à sua concentração na amostra.

São exemplos desta metodologia a determinação de fosfatase alcalina, creatinina,

gamaglutamiltransferase e LDH (lactato desidrogenase).

Turbidimetria

As proteínas (antigénios) da amostra formam complexos insolúveis com anticorpos

específicos. É medida a transmissão de luz que atravessa amostra.

São exemplos desta metodologia a determinação de ácido valproico, carbamazepina, lítio.

Nefelometria

As proteínas (antigénios) da amostra formam complexos insolúveis com anticorpos

específicos. É medida a dispersão de luz pela amostra.

São exemplos desta metodologia a determinação de C3, C4, imunoglobulinas e proteína C

reactiva.

LOCITM (Luminescent Oxygen Channeling Immunoassay)

Baseada na tecnologia de quimioluminescência, a tecnologia LOCITM é um imunoensaio

quimioluminescente homogéneo em sanduiche. Utiliza 2 reagentes sintéticos em forma de

esfera e um fragmento de anticorpo monoclonal anti-substância Y biotinilado. O primeiro

68

reagente em forma de esfera (Sensibeads) é revestido com estreptovidina e contém um

corante fotossensibilizante. O 2º reagente em forma de esfera (Chemibeads) é revestido

com um anticorpo monoclonal anti-substância Y e contém um corante quimioluminescente.

A amostra contendo a substância Y é incubada com o anticorpo biotinilado e Chemibeads

para formar uma sanduiche Chemibeads-subst Y - anticorpo biotinilado. Depois é adicionado

o Sensibeads que vai ligar à biotina formando um imunocomplexo de 2 esferas Chemibeads

– subst Y -anticorpo biotinilado - Sensibeads. Ao ser iluminado a determinado comprimento

de onda, a Sensibeads vai oxidar o oxigénio dissolvido em oxigénio singleto. Este difunde-se

para o Chemibeads desencadeando uma reacção quimioluninescente. Este método

dispensa os passos de separação e lavagem necessários nos imunoensaios heterogéneos

padrão. Pode ser competitivo ou não competitivo.

São exemplos desta metodologia a determinação de ácido fólico e vitamina B12.

IMT (Integrated Multisensor Technology)

Potenciometria indirecta com eléctrodos selectivos (membranas que respondem

selectivamente a determinados iões).

São exemplos desta metodologia a determinação de sódio, potássio e cloretos.

Glúcidos

Glicose

A determinação da glicose é feita no equipamento Dimension VISTA através do método

hexoquinase UV ponto final bicromático aos comprimentos de onda 340/383 nm. O limite

analítico desta técnica é de 0 a 500 mg/dL.

Como amostra podemos usar soro ou urina. Os plasmas permitidos (heparina lítio ou sódio

e fluoreto de sódio) não são usados normalmente no laboratório.

O doseamento da glicose é usado para diagnóstico e monitorização de doenças como a

diabetes mellitus, hipoglicémia neonatal e idiopática e tumores das células dos ilhéus do

pâncreas. A glicose provém da digestão dos carbohidratos da dieta alimentar quando

digeridos no aparelho gastrointestinal a monossacarídeos simples. Estes são absorvidos e

fornecem energia ao organismo. A glicose é regulada pela insulina, cortisol e glucagina.

Níveis baixos de glicose podem estar associados a aumento de insulina ou doenças

hepáticas, enquanto que níveis altos estão maioritariamente associados a diabetes podendo

também corresponder a tumores pancreáticos, hipertiroidismo ou outras disfunções.

Segundo a Norma da Direcção Geral de Saúde nº 002/2011 de 14 de Janeiro de 2011,

alguns dos critérios do valor de glicose a partir do qual se pode diagnosticar diabetes é

69

glicose em jejum ≥ 126 mg/dL ou glicose ≥ 200 mg/dl às 2 horas, na prova de tolerância à

glicose oral (PTGO) com 75g de glicose.

Outras situações de risco de diabetes podem ser identificadas: anomalia da glicemia de

jejum (AGJ) com glicose de jejum ≥ 110 e < 126 mg/dL e tolerância diminuída à glicose

(TDG) com glicose às 2 horas na PTGO ≥ 140 e < 200 mg/dL. No caso da diabetes

gestacional o diagnóstico é feito na primeira consulta de gravidez se glicose em jejum ≥ 92

mg/dL e < 126 mg/dL. Se a glicose for inferior a 92 mg/dL faz-se PTGO com 75 gr de glicose

às 24-28 semanas de gestação se um ou mais valores estiverem acima de: às 0 horas

glicose ≥ 92 mg/dL, à 1 hora glicose ≥ 180 mg/dL e às 2 horas glicose ≥ 153 mg/dL.

Lípidos

Colesterol Total

A determinação do colesterol total é feita no equipamento Dimension VISTA através do

método enzimático ponto final policromático aos comprimentos de onda 540/452/700 nm. O

limite analítico desta técnica é de 50 a 600 mg/dL.

Como amostra podemos usar soro. O plasma permitido (heparina lítio) não é usado

normalmente no laboratório.

A determinação do colesterol total é usada para determinar o risco cardiovascular SCORE

(Systematic Coronary Risk Evaluation) e para diagnóstico e monitorização de patologias do

metabolismo lipídico. O colesterol faz parte das membranas celulares sendo precursor de

várias substâncias como hormonas esteróides, ácidos biliares e vitamina D. É sintetizado

em vários tecidos (hepático e intestinal) e apenas uma pequena parte provém da dieta

alimentar. Níveis altos de colesterol podem também estar ligados a diabetes não controlada,

hipotiroidismo e doença renal enquanto níveis baixos podem estar associados a doença

hepática.

Triglicerídeos

A determinação dos triglicerídeos é feita no equipamento Dimension VISTA através do

método enzimático colorimétrico ponto final bicromático aos comprimentos de onda 510/700

nm. O limite analítico desta técnica é de 2 a 1000 mg/dL.



A determinação dos triglicerídeos é usada para diagnóstico e monitorização de

hiperlipidémias (primárias ou secundárias a outras doenças). São lípidos que fazem parte de

todas as lipoproteínas e são sintetizados no fígado ou absorvidos através da dieta alimentar.

70

Colesterol HDL

A determinação do colesterol HDL é feita no equipamento Dimension VISTA através do

método selectivo detergente líquido ponto final bicromático aos comprimentos de onda

600/700 nm. O limite analítico desta técnica é de 2 a 150 mg/dL.

Como amostra podemos usar soro. Os plasmas permitidos (heparina lítio e sódio) não são

usados normalmente no laboratório.

A determinação do colesterol HDL é usada para determinar o risco cardiovascular SCORE

(Systematic Coronary Risk Evaluation). Níveis elevados de colesterol HDL podem surgir

com terapia de estrogénios e alcoolismo, enquanto que níveis baixos acontecem nos

fumadores.

Colesterol LDL

A determinação do colesterol LDL é feita no equipamento Dimension VISTA através do

método selectivo detergente líquido ponto final bicromático aos comprimentos de onda




A determinação do colesterol LDL é usada para controlar a prevenção da aterosclerose

coronária: a redução do LDL melhora a função endotelial e diminui a progressão da

aterosclerose evitando a rotura das placas.

O colesterol LDL ou lipoproteínas da baixa densidade são essenciais na formação e

desenvolvimento da aterosclerose e esclerose coronária. A maior parte do colesterol

armazenado nas placas ateroscleróticas deriva das LDL. Níveis elevados de colesterol LDL

surgem em distúrbios hereditários do metabolismo do colesterol e dietas alimentares ricas

em gorduras saturadas, enquanto que níveis baixos suegrm em dietas ricas em fibras e com

determinados tratamentos terapêuticos.

Proteínas

Proteínas totais

Séricas:

A determinação das proteínas totais é feita no equipamento Dimension VISTA através do

método biureto ponto final bicromático aos comprimentos de onda 540/700 nm. O limite

analítico desta técnica é de 0 a 12 g/dL.

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A determinação das proteínas totais é usada para diagnóstico e tratamento de doenças do

fígado, rins ou medula óssea e outras perturbações metabólicas ou nutricionais. As

proteínas plasmáticas são sintetizadas principalmente no fígado. Podem sofrer alterações

quantitativas significativas seja no seu todo ou em apenas determinadas fracções ou até

devido a alteração no volume de água no plasma. Valores diminuídos de proteínas podem

acontecer em casos de síndroma nefrótico, hemorragia generalizada, má absorção das

proteínas, queimaduras graves ou outras síndromas. Níveis elevados surgem em casos de

desidratação profunda ou mieloma múltiplo.

Urinárias:

A determinação das proteínas totais na urina é feita no equipamento Dimension VISTA

através do método vermelho pirogalhol ponto final bicromático aos comprimentos de onda


A determinação das proteínas urinárias é importante para a avaliação da função renal e

monitorização de medicamentos nefrotóxicos. A proteinúria é muitas vezes o primeiro sinal

de comprometimento renal como consequência do agravamento de doenças sistémicas e

metabólicas como hipertensão arterial, diabetes e lúpus. As várias proteínas excretadas

dependem da sua taxa de filtração glomerular. Níveis elevados de proteínas urinárias

surgem em casos de permeabilidade glomerular aumentada, reabsorção tubular diminuída e

secreção aumentada de proteínas para o tracto urinário.

Albumina

A determinação da albumina é feita no equipamento Dimension VISTA através do método

corante BCP ponto final policromático aos comprimentos de onda 540/600/700 nm. O limite

analítico desta técnica é de 0 a 8 g/dL.

Como amostra podemos usar soro. Os plasma permitidos (heparina lítio e sódio) não são


A albumina é a fracção mais abundante das proteínas funcionando como proteína de

transporte e estabilizador da pressão oncótica no plasma. Apresenta níveis aumentados na

desidratação e diminuídos na doença renal, hepática, má absorção, queimaduras graves,

infecções e tumores.

Microalbumina

A determinação da microalbumina é feita no equipamento Dimension VISTA através do

método nefelometria ao comprimento de onda 840 nm. O limite analítico desta técnica é de

0,5 a 34 mg/dL.

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Como amostra usamos urina sumária ou de 12 ou 24 horas.

A determinação da microalbuminúria usa-se para detecção precoce da nefropatia diabética.

A microalbuminúria é a excreção diminuída mas anormal de albumina na urina. Esta

situação anormal pode ter origem glomerular (microangiopatia diabética, hipertensão

arterial, lesão glomerular menor), tubular (inibição da reabsorção) ou pós-renal.

Imunoglobulinas

A determinação das imunoglobulinas da classe IgA é feita no equipamento Dimension

VISTA através do método imunonefelometria ao comprimento de onda 840 nm. O limite

analítico desta técnica é de 31,3 a 750 mg/dL.

A determinação das imunoglobulinas da classe IgG é feita no equipamento Dimension



A determinação das imunoglobulinas da classe IgM é feita no equipamento Dimension





A determinação das imunoglobulinas pode ser usada para diagnóstico de imunodeficiências

congénitas ou adquiridas (infecções e tumores) ou para detecção de gamapatias policlonais

(situações inflamatórias ou infecciosas crónicas e doenças hepáticas e autoimunes) ou

monoclonais (macroglobulinémia de Waldenström - IgM, mieloma múltiplo – IgG ou IgA e

outras patologias benignas). As imunoglobulinas são produzidas pelos plasmócitos em

resposta a estimulação antigénica e funcionam como anticorpos. A IgA é importante na

protecção das mucosas, a IgG na resposta imunitária secundária e a IgM na resposta

imunitária primária.

β 2 Microglobulina

A determinação da β 2 microglobulina é feita no equipamento Dimension VISTA através do

método nefelometria policromático ao comprimento de onda 840 nm. O limite analítico desta

técnica é de 0,07 a 2,30 mg/dL.

Como amostra podemos usar soro e plasma EDTA. Os plasmas heparina lítio e sódio não

são usados normalmente no laboratório.

O doseamento da β 2 microglobulina é efectuado em caso de algumas doenças

linfoproliferativas e inflamatórias e disfunção renal. A β 2 microglobulina faz parte dos

antigénios leucocitários classe I e, após a sua degradação, encontra-se no plasma sofrendo

eliminação renal.

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Proteína C Reactiva

A determinação da proteína C reactiva é feita no equipamento Dimension VISTA através do


0,016 a 0,95 mg/dL (proteína C reactiva ultrasensível).



A determinação da proteína C reactiva é usada como indicador de infecção e inflamação na

sua fase mais precoce e para monitorizar a resposta a terapêutica farmacológica ou cirurgia.

A comparação de valores baixos em alturas diferentes de proteína C reactiva pode também

ser usada para avaliar o risco cardiovascular e vascular periférico. A proteína C reactiva é a

proteína de fase aguda mais precoce e sensível, sintetizada no fígado, embora não seja

específica.

α1 Antitripsina

A determinação da α1 antitripsina é feita no equipamento Dimension VISTA através do


17 a 400 mg/dL.



A determinação de α1 antitripsina é principalmente usada no diagnóstico da sua deficiência

hereditária. A α1 antitripsina é um inibidor de proteinase que inibe as proteases da serina.

Níveis baixos de α1 antitripsina encontram-se na deficiência hereditária (normalmente de

causa hereditária), manifestando-se com doenças hepáticas (mais nas crianças) e

pulmonares (mais nos adultos). Níveis altos desta enzima devem-se a uma reacção de fase

aguda a inflamação ou infecções, gravidez ou após a toma de contraceptivos orais.

Proteínas do Complemento (C3 e C4)

A determinação das proteínas C3 e C4 é feita no equipamento Dimension VISTA através do

método nefelometria ao comprimento de onda 840 nm. O limite analítico da técnica do C3 é

de 16 a 410 mg/dL e do C4 é de 6 a 160 mg/dL.

Como amostra podemos usar soro. Os plasmas heparina lítio e sódio não são usados


A proteína C4 do complemento pertence à via clássica de activação do complemento, que

faz parte das defesas imunitárias não específicas de antigénio. A proteína C3 do

complemento faz parte da activação pelas duas vias: a clássica e a alternativa. Níveis

baixos de C3 e C4 encontram-se no lúpus eritematoso sistémico activo, em formas de

glomerulonefrite membrano-proliferativa (C3 também na glomerulonefrite aguda), em

doenças com formação de complexos imunes, no angioedema hereditário e na anemia

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hemolítica autoimune. Níveis elevados de C3 ou C4 podem surgir em doenças inflamatórias

uma vez que o complemento reage como proteína de fase aguda.

Electroforese das Proteínas

A electroforese das proteínas do soro é processada no equipamento Capillarys 2 da Sebia.

Figura 32 – Capillarys 2

O fundamento deste equipamento é a electroforese capilar em solução livre: as moléculas

carregadas são separadas consoante a sua mobilidade electroforética em tampão alcalino

com pH 9.9 e em função do pH do electrólito e do fluxo electro-osmótico. Dispõe de 8

capilares em paralelo. A amostra diluída é injectada na extremidade anódica do capilar que

sofre uma voltagem e a detecção das proteínas é feita a 200 nm na extremidade catódica do

capilar pela seguinte ordem:

- gamaglobulinas (imunoglobulinas e proteína C reactiva)

- beta-1-globulinas (transferrina, ferritina proteínas do complemento C3 e C4, β lipoproteína

e antitrombina III)

- alfa-2-globulinas (α -2-macroglobulina, haptoglobina e ceruloplasmina)

- alfa-1-globulinas (α-1-antitripsina, α-1-glicoproteína ácida, α fetoproteína e α lipoproteína)

- e albumina.

Como amostra podemos usar soro.

A determinação da electroforese das proteínas é útil no diagnóstico de mieloma múltiplo,

macroglobulinémia, enteropatia exsudativa, síndroma nefrótico, cirrose, sarcoidose e

doenças do colagénio. O aumento ou diminuição das fracções de proteínas reflecte diversas

situações patológicas consoante a proteína envolvida.

Na síndroma nefrótica há uma perda alargada de proteínas e aumento de proteínas

inflamatórias que se reflecte no proteinograma na diminuição da fracção albumina e

aumento da α-2-globulina. Na cirrose hepática há diminuição da síntese hepática de

albumina e diminuição da catabolização das globulinas o que se reflecte na diminuição da

fracção albumina e aumento da fracção beta e fracção gama no proteinograma.

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Iões

Cálcio

A determinação do cálcio é feita no equipamento Dimension VISTA através do método

complexo cresolftaleína ponto final bicromático aos comprimentos de onda 577/540 nm. O

limite analítico desta técnica é de 5 a 15 mg/dL.

Como amostra podemos usar soro e urina. Os plasma permitidos (heparina lítio e sódio) não


A determinação do cálcio é usada para diagnóstico e monitorização de hipo e

hipercalcémias. O cálcio influencia a excitabilidade neuromuscular (coração e musculatura

esquelética), participa na coagulação sanguínea e na activação de algumas enzimas

(principalmente as que participam na mineralização óssea). 99% do cálcio encontra-se nos

ossos e o que se encontra no sangue está ligado a proteínas. As hiper e hipoproteinémias

também influenciam os níveis de cálcio doseados. O equilíbrio do cálcio é regulado pela

hormona da paratiróide, vitamina D e calcitonina. Níveis baixos de cálcio surgem nas

deficiências de vitamina D enquanto que níveis aumentados aparecem em situações de

hiperparatiroidismo e tumores.

Fósforo

A determinação do fósforo é feita no equipamento Dimension VISTA através do método

fosfomolibdato UV ponto final bicromático aos comprimentos de onda 340/700 nm. O limite

analítico desta técnica é de 2,1 a 80 µg/mL.

Como amostra podemos usar soro e urina. O plasma permitido (heparina lítio) não é usado


A determinação do fósforo é usada em conjunto com o doseamento do cálcio. A maioria do

fósforo do organismo está presente no osso e o restante está envolvido no metabolismo

intermédio dos hidratos de carbono e faz parte de substâncias como o ATP, fosfolípidos e

ácidos nucleicos. Um aumento dos níveis de fósforo provoca uma diminuição do cálcio e

vice-versa, sendo controlado pela paratormona e vitamina D. Níveis baixos de fósforo

aparecem no raquitismo, hiperparatiroidismo e síndroma de Fanconi, enquanto que níveis

altos surgem no hipoparatiroidismo, intoxicação por vitamina D e insuficiência renal.

Magnésio

A determinação do magnésio é feita no equipamento Dimension VISTA através do método

azul metiltimol colorimétrico ponto final bicromático aos comprimentos de onda 600/510 nm.

O limite analítico desta técnica é de 0,2 a 20 mg/dL.

Como amostra podemos usar soro e urina. Os plasmas permitidos (heparina lítio e sódio)

não são usados normalmente no laboratório.

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A determinação do magnésio é usada na insuficiência renal ou distúrbios gastrointestinais

assim como na avaliação de problemas musculares ou arritmias cardíacas. O magnésio

funciona como activador de várias enzimas (especialmente as que convertem energia para a

função muscular) e faz parte do osso (está complexado com o cálcio e o fósforo). No plasma

encontra-se ligado à albumina, pelo que os seus níveis estão dependentes desta. Níveis

elevados de magnésio encontram-se no coma diabético e insuficiência renal glomerular e

níveis baixos em perturbações neuromusculares, diarreias prolongadas e má absorção,

hiperaldosteronismo e terapêutica diurética.

Equilíbrio ácido base

Sódio

A determinação do sódio é feita no equipamento Dimension VISTA através do método

potenciometria indirecta com eléctrodos selectivos. O limite analítico desta técnica é de 50 a

200 mmol/L.



A determinação do sódio é usada para diagnóstico e monitorização dos níveis de hidratação

e alterações durante o tratamento da insuficiência renal. O sódio tem uma função na

manutenção do equilíbrio hidríco e da pressão osmótica, sendo regulado pela sua excreção

e reabsorção renal. Níveis baixos de sódio encontram-se na diurese excessiva, perda

gastrointestinal, acidose, doença de Addison e renal, enquanto que níveis elevados estão

presentes na síndroma de Cushing, desidratação, retenção de sal e diabetes insipidus.

Potássio

A determinação do potássio é feita no equipamento Dimension VISTA através do método


10 mmol/L.



A determinação do potássio é usada para diagnóstico e monitorização da hipo e

hipercalcémia em variadas doenças (insuficiência renal, perda de líquidos e electrólitos).

Níveis baixos de potássio encontram-se na debilidade muscular e batimento cardíaco

acelerado, enquanto que níveis altos aparecem na terapêutica intravenosa inadequada,

desidratação, choque, cetoacidose diabética e queimaduras graves.

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Cloro

A determinação dos cloretos é feita no equipamento Dimension VISTA através do método


200 mmol/L.



A determinação dos cloretos é usada para avaliação electrolítica e equilíbrio ácido base e

hídrico. Níveis baixos de cloretos surgem no vómito prolongado (perda de HCl), acidose

metabólica, doença de Addison e renal (perda de sal), enquanto que níveis altos aparecem

na acidose metabólica da diarreia prolongada (perda de NaHCO3) e doença dos túbulos

renais (perda de H+).

Drogas Terapêuticas

Lítio

A determinação do lítio é feita no equipamento Dimension VISTA através do método

colorimétrico ponto final bicromático aos comprimentos de onda 540/700 nm. O limite

analítico desta técnica é de 0,2 a 5,0 mmol/L.

Como amostra podemos usar soro. O plasma permitido (heparina sódio) não é usado


A determinação do lítio é usada para monitorizar a terapêutica para controlo dos distúrbios

maníaco-depressivos. O lítio afecta os neurotransmissores do sistema nervoso central. Não

existe naturalmente no nosso organismo e não é metabolizado. Níveis altos de lítio levam a

intoxicação e distúrbios renais.

Ácido Valpróico

A determinação do ácido valpróico é feita no equipamento Dimension VISTA através do

método PETINIA (imunoensaio turbidimétrico homogéneo) aos comprimentos de onda

340/700 nm. O limite analítico desta técnica é de 3 a 150 µg/mL.



A determinação de ácido valpróico é usada para monitorizar tratamentos de crises

convulsivas. O ácido valpróico é rapidamente absorvido, alcançando a concentração

máxima em 1 a 2 horas com semivida de 16 horas. Pode ser usado em conjunto com a

fenitoína.

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Carbamazepina

A determinação da carbamazepina é feita no equipamento Dimension VISTA através do

método PETINIA (imunoensaio turbidimétrico homogéneo) aos comprimentos de onda

340/700 nm. O limite analítico desta técnica é de 0,5 a 20 µg/mL.



A determinação da carbamazepina é usada para monitorizar tratamentos de crises

convulsivas. A carbamazepina é rapidamente absorvida e o seu metabolito é também activo

terapeuticamente, embora a acção terapêutica da carbamazepina seja influenciada por

outras drogas (fenitoína, fenobarbital e felbamato).

Fenitoína

A determinação da fenitoína é feita no equipamento Dimension VISTA através do método

PETINIA (imunoensaio turbidimétrico homogéneo) aos comprimentos de onda 340/700 nm.

O limite analítico desta técnica é de 0,4 a 40 µg/mL.



A determinação da fenitoína é usada para monitorizar tratamentos de crises convulsivas.

Digoxina

A determinação da digoxina é feita no equipamento VIDAS da bioMérieux.

Figura 33 – VIDAS

Este equipamento usa o método de ELFA (Enzyme Linked Fluorescence Assay) que é uma

combinação de ELISA com leitura final em fluorescência a 450 nm. O limite analítico desta

técnica é de 0,2 a 5 ng/mL.

Como amostra podemos usar soro e plasma EDTA. O plasma heparina lítio não é usado


A determinação da digoxina é usada na monitorização da insuficiência cardíaca e na falha

do batimento cardíaco. A digoxina é um glucosido cardíaco que actua especificamente no

miocárdio. O intervalo terapêutico é muito restrito.

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Drogas de abuso

A determinação das diferentes drogas de abuso na urina é feita com testes de imunoensaio

competitivo cromatográficos de fluxo lateral da Wondfo. Fornecem apenas um resultado

qualitativo.

Opiáceos

O termo opiáceos refere-se a qualquer substância obtida a partir da papoila, incluindo

substâncias naturais como a morfina e a codeína e substâncias semi sintéticas como a

heroína e que actuam nos receptores opióides. Estas substâncias têm efeito analgésico

para controlo da dor através da depressão do sistema nervoso. Doses elevadas de morfina

levam ao desenvolvimento de tolerância e dependência fisiológica. A morfina é excretada

não metabolizada, sendo o maior metabolito da codeína e heroína, podendo ser detectada

na urina durante vários dias após a toma.

O limite de detecção deste teste é de 2000 ng/mL.

Anfetaminas

A anfetamina e outras substâncias estruturalmente relacionadas são aminas

simpaticomiméticas que levam à estimulação do sistema nervoso central, anorexia,

hipertermia e efeitos cardiovasculares (aumento da frequência cardíaca e tensão arterial).

São absorvidas no tracto gastrointestinal e metabolizadas no fígado ou excretadas

inalteradas na urina com semi vida de 12 horas, sendo detectadas na urina durante 1 ou 2

dias após administração. A metanfetamina é parcialmente metabolizada a anfetamina e no

seu metabolito mais activo.


Cocaína

A cocaína deriva das folhas de coca e é um potente estimulante do sistema nervoso central

(euforia, aumento de confiança e energia com aumento da frequência cardíaca, dilatação

das pupilas, febre, tremores e suores) e um anestésico local. É excretada pela urina sob a

forma de benzoilecgonina.


Benzodiazepinas

As benzodiazepinas são fármacos ansiolíticos, hipnóticos, relaxantes musculares e

anticonvulsivantes e potenciam o efeito do álcool e de outros depressores do sistema

80

nervoso central. São metabolizadas no fígado e algumas benzodiazepinas e seus

metabolitos são excretadas na urina. Têm semi vida de 2 a 40 horas, podendo ser

detectadas até 1 ou 2 dias após a administracção. Pode desenvolver-se dependência física

e psicológica.


Canabinóides

A marijuana é um agente alucinogénio extraído das flores do cânhamo com as substâncias

activas tetraidrocanabinol (THC) e canabinol, daí o termo canabinóides. Tem tempo de

semivida de 24 horas, sendo detectada durante 1 a 5 dias após administracção. Produz

efeitos no sistema nervoso central, alterações de humor e percepção sensorial, perda de

coordenação, memória recente debilitada, ansiedade, paranóia, depressão, confusão,

alucinações e aumento da frequência cardíaca. Pode ocorrer tolerância aos efeitos

cardíacos e psicotrópicos, podendo a paragem de administracção produzir agitação, insónia,

anorexia e náusea.


Exame sumário de urina

A análise sumária da urina é realizada no equipamento Aution Max AU 4280 da A. Menarini

diagnostics que analisa alguns parâmetros qualitativamente e outros quantitativamente.

Figura 34 – Aution Max AU 4280 e Sedimax

Usa tiras de teste Uriflet S e conjuga vários métodos de leitura: reflectância em

bicromatismo (tiras), índice de refracção de cor (densidade), reflectância em 4 comprimentos

de onda (cor) e método de dispersão de luz (turvação).

Os vários parâmetros desta análise são usados em vários diagnósticos clínicos embora seja

especialmente útil na monitorização da evolução da doença renal.

81

Cor

A cor da urina é medida através de vários comprimentos de onda dando origem a três

resultados possíveis: “Light”, “Normal” e “Dark”.

A cor normal da urina é amarela devido à produção endógena e constante do pigmento

urocromo. Há alterações de cor que não são patológicas mas outras têm interesse clínico:

incolor (poliúria – diabetes insipidus), vermelha (possível presença de eritrócitos) ou até

negra (possível presença de ácido homogentísico – alcaptonúria).

Glicose

A determinação da glicose na urina usa o método GOD/POD (glucoseoxidase/peroxidase),

não sendo afectada pelo pH, densidade ou presença de corpos cetónicos.

Numa situação normal a glicose na urina não é detectável uma vez que a glicose é filtrada e

reabsorvida. Só em situações em que o valor de glicose no sangue é elevado (acima de 160

ou 180 mg/dL) é que os níveis são detectáveis na urina. Pode haver hiperglicémia sem

glicosúria nas doenças de reabsorção tubular, em lesões do sistema nervoso central e

distúrbios da tiróide.

Corpos cetónicos

A determinação dos corpos cetónicos usa o princípio da reacção de Legal, que tem maior

sensibilidade para o ácido acetoacético do que para a acetona.

Os corpos cetónicos (acetona, ácido acetoacético e ácido β hidroxibutírico) apenas

aparecem na urina quando há necessidade de usar as reservas lipídicas do organismo por

falta de outra fonte de energia. A sua determinação é usada para monitorizar a diabetes

(pode a dose de insulina não estar a ser suficiente).

Bilirrubina

A determinação da bilirrubina na urina usa um sal de diazónio.

Esta detecção é o primeiro sinal de comprometimento hepático, podendo ser útil no

diagnóstico de hepatite e cirrose.

Densidade

A determinação da densidade usa o índice de refracção de cor. A densidade da urina

permite inferir o grau de diluição ou concentração da urina.

Valores baixos podem significar poliúria, pielonefrite ou glomerulonefrite e valores altos

desidratação ou insufuciência da glândula suprarenal.

82

pH

Para a determinação do pH na urina a tira teste tem vários indicadores: vermelho de metilo,

fenolftaleína e azul de bromotimol. Alteram a cor com pH entre 4,5 e 9.

O conhecimento do pH da urina pode ajudar a diferenciar granulações e até cristais. A

alteração do pH da urina pode ajudar a que não se dê a precipitação de substâncias da

urina que originem a formação de cálculos renais.

Proteínas

A determinação das proteínas na urina usa o método do erro proteico de um indicador de

pH, especialmente sensível à albumina.

A excreção aumentada de proteínas pela urina é um sinal de doença renal com

comprometimento glomerular.

Urobilinogénio

A determinação do urobilinogénio usa também um sal de diazónio, sendo específico para o

urobilinogénio.

O urobilinogénio pode ser detectado na urina em caso de doença hepática ou distúrbios

hemolíticos.

Nitritos

A determinação dos nitritos usa o teste de Griess específico para nitritos e, portanto,

indicador da presença de bactérias que reduzem os nitratos a nitritos.

A presença de nitritos na urina pode significar uma possível infecção do tracto urinário.

Leucócitos

A determinação da presença de leucócitos é feita através da detecção de enzimas esterases

granulocitárias.

Os leucócitos podem aparecer na urina, mas um número elevado pode ser sugestivo de

infecção no tracto urinário.

Sangue

Esta determinação faz-se através da reacção da peroxidase sobre peróxido de hidrogénio

na tira. Tanto reage a peroxidase da hemoglobina como da mioglobina.

83

A presença de hemoglobina na urina pode significar hematúria (eritrócitos íntegros –

distúrbios renais ou exercício intenso) ou hemoglobinúria (eritrócitos lisados – lise no tracto

urinário ou hemólise intravascular). A mioglobinúria surge em casos de destruição de tecido

muscular.

Sedimento urinário

Ligado em cadeia ao equipamento Aution Max AU 4280, está o equipamento Sedimax,

também da A. Menarini diagnostics, que procede à análise do sedimento urinário. Usa o

método de microscopia digital: uma determinada quantidade de urina é centrifugada e são

tiradas, pelo menos, 10 fotografias ao sedimento.

A análise destas fotografias permite a visualização dos elementos existentes na urina:

células epiteliais, leucócitos, eritrócitos, cilindros com ou sem inclusões, cristais ou

granulações, leveduras, hifas fúngicas, espermatozóides e bactérias.

A análise do sedimento urinário é feita quando algum parâmetro da tira teste é positivo,

embora seja considerado normal a presença residual de alguns elementos figurados.

Só no caso de o resultado da tira não ser concordante com o resultado do sedimento

urinário automático é que procedemos à realização manual com microscópio óptico do

sedimento urinário.

Metodologias para avaliação das funções fisiológicas e endócrinas

Função renal

Ácido úrico

A determinação do ácido úrico é feita no equipamento Dimension VISTA através do método

uricase ponto final bicromático aos comprimentos de onda 293/700 nm. O limite analítico

desta técnica é de 0,2 a 20 mg/dL.



Esta determinação é útil para monitorizar o tratamento da gota e a produção de ácido úrico

em doentes com doenças mielo ou linfoproliferativas ou com insuficiências renais. O ácido

úrico é um metabolito das purinas (guanosina e adenosina) sendo excretado pelo rim.

Valores baixos de ácido úrico encontram-se em insuficiências hepáticas graves, doença de

Wilson, síndroma de Fanconi e outras. A hiperuricémia pode acontecer em situações de

84

disfunção renal, levando à deposição de cristais de ácido úrico nas articulações (gota) ou

formação de cálculos renais.

Creatinina

A determinação da creatinina é feita no equipamento Dimension VISTA através do método

creatininase ponto final bicromático aos comprimentos de onda 540/700 nm. O limite

analítico desta técnica é de 0,2 a 20 mg/dL.

Como amostra podemos usar soro e urina. Os plasmas permitidos (heparina lítio e sódio)


Esta determinação é usada no diagnóstico e monitorização da doença renal aguda e

crónica, no cálculo da taxa de filtração glomerular e para avaliação da função renal de

doentes dialisados. A determinação da creatinina na urina é usada para determinar a

clearance da creatinina (avaliação do índice de filtração glomerular).

A creatinina é sintetizada endogenamente a partir da creatina e do fosfato de creatina,

estando presente no músculo e sendo excretada por filtração glomerular. Valores altos de

creatinina são encontrados na disfunção renal enquanto que valores baixos se encontram

na gravidez e má nutrição.

Ureia

A determinação da ureia é feita no equipamento Dimension VISTA através do método

urease com GLDH taxa bicromática aos comprimentos de onda 340/383 nm. O limite




Esta determinação é usada para diagnóstico de doenças renais e metabólicas. É usada na

avaliação da função renal dos dialisados. Em conjunto com a determinação da creatinina é

usada para avaliar a insuficiência renal no diagnóstico de hiperurémia pré-renal (diminuição

da descompensação cardíaca, desidratação, aumento do catabolismo das proteínas,

vómitos), hiperurémia renal (glomerulonefrite, nefrite crónica, rins poliquísticos,

nefroesclerose, necrose tubular aguda de origem isquémica, tóxica) e hiperurémia pós-renal

(obstrução do aparelho urinário).

A ureia é o produto final do metabolismo das proteínas e dos aminoácidos, sendo uma

maneira de eliminar o azoto em excesso no organismo. Valores baixos de ureia encontram-

se na dieta pobre em proteínas e doença hepática e valores aumentados encontram-se na

disfunção renal e dieta rica em proteínas.

85

Função hepática e biliar

Aspartato amino transferase (AST)

A determinação da AST é feita no equipamento Dimension VISTA através do método L-

aspartato αKG NADH a NAD a 37ºC taxa bicromática aos comprimentos de onda 340/540

nm. O limite analítico desta técnica é de 3 a 1000 U/L.



Esta determinação com valores elevados indica dano no tecido hepático, muscular, cardíaco

e renal, uma vez que esta enzima se encontra no citoplasma e nas mitocôndrias destes

tecidos. É principalmente usada como indicador de lesão hepatocelular e marcador de lesão

muscular, essencialmente a que ocorre após enfarte do miocárdio.

Alanina amino transferase (ALT)

A determinação da ALT é feita no equipamento Dimension VISTA através do método L-

alanina αKG NADH a NAD a 37ºC taxa bicromática aos comprimentos de onda 340/540 nm.

O limite analítico desta técnica é de 6 a 1000 U/L.



Esta determinação está directamente relacionada com a extensão e gravidade de lesão

hepatocelular, sendo mais sensível e específica do que a AST. Esta enzima encontra-se

principalmente no citoplasma dos hepatócitos e em menor quantidade no tecido muscular.

Os valores elevados de ALT podem surgir em várias situações: aumento até 2x o normal

(hepatite crónica, alcoólica ou esteatose hepática), aumento de 20x nas doenças crónicas

hepáticas e aumento de 10 a 100x na hepatite viral. Aumentos consideráveis acontecem nas

obstruções biliares.

Fosfatase alcalina

A determinação da fosfatase alcalina é feita no equipamento Dimension VISTA através do

método p-NPP/AMP a 37ºC taxa bicromática aos comprimentos de onda 405/510 nm. O

limite analítico desta técnica é de 4 a 1000 U/L.



Esta determinação é usada para diagnosticar alterações hepáticas e ósseas. Esta enzima

está presente em quase todo o organismo mas principalmente no fígado e osso. Valores

elevados de fosfatase alcalina aparecem nas doenças hepatobiliares (colestases mas

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principalmente na icterícia obstructiva), doenças do sistema esquelético (doença Paget,

hiperparatiroidismo, raquitismo, osteomalácia, fracturas e tumores malignos).

Gama glutamil transferase (GGT)

A determinação da GGT é feita no equipamento Dimension VISTA através do método GCNA

a 37ºC taxa bicromática aos comprimentos de onda 405/600 nm. O limite analítico desta

técnica é de 3 a 800 U/L.



Esta determinação é usada como indicador precoce de obstrução biliar extrahepática. Esta

enzima encontra-se no rim, pâncreas, fígado, baço e intestino. Valores aumentados de GGT

encontram-se em situações de alcoolismo, toma de medicamentos indutores enzimáticos e

também em pancreatites e tumores do pâncreas, após enfarte do miocárdio, crises de

epilepsia, certos tumores cerebrais e hipertidoidismo.

Bilirrubina total e directa

A determinação da bilirrubina total e directa é feita no equipamento Dimension VISTA

através do método diazo (J-G) sem branco ponto final bicromático aos comprimentos de

onda 540/700 nm. O limite analítico da técnica da bilirrubina total é de 0,1 a 25 mg/dL e o da

bilirrubina directa é de 0,05 a 16 mg/dL.

Como amostra podemos usar soro e plasma EDTA. O plasma heparina lítio não é usado


Esta determinação é usada para determinar a função hepática e a da bilirrubina directa para

avaliar a capacidade do fígado de excretar a bilirrubina. A bilirrubina tem origem no grupo

heme após a libertação do ferro na decomposição dos glóbulos vermelhos e

minoritariamente tem origem na decomposição da mioglobina e citocromos. A bilirrubina é

libertada no plasma (bilirrubina não conjugada ou indirecta), glucoronoconjugada no fígado

(bilirrubina conjugada ou directa) e excretada pelas vias biliares no intestino. A bilirrubina

total é a soma da directa (conjugada) e não conjugada. Valores aumentados de bilirrubina

total encontram-se na hepatite, cirrose, doenças hemolíticas e obstrução hepática, enquanto

que valores aumentados de bilirrubina directa se encontram em algumas doenças

hereditárias (síndroma Dubin-Jonhson) assim como na cirrose, hepatite e obstrução

hepática. A hiperbilirrubinémia superior a 2 ou 3 mg/dL manifesta-se por icterícia

(pigmentação amarela da pele e mucosas). Pode ocorrer fisiologicamente no recém nascido

e na permanência a grandes altitudes.

87

Função pancreática

Amílase

A determinação da amílase é feita no equipamento Dimension VISTA através do método

CNPG3 a 37ºC taxa bicromática aos comprimentos de onda 405/577 nm. O limite analítico

desta técnica é de 2 a 650 U/L.

Como amostra podemos usar soro e urina. O plasma heparina lítio não é usado


Esta determinação é usada para diagnóstico de doenças pancreáticas, especialmente no

diagnóstico e tratamento da pancreatite aguda, embora não seja específica de doença

pancreática. A α amílase é uma enzima produzida no pâncreas e nas glândulas salivares.

Níveis elevados de amílase aparecem na pancreatite aguda, fase inflamatória da pancreatite

crónica, na insuficiência renal, tumores dos pulmões e ovários, doenças das glândulas

salivares, cetoacidose diabética, intervenções cirúrgicas, inflamação pulmonar e

macroamilasémia. Níveis baixos podem ocorrer em doenças hepáticas.

Lípase

A determinação da lípase é feita no equipamento Dimension VISTA através do método

substrato metilresorufina éster a 37ºC cinética bicromática aos comprimentos de onda

577/700 nm. O limite analítico desta técnica é de 10 a 1500 U/L.



Esta determinação é usada no diagnóstico de doenças pancreáticas como a pancreatite

aguda e a obstrucção dos ductos pancreáticos. A lípase é uma enzima pancreática que

degrada os triglicerídeos provenientes da dieta alimentar em glicerol e ácidos gordos livres

na presença de sais biliares.

Função muscular

Creatina quínase (CK)

A determinação da CK é feita no equipamento Dimension VISTA através do método

substrato CP/ADP NADP a NADPH a 37ºC taxa bicromática aos comprimentos de onda


Como amostra podemos usar soro e plasma de EDTA. Os plasmas de heparina lítio e sódio


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Esta determinação pode ser usada para diagnóstico do enfarte do miocárdio e várias

distrofias musculares. A CK é uma enzima dimérica muito abundante no músculo

esquelético, miocárdio e cérebro, em que as subunidades da enzima reflectem a sua

origem: MM (músculoesquelética), MB (miocárdio) e BB (cérebro). No enfarte do miocárdio,

a CK aumenta à 4ª-5ª hora e tem o máximo na 11ª-18ª hora após enfarte, voltando ao

normal após a 48ª hora. Níveis elevados de CK também se encontram na distrofia de

Duchenne, miosite e poliomiosite e após exercício físico intenso, enquanto que níveis baixos

se encontram em pessoas com baixo índice de massa muscular.

Lactato desidrogenase (LDH)

A determinação da LDH é feita no equipamento Dimension VISTA através do método

substrato L-lactato NAD a NADH a 37ºC taxa bicromática aos comprimentos de onda




Esta determinação é usada para diagnóstico e tratamento de doenças hepáticas (hepatite

viral aguda, cirrose e carcinoma metastático), cardiopatias (enfarte do miocárdio) e tumores

renais e pulmonares, mas principalmente como indicador de lesão dos tecidos. A LDH é

uma enzima tetramérica, existente em vários tecidos (coração, pulmão, fígado, rim e

músculo), em que as subunidades da enzima reflectem a sua origem: H (tecidos que

consomem lactato: coração e cérebro) e M (tecidos que produzem lactato: músculos). No

enfarte do miocárdio a LDH atinge o máximo ao 3ºdia e normaliza ao 10ºdia. Níveis altos de

LDH encontram-se no enfarte do miocárdio, anemia hemolítica e doenças hepáticas,

pulmonares e musculares.

Marcadores cardíacos

Troponina I

A determinação da troponina I é feita no equipamento VIDAS através do método ELFA. O

limite analítico desta técnica é de <0,01 a 30 µg/L.



Esta determinação é usada no diagnóstico do enfarte agudo do miocárdio, mas pode

também ser usada como marcador de necrose cardíaca e na monitorização do tratamento

trombolítico. A troponina é uma enzima do músculo estriado com 3 subunidades I, T e C, em

que a isoforma I é libertada precocemente após enfarte agudo do miocárdio, entre a 4ª e a

8ª hora, tendo o seu máximo à 14ª a 36ª hora e permanecendo elevado durante 3 a 7 dias.

89

CKMB

A determinação da CKMB é feita no equipamento Dimension VISTA através do método

imunoinibição com inibição da CKMM cinética bicromática aos comprimentos de onda




Esta determinação é usada no diagnóstico do enfarte agudo do miocárdio. A enzima CKMB

está presente especialmente no miocárdio. Níveis elevados desta enzima, na ausência de

traumatismos musculares maiores, significam lesão cardíaca após enfarte. É detectável a

partir da 5ª hora, atingindo o máximo entre a 11ª e 18ª hora. Pode também aparecer elevada

na doença de Duchenne, na hiperactividade muscular, na hipo e hipertermia e na

miocardite.

Metabolismo do ferro e marcadores de anemia

Ferro

A determinação do ferro é feita no equipamento Dimension VISTA através do método ferene

sem remoção proteínas ponto final bicromático aos comprimentos de onda 600/700 nm. O

limite analítico desta técnica é de 5 a 1000 µg/dL.



Esta determinação é usada para diagnóstico e tratamento da anemia por deficiência de

ferro, hemocromatose, hemosiderose, hemofuscina e doenças crónicas renais. O ferro

proveniente da dieta é absorvido e circula ligado à transferrina, sendo usado na medula

óssea pelos precursores eritróides e o resto armazenado como ferritina e hemosiderina.

Níveis baixos de ferro encontram-se na anemia por má absorção, na dieta pobre em ferro e

na perda de sangue, enquanto que níveis elevados se encontram na hemocromatose e na

doença hepática. As determinações de ferro são usadas em associação com as de ferritina,

transferrina e cálculo da saturação da transferrina para o diagnóstico diferencial e

monitorização das anemias.

Transferrina

A determinação da transferrina é feita no equipamento Dimension VISTA através do método

nefelometria ao comprimento de onda 840 nm. O limite analítico desta técnica é de 35 a 560

mg/dL.

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Esta determinação é usada no diagnóstico diferencial das anemias e na monitorização do

tratamento das patologias secundárias às alterações do metabolismo do ferro. A transferrina

é a principal proteína de transporte do ferro sendo sintetizada no fígado de maneira

inversamente proporcional à quantidade de ferro intracelular: uma diminuição das reservas

de ferro faz aumentar a transferrina e uma sobrecarga de ferro diminui a transferrina. A

transferrina é uma proteína de fase aguda negativa: na inflamação há retenção de ferro nos

macrófagos o que leva a uma diminuição da sua síntese. Níveis baixos de transferrina estão

presentes na doença hepática crónica, síndroma nefrótico, hemocromatose e excesso de

ferro devido a transfusões múltiplas, enquanto que níveis elevados se encontram nas

anemias ferropénicas.

TIBC (Capacidade Total de Fixação do Ferro)

A determinação da TIBC é feita no equipamento Dimension VISTA através do método

ferene ponto final bicromático aos comprimentos de onda 600/700 nm. O limite analítico

desta técnica é de 8 a 1000 µg/dL.



Esta determinação (da capacidade de ligação do ferro da transferrina sérica) é usada no

diagnóstico e tratamento da anemia por deficiência de ferro e nos distúrbios do metabolismo

do ferro.

Ferritina

A determinação da ferritina é feita no equipamento Dimension VISTA através do método

LOCI quimioluminescente aos comprimentos de onda 680/612 nm. O limite analítico desta




Esta determinação é usada no diagnóstico diferencial das anemias e sua monitorização

terapêutica. A ferritina é a principal forma de armazenamento do ferro, especialmente no

fígado e no baço, funcionando como indicador da quantidade de ferro no organismo em

geral e na medula óssea. A determinação de ferritina permite distinguir anemias

hipocrómicas por carência de ferro (ferritina diminui) das anemias inflamatórias (ferritina

aumenta). Assim, níveis baixos de ferritina são encontrados em deficiências de ferro e níveis

altos no excesso de ferro, inflamação e transfusões múltiplas.

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Ácido fólico

A determinação do ácido fólico é feita no equipamento Dimension VISTA através do método

LOCI quimioluminescente aos comprimentos de onda 680/612 nm. O limite analítico desta




Esta determinação é usada para determinar a causa de anemia macrocítica e na

monitorização terapêutica com ácido fólico. O ácido fólico obtido da dieta alimentar é usado

para a síntese do DNA e, portanto, para a maturação dos eritrócitos. Níveis baixos de ácido

fólico estão associados a baixa ingestão, má absorção gastrointestinal, gravidez, fenitoína e

alcoolismo crónico, enquanto que níveis altos podem ser encontrados na anemia perniciosa.

Vitamina B12

A determinação da vitamina B12 é feita no equipamento Dimension VISTA através do

método LOCI quimioluminescente aos comprimentos de onda 680/612 nm. O limite analítico

desta técnica é de 50 a 2000 pg/mL.



Esta determinação é usada para determinar a sua deficiência e para monitorizar a sua

terapêutica. A vitamina B12, ou cianocobalamina, é obtida a partir da dieta alimentar de

origem animal e para ser absorvida requer uma proteína secretada pelas células parietais da

mucosa gástrica (factor intrínseco), sendo armazenada no fígado e na medula óssea. Tal

como o ácido fólico é importante para a síntese do ADN. Níveis baixos de vitamina B12

encontram-se na má nutrição e má absorção, gastrectomia e na anemia perniciosa,

enquanto que valores elevados se encontram nas doenças hepáticas e mieloproliferativas

assim como na falência renal.

Função tiroideia

As determinações da função tiroideia são processadas no equipamento Advia Centaur XP

da Siemens.

92

Figura 35 – Advia Centaur XP

Este equipamento usa a metodologia de quimioluminescência directa com tecnologia de

éster de acridina como marcador quimioluminescente e partículas paramagnéticas como

fase sólida. O peróxido de hidrogénio oxida o éster rapidamente com pico de emissão de luz

e maximiza a emissão de luz pela alteração do ambiente de ácido para básico. São usados

vários foprmatos de imunoensaio para determinação dos antigénios ou anticorpos

pretendidos: formato tipo sandwiche, competitivo e de captura de anticorpos.

Triiodotironina (T3)

A determinação da T3 total é feita no equipamento Advia Centaur XP através do método

imunoensaio competitivo. O limite analítico desta técnica é de 0,1 a 8 ng/mL. Como amostra

podemos usar soro.

Esta determinação é usada como indicador da capacidade da tiróide para responder a

testes estimulantes e repressivos. A T3 é uma hormona que tem origem na secreção da

tiróide (20%) e na transformação de T4 a T3 (80%), em que a secreção é regulada por um

mecanismo de resposta negativa que envolve a glândula tiróide, pituitária e hipotálamo. Tem

maior acção fisiológica que a T4. Circula ligada à tiroxina (TBG), mas apenas a fracção livre

é metabolicamente activa.

Triiodotironina livre (T3 livre)

A determinação da T3 livre é feita no equipamento Advia Centaur XP através do método

imunoensaio competitivo. O limite analítico desta técnica é de 0,2 a 20 ng/mL. Como

amostra podemos usar soro.

Esta determinação é útil quando os níveis de T3 total estão alterados devido às alterações

dos níveis das proteínas de ligação (principalmente a tiroxina). A gravidez e a terapia com

esteróides podem alterar estes níveis, alterando a T3 mas não a T3 livre.

Tiroxina (T4)

A determinação da T4 total é feita no equipamento Advia Centaur XP através do método



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Esta determinação é usada como indicador sensível de hipotiroidismo. A T4 é secretada na

tiróide como resposta à hormona pituitária estimuladora da tiróide (TSH), sendo regulada por

um mecanismo de resposta negativa que envolve a glândula pituitária, tiróide e hipotálamo.

Está ligada maioritariamente à tiroxina, sendo a parte livre metabolicamente activa.

Tiroxina livre (FT4)

A determinação da T4 livre é feita no equipamento Advia Centaur XP através do método



Esta determinação é útil quando os níveis de T4 total estão alterados devido às alterações

dos níveis das proteínas de ligação (principalmente a tiroxina). A gravidez e a terapia com

esteróides podem alterar estes níveis, alterando a T4 mas não a T4 livre.

Hormona estimuladora tiróide (TSH)

A determinação da TSH é feita no equipamento Advia Centaur XP através do método

imunoensaio tipo sandwiche. O limite analítico desta técnica é de 0,010 a 150 ng/mL. Como


Esta determinação é usada na avaliação do funcionamento da tiróide, especialmente no

diagnóstico diferencial entre hipotiroidismo primário (tiróide), secundário (pituitária) e

terciário (hipotálamo). Níveis baixos de TSH encontram-se no hipotiroidismo secundário e

terciário enquanto que níveis altos se encontram no hipotiroidismo primário. A TSH tem

origem na pituitária em resposta a um mecanismo de resposta negativa que envolve os

níveis de T3 livre e T4 livre. A sua função é estimular a segregação de T3 e T4.

Função fertilidade

Algumas determinações da função da fertilidade são processadas no equipamento Advia

Centaur XP da Siemens, enquanto outras são processadas no equipamento Immulite 2000

da Siemens.

94

Figura 36 – Immulite 2000

O equipamento Immulite 2000 usa a metodologia CLIA quimioluminescência. Utiliza esferas

de poliestireno revestidas com anticorpos ou antigénios específicos de cada ensaio como a

fase sólida. É distribuída uma esfera para um tubo de reacção especialmente concebido,

que funciona como recipiente para processos de incubação, lavagem e desenvolvimento de

sinais. Depois de a amostra estar a incubar com um reagente marcado com fosfatase

alcalina, a mistura de reacção é separada da esfera rodando o tubo de reacção a alta

velocidade ao longo do seu eixo vertical. O fluído é transferido para uma câmara onde

ocorrem quatro lavagens distintas, permitindo que os tubos de reacção sejam processados

sequencialmente, com temporização uniforme. A esfera permanece no tubo de reacção sem

qualquer marcação residual não ligada. A marcação ligada é então quantificada utilizando o

substracto de dioxetano para produzir luz. A luz é emitida quando o substracto

quimioluminescente reage com a marcação de fosfatase alcalina ligada à esfera. A

quantidade de luz emitida é proporcional à quantidade de analito originalmente presente na

amostra. Esta emissão de luz é detectada pelo tubo fotomultiplicador (PMT) e os resultados

são calculados para cada amostra.

Hormona foliculoestimulante (FSH)

A determinação da FSH é feita no equipamento Advia Centaur XP através do método

imunoensaio tipo sanduiche. O limite analítico desta técnica é de 0,03 a 200 mIU/mL. Como


A FSH é uma hormona que tem a subunidade alfa em comum com a TSH, a hCG e a LH. É

segregada pela pituitária em resposta à hormona libertadora de gonadotropina (GnRH)

segregada pelo hipotálamo, sendo importante para o normal funcionamento dos sistemas

reprodutores feminino (folículos dos ovários) e masculino (células de Sertoli nos tubos

seminíferos dos testículos). Níveis baixos de FSH encontram-se no hipergonadismo primário

masculino e na hiperfunção primária dos ovários, enquanto que níveis elevados de FSH

surgem na menopausa e hipofunção ovárica e no hipogonadismo primário masculino. Os

níveis de FSH devem ser avaliados em conjunto com os níveis de LH, estrogénios,

progesterona e testosterona.

95

Hormona luteoestimulante (LH)

A determinação da LH é feita no equipamento Advia Centaur XP através do método

imunoensaio tipo sanduiche. O limite analítico desta técnica é de 0,07 a 200 mIU/mL. Como


A LH é uma hormona que tem a subunidade alfa em comum com a TSH, a hCG e a FSH. É

segregada pela pituitária em resposta à hormona libertadora de gonadotropina (GnRH)

segregada pelo hipotálamo, sendo importante, em conjunto com a FSH, para o normal

funcionamento dos sistemas reprodutores feminino (células da tecla dos folículos, folículo

graafiano e corpo lúteo) e masculino (células de Leydig no tecido intersticial dos testículos).

Níveis baixos de LH encontram-se no hipergonadismo primário masculino e na hiperfunção

primária dos ovários, enquanto que níveis elevados de LH surgem na menopausa,

hipofunção ovárica e doença policística e no hipogonadismo primário masculino. Os níveis

de LH devem ser avaliados em conjunto com os níveis de FSH, estrogénios, progesterona e

testosterona.

Progesterona

A determinação da progesterona é feita no equipamento Advia Centaur XP através do

método imunoensaio tipo competição. O limite de sensibilidade desta técnica é de 0,1

ng/mL. Como amostra podemos usar soro.

Esta determinação é usada para detectar o início da ovulação e para detectar possíveis

risco de aborto nas primeiras semanas de gravidez. A progesterona é uma hormona

esteroide sintetizada a partir do colesterol no ovário e placenta (assim como no córtex

adrenal em homens e mulheres) e metabolizada no fígado a pregnandiol. É importante na

preparação e manutenção da gravidez. Níveis elevados de progesterona aparecem durante

a fase luteínica do ciclo menstrual.

Prolactina

A determinação da prolactina é feita no equipamento Advia Centaur XP através do método

quimioluminescência directa tipo sandwiche. O limite de sensibilidade desta técnica é de 0,3

ng/mL. Como amostra podemos usar soro.

Esta determinação é usada na avaliação da amenorreia, galactorreia e desordens

hipotálamo-pituitária. A prolactina é uma hormona segregada pela pituitária anterior e tem

papel principal na secreção de leite materno e também na supressão da função gonadal

além de ser uma hormona de stress. Níveis altos desta hormona podem surgir, além da

gravidez, na terapia com estrogénios e contraceptivos orais.

96

Estradiol

A determinação do estradiol é feita no equipamento Advia Centaur XP através do método

quimioluminescência directa de competição. O limite de sensibilidade desta técnica é de

11,8 pg/mL. Como amostra podemos usar soro e plasma EDTA.

Esta determinação é usada para avaliação da amenorreia e monitorização da indução de

ovulação. O estradiol é uma hormona esteroide segregada pelos folículos do ovário, supra-

renal, corpus luteum, placenta e testículos. Níveis baixos de estradiol na mulher surgem na

menopausa e níveis altos nos homens surgem em casos de ginecomastia.

Testosterona

A determinação da testosterona é feita no equipamento Advia Centaur XP através do

método quimioluminescência directa de competição. O limite analítico desta técnica é de 10

a 1500 ng/dL. Como amostra podemos usar soro.

Esta determinação, em conjunto com a LH, é usada na avaliação do hipogonadismo

masculino. A testosterona é uma hormona esteroide controlada pela LH, tendo como função

a maturação dos genitais externos e órgãos sexuais secundários masculinos e tem efeitos

anabólicos. Níveis baixos de testosterona nos homens encontram-se no hipogonadismo

hipogonadotrópico, insuficiência testicular, hiperprolactinémia, hipopituarismo, certas

doenças hepáticas e renais. Nas mulheres, níveis altos de testosterona encontram-se na

hiperplasia da supra-renal e na síndroma ovária policística, podendo originar amenorreia,

infertilidade, hirsutismo e obesidade.

Função adrenal

Cortisol

A determinação do cortisol é feita no equipamento Advia Centaur XP através do método

quimioluminescência de competição. O limite analítico desta técnica é de 0,20 a 75 µg/dL.

Como amostra podemos usar soro e urina.

Esta determinação é usada como indicador da função adrenocortical, na diferenciação das

doenças de Addison e Cushing, no hipopituitarismo, na hiperplasia adrenal e no carcinoma

adrenal. O cortisol é uma hormona glucocorticoide segregada pelo córtex adrenal, tendo

função antiinflamatória, reguladora da pressão sanguínea, participa na gluconeogénese, na

absorção de cálcio e na secreção de ácido gástrico e pepsina. Existem vários testes

supressores e estimuladores que fornecem informação complementar.

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Hormona adrenocorticotrópica (ACTH)

A determinação da ACTH é feita no equipamento Immulite 2000 através do método

quimioluminescência. O limite de sensibilidade desta técnica é de 5 pg/dL. Como amostra

podemos usar plasma EDTA.

Esta determinação é usada na avaliação da insuficiência adrenal e hipersecreção. A ACTH

é uma hormona segregada na pituitária e funciona como estimulante da secreção de

esteroides pelo córtex adrenal. Níveis baixos de ACTH surgem na insuficiência adrenal

secundária, na síndroma de Cushing e hiperplasia do córtex adrenal, enquanto que níveis

altos surgem na doença de Addison (insuficiência adrenal primária), na hipersecreção de

ACTH pela pituitária ou sua produção ectópica.



O controlo interno da secção da bioquímica é feito todas as manhãs após a realização das

manutenções e calibrações necessárias. Se, ao longo do dia, for necessário proceder à

calibração de novo lote de reagente será feito novo controlo interno dos parâmetros em

causa.


A secção de bioquímica do Labeto participa no programa de avaliação externa da qualidade

da SEQC (Sociedad Española de Bioquímica Clínica e Patología Molecular), mais

especificamente no programa Bioquimica Suero e Bioquímica Proteínas. Também participa

no programa da AEFA/AEBM de Bioquímica Urinas e no programa do Instituo Nacional de

Saúde Dr. Ricardo Jorge (INSA) de Endocrinologia.


Valência de Imunologia

O estágio na valência de imunologia foi realizado no Labeto, Centro de Análises

Bioquímicas SA das 08h00 até às 17h00 durante 35 dias, sob a supervisão da Drª Maria

Beatriz Tomaz dos Santos.

98


manipulação

Para a maioria das análises da valência de imunologia a amostra biológica é o soro obtido

após formação de coágulo e centrifugação a 4000 rpm por 12 minutos. Pode também ser

usado o plasma de EDTA.

As amostras podem chegar ao laboratório por centrifugar, já centrifugadas ou até já

separadas para tubo secundário. A formação e retracção do coágulo deve estar completa

antes de centrifugar. Devemos evitar a presença de fibrina, células sanguíneas, hemólise e

lipémia uma vez que podem interferir no processo de análise de alguns analitos.

As amostras, em tubo primário ou secundário, são então processadas nos vários

equipamentos. Findo o processo de análise as amostras são armazenadas refrigeradas

durante 7 dias.

As amostras provenientes de mulheres grávidas ou não grávidas com pedido de

determinadas análises (toxoplasma, rubéola, citomegalovírus) são armazenadas durante 9

meses para possibilitar uma confirmação de título serológico caso seja necessário.

Patologias infecciosas

A serologia infecciosa inclui uma série de reacções usadas para diagnóstico de patologias

infecciosas através da detecção de anticorpos dirigidos especificamente contra os agentes

etiológicos.

Não é usado qualquer equipamento automático ou semi automático sendo todo o processo

manual. É essencial um olho treinado para visualizar as subtis mudanças na reacção que se

desenvolve.

Reacções de aglutinação

Teste de Waaler Rose

A determinação de Waaler Rose é feita usando o Waaler Rose Slide-Test da bioMérieux que

detecta os factores reumatoides de classe IgM no soro humano através de uma reacção de

Waaler Rose modificada em carta. O limite de detecção desta técnica é de 10 UI/mL.

Os factores reumatoides foram descritos inicialmente por Waaler e Rose como

imunoglobulinas presentes no soro de pessoas com poliartrite reumatoide e que aglutinam

glóbulos vermelhos de carneiro cobertos de IgG de coelho. Estes factores são auto-

99

anticorpos dirigidos contra o fragmento Fc das IgG humanas e animais. Estes anticorpos

pertencem essencialmente à classe das IgM.

A pesquisa dos factores reumatoides é importante para o diagnóstico da poliartrite

reumatoide. No entanto, estes não são específicos desta doença. Não são detectados em

todos os casos de poliartrite reumatoide e podem estar presentes em 1 a 3% pessoas sãs

assim como em pacientes com outras doenças (lúpus eritematoso disseminado, hepatite,

cirrose do fígado, sífilis, etc).

Após os reagentes atingirem a temperatura ambiente numa carta fazemos um círculo com

soro controlo positivo e dois círculos com amostra controlo. Ao controlo e uma das amostras

adicionamos hemácias de carneiro sensibilizadas com γ globulinas de carneiro e à outra

amostra adicionamos hemácias testemunho de carneiro (permite eliminar interferências

devido à presença de aglutininas naturais). Homogeneizar a mistura com um agitador por

local e rodar a carta lentamente durante 3 a 5 minutos. Após os 5 minutos não se deve

valorizar qualquer resultado.

A aglutinação da amostra com as hemácias sensibilizadas e a não aglutinação com as

hemácias testemunho permite identificar a presença de factores reumatoides, sendo que o

controlo deve sempre aglutinar. Se a suspensão se mantiver homogénea nos dois locais a

presença de factores reumatoides ou é negativa ou inferior ao limite de detecção.

Antigénios febris

A determinação de antigénios febris é feita usando o kit da Laboratory Diagnostics que inclui

os antigénios de Brucella abortus e Proteus OX19 (Reacção de Weil-Felix), e os antigénios

flagelares (H) e somáticos (O) de Salmonella typhi (Reacção de Widal) para a determinação

de testes de aglutinação qualitativos e semiquantitativos de anticorpos originários de

doenças infecciosas com febre persistente como a salmonelose (febre tifoide), brucelose e

rickettsiose.

Tanto a reacção de Widal como a de Weil-Felix são realizadas em lâmina de vidro

(confirmação de resultados positivos em tubo) em que as aglutininas (anticorpos) da

amostra em contacto com os antigénios correspondentes provocam aglutinação visível após

2-3 minutos de rotação. Esta aglutinação depende da concentração de antigénio, título de

anticorpos presente, composição da solução e temperatura. A aglutinação pode ocorrer em

amostras de indivíduos saudáveis, como resultado de imunização prévia, infecção passada,

ou presença de anticorpos contra antigénios semelhantes. Nestes casos os títulos deverão

ser baixos e manter-se constantes. O título dos anticorpos aumenta consideravelmente

entre a infecção aguda e a convalescença fazendo com que um aumento de título em

amostras colhidas entre a fase aguda e a convalescença possa ser significado de

diagnóstico.

Outro teste usado para a detecção de aglutininas específicas da Brucelose é o kit

Brucelloslide-Test da bioMérieux: numa carta o antigénio é misturado com o soro a testar e

após rotação durante 4 minutos é efectuada a leitura. Usa o princípio da prova ao antigénio

tamponado (Rosa Bengala) em que, havendo aglutinação mesmo que fraca, permite o

100

diagnóstico de brucelose em fase aguda (presença de aglutininas específicas da brucelose:

Brucella mellitensis, abortus, bovis e suis). Este teste dá uma resposta mais precoce, mais

sensível e mais duradoura em comparação com a seroaglutinação de Wright.

Teste de RPR

A determinação da sífilis é feita usando o kit RPR-nosticon II da bioMérieux que é um teste

de floculação não treponémico macroscópico que detecta a presença da reagina do

Treponema pallidum. A infecção por esta espiroqueta leva ao aparecimento de anticorpos

designados de reaginas. O soro a testar é colocado num cartão teste e é adicionada,

verticalmente, uma gota de reagente bem homogeneizado. Sem misturar, sofre rotação a

100 rpm sendo o resultado lido no intervalo de 8 minutos.

O antigénio deste teste é uma variação do antigénio VDRL clássico (cardiolipina, lecitina e

colesterol): contém carbono em micropartículas que num resultado positivo dá origem a

flóculos pretos visíveis macroscopicamente que diagnosticam a suspeita de sífilis.

Mononucleose infecciosa

A determinação qualitativa dos anticorpos heterófilos associados à mononucleose infecciosa

em soro humano é feita usando o kit Monoslide-Test da bioMérieux: teste rápido de

aglutinação (rastreio e absorção diferencial) em placa constituído por hemácias de cavalo,

hemácias de boi e células de rim de cobaia (contém antigénios de Forssman).

A mononucleose infecciosa (MNI) é a fase aguda de uma doença de origem viral provocada

pelo vírus de Epstein Barr que pertence à família dos herpes humanos. Normalmente ocorre

na adolescência ou no adulto jovem sendo, na maior parte das vezes, inaparente com

sintomas são pouco específicos: febre, faringite, adenopatia que pode evocar diversas

patologias (mononucleose, toxoplasmose, infecção por CMV, etc). Os doentes atingidos por

MNI possuem no seu soro anticorpos heterófilos que reagem nos glóbulos vermelhos de

diferentes espécies. Estes anticorpos heterófilos podem também encontrar-se nas pessoas

sem patologia.

O teste de rastreio (Hoff e Bauer) permite a detecção de uma aglutinação das hemácias de

cavalo pelos anticorpos heterófilos associados à MNI, mas também pelos anticorpos de tipo

Forssman não específicos. Em lâmina a gota de soro a testar é misturada com a gota de

reagente com antigénio MNI, agita-se durante 1 minuto e repousa durante 1 minuto.

No caso de positividade do teste de rastreio (aglutinação), o teste de absorção diferencial de

Davidsohn permite distinguir os anticorpos associados à MNI dos anticorpos de tipo

Forssman não específicos: absorção dos anticorpos de tipo Forssman pelo antigénio de boi

e absorção dos anticorpos associados à mononucleose pelo antigénio de rim de cobaia.

101

Patologias autoimunes

Anticorpos Antitiroideus

A determinação dos anticorpos antitiroideus é feita no equipamento Advia Centaur XP da

Siemens já descrito anteriormente e compreende a determinação dos anticorpos

antitiroglobulina e dos anticorpos antiperoxidase. Esta técnica consiste num imunoensaio

competitivo de quimioluminescência directa: existe uma relação inversa entre a quantidade

de analito presente na amostra e a quantidade de RLUs (unidades relativas de luz)

provenientes dos agentes marcados com éster de acridina.

Anticorpos Antitiroglobulina

A determinação de auto-anticorpos contra a tiroglobulina é útil na identificação de doentes com doença da tiróide auto-imune. A tiroglobulina tem um importante papel na biosíntese das hormonas da tiróide, T3 e T4. O nível de anticorpos anti-Tg aumenta 80 a 100% dos doentes com tiroidite de Hashimoto ou crónica, em 60 a 70% dos doentes com doença de Graves e em 10 a 20% dos doentes com tiroidite subaguda. Devido à heterogeneidade da tiroglobulina, anticorpos anti-tiroglobulina foram detectados em outros estados de doenças, em idosos e também em doentes clinicamente normais com eutiroidismo. O limite analítico desta técnica é de 10 U/ml.

Anticorpos Antiperoxidase

A medição de auto-anticorpos contra a peroxidase tiroideia é útil na identificação de doentes

com doença da tiróide auto-imune. A TPO, componente principal de uma grande proteína

conhecida como antigénio microssomal da tiróide, catalisa a iodação dos grupos tirosil da

tiroglobulina resultando na síntese das hormonas tioideiaas T3 e T4.

Os níveis de anticorpos anti-TPO são elevados em mais de 90% dos doentes com tiroidite

auto-imune activa. Os anticorpos anti-TPO activam o complemento e pensa-se que estejam

significativamente envolvidos na disfunção da tiróide e na patogénese do hipotiroidismo. Os

anticorpos anti-TPO estão presentes em quase todos os doentes com tiroidite de Hashimoto

e em mais de 70 % dos doentes com doença de Graves. Os anticorpos anti-TPO estão

também presentes em doentes com tiroidite atrópica e mixedema primário.

O limite analítico desta técnica é de 15 U/ml.

Patologias alérgicas

As determinações de IgE total e IgE específicas são efectuadas no equipamento

ImmunoCAP 250 da Thermo Scientific.

102

Figura 37 – ImmunoCAP 250

Este equipamento utiliza polímeros hidrofílicos e flexíveis de um derivado activado de

celulose contido numa cápsula e ELIA Wells (poços em poliestireno revestidos com

antigénios ou anticorpos) como fase sólida para determinar quantitativamente a presença de

anticorpos contra determinados parâmetros.

IgE total

A IgE participa no mecanismo de hipersensibilidade alérgica originada por alergenos, sejam

ambientais ou alimentares. Após início da reacção, os linfócitos diferenciam-se em

plasmócitos que produzem anticorpos (IgE) que se ligam aos mastócitos e basófilos

sensibilizando estas células. Numa segunda exposição ao alergeno, há desgranulação

destas células com libertação de substâncias que levam à vasodilatação e contracção dos

músculos lisos.

A determinação da IgE total mede a IgE no soro ou plasma humano em concentrações entre

2 a 5000 ku/L. Uma maior quantidade de IgE reflecte um maior grau de exposição ou maior

quantidade de alergenos.

IgE específica

Os anticorpos IgE específicos aparecem como resultado de uma exposição a alergenos e

definem a sensibilização a esses alergenos. A presença de anticorpos IgE específicos é útil

para identificar os alergenos que dão origem a sinais e sintomas de alergias em pacientes

com doenças alérgicas respiratórias incluindo asma, alergias alimentares e sensibilidade

anafilática.

As IgEs específicas mais comuns no laboratório incluem ácaros, pós, epitélios, árvores,

ervas, gramíneas e alimentos.

103

Patologias virais

As determinações de marcadores para diagnóstico de patologias virais são processadas nos

equipamentos Advia Centaur XP, Immulite 2000 e VIDAS, anteriormente descritos.

VIH

A determinação do VIH é feita no equipamento Advia Centaur XP através do método

imunoensaio tipo sanduiche com dupla lavagem usando o reagente Advia Centaur XP HIV

ag/ab Combo (CHIV de 4ª geração). O reagente tem antigénios recombinantes de proteína

do invólucro (gp41/120) e do núcleo (p24) do VIH 1, de uma proteína do envelope (gp36) do

VIH 2 e antigénio de péptido sintético para a detecção de anticorpos do VIH 1 grupo O,

assim como três anticorpos monoclonais específicos para detectar o antigénio p24. Existe

uma relação directa entre a quantidade de anticorpos VIH 1 e 2 e/ou antigénio p24 na

amostra e a quantidade de unidades relativas de luz detectadas pelo sistema.

Qualquer resultado positivo sem histórico neste equipamento é repetido novamente e

confirmado noutro equipamento: VIDAS com o kit HIV Duo Ultra teste também de 4ª geração

com detecção de VIH 1, VIH 1 grupo O, VIH 2 (IgG e IgM) e antigénio VIH 1 através da

técnica ELFA.

O vírus da imunodeficiência humana é o agente causador da síndroma de imunodeficiência

adquirida (SIDA).

VHC

A determinação do VHC é feita no equipamento Advia Centaur XP através do método

imunoensaio indirecto tipo sanduiche com dupla lavagem usando o reagente Advia Centaur

XP aHCV. Utiliza dois antigénios peptídicos recombinantes codificados (c200 e NS5) e um

péptido (c22) de núcleo codificado de VHC sintético.

Uma amostra considerada duvidosa ou negativa é duplamente repetida após centrifugação.

O VHC é o principal agente etiológico de hepatite não A e não B crónica. A presença de

anticorpos contra o VHC indica que um indivíduo pode ter sido infectado com VHC ou que

pode ser capaz de transmitir a infecção por VHC. É, frequentemente, assintomática, embora

a maioria (mais de 80%) dos indivíduos expostos ao VHC fique infectada de forma crónica.

Em 20% destes indivíduos infectados de forma crónica, a doença progride para cirrose,

insuficiência hepática e, possivelmente, carcinoma hepatocelular ou colangiocarcinoma.

VHA

A determinação dos anticorpos totais para VHA é feita no equipamento Advia Centaur XP

através do método imunoensaio competitivo quimioluminométrico usando o reagente Advia

Centaur XP aHAVT enquanto que a determinação do VHA IgM é feita através do método

104

imunoensaio quimioluminométrico de micropartículas de captura usando o reagente Advia

Centaur XP aHAVM.

Normalmente, a IgM anti-VHA é detectável durante 3 a 6 meses após o aparecimento da

doença, enquanto a IgG anti-VHA pode persistir indefinidamente. O ensaio ADVIA Centaur

HAV Total detecta todas as classes de anticorpos contra o vírus da hepatite A. A detecção

da actividade total anti-VHA é utilizada para identificar indivíduos susceptíveis e para

determinar a aquisição de imunidade após a vacinação. Devido à produção transitória de

IgM anti-VHA, a sua presença em soros indica uma infecção em curso ou recente e é o

marcador serológico mais útil para o diagnóstico de infecção aguda pelo VHA.

VHB

A determinação do VHB é feita no equipamento Advia Centaur XP usando reagentes

específicos para cada marcador da hepatite B: AgHBs, AcHBs, AcHBc, AcHBcIgM, AgHBe e

AcHBe.

AgHBs

A determinação do antigénio de superfície da hepatite B é feita no equipamento Advia

Centaur XP através do método imunoensaio directo tipo sanduiche quimioluminométrico

usando o reagente Advia Centaur XP HBs. Existe uma relação directa entre a quantidade de

actividade do AgHBs presente na amostra do doente e a quantidade de unidades de luz

relativas (RLUs) detectada pelo sistema.

O AgHBs é um marcador serológico distintivo da hepatite B aguda ou crónica. É o primeiro

antigénio a aparecer após a infecção com o vírus da hepatite B e é geralmente detectado

entre 1 a 10 semanas antes do início dos sintomas clínicos. Os ensaios de AgHBs são

regularmente utilizados para diagnosticar infecções pelo VHB e para monitorizar o estado de

indivíduos infectados, com o intuito de determinar se a infecção desapareceu ou se o doente

se tornou num portador crónico do vírus. Nos doentes que recuperam da infecção pelo VHB,

os níveis do AgHBs desaparecem entre 3 a 5 meses após o início da infecção. Nos doentes

com infecção crónica pelo VHB, os níveis do AgHBs são detectáveis durante toda a vida.

Para além disso, os ensaios AgHBs são utilizados para avaliar a eficácia de fármacos anti-

víricos através da monitorização dos níveis do AgHBs no soro ou plasma do doente. O

rastreio pré-natal do AgHBs tem sido recomendado para que os recém-nascidos de mães

portadoras do VHB possam obter tratamento profilático.

AcHBs

A determinação do anticorpo de superfície da hepatite B é feita no equipamento Advia

Centaur XP através do método imunoensaio directo tipo sanduiche quimioluminométrico

usando o reagente Advia Centaur XP aHBs2. Existe uma relação directa entre a quantidade

de actividade do AcHBs presente na amostra do doente e a quantidade de unidades de luz

relativas (RLUs) detectada pelo sistema.

105

A presença do anticorpo contra o antigénio de superfície da hepatite B (anti-HBs) é utilizada

para determinar o estado imunitário relativamente ao VHB ou a progressão da doença em

indivíduos infectados por VHB. Um aumento dos níveis de anti-HBs, juntamente com uma

perda de antigénio de superfície da hepatite B (AgHBs) circulante detectável, denota

convalescença em infecções por hepatite B. Além disso, os níveis de anti-HBs podem ser

medidos para determinar a necessidade de vacinação ou, após um regime de vacinação,

para determinar se a imunidade de protecção foi alcançada.

AcHBc

A determinação do anticorpo central da hepatite B é feita no equipamento Advia Centaur XP

através do método imunoensaio tipo sanduiche com duas lavagens usando o reagente

Advia Centaur XP HBcT.

O antigénio central da hepatite B (AgHBc), que se encontra nas células hepáticas, não

circula na corrente sanguínea. No entanto, os anticorpos IgM e IgG contra o AgHBc podem

ser detectados serologicamente em indivíduos infectados pelo VHB. A IgM anti-HBc é

detectável em primeiro lugar e permanece detectável durante aproximadamente seis meses.

Pouco depois da resposta da IgM, surge a IgG anti-HBc, podendo permanecer detectável

indefinidamente. A presença da IgM anti-HBc é característica da infecção aguda, enquanto a

presença da IgG anti-HBc é característica da infecção por VHB em fases crónicas ou de

recuperação. Os ensaios de anti-HBc total detectam as respostas da IgM e da IgG anti-HBc.

O mais frequente é os níveis de anti-HBc coincidirem com os níveis detectáveis de outros

marcadores do VHB. Raramente, o anti-HBc pode ser o único marcador do VHB detectável.

Isto pode ocorrer durante o breve período em que o antigénio de superfície da hepatite B

(HBsAg) foi eliminado da corrente sanguínea e antes de os anticorpos contra o antigénio de

superfície da hepatite B (anti-HBs) se tornarem detectáveis. Por esta razão, não se

recomenda a utilização de ensaios de anti-HBc total para detectar uma infecção aguda. Os

ensaios de anti-HBc total devem ser utilizados conjuntamente com outros ensaios de

marcadores para avaliar a exposição actual ou anterior ao VHB.

AcHBcIgM

A determinação da IgM do anticorpo central da hepatite B é feita no equipamento Advia

Centaur XP através do método imunoensaio tipo captura usando o reagente Advia Centaur

XP aHBcM.

As titulações de IgM anti-HBc aumentam rapidamente, atingem o pico durante a fase de

infecção por VHB aguda, decaindo para um nível relativamente baixo à medida que o

doente recupera ou se torna um portador crónico. As titulações de IgM anti-HBc são úteis no

diagnóstico de infecção por VHB aguda, mesmo quando as concentrações de AgHBs se

situam abaixo da sensibilidade do ensaio de diagnóstico. A IgM anti-HBc é possivelmente o

único marcador específico para o diagnóstico de infecção aguda por hepatite B. A utilização

de outros marcadores virais como o AgHBs, anti-HBs e anti-HBc total para diferenciar a

hepatite B aguda da crónica é inconclusiva, porque a maioria destes marcadores também se

encontra numa infecção crónica.

106

AgHBe

A determinação do antigénio e da hepatite B é feita no equipamento Advia Centaur XP

através do método imunoensaio tipo sanduiche com duas lavagens usando o reagente

Advia Centaur XP HBeAg.

A detecção do antigénio HBe no soro e plasma é um indicador de infecção activa e vírus em

replicação. O desaparecimento do antigénio AgHBe e o aparecimento de anti-HBe

juntamente com outros marcadores do VHB permitem ao clínico determinar um prognóstico

e seguir a progressão da doença desde o estado agudo a crónico ou de recuperação, bem

como monitorizar a terapêutica anti-viral. O ensaio AgHBe destina-se a ser utilizado como

um auxiliar no diagnóstico e monitorização de doentes com infecção viral por hepatite B,

quando utilizado em conjunto com os resultados de ensaios de outros marcadores do VHB.

AcHBe

A determinação do anticorpo e da hepatite B é feita no equipamento Advia Centaur XP

através do método imunoensaio competitivo/neutralizador com duas lavagens usando o

reagente Advia Centaur XP aHBe.

O anti-HBe surge pouco depois do fim da fase aguda da infecção por VHB e está presente à

medida que o doente recupera ou se torna um portador crónico. O anti-HBe deixa de estar

presente quando se conclui a recuperação da infecção por VHB. Embora o anti-HBe possa

estar presente com o AgHBs em portadores crónicos, a presença de anti-HBe na ausência

de AgHBs é uma indicação de recuperação precoce ou em curso. O aparecimento do anti-

HBe é um indicador da eficácia do tratamento no caso de portadores crónicos de VHB

submetidos a tratamento com medicamentos antivirais.

CMV

A determinação das IgG e IgM do citomegalovírus é feita no equipamento Immulite 2000. A

determinação da avidez das IgG é feita no equipamento VIDAS.

CMV IgG

O reagente é o Immulite 2000 CMVG que usa o método de imunoensaio

quimioluminescente sequencial.

O CMV é um vírus da família dos herpesvírus e dá origem a infecções maioritariamente

assintomáticas excepto nos neonatos e indivíduos imunocomprometidos. 40 a 100% da

população tem anticorpos para CMV. As IgG surgem uma a duas semanas após

aparecimento da infecção primária, não sofrendo subidas acentuadas em caso de

reactivação do vírus.

107

CMV IgG Avidez

O reagente é o VIDAS CMV IgG Avidity II da bioMérieux que usa o método de sandwiche

imunoenzimático de duas etapas com detecção final em fluorescência (ELFA).

As IgG do CMV são inicialmente de baixa avidez mas maturam para alta avidez alguns

meses após infecção primária. Sendo assim, um indíce de alta avidez permite eliminar uma

infecção recentemente adquirida (com menos de 3 meses). A determinação deste indíce

não pode ser interpretado quando as IgG do CMV são inferiores a 6 Ua/mL ou superiores a

400 Ua/mL. As amostras negativas em IgM e que apresentem uma fraca titulação em IgG

(entre 6 e 12 Ua/ml) devem ser interpretadas tendo em conta o contexto clínico associado.

CMV IgM

O reagente é o Immulite 2000 CMVM que usa o método de imunoensaio

quimioluminescente em três passos.

A presença de anticorpos IgM é um indicador fiável de infecção activa: o seu aparecimento

coincide com o início dos sintomas e sofre uma descida até níveis indetectáveis após vários

meses.

Rubéola

A determinação das IgG e IgM da rubéola é feita no equipamento Immulite 2000.

Rubélola IgG

O reagente é o Immulite 2000 RUB que usa o método de imunoensaio quimioluminescente

sequencial.

A infecção por rubéola é normal na infância mas as infecções durante a gravidez podem ter

graves consequências. A presença de anticorpos IgG para rubéola indica uma vacinação ou

infecção prévia e é indicativo de imunidade se o título for superior a 10 IU/mL.

Rubéola IgM

O reagente é o Immulite 2000 RUM que usa o método de imunoensaio quimioluminescente

em dois passos.

A presença de anticorpos IgM para rubéola surge alguns dias após o aparecimento dos

sintomas ou após a vacinação. É atingido o pico de anticorpos em 3 a 6 semanas e diminui

gradualmente durante vários meses.

108

Toxoplasma gondii

A determinação das IgG e IgM do toxoplasma é feita no equipamento Immulite 2000.

Toxoplasma IgG

O reagente é o Immulite 2000 TXP que usa o método de imunoensaio quimioluminescente

sequencial.

O Toxoplasma gondii é um parasita intracelular obrigatório e as suas infecções podem ser

assintomáticas e permanecer latentes para toda a vida. Tem consequências mais graves se

surgir durante a gravidez e nos imunocomprometidos. A determinação dos anticorpos IgG

determina uma infecção prévia ou uma reactivação da infecção. Os anticorpos surgem 1 a 2

semanas após a infecção, atingindo um pico às 6 a 8 semanas, decrescendo durante vários

meses ou anos. O título de anticorpos não tem relação com a severidade da doença.

Toxoplasma IgM

O reagente é o Immulite 2000 TXU que usa o método de imunoensaio quimioluminescente

em dois passos.

A determinação de anticorpos IgM é essencial para o diagnóstico de infecção aguda. As IgM

surgem imediatamente antes ou junto com o aparecimento dos sintomas. O seu título

diminui durante 4 a 6 meses mas pode persistir em baixos níveis até um ano.

Patologias oncológicas

As análises dos marcadores tumorais são processadas no equipamento Advia Centaur XP

da Siemens já descrito anteriormente.

PSA

O antigénio específico da próstata (PSA) é uma glicoproteína de cadeia única normalmente

encontrada no citoplasma das células epiteliais revestindo os ácinos e vasos da glândula

prostática. É detectado no soro de homens com tecido da próstata normal, hipertrófico

benigno e maligno, não sendo detectado no soro de homens sem tecido da próstata (devido

a prostatectomia ou cistoprostatectomia radical) ou no soro da maioria das mulheres. O

facto de o PSA ser exclusivo do tecido da próstata torna-o um marcador adequado para a

monitorização de homens com cancro da próstata e para a determinação de uma possível

recorrência após a terapêutica quando utilizado juntamente com outros índices. A medição

109

de PSA, juntamente com o toque rectal e uma ecografia, constitui um método optimizado de

detectar o cancro da próstata.

PSA Total

A determinação do PSA é feita usando o reagente ADVIA Centaur PSA que é um

imunoensaio sanduíche em dois locais, utilizando tecnologia quimioluminométrica directa

que, por sua vez, utiliza quantidades constantes de dois anticorpos: um anticorpo anti-PSA

policlonal de cabra marcado com éster de acridinio e um anticorpo anti-PSA monoclonal de

ratinho covalentemente associado a partículas paramagnéticas.

PSA Livre

A determinação do PSA livre (fPSA) é feita usando o reagente ADVIA Centaur fPSA que é

um imunoensaio sanduíche em dois locais, utilizando tecnologia quimioluminométrica directa

que, por sua vez, utiliza dois anticorpos monoclonais de ratinho: um anticorpo anti-PSA

marcado com éster de acridinio e um anticorpo anti-PSA livre marcado com biotina e ligado

a partículas paramagnéticas de estreptavidina.

As principais formas imunorreactivas de PSA no soro incluem o PSA livre e complexos de

PSA, essencialmente com α-1-antiquimotripsina e pequenas quantidades de inibidor de α-2-

antitripsina e inter-α-tripsina. A maioria do PSA livre no soro aparenta estar na forma

inactiva, não podendo formar complexos com inibidores da protease e podendo ser um

zimogénio do PSA ou uma forma cortada de PSA enzimaticamente inactiva.

Existe uma maior probabilidade de detecção de cancro da próstata através de biópsia à

medida que aumentam os níveis de PSA. No intervalo de PSA entre 4–10 ng/ml, também

designado por zona cinzenta de diagnóstico, a percentagem de fPSA (fPSA/tPSA x 100) tem

uma utilidade acrescida: quanto mais baixa for a percentagem de fPSA, maior é o risco de

cancro da próstata.

CEA

A determinação do CEA (antigénio carcinoembrionário) é feita com o reagente ADVIA

Centaur CEA que é um imunoensaio em sanduíche em dois locais, utilizando tecnologia

quimioluminométrica directa que, por sua vez, utiliza quantidades constantes de dois

anticorpos: um anticorpo policlonal anti-CEA purificado de coelho marcado com éster de

acridinio e um anticorpo monoclonal anti-CEA de ratinho covalentemente associado a

partículas paramagnéticas.

O CEA é um marcador tumoral chamado de proteína oncofetal. Foram detectados níveis

aumentados de CEA no soro em pessoas com cancro colorrectal primário, cancro no tracto

gastrointestinal, mama, pulmão, ovários, próstata, fígado e pâncreas e no soro de doentes

com doença não maligna, especialmente nos doentes mais idosos ou fumadores. Os níveis

110

de CEA não são úteis no rastreio da população em geral mas fornecem informações

importantes sobre o prognóstico do doente, recorrência dos tumores após remoção cirúrgica

e eficácia da terapêutica. Por norma, os níveis de CEA regressam aos níveis normais ou a

valores próximos destes no espaço de 1 a 4 meses após a remoção cirúrgica de tecido

canceroso. Um aumento dos níveis de CEA podem ser a primeira indicação de recorrência e

podem preceder os sinais físicos e sintomas.

O CEA consiste numa ferramenta útil para a monitorização e gestão da terapêutica para o

cancro e fornece ao médico informações adicionais sobre o prognóstico do doente.

CA 15.3

A determinação do CA 15.3 é feita com o reagente ADVIA Centaur CA 15-3 que é um

imunoensaio em sanduíche em duas etapas utilizando tecnologia quimioluminométrica

directa.

O cancro da mama metastásico é normalmente associado a antigénios circulantes

relacionados com o cancro, como o CA 15.3. Quando utilizado em conjunção com outros

procedimentos clínicos e de diagnóstico, as determinações de CA 15.3 são úteis para a

monitorização do progresso da doença e da terapêutica em doentes com cancro da mama

metastásico, e para a detecção de recidivas em doentes com cancro da mama

anteriormente tratados.

CA 125

A determinação do CA 125 é feita com o reagente ADVIA Centaur CA 125II que é um


que, por sua vez, utiliza dois anticorpos monoclonais de ratinho específicos do CA 125.

O CA 125 é um antigénio de superfície associado a cancro epitelial não mucinoso dos

ovários, sendo libertado ou secretado pela superfície de células cancerígenas do ovário. A

determinação dos níveis de CA 125 não são usados para rastreio ou diagnóstico de cancro

dos ovários mas como um auxiliar na monitorização e progressão ou regressão da doença

como resposta ao tratamento de cancro do ovário.

CA 19.9

A determinação do CA 19.9 é feita com o reagente ADVIA Centaur CA 19-9 que é um


que, por sua vez, utiliza um anticorpo monoclonal.

111

As determinações de CA 19.9 são mais úteis no diagnóstico e tratamento de doentes com

neoplasias pancreáticas do que com neoplasias do cólon e constituem, actualmente, a

análise ao sangue mais útil para a diferenciação entre doenças pancreáticas benignas e

malignas. A diminuição acentuada destes níveis após cirurgia de remoção do cancro é factor

de bom prognóstico.

Também é utilizada como um auxiliar na monitorização de doentes anteriormente tratados

devido a cancro gastrointestinal (cancros dos canais biliares, hepatocelulares, gástricos, do

cólon, esofágicos e não-gastrointestinais) e, nos doentes que estão clinicamente livres da

doença, devendo ser usado conjuntamente com outros métodos clínicos para a detecção

precoce de recidivas deste cancro. Pode também ser usado como um auxiliar no tratamento

de doentes de cancro gastrointestinal com doença metastática através da monitorização da

progressão ou regressão da doença como resposta ao tratamento.

Alfa-fetoproteína

A determinação da alfa-fetoproteína (AFP) é feita com o reagente ADVIA Centaur AFP que é

um imunoensaio sanduíche em dois locais, utilizando tecnologia quimioluminométrica directa

que, por sua vez, utiliza dois anticorpos monoclonais.

Níveis altos de AFP podem ser encontrados não só, no caso de doentes com cancro

testicular seminomatoso, mas também em outras doenças malignas e não malignas,

enquanto que baixas concentrações de AFP não são necessariamente indicativas de

ausência de doença, particularmente após uma cirurgia ou quimioterapia.

Nos adultos, as concentrações de AFP no soro permanecem baixas, excepto durante uma

gravidez, doenças benignas do fígado (hepatite, cirrose), carcinoma hepatocelular primário e

determinados tumores das células germinais. Durante a gravidez, os níveis de AFP no soro

materno aumentam durante o terceiro trimestre. Níveis altos ou reduzidos de AFP podem

indicar a existência de problemas fetais. No laboratório não procedemos à análise de

rastreio maternofetal.

Beta-HCG

A determinação da beta-HCG (hormona gonadotropina coriónica humana) é feita com o

reagente ADVIA Centaur Total hCG que é um imunoensaio sanduíche em dois locais,

utilizando tecnologia quimioluminométrica directa que, por sua vez, utiliza dois anticorpos

monoclonais.

A HCG é uma glicoproteína com duas subunidades não ligadas por covalência. A

subunidade alfa é semelhante às da hormona luteinizante (LH), da hormona

foliculoestimulante (FSH) e da hormona estimulante da tiróide (TSH)1,2. A subunidade beta

da HCG é diferente das outras hormonas glicoproteicas pituitárias, o que resulta em

propriedades bioquímicas e imunológicas únicas. A HCG é sintetizada pelas células da

112

placenta e está envolvida na manutenção do corpo lúteo durante a gravidez. Detecta-se logo

na primeira semana após a concepção. Este teste pode ser utilizado para detectar a

gravidez no primeiro dia do período menstrual em falta.

Na gravidez, os níveis de HCG aumentam exponencialmente durante 8 a 10 semanas após

o último ciclo menstrual. Mais tarde, durante a gravidez, cerca de 12 semanas após a

concepção, a concentração de HCG começa a baixar à medida que a placenta começa a

produzir hormonas esteróides. Outras fontes de valores elevados de HCG são a gravidez

ectópica, a ameaça de aborto e o fim recente de uma gravidez.



O controlo interno da secção da imunologia é feito todas as manhãs após a realização das

manutenções e calibrações necessárias. Se, ao longo do dia, for necessário proceder à

calibração de novo lote de reagente será feito novo controlo interno dos parâmetros em

causa.


A secção de imunologia do Labeto participa no programa de avaliação externa da qualidade

da SEQC (Sociedad Española de Bioquímica Clínica e Patología Molecular), mais

especificamente no programa Marcadores Tumorais e Serologia. Também participa em

vários programas do Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge (INSA): Citomegalovírus

e Toxoplasmose.


113

Bibliografia Relatório de Estágio

1. Betty A. Forbes, Daniel F. Sahm, Alice S. Weissfeld. Diagnostic microbiology. 11th Edition.

Bailey and Scotts; 2002.

2. Michael J. Pelczar Jr., E. C. S. Chan, Noel R. Krieg. Microbiology Concepts and

applications. International edition. McGraw-Hill, Inc. 1993.

3. John Bernard Henry. Clinical diagnosis and management by laboratory methods. 19th

Edition. Saunders. 1996.

4. William J. Marshall. Clinical chemistry. 3rd Edition. Mosby. 1988.

5. Direcção Geral de Saúde. Diagnóstico e Classificação da Diabetes Mellitus.

Departamento da Qualidade na Saúde. 2011 (Norma 002/2011). Lisboa: DGS; 2011

6. Direcção Geral de Saúde. Avaliação do Risco Cardiovascular SCORE (Systematic

Coronary Risk Evaluation). 2011 (Norma 005/2011). Lisboa: DGS; 2011

7. Instruções de utilização e fundamento teórico dos testes semi-automatizados e manuais 8. Instruções de utilização e fundamento teórico dos kits (VITEK 2 XL, Dimension VISTA 1500, Capillarys 2, VIDAS, Aution Max AU 4280, Sedimax, Advia Centaur XP, Immulite 2000, ImmunoCAP 250) 9. Manual do Operador (VITEK 2 XL, Dimension VISTA 1500, Capillarys 2, VIDAS, Aution Max AU 4280, Sedimax, Advia Centaur XP, Immulite 2000, ImmunoCAP 250) 10. https://www.healthcare.siemens.com/

11. http://www.sebia.com/

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Texto redigido em conformidade com o acordo ortográfico da língua portuguesa em vigor

desde 2009

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