Universidade de Lisboa Faculdade de...

Universidade de Lisboa

Faculdade de Farmácia

O ESTUDO DA COINFECÇÃO LEISHMANIOSE-HIV EM MULHERES

GRÁVIDAS: PREVENÇÃO DA TRANSMISSÃO VERTICAL E INFEÇÃO

CONGÉNITA

Stefanie Paixão Baptista

Relatório de estágio orientado pela Prof. Doutora Quirina dos Santos Costa

e coorientado pelo Dr. Carlos Cardoso

Mestrado em Análises Clínicas

2018

Parte I

IX Mestrado Análises Clínicas Parte I

Stefanie Baptista Prefácio

v

Prefácio

Tendo em mente que o incrível corpo humano sempre me fascinou, bem como

tudo o que está relacionado com a área da saúde, licenciei-me no curso de Ciências da

Saúde pela Universidade de Lisboa, que me deu bases nas várias áreas da saúde. Durante

os três anos adquiri conhecimentos teóricos e práticos, principalmente ao nível da

Bioquímica, Microbiologia, Imunologia e Biologia Molecular. Com isto, conclui que o

meu desejo era trabalhar na área laboratorial e como o curso não é profissionalizante,

decidi continuar o 2º ciclo de estudos na área das Análises Clínicas. Assim, ingressei no

Mestrado em Análises Clínicas da Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa,

cujo plano curricular é apelativo e enriquecedor, de forma a complementar os meus

conhecimentos e alcançar o alvo de trabalhar nesta fascinante área. O presente relatório

diz respeito ao estágio curricular realizado no âmbito do mestrado.

Relativamente à organização, este relatório encontra-se dividido em cinco partes:

na Parte I apresentam-se o prefácio, o resumo em português e inglês, os índices e lista de

abreviaturas; na Parte II expõe-se o relatório de estágio, onde é apresentado um resumo

do local de estágio, descrevendo os conhecimentos adquiridos nos mesmos, para as

valências de Pré-Analítica, Hematologia, Bioquímica (incluindo o Radioimunoensaio e a

Química Analítica) e Microbiologia (incluindo a Biologia Molecular); a Parte III diz

respeito à monografia, desenvolvida no âmbito da valência de Microbiologia, com o título

“O estudo da coinfecção Leishmaniose-HIV em mulheres grávidas: prevenção da

transmissão vertical e infeção congénita”. Na Parte IV, apresentam-se as conclusões e

perspetivas futuras. Por último, a Parte V apresenta os Anexos.

Este relatório está de acordo com o disposto no Artigo 37.º do Regulamento Geral

do Ciclo de Estudos conducente ao Grau de Mestre da FFULisboa, nº 134/2016, DR, 2.ª

série — N.º 26, de 8 de fevereiro de 2016.


Stefanie Baptista Resumo

vi

Resumo

O estágio descrito neste relatório integra o plano de estudos do Mestrado em

Análises Clínicas pela Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa decorreu no

Laboratório Dr. Joaquim Chaves nas áreas de Pré-Analítica, Hematologia, Bioquímica e

Microbiologia.

Este relatório apresenta um resumo da experiência e conhecimentos adquiridos ao

longo dos cerca de seis meses, descrevendo os produtos biológicos, a execução dos

parâmetros analíticos, bem como as metodologias, sistemas e equipamentos utilizados.

Refere ainda os procedimentos adotados para a implementação do Controlo de Qualidade

Interno e Avaliação Externa da Qualidade.

O estágio realizado foi, sem dúvida, uma mais valia pois permitiu colocar em

prática os conhecimentos teóricos obtidos durante o mestrado, aprender metodologias

avançadas e ainda adquirir experiência profissional.

Neste documento é também apresentada, no âmbito da área de Microbiologia, uma

revisão bibliográfica sobre o seguinte tema: o estudo da coinfecção Leishmaniose-HIV

em mulheres grávidas: prevenção da transmissão vertical e infeção congénita.

Palavras-chave: Pré-Analítica, Hematologia, Bioquímica, Microbiologia, Qualidade


Stefanie Baptista Abstract

vii

Abstract

The interneship described in this report integrates the study plan of the Masters in

Clinical Analysis by the Faculty of Pharmacy of the University of Lisbon. It was carried

out at the Dr. Joaquim Chaves Laboratory with respect to the areas of Pre-Analytical,

Hematology, Biochemistry and Microbiology.

This report summarizes the experience and knowledge over six months,

describing the biological products needed to implement the respective analytical

parameters, as well as the methodologies and equipment used for this purpose. It also

refers to the procedures adopted for the implementation of Internal Quality Control and

External Quality Assessment.

This internship was, undoubtedly, an added value because it allowed to put into

practice the theoretical knowledge obtained during the Master's degree, learning

advanced methodologies and still gain professional experience.

In this document is also presented a bibliographic review entitled: the study of

Leishmaniasis-HIV coinfection in pregnant women: prevention of vertical transmission

and congenital infection.

Keywords: Pre-Analytical, Hematology, Biochemistry, Microbiology, Quality


Stefanie Baptista Agradecimentos

viii

Agradecimentos

Agradeço primariamente a todos os docentes e convidados pelos conhecimentos

transmitidos, bem como pela acessibilidade demonstrada ao longo do Mestrado em

Análises Clínicas.

Quero agradecer também ao Dr. Carlos Cardoso pela oportunidade de estagiar

num laboratório tão conceituado, ao Dr. Rui Pimentel pela sua grande disposição em

ajudar, bem como a toda a equipa do Laboratório Dr. Joaquim Chaves, que me recebeu

muitíssimo bem e me fez sentir tão integrada.

Em especial, quero expressar o meu agradecimento à Prof. Doutora Quirina

Santos Costa pela orientação, disponibilidade e apoio.

Acima de tudo, quero agradecer à minha família e amigos, especialmente aos

meus pais, por todos os sacrifícios que têm feito para eu poder concluir os estudos.

Aos meus avós por me terem acolhido nos últimos anos. E ao meu querido Andrei,

por todo o amor, carinho, paciência e compreensão que tem demonstrado nestes últimos

meses. Sem o vosso apoio, isto não teria sido possível. Agradeço do fundo do meu

coração!


Stefanie Baptista Lista de Abreviaturas

ix

Lista de Abreviaturas

Parte II

Relatório de Estágio

aa Aminoácidos

Ac Anticorpo

AEQ Avaliação Externa da Qualidade

Ag Antigénio

AgHBs Antigénio de superfície do vírus da Hepatite B

Anti-HBs Anticorpo do antigénio de superfície da hepatite B

ALP Fosfatase alcalina

ALT Alanina aminotransferase

AST Aspartato aminotransferase

AT Antidepressivos Tricíclicos

ATCC American Type Culture Collection

ATP Trifosfato de adenosina

AVC Acidente Vascular Cerebral

BASO Basófilos

Ca2+ Ião cálcio

CCR Recetor de quimiocinas do grupo CC, do inglês, CC Chemokine Receptor

CHOD Colesterol oxidase

CK Creatina Quinase

CK-MB Isoenzima MB da creatina Quinase

Cl- Ião cloro

CLED Gelose Cistina Lactose Deficiente em Eletrólitos

CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute

CMI Concentração Mínima Inibitória

CNA Gelose Columbia ANC + 5% de sangue de carneiro

CO2 Dióxido de carbono

CQ Controlo da Qualidade

CQI Controlo da Qualidade Interno



x

DIG Diagnóstico Imunológico de Gravidez

DGS Direção-Geral da Saúde

DNA Ácido Desoxirribonucleico, do inglês, Deoxyribonucleic acid

EAM Enfarte agudo do miocárdio

ECLIA Eletroquimioluminescência

EDTA Ácido etilenodiaminotetracético

EIA Ensaio imunoenzimático, do inglês, Enzyme Immunoassay

ELISA Ensaio de imunoabsorção enzimática, do inglês, Enzime-linked

immunosorbent assay

EPO Eritropoietina

FA Fosfatase Alcalina

GGT γ-glutamil transferase

GI Gastrointestinal

GN Gram negativo

GOT Glutamato Oxalacetato Transaminase

Gp Glicoproteína

GP Gram positivo

GPT Glutamato Piruvato Transaminase

Hb Hemoglobina

HbA1c Hemoglobina Glicada

HBV Vírus da Hepatite B, do inglês, Hepatitis B Virus

hCG Gonadotropina coriónica humana

HCO3 Ião bicarbonato

HDL Lipoproteína(s) de alta densidade, do inglês, High Density Lipoprotein

HEKT Gelose Hektoen

HFLC Células linfocitárias de elevada fluorescência

HFR Reticulócitos de Alta Fluorescência, do inglês, High-Flourescence

Reticulocytes

HIV Vírus da Imunodeficiência Humana, do inglês, Human Immunodeficiency

Virus

HK Hexoquinase

HPLC Cromatografia Líquida de alta eficiência, do inglês, High performance

liquid chromatography

IgG Imunoglobulina G



xi

IgM Imunoglobulina M

IG Granulócitos imaturos

INSA Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge

ISSO Organização Internacional de Normalização, do inglês, International

Organization for Standardization

IRMA Ensaio Imunoradiométrico

K+ Ião potássio

KCl Cloreto de potássio

Lac Lactose

LCR Líquido Cefalorraquidiano

LDH Lactato desidrogenase

LFR Reticulócitos de Baixa Fluorescência, do inglês, Low-Flourescence

Reticulocytes

LJC Laboratório Joaquim Chaves

MCK Gelose MacConkey

MFR Reticulócitos de Média Fluorescência, do inglês, Median-Flourescence

Reticulocytes

MRSA Staphylococcus aureus Meticilina-resistentes, do inglês, Methicillin-

resistant Staphylococcus aureus

Na+ Ião sódio

NADP Nicotinamida Adenina Dinucleótido Fosfato

NADPH Nicotinamida Adenina Dinucleótido Fosfato reduzida

nm Nanómetros

NRBC Eritrócitos nucleados, do inglês, Nucleated Red Blood Cells

PBJ Proteínas de Bence-Jones

PCR Reação em Cadeia da Polimerase, do inglês, Polymerase Chain Reaction

pH Potencial de hidrogénio

PCT% Plaquetócrito

PLT Plaquetas

PNAEQ Programa Nacional de Avaliação Externa da Qualidade

PSOF Pesquisa de Sangue Oculto nas Fezes

PTGO Prova de Tolerância à Glicose Oral

RBC Eritrócito, do inglês, Red Blood Cell

RET Reticulócito



xii

RIA Radioimunoensaio, do inglês, Radioimmunoassay

RN Recém-nascido

Rpm Rotações por minuto

RT-PCR Reação em Cadeia da Polimerase com Transcriptase Reversa, do inglês,

Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction

SCA Síndrome Coronária Aguda

SIDA Síndrome da Imunodeficiência Adquirida

SHBG Globulina Ligante de Hormonas Sexuais

SRC Síndrome da Rubéola Congénita

T3 Tiroxina

T4 Triiodotironina

TA Temperatura ambiente

TBG Globulina Ligadora de Tiroxina

TMB Tetrametilbenzidina

TSA Teste(s) de Suscetibilidade aos Antibióticos

TSH Hormona Estimulante da Tiroide

TVP Trombose Venosa Profunda

UFC Unidades Formadoras de Colónias

UK-NEQAS Serviço Nacional de Avaliação Externa da Qualidade do Reino Unido, do

inglês, The United Kingdom National External Quality Assessment Service

UV Ultravioleta

VCAT Meio de gelose chocolate polyvitex

VLDL Lipoproteínas de muito baixa densidade, do inglês, Very Low Density

Lipoprotein

VS Velocidade de Sedimentação

WBC Leucócito, do inglês, White Blood Cell



xiii

Parte III

O estudo da coinfecção Leishmaniose-HIV em mulheres grávidas:

prevenção da transmissão vertical e infeção congénita

AmB Anfotericina B, do inglês, Amphotericin B

ART Terapêutica Antirretroviral, do Inglês, Antiretroviral Therapy

Ca2+ Cálcio

CDC Centros para o Controlo e Prevenção de Doenças, do inglês, Centers for

Control and Prevention

CL-AmB Complexo lipídico de anfotericina B, do inglês, Amphotericin B lipid

complex

CMSPs Células Mononucleares do Sangue Periférico

DAT Teste de aglutinação direta, do inglês, Direct agglutination test

DGS Direção-Geral da Saúde

DNA Ácido Desoxirribonucleico, do inglês, Deoxyribonucleic acid

ELISA Ensaio de imunoabsorção enzimática, do inglês, Enzime-linked

immunosorbent assay

EP4 Recetor da Prostaglandina E2 do tipo 4

Gp Glicoproteína

HAART Terapêutica Anti-retroviral Altamente Ativa

HIV Vírus da Imunodeficiência Humana, do inglês, Human Immunodeficiency

Virus

IFAT Teste de imunofluorescência indireta, do inglês, Immunofluorescence

antibody test

IFN Interferão, do inglês, Interferon

IkB Molécula inibidora do fator nuclear-kB

IL Interleucina

L-AmB Anfotericina B lipossomal, do inglês, Liposomal Amphotericin B

LC Leishmaniose Cutânea

LCD Leishmaniose Cutânea Difusa

LCDS Leishmaniose Cutânea Disseminada



xiv

LCL Leishmaniose Cutânea Localizada

LCR Líquido Cefalorraquidiano

LMC Leishmaniose Mucocutânea

LPG Lipofosfatoglicano

LTR Terminal de Longa Repetição

LV Leishmaniose Visceral

NK Assassinas Naturais, do inglês, Natural Killer

Nm Nanómetro

NRTIs Nucleoside reverse transcriptase inhibitors

PCR Reação de Polimerase em Cadeia, do inglês, Polymerase Chain Reaction

PGE2 Prostaglandina E2

PIs Inibidores de Protease Viral, do inglês, Protease Inhibitors

PKA Proteína quinase A

PKC Proteina quinase C

POC Point of care

PTK Proteína Tirosina Quinase

p65/p50 Elementos ativos do fator nuclear kB

qPCR Reação de Polimerase em Cadeia quantitativo, do inglês, quantitative

Polymerase Chain Reaction

R Recetor do LPG e/ou o seu núcleo de fosfatidil inositol

rK39 Antigénio K39 recombinante

RNA Ácido Ribonucleico, do inglês, Ribonucleic acid

Sb Antimónio (símbolo químico)

SIDA Síndrome da Imunodeficiência Adquirida

TAN Técnica dos Ácidos Nucleicos

Tat Proteína Transativadora da transcrição, do inglês, Trans-Activator of

Transcription

TGF-ß Fator de Crescimento Transformante Beta

Th1 Células T Auxiliares do tipo 1



TNF- Fator de Necrose Tumoral

TREG Linfócito T Regulador, do inglês, Regulatory T cell

UDI Utilizadores de Drogas Injetáveis



xv

WB Western Blot

WHO Organização Mundial de Saúde, do inglês, World Health Organization


Stefanie Baptista Índice Geral

xvii

ÍNDICE GERAL

PARTE I ................................................................................................................... III

PREFÁCIO ................................................................................................................ V

RESUMO ................................................................................................................. VI

ABSTRACT ............................................................................................................ VII

AGRADECIMENTOS ...........................................................................................VIII

LISTA DE ABREVIATURAS ................................................................................. IX

ÍNDICE DE FIGURAS .......................................................................................... XXI

ÍNDICE DE TABELAS ....................................................................................... XXV

PARTE II ..................................................................................................................... 1

RELATÓRIO DE ESTÁGIO ..................................................................................... 3

INTRODUÇÃO ........................................................................................................... 5

1. FASE PRÉ-ANALÍTICA - COLHEITAS E TRIAGEM ............................... 7

2. HEMATOLOGIA ......................................................................................... 13

2.1. HEMOGRAMA ............................................................................................... 13

2.2. VELOCIDADE DE SEDIMENTAÇÃO .................................................................. 20

2.3. HEMOGLOBINA GLICADA (HBA1C) ................................................................ 21

2.4. ELETROFORESE DAS HEMOGLOBINAS ............................................................ 22

2.5. AVALIAÇÃO DA HEMOSTASE E COAGULAÇÃO ............................................... 24

2.6. IMUNOHEMATOLOGIA ................................................................................... 28

3. BIOQUÍMICA ............................................................................................... 31

3.1. IONOGRAMA ................................................................................................. 31

3.2. QUÍMICA CLÍNICA E IMUNOENSAIOS.............................................................. 32

3.2.1. Metabolismo dos Hidratos de Carbono ............................................. 33

3.2.2. Metabolismo Lipídico ...................................................................... 34

3.2.3. Metabolismo Proteico ...................................................................... 36

3.2.4. Função Hepática e Tracto Biliar ....................................................... 36

3.2.5. Função Renal ................................................................................... 38

3.2.6. Função Pancreática .......................................................................... 40

3.2.7. Metabolismo Fosfocálcico ............................................................... 40

3.2.8. Função Cardíaca .............................................................................. 42

3.2.9. Marcadores Tumorais....................................................................... 45

3.2.10. Doenças Infeciosas ........................................................................... 47

3.2.11. Rastreio Serológico da Grávida ........................................................ 50

3.2.12. Sistema Endócrino ........................................................................... 52



xviii

3.3. URIANÁLISE ................................................................................................. 58

3.3.1. Diagnóstico Imunológico da Gravidez (DIG) ................................... 66

3.4. ELETROFORESE DAS PROTEÍNAS .................................................................... 68

3.5. LIPIDOGRAMA .............................................................................................. 73

4. RADIOIMUNOENSAIO (RIA) .................................................................... 74

5. QUIMIOLUMINESCÊNCIA ....................................................................... 77

6. QUÍMICA ANALÍTICA ............................................................................... 79

6.1. CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA DEFINIÇÃO (HPLC) .............................. 79

6.2. ESPECTROFOTOMETRIA DE ABSORÇÃO NO INFRAVERMELHO .......................... 81

6.3. ESPECTROFOTOMETRIA DE ABSORÇÃO ATÓMICA .......................................... 82

6.4. ESPECTROMETRIA DE EMISSÃO ÓTICA POR PLASMA ACOPLADO

INDUTIVAMENTE (ICP)............................................................................................. 83

6.5. ESPECTROFOTOMETRIA DE ABSORÇÃO NO ULTRAVIOLETA E NO VISÍVEL ....... 84

6.6. CROMATOGRAFIA GASOSA/ESPECTROMETRIA DE MASSA (GC/MS) ............... 85

7. MICROBIOLOGIA ...................................................................................... 87

7.1. HEMOCULTURA ............................................................................................ 87

7.2. URINA ASSÉTICA .......................................................................................... 88

7.3. EXSUDADO VAGINAL ................................................................................... 92

7.4. EXSUDADO FARÍNGEO .................................................................................. 95

7.5. EXSUDADO NASAL ....................................................................................... 95

7.6. EXPETORAÇÃO ............................................................................................. 96

7.7. EXSUDADO AURICULAR ................................................................................ 97

7.8. ESPERMOCULTURA ....................................................................................... 98

7.9. COPROCULTURA ........................................................................................... 99

7.10. EXAME MICOLÓGICO .................................................................................. 100

7.11. EXAME URETRAL ....................................................................................... 101

7.12. PESQUISA DE OVOS, QUISTOS E PARASITAS ................................................. 104

7.13. PESQUISA DE SANGUE OCULTO NAS FEZES (PSOF) ..................................... 105

8. BIOLOGIA MOLECULAR........................................................................ 106

8.1. EXTRAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS ............................................................. 106

8.2. AMPLIFICAÇÃO E DETEÇÃO - PCR .............................................................. 107

8.3. MICROARRAYS DE BAIXA INTENSIDADE – CLART-STRIP........................... 108

8.4. SONDAS EM LINHA - DNA STRIP ............................................................... 109

8.5. ELISA ....................................................................................................... 110

8.6. IMMUNOCAP ISAC SIGE 112 ................................................................... 110

8.7. TESTES RÁPIDOS - IMUNOCROMATOGRAFIA ................................................. 111

9. HIGIENE E SEGURANÇA ........................................................................ 112

10. CONTROLO DA QUALIDADE ................................................................ 114

BIBLIOGRAFIA .................................................................................................... 119

PARTE III ............................................................................................................... 127



CONGÉNITA .......................................................................................................... 129



xix

RESUMO ................................................................................................................ 131

ABSTRACT ............................................................................................................ 132

OBJETIVOS ........................................................................................................... 133

MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................... 134

INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 135

1. EPIDEMIOLOGIA ..................................................................................... 139

1.1. EUROPA ..................................................................................................... 141

1.2. ÁSIA .......................................................................................................... 143

1.2.1. Índia .............................................................................................. 144

1.3. AMÉRICA ................................................................................................... 145

1.3.1. Brasil ............................................................................................. 146

1.4. ÁFRICA ...................................................................................................... 146

1.4.1. Burkina Faso .................................................................................. 147

1.4.2. Etiópia ........................................................................................... 147

1.4.3. Somália .......................................................................................... 148

1.4.4. Uganda .......................................................................................... 148

1.4.5. Quénia ........................................................................................... 148

1.4.6. Sudão ............................................................................................. 148

2. ASPETOS CLÍNICOS ................................................................................ 150

2.1. COINFECÇÃO ASSINTOMÁTICA .................................................................... 151

2.2. COINFECÇÃO LEISHMANIOSE VISCERAL/HIV .............................................. 151

2.2.1. Coinfecção Leishmaniose Dérmica Pós Kala-Azar (LDPK)/HIV ... 152

2.2.2. Coinfecção Leishmaniose Visceral/HIV em Mulheres Grávidas ..... 153

2.3. COINFECÇÃO LEISHMANIOSE CUTÂNEA/HIV .............................................. 153

2.3.1. Coinfecção Leishmaniose Cutânea Localizada/HIV ....................... 154

2.3.2. Coinfecção Leishmaniose Recidiva Cutis/HIV ............................... 154

2.3.3. Coinfecção Leishmaniose Cutânea Disseminada/HIV .................... 154

2.3.4. Coinfecção Leishmaniose Cutânea Difusa/HIV .............................. 155

2.3.5. Coinfecção Leishmaniose Mucocutânea/HIV em Mulheres Grávidas

155

2.4. COINFECÇÃO DOENÇA DE RECONSTITUIÇÃO IMUNOLÓGICA (DRI)/HIV ....... 155

3. IMUNOPATOGÉNESE .............................................................................. 157

4. DIAGNÓSTICO .......................................................................................... 161

4.1. PARASITOLÓGICO ....................................................................................... 161

4.1.1. Microscopia ................................................................................... 161

4.1.2. Cultura ........................................................................................... 161

4.2. SEROLÓGICO .............................................................................................. 162

4.3. ANTIGÉNICO............................................................................................... 163



xx

4.4. MOLECULAR .............................................................................................. 163

4.5. ESTRATÉGIA DE DIAGNÓSTICO NOS SERVIÇOS DE SAÚDE DE ÁREAS ENDÉMICAS

164

5. TERAPÊUTICA .......................................................................................... 168

5.1. LEISHMANIOSE ........................................................................................... 169

5.1.1. Antimoniais Pentavalentes (AP) – Sb5+.......................................... 169

5.1.2. Desoxicolato de Anfotericina B (ANB) .......................................... 170

5.1.3. Anfotericina B Lipídica (ANB-L) .................................................. 170

5.1.4. Miltefosina ..................................................................................... 171

5.1.5. Sulfato de Paramomicina ou Aminosidina ...................................... 172

5.1.6. Isotionato de Pentamidina .............................................................. 172

5.1.7. Outros Fármacos ............................................................................ 173

5.1.8. Combinações ................................................................................. 173

5.2. OUTRAS ABORDAGENS TERAPÊUTICAS ....................................................... 173

5.3. PREVENÇÃO ............................................................................................... 173

CONCLUSÃO ......................................................................................................... 175

BIBLIOGRAFIA .................................................................................................... 177

PARTE IV ................................................................................................................ 181

CONCLUSÕES E PERSPETIVAS FUTURAS ..................................................... 183

PARTE V ................................................................................................................. 185

ANEXOS ................................................................................................................. 187


Stefanie Baptista Índice de Figuras

xxi

Índice de Figuras

Parte II


Figura 1. Sistema de vácuo da BD Vacutainer® utilizado para a colheita de sangue ..... 8

Figura 2. Tubo coletor para pesquisa de sangue oculto nas fezes para o aparelho OC-

Sensor Diana® (Eiken) ......................................................................................... 11

Figura 3. Cobas conection modules (CCM) e sua conexão com analisadores e

sistemas pré-analíticos e pós-analíticos da cobas ............................................... 12

Figura 4. Sysmex XN-1000™ Hematology Analyzer ................................................. 14

Figura 5. Gráfico WDF scattergram obtido pelo Sysmex XN-1000™ ........................ 14

Figura 6. Canal de análise diferencial de leucócitos .................................................... 15

Figura 7. Canal WNR obtido pelo Sysmex XN-1000™ .............................................. 15

Figura 8. Método de impedância utilizado no canal RBC/PLT Sysmex XN-1000™ ... 16

Figura 9. Exemplo de gráficos obtidos para RBC e PLT com equipamento Sysmex XN-

1000™ ................................................................................................................ 16

Figura 10. Método de acumulação da altura dos impulsos dos eritrócitos num volume

fixo para obtenção do valor do hematócrito (HCT%) ........................................... 17

Figura 11. Representação esquemática da determinação da hemoglobina pelo método

de deteção SLS .................................................................................................... 17

Figura 12. Canal Ret/PLT-O obtido através do Sysmex XN-1000™ .......................... 19

Figura 13. Aparelho VES-MaticTM Cube-200 ................ Erro! Marcador não definido.

Figura 14. Método de Westergren modificado para determinar a VS ... Erro! Marcador

não definido.

Figura 15. Sistemas automáticos para determinação da HbA1c.................................... 22

Figura 16. Resultado de uma eletroforese de hemoglobinas obtidos por HPLC com o

VARIANT™ II TURBO Hemoglobin Testing System ........................................ 23

Figura 17. Aparelho BCS® XP System ....................................................................... 25

Figura 18. Aparelho ORTHO AutoVue® Innova System ............................................ 28

Figura 19. Esquematização do Teste de Coombs ........................................................ 30

Figura 20. Cobas 8000 modular analyzer series. ....................................................... 31

Figura 21. Evolução dos marcadores cardíacos após ocorrência de lesão tecidular ..... 44



xxii

Figura 22.Evolução dos marcadores serológicos durante a Hepatite B aguda .............. 48

Figura 23. Resposta serológica à infeção por Toxoplasma gondii ............................... 51

Figura 24. Aparelho Cobas 6500 urine analyzer series ............................................. 59

Figura 25. Tiras Siemens Multistix 10 SG ................................................................ 63

Figura 26. Eritrócitos no sedimento urinário............................................................... 64

Figura 27. Leucócitos segmentados na urina .............................................................. 64

Figura 28. Células escamosas. .................................................................................... 65

Figura 29. Cilindros urinários..................................................................................... 65

Figura 30. Cristais urinários. ...................................................................................... 66

Figura 31. Resultados possíveis obtidos com o kit hCG Pregnancy Test ..................... 67

Figura 32. Eletroforese das proteínas séricas. ............................................................. 68

Figura 33. Perfil eletroforético de situações clínicas em que há redução da fração

albumina ............................................................................................................. 69

Figura 34. Perfil eletroforético das proteínas de fase aguda e na Síndrome Nefrótica.. 70

Figura 35. Estrutura esquemática de Ig ....................................................................... 70

Figura 36. Perfil eletroforético de pico policlonal, pico monoclonal de

hipoglobulinemia/agamaglobulinemia ................................................................. 71

Figura 37. Aparelho HYDRASYS 2® da Sebia........................................................... 72

Figura 38. Eletroforese em gel obtida com o kit Hydragel Bence Jones ...................... 72

Figura 39. Eletroforese em gel obtida com o kit Hydragel 7 LIPO +Lp (a) ................. 73

Figura 40. Contador de Raios Gama Wallac Wizard................................................... 74

Figura 41. Aparelho IMMULITE® 2000 da Siemens .................................................. 77

Figura 42. Sistema HPLC Shimadzu .......................................................................... 80

Figura 43. Determinação do interferograma ............................................................... 82

Figura 44. Espectrofotómetro de Absorção Atómica Shimadzu AA 6800. .................. 83

Figura 45. Equipamento Varian Vista MPX – ICP/OES ............................................. 84

Figura 46. Espectrofotómetro Genesys 5 UV-VIS ...................................................... 84

Figura 47. Determinação de substâncias por GC/MS .................................................. 85

Figura 48. Equipamento BacT/ALERT ...................................................................... 88

Figura 49. Equipamento Sysmex UF-1000iTM ............................................................ 89

Figura 50. Meios de cultura utilizados para identificação e TSA da bactéria

Staphylococcus aureus em amostra de urina ........................................................ 91

Figura 51. Meios de cultura utilizados para identificação e TSA da bactéria Echerichia

coli em amostra de urina ...................................................................................... 91



xxiii

Figura 52. Amostras de urina em Meio CLED............................................................ 92

Figura 53. Exame direto com coloração Gram do exsudado vaginal ........................... 94

Figura 54. Trichomonas vaginallis em exame citológico vaginal ................................ 94

Figura 55. Diplococcos GN no exame direto corado pelo Gram, com morfologia

sugestiva de Neisseria gonorrhoeae .................................................................. 102

Figura 56. Aparelho MagNA Pure LC 2.0 Instrument .............................................. 106

Figura 57. Componentes necessários para a realização da RT-PCR e respetivo produto

.......................................................................................................................... 107

Figura 58. Equipamento cobas 4800 System da Roche ........................................... 108

Figura 59. Equipamento LigthtCycler 2.0 da Roche ............................................... 108

Figura 60. Esquema do método de visualização das sondas CLART-Strip .............. 109

Figura 61. Padrão específico de bandas nas DNA-STRIP para vários genótipos do

Mycobacterium ................................................................................................. 110

Figura 62. Representação esquemática do erro total ................................................. 117



xxiv

Parte III



Figura 1. Formas promastigotas de Leishmania sp em cultura. ................................. 135

Figura 2. Phlebotomus papatasi, flebótomo responsável pela transmissão do parasita

Leishmania ........................................................................................................ 135

Figura 3. Estrutura do HIV ....................................................................................... 136

Figura 4. Endemicidade da LV no mundo em 2015 .................................................. 139

Figura 5. Endemicidade da LC no mundo em 2015 .................................................. 140

Figura 6. Prevalência do HIV nos adultos de idades compreendidas entre os 15 e os 49

anos, em 2016 ................................................................................................... 141

Figura 7. Ciclo de Vida da Leishmania sp no ser humano......................................... 150

Figura 8. Lesões de Leishmaniose Cutânea .............................................................. 154

Figura 9. Representação esquemática dos mecanismos de sinalização envolvidos na

expressão da Leishmania sp-Lipofosfoglicano-mediada pelo HIV-1 através dos

monócitos/macrófagos e linfócitos T ................................................................. 159

Figura 10. Resposta Imunológica de células T maternas e os seus efeitos durante a

gravidez coexistente com infeção por Leishmania sp ......................................... 160

Figura 11. Microscopia ótica de formas amastigotas de Leishmania spp. num aspirado

de medula óssea ................................................................................................ 162

Figura 12. Algoritmo para o diagnóstico de LV em indivíduos infetados com HIV .. 165

Figura 13. Algoritmo para o diagnóstico de HIV ...................................................... 167


Stefanie Baptista Índice de Tabelas

xxv

Índice de Tabelas

Parte II


Tabela 1. Índices eritrocitários e respetivas fórmulas .................................................. 18

Tabela 2. Resultados das tiras-teste para a Esterase Leucocitária ................................ 60

Tabela 3. Resultados das tiras-teste para as Proteínas ................................................. 61

Tabela 4. Resultados das tiras-teste para os Eritrócitos ............................................... 62

Tabela 5. Descrição de análises executadas por radioimunoensaio competitivo .......... 75

Tabela 6. Descrição de análises executadas por ensaio IRMA .................................... 76

Tabela 7. Descrição de análises executadas por HPLC ............................................... 80

Tabela 8. Produtos Biológicos e respetivos meios de cultura .................................... 103


Stefanie Baptista Índice de Tabelas

xxvi

Parte III



Tabela 1. Técnicas predefinidas para o diagnóstico de Leishmaniose Visceral em áreas

altamente endémicas, por nível de sistema de saúde, segundo a estratégia da WHO

.......................................................................................................................... 164

Parte II



RELATÓRIO DE ESTÁGIO


Relatório de Estágio orientado pelo Dr. Carlos Cardoso


2018

IX Mestrado Análises Clínicas Parte II

Stefanie Baptista Introdução

5

INTRODUÇÃO

O estágio descrito neste relatório integra o plano de estudos do Mestrado em

Análises Clínicas pela Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa e foi realizado

no Laboratório de Análises Clínicas Dr. Joaquim Chaves (LJC) em Miraflores, Lisboa

para as seguintes valências: Pré-Analítica, Hematologia, Bioquímica e Microbiologia,

orientado pelo Dr. Carlos Cardoso.

A Joaquim Chaves Saúde (JCS) é um grupo português que, desde 1959, opera

exclusivamente no sector da saúde, participando com competência e elevada qualidade

no progresso da medicina, num percurso de rigor e qualidade na prestação de cuidados

de saúde às populações. Após a criação do Laboratório de Análises Clínicas Dr. Joaquim

Chaves, a primeira empresa a ser constituída, a JCS cresceu de forma sustentada no sector

da saúde com a sucessiva abertura de modernas unidades em Portugal Continental,

Madeira e Açores, com particular destaque para as áreas de Laboratório - Análises

Clínicas, Clínicas Médicas, Tratamento Oncológico e Saúde Mental. A motivação e o

compromisso da empresa é proporcionar o acesso às melhores soluções existentes no

sector da saúde, aliando uma elevada competência e especialização humana à

disponibilização das tecnologias mais avançadas (1).

O LJC adotou um Sistema de Gestão da Qualidade, em que são aplicados e

cumpridos os requisitos da Norma 9001:2015 da Organização Internacional de

Normalização (ISO, do inglês, International Organization for Standardization), Normas

para o Laboratório Clínico da Ordem dos Farmacêuticos e do Manual de Boas Práticas

Laboratoriais.

Neste relatório resumo a experiência e conhecimento adquiridos nas várias áreas

do laboratório, ao longo dos cerca de sete meses, mais concretamente 1080 horas,

distribuídas da seguinte forma: 104 horas na Fase Pré-Analítica, 280 horas na

Hematologia, 368 horas na Bioquímica e 256 horas na Microbiologia. As imagens aqui

apresentadas foram obtidas a partir da bibliografia indicada, bem como dos folhetos

informativos e datasheets das técnicas e equipamentos disponibilizadas pelo próprio

Laboratório Dr. Joaquim Chaves, referentes especificamente ao período de estágio

indicado.

Os objetivos da realização do estágio passaram por promover a integração no meio

profissional, aplicando os conhecimentos adquiridos ao longo das unidades curriculares

do mestrado e desenvolver capacidades como a organização, trabalho em equipa e



6

capacidade crítica. Este relatório descreve a metodologia utilizada em cada área, os

parâmetros analisados e ainda o seu significado clínico. Por fim, é brevemente descrito o

sistema de higiene e segurança no LJC, bem como o Controlo de Qualidade.


Stefanie Baptista Fase Pré-Analítica

7

1. FASE PRÉ-ANALÍTICA - COLHEITAS E TRIAGEM

De modo a corresponder às necessidades da população, o Laboratório Dr. Joaquim

Chaves conta com uma rede de mais de 150 Postos de Colheitas a nível nacional. Nestes,

realiza-se a colheita das amostras biológicas, formação e informação relacionada com o

material de colheita de acordo com a natureza do produto e a determinação analítica a

efetuar. Todos os procedimentos das colheitas são seguidos conforme descrito abaixo, a

fim de garantir a fiabilidade dos resultados (2).

Colheita de Produtos Biológicos:

Antes de realizar a colheita é importante certificar-se que o utente está em

condições de a fazer (preparação prévia) e se aplicável preencher os questionários e

modelos. O material utilizado deve ser todo identificado com código de barras na

presença do utente e as informações clínicas relevantes devem ser referidas na Ficha

Individual de Utente (3).

Sangue

A colheita de sangue deve ser efetuada durante o período da manhã e o utente

deve estar em jejum (mínimo de 8h), à exceção dos casos de urgência ou quando há

indicação em contrário. No entanto, nas colheitas para o estudo do Metabolismo Lipídico

o jejum deve ser de 10-12h. Nos recém-nascidos e nos lactentes, a colheita deve ser feita

nos 30 minutos antes da refeição.

Usar luvas descartáveis, selecionar o sistema de vácuo ou sistema de seringa-

agulha, desinfetar a região a puncionar com algodão embebido em solução de Etanol a

70% (substituir o Etanol por Betadine® na determinação da alcoolemia) e aplicar o

garrote. A ordem de colheita dos tubos deve ser a seguinte (conforme recomendado pela

casa comercial BD Vacutainer® e de forma a evitar contaminações):

1º Frascos para hemocultura

2º Tubos para coagulação (citrato de sódio)

3º Tubos para soro, com gel separador

4º Tubos isentos de metais

5º Tubos com heparina

6º Tubos com EDTA, com ou sem gel separador (EDTA-gel e hemograma)



8

Seguidamente pressionar com o algodão a zona puncionada durante alguns

minutos e homogeneizar cuidadosamente por inversões sucessivas (5-10 vezes) todas as

amostras colhidas para tubos com aditivos e depois colocá-las na posição vertical. As

agulhas devem ser colocadas em contentos próprios para cortantes (3).

Urina

- Urina tipo II/ 2 – Exame Sumário de Urina

A colheita da urina tipo II deve ser a primeira da manhã ou com uma retenção

vesical de pelo menos 4h, para um tubo próprio. Limpa-se os genitais externos, da frente

para trás na mulher e a glande nos homens, ou a região perineal nas crianças. A colheita

deve ser efetuada, preferencialmente 7 dias depois da administração de produtos de

contraste radiológico (TAC ou ressonância magnética) (3).

- Urina assética

A colheita da urina assética deve corresponder à primeira urina da manhã ou após

duas a três horas de retenção vesical. Antes de efetuar a colheita lavar as mãos, depois

limpar os genitais externos, de seguida desprezar as primeiras gotas de urina e finalmente

recolher o jato médio para o coletor. Deve ser enviado o coletor, estável 24h refrigerado,

juntamente com o tubo com conservante, estável 24h à TA (3).

- Urina de 24h

A colheita da urina de 24h realiza-se, tal como o nome indica, durante 24h. Por

exemplo, iniciando-se a colheita às 8h, esta deve ser rejeitada e a partir daí, recolhe-se

toda a urina até às 8h do dia seguinte, inclusive. Antes de cada micção, limpar os genitais

externos, da frente para trás na mulher e a glande nos homens, ou a região perineal nas

crianças (3).

Figura 1. Sistema de vácuo da BD Vacutainer® utilizado para a colheita de sangue. a) tubo para soro b) tubo para hemograma c) tubo para coagulação d) agulha butterfly e) agulha e adaptador de tubo de vácuo [Adaptado de (4)].

a) b) c) d)

e)



9

Esperma

- Espermocultura

A colheita para espermocultura deve ser uma colheita de esperma recente após

higiene prévia das mãos e órgãos genitais, com uma abstinência sexual nos 3 dias

anteriores à colheita. A estabilidade é de 12h à TA (3).

- Espermograma

A colheita para o espermograma trata-se de uma colheita de esperma realizada no

laboratório, que necessita de um período de abstinência sexual de 3 dias antes do exame

(3).

Expetoração

A colheita da expetoração deve ser realizada de manhã, para um coletor estéril,

após higiene nasal e oral apenas com água, e deve ser resultante de tosse provocada (3).

Exsudado

- Exsudado amigdalino

A colheita do exsudado amigdalino realiza-se pressionando a língua para baixo

com a espátula e passando a zaragatoa sobre toda a superfície de aspeto patológico

(vermelho ou com pus), evitando tocar nos lábios, língua e úvula. A zaragatoa deve ser

introduzida no meio de Stuart. O doente não deve comer ou beber 2 a 3 horas antes da

colheita (3).

- Exsudado Ano rectal

A colheita do exsudado Ano rectal realiza-se com um zaragatoa ao nível do reto

devendo ser colocada no meio de Stuart e torna-se importante na grávida para pesquisa

de Streptococcus do grupo B. É estável 24h refrigerado (3).

- Exsudado auricular

A colheita do exsudado auricular realiza-se no canal auditivo externo, com 2

zaragatoas. Uma deve ser introduzida no meio de Stuart e outra é utilizada para o

esfregaço de duas lâminas. É estável 12h à TA (3).



10

- Exsudado faríngeo

A colheita do exsudado faríngeo realiza-se pressionando a língua para baixo com a

espátula e passando a zaragatoa sobre toda a superfície de aspeto patológico (vermelho

ou com pus), evitando tocar nos lábios, língua e úvula. A zaragatoa deve ser introduzida

no meio de Stuart. O doente não deve comer ou beber 2 a 3 horas antes da colheita (3).

- Exsudado nasal

A colheita do exsudado nasal realiza-se introduzindo uma zaragatoa na mucosa

nasal e rodando-a até encontrar resistência. Repete-se o processo na outra narina e

introduz-se as zaragatoas no meio de Stuart. O Utente não deve assoar-se e a colheita é

estável 24h refrigerada (3).

- Exsudado ocular

A colheita do exsudado ocular deve ser realizada com zaragatoa na parte interna

da pálpebra inferior, introduzindo-a em meio de Stuart. Caso seja necessário, pode-se

humedecer a zaragatoa com soro fisiológico. Devem ser feitos também dois esfregaços

com outra zaragatoa. A amostra é estável 12h à TA (3).

- Exsudado uretral

A colheita do exsudado uretral deve ser realizada de manhã, antes de urinar, ou

no mínimo 3h após a última micção. Colher o exsudado com uma zaragatoa e colocá-la

no meio de Stuart e com outra zaragatoa realizar dois esfregaços. No caso do homem,

pressionar a uretra de modo a estimular a saída de corrimento e efetuar os esfregaços. De

seguida, utilizar a outra zaragatoa, colher mais corrimento e colocá-la em meio de Stuart.

Quando não há corrimento introduzir uma zaragatoa fina e flexível cerca de 2 cm no

meato uretral. A colheita é estável 12h a TA (3).

- Exsudado vaginal

A colheita do exsudado vaginal realiza-se após a limpeza dos genitais externos,

introduz-se o espéculo estéril até expor corretamente o colo do útero e efetua-se a colheita

com zaragatoa, introduzindo-a no meio de Stuart. Seguidamente utiliza-se outra zaragatoa

para fazer dois esfregaços. A colheita é estável 12h à TA. Se pedido pesquisa de

Chlamydia juntar também uma zaragatoa ao kit Chlamydia (3).



11

- Exsudado vulvar

A colheita do exsudado vulvar realiza-se passando uma zaragatoa sobre a região

inflamada e realizar dois esfregaços e colocando uma segunda zaragatoa no meio de

Stuart (3).

Fezes

A colheita de fezes deve ser feita para um tubo estéril, uma amostra do tamanho

de uma noz. Estabilidade variável conforme a análise (3).

- Pesquisa de Sangue Oculto nas fezes

A colheita para a pesquisa de sangue oculto nas fezes não deve ser realizada

durante o período menstrual nem em situações de hemorroidas com hemorragia e deve-

se evitar que as fezes sejam contaminadas com urina. A amostra deve ser colhida com a

vareta, no caso do coletor para sangue oculto (Figura 2) e é estável 7 dias refrigerada, ou

deve ser colhida uma amostra do tamanho de noz, no caso do coletor estéril e é estável 3

dias refrigerada (3).

- Pesquisa de ovos, quistos e parasitas nas fezes

A colheita para pesquisa de ovos, quistos e parasitas nas fezes deve ser realizada

para o coletor próprio ou para um coletor lavado e seco. A amostra é estável 3 dias

refrigerada (3).

- Coprocultura

A colheita para a coprocultura deve ser realizada para um coletor com meio de

transporte ou para um coletor estéril. Colocar fezes até à linha com a seta vermelha no

caso do coletor com o meio de transporte, que é estável 4 dias à TA. Colocar uma amostra

do tamanho de uma noz no caso do coletor estéril e entregar no próprio dia (3).

Figura 2. Tubo coletor para pesquisa de sangue oculto nas fezes para o

aparelho OC-Sensor Diana® (Eiken) [Adaptado de (5)].



12

Triagem dos Produtos Biológicos:

As amostras colhidas nos postos próprios da Joaquim Chaves Saúde, bem como

as dos postos de terceiros, de outros laboratórios e de hospitais chegam ao Laboratório à

área da triagem, que é responsável pela execução e controlo da fase pré-analítica do

Laboratório, nomeadamente pela receção, verificação, processamento e manipulação

primária das amostras biológicas. Aqui são também registadas as falhas de colheitas e

comunicadas aos postos, laboratórios ou hospitais (6).

A partir da triagem, as amostras são encaminhadas até às respetivas áreas. Nesta

fase, o cobas conection modules (CCM) desempenha um papel importante, já que este

aparelho automático permite a conexão com analisadores e sistemas pré-analíticos e pós-

analíticos da cobas, conforme a Figura 3.

Figura 3. Cobas conection modules (CCM) e sua conexão com analisadores e sistemas pré-analíticos e

pós-analíticos da cobas [Adaptado de (7)].


Stefanie Baptista Hematologia

13

2. HEMATOLOGIA

A Hematologia é a especialidade que estuda o sangue e os seus componentes nas

vertentes clínica e de laboratório, nomeadamente as células sanguíneas – eritrócitos,

leucócitos e plaquetas – e os órgãos que os produzem (órgãos hemapoiéticos) – medula

óssea, baço e gânglios linfáticos (8).

Ao nível da investigação hematológica, os exames complementares de

diagnóstico requisitados incluem o Hemograma, a Velocidade de Sedimentação, a

Hemoglobina Glicada, a Eletroforese de Hemoglobinas, a avaliação da Hemostase e

Coagulação e parâmetros Imunohematolgógicos. Todos estes serão descritos de seguida.

2.1. Hemograma

O hemograma tem como objetivo analisar os elementos figurados do sangue,

nomeadamente o eritrograma, o leucograma e também as plaquetas, bem como

determinar os índices de cada série.

O Sysmex XN-1000™ Hematology Analyzer (Figura 4) é um equipamento

hematológico que realiza a determinação destes mesmos parâmetros, utilizando a

citometria de fluxo com fluorescência, que fornece informação sobre o tamanho e

estrutura celulares, assim como sobre o conteúdo das células. Neste método, as células

são examinadas enquanto fluem através de uma célula de fluxo muito estreita. Primeiro,

a amostra de sangue é aspirada e diluída de acordo com um fator pré-determinado e é

marcada com um marcador fluorescente que se liga especificamente aos ácidos nucleicos.

Em seguida, a amostra é transportada para a célula de fluxo e iluminada por um laser

semicondutor (=639nm), que consegue separar as células utilizando três sinais diretos:

- Luz fluorescente lateral, que indica a quantidade de DNA/RNA presente

na célula.

- Luz dispersa lateralmente, que fornece informação sobre o conteúdo

celular, nomeadamente núcleos e grânulos.

- Luz dispersa frontalmente, que indica o tamanho celular (9).

Células com propriedades físico-químicas similares constituem um grupo num

gráfico denominado diagrama de dispersão (p.e. Figura 5).



14

Canal de Análise diferencial de leucócitos - WBC

O Canal de Análise diferencial de leucócitos é obtido através de uma reação

citoquímica das células com um reagente que perfura as membranas celulares, deixando-

as intactas. De seguida, o DNA e o RNA intracelular são marcados com o corante de

fluorescência e analisados por citometria de fluxo com fluorescência. A intensidade do

sinal de fluorescência é diretamente proporcional ao conteúdo dos ácidos nucleicos

presentes. O canal diferencial fornece as contagens de todas as subpopulações celulares

normais de leucócitos, sinalizando também a informação referente a anomalias,

nomeadamente Granulócitos imaturos (IG) e Células linfocitárias de elevada

fluorescência - Linfócitos Atípicos (HFLC), conforme se verifica na Figura 6.

No canal WDF scattergram, as células são diferenciadas de acordo com a sua

estrutura interna e fluorescência (9).

Neste sentido, existem seis diferentes parâmetros que descrevem uma população

de células (no que diz respeito à nuvem no

diagrama):

- Tamanho da nuvem (tamanho total da

população)

- Comprimento da nuvem (distância

longitudinal)

- Largura da nuvem (distância transversal)

- Posição (centro da nuvem)

- Momentum (forma da nuvem)

- Ângulo (direção dos eixos longitudinais)

Figura 4. Sysmex XN-1000™ Hematology Analyzer [Adaptado de (10)].

Figura 5. Gráfico WDF scattergram obtido pelo Sysmex XN-1000™ [Adaptado de (9)].



15

No canal WNR (Figura 7), a membrana celular dos eritroblastos (NRBC) é

completamente lisada e apenas os seus núcleos são corados. O pH baixo do reagente

estabiliza os basófilos, reduzindo ligeiramente o tamanho de todas as outras células.

(a) (b)

(c)

Figura 6. Canal de análise diferencial de leucócitos. (a) LEFT SHIFT- neutrófilos em banda e com baixa contagem de Granulócitos Imaturos. Os Neutrófios em banda não interferem com a contagem de granulócitos

imaturos. (b) Exemplo de amostra com elevada contagem de Granulócitos Imaturos (IG=7,2%). (c) Exemplo de amostra com elevada contagem de Linfócitos Atípicos (HFLC=6,0%) [Adaptado de (9)].

Figura 7. Canal WNR obtido pelo Sysmex XN-1000™ [Adaptado de (9)].



16

Método de deteção de fluxo envolvente de corrente contínua – RBC e PLT

O analisador Sysmex XN-1000™ utiliza ainda o método de deteção de fluxo

envolvente de corrente contínua para contar os eritrócitos (RBC) e plaquetas (PLT). Uma

parte do sangue é separada do sangue inteiro aspirado e misturada com o diluente. Desta

diluição, uma quantidade definida é enviada para a câmara de deteção, passando através

de um pequeno orifício, a abertura. Cada lado da abertura apresenta elétrodos, através dos

quais passa a corrente contínua (Figura 8). A resistência a essa corrente contínua varia

conforme as células suspensas no diluente passam através da abertura. Esta resistência

provoca uma alteração do pulso elétrico proporcional ao tamanho da célula sanguínea.

Estes dados elétricos são convertidos em representações gráficas, conforme a Figura 9

(9).

O equipamento fornece também o valor do hematócrito (HCT%) através do

método de acumulação da altura dos impulsos dos eritrócitos num volume fixo, conforme

ilustrado na figura 10. O plaquetócrito (PCT%) é equivalente à soma dos impulsos das

plaquetas que são detetadas individualmente pelo princípio da impedância e corresponde

ao hematócrito dos eritrócitos (9).

Figura 8. Método de impedância utilizado no canal RBC/PLT Sysmex XN-

1000™ [Adaptado de (9)].

Figura 9. Exemplo de gráficos obtidos para RBC e PLT com equipamento Sysmex XN-1000™ [Adaptado de (9)].



17

Método de Deteção SLS – Determinação da Hemoglobina

O método de deteção SLS de hemoglobina utiliza laurilsulfato de sódio (SLS) sem

cianeto. O reagente hemolisa os eritrócitos e leucócitos da amostra e a reação inicia-se

com a alteração da conformação da globina, devido à ligação dos grupos hidrofóbicos da

molécula de SLS na molécula de globina e oxidando depois o grupo heme (Fe2+→ Fe3+).

Os grupos hidrofílicos da molécula do SLS ligam-se então ao grupo heme, formando um

complexo corado estável (SLS-HGB), conforme a Figura 11, e que é analisado

fotometricamente a 555nm. Um LED emite uma luz monocromática e, ao passar pela

mistura, a luz é absorvida pelos complexos SLS-HGB. A restante luz é medida por um

fotossensor e é inversamente proporcional à concentração de hemoglobina da amostra

(9).

Ao realizar então a contagem total dos eritrócitos, para determinar o valor da

hemoglobina e do hematócrito, o equipamento calcula os restantes índices, tal como

exemplificado nas seguintes fórmulas da tabela 1:

(a) (b) (c)

Figura 10. Método de acumulação da altura dos impulsos dos eritrócitos num volume fixo para obtenção do valor do hematócrito (HCT%) [Adaptado de (9)].

Figura 11. Representação esquemática da determinação da hemoglobina pelo método de deteção SLS. (a) Alteração

da conformação da globina (b) Oxidação do grupo heme (c) Ligação dos grupos hidrofílicos da molécula do SLS ao grupo heme, com formação de um complexo corado estável (SLS-HGB) [Adaptado de (9)].



18

Tabela 1. Índices eritrocitários e respetivas fórmulas [Adaptado de (11)]

Canal RET/PLT-O

No canal RET, o reagente de lise perfura ligeiramente as membranas celulares dos

eritrócitos, leucócitos e plaquetas, permitindo a penetração do marcador fluorescente nas

células, mas deixando-as intactas. Em seguida, os ácidos nucleicos intracelulares são

marcados pela fluorescência do corante e o sinal emitido é diretamente proporcional à

quantidade de ácidos nucleicos dos reticulócitos. Ao utilizar a dispersão frontal de luz e

o sinal de fluorescência, os reticulócitos podem então ser distinguidos das outras células.

Os reticulócitos emitem um sinal de fluorescência maior que os eritrócitos (que não têm

RNA) e consideravelmente inferior ao sinal dos leucócitos.

Os reticulócitos dividem-se em três categorias, de acordo com a sua intensidade

de fluorescência, representando diferentes graus de maturação:

- LFR, reticulócitos de baixa fluorescência.

- MFR, reticulócitos de média fluorescência.

- HFR, reticulócitos de alta fluorescência.

A IRF (Fração de Reticulócitos Imaturos) reflete a proporção de reticulócitos

imaturos e é calculada pela soma de MFR + HFR. A hemoglobina reticulocitária (RET-

He) refere-se à medição celular direta da disponibilidade de ferro e é usada na

monitorização da eritropoietina (EPO) e/ou na terapia de ferro. Se o valor aumenta, é um

indicador de que a terapia está a ser eficaz (9).

O canal RET fornece também a contagem ótica de plaquetas (Figura 12).

Pârametro Fórmula Valor de

Referência

Volume Globular Médio 𝑉𝐺𝑀(𝑓𝐿) = 𝐻𝑇𝐶(𝐿/𝐿) 𝑥𝐻𝑇𝐶 (𝐿/𝐿)

𝐺𝑉 (𝑥1012/𝐿) 80,0-97,0 fL

Hemoglobina Globular Média 𝐻𝐺𝑀(𝑝𝑔) =𝐻𝐺𝐵 (𝑔/𝑑𝐿)

𝐺𝑉(𝑥1012)/𝐿)𝑥10 26,0-34,0 pg

Concentração de Hemoglobina

Globular Média 𝐶𝐻𝐺𝑀 =

𝐻𝐺𝐵(𝑔/𝑑𝐿)

𝐻𝑇𝐶(𝐿/𝐿) 32,0-36,0 g/dl



19

O Sysmex XN-1000™ Hematology Analyzer fornece complementarmente alguns

alarmes de modo a chamar a atenção para possíveis anormalidades. Nestes casos, são

feitas lâminas de esfregaços sanguíneos automaticamente, para serem vistas ao

microscópio ótico.

Os valores de referência são os seguintes:

Eritrograma (Homem/Mulher)

Eritrócitos 4,30-6,40/ 3,90-5,20 x 1012/L

Hemoglobina: 13,6-16,5/ 12,0-16,0 g/dl

Hematócrito: 39,8-52,0/ 34,7-46,0%

VGM: 80,0-97,0 fL

HGM: 26,0-34,0 pg

CHGM: 32,0-36,0 g/dL

Índice de dispersão eritrocitária: 11,5-15,0%

Leucograma

Leucócitos: 4,0-10,0 x109/L

Neutrófilos: 1,5-8,0 x109/L

Eosinófilos: <0,5 x109/L

Basófilos: <0,3 x109/L

Linfócitos: 0,8-4,0 x109/L

Monócitos: <1,2 x109/L

Trombocitograma

Plaquetas: 140-440 x109/L

Figura 12. Canal Ret/PLT-O obtido através do Sysmex XN-1000™ [Adaptado de (9)].



20

Plaquetócrito: 0,15-0,42%

VPM: 6,5-12,4 fL

Índice de dispersão plaquetária: 9,9-15,3 fL

Reticulócitos: 0,5-2,5%

Hemoglobina Reticulocitária: >27,0 pg

Fração de Reticulócitos Imaturos (IRF): 3,0-14,0%

Índice de Reticulócitos: 0,5-2,5%

2.2. Velocidade de Sedimentação

A velocidade de sedimentação (VS) representa a velocidade da queda dos

eritrócitos existentes no sangue tornado incoagulável (citratado) e colocado num tubo

estreito, graduado, vertical.

O fenómeno de sedimentação caracteriza-se por três etapas: a agregação, que

corresponde à formação de pilhas de eritrócitos; a sedimentação ou queda rápida, que

corresponde à queda das pilhas de eritrócitos a uma velocidade constante; e

a sedimentação final, que corresponde ao seu empilhamento no fundo do tubo.

A VS é expressa pela distância percorrida pelos eritrócitos durante uma hora, em

milímetros. A sua determinação é clinicamente útil em doenças associadas ao aumento

de produção de proteínas de fase aguda (12).

O VES-MaticTM Cube-200 (Figura 13) é um analisador automático para

determinar a VS. A amostra a utilizar é sangue total colhido em tubo de EDTA, com

volume mínimo de 1,5 mL. O equipamento realiza uma homogeneização automática,

mantendo a amostra em repouso por tempo predefinido e permitindo que a sedimentação

ocorra. Através de sensores analógicos, é determinado o nível de sedimentação dos

eritrócitos e calculado automaticamente o valor. As leituras são efetuadas por feixe de luz

visível e os resultados são obtidos em 26 minutos e comparáveis com os obtidos pelo

método de Westergren em 1 hora (13).

Por vezes, recorre-se ao Método de Westergren modificado, conforme a figura 14,

para fazer a confirmação de resultados muito elevados obtidos com o VES-MaticTM Cube-

200 ou quando a quantidade de amostra não é suficiente. Nestes casos, dilui-se 1 ml da

amostra de sangue total colhido em tubo de EDTA em citrato de sódio na proporção de 4

volumes de sangue para 1 volume de anticoagulante. Depois introduz-se a pipeta de

Westergren, graduada de 0 a 150 mm, no suporte adequado e em posição vertical, inicia-

se a contagem no cronómetro e deixa-se 1 hora à temperatura ambiente. Ao fim de 1 hora



21

faz-se a leitura em milímetros, ao nível da coluna dos glóbulos que se separam do plasma

(14).

Os valores de referência para a VS são os seguintes:

– 20 mm/h no Homem

– 30 mm/h na Mulher

– 10 mm/h na criança

Valores superiores a 120 mm/h são reportados como 120 mm/h.

2.3. Hemoglobina Glicada (HbA1c)

A hemoglobina é a principal proteína no interior dos eritrócitos e quando os níveis

de glicose no sangue estão altos, parte desta proteína é sujeita a uma reação química não

enzimática com a glicose em excesso.

A ligação entre a HbA e a glicose é um tipo de glicação não-enzimática, contínua,

lenta e irreversível. A quantidade de hemoglobina glicada que é formada depende assim

da concentração de glicose no sangue e do tempo de vida médio dos eritrócitos (cerca de

120 dias). Desta forma, a medida da quantidade de glicose ligada à hemoglobina pode

fornecer uma avaliação da glicémia média no período de 90 a 120 dias antes da análise

(16).

Os sistemas automáticos D-100™ System e o VARIANT™ II TURBO

Hemoglobin Testing System (Figura 15) utilizam a tecnologia de Cromatografia Líquida

de alta eficiência (HPLC) com troca iónica, em que a coluna é composta por uma resina

de troca catiónica de fase reversa. O aparelho é capaz de utilizar uma amostra de sangue

Figura 13. Aparelho VES-MaticTM Cube-200 [Adaptado de (13)]. Figura 14. Método de Westergren modificado

para determinar a VS [Adaptado de (15)].



22

total em tubo com anticoagulante EDTA e de a diluir, hemolisar e remover a base de

schiff (HbA1c lábil), permitindo a obtenção de resultados precisos para HbA1c (17, 18).

O doseamento da hemoglobina glicada é importante para o diagnóstico da

diabetes, bem como na monitorização do controle glicémico. Esta análise apresenta

vantagens em relação à determinação da glicemia em jejum uma vez que não é necessária

a condição de jejum, o seu valor não é influenciado pela ingestão alimentar ou prática de

exercício recente, não sofre alterações em casos de stress ou doença e tem ainda uma

maior estabilidade.

Os valores de referência para a hemoglobina glicada são os seguintes:

- 5,7-6,4%: risco de diabetes mellitus

- >6,4%: diabetes mellitus

2.4. Eletroforese das Hemoglobinas

A eletroforese de hemoglobinas tem como objetivo separar e quantificar os

diferentes tipos de hemoglobinas presentes no sangue periférico, com o interesse de

diagnosticar patologias que envolvem formas anormais de hemoglobina

(hemoglobinopatias) (19).

Os tipos de hemoglobina mais comuns são a hemoglobina A (maior percentagem

de hemoglobina encontrada nos adultos), a hemoglobina F (principal hemoglobina

presente no feto e no recém-nascido e após o nascimento decresce e é substituída pela

HbA) e a hemoglobina A2 (encontrada em pequenas quantidades nos adultos).

Figura 15. Sistemas automáticos para determinação da HbA1c a) D-100™ System e b) VARIANT™ II TURBO Hemoglobin Testing System [Adaptado de (17,18)]).

a) b)



23

As hemoglobinopatias podem ser classificadas como hemoglobinopatias

qualitativas - resultantes de alterações na estrutura das globulinas, onde se inclui as

variantes de hemoglobina HbS, HbC, HbE e HbD - ou quantitativas - em que há ausência

ou diminuição da síntese das cadeias globínicas originando talassémias (20).

Sempre que é pedida a Eletroforese das Hemoglobinas, o LJC recorre ao sistema

automático VARIANT™ II TURBO Hemoglobin Testing System (Figura 15) que utiliza

a tecnologia de HPLC com troca iónica, em que a coluna é composta por uma resina de

troca catiónica de fase reversa. A amostra utilizada é sangue total em tubo com

anticoagulante EDTA. A análise da área sob a curva dos picos de absorção obtidos

fornece a percentagem relativa a cada fração detetada (Figura 16). O tempo de eluição,

ou de retenção, de qualquer hemoglobina presente é comparado com o de hemoglobinas

conhecidas, permitindo a quantificação tanto das hemoglobinas normais A, F e A2, como

de outras variantes. Deve-se ter em consideração que existem variantes com tempos de

retenção semelhantes, por isso a identificação é presuntiva. Para identificar

definitivamente a Hb é necessário recorrer à análise do DNA ou dos aa da cadeia de

globina.

A drepanocitose e as talassemias são as hemoglobinopatias mais comuns

mundialmente.

A drepanocitose resulta de uma mutação no gene que codifica a cadeia β-globina,

sendo detetada na eletroforese pela presença da HbS. Esta hemoglobina pode estar

presente em quantidades moderadas, indicando que se trata de um portador

heterozigótico, ou em grandes quantidades (juntamente com presença de HbF e ausência

Figura 16. Resultados das percentagens de hemoglobinas obtidos por HPLC com o VARIANT™ II TURBO Hemoglobin Testing System [Adaptado de (21)].



24

de HbA), indicando que se trata de um portador homozigótico, causando uma anemia

hemolítica grave (20).

As talassemias podem ser classificadas de acordo com o tipo de cadeia globina

afetada. Caso a deficiência se verifique na síntese das cadeias alfa, trata-se de uma α-

talassemia, se for na cadeia β trata-se de uma β-talassémia. Estas hemoglobinopatias

podem ainda ser classificadas como talassémia minor (um gene com defeito) ou

talassémia major (dois genes com defeito). A presença de β-talassémia minor na

electroforese é detectada pela diminuição do pico de hemoglobina A e aumento da

hemoglobina A2 e HbF, e a β-talassémia major pela ausência da hemoglobina A,

acompanhada de níveis elevados de hemoglobina fetal F (20).

Níveis elevados de Hb F também se verificam numa condição rara denominada

persistência hereditária de hemoglobina fetal, um distúrbio hereditário assintomático.

Podem ainda ser detetadas outras hemoglobinopatias como a hemoglobinopatia C

e a hemoglobinopatia E, no entanto, são menos frequentes.

Os valores de referência para as hemoglobinas são os seguintes:

Hemoglobina A – 96-98%

Hemoglobina A2 – 1,5-3,5%

Hemoglobina F – 0-1%

2.5. Avaliação da Hemostase e Coagulação

A Hemostase é um processo fisiológico complexo que protege o sistema vascular

aquando de uma lesão, de forma a preservar a integridade da circulação e limitar a perda

de sangue. Este processo envolve vasos sanguíneos e células endoteliais, plaquetas e

proteínas plasmáticas e pode ser divido em três fases: Hemostase primária (avaliada pela

contagem de plaquetas, Agregação Plaquetária e Tempo de Hemorragia), Hemostase

secundária (avaliada pelo Tempo de Protrombina, Tempo de Tromboplastina Parcial

Ativada, Fibrinogénio, Tempo de Trombina, Proteína C, Proteína S, ATIII e Fatores de

Coagulação) e Fibrinólise (avaliada pelos D-dímeros e Plasminogénio) (22).

A avaliação da hemostase torna-se então muito importante por auxiliar na

compreensão do estado do indivíduo quanto a este conjunto de mecanismos fisiológicos

por meio dos quais ocorre a paragem de uma hemorragia, incluindo a vasoconstrição, a

agregação plaquetária e a coagulação.

O BCS® XP System (Figura 17) é um aparelho automático que realiza testes

funcionais para a avaliação da hemostase e da coagulação, com processamento de análises



25

coagulométricas, cromogénicas e de química imunológica, através do método de

fotometria/turbidimetria e recorrendo a uma amostra de plasma obtido em tubo de citrato.

Este método utiliza uma fonte de luz intermitente de xénon com um filtro, que permite

obter um feixe com comprimento de onda desejado. A luz é direcionada em partes iguais

através de um canal de medição e um canal de referência. Ao passar pela cuvete, o feixe

de luz diminui de intensidade devido à difusão por partículas ou à absorção na solução.

Durante o processo de coagulação, a preparação torna-se cada vez mais turva e, por sua

vez, a intensidade é menor. Nas análises cromogéneas, durante a reação é libertado um

pigmento, reduzindo a quantidade de luz que passa pela cuvete. A luz desviada é

bloqueada por um sistema de diafragma e a luz que passa no outro canal é direcionada

até ao segundo detetor. O equipamento tem a capacidade de medir dois pontos por

segundo, por cuvete, sendo a intensidade da luz convertida em sinal elétrico.

Tempo de Protrombina (TP) e INR

O TP permite avaliar a via extrínseca da cascata de coagulação através dos fatores

V, VII, X, protrombina (II) e fibrinogénio (I). A determinação deste parâmetro baseia-se

na adição da tromboplastina tecidular ao plasma do doente, na presença de iões cálcio,

iniciando-se assim a ativação da via extrínseca. Com isto, verifica-se a conversão do

fibrinogénio em fibrina, sendo que o tempo até à formação deste mesmo coágulo de

fibrina é medido em segundos. O resultado é apresentado em tempo (segundos), taxa de

protrombina (%) e INR (Razão normalizada Internacional) e é muito requisitado para

monitorização de anticoagulantes orais, excluindo os novos anticoagulantes que não

requerem monitorização (NOACS). Este último torna-se importante já que podem ser

Figura 17. Aparelho BCS® XP System [Adaptado de (23)].



26

utilizados diferentes reagentes durante o método e desta forma o resultado obtido é

padronizado. O INR é assim calculado do seguinte modo:

𝐼𝑁𝑅 = [𝑇𝑃 (𝐷𝑜𝑒𝑛𝑡𝑒)

𝑇𝑃(𝑚é𝑑𝑖𝑎 𝑑𝑜𝑠 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑜𝑠)]𝐼𝑆𝐼

(ISI – Índice de Sensibilidade Internacional, que varia de lote para lote entre 1,0 e 1,4)

Nestes casos, os valores de referência são os seguintes:

- INR 2,0-3,0 – profilaxia de TVP recorrente, embolia pulmonar e doenças

arteriais (incluindo enfarte agudo do miocárdio).

- INR 3,0-4,5 – prevenção da embolia sistémica recorrente e para válvulas

cardíacas artificiais. (22)

Tempo de Tromboplastina Parcial Ativada (aPTT)

O aPTT é o tempo necessário para a formação de um coágulo de fibrina num

plasma com citrato. A determinação deste valor consiste na incubação a 37ºC da amostra

de plasma com uma quantidade otimizada de fosfolípidos, sílica e iões de cálcio,

iniciando a ativação da via intrínseca da coagulação e desencadeando a formação do

coágulo. A sua determinação permite detetar anomalias dos fatores envolvidos na via

intrínseca: os fatores II, V, VIII, IX, X, XI e XII. Esta análise é ainda útil para a

monitorização da terapêutica com heparina. (22)


- 26-40 s

- RN: 26-60 s

Fibrinogénio

O Fibrinogénio (Fator I) é uma proteína sanguínea produzida pelo fígado que tem

um papel importante na formação do coágulo. Níveis baixos de fibrinogénio podem

significar deficiências adquiridas, como a proteólise intravascular do fibrinogénio pela

trombina, ou congénitas, como em casos de afibrinogenemia ou hipofibrinogenemia.

Níveis temporariamente elevados são encontrados devido ao comportamento do

fibrinogénio como proteína de fase aguda. (22)


- 150-400 mg/dl



27

Tempo de Trombina (TT)

O TT é o tempo necessário para que o fibrinogénio da amostra seja convertido em

coágulo de fibrina, através da adição de trombina bovina purificada. Este valor é

inversamente proporcional à quantidade de fibrinogénio da amostra. (22)

O valor de referência é o seguinte:

- 30 s

Proteína C

A Proteína C (PC) é um inibidor da coagulação dependente da vitamina K e que

regula a atividade dos fatores V e VIII. Para determinar a quantidade de PC

funcionalmente ativa, utiliza-se um substrato cromogénico e cujo produto da reação é lido

a 405 nm. A deficiência congénita de PC origina manifestações trombóticas graves,

quando em homozigotia. (22)


- 64-128%

- RN: 17-53%

Proteína S

A Proteína S (PS) é uma proteína plasmática dependente da vitamina K que atua

como cofator da Proteína C ativada na inativação dos fatores Va e VIIIa. Circula no

plasma sob a forma livre ativa e sob a forma inativa ligada à proteína de ligação C4b. A

deficiência congénita de PS origina manifestações trombóticas graves, quando em

homozigotia, e risco elevado de desenvolvimento de trombose venosa em jovens, quando

em heterozigotia. (22)


- 60-124%

- RN: 12-61%

D-dímeros

Os D-dímeros são produtos de degradação de fibrina ligados transversalmente

gerados por fibrinólise reativa. Neste teste, partículas de polistireno covalente com Ac

monoclonal reagem com os D-dímeros da amostra, aglutinando. Essa mesma aglutinação

é detetada turbidimetricamente pelo aumento da turvação. Este teste é importante para a

exclusão de eventos tromboembólicos como trombose venosa profunda ou embolismo

pulmonar. Níveis aumentados estão associados ao risco de eventos tromboembólicos

recorrentes após interrupção da terapêutica anticoagulante oral (22).



28


- <0,55 g/ml

Plasminogénio

O Plasminogénio é uma proenzima da plasmina e é convertido nesta pelos

ativadores internos (uroquinase) ou pelos ativadores externos (estreptoquinase). Utiliza-

se um subtrato cromogénico para determinar o plasminogénio biologicamente ativo e o

produto da reação é lido a 405 nm. Este teste é requisitado para avaliar desordens

fibrinolíticas e para controlo da terapia. Níveis diminuídos estão associados a doenças

hepáticas e fibrinólise terapêutica. Níveis elevados relacionam-se com carcinomas e

diabetes mellitus (22).


- 77-122 %

2.6. Imunohematologia

A imunohematologia é a área que estuda os antigénios presentes nos eritrócitos,

os anticorpos correspondentes e o seu significado clínico e relaciona-se ainda com a

medicina transfusional.

O ORTHO AutoVue® Innova System (Figura l8) é um equipamento automático

para a realização de testes imunohematológicos numa amostra de sangue total. Utiliza o

método de aglutinação em coluna (reação de aglutinação Ag-Ac). As colunas contêm

reagentes e esferas de vidro e, através da centrifugação de cassetes, os eritrócitos

aglutinados formam uma camada no topo da mistura (formação de precipitado), enquanto

que os não aglutinados depositam-se na parte inferior da coluna.

Figura 18. Aparelho ORTHO AutoVue® Innova System [Adaptado de (24)].



29

Este aparelho utiliza a tecnologia de cassetes e a edição de imagem digital, tendo

a capacidade de automatizar a pipetagem líquida, a incubação, a centrifugação e a

interpretação de resultados. A medição dos resultados é feita através de uma câmara que

lê as cassetes cerca de 25 vezes (24).

À superfície dos eritrócitos existem antigénios determinados geneticamente. As

diversas categorias de antigénios eritrocitários representam cerca de 23 sistemas de

grupos sanguíneos, cujos principais são o sistema AB0 e o sistema Rhésus (Rh), e que o

equipamento procura estudar.

No sistema AB0, os eritrócitos podem ser testados quanto à presença/ausência de

Ags (Prova Direta) ou quanto à presença/ausência de Acs (Prova Reversa). Isto porque

os Ags. A e B têm uma estrutura muito semelhante aos Ags das bactérias e plantas, aos

quais estamos constantemente expostos e por isso, como resultado, praticamente todos os

indivíduos com idade >6 meses que não tenha os Ags. A e B produzem o Ac. Estes Acs

são geralmente IgM e denominam-se Aloanticorpos Naturais ou Regulares.

No sistema Rh apenas existe produção de Acs após exposição com eritrócitos

Rh+. Estes Acs. são geralmente IgG e denominam-se Aloanticorpos Imunes ou

Irregulares. Neste sistema, existem 5 Ags de maior importância e é a presença/ausência

do antigénio D que determina se o indivíduo é Rh+ ou Rh-.

Teste de Coombs direto (Teste Direto da Antiglobulina)

Nesta prova, deteta-se a presença ou ausência de Ag de superfície nos eritrócitos

de amostras de sangue total, pela sua ligação a Ac Anti-A e Ac Anti-B em soros teste

(Figura 19a). Este teste é usado no diagnóstico de doenças auto-imunes e doença

hemolítica do recém-nascido (25).

Teste de Coombs indireto/Pesquisa de anticorpos anti-eritrocitários

irregulares (PAI)

Na prova indireta, testa-se o soro/plasma do doente com eritrócitos A1 e B,

detetando-se a presença ou ausência dos respetivos anticorpos (Figura 19b). Tem como

objetivo detetar anticorpos anti-eritrocitários clinicamente relevantes, ou seja, anticorpos

anti-eritrocitários encontrados no soro ou plasma que não sejam os de ocorrência natural

(anti-A e anti-B). A imunização a antígenos (estranhos) pode ser resultado de gravidez

e/ou transfusão de sangue prévia.

Utilizam-se três suspensões eritrocitárias de dadores selecionados do grupo 0.

Estes apresentam fenótipos conhecidos e que se caracterizam pela presença de antigénios



30

que originam a formação de anticorpos com significado clínico. O resultado obtido é

semiquantitativo, com escala de 1 a 4, sendo que resultados de valor numérico 1 são

duvidosos e devem ser confirmados. Para se apresentar um resultado semiquantitativo

devem ser executadas diversas diluições, de modo a indicar a diluição mais baixa para a

qual o resultado se mantém positivo. Quando o resultado é positivo deve-se proceder à

identificação do Ac específico. O grupo AB0 do paciente é definido quando se observa

concordância no resultado de ambas as provas. Este teste é assim útil em exames pré-

natais de grávidas Rh- e antes de transfusões sanguíneas (25).

a) TESTE DE COOMBS DIRETO

b) TESTE DE COOMBS INDIRETO

Figura 19. Esquematização do Teste de Coombs a) direto e b) indireto [Adaptado de (26)].


Stefanie Baptista Bioquímica

31

3. BIOQUÍMICA

A Bioquímica é uma área que estuda e aplica a química da vida e os processos

químicos que ocorrem nos organismos vivos, nomeadamente as estruturas moleculares e

as funções metabólicas de biomoléculas e componentes celulares, como proteínas,

enzimas, lípidos, ácidos nucleicos, hidratos de carbono, entre outros.

O cobas 8000 modular analyzer series (Figura 20) é o equipamento automático

utilizado no laboratório para determinar inúmeros parâmetros bioquímicos com valor

semiológico, recorrendo a métodos tais como a potenciometria, a colorimetria e a

imunoturbidimetria. Este equipamento consiste num conjunto de quatro módulos

analíticos ligados entre si: o módulo cobas ISE (módulo do ionograma), o módulo cobas

c 702 (módulo de química clínica) e dois módulos cobas e 602 (módulos de

imunoensaios). Abaixo serão apresentados os vários parâmetros, bem como os princípios

realizados em cada um destes módulos.

Já o cobas 6500 urine analyzer series (Figura 26) é o equipamento utilizado para

realizar a análise sumária da urina e é composto por dois módulos ligados: o módulo

cobas u 601 (módulo das tiras-teste) e o cobas u 701 (módulo do sedimento urinário).

3.1. Ionograma

O ionograma é um quadro numérico que indica a quantidade de iões básicos

(catiões) e de iões ácidos (aniões) no plasma (ionograma sanguíneo) ou na urina

(ionograma urinário). Os catiões determinados nesta análise são o sódio (Na+) e o potássio

(K+); o anião determinado é o cloro (Cl-). Esta análise é prescrita principalmente em casos

de perda de consciência, no contexto de doença cardíaca, renal ou hepática, em doentes

sob terapêutica com fluidos endovenosos ou com fármacos que alterem a concentração

destes iões, em doentes com poliúria, oligúria, polidipsia, vómitos ou diarreia, em doentes

com diálise, entre outras. Em relação às condições da colheita, são necessários alguns

Figura 20. Cobas 8000 modular analyzer series [Adaptado de (27)].



32

cuidados especiais. Nas colheitas de sangue, é importante usar o garrote o menor tempo

possível ou preferencialmente não usar garrote e deve ser colhido em tubo seco. (28)

Esta determinação é feita no módulo ISE (Ion-Selective Electrode) do cobas

8000, através do método de potenciometria indireta, ou tal como o próprio nome do

módulo indica, através de um Elétrodo Seletivo de Ião. Um ISE é um sensor que converte

a atividade de um ião específico dissolvido numa solução em potencial elétrico. Utiliza

um elétrodo específico para o ião a analisar e um elétrodo de referência, sendo ambos

imersos na amostra a ser analisada. A diferença de potencial é teoricamente dependente

do logaritmo da atividade iónica, de acordo com a equação de Nerst e é dessa forma que

se calcula a concentração iónica.

Os valores de referência no sangue são os seguintes:

Na+: 136-145 mmol/l

K+: 3,5-5,5 mmol/l

Cl-: 98-109 mmol/l

3.2. Química Clínica e Imunoensaios

O módulo c 702 do cobas 8000 utiliza o método de colorimetria para determinar

variados parâmetros de química clínica. Esta técnica é utilizada para determinar a

concentração de compostos coloridos em solução, utilizando um colorímetro, ou seja, um

dispositivo que determina a concentração de um analito através da medição da

absorvância a um determinado comprimento de onda de luz visível.

O módulo e 602 do cobas 8000 utiliza o método de eletroquimioluminescência

(ECLIA) para determinar variados parâmetros bioquímicos. Esta técnica utiliza a emissão

de luz através da aplicação de potenciais de oxidação ou redução a um elétrodo imerso

em soluções que emitem radiação. O equipamento apresenta micropartículas revestidas

de estreptavidina, um anticorpo monoclonal específico biotinilado e um anticorpo

monoclonal especifico para cada analito. Esta mistura é fixada magneticamente na

superfície do elétrodo e a parte que não é fixada é removida. Seguidamente, aplica-se

corrente elétrica no elétrodo, induzindo emissão quimioluminescente que é medida por

um fotomultiplicador.

De seguida são descritos alguns dos principais parâmetros determinados por estes

módulos.



33

3.2.1. Metabolismo dos Hidratos de Carbono

Glucose

A glucose é o principal hidrato de carbono presente no sangue periférico. A

concentração da glucose no sangue é mantida dentro de limites estreitos por ação de várias

hormonas, sendo algumas produzidas pelo pâncreas. No entanto, uma diminuição no

valor da glicemia traduz-se em hipoglicémia (menos frequente) e o aumento traduz-se em

hiperglicemia. A causa mais frequente de hiperglicemia é a diabetes mellitus, causada por

um défice da secreção ou da ação da insulina, outras causas são a pancreatite, a disfunção

da tiroide, a insuficiência renal e hepatopatias (29).

A determinação da glucose no sangue serve de diagnóstico da diabetes mellitus.

Segundo a DGS, a observação de pelo menos um dos seguintes critérios serve de

diagnóstico (deve ser confirmado com uma segunda análise) (30):

• Glicémia em jejum ≥ 126 mg/dl

• Sintomas clássicos e glicémia ocasional ≥ 200 mg/dl

• Glicémia ≥ 200mg/dl às 2h, numa PTGO (Prova de Tolerância à Glucose

Oral) com 75g de glucose

• HbA1c ≥ 6,5% (ver 2.3. Hemoglobina Glicada)

O diagnóstico da hiperglicemia intermédia ou identificação de categorias de risco

aumentado para diabetes, faz-se com base nos seguintes parâmetros:

• Anomalia da Glicemia de Jejum (AGJ): glicemia de jejum ≥ 110 e < 126

mg/dl

• Tolerância Diminuída à Glicose (TDG): glicemia às 2 horas na PTGO ≥

140 e < 200 mg/dl

O diagnóstico da diabetes gestacional faz-se com base nos seguintes valores para

plasma venoso:

• Glicemia de jejum, a realizar na 1.ª consulta de gravidez, ≥ 92 mg/dl e <

126 mg/dl

• Se glicemia de jejum < 92 mg/dl, realiza-se PTGO com 75 g de glicose, às

24-28 semanas de gestação. É critério para diagnóstico de diabetes

gestacional, a confirmação de um ou mais valores

i. às 0 horas, glicemia ≥ 92 mg/dl

ii. à 1 hora, glicemia ≥ 180 mg/dl

iii. às 2 horas, glicemia ≥ 153 mg/dl



34

A determinação da glucose é feita pelo método da hexoquinase. Conforme as

equações abaixo, a hexoquinase catalisa a fosforilação da glucose em glucose-6-fosfato

por ATP. A glucose-6-fosfato desidrogenase oxida o glocose-6-fosfato na presença de

NADP em gluconato-6-fosfato. A taxa de formação de NADPH durante a reação é

diretamente proporcional à concentração de glucose, sendo determinada

fotometricamente (29).

𝐺𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑒 + 𝐴𝑇𝑃𝐻𝐾→ 𝐺 − 6 − 𝑃 + 𝐴𝐷𝑃

𝐺 − 6 − 𝑃 + 𝑁𝐴𝐷𝑃+𝐺−6−𝑃𝐷𝐻→ 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑛𝑎𝑡𝑜 − 6 − 𝑃 +𝑁𝐴𝐷𝑃𝐻 + 𝐻+ (29)


- 50-100 mg/dl

Microalbuminúria

A microalbuminúria (albumina de baixa concentração) é utilizada como um

parâmetro de avaliação e prevenção da nefropatia diabética. Corresponde à presença de

pequenas quantidades de albumina na urina. Considera-se positiva quando o seu valor

oscila entre 20-200 mg/dl. As causas da microalbuminúria podem ser glomerulares

(devido a microangiopatia diabética, hipertensão), tubulares (inibição da reabsorção) ou

pós-renais (31).

A determinação da albumina em baixa concentração é feita por

imunoturbidimetria. Os anticorpos anti-albumina reagem com o antigénio na amostra e

formam complexos Ag-Ac. Estes, após a aglutinação são determinados por turbidimetria.

A amostra a utilizar é preferencialmente a urina de 24h mas pode também ser utilizada

uma urina ocasional. Neste último caso, é efetuada a quantificação da creatinina

juntamente com a quantificação da microalbumina, como fator corretivo e o resultado é

apresentado como a relação microalbumina/creatinina (também designada relação

albumina/creatinina).


- Em urina de 24h: até 30,0 mg/24h

3.2.2. Metabolismo Lipídico

Colesterol total

O colesterol é um esteroide sintetizado sobretudo no fígado e na parede intestinal.

A sua determinação é útil para o despiste do risco aterogénico e no diagnóstico e



35

tratamento de doenças que envolvem níveis elevados de colesterol bem como

perturbações do metabolismo lipídico e lipoproteico (32).

A determinação é feita por colorimetria enzimática de acordo com as reações

abaixo:

É𝑠𝑡𝑒𝑟𝑒𝑠 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑙𝑒𝑠𝑡𝑒𝑟𝑜𝑙 + 𝐻2𝑂𝐶𝐸→ 𝑐𝑜𝑙𝑒𝑠𝑡𝑒𝑟𝑜𝑙 + 𝑅𝐶𝑂𝑂𝐻

𝐶𝑜𝑙𝑒𝑠𝑡𝑒𝑟𝑜𝑙 + 𝑂2𝐶𝐻𝑂𝐷→ 𝑐𝑜𝑙𝑒𝑠𝑡 − 4 − 𝑒𝑛 − 3 − 𝑜𝑛𝑎 + 𝐻2𝑂2

2𝐻2𝑂2 + 4 − 𝐴𝐴𝑃 + 𝑓𝑒𝑛𝑜𝑙𝑃𝑂𝐷→ 𝑐𝑜𝑟𝑎𝑛𝑡𝑒 𝑞𝑢𝑖𝑛𝑜𝑛𝑎 − 𝑖𝑚𝑖𝑛𝑎 + 4 𝐻2𝑂 (32)


- <200 mg/dl

HDL (High Density Lipoproteins)

As lipoproteínas de alta densidade (HDL) são responsáveis pelo transporte inverso

do colesterol das células periféricas para o fígado. No fígado, o colesterol é ainda

transformado em ácidos biliares que são excretados para os intestinos através das vias

biliares. Trata-se de uma análise importante já que concentrações elevadas de colesterol

HDL são um fator protetor contra a doença cardíaca coronária, enquanto que

concentrações reduzidas, principalmente se associadas a níveis elevados de triglicéridos,

aumentam o risco cardiovascular (33).

A determinação é feita por colorimetria enzimática homogénea. Os valores de

referência são os seguintes:

- >59 mg/dl

LDL (Low Density Lipoproteins)

As lipoproteínas de baixa densidade (LDL) derivam das lipoproteínas VLDL,

ricas em triglicéridos, através da ação de enzimas sintetizadas no fígado. Concentrações

elevadas de LDL no sangue e o aumento do seu tempo de permanência, em associação

com um aumento da taxa de modificação biológica, resultam na destruição da função

endotelial e numa captação superior do colesterol HDL pelo sistema

monócitos/macrófagos e pelas células das paredes dos vasos sanguíneos. Sendo que

apresenta um valor preditivo em relação à aterosclerose coronária (34).



- Até 130 mg/dl



36

Triglicéridos

Os triglicéridos são ésteres do glicerol-álcool tri-hidratado com 3 ácidos gordos

de cadeia longa. Parte deles é sintetizada no fígado e outra parte é adquirida através da

alimentação. A sua determinação é importante para o diagnóstico e tratamento de doentes

com diabetes mellitus, nefrose, obstrução hepática, alterações do metabolismo dos

lípidos, entre outras doenças endócrinas (35).



- Até 150 mg/dl

3.2.3. Metabolismo Proteico

Proteínas Totais

As proteínas plasmáticas são sintetizadas no fígado, células plasmáticas, gânglios

linfáticos, baço e medula óssea. Pode verificar-se hipoproteinemia em casos de perdas de

sangue, caquexia aftosa, síndrome nefrótico, queimaduras graves, síndrome de retenção

de sal e Kwashiorkor. Pode observar-se hiperproteinemia em casos de desidratação grave

e mieloma múltiplo. Alterações na percentagem de frações proteicas (ver 3.4. Eletroforese

das Proteínas) pode não se refletir na quantidade das proteínas totais (36).

A determinação é feita por ensaio colorimétrico. Os valores de referência são os

seguintes:

- 1ºmês: 4,5-7,0 g/dl

- 2 meses a 1 ano: 5,5-7,2 g/dl

- 2 a 60 anos: 6,0-8,3 g/dl

- >60 anos: 5,8-8,1 g/dl

3.2.4. Função Hepática e Tracto Biliar

AST (Aspartato aminotrasferase)

A AST (ou GOT) é uma enzima distribuída pelos tecidos, mas principalmente

pelo tecido hepático, cardíaco, muscular e renal. As doenças hepatobiliares, como a

cirrose, o carcinoma metástico e a hepatite viral provocam um aumento nos níveis séricos

da AST, sendo por isso a sua determinação importante para o diagnóstico e monitorização

da terapêutica nestas situações (37).



37

A determinação é feita por ensaio colorimétrico, conforme as equações abaixo:

𝐿 − 𝐴𝑠𝑝𝑎𝑟𝑡𝑎𝑡𝑜 + 2 − 𝑜𝑥𝑜𝑔𝑙𝑢𝑡𝑎𝑟𝑎𝑡𝑜𝐴𝑆𝑇→ 𝑜𝑥𝑎𝑙𝑜𝑎𝑐𝑒𝑡𝑎𝑡𝑜 + 𝐿 − 𝑔𝑙𝑢𝑡𝑎𝑚𝑎𝑡𝑜

𝑜𝑥𝑎𝑙𝑜𝑎𝑐𝑒𝑡𝑎𝑡𝑜 + 𝑁𝐴𝐷𝐻 +𝐻+𝑀𝐷𝐻→ 𝐿 − 𝑚𝑎𝑙𝑎𝑡𝑜 + 𝑁𝐴𝐷+ (37)

*A taxa de oxidação de NADH é diretamente proporcional à atividade catalítica de AST.

É determinada medindo a diminuição da absorvância.


- Até 32 U/L

ALT (Alanina aminotransferase)

A ALT (ou GPT) é uma enzima cuja principal fonte é o fígado e por isso muito

útil para o diagnóstico de doenças hepática. Observam-se níveis elevados de ALT na

hepatite, cirrose, icterícia obstrutiva, carcinoma hepático e alcoolismo. A ALT catalisa

uma reação semelhante aquela que é catalisada pela AST, sendo que o aspartato é

substituído pela alanina e o oxaloacetato pelo piruvato (38).

A determinação é feita por ensaio colorimétrico. O valor de referência é o

seguinte: - Até 45 U/L

GGT (Gama Glutamiltransferase)

A GGT é uma enzima utilizada no diagnóstico e monitorização das doenças

hepatobiliares. A sua atividade é um dos marcadores hepáticos mais sensíveis, servindo

de teste de despiste para o alcoolismo, bem como na discriminação da origem da fosfatase

alcalina elevada (39).

A determinação é feita por ensaio colorimétrico enzimático, conforme a equação

abaixo:

𝐿 − − 𝑔𝑙𝑢𝑡𝑎𝑚𝑖𝑙 − 3 − 𝑐𝑎𝑟𝑏𝑜𝑥𝑖 − 4 − 𝑛𝑖𝑡𝑟𝑜𝑎𝑛𝑖𝑙𝑖𝑑𝑎 + 𝑔𝑙𝑖𝑐𝑖𝑙𝑔𝑙𝑖𝑐𝑖𝑛𝑎

𝐺𝐺𝑇→ 𝐿 − − 𝑔𝑙𝑢𝑡𝑎𝑚𝑖𝑙 − 𝑔𝑙𝑖𝑐𝑖𝑙𝑔𝑙𝑖𝑐𝑖𝑛𝑎 + 5 − 𝑎𝑚𝑖𝑛𝑜 − 2 − 𝑛𝑖𝑡𝑟𝑜𝑏𝑒𝑛𝑧𝑜𝑎𝑡𝑜 (39)

*A quantidade de 5-amino-2-nitrobenzoato libertada é proporcional à atividade da GGT

na amostra. É determinada medindo o aumento da absorvância.

O valor de referência é o seguinte:

- Até 42 U/L

FA (Fosfatase Alcalina)

A fosfatase alcalina (ou ALP) no soro é constituída por 4 genótipos estruturais

(tipo fígado-osso-rim, tipo intestinal, tipo placentário e variante das células germinais),

sendo a isoenzima fígado-osso-rim a mais importante, auxiliando no diagnóstico de



38

doenças hepatobiliares e ósseas. Verifica-se um aumento da FA em todas as formas de

colestase, particularmente na icterícia obstrutiva (40).

A determinação é feita por ensaio colorimétrico, conforme a equação abaixo:

𝑝 − 𝑛𝑖𝑡𝑟𝑜𝑓𝑒𝑛𝑖𝑙 𝑓𝑜𝑠𝑓𝑎𝑡𝑜 + 𝐻2𝑂𝐴𝐿𝑃→ 𝑓𝑜𝑠𝑓𝑎𝑡𝑜 + 𝑝 − 𝑛𝑖𝑡𝑟𝑜𝑓𝑒𝑛𝑜𝑙 (40)

*A quantidade de p-nitrofenol libertada é proporcional à atividade da FA na amostra. É

determinada medindo o aumento da absorvância.


- 35-136 U/L (variam com a idade, sexo e gravidez)

Bilirrubinas

A bilirrubina forma-se no sistema reticuloendotelial durante a degradação dos

eritrócitos envelhecidos. A porção heme da hemoglobina e de outras proteínas que

contêm heme é removida, metabolizada em bilirrubina e transportada para o fígado sob a

forma de complexo com a albumina sérica. No fígado, a bilirrubina é conjugada com

ácido glucorónico, para solubilização e consequente transporte através do canal biliar, e

eliminação através do aparelho digestivo.

Quando a produção de bilirrubina é mais rápida do que a capacidade do fígado a

metabolizar (em processos hemolíticos), os níveis de bilirrubina não conjugada (indireta)

aumentam no sangue. A obstrução do canal biliar ou lesões da estrutura hepatocelular

provocam aumentos dos níveis séricos da bilirrubina conjugada (direta) bem como da não

conjugada (41).

A determinação é feita por diazométodo colorimétrico, conforme a equação

abaixo:

𝐵𝑖𝑙𝑖𝑟𝑟𝑢𝑏𝑖𝑛𝑎 +3,5 − 𝐷𝑃𝐷á𝑐𝑖𝑑𝑜→ 𝑎𝑧𝑜𝑏𝑖𝑙𝑖𝑟𝑟𝑢𝑏𝑖𝑛𝑎 (41)


- Bilirrubina total: até 1,20 mg/dl

- Bilirrubina direta/conjugada: até 0,30 mg/dl

3.2.5. Função Renal

Creatinina

A creatinina é a forma cíclica da creatina e produto do metabolismo muscular

(proteínas endógenas). É formada a uma taxa relativamente constante pelos músculos e a

sua excreção, feita a nível renal, não é afetada pela dieta. A sua determinação tem por



39

objetivo o diagnóstico e a monitorização da insuficiência renal aguda e crónica e a

monitorização da diálise renal (43).

A determinação baseia-se numa modificação ao método de Jaffé cinético que

utiliza supressão da velocidade e correção da interceção, conforme a equação abaixo:

𝐶𝑟𝑒𝑎𝑡𝑖𝑛𝑖𝑛𝑎 +Á𝑐. 𝑃í𝑐𝑟𝑖𝑐𝑜𝑁𝑎𝑂𝐻→ 𝐶𝑟𝑒𝑎𝑡𝑖𝑛𝑖𝑛𝑎 − 𝑃𝑖𝑐𝑟𝑎𝑡𝑜 (𝑣𝑒𝑟𝑚𝑒𝑙ℎ𝑜) (43)


- Até 1,20 mg/dl (variam com a massa muscular)

Ureia

A ureia é o principal produto final do metabolismo do azoto proteico. É sintetizada

no ciclo da ureia no fígado a partir da amónia, que é produzida por desaminação dos

aminoácidos. A ureia é principalmente excretada pelos rins, mas também pelo suor em

quantidades mínimas, sendo degradada nos intestinos por ação bacteriana. A

determinação do azoto ureico no sangue é o parâmetro mais utilizado para testar a função

renal. Os aumentos da concentração de azoto de ureia no sangue são verificados nos casos

de perfusão renal inadequada, choque, diminuição do volume sanguíneo (causas pré-

renais), nefrite crónica, nefrosclerose, necrose tubular, nefrite glomerular (causas renais)

e obstrução do aparelho urinário (causas pós-renais). Podem também ocorrer valores

elevados durante períodos de elevada ingestão proteica (44).

A determinação é feita por teste cinético com urease e glutamato desidrogenase,

segundo a reação enzimática Roch-Ramel. Os valores de referência são os seguintes:

- 18-65 anos: <50 mg/dl

- >65 anos: <71 mg/dl

Ácido Úrico

O ácido úrico é o produto final do metabolismo das purinas e a sua determinação

é usada no diagnóstico e monitorização de patologias renais e metabólicas,

nomeadamente a insuficiência renal (45).

A determinação é feita por teste colorimétrico, segundo a reação enzimática de

Fossati, utilizando a uricase como ponto final. Os valores de referência são os seguintes:

- 2,4-6,0 mg/dl



40

3.2.6. Função Pancreática

Amilase

A amilase é uma enzima produzida apenas no pâncreas e na saliva, sendo por isso

um ótimo parâmetro para avaliar a função pancreática, principalmente para o diagnóstico

e monitorização da pancreatite aguda. Os seus valores encontram-se elevados na

pancreatite aguda, na parotidite e na presença de úlceras perfuradas (estômago e duodeno)

(46).

A determinação é feita por teste colorimétrico, utilizando o p-nitrofenil-

maltoheptósido bloqueado por etilideno como substrato. Os valores de referência são os

seguintes:

- Até 118 U/L

Lipase

A lípase é uma enzima também utilizada para apoiar o diagnóstico e

monitorização de doenças pancreáticas tais como a pancreatite aguda e obstrução do

ducto pancreático, já que permanece mais tempo em circulação em episódios agudos,

quando comparado com a amilase (47).

A determinação é feita por teste colorimétrico enzimático, onde o substrato

produzido na reação é proporcional à concentração de lipase presente na amostra. Os

valores de referência são os seguintes:

- Até 59 U/L

3.2.7. Metabolismo Fosfocálcico

A homeostase do cálcio e do fósforo dá-se através da interação de 4 sistemas

fisiológicos, que estão separados, mas intimamente ligados: sistema GI. O sistema

endócrino, o sistema renal e o sistema músculo-esquelético ou ossos.

O cálcio e fósforo entram no sistema GI através da dieta, sendo que parte é

excretada pelas fezes e outra parte é absorvida para a corrente sanguínea. Estes eletrólitos

são sujeitos a uma contínua mineralização, com formação e destruição óssea, num

processo denominado de “Bone turnover” (Adaptado de 48).

No sistema renal sofrem filtração, no glomérulo, onde podem ser reabsorvidos nos

túbulos renais ou excretados através da urina.

O sistema endócrino é responsável por regular todos estes sistemas através de

hormonas produzidas pela paratiroide.



41

Cálcio

O cálcio é o quinto elemento mineral mais abundante no corpo humano e tem um

papel importante na mineralização óssea. É um elemento vital nalguns processos

fisiológicos básicos como a coagulação, a contração do músculo cardíaco e esquelético e

na condução neuromuscular. A maioria do cálcio está armazenada no esqueleto sob a

forma de hidroxiapatite. A sua determinação é assim importante para o diagnóstico e

monitorização de doenças da paratiroide, doenças ósseas e doenças renais crónicas (50).

A determinação é feita por teste colorimétrico, já que o cálcio forma um complexo

corado com o Arsenazo III, a baixo pH. Os valores de referência são os seguintes:

- Cálcio Total: 2,15-2,55 mmol/L/ 8,60-10,20 mg/dl

Fósforo inorgânico

O fósforo inorgânico (H2PO4, PO4, fosfato inorgânico) existe combinado com o

cálcio no esqueleto, sendo os seus níveis regulados pela PTH, vitamina D e calcitonina.

É determinado para o diagnóstico e monitorização de doenças renais, perturbações da

glândula paratiroide e desequilíbrios da vitamina D. Os seus valores encontram-se

fisiologicamente aumentados nas crianças, devido ao seu envolvimento no metabolismo

da formação óssea (51).

A determinação é feita por teste colorimétrico enzimático, onde o fósforo

inorgânico reage com o molibdato de amónia na presença de ácido sulfúrico, para formar

o complexo fosfomolibdato não reduzido. Os valores de referência são os seguintes:

- 2,48-4,50 mg/dl

PTH (Hormona Paratiroide)

A PTH é uma hormona formada na glândula paratiroide e segregada na circulação

sanguínea. Esta hormona, juntamente com a vitamina D e a calcitonina, provoca a

mobilização de cálcio e de fosfato no sistema esquelético e aumenta a absorção de cálcio

no intestino, assim como a eliminação de fosfatos através dos rins. Garante ainda que a

concentração sanguínea de cálcio se mantenha constante (52).

A secreção de PTH é inibida pelas concentrações elevadas de cálcio e promovida

pelas baixas concentrações. Deficiências da função da paratiroide provocam o aumento

(hipercalcemia) ou a diminuição (hipocalcemia) do nível de cálcio no sangue. Uma

hiperfunção da paratiroide resulta em aumento da secreção da PTH (hiperparatiroidismo).

A causa primária são os adenomas da paratiroide, e no hiperparatiroidismo secundário a

causa poderá ser a diminuição da vitamina D (52).



42

A determinação é feita pela técnica de sandwich, em que o anticorpo monoclonal

biotinilado reage com o fragmento N-terminal e o anticorpo monoclonal marcado com

um complexo de ruténio reage com o fragmento C-terminal. Os valores de referência são

os seguintes:

- 15,0-65,0 ng/L

Vitamina D

A vitamina D é um percursor da hormona esteroide lipossolúvel que é produzida

principalmente na pele, por exposição solar. A vitamina D é biologicamente inerte e tem

de passar por duas hidroxilações sucessivas no fígado e nos rins, para se transformar na

1,25-diidroxivitamina D biologicamente ativa. As duas principais formas da vitamina D

são a vitamina D3 (colecalciferol) e a vitamina D2 (ergocalciferol) e esta última só é

adquirida através da alimentação (53).

A vitamina D é essencial para a saúde dos ossos e a sua deficiência grave em

crianças pode levar ao raquitismo e nos adultos, juntamente com o aumento da PTH, pode

levar a osteomalacia (53).

A determinação é feita por imunoensaio de competição. Os valores recomendados

internacionalmente são os seguintes:

- Carência: <32 g/L

- Desejável: 32-100 g/L

- Eventual toxicidade: >100 g/L

3.2.8. Função Cardíaca

Os marcadores cardíacos são substâncias libertadas no sangue quando existe uma

lesão no coração. O teste a estes marcadores é usado para ajudar a diagnosticar, avaliar e

controlar os doentes com suspeita de síndrome coronária aguda (SCA). Os sintomas estão

associados a enfarte agudo do miocárdio e anginas, mas podem também ser detetados em

condições que não estão relacionadas com o coração. As subidas de um ou mais

marcadores podem identificar doentes com SCA, permitindo um rápido diagnóstico e o

tratamento adequado do seu estado. O SCA é causado por uma diminuição repentina na

quantidade de sangue e oxigénio que chegam ao coração. Esta diminuição, também

chamada isquémia, deve-se normalmente ao forte estreitamento das artérias coronárias

ou ao bloqueio do fluxo sanguíneo nas artérias. Quando o fluxo sanguíneo para o coração

é bloqueado ou significativamente reduzido, pode causar necrose das células cardíacas,

provocando um enfarte agudo do miocárdio (EAM). Isto pode levar à morte do músculo



43

cardíaco afetado ou a uma lesão permanente, e posterior cicatrização do tecido cardíaco.

Os marcadores cardíacos são descritos de seguida (54).

Creatina Quinase (CK)

A creatina quinase é uma enzima dimérica que ocorre em 4 isoformas diferentes:

uma isoenzima mitocondrial e as isoenzimas citosólicas CK-MM (tipo músculo-

esquelética), CK-BB (tipo cerebral) e CK-MB (tipo miocárdica). Após lesão do

miocárdio, tal como acontece no EAM, a CK é libertada pelas células lesadas. Pode-se

encontrar uma atividade de CK aumentada cerca de 4 horas após o enfarte e atinge o seu

máximo após 12-24h (Figura 23) (55).

A determinação é feita por teste UV, segundo o método de Oliver e aperfeiçoado

por Szasz, em que a CK é rapidamente inativada por oxidação dos grupos sulfidrilo no

seu centro ativo. Os valores de referência são os seguintes:

- Até 200 U/L

CK-MB

A CK-MB é detetável no sangue cerca de 3-8 horas após o início dos sintomas

cardíacos, podendo continuar detetável por um período de tempo relativamente longo,

dependendo da evolução da doença (Figura 23) (56).

A determinação é feita por ensaio de ECLIA, utilizando dois anticorpos

monoclonais diferentes, dirigidos especificamente contra a CK-MB humana. Os valores

de referência são os seguintes:

- Até 24 U/L

Troponina T (cTnT)

A troponina constitui um complexo proteico que regula a contração do músculo

estriado. É composta por três subunidades organizadas periodicamente ao longo do

filamento das miofibrilas. A troponina C liga-se ao Cálcio, a troponina T liga-se à

tropomiosina no filamento fino e a troponina I inibe a actomiosina ATPase.

A Troponina T é um marcador específico do músculo estriado cardíaco e em

situações de Enfarte Agudo do Miocárdio, observa-se um grande aumento 3-4h após

ocorrência dos sintomas cardíacos, mantendo-se aumentada até 14 dias seguintes (57).

A determinação é feita por imunoensaio do tipo sandwich, com deteção por

quimioluminescência direta. Os valores de referência são os seguintes:

- Até 0,014 g/L



44

Troponina I (cTnI)

A Troponina I é uma proteína inibidora que existe em três isoformas distintas, a

do músculo cardíaco, do músculo esquelético de contração lenta e do músculo esquelético

de contração rápida. Cada isoforma apresenta uma sequência de aminoácidos especifica,

sendo a forma cardíaca (cTnI) a mais distinta, garantindo bons resultados enquanto

marcador cardíaco para o diagnóstico do EAM. Pode ser detetada entre 4-8h após início

dos sintomas, apresentando concentração máxima 12-16h depois. Mantém-se aumentada

entre 5 a 9 dias (Figura 23) (58).



- Até 0,160 g/L

Mioglobina

A mioglobina é uma hemoproteína monomérica de ligação ao oxigénio,

encontrada principalmente no tecido muscular cardíaco. Em situações de lesão tecidular

a mioglobina é rapidamente libertada, tornando-se um marcador de resposta rápida. Pode

ser detetada 2-4h após ocorrência de lesão tecidular, apresentando valores máximos entre

9-12h depois. Os valores basais são restabelecidos 24-36h depois (Figura 23) (59).



- Até 100 g/L

Homocisteína

A homocisteína é um aminoácido formado a partir da metionina, sendo o seu

metabolismo regulado por três vias enzimáticas que a convertem em cisteína. Apresenta

Figura 21. Evolução dos marcadores cardíacos após ocorrência de lesão tecidular [Adaptado de (60)].



45

interesse clínico para avaliar se existe risco de EAM ou AVC, para detetar défices de

ácido fólico ou vitamina B12, ou ainda para diagnosticar a doença hereditária

homocisteinúria (67).

A determinação é feita por imunoensaio competitivo. Os valores de referência são

os seguintes:

- 15-65 Anos: < 15,0 µmol/L

- > 65 Anos: < 20,0 µmol/L

- Grávida: < 10,0 µmol/L

3.2.9. Marcadores Tumorais

Os marcadores tumorais (ou marcadores biológicos) são substâncias encontradas

no sangue, na urina ou em outros fluídos corporais e tecidos que podem estar em

quantidades aumentadas quando um determinado tipo de cancro está presente. Assim,

estas substâncias funcionam como indicadores da presença de cancro, e podem ser

produzidas diretamente pelo tumor ou pelo organismo, em resposta à presença do tumor.

É importante realçar que os marcadores tumorais por si só são insuficientes para

indicar a presença de cancro. O resultado de marcador tumoral deve ser analisado

juntamente com o histórico do doente, exame físico, análises clínicas e exames

imagiológicos (61).

Neoplasia da mama

CEA (Antigénio Carcinoembrionário)

O CEA é uma glicoproteína oncofetal sintetizada durante os primeiros seis meses

de vida fetal no trato gastrointestinal e no pâncreas. Nos adultos, a síntese de CEA não

está totalmente reduzida. Apesar de o CEA ser considerado como o marcador tumoral de

eleição na monitorização do cancro colo-rectal, outras doenças noutros órgãos podem

provocar uma elevação dos níveis de CEA, como o ovário, mama, pulmão e estômago.

Outras situações podem causar elevação dos níveis normais de CEA, como a inflamação

do pulmão, fígado (cirrose) e tumores benignos. Os fumadores possuem um limite de

referência superior aos não fumadores. O CEA não é um marcador de deteção nem de

diagnóstico do cancro colo-rectal, mas deve ser utilizado para ajudar ao prognóstico da

doença, monitorização das recidivas e avaliação da resposta terapêutica. Os níveis de

CEA normalizam entre 1-4 meses após remoção cirúrgica do tecido neoplásico (62).



46



- Até 5,0 (fumadores até 10,0) g/L

CA 15.3

O CA 15.3 é uma glicoproteína polimórfica, pertencente á família das mucinas,

produto do gene MUC-1. A sua presença em circulação está associada ao cancro da mama

metastásico. É utilizado como indicador de prognóstico na neoplasia da mama e para

avaliação do estadio da doença bem como monitorização da sua evolução e da resposta à

terapêutica. Apresenta também bons resultados enquanto indicador precoce de recidivas

(63).



- Até 35 kU/L

Ovário e Endométrio - CA 125

O CA 125 é uma glicoproteína que pertence à família dos marcadores tumorais

definidos por hibridoma e encontra-se numa percentagem elevada nos tumores dos

ovários não-mucinosos de origem epitelial e pode ser detetado no soro. Não ocorre no

epitélio de superfície dos ovários normais. Por vezes, observam-se também valores

elevados em várias doenças ginecológicas benignas, tais como quistos do ovário,

metaplasias dos ovários, endometriose, útero miomatoso ou inflamação do colo do útero.

Também se verificam valores aumentados em doenças hepáticas benignas.

Apesar de ser um marcador relativamente inespecífico, é atualmente o marcador

tumoral mais importante para a monitorização da terapêutica e da evolução dos pacientes

com carcinoma seroso do ovário (64).



- Pré-menopausa: <35 kU/L

- Pós-menopausa: <20 kU/L

PSA (Antigénio Específico da Próstata)

O PSA é uma glicoproteína cujas concentrações elevadas no soro são geralmente

indicadoras de patologia da próstata (prostatite, hiperplasia benigna ou carcinoma). A sua

determinação é útil na monitorização da progressão e da eficiência da terapêutica em

doentes com carcinoma da próstata ou que estejam a fazer terapêutica hormonal. A



47

inflamação ou trauma da próstata (retenção urinária, após toque retal, citoscopia,

coloscopia, biópsia transuretral, tratamento laser ou ergometria) podem originar

resultados elevados do PSA (65).



- Até 4,0 g/L

Carcinoma do pâncreas - CA 19.9

O CA 19.9 é uma mucina de alto peso molecular e rica em carbohidratos utilizada

na monitoração do tratamento de carcinomas, principalmente do pâncreas, mas também

nos do estômago, fígado, vias biliares e colon. É importante realçar que este marcador

não pode ser utilizado para deteção precoce do carcinoma do pâncreas. Nos casos de

carcinoma gástrico é aconselhável a determinação concomitante de CA 72.4 e CEA, já

nos casos de carcinoma colo retal, basta a determinação de CEA (a determinação de CA

19.9 pode ser útil nos casos CEA negativos, que são raros) (66).



- Até 39 kU/L

CA 72.4

O CA 72.4 é um marcador tumoral utilizado para a monitorização da terapêutica

do carcinoma do estômago e ovários, no entanto a sua especificidade é baixa, podendo

encontrar-se aumentado em situações benignas (68).



- Até 8,2 kU/L

3.2.10. Doenças Infeciosas

HBV (Vírus da Hepatite B)

O HBV é um vírus que causa hepatite B e que apresenta 3 antigénios proteicos

virais: o antigénio de superfície (HBsAg), o antigénio do núcleo (HBcAg) e o antigénio

e (HBeAg). A infeção por HBV é transmitida por via sanguínea, sexual e perinatal e pode

provocar hepatites agudas e crónicas, que podem conduzir à cirrose ou hepatocarcinoma

(69).

O HBsAg é um dos componentes do invólucro externo da partícula do HBV e a

sua deteção no soro ou plasma humano é um indicador de infeção. Este é o primeiro



48

marcador imunológico, encontrando-se geralmente já presente alguns dias ou semanas

antes de os primeiros sintomas clínicos começarem a manifestar-se, sendo observados em

situações agudas e crónicas (Figura 22), serve assim de diagnóstico e monitorização da

doença. Os anti-HBs (geralmente IgG) são anticorpos específicos dirigidos contra o

antigénio de superfície da hepatite B. Podem formar-se após uma infeção de HBV ou

após a vacina contra a hepatite B. A sua determinação é útil para avaliar a eficácia da

vacina bem como a evolução da doença (69).

O HBeAg é um produto do gene pré-C/C que foi encontrado nos hepatócitos após

a proliferação do vírus. A seguir à proteólise, a proteína HBe é segregada em forma não

particulada para o soro. O HBeAg aparece no soro durante infeções agudas por HBV,

sendo detetável durante um curto período de tempo (dias a semanas). Na fase de

recuperação posterior à hepatite B aguda, o HBeAg é o primeiro marcador serológico

negativo substituído pelo anticorpo correspondente (anti-HBe), conforme a Figura 22. A

determinação destes marcadores é assim útil para monitorizar a evolução da infeção (69).


quimioluminescência direta. Os resultados apresentados são os seguintes:

- Reativo

- Não reativo

HCV (Vírus da Hepatite C)

O HCV é um vírus que causa hepatite C e é uma das principais causas de doença

hepática. A infeção por HCV é transmitida sobretudo por via sanguínea, podendo

Figura 22.Evolução dos marcadores serológicos durante a Hepatite B aguda [Adaptado de (70)].



49

provocar hepatites agudas e crónicas e consequentemente conduzir à cirrose ou carcinoma

hepatocelular. Devido à elevada taxa de infeções assintomáticas, o diagnóstico clínico é

difícil por isso os testes de rastreio são muito importantes. Esta infeção pode ser detetada

medindo a quantidade de RNA do HCV, ALT e dos anticorpos anti-HCV no soro. Os Ac

anti-HCV surgem entre 15 dias a 6 meses após a infeção (71).

A determinação dos anticorpos anti-HCV é feita por imunoensaio do tipo

sandwich, com deteção por quimioluminescência direta. Os resultados apresentados são

os seguintes:

- Reativo

- Não reativo

HIV (Vírus da Imunodeficiência Humana)

O HIV pertence ao grupo dos retrovírus e já foram descritos dois tipos: HIV-1 e

HIV-2. Na sequência da infeção por este vírus, surgem normalmente no soro anticorpos

para as proteínas do HIV, após um período de tempo variável, que servem exatamente de

evidência de infeção (72).

Antes de surgirem no sangue os anticorpos contra o HIV, podem estar presentes

vírus livres que podem ser detetados através do teste do antigénio p24 (proteína do core

do vírus). O tempo necessário para que seja possível detetar o antigénio p24 é,

geralmente, 3-5 semanas. Este antigénio também pode ser detetado na fase mais tardia da

doença provocada pelo HIV (SIDA), em resultado do excesso de virémia (72).

O teste do antigénio HIV é realizado por técnica de sandwich, por ECLIA utiliza

anticorpos monoclonais para determinar o antigénio p24 do HIV-1 e serve para identificar

uma infeção por HIV:

• Em associação com o teste de rastreio do anticorpo anti-HIV em pessoas

com risco conhecido de contrair infeção por HIV

• Em bebés recém-nascidos cujas mães estão infetadas pelo HIV

• No apoio à monitorização durante a terapêutica anti-viral

O diagnóstico de uma infeção por HIV-1 e HIV-2 baseia-se, na prática corrente,

na deteção dos anticorpos séricos por EIA. A deteção combinada do antigénio p24 e dos

anticorpos do HIV-1 e do HIV-2 permite reduzir o período janela compreendido entre a

contaminação e o diagnóstico da infeção, que só será finalizado após obtenção do

resultado de técnicas de confirmação, realizadas na área da Imunologia.



50

Os resultados apresentados são os seguintes:

- Reativo

- Não reativo

3.2.11. Rastreio Serológico da Grávida

Toxoplasmose

A toxoplasmose é uma infeção comum provocada pelo parasita protozoário

Toxoplasma gondii. Esta infeção é adquirida principalmente por ingestão de alimentos ou

de água contaminada por fezes de gatos (e que contenham oócitos maduros de T. gondii),

ou pela ingestão de carne malcozinhada proveniente de animais infetados (73). A infeção

primária materna por Toxoplasma durante a gravidez pode ter como resultado lesões

graves no feto, já que o parasita pode ser transmitido através da placenta. Ainda que a

maioria dos bebés infetados não apresente sintomas clínicos ao nascer, podem surgir

sequelas graves mais tarde, como por exemplo atraso mental e psicomotor, retinite e perda

de audição. Interessa realçar que o risco de ocorrerem manifestações clínicas graves é

mais alto quando a infeção materna ocorre no início da gravidez (73).

Na ausência de sintomas clínicos agudos, o diagnóstico da infeção por

Toxoplasma baseia-se em testes com marcadores serológicos, nomeadamente IgG e IgM.

A IgM é um marcador da fase aguda, mas também podem ser observados resultados

positivos da IgM devido à estimulação ou deteção policlonal de IgM residual ou

persistente durante meses ou anos após a infeção primária. De forma a refinar a data da

infeção são feitos ensaios de avidez de IgG do Toxoplasma, permitindo uma exclusão de

infeções ocorridas nos últimos 4 meses. Este ensaio mede a afinidade da ligação funcional

da IgG em resposta à infeção. Os anticorpos produzidos durante a resposta não primária

ou na fase remota da infeção têm uma avidez de antigénios mais alta do que os anticorpos

produzidos durante a resposta primária (Figura 23). Um resultado de avidez alta após o

quarto mês de gestação não permite excluir uma infeção primária numa fase mais precose

da gestação, numa altura em que pode ter estado presente uma avidez baixa de IgG anti.T.

gondii. A deteção de uma avidez de IgG alta durante o primeiro trimestre de gravidez

pode ser considerada um bom indicador de infeção antiga (73).



51

A determinação destes parâmetros é feita por imunoensaio ECLIA. Os resultados

são apresentados da seguinte forma:

Ac IgM: - Reativo

- Não reativo

Ac IgG: Até 6 kUI/L (não imune)

Rubéola

O vírus da rubéola é o agente etiológico da rubéola, uma doença da infância que

se caracteriza por exantema e que pode ser uma doença grave na mulher grávida, em

especial durante o primeiro trimestre. Este vírus pode ser transmitido pela placenta e

resultar na morte do feto ou causar malformações graves no mesmo, a síndrome da

rubéola congénita (SRC) (75).

A deteção de anticorpos específicos anti-rubéola é utilizada para determinar o

estado imunitário de um indivíduo e para auxiliar no diagóstico da infeção aguda. A

presença de anticorpos IgG anti-vírus da rubéola indica exposição prévia por vacinação

ou devido a infeção anterior pelo vírus; a deteção de anticorpos IgM específicos da

rubéola é utilizada como auxiliar de diagnóstico na infeção aguda pelo vírus. A

seroconversão de anticorpos ou um aumento significativo de anticorpos IgG entre uma

primeira e uma segunda amostra permitem corroborar o diagnóstico de infeção aguda

(75).



Ac IgM: - Reativo

- Não reativo

Ac IgG: < 10 kUI/L (não imune)

Figura 23. Resposta serológica à infeção por Toxoplasma gondii [Adaptado de (74)].



52

Citomegalovírus (CMV)

O citomegalovírus é um vírus da família dos Herpesvírus. Este vírus é transmitido

normalmente por via sexual. A infeção na mulher grávida pode trazer consequências

graves para o feto, nomeadamente atraso mental, cegueira, surdez ou paralisia cerebral

(76).

A deteção dos anticorpos anti-CMV (IgG e IgM) é útil no diagnóstico das

infecções primárias recentes.



Ac IgM: - Reativo

- Não reativo

Ac IgG: < 1,0 kU/L (não imune)

3.2.12. Sistema Endócrino

Eixo Hipotálamo-Hipófise-Suprarrenais

ACTH (Hormona adrenocorticotrópica)

A ACTH é uma hormona produzida na pituitária anterior do cérebro que estimula

a formação e a secreção de glucocorticoides (especialmente o cortisol) pelo córtex

suprarrenal. As concentrações de ACTH apresentam uma variação diurna com níveis

elevados de manhã e níveis baixos à noite, tornando importante conhecer a hora da

colheita. A determinação desta hormona é útil no diagnóstico diferencial da doença de

Cushing (hipersecreção ACTH), de tumores da pituitária e da doença de Addison (77).



- 7h-10h: 7,2-63,3 ng/L

Cortisol

O cortisol (hidrocortisona) é quantitativamente o principal produto

glucocorticoide do córtex suprarrenal, tendo os níveis mais elevados de manhã e os mais

baixos na primeira metade da noite. A sua determinação é útil para o diagnóstico de

doenças provocadas pela sobreprodução de cortisol na síndrome de Cushing, deficiência

da excreção esteroide suprarrenal na doença de Addison e para monitorização da

terapêutica (78).



53


os seguintes:

- 7-10 horas: 5,0-23,0 g/dl

- 15-17 horas: 3,0-16,0 g/dl

- 19-21 horas: <50% do valor às 7-10h

Eixo Hipotálamo-Hipófise-Gónadas

FSH (Hormona Folículo-estimulante)

A FSH pertence à família das gonadotropinas, regulando e estimulando o

crescimento e o funcionamento das gónadas (ovários e testículos) de modo sinérgico. Nas

mulheres, as gonadotropinas atuam de forma a controlar o ciclo menstrual. Nos ovários,

as gonadotropinas estimulam o crescimento e amadurecimento do folículo e

consequentemente a síntese dos estrogénios e progesteronas. A concentração de FSH

apresenta um pico a meio do ciclo, apesar de ser menos marcado do que o que é obtido

com a LH. Devido a alterações na função ovárica e a uma redução da secreção de

estrogénios, verifica-se a ocorrência de concentrações elevadas de FSH durante a

menopausa. Nos homens, a FSH induz o desenvolvimento de espermatogónios (79).

A determinação da FSH serve para reconhecer perturbações funcionais no interior

do sistema hipotálamo-hipófise-gónadas.



- Fase Folicular: 1,4-10,2 UI/L

(3º dia do ciclo) - <10,0

- Fase Ovulatória: 3,4-33,4 UI/L

- Fase Luteínica: 1,1-9,1 UI/L

- Gravidez: <3,0 UI/L

- Pós-menopausa: 15,0-124,3 UI/L

LH (Hormona Luteinizante)

A LH pertence à família das gonadotropinas, tal como a FSH, sendo responsável

por regular e estimular o crescimento e o funcionamento das gónadas de modo sinérgico.

As concentrações mais elevadas de LH ocorrem durante o pico, a meio do ciclo, e

induzem a ovulação e formação do corpo lúteo, cujo principal produto segregado é a

progesterona. Nas células de Leydig dos testículos, a LH estimula a produção de

testosterona (80).



54

A determinação da LH em conjunto com a FSH é utilizada nas doenças congénitas

com anomalias cromossómicas, ovários poliquísticos, clarificação das causas de

amenorreia, síndrome da menopausa e suspeita de insuficiência de células de Leydig.



- Fase Folicular: 1,7-15,0 UI/L

- Fase Ovulatória: 14,0-95,6 UI/L

- Fase Luteínica: 0,6-16,3 UI/L

- Gravidez: <1,5 UI/L

- Menopausa: 14,2-58,5 UI/L

Estradiol

O estradiol é o estrogénio biologicamente mais ativo. Os estrogénios são

responsáveis pelo desenvolvimento das características sexuais secundárias femininas e

controlam os processos importantes da reprodução na mulher. São produzidos pelos

ovários, mas também em pequena quantidade pelos testículos e córtex suprarrenal,

estando ligados a proteínas de transporte (SHBG) (81).

A secreção de estradiol é bifásica durante o ciclo menstrual, sendo a sua

determinação útil para avaliação de problemas de fertilidade no eixo gónado-hipotálamo-

hipofisário, ginecomastia, produção de estrogénios por diferentes tumores e hiperplasia

do córtex suprarrenal.


os seguintes:

- Fase Folicular: 66,3-315,0 ng/L

(3º dia do ciclo - >30,0 ng/L)

- Fase Ovulatória: 28,6-525,0 ng/L

- Fase Luteínica: 7,7-752,0 ng/L

- Pós-menopausa: <138,0 ng/L

- Gravidez:

1º Trimestre: 127,0-4161,0 ng/L

2º Trimestre: 1137,0-25130,0 ng/L

3º Trimestre: >7397,0 ng/L



55

Progesterona

A progesterona é uma hormona esteroide formada nas células do corpo lúteo e,

durante a gravidez, na placenta. A concentração de progesterona está relacionada com o

desenvolvimento e regressão do corpo lúteo, que é quase indetetável na fase folicular do

ciclo menstrual, regista um aumento um dia antes da ovulação e durante a fase luteínica

(82).

A determinação da progesterona é utilizada no diagnóstico de fertilidade para

deteção de ovulação e avaliação da fase luteínica.


os seguintes:

- Fase Folicular: <1,5 g/L

- Fase Ovulatória: 0,8-3,0 g/L

- Fase Luteínica: 3,3-28,0 g/L

- Pós-menopausa: <0,8 g/L

- Gravidez:

1º Trimestre: 11,2-90,0 g/L



hCG (Gonadotropina Coriónica humana)

A hCG é uma hormona glicoproteica produzida pelo tecido trofoblástico e serve

para manter o corpo lúteo durante as primeiras semanas de gravidez. Além disso também

influencia a produção de esteroides. Naturalmente, esta hormona aparece apenas no

sangue e urina de mulheres grávidas. O pico é atingido perto das 9 semanas de gestação.

Nas mulheres não grávidas a hCG pode ser produzida por tumores (83).

O soro das grávidas contém principalmente hCG intacta, mas pequenas frações de

subunidades e circulam sob a forma não ligada. A concentração de hCG livre no

soro é um marcador de aneuploidia fetal e em associação com outros parâmetros como a

PAPP-A é possível avaliar o risco de trissomia 21 (Síndrome de Down).


quimioluminescência direta. Os valores de referência são os seguintes (UI/L):

- Não grávida: até 5

Gravidez (idade gestacional aproximada):

3ª semana: 6-71



56

4ª semana: 9-750

5ª semana: 217-7138

6ª semana: 158-31795

7ª semana: 3697-163563

8ª semana: 158-31795

9ª semana: 63803-151410

10ª semana: 46509-186977

11ª semana: 15000-200000

12ª semana: 27832-210612

13ª-14ª semanas: 13950-62530

15ª semana: 12039-70971

16ª semana: 9040-56451

17ª semana: 8175-55858

18ª semana: 8099-58176

Eixo Hipotálamo-Hipófise-Tiroide

TSH (Hormona Estimuladora da Tiroide)

A TSH é uma glicoproteína formada na hipófise anterior e apresenta um ritmo de

secreção circadiano. A sua libertação é o principal mecanismo de regulação da ação

biológica das hormonas da tiroide. A TSH tem uma ação estimuladora em todas as fases

de formação e secreção das hormonas da tiroide (84).

A determinação da TSH é útil como teste inicial no diagnóstico da tiroide, já que

é muito sensível e específica.



- 19 aos 70 anos: 0,4-4,2 mUI/L

- >70 anos: 0,4-6,0 mUI/L

- Gravidez:

1º Trimestre: 0,100-2,5 mUI/L



T3 (Triiodotironina)

A T3 é a principal hormona responsável pelo desenvolvimento dos efeitos das

hormonas da tiroide nos órgãos-alvo. Esta hormona é essencialmente formada no fígado,



57

por conversão da T4, e por isso a sua concentração no soro reflete mais o estado funcional

do tecido periférico do que o desempenho secretor da tiroide. Mais de 99% da T3 está

ligada a proteínas de transporte, sendo a T3 livre (T3L) a forma ativa não ligada. A sua

determinação tem a vantagem de não depender de alterações das concentrações nem das

propriedades de fixação das proteínas de ligação (TBG) (85).

Estas determinações são úteis no diagnóstico diferencial das alterações da tiroide

e são necessárias para distinguir diferentes formas de hipertiroidismo e identificar doentes

com tirotoxicose da T3.


os seguintes:

- T3:

- 19 aos 50 anos: 70-204 ng/L

- >50 anos: 40-181 ng/L

- Gravidez:

1ºTrimestre: 81-190 ng/L



- T3L: 2,1-4,4 ng/L

T4 (Hormona Tiroxina)

A T4 é o principal produto segregado pela tiroide e tem a função de influenciar

anabolicamente o metabolismo. Mais de 99% da T4 está ligada a proteínas de transporte,

sendo a T4 livre (T4L) a forma ativa não ligada e tal como no caso da T3L, a sua

determinação tem a vantagem de não depender de alterações das concentrações nem das

propriedades de fixação das proteínas de ligação (TBG) (86).

Estas determinações são úteis na deteção de hipertiroidismo, hipotiroidismo

primário e secundário e monitorização da terapêutica de supressão da TSH.


os seguintes:

- T4: Criança:

1ª semana: 9,9-23,2 g/dl

7 dias a 11 meses: 5,9-13,7 g/dl

1-8 anos: 6,2-10,3 g/dl

9-11 anos:5,5-9,3 g/dl



58

12-13 anos: 5,0-8,3 g/dl

14-18 anos (M): 4,7-8,6 g/dl

14-18 anos (F): 5,5-13,0 g/dl

Homem: 4,5-10,9 g/dl

Mulher: 5,5-11,0 g/dl

Grávida: 6,4-15,0 g/dl

- T4L: 0,7-1,8 ng/dl

Anticorpos Anti-tiroideus

Os anticorpos anti-tiroideus (Anti-tiroglobulina e Anti-peroxidase) são auto-

anticorpos dirigidos contra enzimas importantes da tiroide. Concentrações elevadas

destes anticorpos indicam tiroidite com infiltração linfocítica crónica (Tiroidite de

Hashimoto) ou doença de Graves (87).

Estas determinações são úteis para monitorização da evolução da tiroidite bem

como para o seu diagnóstico diferencial.


os seguintes:

- Anti-tiroglobulina: até 115 kUI/L

- Anti-peroxidase: até 34 kUI/L

3.3. Urianálise

A urianálise, também denominada de exame sumário da urina ou urina tipo II é a

análise da urina que tem como objetivo despistar doenças metabólicas e sistémicas,

diagnosticar patologias do aparelho urinário e diagnosticar, avaliar a atividade e

monitorizar a evolução clínica e a resposta ao tratamento, sendo uma análise muito

completa e com valor semiológico significativo e, por isso, bastante requisitada. (88)

As condições da colheita da urina são extremamente importantes para garantir

resultados válidos, de modo que deve ser colhida a primeira urina da manhã para tubo

coletor ou em alternativa, uma urina com uma retenção de pelo menos 4h. Caso o utente

tenha sido submetido a administração de contraste radiológico, a colheita só deve ser feita

3 a 4 dias depois.

Este exame é constituído pela avaliação física, pela análise bioquímica da urina e

ainda pela análise microscópica do sedimento urinário, através do aparelho Cobas 6500

urine analyzer series (Figura 24).



59

O módulo u 601 do cobas 6500 utiliza tiras reativas com resistência ao ácido

ascórbico para realizar a análise bioquímica da urina. Cada tira apresenta 10 zonas

reativas independentes, impregnadas de substâncias químicas e que vão reagir com os

compostos presentes na urina, originando mudanças de cor. O equipamento é capaz de

ler a cor e a intensidade da luz refletida por cada zona reativa, em comprimentos de onda

definidos (465, 528, 560 e 615 nm), por meio da fotometria de refletância, de modo a

transformar essas leituras em resultados específicos.

O aparelho também consegue realizar o exame físico, que inclui a cor e a turvação

da amostra. A cor é determinada por fotometria e a turvação é definida por turbidimetria,

pela medição da transmissão e dispersão da luz que passa pela amostra.

Os parâmetros a determinar são os seguintes:

pH

O teste do ph baseia-se num princípio de duplo indicador e produz um leque de

cores, do laranja ao amarelo e do verde a turquesa, permite a diferenciação do nível do

pH. A contaminação bacteriológica pode conduzir a falsos resultados, no entanto as

proteínas não afetam os indicadores. A tira é composta por vermelho de metilo e azul de

bromotimol (90).


- 5,0-8,0

Esterase Leucocitária

Neste teste, as esterases contidas nos granulócitos hidrolisam um carboxilato

heterocíclico e os fragmentos reagem com sal diazónico para formar um pigmento violeta.

Amostras de indivíduos saudáveis não contêm leucócitos, portanto resultados positivos

são clinicamente relevantes. O limite de sensibilidade são 15 leucócitos/l na urina.

Amostras extremamente coloridas (p.e. Nitrofurantoina) podem afetar a cor na área de

Figura 24. Aparelho Cobas 6500 urine analyzer series [Adaptado de (89)].



60

teste, bem como glicose em grandes concentrações ou determinados antibióticos podem

diminuir a sua reatividade. Falsos positivos podem ser causados por amostras

contaminadas com corrimento vaginal. A tira é composta por Derivado heterocíclico

carboxilado e sal diazónico (90).

Tabela 2. Resultados das tiras-teste para a Esterase Leucocitária [Adaptado de (90)]

Tiras Reativas Leucócitos/l

+ 15 (limite de deteção)

++ 70

+++ 125

++++ 500

Nitritos

O teste dos nitritos é baseado no princípio da reação de Griess. Qualquer grau de

coloração laranja-rosa deve ser interpretado como um teste positivo relativamente aos

nitritos, sugerindo 105 organismos em 1 ml de urina, sendo o limite de deteção 0,06

mg/dl. Resultados negativos não constituem regra para uma bacteriúria significativa.

Devem ser negativados sempre que houver evidência de contaminação por secreções

vaginais ou da região balano-prepucial, e, mesmo que a bacteriúria seja

significativamente “positiva” (≥ 100/μL), em todos os pacientes com esterase negativa e

leucocitúria < 20/μL. As tiras são compostas por 4-ácido arsanílico e N-(naftil)-

etilenodiamina diidroclorido (90).

Proteínas

Este teste baseia-se no “erro proteico” de um indicador de pH. É particularmente

sensível à albumina (três vezes mais sensível) e menos sensível a outras proteínas

urinárias. Normalmente, nenhuma proteína é detetável na urina, apesar de uma

quantidade mínima ser excretada por rins saudáveis. A proteinúria patológica

normalmente produz valores acima dos 30 mg/dl e é persistente. Falsos positivos podem

ser encontrados em urinas fortemente alcalinas (pH>9) de grande densidade. As tiras

contêm azul de tetra-bromofenol (90).



61

Tabela 3. Resultados das tiras-teste para as Proteínas [Adaptado de (90)]

Tiras Reativas Proteínas (mg/dl)

Vestígios 10 (limite de deteção)

+ 30 mg/dl / 0,300 g/l

++ 100

+++ 300

++++ 1000

cutoff para a microalbuminúria

Glicose

O teste baseia-se no método específico da glicose oxidase/peroxidase, sendo que

a área reagente não reage com outros açúcares. Normalmente, não se deteta qualquer

glicose na urina, apesar de uma quantidade mínima ser excretada por rins saudáveis. O

limite de deteção são 30 mg/dl (0,30 g/l) e o limiar de absorção renal varia entre 160-200

mg/dl. Glicosúrias normoglicémicas (diabetes renal) surgem na gravidez, com lesão dos

túbulos proximais renais (Síndrome de Fanconi). Glicosúrias hiperglicémicas são comuns

na diabetes mellitus, no Síndrome de Cushing, no hipertiroidismo, no

hiperaldosteronismo primário, hipertensão intracraneana e feocromocitoma. As tiras

contêm glicose oxidase, peroxidase e tolidina hidroclorido (Adaptado de 90).

Corpos cetónicos

O ácido acetoacético e as cetonas reagem com o nitroprussiato de sódio em

soluções alcalinas, originando um complexo violeta (Teste de Legal). Normalmente, a

urina está livre de cetonas, no entanto, concentrações detetáveis podem ser originadas por

stress fisiológico, nomeadamente jejum, gravidez, desporto excessivo, eclampsia,

vómitos e diarreia bem como por uma situação de cetoacidose diabética. O limite de

deteção são 5 mg/dl. As tiras contêm nitroprussiato de sódio (Adaptado de 90).

Urobilinogénio

O teste baseia-se na mistura de urobilinogénio com um sal estável diazóico e é

específico para urobilinogénio e estercobilinogénio. Baixa concentração de

urobilinogénio pode ser resultado de síndromes hiperbilirrubínicas. Níveis elevados

podem indicar icterícia hemolítica, sobrecarga hepática, destruição excessiva de

eritrócitos, produção de urobilinogénio aumentada, função hepática comprometida,



62

infeção hepática, envenenamento ou cirrose hepática. O limite de deteção é 1,0 mg/dl

(=1,0 unidade Ehrlich). A tira contém sal diazónico (90).

Pigmentos biliares

O teste baseia-se na mistura de bilirrubina com um sal estável num forte meio

ácido. Normalmente, a bilirrubina não é detetada na urina, portanto pequenas quantidades

conduzindo a uma cor de pêssego são suficientes para indicar um estádio inicial de

doenças do fígado que devem ser posteriormente investigadas. O limite de deteção são

0,2 mg/dl (bilirrubina direta). As tiras contêm sal diazónico (Adaptado de 90).

Eritrócitos

O teste baseia-se na atividade de peroxidação da hemoglobina e mioglobina que

catalisa a oxidação do indicador na presença do peróxido orgânico na área de teste. O

teste é sensível a hemoglobina livre e pode detetar concentrações correspondentes a 5

eritrócitos/l, equivalente a, aproximadamente 0,015 mg de hemoglobina por dl de urina.

O teste apresenta a mesma sensibilidade relativamente à mioglobina. Pontos verdes

(eritrócitos intactos) ou a verde (hemoglobina livre, mioglobina) requerem avaliação

clínica pois o seu significado pode variar de caso para caso. As tiras são compostas de

isopropilbenzol hidroperoxido e tetrametilbenzina diidroclorido (Adaptado de 90).

Tabela 4. Resultados das tiras-teste para os Eritrócitos [Adaptado de (90)]

Densidade

Este teste baseia-se na mudança de cor do reagente de azul-verde para verde-

amarelo ou castanho, dependendo da concentração de constituintes iónicos na urina. A

escala de cores com cores de comparação de 1,000 e 1,030 é otimizada para um pH médio

da urina de 6,00. Urinas fortemente alcalinas (pH>8) ou ácido (pH<6) conduzem a

ligeiras flutuações dos resultados. As tiras são compostas por dibromo-3-hidróxido-4-

isopropil-toluol-sulfoftalaine (89).

A densidade reflete o estado de hidratação e capacidade de concentração.

Tiras Reativas Eritrócitos/l

Vestígios (150 gHb/l)

+ 80

++ 200

+++ 560



63


- 1,003-1,030

Cor

A cor da urina faz parte do seu exame físico e os resultados podem variar da

seguinte forma:

- Amarelo pálido: urina diluída (diabetes, consumo excessivo)

- Amarelo: urina normal

- Âmbar: urina concentrada, pigmentos de bilirrubina

- Castanho: bilirrubina, hemoglobina e metahemoglobina

- Verde: bilirrubina oxidada, azul de metileno, fármacos

- Vermelho/rosa: porfirinas, mioglobina, hemoglobina, fármacos

- Laranja: fármacos

- Preto: melanina e ácido homogentísico

Turvação

A turvação ou aspeto faz parte do exame físico e refere-se à transparência da

amostra e os resultados variam da seguinte forma:

- Transparente/límpida

- Semi-turva

- Turva/opaca

- Leitosa

Quando o aparelho não consegue fazer a análise

bioquímica da urina, por não ter amostra suficiente, por

exemplo, a análise é feita manualmente, recorrendo a tiras

Siemens Multistix 10 SG (Figura 25), tiras reativas para

urianálise.

Sempre que surgem variações na avaliação bioquímica

é feito automaticamente o sedimento da urina.

O módulo u 701 do cobas 6500 utiliza pequenas cuvetes onde introduz o

sedimento urinário e realiza a contagem dos elementos figurados, através do método de

citometria de fluxo combinado com a impedância, gravando imagens que podem ser

rapidamente analisadas pelo utilizador.

Os elementos figurados contados pelo aparelho são os descritos de seguida.

Figura 25. Tiras Siemens

Multistix 10 SG [Adaptado de (91)].



64

Eritrócitos

A hematúria é clinicamente significativa quando os eritrócitos são superiores a

20-25/l com hemoglobinúria positiva (Figura 26). A origem pode ser glomerular

(associada a acantócitos com proteinúria e cilindros), renal (associada a proteinúria sem

acantócitos nem cilindros) ou urológica/pós-renal (sem acantócitos nem cilindros) (92).

Leucócitos

A piúria refere-se à presença de anormal número de leucócitos na urina (Figura

27), que pode surgir em caso de infeção (92).

Células

Células epiteliais do túbulo renal são maiores que os leucócitos e podem surgir

em grande número na Síndrome Nefrótica. Células epiteliais transitórias são um pouco

maiores que as do túbulo renal e as células epiteliais escamosas (Figura 28) são muito

grandes e podem significar contaminação da amostra com flora da pele (92).

Figura 26. Eritrócitos no sedimento urinário. À direita, acantócitos (100x) [Adaptado de (92)].

Figura 27. Leucócitos segmentados na urina (1000x) [Adaptado de (92)].



65

Cilindros

Os cilindros urinários são formados no túbulo contornado distal e no túbulo

coletor. Cilindros hialinos são compostos principalmente por mucoproteína. Também

podem surgir cilindros de eritrócitos, que indica lesão glomerular ou renal ou de

leucócitos, que indica presença de pielonefrite aguda ou glomerulonefrite, e inflamação

do rim em ambos os casos. Cilindros granulares podem surgir devido à acumulação de

células (Figura 29) (92).

Cristais

Alguns cristais podem surgir em utentes saudáveis, tais como os de oxalato de

cálcio, de trifosfato ou de fosfato amorfo. Outros são sempre patológicos, tais como os

de leucina, cistina e tirosina (Figura 30) (92).

Figura 28. Células escamosas (400x) [Adaptado de (92)].

Figura 29. Cilindros urinários: a) hialino b) de eritrócitos c) de leucócitos d) granular (400x) [Adaptado de (92)].

a)

b)

c)

d)



66

Bactérias e elementos leveduriformes

As bactérias e os elementos leveduriformes são comuns nas amostras de urina

devido à contaminação da flora da vagina ou do meato uretral ou numa real infeção, mas

não devem ser valorizados nesta análise (92).

Espermatozoides

Os espermatozoides são também contabilizados pelo aparelho, mas não

apresentam valor semiológico (92).

3.3.1. Diagnóstico Imunológico da Gravidez (DIG)

O DIG é um teste qualitativo que permite a deteção da -hCG na urina, de modo

a diagnosticar uma possível gravidez. Esta hormona é uma glicoproteína produzida

durante a formação da placenta, após a fertilização, e aumenta no soro e na urina ao longo

da gestação. É a única hormona exclusiva da gravidez, tornando-a um ótimo marcador no

diagnóstico precoce da gravidez (93).

O kit utilizado, o hCG Pregnancy Test, da Dedicio Medical Test, é qualitativo,

uma vez que apenas deteta a presença da hormona, e recorre ao método de

imunocromatografia numa amostra de urina. Nesta técnica, a amostra migra por

capilaridade sobre uma membrana onde reage com anticorpos, sendo que um resultado

positivo é indicado pela presença de duas linhas coloridas. A primeira linha contém um

anticorpo monoclonal hCG que deteta a presença da hormona hCG. A segunda linha serve

de controlo e é composta por anticorpos policlonais de cabra e partículas de ouro

Figura 30. Cristais urinários: a) oxalato b) trifosfato c) cistina d) leucina e) tirosina. Ampliação de 400x [Adaptado de (92)].

a) b) c)

d) e)



67

coloidais, de forma a garantir que a quantidade de amostra seja suficiente e que haja

absorção da mesma na membrana (Figura 31).

Figura 31. Resultados possíveis obtidos com o kit hCG Pregnancy

Test, da Dedicio Medical Test [Adaptado de (94)].



68

3.4. Eletroforese das Proteínas

3.4.1. Eletroforese das proteínas séricas

A eletroforese das proteínas séricas tem como objetivo separar as proteínas do

soro em frações, com o interesse de diagnosticar e monitorizar patologias que envolvem

alterações do perfil das proteínas, nomeadamente mieloma múltiplo, síndrome nefrótico

e cirrose (95).

As proteínas são formadas por uma cadeia de aminoácidos unidos por ligações

peptídicas. A combinação de diferentes aminoácidos, bem como a quantidade de

aminoácidos presentes na proteína, resulta em peso e carga elétrica distinta.

O CAPILLARYS 2 FLEX piercing® da Sebia (Figura 32) é um aparelho que

realiza eletroforese capilar, separando as proteínas pelo seu tamanho e outras

propriedades físico-químicas, através do tubo capilar, originando diferentes bandas de um

eletroforetograma (albumina e globulinas alfa, beta e gama). Esta técnica apresenta maior

resolução do que a técnica em gel de agarose, permitindo a separação de bandas pouco

visíveis no método convencional, tais como os picos da β1 (transferrina e hemopexina) e

β2 (complemento C3), resultando num padrão de 6 bandas. É também mais sensível à

deteção de componentes monoclonais em pequenas concentrações, nomeadamente IgA

ou cadeias leves, que podem não ser detetadas pela eletroforese em gel de agarose, devido

à co-migração com a transferrina e o C3. As frações são quantificadas criando um gráfico,

conforme na Figura 32.

Os resultados são sempre expressos em percentagem e concentração das diversas

frações e em forma gráfica.

Figura 32. Eletroforese das proteínas séricas. À esquerda, aparelho automático CAPILLARYS 2 FLEX piercing® da Sebia, à direita, gráfico de corrida eletroforética normal [Adaptado de (96,97)].



69

A albumina é a proteína mais abundante no plasma, correspondendo a cerca de

60% da concentração total de proteínas e é sintetizada no fígado. A hipoalbuminemia é

muito inespecífica e pode verificar-se em muitas doenças, em situações de síntese

diminuída (cirrose hepática e hepatite viral), aumento do catabolismo e aumentos das

perdas (pelos rins e intestinos). Os menores níveis de albumina sérica verificam-se na

síndrome nefrótica ou em enteropatias perdedoras de proteínas (Figura 33) (97).

As alfa-1 globulinas são um grupo constituído pela alfa-1-antitripsina,

protrombina, transcortina, globulina ligadora de tiroxina (TBG) e alfa-fetoproteína.

Normalmente, o aumento desta fração deve-se a processos inflamatórios, infeciosos e

imunes, de forma inespecífica (97).

A banda das alfa-2 globulinas é constituída pela haptoglobina, alfa-2-

macroglobulina, ceruloplasmina, eritropoietina e colinesterase. Tal como as alfa-1

globulinas, também se comportam como proteínas de fase aguda (Figura 34) (97).

A alfa-2-macroglobulina é uma das maiores proteínas globulínicas presentes no

plasma e a sua concentração aumenta cerca de 10 vezes ou mais na Síndrome Nefrótica,

já que são perdidas as outras proteínas de peso molecular mais baixo. Nesta situação, o

nível sérico pode ser igual ou superior ao da albumina, conforme a Figura 34 (97).

Figura 33. Perfil eletroforético de situações clínicas em que há redução da fração albumina: Cirrose hepática, à esquerda, e Enteropatia Perdedora, à direita. (A: albumina; α1: alfa-1-globulina; α2: alfa-2-

globulina; β: betaglobulina e γ: gamaglobulina) [Adaptado de (97)].



70

A fração das betaglobulinas é formada pelas beta-lipoptoteínas, pela transferrina

e pelo componente C3 do complemento. A transferrina encontra-se aumentada na anemia

ferropénica e na gravidez (97).

A banda das gamaglobulinas corresponde às imunoglobulinas. Todas as classes

de Igs são formadas por duas cadeias pesadas (G, A, M, D e E) e duas cadeias leves

(kappa ou lambda), conforme a Figura 35. O soro é a amostra de eleição para esta

determinação exatamente para evitar o aparecimento da banda do fibrinogénio nesta

região onde geralmente migram as imunoglobulinas (97).

A fração gama apresenta três principais padrões eletroforéticos (97):

- Pico policlonal: representa a resposta imunológica simultânea de diversos clones

plasmocitários a determinado estímulo antigénico, seja inflamatório, imune ou infecioso,

Este padrão aparece como aumento difuso da fração gama, representado pela presença de

uma curva de base larga, demonstrando a produção de todas as classes de

imunoglobulinas (Figura 36a).

- Pico monoclonal: consiste no aumento homogéneo da fração gama, que

representa a produção por um único clone plasmocitário de um tipo específico de

imunoglobulina, levando à produção de uma curva de base estreita conhecida como pico

Figura 34. Perfil eletroforético das proteínas de fase aguda (à esquerda) e na Síndrome Nefrótica (à direita) [Adaptado de (97)].

Figura 35. Estrutura esquemática de Ig [Adaptado de (97)].



71

monoclonal (Figura 36b). No mieloma múltiplo, a eletroforese de proteínas séricas faz

parte dos critérios de diagnóstico.

- Hipogamaglobulinemia/agamaglobulinemia - consiste na redução do nível das

gamaglobulinas, geralmente sem alteração significativa nas outras frações. É sugestiva

da variante de cadeia leve do mieloma múltiplo (cerca de 20% dos casos de mieloma, no

qual o pico monoclonal se encontra na eletroforese urinária e não na sérica, devido ao

componente de cadeia leve exclusivo) (Figura 36c).

O HYDRASYS 2® da Sebia (Figura 37) é um aparelho que realiza a eletroforese

de proteínas e a imunofixação, recorrendo às forças eletroforéticas e eletroendosmóticas

presentes no sistema. A amostra de soro é aplicada no gel de agarose e, em seguida, sofre

a ação de um potencial elétrico gerado por um polo positivo (ânodo) e outro negativo

(cátodo). Esse potencial provoca a migração das proteínas em direção ao ânodo e, de

acordo com o peso molecular e carga elétrica, elas percorrem distâncias distintas,

originando diferentes bandas de um eletroforetograma (albumina e globulinas alfa, beta

e gama). Em seguida, é realizada a imunoprecipitação e a fixação com anti-soros. Após a

imunofixação, as frações proteicas são reveladas corando as bandas, que se apresentam

conforme a Figura 38.

a) b)

c)

Figura 36. Perfil eletroforético de a) pico policlonal b) pico monoclonal c) hipoglobulinemia/agamaglobulinemia [Adaptado de (97)].



72

3.4.2. Eletroforese das proteínas urinárias

A eletroforese das proteínas urinárias tem como objetivo fazer uma avaliação

qualitativa da proteinúria, sendo bastante importante na suspeita de proteinúria de

sobrecarga. Identifica picos monoclonais na fracção gama, relacionados com a presença

de cadeias leves de imunoglobulinas (Proteínas de Bence-Jones - PBJ) e característicos

das discrasias plasmocitárias. A PBJ é formada por dímeros de cadeias leves (kappa e

lambda) de imunoglobulinas monoclonais encontradas na urina. A presença ou a ausência

da proteína de Bence Jones na urina depende da taxa e da quantidade de síntese de cadeias

leves e do estado renal do paciente, tendo em conta que a proteinúria de Bence Jones tem

um efeito nefrotóxico. Pacientes com mieloma que secretam só proteína de Bence Jones

têm prognóstico pior, sendo que os com Mieloma de cadeias lambda têm prognóstico pior

do que os de cadeias kappa (99).

A associação da eletroforese à imunofixação, obtida com o kit Hydragel Bence

Jones pelo aparelho HYDRASYS 2® da Sebia (a amostra pode ser urina ou soro), permite

identificar o tipo de cadeia em causa (k ou λ), aumentando a sensibilidade para deteção

da paraproteína (Figura 38). Os valores de referência são os seguintes:

Soro (Imunoturbidimetria):

- Cadeia kappa: 170-370 mg/dl

- Cadeia lambda: 90-210 mg/dl

- Razão K/Lambda: 1,3-2,7

Urina (Nefelometria):

- Cadeia kappa: <9,0 mg/L

- Cadeia lambda: <5,0 mg/L

Figura 37. Aparelho HYDRASYS 2® da Sebia [Adaptado de (98)].

Figura 38. Eletroforese em gel obtida com o kit Hydragel Bence Jones pelo aparelho HYDRASYS 2® da Sebia [Adaptado de (100)].



73

3.5. Lipidograma

O HYDRASYS 2® da Sebia (Figura 37) determina ainda o lipidograma. Esta é

uma análise muito útil no diagnóstico de dislipidémias e é muito importante já que estas

estão associadas a aterosclerose e a processos trombóticos. Trata-se da separação e

quantificação das maiores lipoproteínas encontradas no soro (com colheita em jejum de

10-12h), nomeadamente as quilomícrons, as beta-lipoproteínas (LDL), pré-beta-

lipoproteínas (VLDL) e as alfa-lipoproteínas (HDL) (101).

A análise é feita por eletroforese em gel, conforme a Figura 39, e em todos os

ensaios deve ser incluída uma amostra de referência com valores normais de colesterol

e triglicéridos. Em seguida, a leitura por densitometria permite definir concentrações

relativas de cada fração obtida.


- Beta-lipoproteínas (LDL): 42,3 a 69,5%

- Pré-beta-Lipoproteínas (VLDL): 2,0 a 31,2%

- Alfa-Lipoproteínas (HDL) 15,1 a 39,9%

Figura 39. Eletroforese em gel obtida com o kit Hydragel 7 LIPO +Lp (a) pelo

aparelho HYDRASYS 2® da Sebia

[Adaptado de (102)].


Stefanie Baptista Radioimunoensaio

74

4. RADIOIMUNOENSAIO (RIA)

O Radioimunoensaio é uma área do LJC que se dedica ao estudo bioquímico e

avaliação funcional dos eixos endocrinológicos e ainda ao estudo laboratorial da doença

alérgica e das atopias. É uma área muito específica do laboratório e que segue uma série

de regras de segurança devido ao facto de trabalhar com isótopo radioativo, o 125I. Trata-

se de um método muito específico, por recorrer a uma reação imunológica, e ao mesmo

tempo muito sensível, devido à utilização de radioisótopos. O Contador de Raios Gama

Wallac Wizard (Figura 40) é um equipamento que utiliza como radioisótopo o 125I, sendo

constituído por um cristal de iodeto de sódio, um condutor de luz, um escudo de chumbo

e um tubo fotomultiplicador. No detetor de cintilação com cristais de iodeto de sódio, a

absorção da radiação produz excitação e ionização, convertendo essa energia em luz

visível ou ultravioleta que vai atingir o fotomultiplicador. Este transforma as cintilações

em impulsos elétricos que são medidos (103, 104).

A intensidade da radiação gama emitida é direta ou inversamente proporcional à

concentração do analito presente na amostra, dependendo do tipo de técnica. Para o

cálculo da concentração, recorre-se a uma curva de calibração.

Radioimunoensaio competitivo

No radioimunoensaio competitivo, o antigénio é marcado com um isótopo

radioativo que compete com o antigénio presente na amostra pela ligação ao anticorpo

anti-analito que reveste o tubo do ensaio. As concentrações de anticorpo específico e do

antigénio marcado são fixas e quando é atingido o equilíbrio de reação, são removidos os

conjugados não reativos. Neste caso, a quantidade de antigénio marcado com o isótopo

radioativo ligado ao anticorpo é inversamente proporcional à concentração de antigénio

presente na amostra.

Figura 40. Contador de Raios Gama Wallac Wizard [Adaptado de (104)].



75

Alguns dos parâmetros realizados por este equipamento são brevemente descritos

abaixo na tabela 5.

Tabela 5. Descrição de análises executadas por radioimunoensaio competitivo [Adaptado de (105, 106)].

Analito Amostra Descrição Valores de Referência

11-Desoxicortisol Soro

Esteroide intermediário

na biossíntese de

glucocorticoides.

Variação circadiária.

Normal: 7,2 nm/L (2,55

ng/ml)

17-OH

Progesterona (17-

OHP)

Soro ou no

líquido

amniótico

Hormona esteroide C-

21 produzida pela 17-

hidroxipregnenolona

na adrenal e também

nos ovários, testículos e

placenta

Homens: 0,59 – 3,44 ng/ml

Mulheres:

- Fase Folicular: 0,11 – 1,08

- Fase Luteínica: 0,95 –

5,00

Gravidez:

- Primeiro Trimestre: 2,50 –

9,78

- Segundo Trimestre: 3,40 –

8,50

- Terceiro Trimestre: 4,53 –

18,86

Recém-nascidos: 2,67

Aldosterona Soro e urina

24h

Hormona sintetizada

nas glândulas

suprarrenais e que tem

como alvo os rins,

sendo responsável por

regular o equilíbrio

eletrolítico. Esta

hormona tem um papel

importante na

manutenção da pressão

arterial e do ph

Soro:

- Manhã: 49,3-175 pg/ml

- Em estado vertical há pelo

menos 2 horas: 34,7-275

pg/ml

Urina de 24h: 2,84-33,99

g/dia

AMP cíclico Urina ou

plasma

Segundo mensageiro

no sinal de transdução

de várias hormonas,

nomeadamente

adrenalina, ACTH, LH,

FSH, glicagina e

calcitonina

Urina: 2,82 1,71 nmol/ml

4,25 – 1,42 mol/g

creatinina

Plasma: 16,4 3,32

pmol/ml

Estrona-E1 Soro ou plasma

Hormona estrogénica

secretada pelo ovário e

é produzida a partir da

androstenediona.

Homens: 10-60 pg/ml

Mulheres:

Fase Folicular: 50-100

Fase Luteínica: 100-300

Menopausa: ND-60



76

Ensaio imunoradiométrico (IRMA)

No ensaio imunoradiométrico (IRMA), utiliza-se um anticorpo marcado com o

isótopo radioativo. Nesta reação são usados dois anticorpos específicos para o antigénio

a dosear. O anticorpo encontra-se associado a uma fase sólida (em esferas ou a revestir

os tubos de reação), formando um complexo com o antigénio. O anticorpo marcado é

adicionado posteriormente para reagir com o complexo Ag-Ac. Quando é atingido o

equilíbrio da reação, são removidos os excessos que não reagiram. Neste caso, as

concentrações do anticorpo e do anticorpo marcado são constantes, de modo que a

concentração de antigénio da amostra é diretamente proporcional à concentração de

anticorpo marcado.

Alguns dos parâmetros realizados por este equipamento são brevemente descritos

abaixo, na tabela 6.

Tabela 6. Descrição de análises executadas por ensaio IRMA [Adaptado de (105, 106)]

Analito Amostra Descrição Valores de Referência

Auto anticorpos

contra os recetores

da acetilcolina

(ARAb)

Soro ou plasma

Responsáveis pela

fraqueza muscular e

fadiga da miastenia

gravis

<0,25 nmol/L– negativo

0,25–0,4–indeterminado

>0,4 – positivo

Arginina

Vasopressina -

ADH

Plasma

Produzida pelo eixo

hipotálamo e libertada

pela hipófise.

responsável por regular a quantidade

de água no sangue

Normal: 6,7 pg/ml

Renina ativa Plasma

Ativa o sistema

renina-angiotensina

através da clivagem de

angiotensinogénio.

regulação da pressão

arterial e o controlo da

filtração glomerular

Posição ereta:

1,3-13,8 pg/ml

Decúbito dorsal:

1,0-8,2 pg/ml


Stefanie Baptista Quimioluminescência

77

5. QUIMIOLUMINESCÊNCIA

No laboratório JCS, a área da RIA é responsável por realizar os ensaios de

quimioluminescência, um método em que um tipo de reação química é processado de

modo a gerar energia luminosa. Durante essa reação, os reagentes passam para estados

eletronicamente mais excitados e, consequentemente, ao passarem para um estado menos

excitado, libertam energia sob a forma de luz. O IMMULITE® 2000 (Figura 41) é um

equipamento de imunoensaio que utiliza este método para analisar vários parâmetros.

Para cada um deles, recorre a uma fase sólida, composta por uma esfera de poliestireno

revestida com uma camada de anticorpos específicos (mono ou policlonais), e uma fase

líquida. A esfera é dispensada num tubo de reação que funciona como reservatório da

reação imunológica e onde ocorre a lavagem, incubação e emissão do sinal de leitura.

Neste método, a esfera é revestida com o anticorpo e é incubada com a amostra que

contém o antigénio a analisar. Após realizar a lavagem, adiciona-se o anticorpo específico

marcado com fosfatase alcalina e forma-se assim um complexo Ac-Ag-Ac-enzima, em

fase sólida. Depois da incubação, a esfera é lavada por rotação sobre o seu eixo vertical,

provocando a passagem do líquido para as paredes do tubo. Este líquido é recolhido numa

câmara, havendo assim a separação entre a fase líquida e a fase sólida (ligada). E seguida,

adiciona-se um substrato quimioluminescente que é transformado em produto, na

presença da fosfatase alcalina, e com concentração diretamente proporcional à

concentração do antigénio presente na amostra. Caso se pretenda fazer a pesquisa de

anticorpos, associa-se o antigénio à fase sólida (107).

Figura 41. Aparelho IMMULITE® 2000 da Siemens [Adaptado de (107)].


Stefanie Baptista Quimioluminescência

78

Alguns parâmetros realizados por este equipamento são os seguintes:

- Delta 4-Androstenediona

- DPD - Desoxipiridinolina

- E3 Livre - Estriol Livre ou não conjugado

- EPO - Eritropoietina

- Estriol (E3) livre ou não conjugado

- Fosfatase Ácida Prostática - PAP

- Gastrina

- Globulina Fixadora da Tiroxina – TBG

- IGF-1 - Somatomedina C

- PAP – Fracção prostática da Fosfatase Ácida


Stefanie Baptista Química Analítica

79

6. QUÍMICA ANALÍTICA

A Química Analítica é uma área do LJC que se dedica ao estudo laboratorial de

metabolitos, hormonas, vitaminas, elementos traço, neurotransmissores, metais pesados

e outros bioconstituintes através do recurso a sistemas analíticos próprios. Realiza

também a confirmação da presença de drogas ilícitas em diversos produtos biológicos,

bem como a monitorização de fármacos e identificação dos seus metabolitos. Executa

ainda a análise físico-química e espectroscópica do cálculo urinário, vesículo-biliar e

prostático (108).

De seguida são descritos os métodos utilizados para realizar estas análises.

6.1. Cromatografia Líquida de Alta Definição (HPLC)

A Cromatografia Líquida de Alta Definição (High Performance Liquid

Chromatography) é o processo através do qual uma mistura de compostos é separada nos

seus constituintes, utilizando uma fase líquida móvel sob pressão, utilizando colunas com

enchimentos de partículas de dimensões reduzidas e com sistemas de deteção contínua

do eluído. A separação baseia-se não só na relação entre a solubilidade dos solutos nas

duas fases, mas também na sua interação com a fase estacionária (109).

Um sistema de HPLC é constituído por várias partes, nomeadamente um

reservatório de solvente, uma bomba, um injetor, uma coluna de alta eficiência, um

detetor e um computador. Este método é utilizado para a análise de variados parâmetros,

sendo que as características específicas da bomba e da coluna, por exemplo, podem variar.

Assim, devem ser realizadas purgas ao sistema sempre que se troca a técnica.

De forma a obter uma análise quantitativa, é necessário avaliar a área e/ou a altura

dos picos cromatográficos, dados obtidos através de um cromatograma. Para que os

resultados sejam aceitáveis, é necessário recorrer também a calibração e eventualmente a

adição de padrão interno (dependente dos parâmetros). Neste sentido, o traçado gráfico

da curva de calibração representa-se pela concentração do componente i (Ci) em função

da razão das áreas do componente i e do padrão interno (Ai/Ap).

No sistema HPLC Shimadzu (Figura 42), a cromatografia realiza-se geralmente

em coluna de fase reversa (os grupos funcionais da fase estacionária são apolares) em

sistema isocrático ou gradiente de solventes, cuja deteção varia consoante o parâmetro

que queremos determinar.



80

A tabela 7 enuncia vários parâmetros analisados por este método, bem como

algumas especificidades.

Tabela 7a. Descrição de análises executadas por HPLC [Adaptado de (111)].

Analito Amostra Tipo de HPLC Valores de Referência

Ácido

Vanilmandélico Urina

Sistema isocrático

com deteção Eletroquímica

<13,6 mg/24h

Hidroxiprolina Urina e Soro

Sistema isocrático

com deteção espectrofotométrica

no visível

16,0-40,0 mg/24h

Metanefrinas Urina

Sistema isocrático

com deteção

eletroquímica Até 1000,0 g/24h

Catecolaminas Urina e

Plasma

Sistema isocrático

com deteção eletroquímica

Urina

(g/24h)

Noradrenalina:

até 97,0

Adrenalina: até 27,0

Dopamina:

até 500,0

Plasma

(pg/mL)

Noradrenalina: até 420,0

Adrenalina:

até 84,0 Dopamina:

até 85,0

Serotonina Soro e Urina

Sistema isocrático

com deteção eletroquímica

117,5-193,3 g/L

Porfirinas

Urina,

Plasma e

Fezes

Deteção por fluorescência

Urina: <150 g/24h

Plasma: <32,5 g/L

Fezes: <123,8 g/g fezes

Vitamina A e E Soro

Sistema isocrático

com deteção espectrofotométrica

no visível

Vitamina A: 30-80 l/dl

Vitamina E: 500-1800 l/dl

Figura 42. Sistema HPLC Shimadzu [Adaptado de (110)].



81

Tabela 7b. Descrição de análises executadas por HPLC [Adaptado de (111)]

Vitamina B6 Soro

Derivatização em

coluna. Deteção por fluorescência

3,6-18,0 ng/mL

Vitamina B1 Sangue

total

Deteção por

fluorescência 28,0 a 85,0 g/L

Vitamina B2 Sangue

total

Deteção por

fluorescência 137 – 370 g/L

Carotenos Soro Sistema isocrático

com deteção no

visível

P.e: -carotenos: 100,0 a 850,0 ng/mL

Benzodiazepinas

e

Antidepressivos

tricíclicos (AT)

Soro

Sistema isocrático com deteção

espectrofotométrica

no visível

Benzodiazepinas

(ng/ml): Alprazolam:

5-50

Diazepam: 200-2000

AT (ng/ml):

Amitriptilina:

50-300 Maprotilina:

100-250

Aminoácidos Soro e Urina

Deteção por fluorescência

P.e: Tirosina

Soro: Adulto: 0,40-1,57 mg/dl

Urina: Adulto 12-55 mg/24h

6.2. Espectrofotometria de Absorção no Infravermelho

A espectrofotometria de absorção no infravermelho é usada para determinar a

composição química dos cálculos renais e biliares. Neste método, a radiação passa por

um divisor de feixe (beamsplitter) que a divide em duas direções, em ângulos retos. Um

dos feixes de radiação é enviado para um espelho fixo e volta para trás e o outro é enviado

para um espelho móvel. O movimento do espelho móvel torna variável a distância total

percorrida pela radiação em relação à do espelho fixo e quando os dois feixes de radiação

(procedentes dos espelhos) se encontram de novo no divisor do feixe, recombinam-se.

No entanto, a diferença entre as distâncias percorridas origina interferências construtivas

e destrutivas, que se refletem num interferograma (Figura 43). Estas interferências

devem-se a vibrações específicas de alongamento e deformação, bem como às relações

entre os grupos funcionais e a molécula, em consequência da absorção ou ausência de

absorção de radiação infravermelha (IV). O espectro de absorção obtido é extremamente

complexo e característico (112).

Desta forma, compara-se o espetro obtido com a biblioteca dos espetros puros e

assim é possível estabelecer a presença ou ausência bem como a percentagem de certos

grupos funcionais e identificar a natureza do cálculo.



82

O Perkin-Elmer 500 RXI FT-IR (Figura 43) é um aparelho automático que utiliza

esta metodologia e que trabalha na zona do IV médio, sendo a sua lâmpada constituída

por uma bobina de fio de Nicromo.

Antes de ser sujeito a esta análise química, o cálculo é analisado quanto às suas

características físicas: número de cálculos, peso, dimensões, forma, cor, depósitos

superficiais e estrutura interna. De seguida, sofre um tratamento com base na técnica da

“pastilha”. Nesta técnica, com a ajuda de um pilão e almofariz, uma pequenina parte da

amostra é misturada e pulverizada com brometo de potássio em pó e depois é sujeita a

uma grande pressão através de uma prensa, de modo a produzir um disco transparente.

Este disco é então introduzido no aparelho e é feita a leitura.

Normalmente, os cálculos renais são compostos por oxalato de cálcio

monohidratado, fosfato de amónio magnesiano e fosfato tricálcico e os cálculos biliares

são compostos por ácidos biliares ou colesterol.

6.3. Espectrofotometria de Absorção Atómica

A espectrofotometria de absorção atómica é um método de absorção específica e

quantitativa por parte de um elemento mantido no estado de vapor atómico através de

energia calorífica. Esta energia é conseguida pela radiação de uma lâmpada cujo emissor

(cátodo) contém o elemento a ser medido. Interessa que os elementos absorventes estejam

no estado fundamental de modo a poderem absorver radiação. A radiação é então emitida

em vários comprimentos de onda, numa banda estreita, na zona em que o metal tem o seu

máximo. Este corresponde à energia necessária para a transição eletrónica do estado

fundamental a um estado excitado, sendo assim característico de cada elemento. A

amostra sofre dessolvatação, vaporização e atomização, que ocorre no forno de grafite

(115).

Figura 43. Determinação do interferograma. À esquerda: Sistema Perkin-Elmer 500 RXI FT-IR. À direita: Espetro IV do oxalato de cálcio monohidratado (muito comum nos cálculos renais) [Adaptado de (113, 114)].



83

A absorção de radiação é diretamente proporcional à concentração da solução

distribuída na câmara, sendo medida pela diferença entre o sinal transmitido ao detetor

na presença e na ausência do elemento a determinar. Para obter os valores da

concentração recorre-se a uma curva de calibração preparada inicialmente com soluções-

padrão.

O Espectrofotómetro de Absorção Atómica Shimadzu AA 6800 (Figura 44)

utiliza esta metodologia e determina o alumínio no soro, o chumbo na urina e no sangue

total, o selénio no soro, o cobre na urina, o cádmio no sangue total, o crómio no soro e na

urina, o mercúrio no sangue total e na urina e o níquel no soro e na urina.

6.4. Espectrometria de Emissão Ótica por Plasma Acoplado

Indutivamente (ICP)

Este tipo de espectrometria baseia-se na excitação de átomos ou iões livres no

estado gasoso e a consequente emissão de radiação eletromagnética, conseguida pelo

retorno dos eletrões excitados ao seu estado fundamental. A amostra é introduzida no

plasma (conseguido através de uma fonte corrente de árgon), nebulizando-a sob a forma

de aerossol e este é transportado para a zona aquecida, onde é submetido a dessolvatação,

a volatilização para níveis moleculares e a dissociação em átomos, em que alguns são

ionizados. O vapor atómico resultante apresenta-se no estado fundamental de energia e

uma parte é excitada ou ionizada. Ao regressarem ao estado fundamental, os átomos e

iões excitados emitem energia, que é medida na cauda do plasma através de um

espectrofotómetro. Recorrendo a uma curva de calibração, é possível calcular a

concentração do analito na amostra (117).

Figura 44. Espectrofotómetro de Absorção Atómica Shimadzu AA 6800 [Adaptado de (116)].



84

O Varian Vista MPX – ICP/OES (Figura 45) utiliza esta metodologia e determina

o alumínio no soro, o chumbo na urina e no sangue total, o selénio no soro, o cobre na

urina, o cádmio no sangue total, o crómio no soro e na urina, o mercúrio no sangue total

e na urina e o níquel no soro e na urina.

6.5. Espectrofotometria de Absorção no Ultravioleta e no Visível

A espectrofotometria de absorção no UV-VIS é um método de medição da

intensidade da luz em função do comprimento de onda, cuja fonte de radiação pode ser

de tungsténio ou halogénio (zona do visível) ou de deutério ou hidrogénio (zona do

ultravioleta. Os testes em si podem ser de ponto final, cinéticos, complexométricos e

enzimáticos (119).

O Espectrofotómetro Genesys 5 UV-VIS (Figura 46) utiliza esta metodologia para

determinar analitos tais como a glucose-6-fosfato desidrogenase no sangue total, os

oxalatos na urina, a xilose no soro e urina, a D-glucose/D-frutose no sangue total e a

lactato desidrogenase no soro, plasma, LCR e derrames.

Figura 45. Equipamento Varian Vista MPX – ICP/OES [Adaptado de (118)].

Figura 46. Espectrofotómetro Genesys 5 UV-VIS [Adaptado de (120)].



85

6.6. Cromatografia Gasosa/Espectrometria de Massa (GC/MS)

A cromatografia gasosa é um método que separa as substâncias voláteis arrastadas

por um gás, através de uma fase estacionária. A fase estacionária pode ser sólida ou

líquida, permitindo a distribuição dos componentes da mistura entre as duas fases, por

meio de processos físicos e químicos como a adsorção, partição, permuta iónica, exclusão

ou afinidade. A fase móvel é um gás (geralmente hidrogénio, azoto, hélio ou árgon), que

transporta a amostra desde a coluna até ao detetor (121).

A espectrometria de massa é um método que estuda as massas de átomos ou

moléculas após a formação de iões na fase gasosa e separação de acordo com a razão

massa/carga (m/z). Com isto, obtém-se um espectro de massa, um gráfico que mostra a

abundância relativa de fragmentos que atingiram o detetor (Figura 47).

A Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrofotometria de Massa é um método

analítico que combina as características de cromatografia gasosa e da espectrofotometria

de massa para identificar substâncias diferentes dentro de uma amostra. O equipamento

Shimadzu GCMS QP2010 (Figura 47) utiliza esta técnica para determinar substâncias no

soro e na urina tais como a cocaína, o LSD, os opiáceos, as anfetaminas e os canabinóides.

Teste Respiratório do Helicobacter pylori

A técnica de espectrometria de massa é ainda utilizada no Teste Respiratório do

H. pylori (kit Pylobactell) para determinar a atividade da ureia, que é indicativa da

Figura 47. Determinação de substâncias por GC/MS. À esquerda, equipamento Shimadzu GCMS QP2010. À direita, espetros de GC

(acima) e MS (abaixo) da cocaína na urina [Adaptado de (122,123)].



86

presença de Helicobacter pylori. A 13C-ureia, na presença da enzima urease, sofre

hidrólise e o CO2 libertado, marcado isotopicamente, é detetado na amostra de ar

expirado. O teste é constituído por duas colheitas, uma realizada no tempo zero (basal) e

outra realizada 30 minutos após a ingestão de uma solução com 13C-ureia (positivo). Caso

o Helicobacter pylori esteja presente e ativo no estômago, fará a decomposição da 13C-

ureia, sendo detetado no CO2 expirado. O equipamento HeliFAN lê as duas amostras e

determina a diferença de forma automática, se for superior a 3,25 o resultado é positivo

(124).


Stefanie Baptista Microbiologia

87

7. MICROBIOLOGIA

A Microbiologia é uma área que realiza o estudo laboratorial das doenças

infeciosas de etiologia bacteriana, micológica e parasitológica, através do exame

morfológico direto, do isolamento, identificação e determinação da resistência aos

agentes antimicrobianos e dos microrganismos presentes em diferentes amostras

biológicas. Complementarmente também realiza testes para a monitorização da eficácia

da terapêutica antibiótica.

De seguida são descritos os procedimentos realizados nesta área do LJC, por

produto biológico (14).

7.1. Hemocultura

A hemocultura é uma análise cujo objetivo é pesquisar bactérias no sangue, sendo

útil para ajudar no diagnóstico de infeção sistémica. De forma a aumentar a probabilidade

de detetar as bactérias, por norma são pedidas duas ou mais hemoculturas e colhidas como

amostras consecutivas. Para complementar o estudo, podem ser feitos exames culturas

da urina, expetoração ou LCR para identificar a origem da infeção inicial, quando a

pessoa tem sintomas associados a infeção urinária, pneumonia ou meningite. O

procedimento difere consoante a pesquisa seja direcionada para bactérias aeróbias ou

anaeróbias, conforme descrito abaixo.

7.1.1. Aerobiose

- Amostra: frasco para hemocultura em aerobiose. Conservação até 12h à

temperatura ambiente.

- Equipamento: BacT/ALERT (Figura 48)

Exame cultural (em câmara de fluxo laminar)

Quando o resultado do sistema BacT/ALERT é positivo prossegue-se para o

exame cultural. Nestes casos, homogeneíza-se o conteúdo do frasco, desinfeta-se a tampa

de borracha com álcool a 70º e punciona-se com agulha e seringa. Retira-se 1 ml de

sangue e deita-se duas gotas no meio de Columbia. Incuba-se 24h a 35±2°C e observa-se

as colónias.

O frasco deve ser colocado na estufa e o processo deve ser repetido às 24h, 48h e

até ao 7º dia ao passo que não existe desenvolvimento de microrganismos. O resultado

negativo deverá ser expresso como “estéril”.



88

Resultados positivos podem ser bacteriemias em geral, endocardites e sepses. No

entanto, estes resultados devem ser interpretados com cautela, devido à possibilidade de

contaminação. Resultados negativos não implicam necessariamente ausência de

bacteriemia, devido à possibilidade de presença de fatores inibidores como antibióticos.

7.1.2. Anaerobiose

- Amostra: frasco para hemocultura em anaerobiose (tampa laranja). Conservação

até 12h à temperatura ambiente.

- Equipamento: BacT/ALERT


Quando o resultado do sistema BacT/ALERT é positivo prossegue-se para o

exame cultural. Nestes casos, procede-se da mesma forma que em 7.1.1. Aerobiose, no

entanto, as placas são colocadas no GenBag ANAER (bioMérieux®). Incuba-se 48h a 72h

a 35±2°C e compara-se com frasco de aerobiose ou sementeira em aerobiose em meio

Columbia.

O processo também deve ser repetido às 24h, 48h e até ao 7º dia ao passo que não

existe desenvolvimento de microrganismos. O resultado negativo deve ser expresso como

“estéril”. Resultados positivos devem-se na maioria dos casos a bactérias anaeróbias

facultativas, nomeadamente Staphylococcus spp..

7.2. Urina Assética

A urina assética (ou urocultura, ou exame microbiológico da urina) é examinada

quando se suspeita de infeção urinária, de forma a detetar o microrganismo que está a

Figura 48. Equipamento BacT/ALERT [Adaptado de (125)].



89

provocar a infeção. Os microrganismos mais frequentemente responsáveis por infeções

urinarias são os seguintes:

- E. coli

- Proteus spp.

- Klebsiella spp.

- Enterococcus spp.

- Staphylococcus spp.

- Candida spp.

Exame citobacteriológico (citometria de fluxo)

Na análise da urina assética, a primeira fase diz respeito ao exame

citobacteriológico, por citometria de fluxo, recorrendo ao equipamento Sysmex UF-

1000iTM (Figura 49). O citómetro aspira 800 μl de amostra, sendo que em amostras com

pouca quantidade não deve ser realizado o exame citobacteriológico, apenas o exame

cultural, referenciando este facto nas observações do boletim.

A lista de trabalho obtida a partir do equipamento apresenta os seguintes

parâmetros:

- Número de glóbulos vermelhos

- Número de leucócitos

- Número de células epiteliais

- Número de bactérias

A lista indica também a presença de cristais, células epiteliais tubulares, leveduras

e espermatozoides.

O equipamento fornece os seguintes alertas:

- “REV” e “UTI” (>20 WBC/μl e >30 bact/μl)

Figura 49. Equipamento Sysmex UF-1000iTM [Adaptado de (126)].



90

Todas as amostras com os alertas “REV” ou “UTI”, bem como aquelas com >500

bact/μl, amostras de crianças até aos 6 anos ou urgências devem ser semeadas.

Exame do sedimento urinário (microscopia ótica)

Deve ser realizado o exame do sedimento por microscopia ótica sempre que no

exame citobacteriológico surgem os seguintes alertas:

- Muitas células epiteliais e muitos leucócitos

- Células epiteliais tubulares

- Cristais e presença de eritrócitos

- Leveduras

- “(*)” em todos os parâmetros

Nestes casos, a partir do balão inicial verte-se 10 ml de urina para um tubo de

plástico e centrifuga-se 5 min a 1500 rpm. De seguida, decanta-se o sobrenadante e

monta-se o sedimento entre lâmina e lamela após a homogeneização da amostra. Observa-

se então ao microscópio ótico com ampliação de 400x e faz-se a quantificação por campo.

Para obter o resultado final em μl, deve-se multiplicar pelo fator 5.


- Meio de cultura: CLED

Com ansa descartável semeia-se fazendo um inóculo vertical e espalmando-o

perpendicularmente a esse. Incuba-se na estufa durante 18-48h (35±2°C). Observa-se as

placas e efetua-se a valorização clínica das amostras de acordo com o número de células

epiteliais, de leucócitos e com a contagem de colónias:

10 Colónias – 1000 UFC/ml (103)

100 Colónias – 10000 UFC/ml (104)

1000 Colónias – 100000 UFC/ml (105)

Considera-se significativo um crescimento >105 UFC/ml (colónias incontáveis).

Em crianças ou diabéticos, sempre que a informação clínica justifique, podem ser

valorizados crescimentos >104 UFC/ml.

De forma conseguir uma identificação inequívoca da bactéria em causa, seguem-

se vários procedimentos, conforme exemplificado de seguida:

Exemplo 1(ver Figura 50 e Anexos):

→ Meio CLED: Bactérias Lac+ (Colónias pequenas e brilhantes)

→ Gram: Gram+

→ Reisolamento em Meio CNA: colónias brancas acizentadas



91

→ Teste da Coagulase: Coagulase+

Identificação: Staphylococcus aureus

Exemplo 2 (Ver Figura 51 e Anexos):

→ Meio CLED: Bactérias Lac+

→ Gram: Gram-

→ Reisolamento em Meio MCK: Lac+

→ Meio CPSE: Colónias castanhas

Identificação: Echerichia coli

Exemplo 3 (Ver Figura 52):

→ Meio CLED: Bactérias Lac- (Aspeto mucoide)

→ Gram: Gram-

→ Reisolamento em Meio MCK: Lac-

a) b

)

c)

Figura 50. Meios de cultura utilizados para identificação e TSA da bactéria Staphylococcus aureus em

amostra de urina. a) Meio CLED b) Meio CNA c) TSA em meio MHE [Adaptado de (127)].

a) b)

c)

Figura 51. Meios de cultura utilizados para identificação e TSA da bactéria Echerichia coli em amostra de urina. a) Meio CLED b) Meio MCK c) Meio CPSE [Adaptado de (127)].



92

→ VITEK: Carta Gram-

Identificação: Klebsiella pneumoniae

Em culturas mistas, a avaliação deve ser feita de acordo com o número células

epiteliais, leucócitos e bactérias e com os dados clínicos disponíveis.

Identificação e teste de suscetibilidade aos antimicrobianos (TSA)

A identificação e TSA pode ser feita em placa, conforme a Figura 50c (Ver

Anexos) ou diretamente no VITEK. Em ambos os casos é referida a lista de antibióticos

para os quais foi detetada suscetibilidade ou resistência.

7.3. Exsudado Vaginal

O exame do exsudado vaginal serve como auxiliar ao diagnóstico nas infeções

genitais. Na grávida, efetua-se o despiste da colonização por Streptococcus do grupo B

para prevenção da sepsis neonatal precoce.

A pesquisa é orientada para a deteção de:

- Neisseria gonorrhoeae

- Gardnerella vaginalis

- Streptococcus beta-hemolíticos do grupo B (com exsudado perianal)

- Listeria monocytogenes

- Candida spp.

- Trichomonas vaginalis

- Candida albicans

Em situações particulares poderão ser pesquisados outros microrganismos de

acordo com a informação clínica disponível. As bactérias de infeção vaginal com

Figura 52. Amostras de urina em: a) Meio CLED: à esquerda, Klebsiella

pneumoniae; à direita, E. coli b) Meio MCK: Pseudomonas aeruginosa [Adaptado de (127)].

a) b)



93

exigência de meios específicos de desenvolvimento, que não são despistadas neste ensaio,

devem ser alvo de prescrição específica e orientada (por exemplo Chlamydia e

Mycoplasmas genitais).


- Meios de cultura: Columbia ANC, Chocolate polyVitex VCAT3 (M4), Gelose

Gardnerella (se sugestivo), Sabouraud (com Gentamicina e Cloranfenicol) (M13), Meio

de Granada/Gelose Strep. B1.

Seleciona-se os meios, faz-se as sementeiras e incuba-se durante 24-48h a 35±2°C

em estufa, sendo que o meio M4 é colocado em estufa de CO2.

Quando não existe desenvolvimento de bactérias patogénicas, o resultado é

expresso por “não se desenvolveram bactérias potencialmente patogénicas”. Quando o

exame direto é sugestivo de vaginose (muitos cocobacilos Gram negativo e o meio de

Gardnerella apresenta hemólise sugestiva – Figura 53a), apresenta-se o resultado como

Gardnerella vaginalis. Caso exista predomínio de outro microrganismo valorizável, é

feita a identificação e respetivo antibiograma.

Exame citológico (microscopia ótica)

Coloca-se um pouco de exsudado entre lâmina e lamela e pesquisa-se ao

microscópio ótico a presença de leucócitos, eritrócitos, parasitas (Trichomonas

vaginalis), formas leveduriformes e filamentosas de fungos. Faz-se a semi-quantificação

da seguinte forma:

- 0 a 5/campo com ampliação 400x – raros

- 6 a 29/campo com ampliação de 400x – alguns

- 30 ou mais/campo com ampliação de 400x – muitos

Exame direto (com coloração de Gram)

Efetua-se a coloração e pesquisa-se ao microscópio ótico a presença e morfologia

de bactérias (Gram positivo ou Gram negativo), bem como formas leveduriformes e

filamentosas de fungos. Refere-se também a presença ou ausência de bacilos de

Döderlein ou Lactobacillus spp. (Figura 53b) e ainda a presença de flora mista sem

predomínio ou flora escassa. Faz-se a semi-quantificação da seguinte forma:

- 0 a 5/campo com ampliação de 1000x – raros





94

Exame micológico

Quando não existe desenvolvimento de fungos no meio de Sabouraud, o resultado

é dado como negativo. Quando existe desenvolvimento, é feita a sementeira em meio

Candida ID (CAN2) e o resultado é dado como Candida albicans (se as colónias

apresentam cor azul) ou Candida spp. (se as colónias apresentam cor branca). Caso seja

pedida a identificação específica da levedura, efetua-se o ID-YST.

Exame parasitológico

Quando não se observam Trichomonas, o resultado é dado como negativo.

Quando se observam Trichomonas no exame citológico (Figura 54), é referida a sua semi-

quantificação.


É referida a lista de antibióticos para os quais foi detetada suscetibilidade ou

resistência (apenas realizado se explicitamente requisitado).

a) b)

Figura 53. Exame direto com coloração Gram do exsudado vaginal. a) Células epiteliais rodeadas de cocobacilos gram-, sugestivo de vaginose provocada por Gardnerella vaginallis b) Células epiteliais e bacilos

de Döderlein (Lactobacillus spp.) (1000x) [Adaptado de (128, 129)].

Figura 54. Trichomonas vaginallis em exame citológico vaginal (400x) [Adaptado de (130)].



95

7.4. Exsudado Faríngeo

O exsudado faríngeo serve de auxiliar de diagnóstico nas infeções bacterianas do

trato respiratório superior. A pesquisa é orientada para o Streptococcus β-hemolítico dos

grupos A, C e G de Lancefield.


- Meios de cultura: Columbia (M1), meio de Todd Hewitt/ Sangue de

carneiro/cavalo (M11), Columbia ANC (M14).

Após semear o meio de Columbia com a zaragatoa, incuba-se o mesmo na estufa

a 35±2ºC durante 24-48h. De seguida, coloca-se a zaragatoa no meio de Todd-Hewitt

com sangue e incuba-se a 35±2ºC durante 18-24h. Depois deste tempo, repica-se então a

partir do meio Todd-Hewitt para uma placa de meio Columbia ANC, que incuba a 35±2ºC

durante 18-24h. Por fim, observam-se as placas e procura-se colónias sugestivas de β-

hemólise.

Caso não exista desenvolvimento de bactérias patogénicas no exame cultural, o

resultado é expresso por “não se desenvolveram bactérias potencialmente patogénicas”

nos meios usuais. No caso de o exame cultural ser positivo, deve ser identificado o

microrganismo com base no procedimento de testes de identificação.



resistência.

7.5. Exsudado Nasal

O exsudado nasal serve de auxiliar de diagnóstico nas infeções do trato

respiratório superior. A pesquisa é orientada para:

- Staphylococcus aureus

- Streptococcus β-hemolítico do grupo A de Lancefield*

- Streptococcus pneumoniae*

- Morexella (Branhamella) catarrhalis*

(*) valoriza-se apenas em casos de culturas puras ou quando a informação

clínica justifica.


- Meios de cultura: Columbia (M1) e Gelose de Chapman (M5).



96

Em câmara de fluxo laminar semeiam-se os meios com as zaragatoas e incubam-

se em estufa a 35±2°C durante 24-48h. Depois observam-se as colónias.


expresso por “não se desenvolveram bactérias potencialmente patogénicas” nos meios

usuais. No caso de o exame ser positivo, deve ser identificado o microrganismo com base

nos testes.



resistência.

7.6. Expetoração

A expetoração serve de auxiliar de diagnóstico nas infeções bactéricas que causam

pneumonia, já que corresponde à secreção (muco) produzida pelos pulmões e que são

expelidas com a tosse profunda. Os microrganismos mais frequentemente valorizados são

os seguintes:


- Haemophylus influenza

- Streptococcus pneumoniae

- Moraxella catarrhalis

- Klebsiella pneumoniae

- Pseudomonas aeruginosa

- Acinectobacter ou Acinobacter baumannii


- Meios de cultura: Columbia (M1), MacConkey (M2) e Chocolate Haemophilus

(M3).

Em câmara de fluxo laminar, retira-se do frasco estéril um pouco da amostra, de

preferência com pus ou sangue, com uma ansa descartável, e semeiam-se os meios de

cultura. Preparam-se também duas lâminas. Incubam-se as placas M1 e M2 em estufa a

35±2°C até 48h e a placa M3 em estufa de CO2 a 35±2°C até 48h.

Quando não se verifica desenvolvimento de bactérias patogénicas, o resultado é

expresso por “não se desenvolveram bactérias potencialmente patogénicas”. Caso o

exame seja positivo, é feita a identificação do microrganismo e respetivo antibiograma.



97


Depois de secas, fixa-se as lâminas à chama e efetua-se a coloração de Gram.

Observa-se então as lâminas no microscópio ótico com ampliação de 100x para

quantificar as células epiteliais e leucócitos e com ampliação de 1000x para analisar o

predomínio de bactérias da amostra. Faz-se a semi-quantificação (raros, alguns ou

muitos) de células e leucócitos, referindo o predomínio da flora encontrada ou “flora

saprófita habitual”. Paralelamente observa-se as placas com colónias com morfologia

sugestiva.



resistência.

7.7. Exsudado Auricular

O exsudado auricular serve de auxiliar de diagnóstico nas infeções do ouvido. Os

microrganismos mais frequentes são os seguintes:

- Haemophilus influenzae

- Streptococcus pneumoniae

- Streptococcus β-hemolíticos

- Moraxella catarrhalis

- Pseudomonas aeruginosa


- Meios de cultura: Columbia (M1), MacConkey (M2), Chocolate Haemophilus

(M3) e Gelose de Chapman (M5).

Semeia-se os respetivos meios de cultura com o exsudado e incuba-se as placas

em estufa a 35±2 °C durante 24-48h, tendo em conta que o meio M3 (Chocolate

Haemophilus) incuba na estufa de CO2. Depois observa-se as placas.

Quando não se verifica desenvolvimento de bactérias patogénicas no exame

cultural, o resultado é expresso por “não se desenvolveram bactérias potencialmente

patogénicas”. Caso o exame seja positivo, é feita a identificação do microrganismo e

respetivo antibiograma.

Exame direto (coloração de Gram)

Com o exsudado prepara-se duas lâminas, efetua-se a coloração de Gram e

observa-se ao microscópio ótico para pesquisa de bactérias e de formas leveduriformes e

filamentosas de fungos. É feita a semi-quantificação da seguinte forma:



98

- 0 a 5/campo de 1000x – raros

- 6 a 29/campo de 1000x – alguns

- 30 ou mais/campo de 1000x – muitos



resistência.

7.8. Espermocultura

A espermocultura é auxiliar de diagnóstico de infeção do trato genital masculino.

Os microrganismos mais frequentes são os seguintes:


- Enterococcus spp.


- Enterobacteriaceae

Bactérias de cultura difícil como a Chlamydia e Mycoplasma só são estudadas

com pesquisa orientada.


- Meios de cultura: Columbia (M1), Chocolate polyVitex VCAT3 (M4) e

Sabouraud (com Gentamicina e Cloranfenicol) (M13).

Semeia-se os respetivos meios de cultura com a amostra e incuba-se as placas em

estufa a 35±2 °C durante 24-48h, tendo em conta que o meio M4 (Chocolate polyVitex

VCAT3) incuba na estufa de CO2. Depois observa-se as placas.


expresso por “não se desenvolveram bactérias potencialmente patogénicas”. Caso exista

predomínio de outro microrganismo valorizável, é feita a identificação e respetivo

antibiograma.


Com o exsudado prepara-se duas lâminas, efetua-se a coloração de Gram e

observa-se ao microscópio ótico para pesquisa de bactérias e de formas leveduriformes e

filamentosas de fungos. É feita a semi-quantificação da seguinte forma:

- 0 a 5/campo de 1000x – raros

- 6 a 29/campo de 1000x – alguns

- 30 ou mais/campo de 1000x – muitos



99

Quando não se observam microrganismos dar o resultado como “ausência de

microrganismos”.



microscópio ótico a presença de leucócitos, eritrócitos, parasitas, formas leveduriformes

e filamentosas de fungos. Faz-se a semi-quantificação da seguinte forma:




Exame micológico








resistência.

7.9. Coprocultura

A coprocultura serve de auxiliar de diagnóstico nas infeções do aparelho

digestivo, nomeadamente as gastroenterites. Os microrganismos mais frequentes são os

seguintes:

- Salmonella sp.

- Shigella sp.

- Campylobacter spp.

- E. coli enteropatogénica (EPEC, crianças)

- Yersinia sp. (se solicitada)

- Candida sp. (se solicitado o exame micológico)

Exame cultural

- Meios de cultura: Gelose Hektoen (M9), Gelose Yersinia [(M10), se pedido],

Selenito F Broth (M12), Sabouraud (com Gentamicina e Cloranfenicol) (M13) e

Campylosel (M15).



100

Em câmara de fluxo laminar, retira-se uma pequena porção de amostra com o

auxílio de ansa descartável e semeia-se nos meios de cultura selecionados. Incuba-se em

estufa a 35±2ºC durante 24-48h e o meio M15 deve ser colocado numa saqueta GenBag

ANAER na estufa a 42±2ºC durante cerca de 48h. Repica-se o meio líquido de Selenito

para um segundo meio M9 após cerca de 12h, com o auxílio de uma ansa. Observa-se por

fim as placas.


expresso por “negativo” nos meios usuais para cada uma das bactérias pesquisadas no

exame cultural. Quando o exame é positivo prossegue-se para a identificação e teste de

suscetibilidade aos antibióticos.



resistência.

7.10. Exame Micológico

O exame micológico serve de auxiliar de diagnóstico em infeções fúngicas

nomeadamente naquelas provocadas por Candida e Aspergillus.


- Meio de cultura: Sabouraud (com Gentamicina e Cloranfenicol) (M13)

Em câmara e fluxo laminar retira-se a zaragatoa do meio de Stuart ou uma pequena

porção da amostra com o auxílio de uma ansa descartável e semeia-se no meio M13.

Incuba-se a 35±2°C durante 24-48h. Observa-se então a placa do meio seletivo e quando

existe desenvolvimento de colónias esbranquiçadas e cremosas, efetua-se o exame a

“fresco”, colocando com uma ansa uma colónia entre lâmina e lamela, com uma gota de

água.

Caso se observem estruturas redondas ou ligeiramente ovaladas ao microscópio

ótico, prossegue-se com a identificação, fazendo uma repicagem de uma colónia para o

meio de Candida ID2. Incuba-se em estufa a 35±2°C durante 24h. Se for pedido pesquisa

de Aspergillus spp. incuba-se mais 24-48h à temperatura ambiente.

Se existe desenvolvimento de colónias filamentosas, observa-se novamente a

“fresco” e identifica-se as estruturas microscópicas para verificar se correspondem a

Aspergillus.



101

Quando não existe desenvolvimento de colónias, apresenta-se o resultado como

negativo. Quando se verifica crescimento no meio de Candida ID2, os resultados são

apresentados de acordo com o seguinte:

- Colónias de cor azul-turquesa: exame positivo para Candida albicans

- Colónias rosadas ou acastanhadas: exame positivo para Candida

tropicalis

- Colónias brancas: exame positivo para Candida spp.

Quando é pedida expressamente a identificação do fungo, usa-se as cartas ID-YST

do VITEK2 e o teste de suscetibilidade.

Nos casos em que o exame é positivo para Aspergillus, apresenta-se o resultado

indicando a espécie (em amostras de expetoração e exsudado auricular).

7.11. Exame Uretral

O exame do exsudado uretral auxilia o diagnóstico das infeções genitais e a

pesquisa é orientada para a deteção dos seguintes microganismos:


- Candida spp.

- Trichomonas vaginalis

Em situações particulares poderão ser pesquisados outros microrganismos de

acordo com a informação clínica disponível. As bactérias de infeção genital com

exigência de meios específicos de desenvolvimento, como Chlamydia e Mycoplasma, que

não são despistadas neste ensaio, devem ser alvo de prescrição específica e orientada.


- Meios de cultura: Columbia (M1), Chocolate polyVitex VCAT3 (M4) e

Sabouraud (com Gentamicina e Cloranfenicol) (M13).

Seleciona-se os meios, faz-se as sementeiras e incuba-se durante 24-48h a 35±2°C

em estufa, sendo que o meio M4 é colocado em estufa de CO2.


expresso por “não se desenvolveram bactérias potencialmente patogénicas”. Caso exista

predomínio de outro microrganismo valorizável, é feita a identificação e respetivo

antibiograma.



microscópio ótico a presença de leucócitos, eritrócitos, parasitas (Trichomonas



102

vaginalis), formas leveduriformes e filamentosas de fungos. Faz-se a semi-quantificação

da seguinte forma:





Efetua-se a coloração e pesquisa-se ao microscópio ótico a presença e morfologia

de bactérias (Gram positivo ou Gram negativo), bem como formas leveduriformes e

filamentosas de fungos. Faz-se a semi-quantificação da seguinte forma:

- 0 a 5/campo com ampliação de 1000x – raros



Quando se observam diplococcos Gram negativo no exame direto corado pelo

Gram, com morfologia sugestiva de Neisseria gonorrhoeae (Figura 55), e não existe

desenvolvimento no exame cultural, é reportado como “morfologia sugestiva de

Neisseria gonorrhoeae no exame direto sem desenvolvimento no exame cultural”.

Exame micológico






Figura 55. Diplococcos GN no exame direto corado pelo Gram, com morfologia sugestiva de Neisseria gonorrhoeae (1000x) [Adaptado de (131)].



103

Exame parasitológico

Quando não se observam Trichomonas, o resultado é dado como negativo.

Quando se observam Trichomonas no exame citológico, é referida a sua semi-

quantificação.



resistência (apenas realizado se explicitamente requisitado).

Tabela 8a. Produtos Biológicos e respetivos meios de cultura [Adaptado de (14)]

Hem

ocu

ltu

ra

aero

bio

se p

osi

tiv

a

Hem

ocu

ltu

ra

anae

rob

iose

po

siti

va

Uri

na

assé

tica

Ex

sud

ado

vag

inal

/vu

lvar

Ex

sud

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Ex

sud

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sud

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Au

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Ocu

lar

Esp

erm

ocu

ltu

ra

Co

pro

cult

ura

Ex

am

e

mic

oló

gic

o

Columbia (M1) X x X x x x x x x

MacConkey (M2)

x x

Chocolate

Haemophilus

(M3) X x x

Chocolate

polyVitex

VCAT3 (M4) X x x x

Gelose de

Chapman (M5) x x

Gelose

Gardnerella (M6) X

Schaedler (M7) x

CLED (M8) x

Gelose Hektoen

(M9) x

(2)Gelose

Yersinia (M10) x

*Meio de Todd

Hewitt (M11) x

Selenito F

(M12) x x

Sabouraud

(com

Gentamicina e

Cloranfenicol) (M13)

X x x x x



104

Tabela 8b. Produtos Biológicos e respetivos meios de cultura [Adaptado de (14)]

7.12. Pesquisa de Ovos, Quistos e Parasitas

A pesquisa de ovos, quistos e parasitas é feita através da técnica de concentração

pelo formol etil-acetato em tubo com solução conservante e baseia-se na diferença de

solubilidade e de densidade dos diferentes componentes das fezes. A solução de

formaldeído simultaneamente conserva os parasitas e solubiliza os componentes

hidrófilos. A solução de acetato de etilo solubiliza os componentes lipófilos como as

gorduras. A solução de iodo cora diferencialmente as estruturas. Estes meios quando

misturados criam uma suspensão imiscível que após filtração é centrifugada e exibe três

camadas distintas:

- superficial de componente lipófilos

- intermédia formada por detritos de densidade intermédia

- profunda composta por elementos hidrófilos e no fundo do tubo um

sedimento de componentes de alta densidade que inclui os ovos e quistos e larvas

de parasitas.

Realiza-se o ensaio em ambiente com exaustão forçada e com máscara por causa

da utilização de acetato de etilo.

Abre-se o tubo de transporte e adiciona-se 1,25 ml de acetato de etilo e 0,25 ml

de solução de iodo. Acopla-se o tubo de processamento e faz-se uma inversão de 180º ao

conjunto dos dois tubos. Agita-se no vortex durante 10-15s. Filtra-se a suspensão durante

5-10min a 1500-2000G e rejeita-se o sobrenadante. Por fim, junta-se algumas gotas de

solução de iodo e com uma pipeta de plástico ressuspende-se o concentrado de parasitas.

Coloca-se uma gota da suspensão entre lâmina e lamela e observa-se ao

microscópio ótico.

Columbia ANC (M14)

x

Campylosel (M15) x

Meio de

Grabada/Gelose

Strep. B1 (M16) x



105

- Resultados:

Positivo - Observação de ovos, quistos ou larvas de parasitas corados pelo

iodo. A visualização de um único elemento parasitário por lâmina é suficiente para

afirmar o diagnóstico.

Negativo - ausência de estruturas parasitárias. Os detritos fecais devem

estar sempre presentes.

7.13. Pesquisa de Sangue Oculto nas Fezes (PSOF)

A pesquisa de sangue oculto nas fezes tem o objetivo, como o nome indica, de

detetar a presença de quantidades mínimas de sangue nas fezes, pequenas o suficiente

para não poderem ser vistas a olho nu. É uma análise pedida também para investigar

anemias de causa desconhecida, mas o seu maior intuito é o rastreio do cancro do colon.

As amostras são introduzidas no aparelho OC-Sensor Diana® (Eiken) e lidas

automaticamente. O princípio do método baseia-se na utilização de medição ótica através

de um analisador automático e uma reação de aglutinação em látex. O reagente é

preparado por sensibilização de anticorpos anti-HbAO em partículas de poliestireno em

látex. Quando o reagente é misturado com a amostra, vai reagir com a Hb que esteja

presente por ligação ao anticorpo anti-HbAO, resultando uma reação de aglutinação. O

analisador vai depois detetar a variação na densidade ótica e por correlação com uma

curva de calibração, apresenta resultados quantitativos.


Stefanie Baptista Biologia Molecular

106

8. BIOLOGIA MOLECULAR

Associada à área da Microbiologia, o LJC dispõe da área das Doenças Infeciosas,

que recorrendo à Biologia Molecular, realiza o estudo qualitativo e quantitativo de

sequências genómicas de ácidos nucleicos específicas de microrganismos potencialmente

patogénicos.

A realização das técnicas nesta área implica um fluxo direcional de marcha em

frente das amostras, sendo que estas circulam da sala 1 (sala de pré-PCR – câmaras de

fluxo vertical classe II-A para manipulação das amostras e outra para manipulação dos

reagentes) para a sala 2 (sala de PCR – termocicladores clássicos de PCR) e desta para a

sala 3 (sala de pós-PCR - equipamentos de deteção dos produtos amplificados). Existe

ainda a área comum onde se encontram os equipamentos fechados, nomeadamente para

PCR-RT e os extratores. As técnicas realizadas seguem, de modo geral, as seguintes fases:

1º Extração

2º Amplificação

3º Deteção do amplificado

De seguida são descritos vários procedimentos e equipamentos utilizados ao longo

das três fases mencionadas. Para além de técnicas de Biologia Molecular, nesta área são

realizados outros testes que serão igualmente descritos.

8.1. Extração de Ácidos Nucleicos

A extração de ácidos nucleicos purificados (DNA e RNA) de amostras de soro,

plasma ou sangue total é feita através do equipamento MagNA Pure LC 2.0 Instrument

(Figura 56). Este equipamento utiliza esferas magnéticas para o isolamento e purificação

dos ácidos nucleicos, escolhendo-se o protocolo, volume de amostra e eluído. No caso

das amostras de soro ou plasma, o volume a pipetar são 200 l e o volume final extraído

é de 100 l. O produto obtido pode ser utilizado para PCR ou RT-PCR (132).

Figura 56. Aparelho MagNA Pure LC 2.0 Instrument [Adaptado de (133)].



107

8.2. Amplificação e Deteção - PCR

A amplificação dos ácidos nucleicos é conseguida através da técnica de PCR

(Polymerase Chain Reaction) ou q-PCR. Estas técnicas compreendem 3 passos:

Desnaturação, Hibridação e Extensão ou polimerização. Faz-se a amplificação de regiões

específicas do genoma do agente patológico utilizando primers específicos e na q-PCR o

produto amplificado é detetado utilizando corantes fluorescentes. Estes corantes estão

ligados a sondas do oligonucleotídeos que se ligam especificamente ao produto

amplificado durante a amplificação. A monitorização em tempo real das intensidades de

fluorescência durante a q-PCR permite a deteção de produto em acumulação sem reabrir

os tubos de reação após a realização da PCR (Figura 57). Alguns protocolos (p.e. para

deteção de H. pylori) utilizam o “hot-start”, que reduz bastante a frequência de reações

inespecíficas dos primers. O “hot-start” é garantido pela separação dos nucleótidos e da

Taq-polimerase, utilizando uma polimerase modificada quimicamente (TaqF). Esta é

ativada através do aquecimento a 95ºC durante 15 min. Para os diversos Kits de PCR,

existem controlo positivo, controlo negativo e padrão interno. O padrão interno é

normalmente constituído por um fragmento de DNA de uma proteína ubíqua endógena,

como a β-globina, que permita garantir a eficácia do processo de replicação em amostras

negativas para as pesquisas em causa, observando-se sempre a presença do padrão interno

nessas mesmas amostras (134).

Quando se aplicam técnicas em Tempo Real, existem pelo menos 2 comprimentos

de onda distintos para as leituras, sendo um para ler amostras, controlos e calibradores e

o outro para ler os padrões internos. Para avaliar o ciclo de q-PCR, também se deve

observar a temperatura de melting dos controlos positivos, uma vez que esta é especifica

de cada “amplicon”.

O equipamento cobas 4800 System da Roche (Figura 58) combina a técnica de

q-PCR para amplificação e deteção dos ácidos nucleicos. Este aparelho é utilizado para a

Figura 57. Componentes necessários para a realização da RT-PCR e respetivo produto [Adaptado de (135)].



108

deteção qualitativa da Chlamydia trachomatis e/ou Neisseria gonorrhoeae, HPV, HIV,

entre outros.

O equipamento LigthtCycler 2.0 da Roche (Figura 59) é um equipamento

totalmente automatizado para PCR em tempo real, com determinação da curva de

dissociação (melting) ou quantificação do alvo de ácidos nucleicos (amplicon). Os

resultados são tratados de forma diferente quer se trate de ensaio qualitativo por curva de

dissociação ou ensaio quantitativo por curva de calibração (137).

8.3. Microarrays de baixa intensidade – CLART-Strip

O dispositivo CLART é baseado na amplificação de fragmentos específicos do

genoma viral e sua hibridação com sondas específicas para cada serotipo. A deteção do

produto amplificado por PCR é efetuada através de uma plataforma tecnológica baseada

Figura 58. Equipamento cobas 4800 System da Roche [Adaptado de (136)].

Figura 59. Equipamento LigthtCycler 2.0 da Roche [Adaptado de (137)].



109

em microarrays de baixa densidade a plataforma consiste em incluir um microarray no

fundo de um poço de placa microtitulada (CLART-Strip- CS).

A hibridação do produto amplificado por PCR é detetada pela formação de um

precipitado insolúvel nas zonas do microarray onde os produtos amplificados foram

capturados pelas sondas. Durante o PCR, os produtos amplificados são marcados com

biotina. Estes produtos hibridizam com as respetivas sondas específicas que se encontram

imobilizadas na superfície do microarray. Depois de incubar com o conjugado

estreptavidina-peroxidase. Na presença de o-Dianisidina, a atividade da peroxidase

metaboliza este composto, formando um precipitado insolúvel nos locais onde ocorreu a

hibridação (Figura 60) (138).

Este teste é utilizado para realizar a Genotipagem de HPV por identificação

genómica, bem como de outras infeções sexualmente transmissíveis.

8.4. Sondas em linha - DNA STRIP

Os testes GenoType baseam-se na tecnologia de DNA STRIP da HAIN

LIFESCIENCE em que o DNA ou RNA é isolado da amostra, amplificado e detetado

através de uma hibridação e reação de fosfatase alcalina numa tira de membrana. Após o

isolamento do DNA, os ácidos nucleicos são replicados seletivamente numa reação de

amplificação. No próximo passo, os amplicons são quimicamente desnaturados, uma vez

que a deteção na DNASTRIP é feita usando DNA de cadeia simples. Durante a reação

Figura 60. Esquema do método de visualização das sondas

CLART-Strip [Adaptado de (138)].



110

conjugada, o produto especificamente ligado é marcado com a enzima fosfatase alcalina

e é então tornado visível numa reação de deteção colorimétrica. Desta forma, um padrão

de bandas específicas desenvolve-se na DNA STRIP (Figura 61). Usando um modelo de

avaliação específico do teste, o resultado do teste pode ser lido de forma rápida e clara.

Ao usar este ensaio, é possível determinar o genótipo do microorganismo presente, bem

como suas resistências (139).

8.5. ELISA

O teste ELISA da MP Diagnostics é uma prova imunoenzimática para a deteção

de Acs IgG para vírus no soro ou plasma humanos (p.e. HEV). Neste teste, os poços das

tiras de poliestireno da microplaca são revestidos com Ags específicos do vírus. As

amostras diluídas na solução-tampão são incubadas nos poços revestidos. Os Acs anti-

“vírus”, caso presentes, unem-se ao Ags da fase sólida. Após lavagem completa dos poços

adiciona-se aos mesmos anti-IgG humana purificada por afinidade e marcada com

peroxidase do rábano. Este Ac marcado vai ligar-se a todos os complexos Ag-Ac

anteriormente formados e o excesso de Acs não ligados é removido por lavagens. Uma

solução de subtrato com TMB (140).

8.6. ImmunoCAP ISAC sIgE 112

O ImmunoCAP ISAC sIgE 112 é um teste in vitro para a determinação semi-

quantitativa de anticorpos IgE específicos, em soro ou plasma humanos. Destina-se ao

diagnóstico in vitro, como ajuda na identificação de distúrbios alérgicos mediados por

IgE em conjunto com outros resultados clínicos. Este é um teste imunológico de fase

Figura 61. Padrão específico de bandas nas DNA-STRIP para vários genótipos do Mycobacterium [Adaptado de (139)].



111

sólida em que os componentes alergénicos imobilizados num substrato sólido em formato

de microarray reagem com os IgE específicos na amostra do doente. Após lavagem dos

anticorpos IgE não específicos, é acrescentado o Ac IgE anti-humano marcado com

fluorescência para formar um complexo. Após a incubação, os Acs IgE anti-humanos não

ligados marcados com fluorescência são removidos com uma lavagem. O procedimento

é seguido por uma medição da fluorescência utilizando um scanner de microarrays.

Quanto maior for o valor de resposta, mais Acs IgE específicos estão presentes na

amostra. Os resultados dos testes são analisados e são calculados unidades padronizadas

ISAC para IgE específicos (ISU-E) (141).

8.7. Testes rápidos - Imunocromatografia

Os testes rápidos imunocromatográficos da NADAL são ensaios qualitativos

para a deteção de antigénios específicos de vírus. Existe o teste do vírus Influenza, do

Rotavírus, do Adenovírus, entre outros. Durante a realização do teste, a amostra reage

com a partícula revestida com Acs anti-“vírus”. Os complexos Ag-Ac migram por ação

capilar ao longo da membrana que está pré-revestida com Acs monoclonais direcionados

contra os Ags do vírus da região da linha de teste. No caso de um resultado positivo, ao

fim de 10 min. Surgem duas linhas coloridas (linha controlo e linha teste). No caso de um

resultado negativo surge apenas uma linha colorida (linha controlo). O aparecimento da

linha teste isolada indica um resultado inválido (142).


Stefanie Baptista Higiene e Segurança

112

9. HIGIENE E SEGURANÇA

O LJC segue as normas definidas na legislação, quanto à higiene e segurança. No

que diz respeito ao tratamento dos resíduos existe uma clara organização e gestão de

resíduos hospitalares. Os resíduos hospitalares são diferenciados, segundo o Despacho

N.º 242/96 do Ministério da Saúde, em quatro grupos da seguinte forma (143):

Resíduos não perigosos (Não necessitam de tratamento especial):

Grupo I (Residuos equiparados a urbanos – Ecopontos e lixo comum):

• Resíduos provenientes de serviços gerais como gabinetes, salas de reunião

e de convívio, instalações sanitárias, higiene pessoal, vestiários, etc.

• Embalagens e invólucros comuns

• Resíduos provenientes de atividades de alimentação, resultantes da sua

aquisição, confeção e consumo incluindo restos alimentares não incluídos

no grupo III

• Resíduos provenientes de serviços de apoio como oficinas, jardins,

armazéns, etc.

Grupo II (Resíduos hospitalares não perigosos – Lixo comum):

• Embalagens vazias de medicamentos ou de outros produtos de uso clínico

ou comum, com exceção dos incluídos no grupo II ou no grupo IV

• Fraldas e resguardos descartáveis, papeis protetores de marquesa não

contaminados e sem vestígios de sangue

• Frascos de soro não contaminados, com exceção do grupo IV

Resíduos perigosos:

Grupo III (Resíduos hospitalares de risco biológico – contaminados ou

suspeitos de contaminação):

• Resíduos de provenientes da administração de sangue e seus derivados

• Sacos coletores de fluidos orgânicos e respetivos sistemas

• Material de proteção individual utilizado em cuidados de saúde e serviços

de apoio geral em que exista contato com os produtos contaminados

• Fraldas e resguardos descartáveis contaminados ou com vestígios de

sangue

Os contentores que contêm resíduos perigosos do Grupo III, pretos com tampa

amarela, estão devidamente sinalizados com o símbolo de risco biológico e são usados


Stefanie Baptista Higiene e Segurança

113

sacos brancos. Estes resíduos poderão ser sujeitos a incineração ou outro pré-tratamento

que permita a posterior eliminação como resíduo urbano.

Grupo IV (Resíduos hospitalares específicos – de inceneração obrigatória):

• Materiais cortantes e perfurantes: agulhas, cateteres e todo o material

invasivo

Materiais cortantes considerados resíduos do Grupo IV são acondicionados em

contentores amarelos pequenos imperfuráveis e também assinalados com símbolo de

risco biológico. Estes resíduos são encaminhados para incineração.

Existe uma empresa externa que se encarrega da recolha e transporte dos resíduos

específicos do laboratório.

Formações de higiene e segurança são organizadas periodicamente para todos os

funcionários, de forma a garantir que todos cumpram as normas estabelecidas.


Stefanie Baptista Controlo de Qualidade

114

10. CONTROLO DA QUALIDADE

O Laboratório Dr. Joaquim Chaves apresenta um sistema de gestão da qualidade

com o objetivo de prestar um melhor serviço ao utente, tendo implementado uma política

de qualidade que defende orientações tão importantes tais como a focalização no serviço

prestado ao utente, a monitorização de funções críticas, a aposta na formação e

qualificação das equipas, o desenvolvimento de relações de parceria, a organização

preventiva e a otimização dos recursos para uma Boa Prática e Conformidade Legal (144).

Neste sentido, o LJC implementou Programas de Controlo Interno e Avaliação

Externa da Qualidade, com auditorias internas e externas, com o fim de monitorizarem e

fazerem a aferição do seu desempenho analítico. Atualmente, o Laboratório está

certificado com base na Norma ISO 9001.

Ao nível do Controlo da Qualidade Interno (CQI), o Laboratório seleciona para

cada sistema analítico o procedimento de CQ mais adequado, seguindo as diretrizes

descritas abaixo. O Controlo da Qualidade Estatístico é uma técnica quantitativa que

serve para comparar o desempenho atual de um ensaio com aquele que é esperado quando

está a funcionar em condições estáveis. O seu principal objetivo é assegurar a qualidade

dos resultados laboratoriais, detetando precocemente, os erros, ou seja, a existência de

algum problema com o seu desempenho, antes que os resultados comecem a sofrer

variações clinicamente significativas (145).

Definir os objetivos da Qualidade

Primariamente são definidos os objetivos da qualidade, nomeadamente o erro

máximo tolerado (ETa%, imprecisão e inexatidão máximas admissíveis) para cada

ensaio, tendo por base especificações da qualidade analítica recomendados

hierarquicamente:

• Modelo Clínico e Biológico: requisitos definidos de forma a que os resultados

não tenham impactos negativos nas decisões clínicas.

• Recomendações Profissionais (Guidelines)

• Recomendações de entidades reguladoras (P.e. CLIA e RCPA)

• Modelo baseado no Estado da Arte: extraído dos 20% melhores laboratórios

participantes na AEQ ou de publicações recentes. Reflete o que é alcançável

em vez do que é desejável.



115

Selecionar os materiais de Controlo

Seguidamente são selecionados os materiais de controlo, que podem ter origem

comercial (líquidos ou liofilizados) ou preparados no próprio laboratório a partir de uma

amostra biológica específica ou de um conjunto de amostras representativas. Para a

escolha dos controlos são considerados os seguintes fatores:

- Devem ser estáveis, ter uma matriz homogénea e um comportamento analítico

semelhante ao das amostras biológicas.

- Devem ser de fabricantes diferentes dos fabricantes dos calibradores e dos

reagentes

- A escolha do número de níveis de controlo e sua concentração deve permitir

monitorizar o desempenho do sistema analítico.

Determinar o desempenho do ensaio

O passo seguinte é determinar as características de desempenho do ensaio

(caracterização do estado da arte interno do laboratório):

• Precisão e exatidão. Comparar com:

o Precisão interlaboratorial

o Exatidão (BIAS%)

o EQA requeridas

• Erros (caracterização da instabilidade esperada para o ensaio):

o Natureza: persistentes e intermitentes

o Tipo: sistemáticos/fortuitos ou aleatórios (Tabela d)

o Amplitude ou magnitude

o Frequência com que ocorrem

Imprecisão analítica (CV% ou SD):

A imprecisão é definida como a discordância de valores medidos, obtidos por

medições repetidas no mesmo objeto ou objetos semelhantes em condições específicas,

sendo que na área laboratorial mais propriamente na fase analítica, é definida como a

nível de discordância nos resultados medidos repetidamente no mesmo lote da amostra.

Trata-se do parâmetro crítico mais importante e deve refletir os efeitos de

variabilidade relacionados com:

- Calibrações

- Mudança de reagentes e calibradores

- Manutenção de equipamentos



116

- Diferentes operadores

- Variáveis ambientais (p.e. temperatura e humidade)

A imprecisão analítica é expressa de forma numérica através do desvio padrão (s)

e coeficiente de variação (CV):

Inexatidão analítica (BIAS%):

A inexatidão é a diferença numérica entre o valor medido e o valor verdadeiro.

Trata-se de um parâmetro que exige comutabilidade entre as amostras usadas nos ensaios

de comparação e as biológicas. É importante que os valores “alvo” sejam atribuídos por

um método de referência. Este valor é avaliado por comparação com o valor obtido em

eventos de referência (locais e nacionais ou internacionais).

É recomendável que o laboratório assuma um valor BIAS de zero. Caso se

verifiquem alterações neste valor, deve-se recorrer a:

- Ações corretivas (p.e. calibração)

- Implementação de uma função de correção ou de ajustamento

O BIAS é o parâmetro que avalia o desvio do valor obtido pelo laboratório em

relação ao valor alvo e calcula-se da seguinte forma:

Erro total analítico (Et%):

O erro total analítico representa o erro total máximo que pode ocorrer num

resultado, devido à imprecisão (erro aleatório) e à inexatidão (erro sistemático) do

processo de medição (Figura 62). O erro total é calculado da seguinte forma:

Z - Multiplicador definido com base na distribuição normal reduzida, que varia consoante o nível de

significância escolhido. Normalmente, o erro total é calculado com um nível de significância de 10%

(incluindo 90% da distribuição), o que significa que o valor de Z é de 1,65.



117

Determinar o desempenho esperado para o ensaio e os erros críticos As cartas de controlo mostram se um processo está ou não sob controlo estatístico,

mas também é necessário saber se o processo tem capacidade de produzir de acordo com

as especificações estabelecidas para os diferentes métodos.

Métrica sigma (σ):

A métrica sigma permite determinar a instabilidade esperada para o ensaio com

base nos valores da precisão e exatidão próprias do ensaio em função do erro total

máximo admissível adotado. Apresenta as seguintes características:

- Caracteriza o desempenho esperado do método

- Reflete o número de erros inaceitáveis esperados

- Mostra se o desempenho estável do método é adequado para atingir as

metas requeridas

A métrica sigma é calculada da seguinte forma:

σ =(Eta%−BIAS%)

𝐶𝑉% ou σ =

ETa%

𝐶𝑉%

(Na prática assume-se que BIAS=0)

Estratégia de CQI

A estratégia de CQI é definida por:

• Tipo de materiais de controlo (número de níveis e as concentrações –

recomendável 2 níveis no mínimo)

• Número de determinações realizadas nas amostras CQ (recomendável 2

determinações para 2 níveis e 3 para 3 níveis)

Figura 62. Representação esquemática do erro total [Adaptado de (146)].



118

• Localização e frequência dos eventos de CQ (devem anteceder a análise das

amostras dos pacientes)

• Regras e limites de CQ (critério de decisão estatístico)

É importante delinear a estratégia de CQI para cada ensaio, equilibrando os

componentes estatísticos e não estatísticos. Inclui-se nos componentes não estatísticos os

seguintes:

• Boas práticas laboratoriais

• Cumprir as instruções dos fabricantes

• Formação dos operadores

• Manutenção dos equipamentos.

Avaliação Externa da Qualidade (AEQ)

A AEQ avalia o desempenho dos sistemas analíticos de um laboratório, por meio

de programas interlaboratoriais realizados por uma entidade externa. Ao participar nestes

programas, o laboratório pretende assegurar que os resultados que obtém para os diversos

parâmetros analisados se aproximam do valor real, através de comparação entre os

laboratórios e promove a confiança nos resultados por parte de todas as partes

interessadas, nomeadamente pessoal do laboratório, utentes e clínicos.

O LJC participa em programas de AEQ, nomeadamente o PNAEQ (Programa

Nacional de Avaliação Externa da Qualidade), promovido pelo INSA (Instituto Nacional

de Saúde Dr. Ricardo Jorge), e o programa do Serviço Nacional de Avaliação Externa da

Qualidade do Reino Unido (UK-NEQAS, do inglês, United Kingdom National External

Quality Assessment Service). Similarmente ao que sucede para o CQI, também no caso

da AEQ existe um plano que descreve o desempenho de cada área analítica para cada

parâmetro.

A execução dos ensaios é feita, sempre que possível, logo após receção das

amostras de modo a cumprir os requisitos de estabilidade e está sujeita aos mesmos

critérios de execução das amostras de rotina. Normalmente os resultados obtidos são

enviados por e-mail ou submetidos no site. Qualquer resultado inaceitável deve ser

investigado e as medições corretivas documentadas.

Todos os resultados do CQI e AEQ são compilados pelo coordenador de controlo

de qualidade, que elabora um relatório mensal a ser avaliado pela Direção Técnica do

LJC, com conhecimento da Administração.


Stefanie Baptista Bibliografia

119

BIBLIOGRAFIA

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Parte III





CONGÉNITA


Monografia orientada pela Professora Doutora Quirina dos Santos Costa


2018

IX Mestrado Análises Clínicas Parte III

Stefanie Baptista Resumo

131

Resumo

O estudo da coinfecção Leishmaniose-HIV em mulheres grávidas: prevenção da

transmissão vertical e infeção congénita.

De acordo com a Organização Mundial de Saúde, a coinfecção Leishmaniose-HIV

já foi reportada em mais de 35 países, sendo particularmente importante a Este de África,

no Sudeste da Ásia e na América Latina. Esta coinfecção pode manifestar-se na forma

visceral, cutânea e mucocutânea, sendo a segunda a mais comum. No que diz respeito à

mulher grávida, a infeção por HIV torna-a mais suscetível a complicações,

nomeadamente, parto prematuro, limitação do crescimento uterino, desenvolvimento de

anemia severa, aborto e taxa de mortalidade materna e neonatal superiores.

Adicionalmente, a Leishmaniose manifesta-se através de hepatoesplenomegalia marcada,

perda de peso significativa, adinamia, anemia acentuada e hemorragia.

A coinfecção induz um défice nas respostas humorais e celulares do hospedeiro,

limitando o valor de diagnóstico dos testes serológicos nos indivíduos coinfetados. Ainda

assim, o Teste de Aglutinação Direto, o Western Blot e o Teste de aglutinação de látex

podem ser utilizados no diagnóstico destes casos. Todas as terapêuticas para a

Leishmaniose são menos eficazes em indivíduos seropositivos para HIV. Existe uma alta

taxa de mortalidade devido à coexistência das doenças, a complicações e à toxicidade dos

fármacos. De forma a prevenir a infeção congénita, deve ser combinada a Terapêutica

Antirretroviral com a terapêutica para Leishmaniose na mulher grávida.

Nesta monografia, é feita uma revisão acerca dos desafios atuais da coinfecção

Leishmaniose-HIV, com foco principal nas manifestações clínicas, diagnóstico e

tratamento da Leishmaniose.

Palavras-chave: Leishmaniose, HIV, Coinfecção, Epidemiologia, Manifestações

Clínicas, Diagnóstico, Tratamento


Stefanie Baptista Abstract

132

Abstract

The study of Leishmaniasis-HIV coinfection in pregnant women: prevention of

vertical transmission and congenital infection.

According to the World Health Organization, Leishmaniasis-HIV coinfection has

been reported in more than 35 countries, particularly in East Africa, Southeast Asia and

Latin America. This coinfection may manifest in the visceral, cutaneous and

mucocutaneous forms, the second being the most common. To pregnant women, HIV

infection makes them more susceptible to complications, such as premature birth, delay

in the intrauterine growth, development of severe anemia, miscarriage, and higher

maternal and neonatal mortality rates. In addition, Leishmaniasis manifests through

marked hepatosplenomegaly, significant weight loss, adynamia, marked anemia and

hemorrhage.

This coinfection induces a deficit in the host's humoral and cellular responses,

limiting the diagnostic value of serological tests in coinfected patients. However, Directo

Agglutination Test, Western Blot and Latex Agglutination Test can be used in the

diagnosis of these cases. All therapies for Leishmaniasis are less effective in HIV positive

patients and there is a high mortality rate due to the coexistence of diseases, complications

and drugs toxicity. In order to prevent congenital infection, Antiretroviral Therapy should

be combined with Leishmaniasis therapy in pregnant women.

In this monography, a review is made from the current challenges of

Leishmaniasis–HIV coinfection, focusing mainly on the clinical manifestations, diagnosis

and treatment of Leishmaniasis.

Keywords: Leishmaniasis, HIV, Coinfection, Epidemiology, Clinical Manifestations,

Diagnosis, Treatment


Stefanie Baptista Objetivos

133

Objetivos

O objetivo da presente monografia passa por analisar a situação da coinfecção por

Leishamania sp e Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV, do inglês, Human

Immunodeficiency Virus), nomeadamente no contexto da mulher grávida, e compreender

o efeito da infeção pelo parasita na transmissão vertical do vírus. Pretende-se ainda

enunciar de que formas a infeção congénita pode ser prevenida, revendo o tratamento

utilizado presentemente para esta coinfeção.


Stefanie Baptista Material e Métodos

134

Material e Métodos

Para a execução desta monografia foram consultadas várias páginas na internet

para a análise e interpretação de vários artigos científicos originais e de revisão,

publicados entre 1991 e 2017.

A pesquisa bibliográfica foi realizada no período compreendido entre fevereiro e

dezembro de 2017. Como fontes de pesquisa foram utilizadas a plataforma Pubmed

(www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/) e as páginas de internet do Centro de Controlo e

Prevenção de Doenças (CDC, do inglês, Centers for Disease Control and Prevention)

(www.cdc.gov) e Organização Mundial de Saúde (WHO, do inglês, World Health

Organization) (http://www.who.int/en/). Para iniciar a procura bibliográfica utilizaram-

se as seguintes palavras-chave: Leishmania sp, HIV, Coinfecção, Gravidez, Revisão.



135

INTRODUÇÃO

A Leishmaniose continua a ser uma das mais negligenciadas doenças do mundo,

afetando os mais pobres, maioritariamente nos países em desenvolvimento (1). Trata-se

de uma doença causada por um parasita protozoário do género Leishmania (Figura 1),

que pertence à família Trypanosomatidae e que apresenta mais de 20 espécies. Este

parasita é transmitido aos humanos através da picada de fêmeas de pequenos insetos do

género Phlebotomus (Figura 2) e do género Lutzomyia (mais de 90 espécies conhecidas

transmitem o parasita) (2–5).

Existem três principais manifestações clínicas de Leishmaniose: Leishmaniose

Visceral (LV) também conhecida como Kala-azar; Leishmaniose Cutânea (LC), a forma

mais comum de Leishmaniose, que causa lesões cutâneas; e Leishmaniose Mucocutânea

(LM), levando à destruição parcial ou total das mucosas do nariz, boca e garganta (2).

Para além da transmissão por vetor, a infeção pode ainda ser transmitida através

de seringas partilhadas por toxicodependentes, transfusão sanguínea, infeções venéreas e

através de infeção congénita, ainda que estas mostrem ser muito raras em comparação

com a transmissão por vetor (3).

A infeção por Leishmania sp durante a gravidez é rara, mas merece especial

atenção, uma vez que os casos tornam-se cada vez mais frequentes nas zonas endémicas

e ainda existe pouca informação disponível (6). O potencial fisiopatológico da infeção

por Leishmania sp durante a gravidez tem sido desconsiderado comparativamente a

outros parasitas. Contudo, evidências recentes da pesquisa de doenças infeciosas,

obstétricas e imunológicas aumentaram a compreensão da distribuição anatómica do

Figura 1. Formas promastigotas de Leishmania sp em cultura (1000x). [Adaptado de (4)].

Figura 2. Phlebotomus papatasi, flebótomo responsável pela transmissão do parasita Leishmania

[Adaptado de (5)].



136

parasita, bem como a resposta imune do hospedeiro em relação a esta população

específica. Estes recentes avanços são paradigmas quanto ao impacto da resposta

imunológica materna à infeção na saúde do feto (7).

O Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV, do Inglês, Human Immunodeficiency

Virus) continua a ser um grande problema de saúde pública global. Trata-se de um

retrovírus direcionado para o sistema imunológico e que enfraquece os sistemas de defesa

contra infeções e alguns tipos de cancro (Figura 3). À medida que o vírus destrói e

prejudica a função das células de defesa, os indivíduos infetados tornam-se gradualmente

imunodeficientes, sendo a função imunológica medida pela contagem de células T CD4+

(8,9). A imunodeficiência resulta no aumento da suscetibilidade a uma grande panóplia

de infeções, nomeadamente a Leishmaniose, cancro e outras doenças que pessoas

saudáveis podem combater (8). O estágio mais avançado da infeção por HIV é a Síndrome

da Imunodeficiência Adquirida (SIDA), que pode demorar 2 a 15 anos a desenvolver-se,

dependendo do indivíduo. A SIDA é definida pelo desenvolvimento de certos tipos de

cancro, infeções ou outras manifestações clínicas severas (8).

Os sintomas da infeção por HIV variam dependendo do estágio da infeção, sendo

que nas primeiras semanas após a mesma, os indivíduos infetados podem ser

assintomáticos ou demonstrar febre, dores de cabeça, erupção cutânea ou dor de garganta.

Com o progresso da infeção, outros sinais e sintomas surgem, tal como aumento dos

nódulos linfáticos, perda de peso, febre, diarreia e tosse. Sem tratamento, estes doentes

Figura 3. Estrutura do HIV. É possível ver o antigénio gp120, a bicamada lipídica, a matriz

proteica, as proteínas do core, o RNA e a

transcriptase reversa. [Adaptado de (9)].



137

podem desenvolver doenças graves como tuberculose, meningite criptocócica, infeções

bacterianas graves, linfoma, Sarcoma de Kaposi, entre outras (8).

O HIV pode ser transmitido através da troca de fluidos corporais de indivíduos

infetados, tais como sangue, leite materno, sémen e secreções vaginais. Não existe

transmissão através do contato comum como beijar, abraçar, apertar as mãos ou

compartilhar objetos pessoais, alimentos ou água (8).

No caso da mulher grávida, existe uma relação diretamente proporcional entre

maiores cargas virais e um maior risco de transmissão. Assim, a carga viral materna é o

melhor fator preditivo de transmissão perinatal do HIV. As mulheres grávidas

seropositivas para HIV estão mais suscetíveis a complicações, nomeadamente, partos

prematuros, limitação do crescimento uterino, desenvolvimento de anemia severa, aborto

e taxa de mortalidade materna e neonatal superiores, em comparação com mulheres não

infetadas com o vírus (10,11).

A coinfecção entre Leishmania sp e HIV é prevalente em zonas de sobreposição

de ambas as infeções, sendo particularmente importante a Este de África, no Sudeste da

Ásia e na América Latina (12,13). A maioria dos estudos sobre a coinfecção está

relacionada com a LV e o HIV, pouco se sabe sobre a situação atual da coinfecção LC-

HIV (ou outras manifestações clínicas da Leishmaniose). De facto, o HIV acabou por

afetar a ocorrência de Leishmaniose, nomeadamente a LV, já que aumenta o risco de

desenvolver LV em 100 a 2320 vezes em áreas endémicas, reduz a probabilidade de uma

resposta terapêutica e aumenta consideravelmente a probabilidade de recaída. Ao mesmo

tempo, a LV promove a progressão clínica da doença por HIV e desenvolvimento de

SIDA. Existem alguns fatores relacionados com o hospedeiro e com o ambiente que

podem influenciar a prevalência de LV-HIV. Ambas as doenças exercem um efeito

prejudicial sinérgico na resposta imunológica celular porque atingem células

semelhantes. Este facto contribui para a replicação de ambos os patogénicos, acelerando

a progressão da LV e do HIV. Assim, a imunossupressão é também um importante fator

para o desenvolvimento da LV em indivíduos com HIV que vivem em zonas endémicas

para a doença. Outro fator importante está associado à migração, quando indivíduos se

tornam infetadas em áreas urbanas e posteriormente retornam às áreas rurais onde a LV

é prevalente (12,13).

J. Lauletta et al. assumiram que a maioria dos casos de Leishmaniose ocorrem em

indivíduos seropositivos para HIV porque algumas manifestações clínicas podem ser

confundidas com as de outras infeções oportunistas em indivíduos imunossuprimidos



138

com lesões viscerais ou cutâneas (13). Em geral, é aceite que a incidência global da

coinfecção é subestimada, em parte porque a LV ocorre em populações negligenciadas e

ainda porque não consta na lista de infeções oportunistas do Centro de Controlo e

Prevenção de Doenças (CDC, do inglês, Centers for Disease Control and Prevention) de

modo que raramente é relatada em sistema de notificação de SIDA. Contudo existem

ainda muitas questões por esclarecer relacionadas com a coinfecção Leishmania-HIV e

indiscutivelmente no que diz respeito à coinfecção na mulher grávida.


Stefanie Baptista Epidemiologia

139

1. EPIDEMIOLOGIA

A Organização Mundial de Saúde (WHO, do Inglês, World Health Organization)

estima que 700 000 a 1 milhão de novos casos de Leishmaniose e 20 000 a 30 000 mortes

provocadas pela mesma ocorrem anualmente. De todos os indivíduos infetados com

Leishmania sp, apenas uma pequena fração desenvolverá eventualmente a doença (2).

Segundo os dados de 2016 do Observatório Global de Saúde (GHO, do Inglês Global

Health Observatory data), a Leishmaniose é endémica em 97 países e territórios (14). A

doença afeta maioritariamente pessoas pobres em África, Ásia e América Latina, estando

associada a malnutrição, deslocação populacional, habitação pobre, sistema imunológico

fraco e falta de recursos. A disseminação da doença está associada a mudanças ambientais

tais como a desflorestação, a construção de barragens, a canais de irrigação e a

urbanização (2).

A LV é fatal em 95% dos casos não tratados e fortemente endémica na Índia e a

Este de África, com uma estimativa de 50 000 a 90 000 novos casos por ano, no mundo

inteiro. Em 2015, mais de 90% dos novos casos de LV reportados à WHO ocorreram em

7 países: Brasil, Etiópia, Índia, Quénia, Somália, Sul do Sudão e Sudão (Figura 4) (2,15).

Relativamente à LC, 95% dos casos ocorrem na América, Mediterrâneo, Médio

Oriente e Ásia Central. Mais de dois terços dos novos casos de LC ocorrem em 6 países:

Figura 4. Endemicidade da LV no mundo em 2015, segundo a WHO. [Adaptado de (2)].



140

Afeganistão, Argélia, Brasil, Colômbia, Irão e Síria. A estimativa é de 0,6 a 1 milhão de

novos casos por ano, no mundo todo. No que diz respeito à Leishmaniose Mucocutânea,

mais de 90% dos casos ocorrem na Bolívia, Brasil, Etiópia e Peru (2,15).

O HIV já tirou mais de 35 milhões de vidas até ao momento. Segundo a WHO,

estima-se que mundialmente 0,8% das pessoas entre os 15 e 49 anos são seropositivos

para HIV (Figura 6). Em 2016, 1 milhão de pessoas morreram por causas relacionadas

com o HIV, aproximadamente 36,7 milhões de pessoas viviam com o mesmo e 1,8

milhões de novos casos de infeção surgiram nesse ano. De todas as pessoas que vivem

com HIV, 54% dos adultos e 43% das crianças estão a receber Terapêutica Antirretroviral

(ART, do Inglês, Antiretroviral Therapy) ao longo da vida, sendo que 76% de mulheres

grávidas e a amamentar recebem ART. A região mais afetada pela infeção, com 25,6

milhões de pessoas infetadas em 2016, é África (8).

A transmissão vertical do HIV pode ocorrer em qualquer altura na gravidez,

durante o parto ou amamentação. Todavia, se a mulher fizer ART na fase inicial na

gravidez, o risco de transmissão vertical pode ser reduzido para 1% ou menos. Segundo

uma estimativa do CDC em 2006, aproximadamente 8 500 mulheres infetadas com o HIV

dão à luz anualmente e, entre 1994 e 2010, foram prevenidos cerca de 21 956 casos de

transmissão vertical (16).

Figura 5. Endemicidade da LC no mundo em 2015, segundo a WHO [Adaptado de (2)].



141

Claramente, analisando as Figuras 4,5 e 6 é possível observar uma sobreposição

entre as áreas de transmissão de HIV e Leishmania sp. O primeiro caso de coinfecção foi

reportado em 1985, tendo posteriormente aumentado rapidamente o número de casos no

sul da Europa. Até ao momento, 35 países já reportaram casos de coinfecção. Após a

introdução da ART, o número de casos coinfetados em países europeus onde a doença é

endémica desceu acentuadamente. No entanto, o problema expandiu-se para outros focos

importantes de Leishmaniose no mundo, devido à sobreposição das duas doenças (12,13).

1.1. Europa

Na Europa, na região mediterrânea, a Leishmaniose é causada pelo protozoário

Leishmania infantum e transmitida pelo inseto do género Phlebotomus. Adicionalmente,

L. donovani foi recentemente identificada como agente etiológico em casos de LV no

Chipre e Turquia. A LV é a principal forma de doença e ocorre em áreas rurais, aldeias

em regiões montanhosas e também em algumas zonas de periferia da cidade, onde os

parasitas vivem principalmente em cães (2).

Curiosamente, foi demonstrado que a deteção de parasitemia por PCR em

amostras de sangue periférico é muito mais frequente nos indivíduos coinfetados com

Leishmania-HIV do que naqueles com Leishmania sp não infetados com HIV (17). Desde

que a WHO descontinuou a sua base de dados em 2006, já não existe acompanhamento

Figura 6. Prevalência do HIV nos adultos de idades compreendidas entre os 15 e os 49 anos, em 2016,

segundo a WHO [Adaptado de (8)].



142

dos dados da coinfecção. Desde então, a WHO tem feito esforços para estabelecer um

programa em áreas selecionadas da Europa (17).

Um estudo da WHO que envolveu 16 instituições, monitorizou a coinfecção

Leishmania-HIV no Sul da Europa, desde 1994. Os casos reportados mostraram que 4

países estavam maioritariamente envolvidos: França, Itália, Portugal e Espanha. A grande

maioria dos cados foram detetados em Espanha, podendo este facto estar relacionado com

a reativação de infeções assintomáticas, juntamente com o facto de apresentar uma maior

área geográfica de sobreposição entre as duas infeções, quando comparada com outros

países do sul da Europa. Para além disso, foi também demonstrado que novas infeções

ocorreram em toxicodependentes que partilhavam seringas infetadas com Leishmania sp.

Em 2001, de todos os casos reportados, 57% eram provenientes de Espanha. A análise de

todos os casos por localização geográfica mostrou que 75% dos indivíduos viviam em

áreas de costa urbana com alta densidade populacional relativa, tendo sugerido

posteriormente uma distribuição progressiva dos casos das áreas urbanas para as rurais

(12).

Um claro decréscimo na incidência da coinfecção foi observado no fim dos anos

90, cuja causa pode ser atribuída à utilização de ART na maior parte do sul da Europa,

desde 1997. No período de 2001 a 2006, foram reportados 241 novos casos provenientes

de Espanha (n=95), Portugal (n=64), Itália (n=52) e França (n=30). Outros países como

a Suíça, a Alemanha, o Reino Unido e a Grécia reportaram esporadicamente casos

importados. A diminuição da incidência devido à ART não se verificou em Portugal,

onde, por causas desconhecidas, 107 casos de coinfecção e 173 casos de LV foram

reportados no período de 2000 a 2009 (12,17).

LV e LC adquiridas na região mediterrânea, em países como a Grécia, França,

Espanha, Itália, Portugal, Turquia e Croácia, que são considerados destinos turísticos,

foram importadas para países do norte da Europa. Para além disso, foram descritos casos

importados para a região mediterrânea, maioritariamente LC adquiridos por viajantes da

América Central e do Sul (17).

A média das idades dos indivíduos coinfetados foi de 38,6 anos (n=965), de 1990

a 1998, e 38,9 anos, de 2001 a 2006. A distribuição por género foi similar em ambos os

períodos, sendo a prevalência nos homens superior à das mulheres (83,2% e 88,5

respetivamente). Quanto aos fatores de risco, verificou-se uma diminuição relativa dos

casos de coinfecção relacionada com a utilização de drogas intravenosas um aumento

relativo entre a população heterossexual na Europa Ocidental. Quanto à



143

homossexualidade, os valores são similares em ambos os períodos. No que diz respeito a

fatores imunológicos, ainda que os indivíduos fossem severamente imunodeprimidos em

ambos os períodos, o número de células CD4+ era inferior de 1990 a 1998 (12).

1.2. Ásia

Na Ásia, a Leishmaniose é causada pelo protozoário Leishmania donovani e

transmitida pelo inseto do género Phlebotomus. Adicionalmente, L. tropica é também

identificada como agente etiológico na Índia. No Sudeste Asiático, a LV é a principal

forma da doença. A transmissão geralmente ocorre em áreas rurais com chuvas anuais

fortes, humidade média acima dos 70%, temperatura de 15-38ºC, vegetação abundante,

águas de subsolo e com solo aluvial. A doença é mais comum em aldeias agrícolas onde

as casas são frequentemente construídas com paredes e pisos de barro e o gado vive perto

das pessoas. O humano é considerado o único reservatório dos parasitas nesta região (2).

A Ásia é o maior foco de LV do mundo, mais propriamente o Sul da Ásia, com

67% do total dos casos de Leishmaniose. Segundo a WHO, em 2016, o Bangladesh, a

Índia e o Nepal reportaram 6 558 casos no total (12,18–21). Apesar destes números, os

casos de LV diminuíram bastante nos últimos anos. No Bangladesh, diminuíram de 9 379

em 2006 para apenas 159 em 2016 e a mortalidade permaneceu em torno de 1% ou abaixo,

indicando que o país está perto de eliminar a doença como um problema de saúde pública.

Na Índia, diminuíram de 39 173 em 2006 para 6 249 em 2016. No Nepal, os casos

diminuíram de 1 531 em 2006 para 150 em 2016. Esta impressionante conquista é o

resultado de uma combinação de fatores que incluem a disposição da população para

apoiar atividades e monitorização de vigilância, crucial para o sucesso do Programa

Nacional de Eliminação de Kala-Azar (NKEP, do inglês, National Kala-Azar Elimination

Program) desde o seu lançamento em 2005 (18–20,22).

A reemergência da doença nos anos de 1970 deveu-se à existência de indivíduos

com Leishmaniose Dérmica Pós Kala-Azar (LDPK) residual, protegendo assim os

parasitas na pele. Adicionalmente, uma diminuição da imunidade adquirida pode explicar

a periodicidade dos picos de incidência de LV a cada 10 a 15 anos. No passado, a maioria

dos casos verificavam-se em adultos, mas agora são reportados muitos mais casos em

crianças e adolescentes afetados, isto é, em indivíduos imunocomprometidos.

Quanto à infeção por HIV, 3,5 milhões de pessoas vivem com a mesma no Sudeste

da Ásia, segundo uma estimativa da WHO em 2016 (23).



144

Vários casos de coinfecção Leishmania-HIV têm sido reportados desde 1999,

sendo que indivíduos com LDPK podem representar um importante reservatório de

parasitas com um alto potencial de ser transmitidos através do vetor e causar infeção a

nível da comunidade. Contudo, apesar da extensão da sobreposição entre ambas as

infeções continuar a ser limitada, o potencial para a coinfecção nestes focos é muito alta,

especialmente porque os infectados nesta zona apresentam uma alta taxa de resistência à

terapêutica para Leishmaniose (12).

1.2.1. Índia

Curiosamente, nenhum caso de coinfecção de Leishmania-HIV foi reportado na

Índia até 1999. Muito provavelmente porque a epidemia do HIV permaneceu localizada

a Oeste e Sul do país, onde a Leishmaniose não se verifica. O primeiro caso de LV-HIV

foi publicado em 1999 e tratava-se de um paciente que tinha sido diagnosticado com

tuberculose já que nunca se suspeitou de kala-azar naquela área não endémica para

Leishmaniose. É interessante notar que os coinfetados na Índia apresentaram

manifestações atípicas, tais como Leishmaniose Pós Kala-Azar Mucocutânea (PKML),

LV-HIV com úlceras orais ou casos com linfoadenopatia cervical (24).

Até 2014, um total de 89 casos de LV-HIV foram publicados, tendo sido

provenientes dos estados de Bihar, Bombai e Uttarakhand. Destes, 28 foram relatados nos

primeiros 10 anos (1997 a 2006) após o primeiro caso diagnosticado em 1997, e de 2007

até 2014, foram adicionados 61 novos casos. Nos segundos 9 anos de relatórios desta

coinfecção (2007 a 2013), 197 332 casos de VL e 2,1 milhões de casos de HIV foram

reportados ao Governo da Índia. Foram ainda reportados 5 casos de LC-HIV e 5 casos de

LC difusa (LCD)-HIV, provenientes da zona endémica de Rajasthan, de Kerala e de

Karnataka (24).

Assim, a taxa de coinfecção nestes anos é estimada em apenas 0,029%. Apesar de

ter aumentado nos últimos anos, esta taxa permanece muito baixa em comparação com

outras regiões co endémicas de LV e HIV, como o Sul da Europa (20-40%) e alguns

países africanos (até 70%). Mesmo calculando a taxa de casos de HIV e LV apenas para

os estados endémicos de LV, Bihar e Jharkhand, isso representa apenas 6,86% por ano

(24).

Poderão existir vários motivos para esta baixa taxa de coinfecção na Índia. O mais

importante diz respeito à baixa taxa de uso de drogas intravenosas em áreas endémicas

de LV e a predominância de populações ortodoxas no norte da Índia, que justifica uma



145

disseminação lenta do HIV em comparação com o Oeste e Sul do país. Nos estados

endémicos de LV, a taxa de incidência do HIV permaneceu <0,3%, enquanto nos estados

do Sul da Índia e Maharashtra, manteve-se entre 0,5% e 1,2% (24).

1.3. América

Na América, a Leishmaniose é causada pelos protozoários L. guyanensis, L.

amazonensis, L. braziliensis, L. infantum, L. lainsoni, L. shawi, L. naiffi, L. lindenbergi,

L. panamensis, L. colombiensis, L. mexicana e L. peruviana e transmitida pelo inseto do

género Lutzomyia. A LV é similar à encontrada na zona mediterrânea, já que o hábito de

ter cães e outros animais domésticos dentro de casa promove a infeção humana (2).

A Leishmaniose Cutânea e Mucocutânea ocorre em 20 países, sendo endémica

em 18 deles, com diferentes intensidades de transmissão: baixa, média, alta, intensa e

muito intensa. No período de 2001 a 2015 foram reportados à Organização Pan-

Americana da Saúde (PAHO, do Inglês, Pan American Health Organization)/WHO, 843

931 novos casos de LC e LM com uma média anual de 56 262 casos, distribuídos em 17

dos 18 países endémicos. Observa-se uma redução dos casos nos últimos 5 anos, sendo

que em 2015 foi registado o menor número para todo o período analisado, com um

decréscimo de 10% em relação a 2014. Em 2015, 17 dos 18 países endémicos reportaram

46 082 casos de LC e LM. Do total de casos da região, 70% foram reportados pelo Brasil

(19 395), Colômbia (7 541) e Peru (5 459). A taxa de incidência da América foi de 18,35

casos por 100 000 habitantes, e as maiores incidências foram registadas no Suriname

(218,48/100 000 habitantes) e em Nicarágua (76,64/100 000 habitantes). A população

primariamente afetada são os homens (61,7%) e 36% são crianças com menos de 5 anos

(25,26).

A SIDA é considerada uma doença emergente na América devido à sua

distribuição geográfica e extensão de população afetada (25). De acordo com os dados de

2016 da WHO, 3,3 milhões de pessoas vivem com HIV neste continente (23).

A disseminação do HIV para as áreas rurais e a urbanização da transmissão da L.

infantum pode ter influenciado a história natural das doenças causadas por estas infeções,

incluindo o aceleramento da progressão de ambas (25).

O primeiro caso de coinfecção Leishmania-HIV na América foi reportado no

Brasil, em 1990. Diferentemente do que acontece na Europa, no continente Americano a

via sexual é o principal meio de transmissão de HIV entre os indivíduos coinfetados com

LV-HIV (25).



146

Apesar da coinfecção LV-HIV ser um problema na América, este tem sido

ignorado e pouco reportado (25).

1.3.1. Brasil

Segundo a WHO, foram reportados 3 336 casos de LV e 12 886 casos de LV em

2016, no Brasil (21). A LC é amplamente distribuída, enquanto que a LV é endémica nas

regiões a Norte, contando com 87% de todos os casos. Ainda assim, a LV está a expandir-

se para o Centro Oeste, Norte e Sul do país. Preocupante é verificar-se o processo de

urbanização da transmissão do parasita, estando a doença a expandir-se para cidades

importantes como o Rio de Janeiro, Belo Horizonte, Santarém, Teresina, Natal e Fortaleza

(12).

O Brasil é o epicentro da epidemia de HIV na América do Sul, onde um terço de

todas as pessoas com HIV desta região vive (25). O primeiro caso foi reportado em 1983

e, segundo os dados de 2016 da WHO, é estimado que 830 000 pessoas vivem com HIV

(27).

De 2001 a 2005, 16 210 casos de LV foram reportados no Brasil e destes, 315

(2%) estavam coinfetados com HIV. Dos indivíduos coinfetados, 78% eram homens e a

média das idades era 38 anos; 56,3% das infeções foram atribuídas a transmissão

heterossexual. Quanto às manifestações clinicas, 43% são LMC, 37% LV e 20% LC.

Verificaram-se 8% de casos com manifestações atípicas e 24% de casos fatais por

ausência de tratamento ART (12).

Quanto à LC, 150 000 casos foram reportados de 2001 a 2005, sendo que 150

(0,1%) eram HIV positivos. É interessante que a LMC é frequentemente observada em

indivíduos coinfetados com HIV (43%), algo que acontece raramente no Sul da Europa

(12).

1.4. África

Em África, a Leishmaniose é causada pelo protozoário Leishmania donovani e

transmitida pelo inseto do género Phlebotomus, sendo o humano o principal reservatório

do parasita. Existem surtos frequentes de LV na África Oriental, nas savanas do Norte e

nas savanas e florestas do Sul, onde os flebótomos vivem junto às térmitas. A LC ocorre

nas terras altas da Etiópia e em outros locais onde o aumento do contato

humano/flebótomo ocorre em aldeias construídas à beira-rio (2).

Segundo os dados da WHO de 2016, 25,6 milhões de pessoas vivem com HIV em

África, sendo a maior região afetada do mundo, especialmente entre mulheres jovens. De



147

todas as mulheres grávidas que vivem com HIV, 75% recebem fármacos para prevenir a

transmissão de mãe para filho (8).

1.4.1. Burkina Faso

Casos esporádicos de LC têm sido reportados em Burkina Faso desde 1953 a

1984, mas a incidência aumentou nos anos recentes:1 194 em 2003, 901 em 2004, 827

casos em 2005 e 947 em 2013 (12,21). O aumento de casos desde 2000 em consequência

do desenvolvimento de um novo distrito numa área rural perto da capital Ougadougou

ficou conhecido como “Ouaga 2000”. O pico de incidência ocorre entre agosto e

setembro, sobrepondo-se com o pico sazonal da malária, e verifica-se a ocorrência de

casos em todas as faixas etárias, sendo a prevalência igual entre homens e mulheres (12).

Quanto à infeção por HIV, segundo a estimativa da WHO de 2016, a prevalência

é de 95 000 em Burkina Faso (27).

Dos 70 casos “Ouaga 2000”, 10 eram coinfetados com HIV. Num estudo

prospetivo de 32 coinfetados foram encontradas várias manifestações atípicas de LC,

incluindo a forma tipo lepra e difusa (n=15), ulcerativa (n=14), infiltrativa (n=12),

papulonodular (n=9), tipo psoríase (n=5), tipo sarcoma de Kaposi (n=1), queloied (n=1)

e histiode (n=1) (12).

Observou-se que após tratamento para a Leishmaniose, os indivíduos coinfetados

tiveram recaídas clínicas, requerendo tratamentos repetidos (12).

1.4.2. Etiópia

Apesar da incompleta informação epidemiológica da Leishmaniose na Etiópia,

existem casos reportados desde a década de 1940. A doença é maioritariamente

prevalente em zonas baixas e áridas e a incidência em 2015 foi de 2 080 casos (21). As

seis áreas endémicas identificadas são o Noroeste (Metema, Humera, Wolkayit e

Libo/Fogera), Nordeste (Awash Valley e fronteira Ethio-Djibouti) Sul e Sudoeste (Dawa,

Genale, Gelana, Segen, Woito, Konso e Omo River Valley), a fronteira do Kenuanr e a

fronteira Gambela-Sudão.

O primeiro caso HIV-positivo foi reportado em 1984 e, segundo os dados de 2016,

a WHO estima que 710 000 pessoas vivem com o vírus na Etiópia (12,27).

Em Humera (Noroeste da Etiópia), a proporção de coinfetados aumentou de

18,5% em 1998-1999 para 40% em 2006. Numa revisão de 791 casos em Tigray,

observou-se que o número de casos fatais em coinfetados LV-HIV foi quatro vezes

superior ao referente a indivíduos com LV não infetados com HIV. Na Libo, 15 a 18%



148

de todos os casos de LV são seropositivos para HIV. Os grupos de alto risco para a

coinfecção são os trabalhadores que migram sazonalmente, trabalhadores de sexo, jovens

adultos em áreas de realojamento, condutores de transportes públicos e militares nas

fronteiras (12).

1.4.3. Somália

Em 2016 foram reportados à WHO 781 casos de LV na Somália (21). A guerra

civil promoveu a emergência de Leishmaniose nos estados do Sul, Bakool, Gedo e Bay.

Bakool é particularmente conhecido como região altamente endémica para LV e já teve

vários surtos da doença. Sabe-se que houve um importante surto de LV, tendo sido

reportados pelos Médicos Sem Fronteiras da Bélgica (MSF-Bélgica) 263 casos em 2005

e 1 300 casos em 2006. Contudo, ainda não foram reportados casos de coinfecção LV-

HIV (12,28).

1.4.4. Uganda

Em 2016, foram reportados à WHO 29 casos de LC e 692 casos de LV no Uganda

(21). A única área documentada onde a LV é endémica é Pokot County, no distrito de

Nakapiripirit, a Nordeste da região do Karamoja. Trata-se de uma extensão do foco de

endemicidade de distritos do Quénia. Não existe programa de controlo nacional, sendo

os casos monitorizados pelos Médicos Sem Fronteiras da Suíça (MSF-Suíça), que

trataram mais de 2 500 doentes no Hospital Amudat de 2000 a 2006. Aproximadamente

70% destes doentes eram provenientes do Quénia. A proporção de homens/mulheres

infetados era de 3:1 e mais de 60% tinham menos de 15 anos de idade. Foram confirmados

8 casos de LV-HIV pelos MSF-Suíça, sem outros dados até à data. Porém, os conflitos

locais podem ter exacerbado a situação e elevado o potencial de coinfecção no país (12).

1.4.5. Quénia

O Quénia apresenta um historial de Leishmaniose, com vários focos reportados:

Oeste de Pakot, Baringo, Mandera, Garissa e Mwingi. Houve um surto em 2006, a Norte

do Quénia, em Wajir e Issiolo, que afetou muitas crianças (n=48; 95% com idade <5

anos). Em 2016, foram reportados a WHO 29 casos de LC e 692 casos de LV (12,21).

Em 2006, 15 casos de coinfecção LV-HIV foram reportados e o risco de

coinfecção está a aumentar (12).

1.4.6. Sudão

A maior área endémica de Leishmaniose no Sudão localiza-se a Sudeste do país,

na fronteira com a Etiópia. Verificaram-se episódios recorrentes de epidemias com taxas



149

elevadas de mortalidade, como em 1989 (12). Segundo a WHO, em 2016 houve 2 011

casos de LC reportados e 3 810 casos de LV. É interessante notar que apesar de a infeção

ser maioritariamente causada por L. donovani, também ocorre por L. infantum. A

transmissão é feita basicamente por vetor, com a presença de LDPK em 50% dos casos

de LV, formando assim um importante reservatório humano.

A prevalência do HIV no Sudão em 2016 foi de 56 000, segundo a WHO. A

transmissão é maioritariamente heterossexual e a transmissão vertical é também

importante (12,21).

Desde 1998, foram identificados 3 casos de coinfecção Leishmania-HIV. Desde

então, a prevalência baseada em estudos de hospitais foi de 5% (3/60) em Khartoum,

entre 1998 e 1999, 9,4% (5/53) em Khartoum, em 2002, e 8,1% (3/37) e 3,6% (3/84) em

2002 e 2003, respetivamente, no Estado de Gedaref (12).


Stefanie Baptista Aspetos Clínicos

150

2. Aspetos Clínicos

Após a transmissão da Leishmania sp por picada de inseto ou agulha

contaminada, o parasita entra nos macrófagos ou noutras células fagocitárias. Após a

multiplicação de amastigotas, existe uma rutura destas células e os parasitas infetam

outras células. Dependendo das espécies de Leishmania envolvidas na infeção, pode

causar LV ou LC. Após o inseto tomar uma refeição de sangue, ingerindo os macrófagos

infetados (na forma amastigota), os parasitas transformam-se na forma promastigota, no

tubo digestivo dos vetores. Quando precisam de alimentar-se novamente, as fêmeas

infetadas têm a capacidade de transmitir os promastigotas (forma infeciosa) ao hospedeiro

vertebrado (Figura 7) (29).

As variadas formas de apresentação clínica da Leishmaniose dependem de vários

fatores tais como a complexa interação entre a espécie infetante, o vetor, o estado

imunológico e nutricional do hospedeiro, a idade, a herança genética do hospedeiro, o

local de inoculação e a carga parasitária. A forma visceral, a cutânea e a mucocutânea

são, sem dúvida, as principais manifestações clínicas da doença (13).

Figura 7. Ciclo de Vida da Leishmania sp no ser humano [Adaptado de (29)].



151

2.1. Coinfecção Assintomática

O papel da coinfecção assintomática continua a ser pouco reconhecido. A sua

proporção é 5 a 10 vezes superior nos hospedeiros imunocompetentes quando

comparados com o número de casos de LV, tal como demonstrado por evidência

serológica de anticorpos anti-Leishmania, por deteção de DNA de parasitas em amostras

de sangue ou por uma reação positiva ao teste de pele para a Leishmania sp. A

epidemiologia da infeção assintomática no ciclo do parasita ainda é desconhecida (13).

Relativamente aos indivíduos infetados pelo HIV, o número de portadores

assintomáticos também parece ser maior do que o número de indivíduos com LV

clinicamente evidentes. A associação de uma maior carga parasitária em pessoas com

cargas virais de HIV mais altas já foi demonstrada e parece estar relacionada com um

maior risco para desenvolver a doença clínica (13).

2.2. Coinfecção Leishmaniose Visceral/HIV

A apresentação da LV causada por L. infantum ou L. donovani nos indivíduos

seropositivos para HIV é equivalente à observada nos indivíduos que não estão

coinfetados (12,13). As formas típicas da doença apresentam inicialmente febre

intermitente seguida por um padrão contínuo; hepatoesplenomegalia; pancitopenia,

principalmente por causa dos parasitas que invadem a medula óssea, causando sinais e

sintomas relacionados com cada citopenia e consequentemente anemia, hemorragias e

infeções concomitantes. A perda de peso e a anorexia podem ser mal diagnosticadas com

outras infeções oportunistas ou com caquexia consequente da própria SIDA (13).

As manifestações clínicas de LV em indivíduos coinfetados que recidivaram são

comparáveis aos episódios iniciais de LV e não apresentam mudanças desde a introdução

da ART, exceto o fato de que as infeções oportunistas diminuem. Por outro lado,

seropositivos que recebem ART apresentam frequências significativamente mais baixas

de trombocitopenia e leucopenia, para além de uma menor frequência de níveis

aumentados de enzimas hepáticas, relativamente aos que não receberam a terapêutica

durante os episódios de LV (12).

Em contraste com as manifestações clínicas, o progresso clínico e o prognóstico

da LV diferem. A coinfecção LV-HIV é caracterizada por taxas de cura

significativamente menores, maior toxicidade aos fármacos, maiores taxas de recaída e

maiores taxas de mortalidade do que a LV em indivíduos não coinfetados (12).



152

Ademais, a LV atípica permanece não diagnosticada em contexto clínico ou é

diagnosticada com um atraso considerável, quando o reconhecimento precoce e o

tratamento são extremamente necessários. A maioria das manifestações clínicas

incomuns ocorre em indivíduos com HIV cuja contagem de células T CD4+ é muito baixa.

Estes indivíduos também podem ser afetados por outras infeções oportunistas, o que

dificulta o diagnóstico etiológico oportuno (13).

A equipa de Diro E. et al., realizou um estudo sobre a profilaxia secundária para

recidivas de LV, onde 8 (15%) dos 54 coinfetados LV-HIV selecionados durante 14

meses apresentaram manifestações atípicas de Leishmaniose. Três deles apresentaram

lesões cutâneas (um paciente com lesões nodulares e dois com lesões do tipo

Leishmaniose Dérmica Pós Kala-Azar), 2 tiveram lesões orais, 2 tiveram envolvimento

dos nódulos linfáticos (um com envolvimento do nódulo linfático intra-abdominal), e 1

paciente teve lesões retais (13).

Contudo, as principais diferenças clínicas entre indivíduos coinfetados pelo HIV

e os não coinfetados parecem ser uma grande variedade de manifestações clínicas atípicas

e sobrepostas, com parasitas de Leishmania sp isolados de locais incomuns (mucosa

gastrointestinal e oral, pele, pleura, pericárdio, nódulos linfáticos, lesões de sarcoma de

Kaposi e trato respiratório). Além disso, é importante salientar que a menor taxa de

resposta ao tratamento e a maior taxa de recaída podem ser reduzidas pela ART, mas não

inteiramente evitadas (13).

2.2.1. Coinfecção Leishmaniose Dérmica Pós Kala-Azar

(LDPK)/HIV

A LDPK é comum em indivíduos seronegativos para HIV, aparecendo pouco

depois ou durante o tratamento em 50% dos casos de LV no Sudão e, após um período

mais longo, em 5 a 10% dos casos de LV na Índia. A LDPK manifesta-se com lesões

maculopapulares ou nodulares na face, tronco e membros. Foram reportados apenas

alguns casos de LDPK em seropositivos para HIV. Todavia, na Etiópia, numa

monitorização de 6 meses, a LDPK L grave foi mais comum em coinfetados com HIV

(27,3%) do que em indivíduos seronegativos para HIV (13,3%) (12).

Os casos reportados de indivíduos coinfetados com LV-HIV descreveram lesões

cutâneas que precedem e acompanham a LV após o tratamento. Não está claro se estas

são formas de LDPK ou lesões cutâneas parasitadas formadas durante o decurso da LV.

Além disso, uma associação entre a LDPK e a Doença de Reconstituição Imunológica



153

(DRI) logo após o início da ART foi descrita. Curiosamente, a LDPK-DRI também ocorre

após LV causada por L. chagasi e L. infantum, que geralmente não estão associadas à

LDPK (12).

2.2.2. Coinfecção Leishmaniose Visceral/HIV em Mulheres

Grávidas

No que diz respeito à mulher grávida, as manifestações clínicas da LV não variam

de forma evidente relativamente à forma clássica da doença. Na maioria dos casos, a febre

é o primeiro sintoma, acompanhado de adinamia, perda de peso e hemorragia, sendo este

último sintoma confundido com condições hemorrágicas relacionadas com gravidez

propriamente dita. Quanto à característica hepatoesplenomegalia, a sua observação pode

ser prejudicada devido ao aumento do tamanho do útero (6).

Uma vez que os sintomas são inespecíficos e facilmente confundidos com outras

situações clínicas, a análise dos dados epidemiológicos e laboratoriais é fundamental.

Desta forma, o diagnóstico clínico torna-se mais fácil à medida que os sinais e sintomas

clássicos da LV se tornam mais exuberantes, incluindo manifestações como

hepatoesplenomegalia marcada, perda de peso significativa, adinamia, anemia acentuada

e hemorragia (6).

2.3. Coinfecção Leishmaniose Cutânea/HIV

Após a picada do inseto e o período de incubação de 2 semanas a 3 meses, surge

uma pequena lesão eritematosa, papular ou nodular, que causa prurido e que por vezes

precede ou é seguida pelo aumento da drenagem dos nódulos linfáticos. Esta lesão inicial

pode curar-se espontaneamente ou evoluir para uma forma específica da doença clínica,

meses mais tarde (Figura 8) (13).

É importante realçar que as manifestações descritas parecem ser semelhantes nos

indivíduos coinfetados com HIV e nos não coinfetados, mas podem estar presentes em

formas incomuns. Por exemplo, foram descritas diferentes formas de lesões mucosas,

como infiltração disseminada difusa da superfície mucosa do palato e lesões genitais

(presentes em 27% dos coinfetados com HIV) (13).



154

2.3.1. Coinfecção Leishmaniose Cutânea Localizada/HIV

A Leishmaniose Cutânea Localizada (LCL) é a mais frequente forma causada por

espécies dermotrópicas. Muitas vezes, as lesões aparecem numa área exposta da

superfície do corpo (uma a dez). A lesão típica é uma úlcera redonda, bem delimitada e

indolor com uma crosta central, que às vezes pode ser hemorrágica. A lesão pode curar-

se espontaneamente, originando uma cicatriz hipopigmentada, lisa e fina. A LCL é

causada por L. major, L. aethiopica, L. tropica, L. mexicana, L. amazonensis, L. (V.)

braziliensis, L. (V.) guyanensis, L. (V.) shawi, L. (V.) lainsoni, e L. (V.) naiffi (13).

2.3.2. Coinfecção Leishmaniose Recidiva Cutis/HIV

A Leishmaniose Recidiva Cutis é mais comum nos Países em Desenvolvimento.

É responsável pelo aparecimento de lesões papulares/vesiculares no interior ou nas

imediações de cicatrizes de lesões já curadas, num período de tempo que pode variar de

meses a anos. É causada principalmente por L. (L.) aethiopica e L. (V.) braziliensis (13).

2.3.3. Coinfecção Leishmaniose Cutânea Disseminada/HIV

A Leishmaniose Cutânea Disseminada (LCDS) causa múltiplas lesões

pleomórficas (10-300), muitas vezes acneiformes e papulares, em duas ou mais áreas da

Figura 8. Lesões de Leishmaniose Cutânea. (A) Lesão típica de Leishmaniose Cutânea Localizada, (B) Manifestação atípica de Leishmaniose Cutânea, caracterizada por grandes ulcerações cutâneas, (C) e (D)

Leishmaniose Mucocutânea [Adaptado de (13)].



155

superfície do corpo, mas não contíguas. Até ao momento, L. (V.) braziliensis é a única

espécie encontrada (13).

2.3.4. Coinfecção Leishmaniose Cutânea Difusa/HIV

A Leishmaniose Cutânea Difusa (LCD) é uma forma rara da doença que apresenta

lesões nodulares que não evoluem para ulcerações. Tipicamente, as lesões são ricas em

parasitas e as espécies envolvidas são L. (L.) mexicana e L. (L.) amazonensis na América

e L. (L.) aethiopica nos Países em Desenvolvimento (13).

2.3.5. Coinfecção Leishmaniose Mucocutânea/HIV em

Mulheres Grávidas

A Leishmaniose Mucocutânea ocorre anos após o início da LC e é caracterizada

pela destruição das cavidades oral-nasal e faríngea, podendo evoluir para lesões

desfigurantes. As manifestações clínicas podem começar com uma inflamação nasal leve

e congestionamento, seguidos de ulcerações e perfurações do septo, que se estendem ao

palato mole, faringe ou laringe. É causada principalmente por L. (V.) braziliensis e L. (V.)

guyanensis (13). Até ao período final de consulta de bibliografia não existem dados

descritos para esta lesão cutânea em mulheres grávidas e coinfetadas com HIV.

2.4. Coinfecção Doença de Reconstituição Imunológica (DRI)/HIV

A ART levou a uma diminuição significativa da morbilidade e mortalidade

associadas à SIDA, em parte devido à recuperação parcial do sistema imunológico.

Contudo, alguns indivíduos sob o efeito da ART podem apresentar agravamento da

situação clínica, apesar do aumento da contagem de linfócitos CD4+ e diminuição da

carga viral de HIV-1 no plasma. Este facto é o resultado de uma resposta inflamatória ou

“desregulação” do sistema imunológico tanto aos agentes patogénicos subclínicos

intactos como aos antigénios residuais. Consequentemente, verificam-se diferentes

manifestações clínicas, conforme os agentes infeciosos ou não infeciosos envolvidos.

No caso da infeção por Leishmania sp, a DRI pode resultar numa nova doença ou

em progressão da doença latente. Já foram reportadas três variações clínicas da

Leishmaniose com comprometimento dermatológico: Leishmaniose Mucocutânea

Difusa, Leishmaniose Dérmica Pós ou Para-Kala-Azar (LDPK) e nódulos cutâneos

esporotricoides e subcutâneos. Até ao momento, foram reportados apenas alguns casos

de Leishmaniose Cutânea associada a DRI em indivíduos em fase de SIDA. De forma



156

geral, foram notificadas lesões cutâneas disseminadas (nos braços, pernas e pés) e lesões

na mucosa nasal, orofaríngea e genital (13).

Relativamente à LV, embora esta pareça ser rara no contexto de DRI, deve ser

considerada como causa da febre repentina de origem desconhecida após o início de ART

em indivíduos seropositivos para HIV de áreas endémicas (ou com histórico de viagem

para essas mesmas áreas) (13).


Stefanie Baptista Imunopatogénese

157

3. Imunopatogénese

Ao longo dos anos, vários esforços foram feitos para determinar o mecanismo por

trás da patogénese da coinfecção Leishmania-HIV e também confirmar se existem

interações entre os dois agentes patogénicos a nível celular e molecular.

A presença do parasita e do vírus na mesma célula mostrou influenciar a

multiplicação e expressão de um ou de ambos os organismos. Acredita-se que, em

coinfetados, existe uma relação simbiótica entre os parasitas de Leishmania sp e o HIV.

Segundo Bentwich Z, et al. (2003), os parasitas estimulam a ativação imunológica

crónica, levando a um aumento da carga viral do HIV com progressão mais rápida para

SIDA. No entanto, Santos-Oliveira JR, et al. (2010) mostraram que o sistema

imunológico pode ser fortemente ativado sem um aumento concomitante da carga viral

do HIV em indivíduos coinfetados. Adicionalmente, a imunossupressão causada pelo

vírus é particularmente favorável à multiplicação descontrolada do parasita Leishmania

sp (30,31).

As formas amastigotas de Leishmania e o HIV infetam e interagem com as células

dendríticas (DCs, do Inglês, Dendritic Cells) e com os macrófagos. As consequências

desta interação ainda não foram totalmente determinadas. No entanto, sugeriu-se que

estes parasitas e o HIV-1 podem tirar partido das DCs através de modulação de várias

moléculas de superfície celular, inibição da função das DCs, produção de fatores solúveis

e atraso na fusão lisossomal e nas atividades de morte intracelular. Quando as DCs e os

macrófagos encontram antigénios, processam e exibem os seus péptidos de superfície e

migram para os órgãos linfoides de drenagem mais próximos, onde apresentam estes

mesmos péptidos às células T naïve (Figura 9) (30,31).

É interessante que a infeção de DCs e macrófagos com Leishmania sp e HIV

mostrou alterar as funções fisiológicas dessas células, particularmente a sua capacidade

de processamento e apresentação de antígenos. A infeção por HIV-1 também mostrou

afetar a fagocitose e a replicação de Leishmania sp por macrófagos, bem como a resposta

fisiológica que leva à produção de moléculas imunomoduladoras. Por exemplo, Tat do

HIV-1 aumenta a expressão de PGE2, Ciclooxigenase 2 e do TGF-ß por macrófagos e

DCs, e isso pode ser a causa do aumento da replicação de parasitas nestas células (30,31).

No que diz respeito à superfície do parasita Leishmania sp, o LPG é o principal

glicofosfato expresso na forma promastigota. Após a fagocitose, os promastigotas são

envolvidos pelos fagolisossomas nas Células Apresentadoras de Antígenos (APCs, do



158

Inglês, Antigen-Presenting Cells), especialmente macrófagos, onde se transformam nas

formas intracelulares (amastigotas). No fagolisossoma, a molécula de LPG é desintegrada

deixando apenas a âncora de fosfatidil inositol. Pensa-se que o LPG é fundamental para

a sobrevivência e o estabelecimento do parasita nos macrófagos e desempenha um papel

importante na modulação das suas funções, podendo aumentar a expressão do HIV.

Estudos in vitro mostram que os amastigotas de Leishmania infantum nas DCs ligadas a

células T causam maior produção de vírus HIV-1, e isto devido à produção de citocinas

pró-inflamatórias pelas DCs infetadas. De acordo com isto, estudos sugerem que a

Leishmania pode modular diretamente o ciclo de vida do vírus pela da indução do NF

dependente do TNF- e IL-1. Conjuntamente, estas descobertas sugerem que a

coinfecção com Leishmania sp pode aumentar a progressão SIDA (32).

Por outro lado, a infeção por HIV também afeta negativamente o resultado da

infeção por Leishmania sp, aumentando a replicação dos parasitas nas células coinfetadas.

A causa disto foi atribuída ao comprometimento das funções dos macrófagos.

Adicionalmente, isto também pode explicar o aumento da recorrência e reativação da

doença em indivíduos com esta coinfecção HIV-Leishmania sp. Além disso, os

coinfetados com LC e HIV e com imunodepressão moderada têm maior taxa de reinfeção,

maior número de lesões e fraca resposta ao tratamento em comparação com os indivíduos

seronegativos para HIV. Curiosamente, além da imunossupressão causada pelo HIV, a

LV também leva à imunossupressão por si só, o que foi atribuído ao papel

imunorregulador da IL-10, geralmente observada em níveis elevados nos soros de

indivíduos infetados. Este facto sugere que pode haver imunossupressão mais acentuada

em indivíduos coinfetados com HIV (32).

A resolução de LC e LV geralmente está associada a uma resposta Th1 forte

porque esta garante a produção de citocinas ativadoras de macrófagos, especialmente

IFN-, que impedem a replicação parasitária. Concretamente, a suscetibilidade foi

atribuída à sobreprodução de citocinas associadas às células Th2 (incluindo IL-4, IL-5 e

IL-10), que inibem as citocinas Th1 e desativam os macrófagos, levando à proliferação e

sobrevivência parasitárias. No entanto, na LV, o papel das citocinas de Th1 ou Th2 na

resistência e suscetibilidade, respetivamente, não é muito óbvio porque as citocinas de

Th1 e Th2 foram detetadas em doentes com LV que apresentam diferentes manifestações

da doença clínica.



159

Estudos sugerem que a infeção pelo HIV pode alterar a capacidade de resposta

das células T à Leishmania sp, o que inclui a capacidade de resposta das CMSPs aos

antígenos de Leishmania sp. Além disso, a estimulação de CMSPs com antigénios de

Leishmania sp em indivíduos infetados com HIV resulta na produção de baixos níveis de

IFN-, mas níveis elevados de IL-10. Da mesma forma, a produção de IL-12 e/ou IL-18

(citocinas-chave para induzir resposta Th1 robusta) por CMSPs é menor em indivíduos

com LV-HIV. De acordo com isso, Nigro et al. mostraram que os indivíduos infetados

com HIV produziram mais IL-10 e IL-4 do que indivíduos infetados com LV-HIV.

Adicionalmente, a citocina IL-15, que promove a resposta das células T CD8+ e a

produção de citocinas que aumentam a resposta protetora aos parasitas intracelulares, está

diminuída nos indivíduos seropositivos para HIV, tendo um papel importante na resposta

à terapêutica.

Citocinas pró-inflamatórias, tais como o TNF- estão aumentadas em indivíduos

coinfetados com LV-HIV em relação aos indivíduos seronegativos para HIV, associado

assim ao aumento da replicação viral. Olivier et al. sugeriram que as infeções oportunistas

durante a infeção pelo HIV poderiam levar à produção de citocinas pró-inflamatórias

durante o estágio da imunodeficiência, acelerando assim a progressão da doença.

No que diz respeito à mulher grávida, o ambiente imunológico materno durante a

gravidez coexistente com a infeção por Leishmania sp também é uma fonte potencial de

fisiopatologia. Na resposta imunológica à gravidez normal existe um ajuste no qual o

Figura 9. Representação esquemática dos mecanismos de sinalização envolvidos na expressão da Leishmania sp-Lipofosfoglicano-mediada pelo HIV-1 através dos monócitos/macrófagos e linfócitos T [Adaptado de

(31)].



160

sistema imunológico materno se adapta para permitir a presença de antigénios estranhos

inerentes à gestação, ao mesmo tempo que mantém a defesa da mãe e da criança contra

microrganismos infeciosos. Isto implica respostas imunológicas pró-inflamatórias

reduzidas com respostas humorais mantidas, especialmente ao nível da placenta, que

demonstrou atuar como um regulador deste estado imunológico tão particular. Como tal,

no caso da infeção por Leishmania sp durante a gravidez, o resultado clínico da mãe e do

feto é um reflexo do compromisso resultante entre a gravidez saudável e a resposta efetiva

ao parasita invasor (7).

A gravidez saudável tem sido associada a equilíbrios específicos de células T,

nomeadamente a predominância de Th2 sobre as Th1 e a prevalência de células T

reguladoras sobre as Th17 (Figura 10). Embora existam certas exceções a esta tendência

anti-inflamatória na gravidez normal, o aborto, o parto prematuro e outras complicações

da gravidez estão associadas a desvios destes padrões. Até à data, o aspeto mais estudado

deste equilíbrio na infeção por Leishmania sp durante a gravidez foi a diferenciação

Th1/Th2 e os padrões de citocinas resultantes. Segundo Robinson, D.P. et al. (2012), uma

resposta predominante de Th1 está associada tanto à rejeição da gravidez quanto ao

controlo de infeções intracelulares de Leishmania sp, enquanto que uma resposta

predominante de Th2 está associada a um estado imunológico tolerante a antigénios

estranhos (incluindo antigénios alogénicos do feto), preservação da gravidez e controlo

fraco de infeção (7).

Figura 10. Resposta Imunológica de células T maternas e os seus efeitos durante a gravidez coexistente com infeção por Leishmania sp [Adaptado de (7)].


Stefanie Baptista Diagnóstico

161

4. Diagnóstico

Nos indivíduos coinfetados com Leishmania-HIV, o diagnóstico de Leishmaniose

pode ser difícil porque as manifestações clínicas típicas da doença nem sempre estão

presentes e/ou os indivíduos podem apresentar sinais clínicos inespecíficos. Além disso,

a esplenomegalia é menos frequente em indivíduos coinfetados e uma boa parte desses

indivíduos apresentam outras infeções oportunistas associadas com sintomas

semelhantes, o que complica ainda mais o diagnóstico clínico.

A WHO recomendou um algoritmo para o diagnóstico de Leishmaniose em

indivíduos infetados com HIV (WHO, Quinta Reunião Consultiva sobre Coinfecção

Leishmania-HIV, Addis Abeba, Etiópia, março de 2007 [OMS / CDS / NTD / IDM /

2007-7]), conforme a Figura 11 (12).

4.1. Parasitológico

A deteção de parasitas de Leishmania sp por microscopia ou em diferentes

amostras de tecido é considerado o método-padrão para o diagnóstico de Leishmaniose

em indivíduos coinfetados com HIV e pode ser uma forma útil de detetar falhas de

tratamento.

4.1.1. Microscopia

Os nódulos linfáticos, a medula óssea e o baço são os principais tecidos utilizados

para a demonstração de formas amastigotas em preparações com coloração de Giemsa,

Leishman ou Wright (Figura 11), devendo ser observadas pelo menos durante 1 hora.

Tanto em indivíduos infetados com HIV como em não infetados com HIV, as amostras

de tecido do baço têm a melhor sensibilidade, seguidas pelas de medula óssea e nódulos

linfáticos. No entanto, a aspiração da medula óssea é o exame mais utilizado devido à sua

boa sensibilidade (67-94%) e menor risco de complicações em comparação com a

aspiração do baço. Adicionalmente, o exame microscópico pode ser realizado em biópsias

hepáticas com uma sensibilidade de 87% e os amastigotas também podem ser encontrados

em locais incomuns, como pulmões, laringe, amígdalas, tubo digestivo, reto, LCR e

outros (12,13).

4.1.2. Cultura

A cultura de aspirados esplénicos mostrou uma alta sensibilidade (63-100%) em

indivíduos coinfetados com Leishmania-HIV. No entanto, devido ao risco de hemorragia

interna, recomenda-se aspiração da medula óssea por ser mais seguro e por ter uma



162

sensibilidade similar (50-100%). A cultura das CMSPs obtém uma sensibilidade de 64 a

67%, sendo esta uma boa opção por ser menos invasiva. As culturas devem ser

examinadas todas as semanas por microscopia de luz, procurando formas de

promastigotas, e cultivadas em meio fresco. As culturas são consideradas negativas se

nenhum parasita flagelado for observado após 4 semanas (12,13).

Apesar deste método ter uma ótima sensibilidade, necessita de um meio especial

(meio Novy-MacNeal-Nicolle), e geralmente não está disponível na maioria das regiões

endémicas (13).

4.2. Serológico

O diagnóstico serológico específico é baseado na presença de uma resposta

humoral específica. Os testes serológicos atuais são baseados em quatro formatos:

Anticorpo Fluorescente Indireto (IFA), Ensaio de Imunoabsorção Enzimática (ELISA),

Western Blot e Teste de Aglutinação Direta (DAT). Um Teste Rápido de Diagnóstico

muito utilizado é o rK39, um imunoensaio qualitativo para deteção de anticorpos contra

a Leishmania sp, que está facilmente acessível e com resultados disponíveis dentro de 10-

20 min (3).

Quanto ao diagnóstico serológico em indivíduos infetados com HIV, há

evidências limitadas do desempenho dos testes, segundo vários estudos. Os testes

serológicos são claramente menos confiáveis nestes indivíduos e há dúvidas sobre que

Figura 11. Microscopia ótica de formas amastigotas de Leishmania spp. num aspirado de medula óssea (1000X). Observam-se numerosas formas amastigotas (setas pequenas) no citoplasma de dois macrófagos infectados (setas maiores).

N: núcleo. Foi utilizada a coloração de Wright. A barra no canto inferior representa 20 milímetros [Adaptado de T. Pothirat, 2014].



163

técnica é superior às outras, neste contexto. Cota et al. realizaram uma revisão, incluindo

33 estudos e 1 489 indivíduos, e mostraram uma sensibilidade total limitada dos testes

serológicos. Observaram ainda que a DAT e o Western Blot tiveram melhor desempenho

em comparação com o teste de ELISA e IFA. Num estudo que incluiu 113 indivíduos

sintomáticos infetados com HIV, o DAT apresentou bom desempenho geral

(sensibilidade de 89%), sem diferenças estatísticas em comparação com o diagnóstico

molecular; o teste IFA apresentou menor sensibilidade (45,6%) (13).

4.3. Antigénico

O teste de aglutinação de látex (KAtex; Kalon Biological, Reino Unido) foi

projetado para detetar antígenos de Leishmania sp na urina. Teoricamente, os métodos

para detetar antígenos funcionariam melhor no diagnóstico de Leishmaniose ativa em

indivíduos coinfetados com HIV, porque os resultados estariam relacionados com carga

de parasitas. Apesar deste conceito, o kit de Katex mostrou sensibilidade e especificidade

satisfatória em indivíduos com LV imunocompetentes, mas menor sensibilidade em

indivíduos coinfetados com HIV. E num estudo que incluía uma pequena amostra de 13

indivíduos com coinfecção Leishmania-HIV na América Latina, apenas cinco eram Katex

positivos, enquanto a sensibilidade do DAT foi 100% (3,12,13).

4.4. Molecular

A PCR é uma técnica útil que foi usada para deteção de diferentes espécies de

Leishmania sp. Os protocolos de PCR podem ser aplicados em numerosas amostras

clínicas, com um melhor desempenho do que os métodos parasitológicos clássicos, com

uma sensibilidade analítica de cerca de 0,01 parasita por reação. Os ensaios de PCR com

amostras de medula óssea e sangue periférico provaram ser uma ferramenta confiável

para o diagnóstico de VL em indivíduos seropositivos para HIV, com uma sensibilidade

de 93 a 100% e 83 a 98%, respetivamente. A PCR é uma técnica útil para monitorizar a

eficácia do tratamento a longo prazo e para calcular o valor preditivo de recidivas devido

ao seu alto desempenho em amostras não invasivas (12,13).

É importante notar que existem vários métodos de PCR, mas, provavelmente, o

teste de PCR baseado na amplificação do cinetoplasto é o método mais sensível para

detetar o DNA de Leishmania sp.

Embora este método seja considerado uma ferramenta útil para o diagnóstico de

indivíduos coinfetados, é de salientar que indivíduos assintomáticos podem apresentar



164

resultados positivos, o que limita seu uso ao diagnóstico de doença ativa em áreas de

elevada transmissão de LV (12,13).

4.5. Estratégia de Diagnóstico nos Serviços de Saúde de Áreas

Endémicas

De forma a controlar a infeção por Leishmania sp, principalmente em áreas

endémicas, deve ser elaborada uma política de diagnóstico específica para o serviço de

saúde, uma vez que as técnicas laboratoriais disponíveis dependem fortemente do nível

do sistema de saúde (Tabela 1). Segundo a WHO, nos cuidados de saúde primários e nos

hospitais de distrito rural em áreas altamente endémicas, deve ser utilizado o teste

imunocromatográfico rK39. Indivíduos clinicamente suspeitos com um teste positivo de

rK39 e sem história de Leishmaniose Visceral devem ser tratados. Em áreas onde a

sensibilidade do teste rK39 é inferior a 90%, um teste serológico adicional (por exemplo,

DAT) pode ser necessário se os resultados do teste rK39 forem negativos. O diagnóstico

parasitológico, que também é necessário para diagnosticar uma recaída da Leishmaniose

Visceral, deve ser realizado ao nível de instituições de saúde distrital ou superior. Em

áreas de baixa endemicidade, como a região do Mediterrâneo, são necessários algoritmos

de diagnóstico mais específicos que incluam PCR e exame parasitológico no sangue e na

medula óssea (1).

Tabela 1. Técnicas predefinidas para o diagnóstico de Leishmaniose Visceral em áreas altamente endémicas, por nível de sistema de saúde, segundo a estratégia da WHO [Adaptado de (1)]

Nível de Sistema de Saúde Testes de Diagnóstico

Cuidados de Saúde Primários Teste rK39

Hospital Distrital

Teste rK39, DAT

Microscopia em aspirado de medula

óssea, baço ou nódulo linfático

Cuidados de Saúde Terciários

Serologia: Teste rK39, DAT, outros (p.e.

IFA, ELISA)

Microscopia em amostras de pele, medula

óssea, baço ou nódulo linfático

Cultura ou PCR

Nota: O teste de aglutinação direta deve ser usado somente se a supervisão adequada e a garantia de qualidade estiverem

disponíveis a nível distrital. A aspiração do baço deve ser realizada apenas por pessoal médico experiente e se as

instalações para tratar complicações hemorrágicas estiverem disponíveis.



165

O algoritmo de diagnóstico da Figura 12 indica sucintamente qual a estratégia que

deve ser adotada quando existe suspeita clínica de LV. Primariamente é realizado um

teste rápido ou testes de microscopia menos invasivos e só numa segunda fase se realizam

testes mais invasivos, a nível hospitalar.

É possível verificar que ao longo de todo o algoritmo da Figura 12 existe a

necessidade de realizar paralelamente o Teste HIV, se desconhecida a situação do

indivíduo, dada a prevalência da coinfecção. Desta forma, torna-se essencial efetuar testes

sensíveis e específicos e que ao mesmo tempo estejam disponíveis nas áreas endémicas.

São indicados os testes serológicos de 4ª geração (onde se pesquisam em

simultâneo os anticorpos anti-HIV 1 e anti-HIV 2 e o antigénio p24 e que detetam o HIV

Figura 12. Algoritmo para o diagnóstico de LV em indivíduos infetados com HIV [Adaptado de (12)].

Suspeita clínica de LV

Teste Imunocromatográfico Rápido Testes de microscopia menos invasivos

Encaminhar utente para

ambiente hospitalar

Repetir testes serológicos (pelo

menos 2 testes diferentes)

PCR no sangue e/ou microscopia/cultura utilizando

amostras mais invasivas (medula óssea e baço)

Tratamento

+ Teste HIV, se desconhecido

Tratamento

+

Teste HIV, se desconhecido


Tratamento

+


Colher sangue, raspados de pele ou

aspirado de nódulo linfático

Positivo Negativo

Negativo

Negativo

Positivo

Positivo

Excluir outro possível diagnóstico diferencial e

considerar o tratamento de acordo com a avaliação

clínica



166

1 do grupo 0) para a determinação inicial de infeção por HIV, já que estes métodos

apresentam uma excelente sensibilidade (99,78%-100%) e especificidade (99,5%-

99,93%). A amostra preferencial para o estudo laboratorial de infeção por HIV é o sangue

venoso (32).

Sem dúvida, este tipo de testes apresenta inúmeras vantagens, designadamente o

tempo de resposta ser mais curto do que com o WB (Western Blot), o custo ser mais baixo,

a sensibilidade para a deteção de infeções agudas ser maior e ainda conseguir manter a

capacidade para a deteção das infeções estabelecidas. É importante o facto de que a maior

parte dos diagnósticos se realiza apenas recorrendo a dois testes laboratoriais bem como

a redução ou eliminação da possibilidade de classificação errada das infeções HIV-2.

Nestes procedimentos, só são necessários testes RNA para as amostras sem Acs que

corresponderão a infeções agudas. Importa realçar também que estes testes de 4ª geração

facilitam imenso a entrada nos cuidados de saúde especializados (retentionin care) (33).

O CDC e a DGS apresentam um novo algoritmo para o diagnóstico da infeção por

HIV (Figura 13). Se, pelo menos um destes for reativo, deve ser efetuado teste rápido

serológico de discriminação HIV-1/HIV-2. Caso se apresente teste HIV-1 não reativo e

teste HIV-2 não reativo ou inconclusivo, deve ser efetuado TAN (Técnica dos Ácidos

Nucleicos RT-PCR) para RNA do HIV-1 e HIV-2. Se nenhum deles for reativo, deve ser

feita a pesquisa de DNA integrado por PCR (DNA Proviral) (32,33).

Caso estes testes serológicos não estejam disponíveis numa primeira fase,

nomeadamente em determinadas zonas endémicas, pode-se recorrer a testes rápidos em

situações de point of care (POC). No entanto, é necessário ter em atenção que o uso deste

tipo de testes rápidos apresenta menor sensibilidade, no caso de utilização de um teste de

3ª geração, já que, por não pesquisarem o antigénio p24, podem dar origem a um número

superior de falsos resultados negativos. Para além disso, os locais onde estes tipos de

testes são realizados devem ser supervisionados por um laboratório certificado e devem

ser alvo de um programa robusto de controlo da qualidade (32).



167

Figura 13. Algoritmo para o diagnóstico de HIV [Adaptado de (32,33)].

Interessa notar que durante os primeiros 18 meses de vida, os métodos

moleculares para o diagnóstico da infeção por HIV são os adequados para o diagnóstico

precoce, não devendo ser prescritos os métodos de pesquisa de anticorpos (32).

Reportar como HIV-1 ou HIV-2 positivo

TAN para RNA do HIV-1 e HIV-2

DNA Pro-viral Pesquisa de DNA integrado - PCR


Stefanie Baptista Terapêutica

168

5. Terapêutica

A introdução da ART na Europa levou à diminuição significativa do número de

novas infeções de LV em indivíduos seropositivos para HIV, conforme mencionado

anteriormente. Reduziu ainda o risco de recaída nos indivíduos coinfetados, bem como a

morbilidade e mortalidade (12). Existem cinco categorias de ART: inibidores da

transcriptase reversa análogos de nucleótidos (NRTIs, do inglês, nucleoside reverse

transcriptase inhibitors), inibidores da transcriptase reversa não análogos de nucleótidos

(NNRTIs, do inglês, non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors), inibidores de

protease viral (PIs, do inglês, protease inhibitors), inibidores da integrasse e inibidores

de entrada (enfuvirtide, antagonistas do co-recetor CCR5). O tratamento padrão consiste

numa combinação de pelo menos três fármacos (muitas vezes chamados de "terapêutica

anti-retroviral altamente ativa" ou HAART) que reprimem a replicação do HIV (34).

Como tratamento de primeira linha em mulheres grávidas e a amamentar,

incluindo mulheres grávidas no primeiro trimestre de gravidez e mulheres em idade fértil,

a ART deve conter um NNRTI (Nevirapina ou Efavirenz) e dois NRTIs, um dos quais

deve ser Lamivudina ou Emtricitabina e o outro Zidovudina ou TDF (Tenofovir

Disoproxil Fumarato). A WHO recomenda uma combinação diária de dose fixa de TDF

+ 3TC (Lamivudina) + EFV A (Efavirenz A). Aplica-se tanto ao tratamento ao longo da

vida quanto à ART iniciada para a prevenção da transmissão congénita e depois

interrompida. Os PIs estão incluídos em terapêuticas de segunda linha (35).

O tratamento da Leishmaniose em indivíduos com HIV caracteriza-se por um

número reduzido de opções terapêuticas. Os fármacos são inacessíveis devido ao seu

preço, falta de registo, toxicidade ou ineficácia ou porque ainda não foram testados nestes

indivíduos. Para além disso, existem poucos ensaios clínicos a analisar a eficácia dos

diferentes tratamentos para indivíduos coinfetados com Leishmania-HIV. Em geral, estes

indivíduos têm taxas de cura mais baixas, maiores taxas de toxicidade e maiores taxas de

mortalidade por Leishmaniose do que os indivíduos imunocompetentes. Isto verifica-se

porque a baixa contagem de células CD4+ pode impedir uma recuperação completa e

também porque as múltiplas recidivas muitas vezes não respondem aos fármacos usados

anteriormente. Um outro problema tem haver com o facto de se extrapolar os dados e o

tratamento da L. donovani na África ou na Ásia para os casos na Europa, onde a L.

infantum provavelmente tem diferentes suscetibilidades para os fármacos, menos

virulência e parece ocorrer em indivíduos com menor contagem de células CD4+. De



169

facto, ainda não foram estabelecidos protocolos de tratamento para qualquer região. É

importante notar que uma resposta parasitológica ao tratamento não é indicativa de

ausência de recidivas futuras, enquanto que uma resposta clínica não indica

necessariamente a inexistência de parasitas (12).

5.1. Leishmaniose

5.1.1. Antimoniais Pentavalentes (AP) – Sb5+

Os Antimoniais Pentavalentes injetáveis (Estibogluconato de sódio e Antimoniato

de meglumina) foram extensivamente utilizados e o principal tratamento para LV durante

várias décadas, sendo ainda altamente efetivos, exceto em regiões da Índia (Bihar) e do

Nepal, onde apresentam uma grande resistência (12).

Um tratamento com Antimoniais, segundo o procedimento recomendado pela

WHO de 20 mg/kg de peso corporal/dia durante 28 a 30 dias, levou a uma resposta clínica

e/ou parasitológica em 33 a 82% de indivíduos coinfetados europeus, sendo as recaídas

comuns. As taxas de sucesso em estudos publicados variam muito devido a altos níveis

de abandono e morte precoce. A pancreatite induzida por fármacos foi a causa mais

comum de descontinuação do tratamento e morte. Também foram relatadas alterações

graves no padrão cardíaco. Na Etiópia, um terço dos indivíduos coinfetados morreram

durante o tratamento com Antimoniais. A mortalidade está claramente associada a este

tipo de terapêutica, bem como uma maior incidência de vómitos graves (12).

A causa do aumento da pancreatite clínica com Antimoniais em indivíduos

coinfetados não é clara, é possível que a toxicidade antimonial afete seletivamente estes

indivíduos porque o Antimonial Pentavalente é reduzido ao Antimonial Trivalente tóxico

em maior percentagem. A toxicidade e alta mortalidade durante o tratamento tornam os

Antimoniais inadequados como tratamento de primeira linha para indivíduos coinfetados.

Uma desvantagem adicional destes fármacos é que eles demonstraram estimular a

replicação do HIV-1 in vitro (12).

Paumgartten et al. descreveram que a administração experimental repetida de

Antimoniato de meglumina em mulheres grávidas era letal para o embrião e teratogénica

em ratos, mas nenhuma toxicidade materna e nenhuma redução de peso fetal foram

observadas nos grupos tratados. Também foi relatado que os compostos deste fármaco

atravessam a barreira placentária e podem impregnar o tecido nervoso fetal, levando a

síndromes graves de atraso mental. Durante o período de amamentação, se a mãe está a

ser tratada com compostos de Sb5+, o recém-nascido deve ser amamentado 5 a 6 horas



170

após a administração do fármaco na mãe, quando os níveis de Antimoniais no leite

tornam-se insignificantes (6).

Conforme indicado pelo CDC, doses intravenosas/intramusculares de 20 mg/kg

de Antimoniais durante 28 dias mostraram excelentes resultados no tratamento de LC e

LMC em indivíduos coinfetados com HIV (13).

5.1.2. Desoxicolato de Anfotericina B (ANB)

O Desoxicolato de Anfotericina B tem sido amplamente utilizado para o

tratamento da LV, principalmente na Índia, onde ainda é altamente efetiva após 10 anos

de uso extensivo. O risco de nefrotoxicidade e hipocalemia requer hospitalização e, de

preferência, monitorização bioquímica durante o tratamento, o que é difícil de alcançar

em locais com poucos recursos. A ANB já foi abandonada nos países ocidentais e

substituída pela Anfotericina Lipídica, mais segura e eficaz (12).

Curiosamente, in vitro, a ANB é um fármaco mais potente do que os Antimoniais

no combate à Leishmaniose, pois a sua atividade não depende da resposta imunológica

do paciente. No entanto, em indivíduos coinfetados, a sua superioridade em relação aos

Antimoniais não foi demonstrada. As taxas iniciais de cura variaram de 58 a 82%, com

recaídas regulares. As taxas de toxicidade de ambos os medicamentos mostraram ser

semelhantes, com a ANB a causar toxicidade renal em 18 a 36% dos indivíduos. Tal como

acontece com os Antimoniais, os efeitos adversos da ANB em indivíduos coinfetados são

mais graves do que aqueles em indivíduos seronegativos para HIV (12).

A ANB atravessa a barreira placentária, mas as concentrações plasmáticas no feto

não excedem um terço das observadas no plasma materno. Com base nas altas taxas de

cura de LV (95 a 100%), o uso de ANB foi ampliado e relatado o seu uso seguro em

mulheres grávidas sem repercussões no feto (6).

5.1.3. Anfotericina B Lipídica (ANB-L)

Foram desenvolvidas várias formas lipídicas de ANB e todas elas apresentam

maior segurança do que a de ANB, com a ANB-L considerada superior às outras. A ANB-

L possui o índice terapêutico mais elevado de todos os fármacos para a Leishmaniose,

incluindo as demais formas lipídicas de ANB. É, portanto, indicado para o tratamento de

indivíduos coinfetados. Os limitados dados sobre o uso deste fármaco em indivíduos

coinfetados são provenientes principalmente da Europa. Infelizmente, a ANB-L é muito

dispendiosa, embora já esteja disponível por um custo sem fins lucrativos nos Países em

Desenvolvimento. Nos indivíduos imunocompetentes, não foram observadas falhas no



171

tratamento com a dose total recomendada de 20 mg/kg, exceto no Sudão. Os indivíduos

sudaneses sem HIV eram menos sensíveis à ANB-L do que os europeus ou índios: as

taxas de cura para doses totais de 15 mg/kg, 16 a 20 mg/kg e 20 mg/kg eram 50%, 64%

e 88%, respetivamente. Noutro estudo, 10 dos 64 indivíduos sudaneses não responderam

ao tratamento com ANB-L de 20 mg/kg. Pensa-se que isto pode estar relacionado com as

altas cargas parasitárias iniciais e com doenças imunossupressoras (infeção por HIV e

tuberculose), e sugeriu-se que doses mais elevadas deveriam ter sido usadas. Na Europa,

doses totais de até 30 a 40 mg/kg foram avaliadas num pequeno número de indivíduos

coinfetados e foram bem toleradas, mas não preveniram recaídas (12).

Os relatórios de tratamento da LMC associada ao HIV são escassos, no entanto

foi descrita a cura de um indivíduo coinfetado após o tratamento com ANB-L, cujo

tratamento inicial com Antimoniais tinha falhado. Recomenda-se profilaxia secundária

com ANB-L (3-4 mg/kg) a cada 2-4 semanas para prevenir recaídas de LV em indivíduos

coinfetados pelo HIV, uma vez que apresentam uma alta taxa de recorrência anual (12).

Conforme indicado pelo CDC, doses intravenosas/intramusculares de 20-40

mg/kg de ANB-L durante 28 dias mostraram excelentes resultados no tratamento de LC

e LMC em indivíduos coinfetados com HIV (13).

5.1.4. Miltefosina

O tratamento com Miltefosina tem demonstrado ser seguro e eficaz. É comum

verificar-se efeitos adversos gastrointestinais relativamente moderados. Um estudo de

299 indivíduos indianos mostrou que o vómito ocorreu em 38% e a diarreia ocorreu em

20% dos indivíduos e geralmente durou 1 a 2 dias. Nenhum destes indivíduos estava

coinfetado. Uma grande desvantagem deste fármaco é o seu potencial efeito teratogénico,

impedindo o seu uso em mulheres grávidas ou em lactação e em mulheres em idade fértil

que não tomam contracetivos (12).

Na Etiópia, os efeitos adversos com a Miltefosina são piores em indivíduos HIV-

positivos. Ocorreram vómitos em 65% dos indivíduos coinfetados, em comparação com

45% dos indivíduos não coinfetados. A Miltefosina foi utilizada em 39 indivíduos

coinfetados da Europa que apresentaram recaídas após os tratamentos. A cura foi

alcançada em 64% dos indivíduos, mas quase todos tiveram recaídas e retomaram o

tratamento, com sucesso moderado. Verificou-se que o tratamento prolongado é seguro,

já que um paciente recebeu tratamento durante 2 anos. Na Etiópia, a Miltefosina mostrou-

se menos eficaz do que os Antimoniais em indivíduos coinfetados, com 18% e 2% dos



172

indivíduos cujo tratamento inicial falhou e 25% e 11% com recidivas, respetivamente,

em 6 meses. No entanto, no geral, a mortalidade da Miltefosina (6%) foi inferior à dos

Antimoniais (12%). A Miltefosina tem uma semivida de 1 semana e especialmente nos

indivíduos coinfetados recorrentes existe o risco de desenvolver parasitas resistentes. Na

Índia, onde a distribuição de Miltefosfina em larga escala é planeada no contexto de um

programa de eliminação, o seu uso controlado e o conhecimento do estado de HIV dos

indivíduos são de importância crucial. Na Europa e em outras zonas onde a transmissão

de LV é zoonótica, o uso de Miltefosina (e outros fármacos de primeira linha) não deve

ser permitido em cães para evitar o desenvolvimento de resistências (12).

A Miltefosina também tem sido utilizada para o tratamento de LDPK em

indivíduos coinfetados com HIV (13).

5.1.5. Sulfato de Paramomicina ou Aminosidina

O Sulfato de Paromomicina foi licenciado mais recentemente, mas mostrou-se tão

eficaz quanto a ANB e foi muito bem tolerado. Os principais efeitos secundários foram

uma elevação reversível das enzimas hepáticas, em aproximadamente 1% dos indivíduos

e dor no local da injeção. A Paromomicina é a opção terapêutica mais barata, tem um

bom perfil de segurança e é um antibiótico de amplo espectro, eficaz contra bactérias

gram-positivas e gram-negativas, muitos protozoários e Mycobacterium tuberculosis.

Podem desenvolver-se facilmente resistências adquiridas, contudo, a atividade do

fármaco em indivíduos coinfetados ainda não foi estabelecida (12).

5.1.6. Isotionato de Pentamidina

O Isotionato de Pentamidina foi usado para tratar LV principalmente na Índia,

mas foi abandonado devido à gravidade dos seus efeitos adversos e à fraca eficácia. Uma

complicação séria é a Diabetes mellitus irreversível, ocorrendo em 4 a 12% dos casos.

Dada a falta de segurança ao tratar indivíduos coinfetados, devido à sua toxicidade, estes

fármacos não devem ser utilizados para profilaxia secundária, mas reservados para o

tratamento de casos agudos. Ainda assim, a Pentamidina pode ser utilizada em profilaxia

secundária com doses baixas (12). A recomendação é de doses de 4 mg/kg, mensalmente

(13).

É notável que na sequência de um acordo entre a WHO e o fabricante (Sanofi-

Aventis), a Pentamidina esteja disponível gratuitamente para o tratamento de todas as

doenças negligenciadas, incluindo a Leishmaniose (12).



173

5.1.7. Outros Fármacos

Lauletta et al. sugeriram que um ponto importante a ser explorado no tratamento

da Leishmaniose, tanto a Visceral como a Cutânea, é a investigação de novos fármacos

ativos contra todas as espécies de Leishmania sp, com foco no mecanismo de ação para

eliminar o parasita. Esta é, sem dúvida, uma boa opção terapêutica porque, após a cura

clínica, os parasitas continuam presentes em alguns órgãos ou lesões, e se a

imunossupressão ainda está presente, podem ocorrer reações ou recidivas de

Leishmaniose (13).

5.1.8. Combinações

A terapêutica de combinação para LV deve ser introduzida com urgência para

minimizar o desenvolvimento de resistências. Isto é especialmente importante para

indivíduos coinfetados, uma vez que a exposição repetida a fármacos para Leishmaniose

gera, inevitavelmente, resistência. Para além disso, indivíduos com LV incurável ou

indivíduos com LDPK podem transmitir parasitas resistentes a fármacos. Combinações

de Miltefosina e Paromomicina e Antimoniais Pentavalentes e ANB foram estudadas in

vivo e in vitro. Em indivíduos coinfetados, mesmo se estas combinações não impedirem

a recaída, podem preservar a sensibilidade ao fármaco e, portanto, prolongar a

sobrevivência (12). Adicionalmente, uma combinação de ANB-L (30 mg/kg) e

Miltefosina (100 mg/dia durante 14 dias) também foi utilizada para o tratamento de co

infeções na Índia com ótimos resultados, conforme relatado por Mahajan et al. (13).

5.2. Outras Abordagens Terapêuticas

Como abordagens terapêuticas alternativas, sugeriu-se que, na ausência de uma

resposta imunológica adequada, a adição de IFN- ou a terapêutica recombinante com

IL-2 pode ser útil na LV. No entanto, ainda nenhum estudo demonstrou benefícios

adicionais. Uma outra abordagem interessante é a esplenectomia seletiva, que foi avaliada

em indivíduos coinfetados. No entanto, apesar de ser eficaz na restauração de parâmetros

hematológicos e na redução da necessidade de transfusões de sangue, não evitou novas

recaídas. Além disso, este procedimento deve ser evitado devido ao risco de sepsis e

malária grave (12).

5.3. Prevenção

A prevenção da infeção por Leishmania sp consiste, inicialmente, em reduzir a

exposição ao vetor: utilização de inseticidas e mosquiteiros e remoção dos pequenos



174

reservatórios de água (p.e. proteção de contentores com água e remoção de pratos de

vasos). Não é indicada a profilaxia primária, ou seja, profilaxia antes de ocorrer a infecção

e, infelizmente, não existem vacinas disponíveis para o ser humano. Assim, no caso dos

UDI, os programas de troca de seringas podem contribuir para reduzir a transmissão nesta

subpopulação.

No entanto, após o primeiro caso de LV, é recomendada a profilaxia secundária

nos indivíduos coinfetados com uma contagem de linfócitos CD4+ <200 células/L, ou

seja, profilaxia com o objetivo de evitar recaída e manifestação clínica de Leishmaniose.

De todos os fármacos já estudados, aqueles que apresentaram eficácia foram a L-AmB, a

CL-AmB, a Pentamidina e os Antimoniais Pentavalentes. Destes, deve-se considerar

terapêutica de primeira linha a CL-AmB ou L-AmB. Por outro lado, o Alopurinol não é

recomendado devido à sua baixa eficácia.

Na profilaxia secundária com CL-AmB, um estudo demonstra que 78% dos

indivíduos não teve recorrências em 12 meses. Todavia, existe controvérsia quanto à

duração deste tipo de terapêutica. Alguns autores defendem que a profilaxia secundária

deve ser suspensa quando a contagem de linfócitos CD4+ aumenta para 200-350

células/L, enquanto outros aceitam que deve ser continuada indefinidamente (12).


Stefanie Baptista Conclusão

175

CONCLUSÃO

A disseminação e sobreposição de Leishmaniose e infeção por HIV nas principais

áreas endémicas de Leishmaniose, Índia, Brasil e África Oriental, tornam a coinfecção

LV-HIV uma preocupação mundial. Os programas de prevenção de HIV e LV devem

desenvolver atividades de intervenção integradas e bem coordenadas, particularmente em

áreas onde a LV é endémica. Existe a necessidade de desenvolver estratégias localmente

aplicáveis para a intervenção adequada nas comunidades de migrantes já que a

mobilidade das pessoas de áreas onde a doença é não endémica para aquelas em que é

endémica, e a presença de refugiados bem como deslocações internas da população

devido a guerras e conflitos constituem importantes fatores para a propagação de ambas

as doenças (12).

São necessárias mais pesquisas para determinar claramente o impacto da interação

entre Leishmania sp e o HIV, a fim de compreender melhor a imunopatogénese da doença

em indivíduos coinfetados. Isso permitiria melhores estratégias de tratamento e

monitorização de ambas as doenças nestes indivíduos. Apesar disto, é bem compreendido

que a coinfecção Leishmania-HIV induz um défice nas respostas humorais e celulares do

hospedeiro, limitando o valor de diagnóstico dos testes serológicos nos indivíduos

coinfetados. Apenas 40 a 50% dos indivíduos com LV-HIV têm níveis detetáveis de

anticorpos específicos contra Leishmania sp. Existe assim a necessidade de estudos de

análise comparativa de diferentes áreas geográficas, utilizando diferentes técnicas

serológicas, incluindo a contagem de células CD4+, para caracterizar as amostras de soro

(3,12).

Quanto ao diagnostico da coinfecção, tem sido verificado um extraordinário

progresso, nos últimos anos. Na realidade, o principal desafio nos ensaios foi encontrar

um teste padrão, a fim de estabelecer programas estratégicos eficazes para controlar e

erradicar a Leishmaniose. Para além deste aspeto, na coinfecção, a Leishmaniose pode

aparecer sem os sinais clínicos típicos, o que dificulta o diagnóstico, devido à ação

imunossupressora presente. No entanto, a DAT, o Western Blot e o teste de aglutinação

de látex (KAtex) demonstraram ser superiores no diagnóstico destes casos de coinfecção.

Pode ainda ser necessário um teste molecular ou outro exame serológico ou parasitológico

adicional para alcançar um diagnóstico preciso se os resultados dos testes serológicos

forem negativos (3).


Stefanie Baptista Conclusão

176

Todas as terapêuticas para a Leishmaniose são menos eficazes em indivíduos

seropositivos para HIV. Existe uma alta taxa de mortalidade devido a doença coexistente,

complicações e toxicidade dos fármacos. Os Antimoniais Pentavalentes e a ANB são mais

tóxicos para os indivíduos com HIV, que exigem monitorização devido ao risco de

pancreatite, cardiotoxicidade e nefrotoxicidade. Estes fármacos devem ser evitados se

estiver disponível ANB-L. Ao considerar a terapêutica de combinação, os fármacos

devem ser administrados sequencialmente. A Miltefosina é o fármaco mais seguro para

indivíduos coinfetados, embora ainda haja problemas de teratogenicidade a considerar.

Em geral, os indivíduos que não conseguem eliminar o parasita apresentam recaídas,

independentemente do fármaco utilizado. Estas devem ser tratadas adequadamente, e a

terapêutica combinada pode representar a melhor abordagem para evitar a resistência aos

medicamentos, ao mesmo tempo que equilibra os benefícios com a toxicidade dos

mesmos. Os fármacos utilizados no tratamento de recaídas devem ser evitados na

profilaxia secundária (12).

De forma a prevenir a infeção congénita, no caso da mulher grávida deve ser

combinada a ART com a terapêutica para Leishmaniose e, de acordo com Kumar et al. e

Caldas et al., é recomendada a ANB como fármaco de primeira linha por apresentar

menos efeitos adversos materno-fetais (6).

Futuramente, a prioridade na investigação de tratamentos em indivíduos

coinfetados deverá incluir a avaliação da eficácia e tolerância de fármacos alternativos,

bem como combinações com fármacos atualmente disponíveis. Os possíveis benefícios a

serem alcançados deverão incluir uma duração limitada do tratamento, eficácia

melhorada, redução de custos e proteção da resistência a fármacos (12).



177

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Parte IV

IX Mestrado Análises Clínicas Parte IV

Stefanie Baptista Conclusões e Perspetivas Futuras

183

Conclusões e Perspetivas Futuras

O estágio realizado no Laboratório Dr. Joaquim Chaves permitiu-me adquirir

conhecimentos acerca das condições de colheitas exigidas para obter os diferentes

produtos biológicos, o seu transporte e armazenamento. Aprendi a identificar quais os

produtos necessários à execução de cada parâmetro analítico, bem como executar as

metodologias aplicadas aos mesmos. Para além disso, aprendi a interpretar o Controlo de

Qualidade Interno e Avaliação Externa da Qualidade.

Considero que os objetivos da realização do estágio, que passam por adquirir a

capacidade de trabalhar em equipas multidisciplinares, bem como promover a integração

no meio profissional, aplicando os conhecimentos adquiridos ao longo do mestrado,

foram cumpridos. Estes conhecimentos foram também úteis no desenvolvimento da

monografia apresentada neste trabalho. A realização e duração total deste estágio

possibilitou-me colocar em prática os conhecimentos obtidos nas unidades curriculares

do mestrado e ainda obter novas ferramentas para a prática profissional, nomeadamente

a organização das atividades diárias do laboratório, tendo sido muito benéfica para a

minha formação pessoal e para o meu futuro na profissão.

Parte V

IX Mestrado Análises Clínicas Parte V

Stefanie Baptista Anexos

187

ANEXOS

Anexo 1 - Testes de Identificação Microbiológica

a) Coloração de Gram

- Objetivo: serve de diagnóstico presuntivo do agente infecioso, avalia a qualidade

da amostra e orienta a identificação definitiva.

- Reagentes: solução de cristal violeta, solução de lugol, solução de safranina,

metanol, acetona, água reagente Grau I e soro fisiológico estéril.

- Equipamento: aparelho de coloração, bico de bunsen e vortex.

O aparelho realiza a coloração de forma automática, mergulhando as lâminas nos

4 poços, na seguinte ordem:

- Solução de cristal violeta 90 seg;

- Lavagem com água 5 seg;

- Solução de Lugol 90 seg;

- Descoloração com solução metanol/acetona 30 seg;

- Lavagem com água 45 seg;

- Solução de safrina 30 seg;

- Secagem das lâminas 4 min.

De forma a garantir a qualidade da coloração, é efetuado um controlo com duas

estirpes ATCC: E. coli 25922 e S. aureus 25923.

Retiram-se 5 colónias, aproximadamente, de cada estirpe e faz-se uma suspensão

das mesmas em soro fisiológico (2 ml), num tubo de polistireno. Agita-se em vortex e

preparam-se 50 lâminas com a ajuda de uma ansa. Deixa-se secar e fixa-se à chama.

Diariamente, uma destas lâminas é usada como coloração controlo.

- Resultados: as bactérias são classificadas como Gram positivo e Gram negativo.

Nas amostras, podem ser observados leucócitos (coram como Gram negativo), células e

formas parasitárias e leveduriformes, que devem ser referenciados no resultado final.

Caso não se observem microorganismos, é mencionado no boletim “Ausência de

microorganismos”.

b) Teste da Catalase

- Amostra: colónias com 18 a 24h de incubação.

- Objetivo: distinguir Staphylococcus spp. (catalase positiva) de Streptococcus

spp. (catalase negativa).



188

Para realizar este teste, retiram-se algumas colónias do meio de cultura, com uma

ansa ou bastonete, para uma lâmina. Juntam-se 1-2 gotas de peróxido de hidrogénio 3%

e mistura-se com a ansa ou bastonete. Verifica-se se há libertação de oxigénio (pequenas

bolhas).

- Resultados: catalase positiva – libertação de O2

catalase negativa – ausência de libertação de O2

c) Teste para Identificação de Staphylococcus aureus

- Amostra: colónias de uma cultura suspeita de S. aureus em meio Columbia ou

meio Chapman/Manitol.

- Objetivo: deteção simultânea da afinidade para o antigénio do fibrinogénio (fator

de aglutinação), da proteína A, e os polissacáridos capsulares de Staphylococcus aureus.

O kit PastorexTM STAPH-PLUS trata-se de um teste de aglutinação rápida,

englobando partículas de latex azul sensibilizadas com fibrinogénio humano e com

anticorpos monoclonais.

- Resultados: positivo – aglutinação da amostra com o reagente ao fim de 30 s e

ausência de aglutinação do controlo negativo

negativo – ausência de aglutinação da amostra e do controlo

negativo

d) Teste da Oxidase

- Amostra: colónias com morfologia sugestiva, com 18-24h de incubação.

- Objetivo: separar as bactérias Pseudomonadaceae (oxidase positiva) das

Enterobacteriaceae (oxidase negativa). As Neisseriaceae são também oxidase positiva.

Este teste baseia-se na produção intracelular da enzima citocromo oxidase pela

bactéria. Deita-se 1-2 gotas do reagente da oxidase sobre discos de papel não impregnados

e coloca-se sobre o disco a colónia.

- Resultados: oxidase positiva – cor de violeta a púrpura em 10-30 s.

oxidase negativa – reação tardia ou ausência de cor.

e) Teste da Bacitracina

- Amostra: colónias com β-hemólise sugestiva.

- Objetivo: detetar Streptococcus β-hemolíticos do Grupo A de Lancefield.

Coloca-se um disco impregnado com bacitracina na superfície do meio de

Columbia semeado com o microorganismo em estudo, tendo em conta que os

Streptococcus β-hemolíticos do Grupo A de Lancefield são geralmente sensíveis a uma



189

pequena quantidade de Bacitracina. Pelo contrário, os Streptococcus β-hemolíticos de

outros grupos são geralmente resistentes.

- Resultados: positivo – Streptococcus β-hemolíticos do Grupo A – inibição à

volta do disco 15 mm

negativo – Streptococcus β-hemolíticos de outros grupos –

resistência à bacitracina e crescimento à volta do disco

f) Teste da Optoquina

- Amostra: colónias com α-hemólise.

- Objetivo: testar a sensibilidade dos Streptococcus à optoquina.

Coloca-se um disco impregnado com optoquina na superfície do meio de

Columbia semeado com o microorganismo em estudo, tendo em conta que o

Streptococcus pneumoniae é geralmente sensível, ao contrário dos outros Streptococcus.

- Resultados: halo de inibição 15 mm – Eventualmente Streptococcus

pneumoniae.

g) Teste de Grupagem para Identificação de Streptococcus β-

hemolíticos

- Amostra: colónias com β-hemólise.

Este teste baseia-se no facto de os Streptococcus β-hemolíticos possuírem

antigénios específicos de grupo, que podem ser extraídos e identificados através de anti-

soros. O reagente é constituído por partículas de latex sensibilizadas por anticorpos

dirigidos, que quando se ligam aos respetivos antigénios formam uma aglutinação visível

das partículas de latex. Os testes são específicos para Streptococcus β-hemolíticos do

grupo A, B, C, D, F e G.

Prepara-se um extrato com 0,4 ml de enzima, num tubo, e junta-se 2-3 colónias

do meio. Agita-se no vortex e incuba-se 10-15 min a 35ºC. Ao chegar à temperatura

ambiente, homogeniza-se o tubo no vortex e coloca-se numa placa 1 gota de latex e 1

gota de extrato. Por fim, mistura-se com uma ansa durante 2 min.

- Resultados: positivo – Aglutinação em 2 min

negativo – Ausência de aglutinação

h) Galeria de identificação de Neisseria, Haemophilus e Moraxella

catarrhalis

- Amostra: cultura em gelose de sangue com colónias suspeitas de Moraxella

catarrhalis ou gelose de chocolate com suspeita de Neisseria e Haemophilus.



190

- Reagente: API NH

Prepara-se o inócuo com várias colónias (Padrão 4 de McFarland) e aplica-se na

galeria de identificação API NH, que é um sistema padronizado que engloba mini testes.

Após uma incubação de 2 h a 35-37ºC, as reações são lidas visualmente e a identificação

do microorganismo é obtida consultando o manual com a lista de perfis.

i) Identificação serológica de E. coli enteropatogénica

- Amostra: colónia suspeita de E.coli enteropatogénica.

- Reagente: soro aglutinante anti-E. coli nonavalente.

Coloca-se 1 gota de reagente numa placa ou lâmina. Retira-se 1 colóna suspeita

da cultura e faz-se a suspensão diretamente no reagente, com uma ansa, e mistura-se.

- Resultado: positivo – aglutinação imediata (em 5 seg)

negativo – ausência de aglutinação ou aglutinação tardia

j) Identificação de Bactérias anaeróbias (ANC Test Kit)

- Amostra: colónias em cultura pura com 24-48h de incubação. Caso a cultura não

seja pura, fazer um pré-isolamento antes da identificação. Placas em meio de Columbia

ou meio de Schaedler.

- Objetivo: identificação de bactérias anaeróbias e Corynebacterium de relevância

clínica.

- Equipamento: VITEK2 (bioMérieux®).

k) Identificação de Cocos Gram positivo

- Amostra: colónia em cultura pura com 12-48h de incubação. Caso a cultura não

seja pura, faz-se um reisolamento antes do antibiograma. Retira-se uma colónia com a

ansa e semeia-se numa placa de Columbia CNA, que incuba 18-24h a 35±2°C.

- Equipamento: VITEK2

A carta de GP (Gram positivo) tem como objetivo identificar a maior parte dos

cocos Gram positivo de interesse clinico. Cada carta é cheia e selada e colocada no

incubador/leitor, automaticamente, sendo cada uma constituída por 43 teste bioquímicos.

O VITEK2 fornece a identificação em cerca de 8h, baseando-se nas reações químicas e

nos dados do próprio equipamento.

l) Identificação de Bacilos Gram negativo

- Amostra: colónia em cultura pura com 18-24h de incubação. Se não for pura,

faz-se reisolamento antes da identificação. Retira-se uma colónia com a ansa e semeia-se

numa placa de MacConkey, que incuba 24h a 35±2°C.



191


A carta GN (Gram negativo) tem como objetivo identificar a maior parte dos

bacilos Gram negativo fermentadores e não fermentadores. Cada carta é constituída por

47 testes bioquímicos. O VITEK2 fornece a identificação em cerca de 10h, baseando-se

nas reações químicas e nos dados do equipamento.

m) Identificação de Leveduras

- Amostra: colónias em cultura pura com 18-24h de incubação. Se não for pura,

faz-se reisolamento antes da identificação. Retira-se uma colónia com a ansa e semeia-se

numa placa de Sabouraud (com gentamicina e cloranfenicol), que incuba 18-24h.


A carta ID-YST tem como objetivo identificar a maioria dos fungos com interesse

clínico. Cada carta é constituída por 46 testes bioquímicos. O VITEK2 fornece a

identificação em cerca de 15h.

n) Identificação Serológica de Salmonella spp.

- Amostra: colónias de Salmonella identificadas bioquimicamente.

Após a identificação da Salmonella através de testes bioquímicos, esta deve ser

confirmada serologicamente com um soro polivalente para as aglutininas somáticas,

incluindo também o antigénio capsular.

o) Identificação de Neisseria, Haemophilus, Campylobacter spp. E

Gardnerella vaginalis

- Amostra: colónias em cultura pura com 18-24h de incubação em meio de

Chocolate Haemophylus, Campylosel ou Chocolate VCAT. Se não for pura, faz-se

reisolamento antes da identificação.


A carta IDNH tem como objetivo identificar Neisseria spp., Haemophilus spp.,

Campylobacter spp. e Gardnerella vaginalis. Cada carta é constituída por 30 testes

bioquímicos. O VITEK2 fornece a identificação em cerca de 6h.

Anexo 2 - Testes de Sensibilidade/Antibiograma

a) Antibiograma em placa (método de difusão Kirby-Bauer)

- Amostra: 4 a 5 colónias retiradas de um meio com 18-24h de incubação.



192

- Material: placas de Mueller-Hinton simples, Mueller-Hinton com 5% de sangue

de carneiro ou chocolate com Polyvitex. Estufa de CO2 para o Haemophilus spp. e

Neisseria gonorrhoeae. Discos impregnados de antibiótico.

Método de primeira linha para Neisseria e Streptococcus β-hemolítico. Método

alternativo ou confirmatório para Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp. e outros Gram

negativo não fermentadores, Staphylococcus spp., Enterococcus spp. e Haemophilus spp..

b) Antibiograma em galeria (fungos)

- Amostra: 2 colónias de uma cultura pura em meio de Sabouraud.

- Objetivo: estudar o crescimento dos fungos na presença de 6 antifúngicos.

O Fungitest utiliza o meio RPMI 1640 modificado e os antifúngicos Anfotericina

B, 5-Fluorocitosina, Miconazol, Cetoconazol, Itraconazol e Fluconazol, a duas

concentrações diferentes.

c) Antibiograma em galeria para Haemophilus e Branhamella

- Amostra: algumas colónias de uma cultura pura com 18-24h de incubação.

- Objetivo: determinar a sensibilidade de Haemophilus e Moraxella em meio

semissólido em condições próximas das técnicas de referência de diluição em gelose ou

microdiluição.

Os antimicrobianos testados são a Ampicilina, Amoxicilina/Ácido clavulânico,

Cefalotina, Tetraciclina, Ofloxacina, Cotrimoxazol, Rifampicina, Cloranfenicol,

Cefuroxima, Cefotaxima e são reportados segundo as recomendações do CLSI.

d) Antibiograma automatizado para bacilos Gram negativo


faz-se reisolamento antes do antibiograma. Retira-se uma colónia com a ansa e semeia-

se numa placa de MacConkey, que incuba 24h a 35±2°C.

- Material: placas em meio de meio de MacConkey, meio de Cled e meio de

Columbia.


O antibiograma do VITEK2 é um sistema automatizado que se baseia na

concentração mínima inibitória (CMI).

A carta AST tem como objetivo avaliar a sensibilidade de bacilos gram negativo

aeróbios (clinicamente significativos) aos antimicrobianos e pode ser utilizada

juntamente com a carta de identificação correspondente.



193

Cada carta é constituída por 64 micropoços, incluindo um poço controlo com uma

suspensão bacteriana a estudar. Cada poço contém uma determinada quantidade de um

agente antimicrobiano associado ao meio de cultura. O VITEK2 monitoriza o

crescimento em cada poço e ao fim de 18h é calculado a CMI para cada antimicrobiano.

e) Antibiograma automatizado para cocos Gram positivo


faz-se reisolamento antes do antibiograma. Retira-se uma colónia com a ansa e semeia-

se numa placa de Columbia, que incuba 18-24h.

- Material: placas em meio de meio de MacConkey, meio de Cled e meio de

Columbia.


A carta AST tem também como objetivo avaliar a sensibilidade de cocos gram

positivo (clinicamente significativos).

Ver alínea d).

f) Antibiograma automatizado para Fungos Leveduriformes

- Amostra: colónias em cultura pura com 18-24h de incubação. Placas em meio

de Sabouraud.

Cada carta é constituída por 64 micropoços, incluindo um poço controlo com uma

suspensão fúngica a estudar. Cada poço contém uma determinada quantidade de um

agente antimicrobiano associado ao meio de cultura. O VITEK2 monitoriza o

crescimento em cada poço e ao fim de 18h é calculado a CMI para cada antimicrobiano.

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