UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO ESCOLA DE ENGENHARIA...
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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO ESCOLA DE ENGENHARIA DE LORENA JULIA MARIA DE ARAUJO FARIA Validação de método analítico para análise de um pesticida em feijão por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a espectrometria de massas – CLAE - EM/EM Lorena 2015
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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
ESCOLA DE ENGENHARIA DE LORENA
JULIA MARIA DE ARAUJO FARIA
Validação de método analítico para análise de um pesticida em feijão por
cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a espectrometria de massas
– CLAE - EM/EM
Lorena
2015
AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIOCONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE
Ficha catalográfica elaborada pelo Sistema Automatizadoda Escola de Engenharia de Lorena,
com os dados fornecidos pelo(a) autor(a)
Faria, Júlia Maria de Araújo Validação de método analítico para análise de umpesticida em feijão por cromatografia líquida dealta eficiência acoplada a espectrometria de massas –CLAE - EM/EM / Júlia Maria de Araújo Faria;orientadora Jayne Carlos de Souza Barboza. - Lorena,2015. 48 p.
Monografia apresentada como requisito parcialpara a conclusão de Graduação do Curso de EngenhariaIndustrial Química - Escola de Engenharia de Lorenada Universidade de São Paulo. 2015Orientadora: Jayne Carlos de Souza Barboza
1. Validação. 2. Pesticida. 3. Clae. 4. Boaspráticas de laboratório. 5. Feijão. I. Título. II.Barboza, Jayne Carlos de Souza, orient.
JULIA MARIA DE ARAUJO FARIA
Validação de método analítico para análise de um pesticida em feijão por
cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a espectrometria de massas –
CLAE - EM/EM
Monografia apresentada à Escola de
Engenharia de Lorena da Universidade
de São Paulo como requisito para
graduação em Engenharia Industrial
Química.
Orientadora: Profa. Dra. Jayne Carlos de
Souza Barboza
LORENA
2015
Dedico esta monografia a minha família,
amigos, professores e principalmente a
Deus.
Agradecimentos
Agradeço primeiramente a Deus que me deu o dom da vida e colocou em meu
caminho pessoas e oportunidades que me ajudaram a chegar onde estou hoje. À
minha mãe Ednéia, por ser um exemplo para mim, por me amar incondicionalmente e
por todos ensinamentos. Ao meu pai, que sempre me deu suporte e conselhos durante
sua vida. À minha querida professora Mara, que foi a primeira pessoa a acreditar no
meu potencial e me dar a oportunidade que mudou a minha vida. Agradeço também
aos amigos que fiz durante este período.
Agradeço a todos os professores da EEL pelos ensinamentos na sala de aula.
Agradeço ao meu namorado Wallace, que esteve comigo em todos os momentos me
dando força e me ajudando a crescer como pessoa.
Agradeço também aos amigos do trabalho onde esta monografia foi desenvolvida, em
especial Matheus, Marcella, Roberta, por me ajudarem com o desenvolvimento da
parte experimental e com meu desenvolvimento profissional.
“O único lugar aonde o sucesso vem antes
do trabalho é no dicionário. ”
Albert Einstein
RESUMO
FARIA, J. M. de. A. Validação de método analítico para análise de um pesticida em feijão por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a espectrometria de massas – CLAE - EM/EM Monografia (Conclusão do curso Engenharia Industrial Química) – Escola de Engenharia de Lorena, Universidade de São Paulo, 2015.
O trabalho demonstrou como é feita a validação de um método analítico
para análise de um pesticida seguindo-se as normas exigidas pelos órgãos
reguladores brasileiros. A validação de uma metodologia analítica é uma ferramenta
que visa evidenciar e garantir a confiabilidade dos resultados obtidos através da
mesma. No Brasil, qualquer laboratório que pretenda gerar estudos de resíduo para
as agências regulatórias, para fins de submissão de registro de pesticidas, deve
validar toda metodologia envolvida nas análises necessárias para o estudo no
laboratório em que foram gerados os dados. Além disso, deve garantir que todos os
dados foram gerados seguindo-se os princípios de boas práticas de laboratório, por
tratar-se de um estudo que envolve a segurança alimentar do ser humano. Neste
trabalho realizou-se a validação da metodologia de análise para cultura do feijão, que
é cultura representativa do grupo de alto teor de proteína, segundo a RDC nº4 da
ANVISA. Esta validação teve como objetivo possibilitar a execução de qualquer
estudo de amostras contendo resíduo de um dado pesticida, que será chamado de
composto X. Por tratar-se de um estudo de pesquisa e desenvolvimento não foram
citados o nome do pesticida, dos solventes utilizados nas etapas de extração,
purificação e análise cromatográfica, uma vez que o objetivo era a avaliação dos
critérios de validação, que são aplicáveis a qualquer pesticida. O método de análise
baseou-se na extração do pesticida utilizando-se um solvente orgânico, seguido de
partição líquido-líquido com solvente orgânico e aquoso e evaporação com
ressuspensão com solvente apropriado para injeção no sistema de cromatografia
líquida de alta eficiência. O método foi validado com sucesso e obedeceu a todos os
critérios descritos no artigo 23 da RDC Nº4 de 18 de janeiro de 2012.
Palavras-chave: Validação; Pesticida; CLAE; Boas Práticas de Laboratório; Feijão
LISTA DE EQUAÇÕES
Equação 1. Equação da reta .................................................................................... 23
Equação 2. Cálculo do coeficiente de variação ........................................................ 24
Equação 3. Cálculo da influência de matriz .............................................................. 44
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Agrupamento de culturas para validação e estudos de estabilidade de
resíduos de pesticida ............................................................................................... 21
Tabela 2.Exemplo de preparo das soluções padrão de fortificação .......................... 33
Tabela 3.Exemplo de preparo das soluções padrão de calibração ........................... 34
Tabela 4. Resultados de recuperação da validação em feijão – Transição de
quantificação ............................................................................................................. 39
Tabela 5. Resultados de recuperação da validação em feijão – Transição de
confirmação ............................................................................................................... 40
Tabela 6. Influência da matriz na resposta do equipamento – Transição de
quantificação ............................................................................................................. 43
Tabela 7.Influência da matriz na resposta do equipamento – Transição de confirmação
.................................................................................................................................. 43
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Estrutura de um pleito de registro.............................................................. 19
Figura 2. Esquema de um sistema modular de CLAE .............................................. 26
Figura 3. Linearidade da curva de calibração – Transição de quantificação ............ 35
Figura 4. Linearidade da curva de calibração – Transição de confirmação .............. 36
Figura 5. Cromatograma da SPC de concentração 0,200 ng/mL ............................. 37
Figura 6. Cromatograma do branco de reagentes .................................................... 37
Figura 7. Cromatograma da amostra testemunha utilizada para fortificação ........... 38
Figura 8. Cromatograma da amostra fortificada no nível do LOQ ............................ 38
Figura 9. Cromatograma da amostra testemunha com adição de padrão de
concentração 0,500 ng/mL ........................................................................................ 41
Figura 10. Cromatograma da amostra testemunha com adição de padrão de
concentração 1,00 ng/mL .......................................................................................... 41
Figura 11. Cromatograma da amostra testemunha com adição de padrão de
concentração 2,00 ng/mL .......................................................................................... 41
LISTA DE SIGLAS
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
BPL Boas Práticas de Laboratório
CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
EM Espectrometria de massas
EMBRAPA Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária
IBAMA Instituto Brasileiro do Meio Ambiente
INMETRO Instituto Nacional de Metrologia
LMR Limite máximo de resíduo
LOD Limite de detecção (limit of detection)
LOQ Limite de quantificação (limit of quantification)
MAPA Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento
MMA Ministério do Meio Ambiente
MS Ministério da Saúde
OCDE Organização para a Cooperação e Desenvolvimento Econômico
RDC Resolução da Diretoria Colegiada
RET Registro Especial Temporário
SPE Solução Padrão Estoque
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 14
2. OBJETIVOS ............................................................................................................. 15
2.1.Objetivos específicos ............................................................................................. 15
3. JUSTIFICATIVA ....................................................................................................... 16
4. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ..................................................................................... 16
4.1.Cultura do feijão no Brasil ....................................................................................... 16
4.2. Legislação de Agrotóxicos ................................................................................. 17
4.3. Princípios das Boas Práticas de Laboratório .................................................... 18
4.4. Registro de pesticidas no Brasil ........................................................................ 19
4.5. Critérios de validação ......................................................................................... 20
4.5.1. Especificidade/ seletividade ............................................................................ 22
4.5.2. Curva de calibração e linearidade ................................................................... 22
4.5.3. Sensibilidade .................................................................................................. 23
4.5.4. Precisão ......................................................................................................... 23
4.5.5. Exatidão/Recuperação ................................................................................... 24
4.5.6. Limite de detecção ......................................................................................... 24
4.5.7. Limite de quantificação ................................................................................... 25
4.6. Cromatografia líquida de alta eficiência – CLAE ............................................... 25
4.6.1. O início da cromatografia líquida de alta eficiência ......................................... 25
4.6.2. Equipamentos para CLAE .............................................................................. 26
4.6.2.1. Reservatórios de fase móvel e desgaseificador ....................................... 27
4.6.2.2. Bombeamento ......................................................................................... 27
4.6.2.3. Injetores de amostra ................................................................................ 28
4.6.2.4. Colunas ................................................................................................... 28
4.6.2.5. Fases estacionárias ................................................................................. 29
4.6.2.6. Fases móveis .......................................................................................... 29
4.6.2.7. Detectores ............................................................................................... 30
4.6.2.8. Espectrometria de massas Tandem (EM/EM).......................................... 30
5. MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................................ 31
5.1.Materiais .................................................................................................................... 31
5.1.1. Solventes, reagentes e padrões ..................................................................... 31
5.1.2. Equipamentos ................................................................................................. 31
5.1.3. Vidrarias ......................................................................................................... 32
5.1.4. Outros materiais ............................................................................................. 32
5.2. Métodos ................................................................................................................ 33
5.2.1. Preparo das soluções padrão ......................................................................... 33
5.2.2. Extração, purificação e quantificação ............................................................. 34
6. Resultados e discussão.......................................................................................... 35
6.1. Linearidade da curva de calibração ................................................................... 35
6.2. Especificidade/seletividade ................................................................................ 36
6.3. Precisão/exatidão ................................................................................................ 39
6.4. Influência da matriz na resposta do equipamento ............................................ 40
7. Conclusão ................................................................................................................ 44
REFERÊNCIAS ................................................................................................................... 46
Anexo A – Termo de permissão de uso de informações ................................................ 48
14
1. INTRODUÇÃO
A agricultura exerce um papel fundamental na sociedade e tem como
desafio a produção de alimentos em áreas cada vez menores e com a incidência
de pragas e doenças. Para que seja possível alcançar uma produtividade que
atenda a demanda do mercado faz-se necessário o uso de defensivos agrícolas.
No Brasil a Lei 7.802/89 condicionou os agrotóxicos à obtenção de um registro,
baseado na submissão pela empresa requerente de um conjunto de dados de
desempenho agronômico e de estudos de toxicologia ambiental e humana perante
os três entes públicos reguladores (MAPA, IBAMA e ANVISA) (FRANCO, 2014).
Em 1994, o Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais
Renováveis (IBAMA), exigiu que a condução dos estudos eco toxicológicos fosse
feita por laboratórios que trabalhassem de acordo com as Boas Práticas de
Laboratório (BPL), e em 1997 juntamente com o Instituto Nacional de Metrologia
Qualidade e Tecnologia (INMETRO) publicou uma portaria estabelecendo os critérios
de BPL para o credenciamento feito pelo INMETRO (RODRIGUES; SOUZA;
WATANABE, 2012).
Boas Práticas de Laboratório é um sistema de garantia da qualidade
que abrange as condições nas quais os estudos não clínicos de saúde e de
segurança ao meio ambiente são planejados, desenvolvidos, monitorados,
registrados, arquivados e relatados (INMETRO; NIT-DICLA-035, 2011). A
Resolução da ANVISA – RDC nº4 de 18 de janeiro de 2012 ainda dispõe sobre
todos os critérios para realização de estudos de resíduo de agrotóxicos para fins
de registro no Brasil e o presente trabalho utilizou estes critérios para a validação
da metodologia de análise.
Esta resolução declara no Artigo 20º, parágrafo 1º, inciso I que “a
validação do método deve ser feita no laboratório executor das análises, garantindo
que o procedimento analítico empregado seja adequado às especificações requeridas
para tal análise, quando produzidas no próprio laboratório” (ANVISA; RDC Nº4, 2012).
A validação do método deve ser realizada para evidenciar e garantir que o
método é adequado ao objetivo desejado. O método deve ser testado para avaliar a
sensibilidade, média das recuperações e precisão. Os estudos de recuperação são
15
utilizados para verificar a acurácia do método. São necessárias, no mínimo, 5
replicatas, para verificar a precisão, tanto nos limites de quantificação, quanto em um
nível de maior concentração (ANVISA; RE nº 899, 2003).
O feijão é um dos alimentos mais consumidos no Brasil, ele é a principal
fonte proteica de origem vegetal nos países em desenvolvimento, com um teor de
proteína de 20 a 30%. O Brasil além de ser um dos maiores consumidores deste
grão, também é o maior produtor do chamado feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris
L.), seguido pelo México (EMBRAPA, 2015). Esta leguminosa que é produzida
durante o ano todo sofre com uma variedade de pragas e doenças que podem
minar a produtividade e qualidade do produto final.
No presente trabalho foi realizada a validação da metodologia analítica
na cultura do feijão, que pode ser considerada uma cultura representativa do grupo
de alto conteúdo de proteína. Assim, será possível não somente realizar estudos
cuja matriz seja feijão, como todas culturas que façam parte deste grupo.
2. OBJETIVOS
Este trabalho de conclusão de curso teve como objetivo principal a
validação de um método para análise de um pesticida (composto X) utilizando-se
cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas para que a
metodologia possa ser utilizada no laboratório para posteriores estudos de
resíduos deste pesticida em culturas que fazem parte do grupo de alto conteúdo
de proteína.
2.1.Objetivos específicos
Validação da metodologia seguindo-se os critérios da RDC Nº4/2012
para análise do composto X em feijão;
Avaliação do efeito desta matriz na resposta do equipamento;
Aplicação dos princípios de boas práticas de laboratório.
16
3. JUSTIFICATIVA
A importância deste trabalho é assegurar a confiabilidade e rastreabilidade,
por meio dos princípios de Boas Práticas de Laboratório, dos dados gerados em
estudos que envolvem a avaliação da segurança alimentar e ambiental no uso de um
agrotóxico. Além disso a necessidade da validação de um método analítico no
laboratório executor de tais estudos é uma exigência do órgão regulamentador federal.
4. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
4.1.Cultura do feijão no Brasil
Por ser um dos alimentos mais consumidos no Brasil o feijão é a
principal fonte proteica de origem vegetal no país, com um teor de proteína de 20
a 30%. Além disso o Brasil é um dos maiores produtores deste grão, chamado
feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris L.), seguido pelo México (EMBRAPA, 2015).
A safra do grão é dividida em três etapas, a primeira, conhecida como safra das águas
é assim chamada porque o plantio e a colheita são beneficiados pelo alto índice de
chuvas. O plantio dessa safra na região Centro-Sul vai de agosto a dezembro e no
Nordeste, de outubro a fevereiro. Feita no período com o menor índice de chuva no
país, a segunda safra é chamada de safra da seca. O plantio acontece de dezembro
a março. A terceira safra é a irrigada, é assim conhecida por se referir à colheita do
feijão irrigado, que têm a concentração do plantio na região Centro-Sul, de abril a
junho. O feijão pode ser colhido em média após 90 dias de plantado (MAPA, 2015).
Com isso consegue-se a disponibilidade desta leguminosa durante o ano
todo. O feijoeiro comum é afetado por diversas pragas e doenças, que comprometem
não só a produtividade como também a qualidade do produto final. Por isso se faz
necessário o uso de métodos para minimizar estas pragas por meio de controle
químico.
Para que haja no mercado, cada vez mais, opções de controle para as mais
variadas doenças é necessário o desenvolvimento de novos produtos e consequente
pesquisa, dentre as quais se encontra a presente neste trabalho.
17
4.2. Legislação de Agrotóxicos
No Brasil a regulamentação do uso de agrotóxicos foi feita por meio da lei
7.802 elaborada em 11 de julho de 1989. Ela dispõe sobre a experimentação,
produção, comercialização, entre outros aspectos que tangem a utilização de
agroquímicos tanto para fins de exportação quanto de importação. Ela define
agrotóxico como:
“Produtos e os agentes de processos físicos, químicos ou biológicos, destinados ao uso nos setores de produção, no armazenamento e beneficiamento de produtos agrícolas, nas pastagens, na proteção de florestas, nativas ou implantadas, e de outros ecossistemas e também de ambientes urbanos, hídricos e industriais, cuja finalidade seja alterar a composição da flora ou da fauna, a fim de preservá-las da ação danosa de seres vivos considerados nocivos” (Artigo 2º, Lei 7.802 de 1989).
Esta lei define como obrigatório o registro do produto no órgão federal antes
de sua utilização. Para fins de pesquisa e experimentação há a concessão de um
registro especial temporário (RET) que permite a utilização do produto em testes em
quantidades e localização controlada. Ela também define que somente serão
concedidos registros a produtos que apresentem maior eficácia agronômica e menor
toxicidade do que os já existentes no mercado. Além disso, estabelece critérios de
rejeição para aqueles que os estudos toxicológicos, eco toxicológicos evidenciem
risco de câncer, danos ao aparelho reprodutor humano e danos ao meio ambiente.
A Lei nº 7.802/89 define que a aceitação do registro de um agrotóxico
depende de três órgãos de regulação, sendo cada um deles a competência da análise
dos seguintes aspectos:
Ministério da Agricultura e Pecuária (MAPA): eficiência e necessidade
agronômica;
Ministério da Saúde (MS) / ANVISA: análise toxicológica para o ser humano na
exposição de trabalhadores que lidam com agrotóxicos e segurança alimentar
do consumidor;
Ministério do Meio Ambiente (MMA) / IBAMA: impactos ambientais.
Após a análise e aceitação dos estudos requeridos pelos três órgãos, é
papel do MAPA conceder o registro (FRANCO, 2014).
18
4.3. Princípios das Boas Práticas de Laboratório
Todos os dados apresentados neste trabalho de conclusão de curso foram
gerados segundo os princípios de BPL uma vez que esta validação será apresentada
no pacote de dados para submissão no pleito de registro do composto X para a cultura
do feijão.
Boas Práticas de Laboratório é um sistema de qualidade que abrange o
processo organizacional e as condições nas quais estudos não-clínicos de saúde e
de segurança ao meio ambiente são planejados, desenvolvidos, monitorados,
registrados, arquivados e relatados (INMETRO; NIT-DICLA-035, 2011).
O IBAMA, por meio da portaria nº139, de 21 de dezembro de 1994, definiu
que os estudos toxicológicos, eco toxicológicos e físico-químicos para avaliação de
agrotóxicos deveriam ser realizados por laboratórios acreditados pelo INMETRO,
segundo os princípios de BPL. Assim, em 1995 iniciou-se no Brasil um programa de
reconhecimento de conformidade aos princípios de BPL e a partir daí o INMETRO
tomou várias ações como a criação de um curso para inspetores em BPL e a
publicação da NIT-DICLA-035, que é uma tradução do documento da Organização
para a Cooperação e Desenvolvimento Econômico – OCDE chamado “OECD Series
on Principles of Good Laboratory Practice”.
O programa brasileiro BPL passou por uma avaliação da OCDE, em
novembro de 2009, e em maio de 2011 obteve a aceitação mútua de dados para
Avaliação de Produtos Químicos, incluindo testes não-clínicos de segurança
ambiental e saúde humana para as substâncias "agrotóxicos, seus componentes e
afins". Ou seja, a partir de 2011, os estudos desse tipo, gerados no Brasil por
laboratórios em conformidade com a BPL, podem ser aceitos nos países membros da
OCDE e não membros com adesão plena à aceitação mútua de dados (INMETRO,
2015).
Isso foi de grande importância para a comercialização internacional dos
produtos agrícolas brasileiros.
19
4.4. Registro de pesticidas no Brasil
Como dito, no Brasil qualquer agrotóxico deve possuir um registro antes de
qualquer atividade, seja ela de experimentação, produção ou utilização. O MAPA tem
o papel de concessão do registro desde que a ANVISA e o IBAMA tenham aceitos os
estudos cuja análise esteja sob sua responsabilidade. A estrutura de um pleito de
registro está apresentada na Figura 1.
Figura 1.Estrutura de um pleito de registro
Fonte: Adaptado do Manual de procedimentos para registro de agrotóxicos
São exigidos um grande número de estudos de âmbito agronômico,
toxicológico e eco toxicológico. Um destes estudos é o estudo de resíduos de
agroquímicos que permanecem no alimento. E para que um laboratório possa
executar tal estudo é necessário que ele possua a metodologia analítica validada, de
acordo com critérios que serão explorados, mais adiante, na cultura na qual pretende-
se obter o registro ou em uma cultura representativa da qual esta cultura faz parte.
20
4.5. Critérios de validação
As diretrizes para a realização de um estudo de resíduos de agrotóxicos para
fins de registro no Brasil estão estabelecidas na RDC nº 4 de 18 de janeiro de 2012.
Esta resolução estabelece no artigo 3º, parágrafo 1º a obrigatoriedade da validação
do método no laboratório que executa a análise para garantir que o procedimento seja
adequado às especificações requeridas. No artigo 23 ela dispõe sobre os critérios
mínimos que devem ser avaliados em uma validação, são eles:
Especificidade/seletividade;
Curva de calibração/ linearidade;
Sensibilidade;
Precisão;
Exatidão/ recuperação;
Limite de detecção;
Limite de quantificação.
Estabelece ainda no artigo 23, parágrafo 4º o conceito de cultura representativa
que permite que a validação seja estendida para matrizes que pertençam a um mesmo
grupo de cultura. O agrupamento de culturas é apresentado na tabela1:
21
Tabela 1. Agrupamento de culturas para validação e estudos de estabilidade de resíduos de pesticida
Categoria da cultura
Cultura Cultura típica representativa
Alto conteúdo de água
Pomáceas Frutas com caroço, vegetais de bulbos, frutificação legumes /cucurbitáceas, brássicas vegetais folhosos e ervas frescas caule e vegetais caule, legumes frescos tubérculos, cana de açúcar, chá verde, cogumelo oleaginosas, azeitonas, abacate, lúpulo, cacau, grãos de café, especiarias
Maçã, Pêra, damasco, cereja, pêssego, cebola, tomate, melão, pimentão, pepino, melancia, couve-flor, couve de bruxelas, couve, repolho, alface, espinafre, alho-poró, salsão, aspargo, tabaco ervilha em fava, grão de bico, feijão em fava
Alto conteúdo de óleo
Frutos de casca dura Noz, avelã, castanha, colza, girassol, algodão, soja, amendoim
Alto conteúdo de proteína
Legumes secos Feijão, ervilha, lentilha
Alto conteúdo de amido
Grão de cereal, tubérculos, raízes Trigo, centeio, cevada, arroz e aveia, beterraba (tubérculo), cenoura, batata, batata doce, inhame, cará, mandioca
Alto conteúdo ácido
Frutas cítricas, frutas pequenas, groselhas, uvas, kiwis, abacaxi ruibarbo
Limão, mandarina, tangerina, laranja, morango, amora, framboesa
Fonte: Adaptação do anexo II da RDC nº4 de 18 de janeiro de 2012
Antes de falar sobre cada um destes critérios é necessário introduzir a
terminologia utilizada em estudos de resíduo que também está definida nesta
resolução:
Amostra-tratada: Parte do sistema teste que foi submetida ao tratamento com o
pesticida em experimentação, com a dose, forma de aplicação e carência pretendidos
para registro
Amostra-testemunha: Parte do sistema teste mantido nas mesmas condições das
amostras tratadas, mas que não foi submetida ao tratamento com o pesticida
Limite de quantificação – LOQ: valor mínimo de resíduo de agrotóxico que pode ser
quantitativamente identificado pelo método empregado
Limite de detecção – LOD: valor mínimo que pode ser detectado, não quantitativo,
pelo método empregado
22
Limite máximo de resíduo – LMR: valor máximo de resíduo encontrado no estudo de
resíduo
Amostra fortificada: Amostra na qual foi colocada uma quantidade conhecida do
analito, através dela é possível observar as perdas que ocorrem durante a rota
analítica.
Em uma validação de uma metodologia para análise de resíduos de
pesticida deve-se conduzir no mínimo dois níveis de fortificação, sendo que o menor
deles deve ser o LOQ do método, repetidos pelo menos 5 vezes. A recuperação média
de cada nível deve estar compreendida entre 70-120% e possuir um coeficiente de
variação menor que 20%. Outros critérios de uma validação serão descritos adiante.
4.5.1. Especificidade/ seletividade
A amostra pode possuir substâncias que interferem na análise. Estes
interferentes podem reduzir ou aumentar o sinal. Além disso esta interferência pode
depender da concentração. Para avaliar a seletividade de uma metodologia podem
ser feitos ensaios com padrões de referência com amostras com e sem o analito. Se
não for possível assegurar a seletividade da metodologia outros parâmetros como
linearidade, recuperação e precisão estarão prejudicados.
Ainda neste critério de validação, a RDC Nº 4/2012 especifica no artigo 23,
parágrafo 3º, inciso I que a amostra-testemunha utilizada para fortificação na
validação não deverá apresentar interferentes em concentrações iguais ou superiores
a 30% (trinta por cento) do limite de quantificação – LOQ do método (ANVISA; RDC
Nº4, 2012).
4.5.2. Curva de calibração e linearidade
Os equipamentos de medição, em sua maioria, estabelecem a sua faixa
dinâmica linear. É preciso, porém, constatar até quando esta faixa de concentração
do analito conjuga-se com a faixa dinâmica linear do equipamento. É importante que
seja conhecida a interdependência entre a resposta medida e a concentração do
23
analito. A linearidade é obtida por padronização interna ou externa e a equação da
reta que relaciona as duas variáveis é (Equação 1):
Equação 1. Equação da reta
y = a + bx
Sendo:
y = resposta medida (altura ou área do pico, etc.);
x = concentração;
a = interseção com o eixo y, quando x = 0;
b = inclinação da curva analítica
Vários níveis de concentração do analito são necessários para avaliação
da linearidade da curva de calibração sendo necessários no mínimo 5 pontos (DOQ-
CGCRE-008, 2011). A RDC nº4 ainda diz que cada um deles deverá ser injetado pelo
menos três vezes e que a curva deve apresentar coeficiente de correlação maior ou
igual a 0,99.
4.5.3. Sensibilidade
O método é considerado mais sensível quando pequenas variações de
concentração produzem uma grande variação na resposta, resultando em uma maior
inclinação da reta (b).
4.5.4. Precisão
A precisão é utilizada para avaliar a dispersão dos resultados e é verificada
através das replicatas dos pontos da curva de calibração que não devem apresentar
um coeficiente de variação maior que 20%. O mesmo critério se aplica para as
amostras fortificadas em um mesmo nível, ou até mesmo em dois níveis diferentes. O
24
coeficiente de variação, conhecido também como desvio padrão relativo, pode ser
calculado através da seguinte fórmula (Equação 2):
Equação 2. Cálculo do coeficiente de variação
CV = DVR = DPMD ×
Onde:
CV: Coeficiente de variação;
DVR: Desvio padrão relativo;
DP: Desvio padrão;
MD: Média dos valores encontrados.
4.5.5. Exatidão/Recuperação
Tanto nos padrões da curva quanto nas amostras fortificadas, a
concentração teórica do analito é conhecida e através dos valores de recuperação
apresentados pelos padrões da curva de calibração e das amostras fortificadas é
possível analisar a exatidão comparando-se o valor teórico com o real. Como dito,
cada um dos níveis de fortificação deve apresentar média de recuperação entre 70-
120%, enquanto para os padrões da curva devem estar compreendidos entre 70-
130%. As recuperações acima de 100 % podem ser causadas por pequenas
contaminações na rota analítica, erros no preparo do padrão de fortificação, efeito da
matriz na resposta do equipamento, entre outros.
4.5.6. Limite de detecção
Quando a análise envolve analitos que apareçam como traços na amostra
é importante definir o limite de detecção do método que será o menor valor o qual
25
pode ser identificado o analito sem poder dizer com certeza sua quantidade. Nos
estudos de resíduo ele é considerado 20% do valor do limite de quantificação.
4.5.7. Limite de quantificação
Em um estudo de resíduo o limite de quantificação do método é o menor
valor que pode ser obtido quantitativamente pela metodologia empregada. Este valor
será utilizado na validação como menor nível de fortificação.
4.6. Cromatografia líquida de alta eficiência – CLAE
De todas as técnicas cromatográficas nas quais a fase móvel é líquida, a
cromatografia líquida de alta eficiência talvez seja a melhor. Seu campo de aplicação
ultrapassa o da cromatografia gasosa, sendo capaz de efetuar análise de compostos
não voláteis, que tendem a se decompor com calor, muito polares ou com um peso
molecular elevado. Outro ponto importante desta técnica é a seletividade que pode
ser alcançada explorando-se as muitas interações que podem ocorrer entre a coluna,
fase móvel e o analito (ROUESSAC,1994). Esta técnica de separação é utilizada para
análise de uma variedade de compostos de interesse industrial como: aminoácidos,
proteínas, hidrocarbonetos, drogas, pesticidas, entre outros.
4.6.1. O início da cromatografia líquida de alta eficiência
A CLAE é uma técnica analítica derivada de uma antiga forma de
cromatografia líquida. A cromatografia líquida foi feita inicialmente utilizando-se
colunas de vidro com diâmetros de 1 a 5 cm e comprimentos de 50 a 500 cm. Para
que a vazão da coluna fosse razoável, o diâmetro de partícula da fase estacionária
deveria estar entre 150 a 200 µm. A despeito disso, as vazões obtidas eram muito
pequenas, na ordem de décimos de milímetros por minuto levando a tempos de
separação em horas.
26
Tentativas de aumentar a vazão por meio da aplicação de bombeamento
não trouxeram bons resultados pois diminuíam a eficiência da coluna. Mais tarde os
cientistas descobriram que a diminuição do tamanho das partículas da fase
estacionária conduzia a um aumento da eficiência. A tecnologia necessária para
produção e uso destas fases estacionárias, com partículas de 3 a 10 µm só foi
desenvolvida no fim da década de 60. Necessitava-se de equipamentos que
operassem a altas pressões, bem diferentes das colunas de vidro utilizadas na técnica
anterior (SKOOG, 2002). A técnica moderna melhorou em relação a antiga em termos
de seletividade, resolução através da miniaturização e do uso de fases estacionárias
mais elaboradas.
4.6.2. Equipamentos para CLAE
Um sistema de CLAE é composto por várias unidades específicas que
podem ser encontradas separadamente ou integradas. Um esquema é mostrado na
figura 2.
Figura 2.Esquema de um sistema modular de CLAE
Fonte: Adaptado do livro de Francis Rouessac
27
O sistema modular facilita a adaptação da instalação de acordo com a
aplicação a ser feita. O modelo vertical dos diferentes módulos oferece uma economia
espacial
.
4.6.2.1. Reservatórios de fase móvel e desgaseificador
Os sistemas modulares de CLAE possuem um ou mais reservatórios para
solventes utilizados como fase móvel durante a análise, que podem ser de vidro ou
aço inoxidável. Estes reservatórios estão ligados a um sistema de remoção dos gases
dissolvidos - geralmente oxigênio e nitrogênio – que se não forem retirados causam
bolhas que acarretam alargamento do pico e atrapalham na eficiência do detector.
Podem haver também filtros para conter particulados que causariam danos no sistema
CLAE. Um sistema de eluição onde emprega-se apenas um solvente com
composição constante é chamado de isocrático. A razão de haver mais de um
reservatório se dá pela possibilidade de eluição com utilização de gradiente, onde são
empregados vários solventes com composição variada ao longo da corrida de injeção.
O gradiente geralmente aumenta a eficiência de separação dos analitos (SKOOG,
2002).
4.6.2.2. Bombeamento
Para atuar em cromatografia líquida de alta eficiência o sistema de
bombeamento precisa dos seguintes requisitos:
Gerar pressões de até 6.000 psi;
Ausência de pulsos na saída;
Velocidade de fluxo que varie de 0,1 a 10 mL/min;
Controle de fluxo
Componentes resistentes à corrosão.
28
Três tipos de bombas podem ser encontrados: bombas recíprocas, bombas
seringa e bombas pneumáticas. A mais utilizada delas, cerca de 90% dos sistemas
de CLAE, é a bomba recíproca que tem como vantagens seu pequeno volume interno
(35 a 400µL), pressão de saída de até 10.000 psi e fácil adaptabilidade à eluição com
gradiente e vazões constantes (SKOOG, 2002).
4.6.2.3. Injetores de amostra
Em CLAE, a injeção de um volume preciso de amostra na coluna deve ser
feita tão rápido quanto possível para causar o menor distúrbio no regime dinâmico do
fluxo de fase móvel, que deve ser estável desde a coluna até o detector. O método
mais comum de injeção está baseado em alças (em inglês, loop) que é uma válvula
de duas posições:
Carregar: A amostra em solução é introduzida à pressão atmosférica com o
auxílio de uma seringa em um pequeno tubo chamado de loop. Ele possui um
volume definido.
Injetar: A amostra, agora contida no loop, é inserida no fluxo de fase móvel por
meio de uma rotação de 60º de uma parte da válvula (ROUESSAC,1994).
4.6.2.4. Colunas
As colunas para cromatografia líquida geralmente são feitas de aço
inoxidável, podem ser encontradas também em vidro, mas estas últimas são limitadas
a uma pressão de trabalho de no máximo 600 psi. As colunas analíticas possuem um
comprimento de 10 a 30 cm em geral e diâmetro interno de 4 a 10 mm. O tamanho de
partícula da fase estacionária varia de 5 a 10 µm. Também existem as chamadas pré-
colunas, que são colocadas antes da coluna analítica para reter material particulado,
contaminantes presentes nos solventes e algum componente de amostra que possa
se ligar irreversivelmente à fase estacionária, protegendo-a (SKOOG, 2002).
29
4.6.2.5. Fases estacionárias
De acordo com a natureza da fase estacionária a cromatografia líquida
pode ser classificada de duas formas:
Fase normal: a fase estacionária apresenta maior polaridade que a fase móvel;
Fase reversa: a fase estacionária apresenta menor polaridade que a fase
móvel.
A fase reversa é usada mais comumente para CLAE por apresentar uma
série de vantagens em relação à fase normal, são elas: menor toxicidade dos
solventes da fase móvel, custo menor de solventes como metanol e água, maior
facilidade de trabalhar com gradiente, boa reprodutibilidade em tempos de retenção
(TONHI et al., 2002).
O material básico para confecção de colunas de fase reversa é a sílica gel,
um sólido rígido e amorfo com fórmula molecular SiO2(H2O)n, onde n é muito próximo
de zero. Ela está na forma de partículas esféricas, que podem ser porosas, com
diâmetro entre 2 a 5 µm. Isso facilita o empacotamento, na coluna, compacto e
homogêneo, permitindo uma circulação regular da fase móvel, sem a formação de
caminhos preferenciais (ROUESSAC,1994).
4.6.2.6. Fases móveis
O grau de interação entre a fase móvel e a fase estacionária irá afetar o
tempo de retenção dos analitos. Por exemplo, ao utilizar fase reversa compostos
apolares serão retidos e os polares sairão da coluna mais rapidamente. Isso dificulta
a separação dos compostos polares, mas ao utilizar-se um gradiente de solventes na
fase móvel é possível melhorar a separação. A escolha da fase móvel e gradiente a
ser utilizada na análise deve ser feita com base no grau de separação que espera
obter do analito de interesse.
30
4.6.2.7. Detectores
Existem muitos tipos de detectores para cromatografia líquida de alta
eficiência, são eles: absorbância, fluorescência, eletroquímico, índice de refração,
condutividade, espectrometria de massas, entre outros. Neste trabalho o foco será
dado a este último tipo, por ser o detector utilizado para a validação.
Ao empregar-se cromatografia líquida acoplada a um espectrômetro de
massas, depara-se com incompatibilidades quanto à vazão do eluente do sistema
cromatográfico com relação à velocidade de bombeamento do sistema de vácuo e o
projeto da fonte de íons do espectrômetro de massas. As vazões encontradas em
CLAE são grandes (da ordem de 1,0mL min-1), não sendo possível bombear o eluente
de um cromatógrafo à líquido diretamente para o interior da fonte do espectrômetro,
que opera a pressões de cerca de 1,3 x 10-4Pa. Por isso, é de grande importância
remover toda ou, pelo menos, uma parte significativa da fase móvel (FM) (CHIARADIA
et al., 2008).
Outro problema encontrado no acoplamento de CLAE à espectrometria de
massas é o fato de os compostos em análise apresentarem pouca sensibilidade à
temperatura e baixa volatilidade. Isso torna difícil a ionização, que é um processo
essencial para uma análise espectrométrica.
Várias técnicas de ionização para compostos não voláteis e pouco
sensíveis à temperatura foram desenvolvidas e ajudaram a contornar este problema,
são eles:
Eletro nebulização (Eletrospray ionization)
Ionização química à pressão atmosférica
Fotoionização à pressão atmosférica
4.6.2.8. Espectrometria de massas Tandem (EM/EM)
É um sistema em que dois espectrômetros de massa são utilizados em
sequência, separados por uma câmara de colisão. Esta técnica se sobressai por conta
da sua alta especificidade analítica quando empregada em modo “Multiple Reaction
Monitoring” (MRM), no qual os analisadores de massas Q1 e Q3, selecionam os íons
31
precursor e produto, respectivamente, definindo uma transição de m/z específica.
Neste modo, o segundo quadrupolo (Q2) funciona como uma cela de colisão, onde os
íons precursores selecionados de acordo com as razões m/z em Q1, são
fragmentados por dissociação induzida por colisão, após colisões com um gás inerte
sob uma energia específica. Ao se otimizar o detector para um experimento contendo
mais de uma transição para o mesmo íon precursor, gera-se um método confirmatório,
que traz grande confiabilidade aos resultados analisados (MARTINS JÚNIOR et al.,
2006).
5. MATERIAIS E MÉTODOS
A metodologia de pesquisa empregada neste trabalho foi experimental –
Ex post facto, pois a validação da metodologia já tinha sido realizada quando o projeto
de monografia foi escrito. Por esta validação fazer parte de um pacote que ainda será
submetido aos órgãos regulamentadores não serão citados quais os solventes
utilizados, nem quantidades. Foi utilizada uma amostra-testemunha de feijão
proveniente de um estudo de resíduo para realizar a validação nos dois níveis de
fortificação requeridos. Os dados foram avaliados para garantir que todos os critérios
para aceitação da validação, pelos órgãos regulamentadores, fossem obedecidos.
5.1.Materiais 5.1.1. Solventes, reagentes e padrões
Solventes orgânicos de alta pureza para análise em CLAE;
Padrão de referência do composto X;
Água purificada para análise em CLAE
5.1.2. Equipamentos
Agitador mecânico
Balança analítica
32
Balança semi-analítica
Banho de ultrassom
Centrífuga
Coluna de cromatografia líquida
Cromatógrafo líquido
Dispensete analógico
Espectrômetro de massas
Homogeneizador
Mesa agitadora
Pipetador automático
Sistema concentrador de amostras
Sistema de purificação de água
5.1.3. Vidrarias
Balões volumétricos calibrados
Béquer
Frasco âmbar
Proveta
Vial para cromatografia
5.1.4. Outros materiais
Espátula metálica
Filtro de celulose regenerada
Frascos de plástico para extração
Pipeta Pasteur
Seringa de plástico descartável
Tubos de centrífuga de polipropileno
33
5.2. Métodos
5.2.1. Preparo das soluções padrão Pesou-se em balança analítica com 5 casas de precisão cerca de 10 mg
(corrigindo-se o valor exato pela pureza do padrão) de padrão de referência do
composto X com o auxílio de um béquer de 10 mL e uma espátula metálica. Após
dissolução com um pequeno volume de solvente apropriado, transferiu-se para um
balão volumétrico calibrado de 10 mL, rinsando-se duas vezes o béquer utilizado na
pesagem. Após isso, o volume do balão foi completado até o menisco. A solução
resultante foi transferida para frasco âmbar e armazenada em condições de
temperatura que garantam a estabilidade da mesma. Esta solução foi chamada de
solução padrão estoque (SPE) e tem concentração 1,00 x 106ng/mL. A partir dela
foram feitas as soluções padrão de fortificação (SPF) como mostra a tabela 2.
Tanto no preparo das soluções padrão de fortificação quanto das soluções
padrão de calibração (SPC) foram utilizados solventes/soluções compatíveis com o
analito, e no caso da SPC, com as condições cromatográficas.
Tabela 2.Exemplo de preparo das soluções padrão de fortificação
Solução Concentração
(ng/mL)
Alíquota
(mL)
Volume do
balão (mL)
Nome da
solução
Concentração
(ng/mL)
SPE 1,00x106 0,500 50,0 SPF F 1,00x104
SPF F 1,00x104 0,500 50,0 SPF A 100,0
Fonte: Autoria própria
Para o preparo da curva de calibração foi utilizada a SPF A e as diluições
feitas são demonstradas na tabela 3.
34
Tabela 3.Exemplo de preparo das soluções padrão de calibração
Solução Concentração
(ng/mL)
Alíquota
(mL)
Volume do
balão (mL)
Nome da
solução
Concentração
(ng/mL)
SPF A 100,0 5,00 50,0 SPC F 10,0
SPF A 100,0 1,25 25,0 SPC E 5,00
SPF A 100,0 0,500 25,0 SPC D 2,00
SPC E 10,0 2,50 25,0 SPC C 1,00
SPC E 10,0 1,25 25,0 SPC B 0,500
SPC E 10,0 0,500 25,0 SPC A 0,200
Fonte: Autoria própria
Para todas as diluições foram utilizados balões volumétricos calibrados e
pipetadores automáticos calibrados. As SPF’s e SPC’s também foram transferidas
para frascos âmbar e armazenadas em temperatura adequada.
5.2.2. Extração, purificação e quantificação
O método de análise consistiu na pesagem de uma quantidade de amostra-
testemunha, seguida da fortificação nos níveis de fortificação estabelecidos (LOQ e
100 x LOQ). Após isso, foi feita a adição de um solvente orgânico e extração em
homogeneizador. Em seguida retirou-se uma alíquota do extrato e seguiu-se com uma
partição líquido-líquido para purificação da amostra e eliminação de interferentes.
Uma alíquota de fase orgânica foi levada para evaporação para troca de fase. O
resíduo da evaporação foi dissolvido com solução apropriada para injeção, filtrado e
injetado no sistema cromatográfico.
35
6. Resultados e discussão
A validação da metodologia foi feita no laboratório de análise de resíduos e
parâmetros como linearidade da curva de calibração, especificidade/seletividade,
precisão/exatidão, influência da matriz na resposta do equipamento foram analisados.
6.1. Linearidade da curva de calibração Para provar a linearidade da curva de calibração foi feita a injeção de 6
padrões em quadruplicata para as duas transições de massa na qual o método foi
validado. A transição mais intensa foi chamada de transição de quantificação (figura
3) e a menos intensa de transição de confirmação (figura 4). O range onde a
linearidade foi testada variou de 0,200 ng/mL a 10,0 ng/mL.
Figura 3.Linearidade da curva de calibração – Transição de quantificação
Fonte: Autoria própria
36
Figura 4.Linearidade da curva de calibração – Transição de confirmação
Fonte: Autoria própria
Como se observa na figura 3 e 4, a curva de calibração do composto X
atende aos critérios estabelecidos pela norma RDC nº 4 pois apresenta coeficiente de
correlação maior que 0,99.
6.2. Especificidade/seletividade
Para provar a especificidade e seletividade da metodologia é necessário
observar os cromatogramas do padrão utilizado na curva de calibração de menor
concentração, do branco de reagentes, da amostra testemunha que foi utilizada para
fortificação e da fortificada no nível do LOQ e garantir que não há picos interferentes
no tempo de retenção do analito de interesse. Nas figuras 5 a 8 são apresentados os
cromatogramas obtidos na transição de quantificação. Os cromatogramas da
transição de confirmação apresentaram características similares e, portanto, não
serão apresentados neste trabalho. O tempo de retenção do analito é
aproximadamente 2,1 min.
37
Figura 5.Cromatograma da SPC de concentração 0,200 ng/mL
Fonte: Software Analyst
A figura 5 também prova que o equipamento possui a sensibilidade
requerida pela norma pois apresenta uma razão sinal/ruído maior que 3 (relação
sinal/ruído igual a 65 aproximadamente). Essa relação é calculada dividindo-se a
altura do pico (intensity) pela altura do ruído.
Figura 6.Cromatograma do branco de reagentes
Fonte: Software Analyst
A figura 6 demonstra que não há interferentes provenientes dos reagentes e
solventes utilizados na rota analítica. Na figura 6 e 7 observa-se que os picos da linha de base
38
não ultrapassam 40 cps de intensidade, sendo que o pico do padrão de menor concentração
(figura 5) possui uma altura aproximada de 1300 cps.
Figura 7.Cromatograma da amostra testemunha utilizada para fortificação
Fonte: Software Analyst
A figura 7 demonstra que a amostra testemunha de feijão utilizada para fazer as
amostras fortificadas da validação não possui interferentes no tempo de retenção do
composto X e também não possui nenhum resíduo do mesmo, pode-se dizer que está “limpa”.
Figura 8.Cromatograma da amostra fortificada no nível do LOQ
Fonte: Software Analyst
39
A figura 8 demonstra que o pico do analito não apresenta interferentes
próximos ao seu tempo de retenção e ainda que a presença da matriz não influenciou
no seu formato.
6.3. Precisão/exatidão
Neste trabalho a exatidão do método foi chamada de recuperação e a
precisão é medida pelo coeficiente de variação entre os valores de recuperação. Nas
tabelas 4 e 5 são demostrados os resultados obtidos nas duas transições de massa
para a metodologia validada no nível do LOQ (0,01 mg/Kg) e 100 vezes o LOQ (1
mg/Kg).
Tabela 4.Resultados de recuperação da validação em feijão – Transição de quantificação
Cultura/Parte Analisada
Transição de massa de quantificação
Concentrações Encontradas (mg/kg)
Recuperações (%)
0,010 mg/kg 1,0 mg/kg 0,010 mg/kg
1,0 mg/kg
Feijão
0,00716 0,831 71,6 83,1
0,00774 0,750 77,4 75,0
0,00742 0,828 74,2 82,8
0,00715 0,783 71,5 78,3
0,00753 0,793 75,3 79,3
Média: 74,0 79,7
Desvio padrão: 2,5 3,4
Coeficiente de variação: 3,4 4,2
Média: 76,9
Desvio padrão: 4,1
Coeficiente de variação: 5,3
Fonte: Autoria própria
40
Tabela 5. Resultados de recuperação da validação em feijão – Transição de confirmação
Cultura/Parte Analisada
Transição de massa de confirmação
Concentrações Encontradas (mg/kg)
Recuperações (%)
0,010 mg/kg 1,0 mg/kg 0,010 mg/kg
1,0 mg/kg
Feijão
0,00731 0,741 73,1 74,1
0,00721 0,836 72,1 83,6
0,00792 0,781 79,2 78,1
0,00805 0,833 80,5 83,3
0,00799 0,702 79,9 70,2
Média: 77,0 77,9
Desvio padrão: 4,0 5,8
Coeficiente de variação: 5,2 7,5
Média: 77,4
Desvio padrão: 4,7
Coeficiente de variação: 6,1
Fonte: Autoria própria
Observa-se nas tabelas 4 e 5 que a metodologia empregada nesta
validação foi adequada pois obedeceu aos critérios exigidos pela norma RDC Nº4.
Ela apresentou recuperações dentro do intervalo de 70 a 120 % e um
coeficiente de variação menor que 20%, em ambas as transições de massa
estudadas.
6.4. Influência da matriz na resposta do equipamento
É importante conhecer o comportamento do analito quando em contato com
a matriz, pois esta pode influenciar na resposta do equipamento tanto suprimindo o
sinal quanto aumentando-o. Assim podem ser gerados resultados maiores ou
menores do que o real, e por se tratar de uma metodologia que será mais tarde
empregada em estudos que envolvem segurança alimentar isso pode ser desastroso.
Para saber quanto a matriz feijão influencia na resposta do analito no equipamento,
foi feita a adição de três padrões de diferentes concentrações (0,500 ng/mL; 1,00
ng/mL; 2,00 ng/mL) na amostra testemunha.
41
As figuras 9 a 11 apresentam os cromatogramas obtidos neste teste de
influência de matriz.
Figura 9.Cromatograma da amostra testemunha com adição de padrão de concentração 0,500 ng/mL
Fonte: Software Analyst
Figura 10.Cromatograma da amostra testemunha com adição de padrão de concentração 1,00 ng/mL
Fonte: Software Analyst
42
Figura 11. Cromatograma da amostra testemunha com adição de padrão de concentração 2,00
ng/mL
Fonte: Software Analyst
Para determinar se a influência da matriz era significante a ponto de ser
necessária a utilização de curva diluída com matriz no estudo de validação utilizou-se
a comparação dos três padrões misturados com matriz com os correspondentes
padrões diluídos em solvente. Cada um deles foi injetado em triplicata, e os resultados
obtidos são mostrados nas tabelas 6 e 7.Verifica-se que a influência da matriz pode
ser considerada insignificante pois apresentou médias inferiores a 20%.
43
Tabela 6.Influência da matriz na resposta do equipamento – Transição de quantificação
Transição de massa quantificação
Padrão diluído com solvente
Padrão diluído com matriz
Concentração nominal [ng/mL]
Concentração calculada [ng/mL]
Média das concentrações
calculadas [ng/mL]
Concentração calculada [ng/mL]
Média das concentrações
calculadas [ng/mL]
Interferência de matriz [%]1
0,500
0,517
0,501
0,500
0,469 6,4 0,485 0,459
0,502 0,448
1,00 1,00
0,973 1,01
1,04 6,5 0,972 1,09 0,947 1,01
2,00
2,03
1,84
1,80
1,75 5,1 1,75 1,69 1,74 1,75
Interferência de matriz média
[%] 6,0
Fonte: Autoria própria
Tabela 7.Influência da matriz na resposta do equipamento – Transição de confirmação
Transição de massa confirmação
Padrão diluído com solvente
Padrão diluído com matriz
Concentração nominal [ng/mL]
Concentração calculada [ng/mL]
Média das concentrações
calculadas [ng/mL]
Concentração calculada [ng/mL]
Média das concentrações
calculadas [ng/mL]
Interferência de matriz [%]1
0,500
0,554
0,478
0,479
0,519 8,7 0,429 0,525 0,450 0,554
1,00 0,976
0,926 1,03
1,0700 15,6 0,916 1,11 0,885 1,07
2,00
1,89
1,83
1,77
1,7700 3,1 1,79 1,78
1,80 1,76
Interferência de matriz média
[%] 9,1
Fonte: Autoria própria
44
O cálculo da interferência de matriz foi feito utilizando-se a equação 3:
Equação 3. Cálculo da influência de matriz
% Interferência de Matriz = (Conc. média padrão em solvente) - (Conc. média padrão em matriz) x 100
(Conc. média padrão em solvente)
Fonte: Autoria própria
7. Conclusão
Uma metodologia de análise de um pesticida foi validada, utilizando-se
cromatografia líquida de alta eficiência acoplada ao espectrômetro de massas, de
acordo com os critérios da RDC nº 4 da ANVISA, que dispõe sobre a pesquisa e
experimentação de agrotóxicos. Obteve-se na validação recuperações de 70 – 84 %
nas duas transições de massa estudadas, sendo que os valores apresentaram boa
reprodutibilidade. O coeficiente de variação destas recuperações foi menor que 7%.
Dessa forma o método utilizado foi considerado exato e preciso para a análise do
composto X.
A curva de calibração utilizada apresentou coeficiente de correlação maior
que 0,99 demonstrando a linearidade do intervalo de trabalho utilizado (0,200 ng/mL
a 10,0 ng/mL). O coeficiente de variação dos padrões na curva, injetados em
quadruplicata, manteve-se abaixo de 20%, comprovando que o equipamento não
apresentava variação na sua resposta em diferentes injeções.
Outro aspecto estudado na validação foi a influência do matriz feijão na
resposta do equipamento, que foi menor que 20%, comprovando que a matriz possui
efeito insignificante, sendo possível a utilização da curva de calibração somente em
solvente. Ainda em relação à matriz, após as etapas de extração e purificação não se
observou interferentes advindos da mesma no tempo de retenção do composto X nas
duas transições de massa avaliadas. Também não foram notados interferentes
derivados dos solventes e reagentes utilizados na análise.
A amostra testemunha utilizada na validação não apresentou resíduos do
composto X.
Os picos cromatográficos apresentaram relação sinal/ruído maior que 3
comprovando a sensibilidade do equipamento requerida pela legislação.
Com base em todos os resultados obtidos conclui-se que a metodologia
aplicada para a análise do composto X foi adequada pois obedeceu a todos os critérios
normativos e a análise foi conduzida seguindo-se as boas práticas de laboratório,
45
garantindo-se a rastreabilidade e confiabilidade dos dados gerados e
consequentemente a segurança alimentar dos consumidores.
46
REFERÊNCIAS
AGÊNCIA DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA, Resolução da diretoria colegiada – RDC nº4 de 18 de janeiro de 2012.Disponível em: <http://bvsms.saude.gov.br/bvs/saudelegis/anvisa/2012/res0004_18_01_2012.html> Acesso em: 17/04/2015
AGÊNCIA DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA. Guia para Validação de Métodos Analíticos e Bioanalíticos, RE nº 899 de 29/05/2003
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Anexo A – Termo de permissão de uso de informações
