Universidade de São Paulo Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto Departamento de Química Programa de Pós-Graduação em Química

“Estudo da interação entre polissacarídeos sulfatados e substâncias anfifílicas”.

Thatyane Morimoto Nobre

Tese apresentada à Faculdade

de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão

Preto da Universidade de São Paulo, como

parte das exigências para a obtenção do

título de Doutor em Ciências, Área: Química

Orientadora: Profa.. Dra. Maria Elisabete Darbello Zaniquelli

RIBEIRÃO PRETO -SP

2007

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FICHA CATALOGRÁFICA

Nobre, Thatyane Morimoto

Estudo da interação entre polissacarídeos sulfatados e substâncias anfifílicas. Ribeirão Preto, 2007.

155 p.

Tese de Doutorado, apresentada à Faculdade de Filosofia,Ciências e

Letras– Área de concentração: Química

Orientadora: Zaniquelli, Maria Elisabete Darbello.

1. Carragenanas 2. Tensativos 3. Elasticidade Dilatacional Superficial 4. Monocamadas de Langmuir

“Triste época! É mais fácil desintegrar um átomo que um preconceito.”

Albert Einstein

DEDICATÓRIA

À Deus, pelo dom da vida, pela saúde, e pela possibilidade de aprendizados diários através

de sua Palavra.

À minha mãe, Vera Lúcia Morimoto, pelo exemplo de pessoa que é, por estar ao meu

lado, principalmente nos momentos difíceis, e por ter me ensinado a nunca desistir e a meu

pai, Osny de Paula Nobre, que mesmo tão longe, sempre se fez tão presente de coração, e

por ser um exemplo de determinação e esforço.

Ao meu irmão, Juliano Morimoto Borges, simplesmente porque o amo.

Aos meus queridos avós, Minoru Morimoto e Carolina Mikami Morimoto (in

memorian) por iluminarem meus caminhos e me guiarem até hoje.

Ao Felippe José Pavinatto, pelo amor, companheirismo, mas principalmente por ter

tornado minha vida muito mais feliz.

“A maior glória não é ficar de pé, mas levantar-se cada vez que se cai.”

Confúcio

AGRADECIMENTOS

À amiga e orientadora Maria Elisabete Darbello Zaniquelli, pelos nove anos de

ensinamentos, que me transformaram em uma profissional. Agradeço não apenas o

conhecimento passado, mas toda a paciência, confiança e tempo dedicados a mim.

Ao amigo e professor Pietro Ciancaglini pelo apoio, ajuda e amizade de sempre.

Ao Prof. Dr. Bruno Maggio e a Profa. Dra. Graciela Borioli pela acolhida durante

meu estágio na Universidade Nacional de Córdoba, pela ajuda com o trabalho, e por tanta

competência e prestatividade.

À Profa. Dra. Rosa dos Prazeres Melo Furriel pelas produtivas discussões, e

juntamente com o Prof. Dr. Francisco de Assis Leone e o Dr. Douglas Chodi Massui

pela obtenção das proteínas utilizadas neste trabalho, e pela disponibilidade de

equipamentos.

Ao Prof. Dr. Paulo Barbeitas Miranda (IFSC), juntamente com Heurison de Sousa

e Silva pela colaboração e ajuda nos experimentos de SFG.

Ao Prof. Dr. Richard John Ward (FFCLRP-USP) pelo uso do dicroísmo circular.

Aos colaboradores que tive durante este período, que, mesmo não pertencendo a este

trabalho, em muito colaboraram para o meu crescimento e aprendizado.

À todos os colegas que passaram pelo Laboratório de Físico-Química de Superfícies e

Colóides ao longo desses anos. Agradeço em especial a Dra. Thaís de Paula Rigoletto,

Dr. Luciano Caseli, e Dr. Rodrigo Ferreira Silva, pela colaboração no trabalho e na vida,

e pela grande e verdadeira amizade que nos une.

Além disso, não poderia deixar de agradecer aos queridos André Stoppa dos Santos,

Diego Augusto Bitencourt e Leonardo Gimenez Ghena Neto, por terem sido muito mais

que brilhantes alunos de Iniciação Científica.

Ao grupo de Biofísica da Universidade Nacional de Córdoba, pela acolhida durante

minha estadia no exterior. Agradeço especialmente às Dras. Carla Rosetti e Natália

Wilke e ao Maxi del Boca pela ajuda com os experimentos.

À toda a família Morimoto, Nobre e Benzoni, pelo amor e carinho que sempre

dedicaram a mim, e principalmente por transmitirem a mim o verdadeiro significado da

palavra família. Em especial agradeço minhas tias Carmen, pelo exemplo de profissional e

Marina pela grande amizade.

Aos queridos e verdadeiros amigos que me acompanharam ao longo desta caminhada,

e que pretendo guardar para o resto da vida: Adriana Pavinatto, Renata Rocha de

Oliveira, Patrícia Abrão de Oliveira, Carolina Fortes Rigos, André Luiz de Faria,

Carlos Artério Sorgi, André e Débora Guedes. Também ao Sr. Antônio e D. Maria B.

Pavinatto pelo grande carinho e amizade.

Enfim, à todos aqueles que contribuíram para que esta Tese pudesse se concretizar.

RESUMO

O entendimento do comportamento de sistemas contendo tensoativos e polieletrólitos,

tanto em solução quanto na interface, é importante no contexto de sua ampla aplicabilidade em

processos industriais, tecnológicos e domésticos. Carragenanas são polissacarídeos sulfatados e,

portanto, polieletrólitos negativamente carregados. São extraídas de algas e podem ser

classificadas de acordo com seu grau de sulfatação e a presença ou não de grupos anidro-

galactose. Apresentam larga utilização na indústria alimentícia e têm sido estudadas com o

objetivo de ampliar seu espectro de aplicação. Nesta tese, investigou-se a interação desta classe

de moléculas com diferentes substâncias anfifílicas. Estudos de tensão superficial com

tensoativos solúveis indicaram um abaixamento sinergístico da tensão superficial, provocado

pela presença do polissacarídeo, que não apresenta atividade superficial. Além disso, medidas de

reologia superficial forneceram dados a respeito das propriedades viscoelásticas em função do

regime em que o sistema se encontrava, onde se observou que o máximo valor de elasticidade

coincidiu com a concentração crítica de agregação (CAC) do sistema. Além disso, através de

cinéticas de adsorção em tempos curtos, pode-se comprovar a adsorção de diferentes espécies em

função da razão de cargas QTS/QPOL. Para esta razão >1, observou-se a rápida adsorção do

tensoativo puro, seguida do complexo tensoativo-polímero. A conformação do polímero,

induzida pela presença de eletrólitos específicos também foi investigada. Observou-se um menor

abaixamento da tensão superficial para o sistema formado pelo polímero na conformação

randômica, comparado à conformação hélice, que também mostrou um maior valor de

elasticidade superficial, atribuído à maior rigidez do complexo formado. Estudos de tensoativos

insolúveis, na forma de monocamadas de Langmuir e filmes de Langmuir-Blodgett, mostraram

que íons zinco são capazes de promover a interação entre carragenanas e fosfolipídios,

carregados com carga de mesmo sinal. Carragenanas ainda permitiram a imobilização de uma

enzima, que atuou como um agente de ligação, além de modificar a fluidez da monocamada.

Além disso, através da técnica de espectroscopia por soma de freqüência, foi possível identificar

a orientação do polissacarídeo neste sistema.

ABSTRACT

The understanding of the behavior of systems containing surfactants and

polylectrolytes, either in solution or at interface, is important in the context of their broad

applicability in industrial, technological and domestic processes. Carrageenans are

sulphated polysaccharides and, therefore, negatively charged polyelectrolytes. They are

extracted from seaweeds and can be classified according to their degree of sulfatation and

the presence or absence of anhydrogalactose groups. These compounds present a large

utilization in food industry and have been studied with the aim of broadening their

application. In this PhD thesis, the interaction of this class of molecules with different

amphiphilic substances was investigated. Surface tension studies based on soluble

surfactants indicated a synergistic decrease of the surface tension, promoted by the

presence of the polysaccharide that does not present surface activity. Besides, the surface

rheological measurements gave data on the viscoelastic properties as a function of the

regime in which the system was, and it was observed that the maximum elasticity value

coincided with the critical aggregation concentration (CAC) of the system. Through short-

term adsorption kinetics, one could attest the adsorption of different species as a function of

the charge ratio QTS/QPOL. For QTS/QPOL> 1, a rapid adsorption of the pure surfactant

followed by an adsorption of the surfactant-polymer complex were observed. The polymer

conformation, induced by the presence of specific electrolytes, was also investigated. It was

observed a smaller decrease of the surface tension for the system formed by the polymer in

the random conformation, compared with the helical conformation that also showed a

higher surface elasticity value attributed to the higher rigidity of the formed complex.

Studies on insoluble surfactants in the form of Langmuir monolayers and Langmuir-

Blodgett films showed that the zinc ions are capable of promoting the interaction between

carrageenans and phospholipids, both having the same electric charge. An enzyme has been

immobilized with the use of carrageenan, which actuated as a binding agent and modified

the monolayer fluidity. Through the use of sum frequency generation spectroscopy, it was

possible to identify the polysaccharide orientation in this system.

Índice

1. Introdução ....................................................................................................................... 1 1.1. Polieletrólitos e Substâncias Anfifílicas: Aspectos Gerais ..................................... 1 1.2. Polieletrólitos e Substâncias Anfifílicas: Revisão da Literatura ............................ 6 1.3. Carragenanas ........................................................................................................ 17

1.3.1 - Estrutura Química e Ocorrência ................................................................... 17 1.3.2 - Propriedades Físicas das Carragenanas ........................................................ 23

1.4. Aspectos Dinâmicos de Interfaces Líquidas ......................................................... 26 2. Objetivos Gerais desta Tese e Justificativa .................................................................. 32 3. Materiais e Métodos ..................................................................................................... 33

3.1. Purificação de Carragenanas ................................................................................ 33 3.2. Tensão Superficial ................................................................................................ 34

3.2.1 - Método da Gota Pendente............................................................................. 34 3.2.2 - Elasticidade Dilatacional Superficial............................................................ 36

3.3. Monocamadas de Langmuir ................................................................................. 37 3.4. Filmes de Langmuir-Blodgett ............................................................................... 40 3.5. Microscopia de Fluorescência .............................................................................. 42 3.6. Microscopia no ângulo de Brewster ..................................................................... 43 3.7. Microbalança a Cristal de Quartzo ....................................................................... 45 3.8. Dicroísmo Circular (CD) ...................................................................................... 46 3.9. Espectroscopia por Geração de Soma de Freqüências ......................................... 47 3.10. Reações de Modificação Química de Carragenanas......................................... 48

3.10.1 - Marcação da fração ι-carragenana com sonda fluorescente. .................... 49 3.10.2 - Caracterização do Produto da Reação de Marcação por Sonda Fluorescente. ................................................................................................................. 50

3.10.2.1 Espectroscopia de infravermelho ......................................................... 50 3.10.2.2 UV-visível ............................................................................................ 52

4. Resultados e Discussão ................................................................................................. 53 4.1. Carragenanas e Tensoativos com Carga de Mesmo Sinal. ................................... 53

4.1.1 - Tensoativo Solúvel ....................................................................................... 53 4.1.2 - Tensoativo Insolúvel: Fosfolipídeo. ............................................................. 58

4.2. Carragenanas e Tensoativos com Carga Oposta................................................... 63 4.2.1 - Tensoativos Solúveis .................................................................................... 63

4.2.1.1 Influência da Densidade de Carga do Polieletrólito ................................. 63 4.2.1.2 Formação de Complexos Tensoativo-Polieletrólito ................................. 73 4.2.1.3 Influência da Razão entre cargas do Tensoativo e do Polieletrólito (QTS/QPOL) ................................................................................................................ 77

4.2.1.3.1 Cinética de Adsorção a Tempos Curtos ............................................. 77 4.2.1.3.2 Elasticidade Superficial ...................................................................... 84

4.2.2 - Tensoativo Insolúvel: DODAB .................................................................... 91 4.2.2.1 Influência do tipo de eletrólito ................................................................. 94

4.2.2.1.1 Tensão Superficial de Equilíbrio ........................................................ 94 4.2.2.1.2 Elasticidade Dilatacional Superficial (ε) ............................................ 99

4.3. Interação carragenana-proteína........................................................................... 101

4.3.1 - Carragenanas e Fosfatase Alcalina (FANC) ............................................... 103 4.3.1.1 Microscopia de fluorescência. ................................................................ 107

4.3.1.1.1 Glicolipídeos e Fosfatase Alcalina ................................................... 109 4.3.1.2 Microscopia no Ângulo de Brewster. ..................................................... 120 4.3.1.3 Espectroscopia por Geração de Soma de Freqüências ........................... 122

5. Conclusões .................................................................................................................. 129 6. Referências ................................................................................................................. 130

Lista de Abreviações

CAC Concentração critica de agregação

CMC Concentração crítica micelar

CTAB Brometo de cetiltrimetil amônio

DNA Ácido desoxiribonucleico

DTAB Brometo de dodeciltrimetil amônio

E Módulo dilatacional superficial

NaPAA poli(acrilato de sódio),

PAAm Poli(acrilamida)

PAMPS [(poli(acrilamida)-co-(poli(acrilamida-metil-propanosulfonato)]

poli(DMDAAC) cloreto de poli(dimetil-dialilamônio),

PE Ponto de equivalência de cargas elétricas

PEI Poli(etilenoimina)

PSS Poli(estireno sulfonato)

SDS Dodecil sulfato de sódio

ΓΓΓΓ Excesso superficial ou densidade superficial

ηηηηapp Viscosidade dilatacional superficial aparente

ΦΦΦΦ pol Fração em volume do polímero

ωωωω Freqüência angular

θθθθ Ângulo de fase

DHP Sal de sódio do ácido dihexadecilfosfórico

DMPA Ácido dimiritoilfosfatídico

DPPC Dipalmitoilfosfatidilcolina

DMPC Dimiristoilfosfatidilcolina

NBD-PE Sal de trietilamônio de N-(7-nitrobenzo-2-oxa-1, 3-diazol-4-il)-1,2-dihexadecanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina.

DiIC18 Sal de 1,1'-dioctadecil-3,3,3',3'- tetrametilindodicarbocianina, 4-clorobenzenosulfonato

Lista de Figuras

Página

Figura 1: Conformação de polímeros flexíveis ..................................................................01

Figura 2: Substâncias anfifílicas e exemplos de estruturas auto-organizadas ....................03

Figura 3: Curva de tensão superficial típica para sistemas contendo tensoativo

e polímero ..........................................................................................................06

Figura 4: Unidade repetitiva das carragenanas...................................................................18

Figura 5: Estrutura de algumas das frações de carragenana comercialmente importantes.20

Figura 6: Estrutura da fração híbrida k-2-carragenana. .....................................................21

Figura 7: Variedades de algas produtoras de carragenanas: (a) Kappaphycus alvarezii, e

(b) Eucheuma denticulatum. .............................................................................22

Figura 8: Processo de gelificação de biopolímeros. ...........................................................24

Figura 9: Variação do módulo dilatacional superficial |E| com a freqüência |ω| ...............30

Figura 10: Aparato experimental para as medidas de tensão superficial pelo método da

gota pendente ......................................................................................................................35

Figura 11: Esquema de uma Cuba de Langmuir................................................................38

Figura 12: Estados Bidimensionais de uma monocamada: (G) gasoso; (LE) líquido-

expandido; (LC) líquido-condensado..................................................................................39

Figura 13: Tipos de Filmes LB: (a) Filme tipo X; (b) Filme tipo Y e (c) Filme tipo Z.....41

Figura 14: Esquema de um microscópio de epifluorescência.............................................43

Figura 15: (a) Incidência da luz no ângulo de Brewster da subfase na ausência e (b) na

presença da monocamada.....................................................................................................44

Figura 16: Esquema de uma Microbalança a Cristal de Quartzo........................................45

Figura 17: Esquema da reação de marcação por sonda fluorescente da fração iota-

carragenana...........................................................................................................................50

Figura 18: Espectros de infravermelho para ι-carragenana marcada e seus precursores para

comparação...........................................................................................................................51

Figura 19: Espectros de UV-visível para diferentes concentrações de FITC; e da ι-

carragena marcada................................................................................................................52

Figura 20: Curvas de tensão superficial vs. concentração de SDS em presença de ι-

carragenana...........................................................................................................................53

Figura 21: Tensão Superficial vs. viscosidade para soluções de SDS em presença de ι-

carragenana...........................................................................................................................54

Figura 22: Curvas de tensão superficial vs. concentração de SDS em presença de ι-

carragenana e Zn2+................................................................................................................56

Figura 23: Variação da tensão superficial com a concentração de SDS em água pura e na

presença de iota-car em termos da atividade c*....................................................................58

Figura 24: Isoterma superficial para DHP (▄) sobre água pura, (▼) sobre solução aquosa

de íons Zn2+ 0,1 mM e (○) sobre solução contendo Zn2+ 0,1 mM e ι-car 25 ppm...............59

Figura 25: Micrografias de fluorescência (a) monocamada após ser espalhada sobre a

interface líquido-ar a pressão de 0mN.m-1 e (b) monocamada após um ciclo de compressão

e expansão a 0mN.m-1..........................................................................................................61

Figura 26: Tensão superficial vs. concentração de DTAB para diferentes frações

carragenanas.........................................................................................................................64

Figura 27: Tensão superficial vs. concentração de DTAB para diferentes concentrações de

κ-2 carragenana....................................................................................................................65

Figura 28: Variação da viscosidade relativa soluções de κ-2-carragenana em NaCl 10

mmol.L-1 e temperatura de 200C..........................................................................................69

Figura 29: Efeito do comprimento da cadeia hidrofóbica nas variações de tensão

superficial.............................................................................................................................70

Figura 30: Curva de tensão superficial para DTAB em NaCl e ι-carragenana 25 ppm.....73

Figura 31: Micrografias de BAM para (a) DTAB em água, (b) DTAB em i-car em 10 min

(c) DTAB em i-car em 30 min.............................................................................................74

Figura 32: Curva de elasticidade superficial para DTAB em NaCl e ι-carragenana 25

ppm.......................................................................................................................................75

Figura 33: Cinéticas de adsorção de DTAB na presença de diferentes frações carragenana

25 ppm e NaCl 10mM .........................................................................................................76

Figura 34: Cinética de Adsorção para sistema λ-car com QTS/QPOL = 0,09.......................81

Figura 35: Cinética de Adsorção para sistema com QTS/QPOL = 2,27................................82

Figura 36: Curva de Elasticidade em função da freqüência ...............................................84

Figura 37: Caracterização da interface líquido-ar de soluções de DTAB na presença de λ-

carragenana 25 ppm e NaCl 10 mM.....................................................................................85

Figura 38: Curva de tensão superficial vs. C* para DTAB em: água (�),NaCl 10 mmol L-1

(●), λ-carragenana 25 ppm e NaCl 10 mmol L-1 (▼ ). As setas indicam a CAC, CMC para

DTAB em água e na presença de carragenana (CMC ‘)......................................................86

Figura 39: Deformação aplicada à gota formada com solução aquosa de DTAB 0,1mM,

contendo λ-car 25 ppm e NaCl 10 mM...............................................................................89

Figura 40: Superposição dos sinais de distúrbio (área da gota) e resposta do sistema

(tensão superficial) para as mesmas condições da Figura

36..........................................................................................................................................90

Figura 41: Cinética de Adsorção de k-2 carragenana 25 ppm/NaCl 10 mM em

monocamada de DODAB.....................................................................................................92

Figura 42: Tensão Superficial de DTAB em presença de k-2 carragenana 25 ppm em

diferentes condições salinas.................................................................................................94

Figura 43: Espectros de Dicroísmo Circular para k-2-car 25 ppm/laranja de acridina em

água, Na+ e K+ 10 mM........................................................................................................96

Figura 44: Elasticidade dilatacional superficial de soluções aquosas de DTAB na presença

de κ-2-car 25 ppm em diferentes conformações: (■)NaCl 10 mM (novelo-ao-acaso) e (●)

KCl 10 mM (hélice)..............................................................................................................98

Figura 45: Isoterma superficial para DHP () sobre água pura, (--) sobre solução aquosa

Zn2+ 1 mM e ι-car 25 ppm (__) sobre solução sobre solução aquosa Zn2+ 1 mM / ι-car 25

ppm/FANC 9 nM................................................................................................................103

Figura 46: Cinética de Adsorção da enzima FANC ao filme de

fosfolipídio.........................................................................................................................104

Figura 47: Micrografias de fluorescência monocamadas (DHP + Zn 2+) a 5 mN m-1 usando

como sonda NBD-PE. e (b) DiIC18..................................................................................106

Figura 48: Estrutura dos glicolipídeos (a) GalCer, (b)

Sul.......................................................................................................................................109

Figura 49: Isoterma de pressão superficial versus área por molécula para o lipídeo GalCer..

Figura 50: Micrografias de epifluorescência de monocamadas de GalCer em 5 mN.m-1

obtidas em diferentes tempos: (a) 0 min, (b) 30min, (c) 90 min........................................110

Figura 51: Micrografias de epifluorescência para monocamadas de GalCer em subfase de

FANC em diferentes tempos..............................................................................................110

Figura 52: Variação da pressão superficial para a monocamada de GalCer na presença de

FANC em função do tempo................................................................................................112

Figura 53: Isoterma de pressão superficial versus área por molécula para o lipídeo Sul..113

Figura 54:Micrografias de Epifluorescência de monocamadas de Sul em diferentes

tempos: (a) 0 min, (b) 30min, (c) 90 min...........................................................................114

Figura 55: Micrografias de Epifluorescência de monocamadas de Sul em subfase de

FANC à diferentes tempos: (a) 10 min, (b) 30min, (c) 60 min..........................................115

Figura 56: Micrografias de epifluorescência para monocamadas de Sul em subfase de

FANC, e posterior adição de Zn 2+ a diferentes tempos.....................................................115

Figura 57: Variação da pressão superficial para a monocamada de Sul na presença de

FANC / Zn 2+em função do tempo.....................................................................................117

Figura 58: Microscopias de BAM (a) GalCer 5mN/m, (b) Sul 5 mN/m, (c) GalCer em

subfase de CNC após 30 min, (d) Sul em subfase de CNC após 30 min...........................118

Figura 59: Espectro de SFG na região de estiramento OSO3-...........................................119

Figura 60: Espectro de SFG na região de estiramento CH................................................122

Figura 61: Modelo proposto para a interação da enzima com o filme fosfolipídico mediado

pela enzima.........................................................................................................................127

Lista de Tabelas

Tabela 1: Código de letras alternativo para as diferentes unidades de açúcar encontradas

nas carragenanas, conforme desenvolvido por Knutsen et al................................................18

Tabela 2: Massas molares das frações carragenanas...........................................................34

Tabela 3: Valores de excesso superficial (ΓTS) e área média ocupada por molécula de

DTAB quando em solução de NaCl 10 mM, com a adição de κ-2 carragenana, a 26+1 oC...........................................................................................................................................68

Tabela 4: Valores de concentração para DTAB e CTAB correspondentes ao valor de

60mN.m-1 nas respectivas curvas de tensão superficial. Valores dos coeficientes angulares

da parte linear do gráfico.......................................................................................................71

Tabela 5: Valores de viscosidade superficial para k-2 carragenana em Na+ e K+ no valor

máximo de elasticidade.........................................................................................................99

1

1. Introdução

1.1. Polieletrólitos e Substâncias Anfifílicas: Aspectos Gerais

Polieletrólitos são definidos como macromoléculas que apresentam grupos ionizáveis

ao longo da cadeia. Devido a sua natureza eletrostática, estas substâncias são usualmente

solúveis em água, e a presença de grupos catiônicos ou aniônicos governa a conformação

da macromolécula, através da repulsão eletrostática ou blindagem das cargas quando em

presença de um eletrólito (Figura 1). Deve-se entretanto distinguir esses polieletrólitos

flexíveis daqueles cuja estrutura interna (decorrente de associações intramoleculares)

domina o comportamento em solução. Esse é o caso por exemplo das proteínas.

eletrólito

-

(a) (b) (c)

Figura 1: Conformação de polímeros flexíveis: (a) forma randômica, (b) polieletrólito na forma

de bastão rígido, (c) mudança conformacional do polieletrólito de bastão rígido para a forma enovelada

devido à adição de sal.

Inicialmente, polieletrólitos flexíveis foram amplamente estudados com o objetivo de

alterar a reologia de soluções, dada a sua propriedade de aumentar a viscosidade do meio.

Entretanto, mais recentemente, o interesse na utilização desta classe de substâncias tem sido

na modificação de superfícies sólidas e interfaces (Decher et al., 1994; Caruso et al., 2000),

2

bem como na estabilização ou desestabilização (Beltrán et al., 2003; Stubenrauch e Miller,

2004) de uma grande variedade de sistemas coloidais .

Do ponto de vista teórico, uma cadeia de polieletrólito com certa flexibilidade pode

ser considerada como uma cadeia que tem uma conformação baseada em uma distribuição

estatística dos segmentos. A repulsão eletrostática entre os segmentos de cadeia adjacentes,

bem como as repulsões estéricas, contribuem positivamente para que ocorra um aumento de

energia livre com o dobramento da cadeia. O fenômeno, de um modo geral, impede que um

segmento se aproxime muito de outro e faz com que a cadeia como um todo adquira certa

rigidez e também um maior volume excluído. A adição de eletrólito é normalmente

abordada nesses sistemas em termos do modelo de Poisson-Boltzmann. Assume-se que o

eletrólito atue como um fator de diminuição da repulsão eletrostática, contribuindo na

redução da energia livre de dobramento da cadeia, ou seja, conferindo maior flexibilidade

para a mesma. Dessa forma, o volume da cadeia em solução é menor, e sua conformação é

descrita em termos de determinados parâmetros como comprimento de persistência

intrínsico, definido como uma propriedade que quantifica a rigidez de uma macromolécula.

Em linhas gerais, pode-se dizer que cadeias poliméricas curtas, ou oligômeros, que

tem um comprimento médio em solução menor que o comprimento de persistência podem

ser descritas como um cilindro com elasticidade e flexibilidade características. Por outro

lado, moléculas com grande comprimento médio em solução, maior que o comprimento de

persistência, somente pode ter suas propriedades descritas estatisticamente, em termos de

movimentos randômicos no volume.

Diferentes situações práticas de aplicações industriais, tecnológicas, biológicas e

domésticas, ocorrem na presença conjunta de polieletrólitos e tensoativos. Esses últimos

3

compreendem as chamadas substâncias anfifílicas que apresentam em sua estrutura uma

cadeia alquílica de tamanho variável, e uma extremidade polar, que pode ser: eletricamente

carregada (positiva ou negativamente), não iônica, ou ainda anfotérica (Figura 2a). Dessa

forma, essa classe de moléculas apresenta a propriedade de se orientar na interface líquido-

ar de modo a minimizar sua energia livre. Além disso, podem sofrer auto-associações em

solução aquosa, dando origem a diferentes estruturas como micelas - esféricas ou

cilíndricas, bicamadas, vesículas, entre outras (Figura 2b).

(a)

(b)

Figura 2: (a) Substâncias anfifílicas e (b) exemplos de estruturas auto-organizadas.

Cadeia hidrofóbica Cabeça Polar

Aniônico

Catiônico

Anfotérico

Não Iônico

Micela Lipossomo

Bicamada

4

O fator determinante da ocorrência de adsorção em interfaces e também da presença

destas estruturas em solução é o efeito hidrofóbico, de origem entrópica. Entretanto, a

estrutura do agregado formado depende de forças intermoleculares e parâmetros como:

volume da porção hidrofóbica, comprimento da cadeia e área da cabeça polar. As

dimensões do agregado formado são da ordem de 1nm-1µm, faixa correspondente a

domínios coloidais.

A princípio, muitos pesquisadores estudaram interações fracas, decorrentes de

sistemas envolvendo polímeros não-iônicos com tensoativos carregados, em sua maioria,

negativamente. Entretanto, mais recentemente, uma maior ênfase vem sendo dada a estudos

que envolvem interações fortes entre estas classes de moléculas. Dessa forma, existem

basicamente duas abordagens para a interação entre macromoléculas e tensoativos.

A primeira delas, devida a Goddard e Ananthapadmanabhan, classifica as interações

com base nas cargas elétricas. Para estes autores, a interação em sistemas mistos,

envolvendo tensoativos e polímeros neutros, está relacionada com a atividade superficial do

polímero. Sendo assim, polímeros como poli(acrilamida) (PAAm), que apresenta atividade

superficial negligenciável, se mostrou não reativo com tensoativos em solução, enquanto

para poli(isopropilacrilamida), que apresenta atividade superficial, o comportamento

inverso foi observado (Kwak, 1998). Além disso, é observado que o comportamento de

soluções de polieletrólito-tensoativo é similar ao de polieletrólito-polímero, ou seja, não há

associação quando o polímero ou o tensoativo não apresentam carga, ou quando

apresentam cargas de mesmo sinal, e interações fortes ocorrem quando o sistema apresenta

carga de sinal oposto (Langevin, 2001).

5

Já a segunda abordagem é apresentada principalmente por Piculell, Lindman e

Karlström, e se baseia no grau de importância da associação hidrofóbica entre o tensoativo

e o polímero.

Em geral, sistemas envolvendo polieletrólitos e tensoativos de carga oposta

apresentam um efeito sinergístico, causando um abaixamento considerável na tensão

superficial quando comparada ao tensoativo puro, mesmo em baixas concentrações do

tensoativo. Este fenômeno é normalmente atribuído a efeitos eletrostáticos sobre a própria

atividade do tensoativo, onde se considera o efeito do polieletrólito análogo ao da adição de

um íon multivalente, ocorrendo à formação de complexos entre o tensoativo e a

macromolécula.

Sistemas mistos envolvendo polieletrólitos e tensoativos podem ser estudados por

meio de técnicas simples, como tensão superficial, até técnicas mais sofisticadas, como é o

caso de refletividade de raios X e nêutrons. Nas medidas de tensão de superficial as curvas

apresentam, na maior parte dos casos, um comportamento característico, com a ocorrência

de uma concentração de agregação crítica, CAC, na qual os complexos começam a ser

formados no interior da solução, e posteriormente da concentração micelar crítica, CMC,

com a formação de micelas do tensoativo puro (Figura 3).

6

Figura 3: Comportamento típico da variação de tensão superficial para um sistema misto

contendo tensoativo e polímero e modelo usado para explicar as espécies presentes no sistema em cada

regime. (a partir de Goddard, 1986).

Embora esse seja o comportamento padrão, em alguns casos o perfil das curvas de

tensão superficial de sistemas polieletrólito-tensoativo é bastante complexo.

1.2. Polieletrólitos e Substâncias Anfifílicas: Revisão da Literatura

Os diferentes estudos encontrados na literatura sobre a interação entre polieletrólitos e

substâncias anfifílicas trazem resultados sobre a influência de parâmetros do polieletrólito,

tais como: massa molar, densidade de carga, rigidez do polímero e comprimento de

persistência; ou a influência de características do tensoativo: tamanho da cadeia alquílica,

tipo de grupo polar na formação de complexos polieletrólito-tensoativo em solução e na

7

interface. Salientamos que o número de grupos de pesquisa que se dedica ao estudo da

interação entre polieletrólitos e tensoativos com carga oposta é ainda reduzido.

Asnacios et al. (Asnacios et al., 2000) estudaram a interação de PAMPS

[(poli(acrilamida)-co-(poli(acrilamida-metil-propanosulfonato)] e PSS (poli(estireno

sulfonato)) com tensoativos catiônicos. Para tal, foram utilizadas técnicas de tensão

superficial, elipsometria e reologia, tanto da interface, quanto da solução. Os resultados

mostraram que os polieletrólitos não apresentam atividade superficial nas concentrações

utilizadas (75 a 750 ppm). Entretanto, promoveram abaixamento sinergístico da tensão

superficial, atribuído pelos autores à formação e adsorção do complexo polieletrólito-

tensoativo. Além disso, as variações observadas nas medidas de viscosidade, quando

comparadas aos resultados de tensão superficial em função da concentração do tensoativo,

foram interpretadas pelos autores como correspondentes a diferentes comportamentos entre

a interface e a solução. Em uma faixa inicial de concentração do tensoativo, notou-se um

abaixamento nos valores de tensão superficial. Entretanto, não foram observadas alterações

da reologia da solução. Esses dados levaram os autores a concluírem que em baixas

concentrações do tensoativo não ocorrem interações significativas entre as duas espécies

em solução, enquanto tem-se na interface a adsorção de um complexo altamente tensoativo.

Além disso, para o polímero mais hidrofílico (PAMPS), os autores verificaram, através de

medidas de elipsometria, que a camada formada pelo complexo adsorvido na interface é

menos espessa, quando comparada àquela formada por PSS, sugerindo que as cadeias de

PAMPS estivessem mais esticadas.

Esse estudo foi complementado por Ritacco et al. (Ritacco et al., 2003) que

verificaram a influência do ponto de equivalência (PE) entre as cargas no comportamento

8

dos sistemas anteriormente descritos, e concluiu que, surpreendentemente, a máxima

turbidez obtida para o sistema não coincide com o PE, além deste ocorrer em concentração

inferior a CAC do sistema, como mostraram as curvas de tensão superficial.

Stubenrauch et al. (Stubenrauch, et al., 2000) investigaram a influência da rigidez da

cadeia polimérica na estrutura e propriedades dos complexos tensoativos mistos, formados

pela interação com DTAB. Para o estudo foram utilizados como polímeros flexíveis

PAMPS (75 ppm) e PSS (1000 ppm), e DNA (144 ppm) e Xantana (416 ppm) como

polímeros mais rígidos. Neste trabalho, além do já relatado abaixamento sinergístico da

tensão superficial, os dados de refletividade de raios-X indicaram um aumento da espessura

da camada superficial, e também aumento da fração em volume de polímero adsorvido (Φ

pol), com o aumento da rigidez do polieletrólito. Os autores atribuem o menor valor de Φpol,

obtido para os polímeros mais flexíveis, ao baixo empacotamento do polímero na camada

interfacial.

Um estudo mais detalhado da influência da rigidez nas propriedades de complexação

que ocorrem em solução foi realizado por Guillot et al. (Guillot et al., 2003), utilizando

medidas de tensão superficial, espalhamento de luz estático e viscosidade para DTAB e

carboximetilcelulose (flexível) e DNA (rígido). Os resultados mostraram que ambos os

polieletrólitos, independente da rigidez de sua estrutura, interagem fortemente com DTAB.

Entretanto, são ressaltadas as diferenças observadas para o comportamento superficial dos

sistemas na CAC. Segundo os autores, a diferença entre a CAC e a CMC é uma medida da

força de atração entre o polímero e o tensoativo. Dessa forma, os resultados obtidos para

carboximetilcelulose, que apresentou um patamar muito maior na CAC do que DNA, são

esperados, uma vez que, segundo os autores, a diferença de rigidez permite à

9

macromolécula mais flexível “envolver” os agregados micelares do tensoativo. Pelo mesmo

motivo, a elevadas concentrações do tensoativo, o sistema contendo carboximetilcelulose

apresenta valores de tensão superficial próximos ao do tensoativo puro em solução,

indicando que a camada superficial era constituída apenas por DTAB.

Os dados de viscosidade e espalhamento de luz também mostraram que as diferenças

observadas se relacionam com as mudanças conformacionais causadas pela presença do

tensoativo. Para todos os valores de concentração de DTAB utilizados, a viscosidade da

solução de carboximetilcelulose foi menor do que a viscosidade de soluções deste

polieletrólito na presença de sal, indicando que uma pequena quantidade de tensoativo é

suficiente para re-enovelar a cadeia desta macromolécula. Posterior a este processo, o

colapso da cadeia, segundo os autores, deve ser o fator responsável pela grande diminuição

da viscosidade observada, que acaba se igualando à da água. Além disso, a técnica de

espalhamento de luz detectou “partículas” que apresentaram tamanho correspondente ao da

cadeia polimérica colapsada, o que reafirma a hipótese por eles levantada. Para o sistema

DNA/DTAB, os autores sugerem que a presença do tensoativo leva a cadeia da

macromolécula, de uma conformação estendida, a uma possível estrutura “globular”.

A influência do tamanho da cadeia alquílica do tensoativo na formação de complexos

polieletrólito-tensoativo foi avaliada em um estudo realizado por Monteux et al. (Monteux

et al., 2004), que estudou a série CnTAB (n=8,10,12,14,16) na presença de PSS.

Observaram que de C8 a C12, as curvas de tensão superficial apresentaram o

comportamento chamado de clássico para sistemas com cargas opostas, com a presença do

polieletrólito promovendo abaixamento sinergístico da tensão superficial seguido por um

patamar atribuído a CAC, e posterior queda, até que a CMC fosse atingida. Para C8, o

10

patamar inicial na tensão superficial foi maior que para C10 e C12, condizente com o fato

deste ser menos tensoativo. Já o comportamento observado para C14 e C16 foi

surpreendente, segundo os autores, pelo fato de que os valores de tensão superficial para o

sistema misto foram maiores que os obtidos para o tensoativo puro.

Os dados de elipsometria mostraram comportamentos bastante similares para os

sistemas contendo C12 e C14. Observou-se um aumento inicial na elipticidade atribuído à

formação de complexos com elevada atividade superficial, seguido de queda, quando a

região de precipitação (causada pela saturação do polieletrólito pelas moléculas do

tensoativo) é atingida e os complexos são dessorvidos. Uma subseqüente adição de

tensoativo promove a re-solubilização dos complexos, o que acarreta em novo aumento na

elipticidade. Isto ocorre pela adsorção adicional de moléculas do tensoativo ao complexo já

formado, gerando uma nova espécie ativa na interface. Uma nova adição de CnTAB causa

queda na elipticidade, que atinge valores iguais ao do tensoativo puro, indicando a

solubilização dos complexos com total depleção da interface. Os autores atribuem os

diferentes resultados obtidos para C12 e C14 com as diferentes técnicas ao fato que as

medidas de tensão superficial sozinha não foram suficientes para revelar a adsorção dos

complexos formados por PSS-C14.

Distintos comportamentos entre polieletrólitos e tensoativos resultantes de diferentes

comprimentos de cadeia alquílica já haviam sido observados por Asnacios et al. (Asnacios

et al., 2000), que trabalharam com PAMPS e CnTAB com n=12 e 16. Neste trabalho, os

autores observaram que para C12 o comportamento da tensão superficial segue o modelo

“clássico”, enquanto para C16 a curva de diminuição de tensão se estende para maiores

concentrações, e a CMC do complexo possui valor maior que a CMC do tensoativo puro.

11

Segundo os autores, em concentrações de tensoativo acima da CMC, a adição do

polieletrólito induz a um aumento na tensão superficial, comparada ao tensoativo sozinho, o

que ocorre devido à associação das espécies em solução: se a concentração de moléculas de

tensoativo em solução não é suficiente, micelas não podem ser formadas. Sendo assim, para

uma concentração fixa de monômeros, menor que a CMC para DTAB e maior que CMC

para CTAB os sítios carregados do polieletrólito ainda não estão completamente associados

à molécula do tensoativo.

Diante destas observações, dois outros parâmetros passam a ter grande importância no

estudo da formação e comportamento destes complexos: densidade de carga e concentração

do polieletrólito.

No mesmo trabalho citado acima, Asnacios investigou a influência do grau de

sulfonação, como forma de alterar a densidade de carga do polieletrólito. Eles observaram

que para PAMPS com o menor o grau de sulfonação (x), igual a 10%, a CAC do sistema

não é bem definida, além de ocupar valores bem maiores de área por molécula que PAMPS

com x=25%, sendo estes de 100 e 78 Å2, respectivamente. Segundo os autores, este

resultado provavelmente está associado ao fato de que na interface, o polímero atue como

um “espaçador” das moléculas do tensoativo. Sendo assim, cada carga do polímero

corresponde a um sítio de ligação para o tensoativo, e a distância entre estas moléculas

aumenta se a distância entre as cargas aumentar, fato que ocorre quanto menor for o grau de

sulfonação do polímero. Dados de elipsometria mostraram que para o maior valor de x,

igual a 25%, a espessura da camada superficial foi cerca de 10 vezes menor que o próprio

raio de giração do polímero (em 0,1M de LiNO3), indicando que este provavelmente se

12

encontre com uma conformação mais esticada na interface, uma vez que a espessura da

monocamada é dada principalmente pela contribuição polimérica.

Jain et al. (Jain et al., 2003 a, 2003 b) estudaram o mesmo polímero com x = 10 e

25% complexados com o tensoativo CTAB. O diferencial do estudo, segundo os próprios

autores, foi a utilização pela primeira vez da técnica de microscopia no ângulo de Brewster

para a investigação de monocamadas co-adsorvidas na interface ar-água a partir de uma

solução aquosa. Além disso, o método de análise consistiu na obtenção das isotermas

superficiais aplicando-se uma compressão à monocamada formada em uma cuba de

Langmuir. Os autores analisaram os dados de acordo com os regimes de concentração: i)

Para o complexo PAMPS 10/ CTAB as isotermas de compressão apresentaram

comportamentos idênticos para concentrações de menores ou iguais a CAC. A pressão

superficial (π) inicial foi igual a zero e a isoterma apresentou um aumento inicial de π

seguido de um patamar, sugerindo uma transição de fases. Após o patamar o valor de π

continuou aumentando em um intervalo de tempo de 24 horas, a partir do qual nenhuma

alteração foi observada, sendo que a pressão de colapso foi de aproximadamente 23 mN m-

1. O mesmo comportamento foi observado para o sistema PAMPS 25/CTAB, entretanto

com duas notórias diferenças. O patamar ocorre em valores de π bem maiores,

aproximadamente 18 mN m-1 para x=25% enquanto para x=10% o valor é de 8 mN m-1.

Além disso, para PAMPS 25, o valor de π diminuiu com o tempo, fato contrário ao

observado para PAMPS 10, sendo que após 24 horas, também permaneceu inalterado. As

imagens de BAM foram realizadas em valor de π fixo de 15 mN m-1 e em função do tempo.

Para o sistema PAMPS 10/CTAB abaixo da CAC, um aumento gradual no número de

domínios ocorre com o tempo. Segundo os autores, um aumento neste número de

13

agregados indica que o polieletrólito permanece se ligando ao tensoativo, resultando em um

aumento de espessura da monocamada. Além disso, o fato das interações entre os

agregados serem repulsivas pode explicar a expansão observada. Já as imagens obtidas na

CAC do sistema indicam uma monocamada mais densa que a anterior.

Resultados interessantes foram obtidos com o sistema acima da CAC, onde o

equilíbrio foi atingido aparentemente após 90 minutos. As micrografias para ambos os

polieletrólitos (PAMPS x=10% e x=25%), mostraram pequenas variações no contraste em

função do tempo, entretanto grandes alterações foram observadas com a compressão das

monocamadas. As camadas mistas se comportaram como monocamadas insolúveis no

equilíbrio, sendo sua compressão totalmente reversível, diferentemente do sistema a baixas

concentrações de tensoativo, onde se observou grande histerese. Neste último caso, os

autores concluem que a camada polieletrólito-tensoativo adsorvida esteja ligada por fortes

atrações eletrostáticas, que tornam o sistema irreversível.

Alguns autores também avaliaram o efeito da densidade de carga do polieletrólito,

pela alteração do pH do meio. Esta estratégia teve por objetivo modificar a carga superficial

do polieletrólito de modo a tentar estabelecer uma relação entre as contribuições

eletrostática e hidrofóbica para a interação com o tensoativo. Poli(etilenoimina), PEI, é um

exemplo de polieletrólito utilizado por ser sensível a alterações de pH, sendo neutro em

meio básico e carregado a baixos valores de pH (Penfold et al., 2005). Demonstraram que a

sua interação com tensoativos é extremamente dependente do pH e da arquitetura do

polímero: adsorção mais intensa foi observada para o polímero ramificado a elevados

valores de pH, onde o polímero se encontra neutro, fato que leva a conclusão dos autores de

que a contribuição hidrofóbica para a interação é mais significativa nesse caso.

14

Outro exemplo é a adsorção de poli(acrilato de sódio), NaPAA com DTAB em um

estudo realizado por Zhang et al. (Zhang et al., 2005) usando refletividade de nêutrons e

tensão superficial. Os autores observaram que nos dois valores de pH utilizados, 4,2 e 9,2,

para os quais o polímero se encontra neutro e carregado, respectivamente, ocorre uma

grande diminuição da tensão superficial comparada com a obtida para o tensoativo puro. O

resultado foi atribuído à formação de complexos na interface e foi confirmado pelas

medidas de refletividade de nêutrons. Entretanto, no valor de pH 4,2, a monocamada mista,

com espessura de aproximadamente 20 Å, se encontra adsorvida ao longo de toda a faixa de

concentração de DTAB utilizada. Já para o sistema em pH 9,2, onde o polieletrólito se

encontra altamente carregado, o comportamento se assemelha ao observado para pH 4,2

apenas em baixas concentrações de tensoativo. Entretanto, a elevadas concentrações do

tensoativo, ocorre uma transição que varia de uma monocamada adsorvida à formação de

uma camada estruturada na interface. Segundo os autores, isto é um indicativo de fortes

interações ocorrendo na interface entre o polímero e o tensoativo. Dessa forma, os autores

propuseram que a predominância das interações eletrostáticas, neste valor de pH, leva à

formação de multicamadas.

Mais recentemente, Penfold et al. (Penfold et al, 2006) tratou de duas situações,

considerada por eles extremas, sendo estas o polieletrólito catiônico cloreto de poli(dimetil-

dialilamônio), poli(DMDAAC), com o tensoativo aniônico SDS; e o polieletrólito aniônico

PSS e o tensoativo catiônico DTAB, por meio de medidas de tensão superficial e

refletividade de nêutrons. Os autores observaram que para a mistura poli(DMDAAC)/SDS,

a baixas concentrações do tensoativo, o comportamento da tensão superficial se mostrou

independente da concentração do polímero, conforme também observado por outros autores

15

Asnacios et al (Asnacios et al 2000). Além disso, observaram uma diminuição e posterior

aumento da tensão superficial, antes do patamar correspondente à CMC. Pelos dados de

refletividade de nêutrons, os autores constataram a formação de uma monocamada

constituída pelo complexo polímero-tensoativo, sendo que esta complexação na superfície

resulta em um aumento da quantidade de tensoativo adsorvida. Já a região em que ocorreu

um aumento na tensão superficial foi atribuída a uma parcial depleção do complexo da

interface para a solução. O subseqüente abaixamento no valor de tensão foi explicado em

termos da adsorção de monômeros de tensoativo, que se encontram em “excesso” em

solução. Vaknin et al. (Vaknin et al., 2004) estudaram o mesmo sistema através de técnicas

de tensão superficial, refletividade de raios-X e difração de raios X a ângulos razantes,

GIXD (grazing incidence diffraction). Entretanto, foram utilizados valores de concentração

de polímero 1000 vezes maior, o que torna difícil a comparação com resultados obtidos

anteriormente por Staples et al (Staples et al., 2002). Os dados de tensão superficial

mostram a ocorrência de forte complexação na interface. Além disso, a estrutura dessa

interface apresentou elevado grau de ordenamento, que foi atribuída pelos autores a uma

cristalização superficial.

Já os resultados obtidos para o sistema PSS/DTAB apresentaram comportamento

bastante oposto ao anteriormente relatado. Também foi observado um abaixamento da

tensão superficial a baixas concentrações de DTAB. Entretanto, este comportamento parece

ser dependente da concentração do polímero, uma vez que concentrações de PSS de 20 e

140 ppm mostraram diminuição da tensão superficial que diferem de uma ordem de

magnitude de concentração de DTAB, sendo que quanto menor a concentração do

polieletrólito, mais deslocada se apresentava a curva, em relação ao tensoativo puro.

16

Posterior ao abaixamento descrito, a curva apresentou um patamar que ocorreu no mesmo

valor de tensão superficial para todas as concentrações de PSS, e em seguida, uma

diminuição da tensão levando o sistema a atingir o valor da CMC. Os dados de

refletividade de nêutrons mostram comportamentos bastante distintos, diretamente

relacionados com as etapas observadas nas curvas de tensão superficial. Inicialmente têm-

se a formação de uma monocamada, a qual se assume ser constituída de complexos

polímero-tensoativo. Com o aumento da concentração de DTAB, há um aumento de até

cinco vezes na espessura dessa monocamada.

Como podemos notar pelos trabalhos citados, diferentes comportamentos são

observados resultantes da interação entre polieletrólitos e tensoativos. O que pode ser

concluído a partir da literatura é a existência de uma competição entre a formação de

complexos que apresentem atividade superficial e aqueles que interagem e permanecem em

solução. Sendo assim, o comportamento destes sistemas será regido pela estabilidade de

cada uma destas espécies. Dessa forma, torna-se difícil uma generalização sobre o

comportamento esperado para sistemas contendo polieletrólitos e tensoativos, visto que um

número muito grande de parâmetros deve ser levado em consideração.

Nesta tese iremos abordar o caso específico da interação de carragenanas,

polissacarídeos sulfatados, com diferentes tipos de substâncias tensoativas. Abaixo será

feita uma introdução sobre esta classe de biopolímeros.

17

1.3. Carragenanas

1.3.1 - Estrutura Química e Ocorrência

Carragenanas são uma classe de galactanas sulfatadas que ocorrem na matriz

extracelular de determinadas algas vermelhas, principalmente da família Rhodophyceae.

Constituinte da parede celular, seu papel nas algas está relacionado a permeabilidade

seletiva das células. Esses polissacarídeos sulfatados, quando presentes nas algas que vivem

na zona entre-marés, supostamente protegem-nas contra a dessecação durante as marés

baixas (Tripodi e De Mais, 1975). Além disso, na parede celular das células reprodutivas,

por sua natureza higroscópica, as carragenanas desempenham também um importante papel

na liberação dos esporos e gametas (McCully 1966, Evans et al. 1973, Bouzon et al. 2000).

Elas fazem parte dos chamados hidrocolóides, assim chamados por sua alta capacidade de

retenção de água.

Estes polissacarídeos apresentam a mesma estrutura básica, que consiste de cadeias

lineares de unidades β-D-galactopiranose ligados glicosidicamente através da posição 3

(unidade-G) e α-D-galactopiranose ligados glicosidicamente através da posição 4 (unidade-

D) (Figura 4). Sua classificação se dá de acordo com o número e posição de grupos ésteres

sulfato, e da ocorrência de pontes D-3,6-anidro nos resíduos (unidade-DA). Um resumo da

nomenclatura dos diferentes tipos de carragenanas, desenvolvida por Knutsen et al

(Knutsen et al., 1994), é mostrado na Tabela 1.

18

Figura 4: Unidade repetitiva para carragenanas.

Tabela 1: Código de letras alternativo para as diferentes unidades de açúcar encontradas nas

carragenanas, conforme desenvolvido por Knutsen et al. (1994).

CÓDI

GO NOME IUPAC

G β-D-galactopiranose ligada através da posição 3 D α-D-galactopiranose ligada através da posição 4

DA 3,6-anidro-α-D-galactopiranose ligada através da posição 4 S Éster de sulfato (O-SO3

-) G2S β-D-galactopiranose 2-sulfato ligada através da posição 3 G4S β-D-galactopiranose 4-sulfato ligada através da posição 3

DA2S 3,6-anidro-α-D-galactopiranose 2-sulfato ligada através da posição 4 D2S,6S α-D-galactopiranose 2,6-dissulfato ligada através da posição 4

D6S α-D-galactopiranose 6-sulfato 4-ligada

Interessante notar que o Agar, outro hidrocolóide amplamente utilizado há mais

tempo que as carragenanas, também extraído da mesma família de algas que as

carragenanas (Rhodophycae), possui estrutura muito semelhante, porém seus grupos

carregados são compostos por carboxilatos, e ao invés de um D-3,6-anidro-α-

galactopiranose encontra-se um grupo L-3,6-anidro-α-galactopiranose.

19

As carragenanas são geralmente classificadas em 4 famílias, as quais levam um

prefixo de uma letra do alfabeto grego, de acordo com a posição dos grupos sulfato nas

unidades G ou D, e com a ocorrência de unidades DA:

Família Kappa (κ): Apresenta grupos sulfato no Carbono-4 da unidade G.

Família Lambda (λ): Apresenta grupos sulfato no Carbono-2 de ambas unidades.

Família Beta (β): Compreende polissacarídeos em que a unidade G não é sulfatada.

Família Ômega (ω): Compreende galactanas que apresentam grupos sulfato no

carbono-6 da unidade G.

As Figuras 5(a) e 5(b) mostram as frações precursoras µ− e ν− carragenana que, por

meio de reações de eliminação em meio alcalino, dão origem às frações κ (DA-G4S) e ι

(DA2S-G4S), comercialmente importantes por formarem géis termorreversíveis em

condições adequadas. Já a fração precursora λ−carragenana (D2S6S-G2S) (Figura 5(c)), é

mais utilizada industrialmente, que a θ−carragenana, pelo fato da reação de transformação

ser extremamente lenta e de baixo rendimento, o que leva a uma grande quantidade de

mistura entre as duas frações. Além disso, reconhece-se a sua importância por suas

características como agente espessante, apesar de não ser formadora de gel.

20

(a)

(b)

(c)

Figura 5: Estrutura de algumas das frações de carragenana comercialmente importantes: (a) µµµµ-

carragenana, precursora da fração κκκκ-carragenana; (b) νννν-carragenana, precursora da fração ιιιι-

carragenana; e (c) λλλλ-carragenana, precursora da fração θθθθ-carragenana.

As frações de carragenanas citadas acima correspondem a estruturas ideais, formadas

por apenas um dos tipos de dissacarídeo como unidade monomérica. Entretanto, na

natureza, carragenanas podem conter mais de um tipo de unidade repetitiva, caracterizando

o que se denomina de frações híbridas. Nestas, por exemplo, podem ser observadas em uma

21

mesma molécula estruturas repetitivas de κ- e ι- carragenanas em diferentes proporções. No

caso de 50%, a fração é denominada de kappa 2 (κ-2) (Figura 6).

Figura 6: Estrutura da fração híbrida κ−κ−κ−κ−2-carragenana.

Na divisão Rhodophyta, a ordem Gigartinales é a mais numerosa, sendo formada por

41 famílias, 100 gêneros e 700 espécies (Chopin et al.,1999), e algumas delas são

conhecidas como típicas produtoras de determinadas frações de carragenana: κ-carragenana

é predominantemente obtida pela extração da alga tropical Kappaphycus alvarezii (Figura

7(a)), conhecida comercialmente como Euchema cottonii. Já a principal espécie produtora

de ι-carragenana é a Eucheuma denticulatum (Figura 7(b)), comercialmente conhecida

como Euchema spinosum.

22

(a) (b)

Figura 7: Variedades de algas produtoras de carragenanas (a) Kappaphycus alvarezii, e

(b) Eucheuma denticulatum.

As variações quanto ao tipo de carragenanas não ocorrem somente entre diferentes

espécies de algas, mas também em diferentes estágios de vida de uma mesma espécie (De

Ruiter e Rudolph, 1997).

A principal fonte dessas espécies de algas tropicais encontra-se na sua grande maioria

na costa das Filipinas, entretanto no Brasil, o cultivo de determinadas espécies vêm sendo

implementado em Ubatuba, na costa paulista, pelo Centro de Pesquisas em Aquicultura

(CPAqui) do Instituto de Pesca em São Paulo. O objetivo dos pesquisadores brasileiros

consiste no desenvolvimento de criação auto-sustentável de camarões pela integração do

cultivo de microalgas, sendo que o trabalho já vem obtendo sucesso com a utilização de

Kappaphycus alvarezii (Lombardi et al., 2006). O cultivo das algas dentro das gaiolas de

criação de camarões pode incrementar o retorno econômico da produção de ambos os

organismos. As primeiras tentativas do cultivo desta alga em sistema integrado às gaiolas

de criação de camarões demonstraram um potencial de produção de, aproximadamente, 200

23

toneladas/ha/ano. Os autores ressaltam que existem outras vantagens na introdução de algas

nas gaiolas de criação de camarões. Elas podem ser utilizadas como um excelente filtro de

absorção orgânica. Esta integração, portanto, pode reduzir o impacto ambiental, causado

pela poluição gerada no sistema, uma vez que as macroalgas possuem alta capacidade de

remover o excesso de nutrientes que porventura seja produzido durante a criação de

camarões, ou seja, as algas absorvem os elementos nitrogenados provenientes da excreção

dos camarões e dos restos de alimento.

1.3.2 - Propriedades Físicas das Carragenanas

O processo físico de gelificação é um fenômeno bastante comum envolvendo

polissacarídeos solúveis. Entretanto, o entendimento molecular do mecanismo pelo qual

essas moléculas podem formar géis mais fracos ou mais rígidos ainda é discutido.

Muitos biopolímeros com capacidade de formar géis apresentam uma característica

em comum: o processo de gelificação é precedido por uma transição de um estado

desordenado (em que dizemos que o polímero se encontra com uma conformação aleatória

ou ao acaso), para uma conformação ordenada (hélice), seguindo o seguinte esquema

representado na Figura 8. Além disso, a conformação do tipo hélice pode ser induzida

através de variações de temperatura, por alteração do solvente, ou ainda, por adição de um

sal (Piculell e Nilsson, 1990).

24

Figura 8: Processo de gelificação de biopolímeros.

No caso específico das carragenanas, a capacidade de gelificação também está

associada à formação de duplas hélices que, ao interagirem entre si, formam uma rede

molecular tridimensional que aprisiona o solvente (Rochas et al., 1990, Viebke et al.,

1994). Este tipo de processo ocorre apenas para frações que apresentam o grupo 3,6-

anidrogalactose em sua estrutura, sendo atribuída ao fato de que, neste caso, a unidade

sacarídica pode adquirir uma conformação 1C4, onde o anel anidro se encontra na

conformação cadeira, com os carbonos 1 e 4 em lados opostos (Turvey, 1965). Esse tipo de

conformação oferece a condição geométrica propícia para a formação das hélices, que no

caso das carragenanas ocorre provavelmente para proteger o grupo anidro-galactose do

contato com a água (van de Velde, et al., 2002).

Piculell e colaboradores investigaram uma série de efeitos eletrostáticos capazes de

afetar a conformação de equilíbrio de biopolímeros (Piculell, 2006). Para a série de

trabalhos realizados, carragenanas (frações κ− e ι-) foram eleitas como sistema modelo,

25

principalmente devido a possibilidade de obter a macromolécula com diferentes densidades

de carga sem a necessidade de titulação. Dentre os fatores analisados, encontram-se a

valência do contra-íon e concentração do poli-íon (Nilsson, e Piculell, 1991; Piculell et

al.,1997), concentração de sal (Viebke et al., 1998) e constante dielétrica do solvente

(Viebke, et al., 1994). Entretanto, uma das características mais marcantes dessa classe de

moléculas, e que também influencia diretamente nas propriedades do gel a ser formado, é a

grande sensibilidade que apresentam frente ao ambiente iônico em que se encontram, que

não está relacionado apenas à quantidade ou valência dos íons, mas principalmente a

identidade dos mesmos.

Para a fração k-carragenana, a força do gel aumenta com o aumento da força iônica,

que é potencializada quando em presença de Cs+, Rb+ e K+, enquanto Na+, Li+, N(CH3)4+

têm, comparativamente, um menor efeito (Smidsrod and Grasdalen, 1982). Já a fração iota

forma géis mais fortes quando em presença de íons cálcio, sugerindo a especificidade desta

fração por este íon (Nilsson e Piculell, 1991). Um gel é tanto mais forte quanto menos

quebradiço (menos friável) e maior retenção de solvente (menor sinérese).

Dessa forma, levando em consideração os modelos descritos e aceitos na literatura

para formação de géis e as características peculiares das carragenanas, podemos dizer que o

mecanismo de formação de gel envolve a associação entre as cadeias helicoidais, ou ainda a

formação de agregados envolvendo várias hélices, formando uma estrutura super-

helicoidal. Assim, a presença e a identidade de determinados íons é que direcionará qual

mecanismo acima será predominante em relação ao outro.

26

1.4. Aspectos Dinâmicos de Interfaces Líquidas

No estudo do comportamento de polieletrólitos e tensoativos em interfaces, não

apenas situações de equilíbrio são importantes, mas também aquelas envolvendo aspectos

dinâmicos. Dentre os aspectos dinâmicos, ou de não-equilíbrio, estudos relacionados a

velocidade de adsorção na interface líquido-ar a áreas constantes podem ser conduzidos a

partir do acompanhamento das variações de tensão superficial em função do tempo.

O primeiro modelo para o estudo da adsorção de substâncias anfifílicas em interfaces

a áreas constantes foi descrito por Ward e Tordai (Ward e Tordai, 1946), e é baseado na

existência de uma dependência da tensão superficial com o tempo, sendo que esta se

relaciona diretamente com a concentração das moléculas adsorvidas (ou excesso

superficial, Γ), causada pelo transporte do tensoativo à interface. A interface é considerada

como sendo composta de duas partes: a superfície propriamente dita e a região adjacente à

mesma, ou sub-superfície. Este modelo tratou de uma única espécie ativa, e forneceu idéias

sobre as etapas envolvidas no processo de adsorção, tais como: a difusão das moléculas no

interior da solução e o conceito de subsuperfície. Dessa forma, assumem que o processo

seja controlado por difusão, por tratar-se de um modelo de “tudo-ou-nada”, no sentido que

apenas um valor de área superficial, associado a um estado de adsorção era considerado.

Por outro lado, processos controlados por cinética são baseados nos mecanismos de

transferência de moléculas da subsuperfície, para a interface propriamente dita. Este

processo é determinado principalmente por movimentos moleculares, como rearranjos ou

rotações, que no caso de macromoléculas pode também envolver denaturação. Baseando-se

nestas idéias, Fainerman e colaboradores (Fainerman et al., 1994), acrescentaram na teoria

27

as possibilidades de diferentes estados de adsorção, que levam a diferentes recobrimentos

da superfície, na dinâmica da adsorção, introduzindo a possibilidade de diferentes áreas

superficiais.

Se, por um lado, o processo de adsorção é uma propriedade dinâmica ocorrendo a

área constante, por outro lado temos aspectos dinâmicos da superfície que ocorrem

considerando variações de área, e determinam aspectos reológicos dilatacionais da

interface.

A resistência que interfaces fluidas oferecem frente a uma deformação é determinante

nos processos de formação e estabilização de vários sistemas dispersos como espumas e

emulsões. Além disso, são também extremamente importantes na forma e função de certos

organismos vivos, como é o caso dos alvéolos pulmonares.

Na década de 60, Max van den Tempel enfatizou a importância de um melhor

entendimento do comportamento de interfaces quando submetidas a deformações

dilatacionais, tanto para aplicações tecnológicas como biológicas.

O trabalho deste autor em colaboração com van de Riet (van den Tempel e van de

Riet, 1965), e paralelamente o de Hansen e Mann (Hansen e Mann, 1964), e posteriormente

o trabalho com Lucassen (Lucassen e van den Tempel, 1972a), estabeleceram um novo

tratamento teórico e experimental para o comportamento superficial dinâmico, no qual são

definidos e medidos parâmetros superficiais, de modo a relacionar as propriedades

moleculares da substância tensoativa com os fenômenos observados quando o sistema sofre

deformação.

O parâmetro central que descreve o comportamento de superfícies submetidas a

compressão/expansão é chamado de módulo dilatacional superficial. O seu valor de

28

equilíbrio é identificado com o módulo de Young para interfaces e corresponde à

elasticidade de Gibbs no caso de substâncias solúveis. Quando as velocidades de difusão na

interface são mais importantes que a difusão do interior para a interface, o efeito ou

elasticidade Marangoni prevalece. Em ambos os casos o módulo dilatacional superficial, ou

elasticidade Gibbs-Marangoni, é definido como:

E = dγγγγ / d ln A

Nesta equação, dγ representa a variação infinitesimal de tensão superficial em função

de uma variação relativa na área (dA/A = d lnA). Desta forma, a presença de gradientes de

tensão superficial resultarão em uma movimentação de moléculas do interior da solução

(Gibbs) ou de regiões da própria superfície (Marangoni) de modo que moléculas em regiões

de menor tensão superficial migrarão para regiões de maior γ. Este gradiente pode ser

provocado, por exemplo, por alterações na área.

De maneira geral, o valor numérico do módulo E dependerá da escala de tempo

aplicada, e este módulo determina tanto a resistência à variação de tensão superficial, bem

como a velocidade com que esse gradiente desaparece, uma vez cessada a deformação

sobre o sistema.

As forças tangenciais pelas quais os elementos de área são sujeitos a uma deformação

em uma região não uniforme de tensão superficial geram um espectro de ondas

longitudinais, com diferentes velocidades de propagação. Estas ondas se propagam por toda

a superfície, aumentando dessa forma a distância a partir da origem, e também o tempo a

partir do qual o processo se iniciou. Sendo assim, a elasticidade dilatacional superficial será

29

tanto maior quanto maior for a rapidez para restabelecer a uniformidade da tensão

superficial.

Baseados nestes conceitos, os autores descreveram métodos para a medida de E, que

consistem puramente de variações senoidais na área do sistema com a subseqüente medida

da tensão superficial resultante.

Como dito anteriormente, um comportamento perfeitamente elástico da superfície é

aquele em que processos de relaxação, que tendem a desviar a tensão superficial do seu

valor de equilíbrio, não ocorram no intervalo de tempo do experimento. Quando processos

de relaxação ocorrem, atribui-se à superfície um comportamento viscoelástico. Neste caso,

diferenças de fase ocorrem entre a variação de γ e variação de área, fato que foi

formalmente considerado pela introdução de um módulo complexo:

E = E e i θθθθ = E cos θθθθ + i E sen θθθθ.

A parte imaginária está relacionada com processos dissipativos de energia, e sua

contribuição pode ser expressa em termos da viscosidade dilatacional superficial:

ηηηη d = E sen θθθθ / ωωωω

Dessa forma, para uma medida completa, é necessária a determinação da diferença de

fase entre a deformação e o restabelecimento do sistema. Entretanto, a relação, em função

do tempo, do módulo e do ângulo de fase dependem do processo de relaxação envolvido,

sendo que o método apenas considera processos típicos, como adsorção/dessorção do

material tensoativo, acompanhado da difusão do mesmo.

30

Os autores ainda estabelecem que para sistemas onde a difusão é a etapa determinante

no processo de relaxação, o equilíbrio de adsorção é estabelecido em tempos curtos quando

comparados a ω-1, ou seja, o tempo característico do experimento. Isto significa que a

tensão superficial de equilíbrio é atingida rapidamente, e as variações na tensão superficial

se devem a flutuações de concentração na subsuperfície.

Para estes casos dependentes da difusão, a determinação experimental da relação

entre E e ω é possível, de modo a obter a isoterma de equilíbrio de adsorção do sistema,

que obedece ao formato da curva mostrada na Figura 9.

|Ε|

|ω| Figura 9: Variação do módulo dilatacional superficial ||||E|||| com a freqüência ||||ωωωω|||| para processos de

relaxação dependente da difusão.

Na região em que o tempo característico do experimento é menor comparado ao

tempo relacionado ao processo de difusão (valores de ω mais elevados), E é

independente da freqüência. Dessa forma, a superfície se comporta como sendo recoberta

por uma monocamada elástica “insolúvel”, devido a virtual ausência de transporte por

difusão.

31

Lucassen e van den Tempel (Lucassen e van den Tempel, 1972b), realizaram também

estudo de E a baixas freqüências, e concluíram que a conseqüência importante de variações

lentas de área é a possibilidade de ocorrência de processos de relaxação, uma vez que a

interface se comporta como não puramente elástica. Neste caso, para monocamadas com

razoável solubilidade, que permitam o processo de difusão, podem ocorrer trocas entre a

solução e a interface, que foram consideradas pelos autores como sendo a origem da

viscosidade dilatacional superficial.

Ivanov et al. (Ivanov et al., 2005) consideram a viscosidade superficial resultante

principalmente de dois processos quando a interface é perturbada: reações superficiais,

onde as moléculas interagem entre si na interface; e o transporte do tensoativo na interface.

Para ambos os processos, os autores definem a viscosidade superficial dilatacional,

considerando-na como aparente (ηapp), uma vez que não há como separar os processos

difusivos das moléculas do interior para a interface, não existindo dessa forma uma

dependência apenas de parâmetros superficiais.

Dos pontos apresentados entende-se que a faixa de freqüência empregada é um

importante parâmetro, e dependerá do sistema a ser analisado, dos processos que podem

ocorrer na faixa de tempo estudada, e da informação que se pretende obter do sistema.

Existem muitos métodos descritos para o estudo dinâmico de interfaces (Edwards, et

al., 1991; Dukhin, et al., 1995; Möbius, et al., 2001), que podem ser classificados em dois

grupos:

i) Métodos de relaxação: que consistem da súbita expansão de área de uma interface

em equilíbrio, com o subseqüente acompanhamento da relaxação do sistema por meio dos

valores de tensão superficial (Passeroni et al., 1991; Liggieri et al, 1991; Nagarajan e

32

Wasan, 1993). Estes métodos podem ser correlacionados ao método de “creep/recovery”

usado para o volume. O método de amortecimento de ondas capilares (Capillary wave

damping) é um exemplo de um método de relaxação. Neste método, a propagação de ondas

capilares, geradas por um sistema de vibração eletromecânico, causa uma oscilação

(freqüência de 10-104 Hz) da capacitância de um condensador formado por lâminas

colocadas em contato com a interface. Essa variação de capacitância resulta em uma

corrente elétrica alternada. O método mede a amplitude e o deslocamento de fase do sinal

elétrico, resultante do amortecimento da propagação das ondas na interface e estes estão

relacionados com propriedades da interface. Quando a freqüência empregada é baixa (1-20

Hz) o método é chamado de ondas longitudinais.

ii) Métodos de perturbação: são baseados em perturbações contínuas, expansão e/ou

contração, da interface. Para monocamadas insolúveis, estes métodos podem ser realizados

pela movimentação das barreiras de uma cuba de Langmuir (Adamson e Gast, 1997) ou

pela oscilação de uma bolha ou gota (descrito com detalhes na parte experimental desta

tese).

2. Objetivos Gerais desta Tese e Justificativa

Esta tese teve por objetivo o estudo da interação de diferentes tipos de substâncias

anfifílicas com um tipo particular de polieletrólito, as carragenanas. A escolha desse

sistema deve-se ao fato de que esse biopolímero pode ser obtido como diferentes frações

que apresentam variações de densidade de carga superficial, e além disso, exibir diferentes

33

conformações, de acordo com o tipo de fração utilizada, ou ainda em função do ambiente

em que se encontram.

Sendo assim, explorar as propriedades físico-químicas destes sistemas mistos em

solução diluída pode ajudar no entendimento do comportamento destes sistemas mistos,

bem como fornecer subsídios para aplicação destes sistemas em outras áreas da indústria,

visto seu elevado emprego na área alimentícia. Por último, as informações obtidas podem

ser úteis no emprego desses biopolímeros em sistemas contendo tensoativos e podem

apontar para a utilidade dos mesmos como matrizes para a imobilização de enzimas.

3. Materiais e Métodos

3.1. Purificação de Carragenanas

Carragenanas foram fornecidas pela empresa Gelymar-Chile. Todas as frações

utilizadas foram previamente dialisadas e convertidas para a forma Na+ (sal de sódio) por

troca iônica (resina de troca iônica -Amberlite IR120 ou Dowex 50 WX4-100 Sigma-

Aldrich) seguida por rotoevaporação e liofilização. A eficiência da metodologia foi

controlada por espectrofotometria de chama (Shimadzu AA-680), e a determinação da

massa molar feita na Universidade Federal do Paraná por SEC-MALLS (cromatografia por

exclusão de tamanho HPWaters – USA), utilizando quatro ultrahidrogéis seqüenciais

(WatersTM com limites de exclusão de 5.103, 8.104, 4.105, e 7.106 g.mol-1), acoplado a

um espalhamento de laser dinâmico a vários ângulos (Dawn-DSP-Wyatt Technology) com

um refratômetro diferencial (Waters, model 2410); soluções aquosas em nitrato de sódio

34

0,1 mmol L-1 foram injetadas usando um fluxo controlado de 0,6 mL min-1. Na Tabela 2

seguem os valores obtidos para a massa molar das frações.

Tabela 2: Massas molares das frações carragenanas

Fração

Carragenana

Massa Molar

(kg.mol-1)

Kappa (Na+) 6,0x102

Kappa-2 (Na+) 2,9x103

Iota (Na+) 2,7x103

Lambda (Na+) 5,2 x102

3.2. Tensão Superficial

3.2.1 - Método da Gota Pendente

Um dos métodos de determinação da tensão superficial é baseado no formato de uma

gota pendente. Essencialmente, o formato da gota é determinado por uma combinação de

efeitos da tensão superficial e gravidade. Forças superficiais tendem a formar gotas

esféricas, enquanto a gravidade tende a alongar a gota pendente.

As vantagens do método são inúmeras, uma vez que utiliza pequenas quantidades de

amostra, além do fato de que a técnica cobre intervalos de tempo que podem variar de

segundos até horas ou dias (Fainerman et al., 2001), sendo que processos bastante lentos

também podem ser acompanhados.

As tensões superficiais foram medidas pelo método da gota pendente, empregando o

método da análise do perfil eixo-simétrico da gota (ADSA), (Rotenberg et al., 1983 e

35

Cheng at al., 1990) usando um tensiômetro automático modelo OCA-20, Dataphysics,

Alemanha. Para tal, uma gota da solução aquosa de interesse é formada por uma seringa,

acoplada a uma bomba de injeção, na extremidade de uma agulha com ponta reta e

diâmetro conhecido, contida em uma cubeta ótica contendo um certo volume da solução

trabalhada, para manter a atmosfera saturada, de forma a evitar a evaporação da gota

durante as medidas (Figura 10). Dessa forma, a gota pode ser filmada por meio de uma

câmara CCD. Um programa com um processo de disparo programado de filmagem, a partir

do posicionamento conveniente de uma linha de referência, permite filmar imagens mesmo

antes da formação da gota. O tempo zero é definido com a formação da interface (gota)

após analisar o filme e selecionando-o quadro a quadro.

PC

CCD

SE

L A

Figura 10: Aparato experimental para as medidas de tensão superficial pelo método da gota

pendente: A: cubeta ótica termostatizada, L: lâmpada, SE: seringa eletrônica.

A tensão superficial é determinada digitalizando a imagem e analisando o seu perfil,

quadro a quadro, ajustando-o à equação de Young-Laplace (Davies e Rideal, 1963),

36

utilizada para condições de equilíbrio para dois fluidos homogêneos, separados por uma

interface:

∆∆∆∆P = (ρρρρl – ρρρρa ) g h = (γγγγ/R1 ) + (γγγγ/R2)

para a qual ∆P corresponde à diferença de pressão entre o interior e a parte externa da

gota; ρl – ρa são as densidades da fase líquida e do ar, respectivamente; g é aceleração da

gravidade, h altura da coluna líquida na gota e R1 e R2 os dois raios principais de curvatura.

De fato esses raios são expressos em termos de coordenadas no ajuste do perfil da gota à

equação.

3.2.2 - Elasticidade Dilatacional Superficial

Para as medidas de elasticidade superficial dilatacional, o mesmo aparato foi utilizado

(OCA-20, Dataphysics), com o adicional de um sistema de oscilação de freqüência, e um

software adequado para a aquisição dos dados.

Dessa forma, a oscilação na gota é iniciada depois de o sistema ter atingido o

equilíbrio, acompanhado pela não variação da tensão superficial em função do tempo. Foi

estabelecido como equilíbrio o sistema que apresentava variação de tensão superficial

menor que 0,5 mN.m-1 durante um intervalo de tempo de 10 minutos.

Um dispositivo piezelétrico, conectado a um gerador de função de onda e localizado

acima da agulha, produz um movimento senoidal na gota, em valores específicos de

freqüência e amplitude pré-determinados. As imagens da oscilação da gota são também

gravadas com uma vídeo-câmera. Ao final do experimento, o software recupera as imagens

37

e calcula os valores de área e o valor de tensão superficial correspondente, para cada ciclo

de oscilação aplicado. Por meio de análise por transformada de Fourier, o módulo

dilatacional superficial complexo (E) e o ângulo de fase (θ) são determinados. A partir

desses, o módulo de armazenamento (parte real: Er � Gr) e de perda (parte imaginária, Ei

� Gi) são calculados. O software do equipamento considera as equações propostas por

Lucassen e van den Tempel, que associa Gr e Gi aos valores de elasticidade dilatacional e

viscosidade dilatacional superficial ηs , respectivamente. Ivanov et al. (Ivanov et al., 2005)

apresentam ηs = Gi / 2πf = Gi / ω., por questão de unidades, que deveria ser de N m-1 s-1 e

não N m-1. Já Ravera et al. (Santini, et al., 2007; Ravera et al., 2006) apresenta seus

resultados da forma como descrito anteriormente, forma que será adotada nesta tese.

3.3. Monocamadas de Langmuir

A técnica de Langmuir é baseada no espalhamento de uma substância anfifílica na

interface ar-água, sendo que essa substância deve apresentar as características de ser

insolúvel, e apresentar um coeficiente de espalhamento favorável à ocorrência desse

processo, ou seja, deve se orientar nesta interface de forma a minimizar sua energia livre

(Langmuir, 1917) . Além disso, a técnica permite não apenas análise de interações entre a

substância formadora da monocamada, mas também com outras, que se encontrem na

subfase. Dessa forma, é possível verificar efeito de eletrólitos, interação com polímeros,

peptídeos e proteínas, o que torna o método um excelente modelo mimetizador de

membranas biológicas, quando a monocamada for constituída por um lipídeo, ou por

misturas destes (Brockman, 1999; Brezesinski e Möhwald, 2003).

38

Quando esta substância anfifílica adsorve na interface, provoca uma diminuição na

tensão superficial da água (γ0), até um novo valor de tensão (γ). Essa variação da tensão

superficial (γ0 -γ) é chamada de pressão superficial, propriedade que fornecerá informações

a respeito da adsorção da monocamada formada.

Nesta técnica, a presença de uma barreira móvel, capaz de varrer a superfície, faz com

que a monocamada possa ser comprimida ou expandida. Sendo a tensão superficial medida

por uma placa de Wilhelmy, com a compactação dessa monocamada, um aumento na

pressão superficial será observado com a compressão da mesma (Figura 11).

sensor de Wilhelmy

Figura 11: Esquema de uma cuba de Langmuir.

Dessa forma, obtemos então uma curva que relaciona a pressão superficial com a área

disponível por molécula da substância anfifílica, denominada isoterma de pressão

superficial (π-A), obtida à temperatura constante (Figura 12).

39

Figura 12: Estados Bidimensionais de uma monocamada: (G) gasoso; (LE) líquido-expandido;

(LC) líquido-condensado; (S) sólido.

Analisando o perfil de uma isoterma, podemos identificar regiões de diferentes

estágios de compressibilidade: gasoso, líquido-expandido, líquido-condensado e sólido;

sendo todos eles análogos aos estados tridimensionais da matéria. Regiões com pressão

superficial constante, mesmo sob compressão, são atribuídas a transições de fase.

Além disso, a partir da isoterma π-A, uma importante propriedade da monocamada é

dada pela relação -1/A (dπ /dA)T, conhecida como módulo compressional de superfície

(Davies e Rideal, 1963), ou ainda como elasticidade no plano (Smaby et al., 1997) e se

relaciona com a elasticidade da monocamada em uma condição de equilíbrio.

Graficamente, é proporcional a medida da inclinação da curva π-A, ou seja, quanto maior o

40

aumento da pressão superficial diante da compressão (diminuição da área por molécula),

maior a elasticidade da monocamada.

A extrapolação da região de menor compressibilidade para valores de π igual a zero

são conhecidas como área mínima, e a pressão máxima atingida durante uma compressão é

conhecida por pressão de colapso, que corresponde ao ponto em que a estrutura da

monocamada é desfeita, dando lugar a formação de bi ou multicamadas desorganizadas.

Para a realização dos experimentos, fosfolipídios foram dissolvidos em clorofórmio e

glicolipídios em uma solução e clorofórmio/metanol (9:1), sendo que em ambos os casos as

concentrações foram da ordem de 1 mM. Após a evaporação do solvente

(aproximadamente 15 minutos), as monocamadas foram comprimidas a uma velocidade

0,58 mm.s-1. As variações de pressão superficial foram registradas em função da área

disponível por molécula para a construção das isotermas de superfície em uma cuba de

Langmuir- Insight (Brasil) (Zaniquelli et al., 1993), e os experimentos foram realizados à

temperatura de 24 oC ±1,0.

3.4. Filmes de Langmuir-Blodgett

A técnica de Langmuir-Blodgett (LB) consiste na transferência das monocamadas

formadas na interface líquido-ar para suportes sólidos (Blodgett, 1935; Blodgett e

Langmuir, 1937). A monocamada é inicialmente comprimida até atingir um elevado grau

de compactação. Quando tal grau é atingido, um suporte sólido é imerso verticalmente na

subfase aquosa, de forma que, ao passar pela interface ar-água, uma camada do filme é

transferida para este substrato. Se o filme for emerso da subfase, uma segunda camada será

41

transferida (Figura 13). Dessa forma, o número de camadas e a espessura do filme serão

controlados pelo número de imersões e emersões deste substrato através da interface.

Figura 13: Tipos de Filmes LB: (a) Filme tipo X; (b) Filme tipo Y e (c) Filme tipo Z.

Parâmetro importante na formação de filmes LB consiste no conhecimento da razão

de transferência (R) da monocamada para o suporte sólido. Para tal cálculo, a barreira

móvel deve estar parada em um valor constante de pressão superficial, antes do início da

transferência. Quando o substrato passa pela interface, se houver transferência desta

monocamada, ocorrerá um decréscimo da pressão superficial, em função da quantidade de

material retirado da interface líquido-ar. Sendo assim, a barreira móvel deve ser acionada,

de modo a comprimir a monocamada para restaurar o valor de pressão superficial inicial.

Desta forma, o deslocamento de área na cuba (∆Ac) (verificado através da compensação da

barreira) deve ser igual à área do suporte sólido para o qual a monocamada foi transferida

(∆As):

42

R = ∆∆∆∆Ac / ∆∆∆∆As

Quanto mais próximo de 1 for o valor de R (razão de transferência), melhor a

transferência da monocamada para o suporte sólido.

Para os experimentos descritos nesta tese, as monocamadas foram comprimidas até

um valor de pressão superficial, que variaram entre 30 e 40 mN m-1, dependendo do

lipídeo utilizado. A velocidade de deposição ou transferência das monocamadas foi de

0,038 mm s-1.

3.5. Microscopia de Fluorescência

A técnica de microscopia de fluorescência aplicada a interfaces (epifluorescência) é

utilizada para a análise morfológica de monocamadas (McConnel, 1983). Esta consiste da

adição de uma sonda fluorescente à substância em quantidades extremamente baixas,

aproximadamente 1% mol, de modo que esta atue como uma “impureza fluorescente”. Com

a compressão da monocamada, regiões de transição de fase poderão surgir, fazendo com

que a sonda utilizada se solubilize preferencialmente em uma destas, e dessa forma

domínios passarão a ser observados como resultado das fases onde esta sonda se encontra

presente (regiões claras) e ausente (regiões escuras).

Na montagem experimental, a objetiva e a luz de incidência podem se encontrar

acima da cuba, ou então, a luz incidente pode estar abaixo da cuba, passando então por uma

janela no fundo da cuba, e atingindo a objetiva após passar pela subfase e pela

monocamada (Figura 14).

43

Cuba de Langmuir

Microscópio de Epifluorescência

Cuba de Langmuir

Microscópio de Epifluorescência

Figura 14: Esquema de um microscópio de epifluorescência.

Neste trabalho, dois microscópios foram utilizados, um deles normal (Olympus B-

max acoplado a uma SIT (silicon intensified tube) câmera Hamamatsu, mod. C-32, com

sensibilidade de 10-3 Lux) com adaptação de uma cuba de Langmuir montada nas Oficinas

do Campus de Ribeirão Preto, USP e o outro, invertido (Zeiss Axiovert (Carl Zeiss,

Oberkochem, Alemanha), acoplado a cuba da Langmuir (KSV, Helsinki, Finlândia)

disponível no Centro de Microscopia da Universidade Nacional de Córdoba.

3.6. Microscopia no ângulo de Brewster

Outra técnica que permite observar a morfologia de monocamadas e não necessita a

adição de sonda é a microscopia no ângulo de Brewster (Höning e Möbius, 1991; Mëunier,

2000).

44

Nessa técnica um feixe de luz incidindo na interface no ângulo de Brewster, refletirá

e será captado por um detector situado no lado oposto do braço de incidência. No ângulo de

Brewster, não há refletividade para uma interface de Fresnel (sem rugosidade e cujo índice

de refração varie abruptamente entre uma fase mais condensada e outra menos condensada)

(Figura 15). Porém, para uma monocamada de Langmuir, uma interface real, essa

refletividade é mínima no ângulo de Brewster (para a água, θB é próximo de 54°), porém a

presença da monocamada altera esse ângulo o que proporciona à técnica uma alta

sensibilidade para a análise da morfologia superficial, proporcionando diferentes contrastes

dependentes não só dos estados de condensação de fases presentes na interface, mas

também da espessura da monocamada formada (Rosetti et al., 2003).

Figura 15: (a) Incidência da luz no ângulo de Brewster da subfase na ausência e (b) na presença

da monocamada

Para as medidas realizadas, utilizou-se um Microscópio mini-BAM (NFT), disponível

no Centro de Microscopia da Universidade de Córdoba-Argentina e, em alguns

experimentos, um Microscópio BAM 2 Plus (NFT) do Grupo de Polímeros do Instituto de

Física de São Carlos-USP, com o Prof. Dr. Osvaldo Novais de Oliveira Jr.

Ar

Monocamada

Subfase

(a) (b)

45

3.7. Microbalança a Cristal de Quartzo

A técnica da microbalança a cristal de quartzo (QCM) é uma técnica

nanogravimétrica utilizada para determinar a quantidade de monocamada que foi

transferida ao substrato sólido.

Consiste de um disco fino de quartzo, com filmes de ouro depositados em ambos os

lados, que servem como eletrodos, e que são conectados a um freqüencímetro (Figura 16).

Superficie de ouro

Conectores elétricos

Cristal de quartzo

Superficie de ouro

Conectores elétricos

Cristal de quartzo

Figura 16: Esquema de uma Microbalança a Cristal de Quartzo.

A freqüência fundamental do cristal depende da sua estrutura química, espessura,

formato, massa e também do tipo de corte do cristal. Sendo assim, a deposição de uma

determinada massa sobre esse cristal implicará em uma variação na freqüência fundamental

de ressonância deste, e através da relação dada pela equação de Sauerbrey (Sauerbrey,

1959), temos:

∆∆∆∆m = - ∆∆∆∆F Ac (2,26 . 10 6 Fo2) -1

46

Onde ∆m corresponde a massa depositada sobre o cristal, em nanogramas, ∆F a

variação de freqüência de oscilação do cristal, em Hz, Ac a área ativa do cristal,

compreendida entre os eletrodos e Fo é a freqüência fundamental do cristal.

Dessa forma, a técnica de QCM pode quantificar a massa depositada de filmes LB,

bem como estimar a quantidade de determinadas moléculas que possam adsorver

fisicamente a um filme LB já preparado, a partir de solução.

Nos experimentos realizados, o cristal utilizado continha as seguintes especificações:

Fnominal 10 MHz, área ativa, Ac, 0,662 cm2, fornecidos pela ICM, (International Crystal

Manufacturing, EUA). Os cristais foram montados em suporte apropriado e conectados a

um sistema de oscilação (mod. ICM, Lever Oscilators -10000 MHz EUA) e a um

freqüencímetro (mod. Lutron FC2700TCXO).

3.8. Dicroísmo Circular (CD)

Dicroísmo circular (CD) é uma técnica muito utilizada para estudos de moléculas

quirais. A técnica mede a diferença de absorção das componentes esquerda e destra da luz

elipticamente polarizada, por moléculas opticamente ativas. Isto ocorre quando um grupo

cromóforo faz parte de uma estrutura assimétrica, ou quando é imobilizado dentro de um

ambiente assimétrico (Schmid, 1990). Devido à disponibilidade de instrumentos de alta

precisão, CD se tornou a técnica mais empregada para medir a atividade óptica de

macromoléculas, principalmente proteínas, para diferenciar ou verificar a presença de

através das diferentes estruturas secundárias: α-hélice, β-folha, dobraβ e estruturas ao acaso

também denominadas não organizadas, ou desordenadas (Brahms e Brahms, 1980; Yang et

47

al., 1986). Além disso, esta técnica pode ser utilizada para monitorar perturbações na

estrutura de macromoléculas, por mudanças conformacionais causadas p.e. por variações

do meio ou temperatura ou quando estas interagem com outras moléculas. Dessa forma,

medidas de CD foram utilizadas na tentativa de se detectar modificações conformacionais

das carragenanas na presença de íons sódio e potássio em diferentes concentrações. Uma

vez que a macromolécula não absorve na região do visível, utilizou-se um corante, laranja

de acridina, para a realização dos experimentos. Os espectros foram registrados em um

espectropolarímetro JASCO, Laboratório do Prof. Dr. Richard J. Ward, DQ / FFCLRP /

USP.

3.9. Espectroscopia por Geração de Soma de Freqüências

A técnica de espectroscopia por geração de soma de freqüências (SFG) é baseada em

um fenômeno ótico não linear, isto é, envolve termos de ordem superior, no caso, de

segunda ordem, nas equações que relacionam a intensidade do sinal ótico gerado. Para a

técnica de SFG, dois lasers com freqüências (ω) nas regiões do visível e do infravermelho

se sobrepõem na interface e geram um sinal com freqüência ω SFG = ω VIS + ω IR. Este sinal

é proporcional ao quadrado da susceptibilidade de segunda ordem χ 2 (ω SFG = ω VIS + ω

IR). Sendo um processo de segunda ordem, é proibido em meios com centro de inversão,

mas permitido na interface, uma vez que a simetria de inversão é quebrada. Esta é a razão

pela qual o sinal de soma de freqüência é detectado apenas para moléculas na interface,

discriminando as espécies em solução, ou para sistemas anisotrópicos, que não possuem

centro de inversão, como é o caso de certas conformações de macromoléculas. Desta forma,

48

a estruturação de filmes LB, bem como o ordenamento da carragenana na interface, foram

estudados por meio de SFG.

Para os experimentos, utilizou-se um espectrofotômetro de SFG comercial (Ekspla,

Lituânia), para o qual um laser pulsado de Nd3+:YAG fornece um feixe fundamental em

1064 nm (28 ns de duração e freqüência de repetição de 20 Hz), e uma unidade harmônica

de geração de segundo e terceiro harmônicos fornecem feixes em 532 e 355 nm,

respectivamente. O primeiro, na região do visível, excita a amostra com um pulso de

energia de aproximadamente 950 µJ. Os feixes fundamental e terceiro harmônico por sua

vez, bombeiam um sistema ótico, gerando um feixe infravermelho sintonizável entre 1000 e

4000 cm-1, com energia de pulso entre 30-150 µJ. Este sinal, juntamente com o feixe visível

(532 nm) se sobrepõem, incidindo ambos sobre a amostra. Os ângulos de incidência e

diâmetros do feixes na amostra são, respectivamente, 51o, 500 µm and 60o, 1000 µm para

os feixes IV e visível, respectivamente. O sinal gerado de soma de freqüências, como uma

função da freqüência do feixe IV, é coletado por uma fotomultiplicadora, após passar por

filtros espaciais (polarização paralela ou perpendicular) e espectrais. Para cada varredura,

os dados são coletados com 100 pulsos para cada ponto amostral e em incrementos de

número de onda do feixe infravermelho de 3 cm-1. Os experimentos usando a técnica de

SFG foram realizados em colaboração com o Prof. Dr. Paulo Barbeitas Miranda do Grupo

de Polímeros do Instituto de Física de São Carlos-USP.

3.10. Reações de Modificação Química de Carragenanas

49

3.10.1 - Marcação da fração ιιιι-carragenana com sonda fluorescente.

A marcação da fração iota-carragenana com um composto fluorescente foi feita

seguindo o procedimento descrito por Tromp et al. (Tromp et al., 2001). Inicialmente, o

polissacarídeo foi convertido da forma de sal de sódio para a forma de um sal de

trietilamônio, de modo a aumentar sua solubilidade no solvente utilizado (DMSO). Para a

troca iônica, foram dissolvidos em 50mL de água (60oC), 0,75g de iota-carragenana sob

agitação. Após a dissolução, a solução do polímero foi dialisada contra uma solução 0,1 M

de cloreto de trietilamônio em pH 7,0 (3 x 75mL) e água Milli-Q (4 x 2L). Após a diálise

a solução foi liofilizada obtendo-se então a carragenana na forma desejada.

Numa segunda etapa, dissolveu-se 250 mg do polissacarídeo em 25 mL de DMSO,

aos quais foram acrescentados 350 mg de Fluoresceína Isotiocianato (FITC), 100µL de

piridina e 20 µL de dilaurato de dibutilestanho. A mistura reacional foi aquecida a 100ºC e

agitada durante 4 horas. Após este período o produto da reação foi precipitado com 100 mL

de álcool isopropílico e centrifugado por 45 minutos a 9600 rpm a 20ºC. O precipitado foi

então coletado e redissolvido em 50ml de água Milli-Q e dialisado contra uma solução de

NaCl 0,1M (3 x 2L), de modo a eliminar principalmente o excesso de FITC (não ligada),

purificando o composto e convertendo-o para sua forma sódio. A reação de ligação da

molécula de FITC à carragenana segue o esquema da Figura 17.

50

OHO OH

N

O

O

C

S

H

HO

45

6

7

..

OHO OH

NH

O

O

C

H

O

45

6

7

S

5-fluoresceína-isotiocianato

grupo hidroxila do polissacarídeo derivado acoplado

Figura 17: Esquema da reação de marcação por sonda fluorescente da fração iota-carragenana.

3.10.2 - Caracterização do Produto da Reação de Marcação por Sonda Fluorescente.

A caracterização do composto foi feita por análise espectroscópica na região do

infravermelho e UV-visível.

3.10.2.1 Espectroscopia de infravermelho

A fim de verificar a eficiência da marcação da carragenena, foram obtidos os

espectros na região do infravermelho da iota-carragenana, da iota-carragenana marcada e da

FITC, todos em pastilhas de KBr. Os espectros são mostrados na Figura 18.

51

2200 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 40030

35

40

45

50

55

60

65

SCN-

%

Tra

nsm

itân

cia

Número de Onda ( cm-1)

iota carragenana fluoresceína iota carragenana marcada

Figura 18: Espectros de infravermelho para ιιιι-carragenana marcada e seus precursores para

comparação.

É possível constatar na Figura 18 que as bandas da carragenana marcada estão, de

uma forma geral, deslocadas. As principais evidências da presença da fluoresceína no

produto purificado provêm do aparecimento das bandas em torno de 1100 cm-1 e de 585 cm-

1, ausentes no espectro da ι−carragenana. As bandas são atribuídas, respectivamente, as

vibrações dos grupos C-O-C dos anéis e do grupo SCN-, presentes no marcador. Uma prova

adicional do sucesso da incorporação é a diminuição da banda característica de OH, na

região entre 2000 e 2200 cm-1, devida a participação das hidroxilas nas reações com a

FTIC.

52

3.10.2.2 UV-visível

Análises de UV-visível de amostras de FITC com concentrações conhecidas foram

realizadas de modo a verificar também a marcação do composto. Os resultados das medidas

são mostrados na Figura 19.

200 400 6000.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

Abs

orbâ

ncia

comprimento de onda (nm)

1.10-5 M 5.10-5 M 7.10-5 M 1.10-4 M 2.10-4 M ι-FITC

Figura 19: Espectros de UV-visível para diferentes concentrações de FITC; e da ιιιι-carragena

marcada.

Pelos espectros, podemos verificar que a amostra de carragenana marcada apresenta

picos em (275nm e 278nm), comuns aos espectros das amostras de FITC, mas com um

deslocamento no pico de maior comprimento de onda devido à ligação da molécula de

FITC à iota carragenana.

53

4. Resultados e Discussão

4.1. Carragenanas e Tensoativos com Carga de Mesmo Sinal.

4.1.1 - Tensoativo Solúvel

A literatura não relata trabalhos envolvendo estudos de interação entre polieletrólitos

e tensoativos que apresentem carga de mesmo sinal . Entretanto, este estudo apresenta

relevância, por exemplo, no estudo de sistemas dispersos, como lipossomos, constituídos

por fosfolipídios e estabilizados por polieletrólitos aniônicos (Rigoletto, 2005).

Dessa forma, primeiramente, determinou-se a curva de tensão superficial versus

concentração do tensoativo aniônico dodecilsulfato de sódio (SDS), somente em presença

da fração iota-carragenana, a diferentes concentrações do polieletrólito (Figura 20).

-4.0 -3.5 -3.0 -2.5 -2.0 -1.5

35

40

45

50

55

60

65

70

75

tens

ão s

uper

ficia

l (m

N/m

)

[SDS]

SDS em:águaι-car 100 ppmι-car 250 ppmι-car 1000 ppm

Figura 20: Curvas de tensão superficial vs. concentração de SDS em presença de ιιιι-carragenana.

54

Através das curvas, podemos observar que a presença do polieletrólito nas

concentrações 100 e 250 ppm, pouco altera o valor de tensão superficial do tensoativo, e

que no caso da concentração mais elevada, 1000 ppm, a uma diferença passa a ser

observada.

Como forma de investigar a natureza do abaixamento observado, medidas de

viscosidade foram realizadas, e os valores obtidos foram plotados em função dos valores de

tensão superficial, e apresentaram o comportamento mostrado na Figura 21.

0.001 0.002 0.003 0.004 0.005

35

40

45

50

55

60

65

70

75

tens

ão s

uper

ficia

l (m

N/m

)

viscosidade (kg/m.s)

ι-car 100 ppm ι-car 250 ppm ι-car 1000 ppm

Figura 21: Tensão Superficial vs. viscosidade para soluções de SDS em presença de ιιιι-

carragenana.

A partir da Figura 21 podemos notar, para as menores concentrações de ι-

carragenana, que o aumento da concentração do tensoativo não altera o valor de

viscosidade do sistema, ao passo que para a concentração de 1000 ppm, observamos uma

55

dependência entre as duas propriedades, fato que provoca o “artefato” no comportamento

da tensão superficial observado na Figura 20. Neste caso, explica-se que a diminuição da

viscosidade com aumento da concentração do tensoativo ocorra pela quebra da estrutura

polimérica.

Posteriormente, foi investigada a adição de um sal ao sistema, com a finalidade de

verificar a influência deste no sistema com cargas de mesmo sinal.

Para este trabalho, adicionou-se acetato de zinco, tendo em vista a sua capacidade de

interação entre grupos fosfato. (Caseli, et al., 2002).

A curva de tensão superficial versus [SDS] foi determinada na presença do íon, uma

vez que sabe-se que a presença deste facilita o empacotamento do tensoativo na interface,

diminuindo o valor da CMC (Figura 22). Analisando-se as curvas desta Figura,

encontramos que o valor de CMC para SDS puro é de 8,7.10-3 mol L-1, de acordo com o

valor encontrado na literatura de 8,3.10-3 mol L-1 (Jönsson et al., 1999), e que a presença de

íons Zn2+ abaixa esse valor para 5,9.10-3 mol L-1.

56

-5.0 -4.5 -4.0 -3.5 -3.0 -2.5 -2.0 -1.5 -1.030

35

40

45

50

55

60

65

70

75

tens

ão s

uper

ficia

l (m

N/m

)

log [SDS]

SDS em : água Zn2+ 0,1 mM Zn2+ 0,1mM + ι-25 ppm

Figura 22: Curvas de tensão superficial vs. concentração de SDS em presença de ιιιι-carragenana e

Zn2+.

Posteriormente, verificamos o comportamento do sistema misto SDS/Zn2+/ι-

carragenana, conforme a Figura 22. Importante ressaltar que a concentração de ι-

carragenana para este caso foi, no mínimo, 10 vezes menor que na ausência de sal, sendo de

25 ppm de iota e de 0,1 mM de Zn2+. Mesmo a valores de concentração tão baixas do

polissacarídeo, podemos notar a influência deste, uma vez que a CMC do tensoativo teve

uma redução para 2,75 .10 -3 mol.L-1.

Sendo assim, de forma análoga ao mecanismo de formação de géis do polissacarídeo

(interação entre os grupos sulfato mediados por um cátion), o resultado indica que

possivelmente íons Zn2+ promoveram a interação entre os grupos com carga de mesmo

sinal.

57

Os dados representados na Figura 22 podem ser graficados em termos de uma

concentração efetiva, calculada tendo em vista os coeficientes de atividade para as espécies

iônicas presentes em solução (Fainerman, et al., 2001). Através desta análise, podemos

verificar se o comportamento observado se deve puramente a interações eletrostáticas. Para

tal, calculamos a atividade das isotermas, c*:

c* = f ±±±± (c DTAB + eletrólito . c DTAB)1/2

onde o coeficiente médio de atividade dos íons em solução f ± é dado pela equação de

Debye-Hückel, corrigida para interações de curto alcance

log f ±±±± = -[(0,5115 I1/2)/1 + 1,316 I 1/2 )] + 0,055 I

Quando esta análise é feita (Figura 23), conclui-se que o efeito deva ser praticamente

puramente eletrostático, mas não elimina a possibilidade dos íons zinco promoverem a

interação entre o grupo hidrofílico do tensoativo – carregado negativamente - e os grupos

sulfatados da carragenana, formando uma “ponte” entre essas duas espécies.

58

-4,0 -3,5 -3,0 -2,5 -2,0 -1,530

35

40

45

50

55

60

65

70

75

tens

ão s

uper

ficia

l (m

N/m

)

c*

SDS em água SDS em iota-car + ZnCl

2

Figura 23: Variação da tensão superficial com a concentração de SDS em água pura e na

presença de iota-car em termos da atividade c* .

4.1.2 - Tensoativo Insolúvel: Fosfolipídeo.

A interação na interface líquida entre o polissacarídeo negativamente carregado e uma

substância anfifílica com carga de mesmo sinal pode também ser verificada, de maneira

mais contundente, se a mesma permanecer apenas na interface. Nesse sentido, elegeu-se o

sal de sódio do ácido dihexadecilfosfórico (DHP), que também apresenta carga negativa.

Íons zinco foram mantidos para verificar agora a possibilidade de formação de pontes entre

os grupos fosfato do fosfolipídio e os grupos sulfato da carragenana.

As isotermas superficiais são apresentadas na Figura 24 para DHP sobre água pura,

sobre solução de Zn2+ e sobre solução contendo Zn2+ e ι-car 25 ppm.

59

30 40 50 60 70 80 90-10

0

10

20

30

40

50

60

70

pres

são

supe

rfic

ial (

mN

/m)

área por molécula (Å2)

água Zn 2+ 0,1 mM iota-car 25 ppm / Zn 2+ 0,1 mM

Figura 24: Isoterma superficial para DHP (▄

) sobre água pura, (▼) sobre solução aquosa de íons

Zn2+ 0,1 mM e (○) sobre solução contendo Zn2+ 0,1 mM e ιιιι-car 25 ppm.

Podemos observar que, enquanto Zn2+ provoca uma condensação da monocamada, a

adição de ι-carragenana provoca uma expansão da mesma, resultando em valores de Cs-1 de

884.6 e 487.5 mN.m-1, respectivamente. Ainda assim, a expansão observada na

monocamada não resulta em uma conclusão consistente com relação à interação do

polissacarídeo com a monocamada, uma vez que para este resultado observado, duas

hipóteses surgem: a primeira, de que a expansão se deva à repulsão eletrostática dos

fosfolipídios da monocamada, devido à presença da macromolécula carregada com mesmo

sinal, anulando o efeito de blindagem promovido pelos íons Zn2+; ou, a segunda

60

possibilidade, de que a carragenana possa estar interagindo efetivamente com a

monocamada, e por sua natureza polimérica, aumentando a área por molécula.

Duas metodologias foram então empregadas para o sistema, microscopia de

epifluorescência e filmes LB.

Para a microscopia de epifluorescência, a monocamada do fosfolipídio DHP foi

formada sobre uma solução de ι-carragenana, sendo que 1% em massa correspondia a ι-

FITC-carragenana marcada. A solução foi deixada em repouso por aproximadamente 30

minutos, e após esse intervalo a solução não apresentava nenhum domínio de fluorescência

para um valor de pressão superficial de 0 mN.m-1.

A monocamada foi então comprimida diminuindo a área disponível por molécula na

superfície, até a um valor de pressão superficial igual a 30 mN.m-1. Em nenhum momento

do processo de compressão da monocamada observou-se pontos de fluorescência,

indicando, portanto que não houve nenhuma interação entre as duas espécies.

Sendo assim, um novo experimento foi realizado, nas mesmas condições do anterior,

entretanto, com a adição de acetato de zinco 0,1 mM.

Logo após o espalhamento do fosfolipídio sobre a superfície, domínios circulares

foram observados, indicando a ocorrência de interação mediada pelos íons zinco (Figura

25(a)). A região clara da micrografia corresponde a regiões ricas no polissacarídeo,

enquanto que os domínios devem ser ricos em fosfolipídio. Na seqüência, a monocamada

foi comprimida, e em aproximadamente 30 mN.m-1, com a monocamada já bastante

condensada, os domínios anteriormente relatados desapareceram, passando a ser

completamente escura a observação da monocamada. Após um ciclo de compressão a

61

monocamada foi novamente expandida, e mais uma vez domínios escuros dispersos em um

campo claro, rico em ι-carragenana (Figura 25(b)), voltaram a ser observados.

(a)

(b)

(c) Figura 25: Micrografias de fluorescência (a) monocamada após ser espalhada sobre a interface

líquido-ar a pressão de 0mN.m-1 e (b) monocamada após um ciclo de compressão e expansão a 0mN.m-

1.

62

Diante dos resultados expostos, podemos concluir que, com a adição dos íons zinco, o

polissacarídeo pode interagir com a monocamada fosfolipídica, fato que resulta no

aparecimento de domínios, quando a monocamada está expandida. Já com a compactação

da monocamada, a diminuição da área disponível por molécula promoveu a expulsão da

macromolécula da interface, fato já observado para copolímeros tribloco e monocamadas

de DHP (Caseli, et al., 2001)

As monocamadas de DHP/Zn2+ foram então transferidas a um substrato sólido, onde

puderam ser quantificadas pela técnica da microbalança a cristal de quartzo (QCM). Na

metodologia utilizada três camadas do fosfolipídio mediadas por íons Zn2+ foram

transferidas, e para essas camadas detectou-se, uma massa de 187,9 + 1,1 ng por camada de

filme depositada.

Na quarta camada, a monocamada de DHP foi transferida durante a imersão do filme

a partir de uma subfase aquosa contendo íons zinco 0,1 mmol L-1 e ι-car 25 ppm. Nesse

caso a massa da quarta camada do filme seco resultou em 302,0 + 1,8 ng. O enxágüe desse

filme com água durante 30 minutos ocasionou uma perda de massa de 41,3 ng,

correspondente a quantidade de ι-car fracamente ligada à superfície.

Resultados anteriormente realizados em nosso laboratório (Rigoletto, 2005) indicaram

que carragenana interagiam com lipossomos, sendo que a estabilização ou desestabilização

dos lipossomos promovida pela presença do polissacarídeo eram dependentes da forma de

incorporação da molécula no sistema.

Οbservou-se que a fração ι-carragenana aumenta a estabilidade dos lipossomos

pequenos de DMPC/DMPA preparados por sonicação na presença do polissacarídeo ou

63

quando o mesmo é adicionado após o preparo da dispersão, sendo que em ambos os casos,

o tamanho médio é aumentado em relação à dispersão em água pura.

Dessa forma, pode-se concluir que um efeito eletro-estérico aliado a um efeito de

flexibilidade (associada ao módulo de compressiblidade) das vesículas pareçam ser as

causas mais prováveis para a estabilização das dispersões neste caso.

Sendo assim, associando os resultados previamente obtidos e comparando os

resultados de massa transferida, podemos comprovar a existência de interação entre os

grupos com carga elétrica de mesmo sinal, quando mediados por um íon.

4.2. Carragenanas e Tensoativos com Carga Oposta

4.2.1 - Tensoativos Solúveis

4.2.1.1 Influência da Densidade de Carga do Polieletrólito

Para situar o regime em que os dados cinéticos foram obtidos, as curvas de tensão

superficial de equilíbrio para DTAB puro e em presença das carragenanas são apresentadas

na Figura 26. A força iônica na presença de 10 mM do eletrólito variou entre 10,3 e 11,7

mM para a faixa de concentração do polissacarídeo utilizada nos experimentos.

Através da observação das curvas podemos notar os diferentes comportamentos em

função exclusivamente da densidade de carga do polieletrólito uma vez que a força iônica

gerada pela presença do sal garante que as espécies se apresentem na conformação ao

acaso. Entretanto, todas as frações carragenana promoveram o abaixamento sinergístico da

tensão superficial.

64

A partir da Figura 26 podemos fazer as seguintes observações: primeiramente, que

para as frações kappa-2 e iota, não é possível distinguir a concentração de formação de

micelas, em função da precipitação anterior a CMC. Além disso, observamos uma

dependência da tensão superficial com o tipo de carragenana, fato que se deve

provavelmente às diferentes densidades de carga do polieletrólito. Conforme maior a

densidade de carga, maior a quantidade de “pontos” de interação para o tensoativo na

macromolécula. Sendo assim, espera-se que a fração lambda forme complexos com maior

atividade superficial, pois pode, em média, interagir com ~ 3 moléculas de tensoativo por

dímero, enquanto que as outras duas, apenas 1,5 e 2 respectivamente.

-7 -6 -5 -4 -3 -2

35

40

45

50

55

60

65

70

75

tens

ão s

uper

ficia

l (m

N.m

-1)

log[DTAB]

DTAB em:água κ-2 carragenana 25 ppm ι-carragenana 25 ppm λ-carragenana 25 ppm

Figura 26: Tensão superficial vs. concentração de DTAB para diferentes frações carragenanas.

65

De modo a verificar a influência da concentração do polímero, medidas foram

realizadas para DTAB em diferentes concentrações de κ-2 carragenana (Figura 27).

-7 -6 -5 -4 -3 -235

40

45

50

55

60

65

70

75

tens

ão s

uper

ficia

l (m

N.m

-1)

log [DTAB]

DTAB em água em NaCl

κ-2 carragenana 25 ppm 100 ppm 250 ppm 500 ppm

Figura 27: Tensão superficial vs. concentração de DTAB para diferentes concentrações de κκκκ-2

carragenana.

Através da observação das curvas, podemos notar enquanto a concentração de 25 ppm

apresenta um comportamento ligeiramente distinto das demais, ao passo que variações

entre 100 e 500 ppm de κ-2 não são diferenciadas quanto ao efeito sobre a tensão

superficial do DTAB. Além disso, para estas concentrações, a CAC não é detectada até o

ponto que antecede a precipitação, correspondente à 0,7 mM de DTAB.

Registra-se na literatura (Tomasic, et al., 2002) que concentrações de carragenana (no

caso a fração iota) tão baixas quanto 10-7 %, causam modificações nas curvas de tensão

66

superficial de DTAB. Entretanto, os dados apresentados mostram uma dependência da

tensão superficial com a concentração do polímero, mesmo para uma faixa de concentração

da macromolécula entre 10-7 e 10-4 %. Além disso, para cada valor de concentração

trabalhado pelos autores, um comportamento foi observado, sendo que conforme o aumento

da concentração, mínimos na curva de tensão superficial foram observados durante o

patamar atribuído à CAC, indicando que nesta região, o complexo dessorveu. Se

associarmos esse resultado àqueles obtidos para tensoativos na presença de impurezas,

como por exemplo SDS na presença de álcool dodecílico, esse relutado pode ser

interpretado como uma adsorção conjunta de espécies tensoativas na região da CAC, que

dessorvem após a mesma ser atingida.

Conforme observado na Figura 26, as diferentes frações carragenanas já apresentam

comportamento bastante distinto, o que torna difícil a comparação dos resultados aqui

obtidos com os de Tomasic e colaboradores. Além disso, as faixas de concentração do

polímero trabalhada em cada caso também foram bastante distintas: enquanto os autores

variaram entre 10 -7% e 10-4% (correspondente a 0,001 a 1 ppm), a variação aqui utilizada

foi de apenas 25 a 500 ppm.

Sendo assim, podemos concluir que neste caso também observamos certa

dependência do comportamento da tensão superficial em função da concentração do

polímero, uma vez que podemos distinguir entre as concentrações de 25 ppm das demais.

Entretanto a não dependência para as concentrações mais elevadas provavelmente se deva

ao fato de que ele se encontra em excesso em todas as situações trabalhadas. Este

provavelmente também seja o motivo pelo qual apenas pequena diferença de

comportamento foi observada para a menor concentração utilizada neste trabalho.

67

A adsorção de unímeros em concentrações abaixo da CAC (concentração de

agregação crítica) é considerada como sendo principalmente devido a interações iônicas,

envolvendo uma troca do contra-íon do tensoativo pelo macro-íon (Goddard, 1986). A

compactação da interface formada pelo tensoativo catiônico na presença da carragenana

pode ser atribuída ao fato de que, com a formação do complexo tensoativo-polímero, a

repulsão entre os grupos catiônicos é reduzida pela interação desses com os grupos –OSO3-.

Entretanto a comparação dos efeitos da adição de NaCl (I=10 mM) e deste eletrólito

acrescido de κ-2 100 ppm (I= 10,3 mM) apontam para uma contribuição adicional ao efeito

de blindagem eletrostática que poderia ser atribuída i) a efeitos de hidratação diferenciada

da cabeça polar na presença do polissacarídeo, ii) à adsorção conjunta do tensoativo e de

um complexo tensoativo-carragenana ou ainda iii) a interações dispersivas devido ao efeito

hidrofóbico. Para esta última possibilidade, devem ser consideradas alterações nas

interações entre cadeias hidrocarbônicas dos tensoativos devido a mudanças de orientação e

empacotamento das cadeias, provocadas pela interação com o polieletrólito.

Os excessos superficiais de DTAB puro e na presença da macromolécula com a

adição de eletrólito (NaCl 10 mM) podem ser calculados a partir da isoterma de Gibbs:

ΓΓΓΓTS = - [(1/RT) (dγγγγ /dln[TS])

Calculando os coeficientes angulares das curvas obtêm-se os valores apresentados na

Tabela 3. Através dos resultados, observa uma tendência de aumento de Γ com a

concentração do polissacarídeo. Assim, parece ser mais razoável assumir um valor médio

de 0,79 nm2 para a área ocupada por molécula para as três maiores concentrações

68

estudadas. Este valor corresponde ao dobro daquele obtido para o tensoativo na ausência da

carragenana e, interessantemente, coincide com o valor médio encontrado para outro

sistema DTAB/polieletrólito (PAMPS-25) para o qual a concentração do polímero variou

entre 89 e 353 ppm (Asnacios et al., 2000)

Tabela 3: Valores de excesso superficial (ΓΓΓΓTS) e área média ocupada por molécula de DTAB

quando em solução de NaCl 10 mM, com a adição de κκκκ-2 carragenana, a 26+1 oC.

[κ-2] / ppm ΓTS (x10

18moléc/m2)

A (nm2/moléc.)

0 2,50+0,22 0,39

100 1,29+0,18 0.78

250 1,15+0,16 0,87

500 1,39+0.08 0,72

As características dos sistemas DTAB/ κ-2 carragenana e DTAB/PAMPS estão

resumidos na Tabela 3.

Características dos sistemas DTAB/κκκκ-II carragenana e DTAB/PAMPS-25 utilizado em Ritacco et al., 2003.

Macromolécula

Mw (g/mol)

N No. médio de

cargas/molécula

QTS /QPOL

* ([Pol] 100 ppm

κ-II 2 x 106 4490 6734 0,77 PAMPS-25

4 x 105 4000 1000 1,00

* cálculo feito para [DTAB] = 0,25 mM.

69

Sendo assim, percebe-se que independentemente das características da

macromolécula carregada negativamente presente no sistema misto DTAB/polieletrólito, o

valor ocupado por molécula do tensoativo na interface depende da razão entre cargas

polieletrólito/tensoativo.

O copolímero de acrilamida e acrilamida metilpropano sulfonato apresenta Mw de

4x105 g/mol, grau de polimerização N ~ 4000, dos quais 25% são negativamente

carregados, ou seja ~1000 cargas por macromolécula. A fração κ-2 apresenta uma massa

molar por unidade dissacarídica de 445,5 g/mol e Mw de 2 x106 g/mol, logo N ~ 4490.

Como a fração κ-2 apresenta em média 1,5 cargas por dissacarídeo, tem-se um valor médio

total de cargas por molécula de 675.

A concentração c* de viscosidade para κ-2 é em torno de 0,04% (Figura 28). Logo, na

faixa de concentração utilizada, o sistema encontra-se no regime diluído ou início do semi-

diluído, ou seja, não ocorre interação entre as cadeias do polissacarídeo para as menores

concentrações e em 500 ppm começa a haver interação entre elas.

70

0,1 1

1

10

100

1000

C**C*

região concentrada

região semi-diluída

região diluída

concentração (%m/v)

visc

osid

ade

rela

tiva

Pa

s

Figura 28: Variação da viscosidade relativa soluções de κκκκ-2-carragenana em NaCl 10 mmol.L-1 e

temperatura de 200C.

A força iônica devido à adição de eletrólito (NaCl 10 mM) é pelos menos 1,5 vezes

maior que aquela relativa apenas ao polieletrólito, garantindo, dessa forma, blindagem das

interações entre os grupos sulfatos, suficiente para que as moléculas de carragenana estejam

de fato na conformação de novelo-ao-acaso.

Se, por outro lado, a contribuição hidrofóbica fosse relevante na interação entre

carragenana e tensoativo catiônico, deveriam ser observadas diferenças nas interações entre

tensoativos que apresentem a mesma cabeça polar, mas com diferentes comprimentos de

cadeia hidrofóbica.

71

Dessa forma, investigou-se a interação da fração κ-2 carragenana com CnTAB (n=12

e 16). Os dados de tensão superficial vs. concentração de tensoativo se encontram na Figura

29.

-7 -6 -5 -4 -3 -2

35

40

45

50

55

60

65

70

75

tens

ão s

uper

ficia

l (m

N.m

-1)

log[tensoativo]

DTAB: em água κ-2 carragenana 500 ppm

CTAB:em águaκ-2 carragenana 500 ppm

Figura 29: Efeito do comprimento da cadeia hidrofóbica nas variações de tensão superficial. O

limite superior de concentração dos tensoativos na presença da carragenana é dependente da

solubilidade do sistema misto

Os dados apresentados na Figura 29 mostram que a curva de tensão superficial para o

tensoativo com cadeia hidrofóbica mais longa, CTAB, é menos afetada pela adição de

carragenana que aquela relativa ao tensoativo com cadeia menos hidrofóbica, DTAB. Para

quantificar essa diferença escolheu-se arbitrariamente um mesmo valor de tensão

superficial (no caso 60 mN.m-1) para o qual fosse possível obter os valores das

72

concentrações dos tensoativos, na presença e ausência de κ-2, necessárias para abaixar o

valor da tensão superficial até aquele valor estipulado. O resultado está resumido na Tabela

4, onde também são apresentadas as tangentes, -dγ / d log[TS], que são proporcionais ao

excesso superficial do tensoativo em cada caso.

Tabela 4: Valores de concentração para DTAB e CTAB correspondentes ao valor de 60mN.m-

1 nas respectivas curvas de tensão superficial. Valores dos coeficientes angulares da parte linear do

gráfico.

DTAB

[TS](mM) tg

(mN.m-1)

CTAB

[TS](mM) tg

(mN.m-1)

água pura 1.1

2

24,99 0.1

82

24.93

+ κ-2 500

ppm

1.7

8x10-2

21,25 1.0

5x10-2

11.48

Razão:

[TS]A/[TS

]POL

62,9 17,3

Contrário ao que ocorre com tensoativos iônicos na presença de eletrólitos simples, as

inclinações das curvas antes da CMC diminuem na presença do polissacarídeo para ambos

os tensoativos catiônicos, sendo a diminuição mais pronunciada para CTAB. Este resultado

indica que a adsorção do tensoativo diminui na presença do polieletrólito. Porém, como a

tensão superficial cai a 60 mN.m-1 com uma concentração do tensoativo inferior àquela em

73

água pura, então o complexo formado entre tensoativo-polieletrólito deve apresentar

natureza mais hidrofóbica que o próprio tensoativo ou tem-se um efeito de orientação das

cadeias hidrocarbônicas na presença do polieletrólito que difere daquela para o tensoativo

puro.

A ligação do tensoativo à carragenana depende da solubilidade do próprio tensoativo.

Assim, CTAB, que apresenta menor solubilidade, deve apresentar uma menor

probabilidade de ligar-se à carragenana. O complexo polieletrólito-tensoativo formado

nestas condições de concentração seria equivalente a introduzir uma cauda hidrofóbica em

algumas das macromoléculas presentes em solução. O excesso superficial do complexo

deve ser diferente nos dois casos, com CTAB e com DTAB. Naturalmente o polieletrólito

também deve contribuir para a blindagem da repulsão entre as cargas positivas das

moléculas do tensoativo presentes na interface, mas este não é o efeito preponderante.

DTAB, sendo bem mais solúvel, quando puro, apresenta uma CMC mais elevada. A

interação eletrostática entre DTAB e κ-2 forma espécies bem mais hidrofóbicas que

diminuem, em maior proporção, a tensão superficial da solução mista, quando comparada

àquela de DTAB puro. Se a formação do complexo TS-POL ocorrer no interior da solução

e depender da razão entre cargas QTS/QPOL, então as cinéticas de adsorção para o sistema

misto também devem depender desse parâmetro.

4.2.1.2 Formação de Complexos Tensoativo-Polieletrólito

Conforme já descrito na Introdução desta Tese, bem como observado na Figura 25, a

adição do polieletrólito promove um abaixamento sinergístico da tensão superficial com

74

relação ao tensoativo puro. Desta forma, o objetivo desta etapa foi verificar a formação

destes complexos em baixas concentrações do tensoativo, através de Microscopia no

Ângulo de Brewster. Estes experimentos foram realizados em colaboração com o Prof. Dr.

Osvaldo Novais de Oliveira Jr. no Grupo de Polímeros do Instituto de Física de ao Carlos-

USP.

A Figura 30 mostra a curva de tensão superficial vs. concentração para DTAB em

água e em presença de sal e iota-carragenana. O valor de concentração escolhido para as

imagens de BAM foi de 5,0 x 10 -6 mol.L-1.

-7 -6 -5 -4 -3 -235

40

45

50

55

60

65

70

75

tens

ão s

uper

ficia

l (m

N.m

-1)

log [DTAB]

Figura 30: Curva de tensão superficial para DTAB em água(○) e em NaCl / ιιιι-carragenana 25

ppm(■).

Conforme observado pelas micrografias (Figura 31), o tensoativo puro em água não

promove alterações na intensidade de luz incidida, gerando uma imagem completamente

75

escura, indicando que não ocorre variação de índice de refração ou modificação da

espessura desta monocamada, ao qual atribuímos a não adsorção da espécie na interface

líquido-ar, fato que pode ser comprovado pela Figura 30.

(a) (b) (c)

Figura 31: Micrografias de BAM para (a) DTAB em água, (b) DTAB em i-car em 10 min (c)

DTAB em i-car em 30 min

Com a adição do polieletrólito, notamos duas significativas diferenciações nas

micrografias: a alteração da intensidade de luminosidade, bem como a formação de

agregados, que parecem se intensificar em função do tempo.

A Figura 32 mostra o comportamento da elasticidade superficial dilatacional do

sistema misto em função da concentração do tensoativo. Através desta Figura, notamos que

o sistema se comporta de modo a aumentar o valor de elasticidade até que atinge um

máximo e decai.

76

-7,0 -6,5 -6,0 -5,5 -5,0 -4,5 -4,00

10

20

30

40

50

elas

ticid

ade

supe

rfic

ial (

mN

.m-1)

log [DTAB]

Figura 32: Curva de elasticidade superficial para DTAB em NaCl e ιιιι-carragenana 25 ppm.

Diante dos resultados, podemos definitivamente atribuir o abaixamento sinergístico

da tensão superficial a baixas concentrações de DTAB a formação destes complexos

tensoativo-polieletrólito na interface, uma vez que agregados podem ser observados,

resultado que está em conformidade com os de Ritacco et al. (Ritacco et al., 2003). Além

disso, fator determinante para esta conclusão se dá pela curva de elasticidade, uma vez que

a monocamada do tensoativo puro apresenta elasticidade nula neste valor de freqüência.

77

4.2.1.3 Influência da Razão entre cargas do Tensoativo e do Polieletrólito

(QTS/QPOL)

4.2.1.3.1 Cinética de Adsorção a Tempos Curtos

A influência da razão entre as cargas do polieletrólito e do tensoativo foi verificada,

primeiramente, através de cinéticas de adsorção em tempos da ordem de 15 segundos.

Foram estudadas as frações κ, κ-2 e λ-carragenana, que apresentam em média,

respectivamente, 1; 1,5; e 2,7 grupos sulfato por dímero. As curvas (Figura 33) foram

obtidas para uma mesma concentração do polieletrólito (25 ppm), e na presença de NaCl 10

mM, variando-se a concentração de DTAB, de modo a alterar a razão entre as cargas.

0 2 4 6 8 10 12 14 16

70.0

70.5

71.0

71.5

72.0

72.5

tens

ão s

uper

ficia

l (m

N/m

)

tempo (s)

k-I carragenana 25 ppm /NaCl 10 mM DTAB 1.0 . 10-5 M Q

TS/POL=1,16

DTAB 5.0 . 10-5 M QTS/POL

=4,08

DTAB 1.0 . 10-4 M QTS/POL

=12,1

(a)

78

0 5 10 15

55

60

65

70

75

ten

são

sup

erf

icia

l (m

N/m

)

tempo (s)

k-II carragenana 25 ppm + NaCl 10 mM DTAB 5,0 x 10 -5M Qts/Qpol=0,61DTAB 2,5 x 10 -4M Qts/Qpol= 3,06DTAB 5,0 x 10 -4M Qts/Qpol= 6,13DTAB 7,5 x 10 -4M Qts/Qpol= 9,07

(b)

(c)

1 10

68

70

72

74

CDTAB

(mol L-1) C*

1.0 10-5 2.9 10-4 7.5 10-5 8.0 10-4

1.0 10-4 9.0 10-4

Su

rface T

en

sio

n (

mN

m-1)

Time (s)

QTS/POL

0.09 0.67 0.90

Ten

são

Sup

erfic

ial (

mN

/m)

Tempo (s)

79

(d)

Figura 33: Cinéticas de adsorção de DTAB na presença de diferentes frações carragenana 25

ppm e NaCl 10mM (a) κκκκ-carragenana, (b) κκκκ 2 -carragenana, (c) e (d) λλλλ-carragenana. As concentrações

de DTAB são variáveis e determinam a razão entre cargas QTS/QPOL.

Analisando as curvas da Figura 33, verifica-se que, de uma maneira geral, o sistema

se comporta de duas formas distintas, de acordo com a razão entre cargas QTS/QPOL.

Para QTS/QPOL < 1, temos que a quantidade de cargas do polieletrólito é maior que

aquela do tensoativo. Quando o sistema se encontra nesse regime, observa-se que

aparentemente existe um tempo de indução, durante o qual a tensão superficial varia muito

pouco ou não varia, para somente depois decair, na maior parte dos casos de forma

exponencial, fato que parece ser mais evidente para o sistema DTAB-λ −carragenana

(Figura 33 (c)). Pode-se então supor que apenas uma espécie esteja sendo adsorvida nesse

regime de razão entre cargas, e que provavelmente este complexo esteja sendo formado em

solução.

0 2 4 6 8 10 12 14 16

69

70

71

72

73

Su

rface T

en

sio

n (

mN

m-1)

Time (s)

Ten

são

Supe

rfic

ial (

mN

/m)

Tempo (s)

80

Quando o sistema se encontra em um regime caracterizado por QTS/QPOL >1, tem-se

então uma predominância de cargas positivas do tensoativo sobre as cargas do

polieletrólito. Observa-se, nesse caso, que as curvas indicam uma adsorção ocorrendo em

duas etapas: inicialmente, a tensão superficial atinge um mínimo e aumenta abruptamente,

para em seguida decair suavemente.

Pode-se atribuir esse resultado à adsorção de duas espécies, uma delas sendo o

tensoativo em excesso a eletroneutralidade. O tensoativo em excesso, não interagindo com

o polieletrólito, adsorve rapidamente na interface, mas acaba sendo retardado pela presença

do contra-íon polivalente em solução, uma vez que a adsorção do tensoativo puro ocorre

em intervalos de tempo menores que o observado. Dessa forma, o mínimo observado na

curva refere-se à adsorção dessa primeira espécie.

Posterior à adsorção do tensoativo livre, sugere-se a adsorção do complexo

tensoativo-polímero, mais lento, por apresentar uma difusão menor devido ao seu elevado

tamanho. Dessa forma, o aumento no valor de tensão superficial refere-se à adsorção dessa

espécie, e posterior a essa etapa, o sistema caminha para atingir do equilíbrio de adsorção-

dessorção, chegando então ao valor de tensão superficial de equilíbrio.

Para a fração κ-1-car (Figura 33 (a)), todas as curvas apresentadas, se encontram na

condição de QTS/QPOL > 1. Para as duas primeiras concentrações, observamos o mínimo na

curva de cinética de adsorção, conforme discutido anteriormente. Entretanto, podemos

notar dois pontos importantes: o primeiro se refere aos dois primeiros valores de

concentração, em que observamos grande diferença com relação ao estabelecimento do

valor de tensão superficial. O segundo ponto é o fato de que, com o aumento da

81

concentração do tensoativo, para valores acima de 1,0. 10-4 M, terceira curva, passamos a

não mais observar o mínimo na curva.

Provavelmente, a explicação para as observações seja o fato de que com o aumento da

concentração, uma quantidade maior de tensoativo livre esteja presente, fazendo com que

sua adsorção seja mais rápida na interface, impossibilitando, na escala de tempo em que o

experimento foi realizado, sua determinação.

Ritacco et al. (Ritacco et al., 2003) realizaram experimentos de tensão superficial

dinâmica pelo método de pressão máxima da bolha para o sistema PAMPS 25 e DTAB em

intervalos de tempo de 40 segundos, e com precisão de 0,05 segundos. Para situações acima

do ponto de equivalência de cargas, a curva apresentava duas regiões, separadas por um

patamar. Entretanto, os autores não chegaram a um consenso que justificasse esse patamar

observado, inclusive desconsiderando-o em cálculos posteriores.

Para a fração k-2, observamos que o mínimo nas curvas se torna mais pronunciado

com o do aumento da concentração do tensoativo e de QTS/QPOL, o que reafirma a

proposição de que a adsorção nesse regime ocorra em duas etapas, sendo a primeira delas

correspondente ao tensoativo em excesso. Além disso, podemos notar claramente na Figura

33 (b) (fração κ-2) que a etapa correspondente à dessorção do tensoativo puro para

posterior adsorção do complexo se torna mais lenta com o aumento da concentração do

tensoativo, ou aumento da razão de cargas QTS/QPOL, ao passo que para a Figura 33 (a),

correspondente à adsorção da fração κ-1, esse efeito parece ser contrário.

Dessa forma, podemos concluir que duas propriedades parecem influenciar esse

comportamento: a densidade de cargas do polímero e a própria razão de cargas do sistema,

sendo que ambos podem afetar as propriedades do complexo formado, como difusão e

82

conformação do mesmo, fato que poderia explicar a diferença entre os comportamentos

observados.

As Figuras 34 e 35 apresentam as cinéticas de adsorção para o sistema DTAB/

λ−carragenana na presença de NaCl 10 mM, sendo que a primeira curva se encontra com

QTS/QPOL menor que 1, e segunda, maior que 1.

0 2 4 6 8 10 12 14 1672,45

72,60

72,75

72,90

73,05λ- carragenana 2,5 x 10 -3%NaCl 10 mM DTAB 1,0 x 10 -5MQ

TS/Q

POL= 0,09

tens

ão s

uper

ficia

l (m

N.m

-1)

tempo (s)

Figura 34: Cinética de Adsorção para sistema λλλλ-car com QTS/QPOL = 0,09.

83

0 2 4 6 8 10 12 14 16

69,5

70,0

70,5

71,0

71,5

72,0

72,5

73,0

tens

ão s

uper

ficia

l (m

N.m

-1)

tempo (s)

λ- carragenana 2,5 x 10 -3%NaCl 10 mM DTAB 2,5 x 10 -4MQ

TS/Q

POL= 2,27

Figura 35: Cinética de Adsorção para sistema com QTS/QPOL = 2,27.

Interessante notar, para os dados brutos, que com o aumento do valor da concentração

do tensoativo, as curvas passam a apresentar menor ruído ou “oscilação”. Sugere-se

“oscilação” principalmente pela observação da Figura 34 que apesar de ter sido ajustada a

uma sigmóide é aparente a existência de um período amortecido com picos ao redor de 3 e

11 s.

À medida que a concentração do tensoativo é aumentada, aumenta-se também a

adsorção superficial. A partir da curva de tensão superficial de equilíbrio verifica-se que a

presença do polieletrólito, mesmo não apresentando atividade superficial, é capaz de

modificar a interface. Dessa forma, a diminuição do ruído pode ser um indício adicional de

que o polieletrólito se encontre na vizinhança dessa interface, interagindo e orientando a

84

camada de tensoativo adsorvida, o que provocaria uma menor mobilidade dessas moléculas

na interface, diminuindo assim a oscilação nas medidas.

4.2.1.3.2 Elasticidade Superficial

Estes efeitos cinéticos podem influenciar as propriedades reológicas da interface e

apontam para uma possibilidade de se obter sistemas com elasticidade superficiais

diferentes, pelo ajuste da razão entre cargas do tensoativo e da macromolécula.

Para testar essa hipótese, medidas de elasticidade dilatacional superficial foram

realizadas para a fração λ-carragenana, que foi escolhida devido à sua elevada densidade

superficial de carga, comparada às outras frações, fato que permitiu uma maior faixa de

variação do tensoativo catiônico, sem que ocorresse precipitação.

A freqüência de perturbação aplicada neste trabalho foi de 1,5 Hz, pelo fato de que

neste valor, já obtemos o sistema independente da freqüência (Figura 36), conforme

explicado anteriormente, permitindo negligenciar efeitos de difusão.

85

0,0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5

25

30

35

40

45

50

55

60

65

E (

mN

.m-1)

frequência (Hz)

Figura 36: Elasticidade dilatacional em função da freqüência.

Dessa forma, foram realizadas as medidas de elasticidade superficial dilatacional para

o sistema com diferentes razões de carga QTS/QPOL, conforme mostrado na Figura 37. A

curva de tensão superficial vs. concentração de DTAB para o sistema contendo λ-

carragenana é novamente mostrada para que possamos localizar na curva e compará-los aos

resultados obtidos de elasticidade.

86

-5,0 -4,5 -4,0 -3,5 -3,0 -2,5 -2,0 -1,5

35

40

45

50

55

60

65

70

75

tens

ão s

uper

ficia

l (m

N.m

-1)

log[DTAB]

(a)

-5,0 -4,5 -4,0 -3,5

0

10

20

30

40

50

60

70

Ela

stic

idad

e S

uper

ficia

l (m

N.m

-1)

log [DTAB]

(b) Figura 37: Caracterização da interface líquido-ar de soluções de DTAB na presença de λλλλ-

carragenana 25 ppm e NaCl 10 mM: (a) Variação da elasticidade superficial (b) Curva de Tensão

superficial (○) em água e (▄) em subfase de λλλλ-car.

87

Através da observação da curva, podemos notar que o sistema atinge seu máximo

valor de elasticidade coincidente com a concentração de DTAB mais próxima do ponto de

eletroneutralidade das cargas. Além disso, o ponto de equivalência entre as cargas coincide

com o aparecimento do patamar na curva de tensão superficial de equilíbrio do sistema,

designada como sendo a CAC.

Já para valores logo acima desse ponto, QTS/QPOL> 1, a elasticidade cai

abruptamente.

Para este sistema, também foram realizados os cálculos em função da concentração

efetiva c*, apresentado na Figura 38.

1E-6 1E-5 1E-4 1E-3 0.01

40

50

60

70

(B)

CMC

CMC'

CAC

Su

rface T

en

sio

n (

mN

m-1)

C*

Figura 38: Curva de tensão superficial vs. C* para DTAB em: água (����),NaCl 10 mmol L-1 (●), λλλλ-

carragenana 25 ppm e NaCl 10 mmol L-1 (▼), pelo método da gota pendente e (▲), pelo método do anel

de Du Nöuy. As setas indicam a CAC, CMC para DTAB em água e na presença de carragenana (CMC

‘).

Neste caso, podemos notar que, enquanto a isoterma para DTAB em água, e para

DTAB na presença de NaCl são praticamente coincidentes, um considerável desvio deste

Ten

são

Sup

erfic

ial (

mN

.m-1

)

88

comportamento é observado para o sistema na presença do polissacarídeo. Desta forma, a

correção das atividades iônicas não justifica o deslocamento observado na curva de DTAB-

λ-carragenana.

Como dito anteriormente, muitos autores apresentam diferentes significados físicos

para a CAC, concentração de agregação crítica, uma vez que muitos tratam desta como

sendo a concentração em que moléculas do tensoativo passam a interagir com o

polieletrólito, ao passo que outros tratam dessa concentração como sendo a interação entre

micelas do tensoativo e o polímero.

O fato comum é que estas interações, que antes ocorriam na interface, passam agora a

ocorrer em solução, fato inclusive bastante noticiado por pesquisadores que utilizam a

técnica de refletividade de nêutrons e elipsometria para avaliar a espessura de

monocamadas, conforme discutido na Introdução desta Tese.

Sendo assim, considerando que os complexos tensoativo-polieletrólito são formados

em solução apenas após a CAC, a diminuição na tensão superficial e aumento na

elasticidade dilatacional superficial gradativo, indicam que a presença do polieletrólito

promova diferente empacotamento superficial e orientação das caudas hidrofóbicas do

tensoativo na interface, comparado ao efeito provocado pela adição de eletrólitos pequenos,

representando um efeito adicional às interações coulômbicas.

Além disso, a concentração de saturação de ligação representa um limite para a

elasticidade superficial, indicando uma preferência de interação entre a macromolécula e o

tensoativo no interior da solução em detrimento às interações na interface, e que o aumento

da elasticidade superficial, que é nula para o tensoativo puro, na faixa de freqüência

trabalhada, é devido à presença da macromolécula na interface.

89

Resultados prévios obtidos em nosso laboratório mostraram que a elasticidade

superficial atinge um valor máximo na CAC, para sistemas mistos contendo tensoativos

não-iônicos na presença de proteínas (Caseli et al., 2005).

Dessa forma, podemos concluir que a razão entre cargas deva estar relacionada com a

CAC para este sistema, mas que esta não seja a principal razão para os resultados

observados de variação da elasticidade superficial com a concentração do surfactante.

A diferença de fase, descrita pelo ângulo θ, entre a deformação e a resposta do

sistema, fornece informação sobre a viscoelasticidade do sistema. A Figura 39 mostra o

distúrbio senoidal com freqüência de 1,5 Hz aplicado à gota de solução de DTAB/λ-car

para a qual a razão entre as cargas QTS/QPOL ~1, condição na qual o sistema apresentou

elasticidade superficial máxima.

90

0 1 2 3 4 5

14

15

16

17

18

19

área

da

gota

(m

m2 )

tempo (s)

Figura 39: Deformação aplicada à gota formada com solução aquosa de DTAB 0,1mM, contendo

λλλλ-car 25 ppm e NaCl 10 mM.

Além disso, a Figura 40 apresenta a superposição do distúrbio e a correspondente

resposta do sistema para um período completo, indicando o ângulo de fase φ. Para este

caso, φ foi igual a 2,09, mostrando que o sistema se comporta quase como perfeitamente

elástico, ou ainda que o ângulo pequeno, porém detectável , possa estar associado com

mudanças irreversíveis de conformação do macro-íon com a presença do surfactante na

camada adsorvida após a dilatação da mesma. Os resultados descritos nesta etapa

encontram-se relatados em Nobre et al. (Nobre et al., 2007).

91

0 50 100 150 200 250 300 350 400

32,5

35,0

50

55

área

da

gota

(m

m2 )

te

nsão

sup

erfic

ial (

mN

.m-1)

ângulo ( o )

Figura 40: Superposição dos sinais de distúrbio (área da gota) e resposta do sistema (tensão

superficial) para as mesmas condições da Figura 37.

4.2.2 - Tensoativo Insolúvel: DODAB

No caso dos experimentos acima relatados, a substância tensoativa está distribuída

entre o interior da solução e a interface. Estudando substâncias anfifílicas insolúveis

simplifica-se o sistema uma vez que a interação com o polieletrólito somente ocorre na

interface.

Com isto em mente, foram realizados experimentos com um tensoativo insolúvel

também positivamente carregado, DODAB (brometo de dioctadecil dimetil amônio). Neste

caso, diferentemente do fosfolipídio DHP, que fora espalhado sobre uma subfase aquosa

92

em uma cuba de Langmuir, DODAB dissolvido em clorofórmio foi espalhado sobre uma

gota formada com a solução da carragenana. Após a evaporação do solvente a gota foi

comprimida e as medidas tiveram início com a expansão da gota.

Desta forma o equilíbrio não deve ser influenciado pela difusão da substância

anfifílica a partir do interior da solução, mas dependente dos processos de espalhamento e

orientação do lipídio na superfície recém-criada, e de sua interação com o polissacarídeo de

carga oposta nas vizinhanças da interface. Assim, isola-se o processo de formação de

complexos no interior da solução e, também a adsorção/dessorção do mesmo.

Uma curva sem a presença de mínimos é observada (Figura 41) no caso do

espalhamento de DODAB sobre solução da κ-2 carragenana. Pode-se constatar que a

presença da macromolécula altera o valor da pressão superficial inicial, provavelmente

devido à adsorção ou modificação da orientação destes lipídios na interface. Como neste

caso não se tem efeito de difusão de possíveis complexos polímero/tensoativo formados no

interior da solução, sugere-se que a adsorção ocorra devido à mudança de orientação da

macromolécula na vizinhança da interface, influenciando no empacotamento do tensoativo.

Este deve ser também o efeito dominante na cinética de adsorção do tensoativo solúvel na

presença da carragenana em tempos maiores que 2 segundos.

93

0 50 100 150 200 250 300

67,0

67,5

68,0

68,5

69,0

69,5

70,0

tens

ão s

uper

ficia

l (m

N.m

-1)

tempo (s)

Figura 41: Cinética de Adsorção de k-2 carragenana 25 ppm/NaCl 10 mM em monocamada de

DODAB.

Com base nesses resultados, podemos concluir que provavelmente a etapa limitante

para a adsorção do complexo formado pelo tensoativo solúvel seja a difusão deste no

interior da solução para a interface, o que se deve à estrutura desse complexo. No caso do

experimento realizado com o fosfolipídio, se compararmos o tempo que o sistema tardou

para atingir o equilíbrio, podemos notar que foi muito mais rápido em comparação ao

sistema contendo DTAB.

Dessa forma, a hipótese que surge é a de que a insolubilidade do tensoativo obriga

que a formação do complexo ocorra na interface, eliminado a etapa difusiva deste.

94

4.2.2.1 Influência do tipo de eletrólito

Como descrito anteriormente, sabe-se que um dos fatores que influenciam a

conformação do polissacarídeo é o tipo e a concentração do eletrólito adicionado ao

sistema. Dessa forma, estudou-se a influência da adição de KCl e NaCl nos valores de

tensão superficial e elasticidade dilatacional superficial de DTAB na presença de κ-2

carragenana.

4.2.2.1.1 Tensão Superficial de Equilíbrio

A Figura 42 mostra as curvas de tensão superficial em função da concentração de

DTAB e κ-2 carragenana na presença dos diferentes eletrólitos.

95

-5,4 -5,1 -4,8 -4,5 -4,2 -3,9 -3,640

45

50

55

60

65

70

tens

ão s

uper

ficia

l (m

N.m

-1)

log [DTAB]

κ-2 carragenana 25 ppm em:KCl 10 mM NaCl 10 mM

Figura 42: Tensão Superficial de DTAB em presença de k-2 carragenana 25 ppm em diferentes

condições salinas.

Pela observação da Figura, podemos notar que na presença de KCl a tensão

superficial de DTAB/κ-2 car (25 ppm) cai mais acentuadamente comparado ao sistema em

meio de NaCl. Além disso, ambas tendem a um patamar, que na presença de NaCl ocorre

em aproximadamente em 51 mN.m-1 a 0,076 mM de DTAB, ao passo que em KCl ocorre

aproximadamente em 46 mN.m-1a 0,055 mM do tensoativo. Como em ambos os casos a

força iônica é a mesma, essa diferença deve ser atribuída ao tipo de contra-íon.

A especificidade de carragenanas frente a diferentes contra-íons refere-se ao processo

de formação de gel. Desta forma, pode-se propor que o eletrólito produza ou uma indução

de mudança de conformação da macromolécula (de novelo-ao-acaso para hélice), ou ainda

96

que o efeito da formação de gel possa ser simplesmente devido a uma diferença de

afinidade ou constante de ligação do contra-íon pelo polieletrólito.

Sabe-se que o íon potássio é específico para a fração κ-car. Como κ2-car é uma

espécie híbrida, que tem em sua composição 50% de kappa, esta deve de maneira análoga

ser afetada por esse íon.

Snoeren e Payens (Snoeren e Payens, 1976) verificaram, através de medidas de

rotação ótica e espalhamento de luz que para uma concentração de κ-car 1000 ppm, na

presença de Na+, a macromolécula se encontra na conformação novelo-ao-acaso, ao passo

que em 30 mM de K+, a molécula adquire conformação hélice.

Entretanto, não existem dados na literatura que comprovem a conformação em que a

carragenana se encontra quando em concentrações tão baixas, com a macromolécula no

regime diluído, como na concentração em que o trabalho foi realizado. Dessa forma,

medidas de dicroísmo circular foram realizadas, usando-se como sonda o corante laranja de

acridina (Figura 43).

97

350 400 450 500 550 600

-2

-1

0

1

2

elip

ticid

ade

(mde

g)

comprimento de onda (nm)

AO-k-2 carragenana-K+

AO-k-2 carragenana-Na+

AO-k-2 carragenana-água

Figura 43: Espectros de Dicroísmo Circular para k-2-car 25 ppm/laranja de acridina em água,

Na+ e K+ 10 mM.

Pela observação dos espectros, podemos notar que, enquanto a curva para o corante e

a carragenana se apresenta muito semelhante a do sistema em meio de Na+, a variação em

meio de íons K+ é bastante significativa, indicando que este induza a uma diferente

conformação da macromolécula.

Ciszkowska e Osteryoung (Ciszkowska e Osteryoung, 1998), através de dados

obtidos por difração de raios-X, mostraram que a distância de separação entre as cargas, b,

para κ−car é da ordem de 0,43 nm para a forma hélice, e de 0,75 nm para a forma novelo-

ao-acaso. Kvam e Grasdalen (Kvam e Grasdalen, 1989) mostraram que a distribuição de

cargas na molécula de κ-2 carragenana é diferente na presença destes dois íons. Além disso,

Takemasa e Nishinari (Takemasa e Nishinari, 2004) mostraram que a condutividade

98

elétrica diminuía consideravelmente abaixo da temperatura de transição novelo-ao-

acaso/hélice, quando uma macromolécula se encontra na conformação hélice. O resultado

foi interpretado como sendo um aumento da interação do contra-íon com o polieletrólito na

conformação hélice, como conseqüência do aumento na densidade linear de cargas da

macromolécula nessa conformação, quando comparado ao estado novelo-ao-acaso.

Analogamente às situações citadas, os resultados aqui apresentados mostram que a

carragenana na forma hélice, com uma menor distância de separação e maior densidade

linear de cargas, deve possibilitar que uma maior quantidade de íons DTA+ interaja com a

macromolécula. Outro fator que também pode contribuir com o resultado obtido, é o

entrópico, uma vez que para a macromolécula que se encontra na conformação novelo-ao-

acaso (presença de NaCl), a interação com íons DTA+ deve ser mais desfavorável, uma vez

que a mesma implica em uma maior perda de graus de liberdade quando comparada à

interação da forma hélice. Dessa forma, tanto densidade de carga como fatores entrópicos

contribuem para que o sistema contendo DTAB e κ2-car apresente uma maior atividade

superficial na presença de KCl.

As curvas de γeq na presença dos dois eletrólitos são praticamente paralelas, exceto a

concentrações abaixo de 0,01 mM de DTAB. Isto implica que os módulos de elasticidade

de equilíbrio devam ser bastante próximos. Porém, os valores dinâmicos podem ser

influenciados de maneira distinta.

99

4.2.2.1.2 Elasticidade Dilatacional Superficial (εεεε)

A Figura 44 mostra os valores de elasticidade dilatacional superficial para os sistemas

em Na+ e K+.

-5,2 -4,8 -4,4 -4,0 -3,6

0

10

20

30

40

50

60

70

Ela

stic

idad

e S

uper

ficia

l (m

N.m

-1)

log [DTAB]

Figura 44: Elasticidade dilatacional superficial de soluções aquosas de DTAB na presença de κκκκ-2-

car 25 ppm em diferentes conformações: (■)NaCl 10 mM (novelo-ao-acaso) e (●) KCl 10 mM (hélice).

A Figura mostra que os valores de ε são maiores na presença de KCl, apresentando

um máximo em 7,5 .10-5 M. Usando o mesmo argumento anteriormente apresentado, esse

resultado deve estar relacionado com a diferença de conformação e/ou de densidade de

carga da carragenana na presença de K+ e Na+.

Tridimensionalmente, o módulo de elasticidade (de equilíbrio) de um determinado

material relaciona-se com a sua rigidez, uma vez que é calculado a partir do coeficiente

100

entre a tensão e a correspondente deformação no regime elástico. Analogamente, o módulo

de elasticidade dilatacional superficial (bidimensional) de equilíbrio Cs-1 deve ser tanto

maior quanto mais condensado ou rígido for o filme. Entretanto esta propriedade quando

determinada de forma dinâmica pode também sofrer influência de processos difusivos.

Dessa forma, o filme formado pelo complexo DTAB-κ-2-car, por sua conformação hélice

(KCl) deve ser mais resistente à deformação que aquele formado com a macromolécula na

conformação novelo-ao-acaso. Já na presença de NaCl, as características da interação entre

DTAB e k-2-car refletem-se nos valores de viscosidade superficial, uma vez esta

propriedade apresenta valores ligeiramente mais elevados quando o sistema se encontra

nessa condição (vide Tabela 5).

Tabela 5: Valores de viscosidade superficial para k-2 carragenana em Na+ e K+ no valor

máximo de elasticidade.

k-2-car + DTAB

0,075mM

ηηηηs(mN.

m-1)

εεεε

(mN.m-1)

K+ ~0

(0,47)

63,5

Na+ 4,75 41,3

Ao contrário da elasticidade superficial dilatacional que se refere à recuperação ou

restauração de valores iniciais de pressão superficial, a viscosidade superficial (ηs) refere-se

a processos dissipativos e que ocorrem de maneira irreversível como pode ser o caso de

rearranjos conformacionais destas macromoléculas ligadas ao tensoativo na interface.

Seguindo esse raciocínio, pode-se inferir que os valores de ηs encontrados nesse trabalho

referem-se à maior flexibilidade do complexo formado pela carragenana na forma novelo-

101

ao-acaso, que sendo a forma mais flexível, permite a ocorrência de processos dissipativos e

menos regenerativos que para o sistema na presença da macromolécula na conformação

hélice.

Conclui-se então que o complexo formado com a macromolécula na conformação

hélice se mostra mais resistente à deformação e regenera prontamente quando submetida a

um distúrbio dilatacional. Entretanto, a interface contendo o complexo com a

macromolécula como novelo-ao-acaso pode sofrer deformações mais facilmente,

apresentando entretanto, a uma maior possibilidade de ocorrência de processos dissipativos,

a julgar pela comparação entre os valores de viscosidade superficial nos dois casos. Esses

processos dissipativos devem estar associados a rearranjos da molécula de carragenana que,

na ausência de interações específicas, perde o efeito de memória característico para a

macromolécula na conformação hélice.

4.3. Interação carragenana-proteína.

A grande quantidade de trabalhos encontrados na literatura envolvendo a interação de

carragenanas com proteínas, em sua grande maioria de leite, se deve a sua aplicabilidade

como espessantes em alimentos laticínios.

Sabe-se que carragenanas interagem sinergisticamente com estas proteínas,

provocando um aumento na gelificação e viscosidade de soluções de caseína (Spagnuolo et

al., 2005). Para explicar esta interação, duas teorias são propostas pelos autores: a primeira

delas propõe que as cargas negativas da carragenana interajam com uma região

102

positivamente carregada da caseína, de forma que a molécula do polissacarídeo estaria

adsorvendo na superfície do que é chamado de micela de caseína.

Já a segunda, propõe que as moléculas de carragenana formem um gel fraco que irá

rodear as micelas de caseína, impedindo então a separação de fases.

Além disso, também se encontra na literatura estudos sobre a interação de

carragenanas com outras proteínas de diferentes origens, sendo que estas apresentam em

comum o fato de serem utilizadas na indústria alimentícia, como proteína de soja (Ipsen,

1995), canola (Uruakpa et al., 2004) e ervilha (Nunes et al., 2006).

Em nossa pesquisa os fatores que nortearam a escolha da proteína de estudo foram a

sua estrutura química e disponibilidade. Sob o ponto de vista fundamental, sabe-se que

muitas biomembranas estão envolvidas por carboidratos ou ainda, que estes se encontram

acumulados nesta interface, com a função de proteção, em decorrência de processos como

desidratação ou resfriamento (Crowe et al., 1985, Crowe et al., 1988). Além disso,

determinados carboidratos podem servir como sinalizadores, ou ainda de sítios para adesão

de proteínas (Morris, 1981).

Nesse sentido, escolhemos para o estudo uma proteína que apresentasse em sua

constituição grupos glicosilados. Dessa forma, poderíamos acrescentar ao estudo da

interação de carragenanas com moléculas anfifílicas eletricamente carregadas, uma

discussão com relação à interação das carragenanas com grupos carboidratos.

103

4.3.1 - Carragenanas e Fosfatase Alcalina (FANC)

Utilizou-se uma fosfatase alcalina (FA) purificada (Lab.Bioquímica-DQ/FFCLFP-

F.A.Leone/R.P.M.Furriel) a partir de uma conídia de uma Neurospora crassa, denominada

daqui para frente de FANC (fosfatase alcalina de Neurospora crassa).

A proteína apresenta massa molecular de 1,1 x 105 g mol-1, e se apresenta como um

tetrâmero com grau de glicosilação de 40% (Say et al.1981).

Para estudar a sua interação com carragenanas, usou-se como sistema modelo as

monocamadas de Langmuir. Para a formação das monocamadas utilizou-se inicialmente o

fosfolipídio sintético DHP (sal de sódio do ácido dihexadecilfosfórico).

A isoterma superficial para monocamadas deste fosfolipídio, formadas sobre água

pura, é característica de um lipídio condensado, onde não se observa uma região de

coexistência de fases (Figura 45). As monocamadas de DHP foram também preparadas

sobre solução contendo iota-carrageanana (ι-car) ou (ι-car+ FANC).

104

40 50 60 70 80 90

0

10

20

30

40

50

60

70

pres

são

supe

rfic

ial (

mN

.m-1)

área por molécula (Å2)

DHP/Zn DHP/Zn/iota DHP/Zn/iota/CNC

Figura 45: Isoterma superficial para DHP () sobre água pura, (--) sobre solução aquosa Zn2+ 1

mM e ιιιι-car 25 ppm (__) sobre solução sobre solução aquosa Zn2+ 1 mM / ιιιι-car 25 ppm/ FANC 9nM.

Conforme citado no item 4.1.2., filmes LB de DHP foram preparados, com três

camadas, e quantificados por QCM, fornecendo uma massa de 187,9 ng por camada.

A diferenciação entre as duas metodologias se deu a partir da quarta camada sendo

que na primeira delas, a inserção da carragenana ocorreu através da deposição conjunta do

fosfolipídeo e do polissacarídeo que se encontrava na subfase. Esse filme depois de

enxaguado e seco, resultou em um valor de massa de 260,7 ng.

Na seqüência esse filme foi mergulhado em uma solução aquosa contendo a

proteína FANC (9 nmol L-1 ) e a massa adsorvida foi monitorada por QCM, retirando-se o

105

filme da solução em intervalos de 20 minutos e secando-o para pesagem. O resultado está

apresentado na Figura 46 e representa a curva de cinética de adsorção da FANC ao filme.

10 100

300

400

500

600

700

800

ma

ss

a d

ep

os

itad

a (

ng

)

Tempo (min)

Figura 46: Cinética de Adsorção da enzima FANC ao filme de fosfolipídio.

No período de duas horas a massa adsorvida apresenta um aumento linear com o

tempo, não atingindo a saturação. Esse comportamento pode evidenciar que a proteína

esteja adsorvendo em multicamadas.

O valor máximo depositado durante esse período corresponde a uma densidade

superficial de 1.13 µg cm-2, que, levando-se em consideração a massa molecular da enzima,

equivale a uma área média ocupada por molécula de proteína na superfície do filme de

1617 Å2/ molécula.

106

Este valor é compatível com a área que deveria ser ocupada por uma proteína

globular, com massa molecular correspondente FANC, como por exemplo a fosfatase

alcalina de placenta de bezerro no formato de uma elipse, e que ocupa uma área de 3935

Å2 quando orientada paralelamente com o eixo maior em relação à interface e de 1962 Å2

quando orientada perpendicularmente à interface (Rieu et al., 2002).

Na segunda metodologia, o filme de três camadas de DHP/Zn2+, foi imerso a partir de

uma monocamada de DHP formada sobre uma subfase aquosa contendo simultaneamente

ι-car e FANC (9 nM), como tentativa de transferência simultânea do polissacarídeo e

enzima com o filme de fosfolipídio.

O filme obtido foi seco e a massa da quarta camada determinada em 198,9 + 1,1 ng.

Como podemos comparar com os valores anteriormente obtidos, este valor de massa é

correspondente ao obtido pela transferência apenas de uma camada de DHP/Zn2+ ,

evidenciando que a transferência conjunta não foi eficiente.

Como experimento controle, foram preparados filmes contendo quatro camadas de

DHP/Zn2+ e a adsorção da FANC foi conduzida na ausência de ι-car. Neste caso, a massa

total depositada, após 60 min, foi de apenas 49,3 + 1,1 ng.

Através dos valores de massa de FANC depositada na presença e na ausência do

polissacarídeo, podemos concluir que além do polissacarídeo ter influenciado na fluidez da

monocamada, sua presença parece ser fundamental para a transferência da enzima à matriz

fosfolipídica.

107

4.3.1.1 Microscopia de fluorescência.

A fim de verificar se a morfologia da monocamada de DHP era modificada pela

presença da carragenana na subfase, usou-se a técnica de microscopia de fluorescência.

Inicialmente, foram utilizadas as sondas NBD-PE e DiIC18 para a marcação da

monocamada de DHP. Para a primeira sonda utilizada, a interface apresentou um único

campo escuro, enquanto que para DiIC18 apresentou padrões irregulares, mesmo para

pressões da ordem de 5 mN.m-1 (Figura 47).

(a)

(b)

Figura 47: Micrografias de fluorescência monocamadas (DHP + Zn 2+) a 5 mN m-1 usando como

sonda NBD-PE e (b) DiIC18.

108

Na técnica de microscopia de fluorescência, a diferença de solubilidade da sonda em

diferentes estados físicos que possam coexistir na monocamada é a responsável pelo

contraste observado na técnica. Sendo assim, quando duas fases coexistem, é possível

distingui-las através da fluorescência, uma vez que a densidade das moléculas fluorescentes

(sonda) será diferente nas distintas fases. Neste caso, para substâncias puras a presença de

domínios está relacionada à região de coexistência de fases líquido-condensado/líquido-

expandido. Em se tratando de misturas, a presença conjunta de substâncias imiscíveis na

interface pode resultar em contraste para a técnica.

A total ausência de contraste no caso da micrografia obtida com a sonda NBD-PE,

solúvel em regiões expandidas, é atribuída a não solubilização desta sonda na monocamada

de DHP que, como pode ser visto, pela Figura 45, exibe uma isoterma característica de

monocamada condensada, quando formada sobre água pura ou sobre solução de íons zinco.

Já a micrografia obtida usando DiIC18 como sonda fluorescente, mostrou padrões

irregulares, mas ausência da presença de domínios, mostrando simplesmente o início da

solubilização da sonda em uma região uniforme condensada.

Resultado similar foi obtido para as micrografias de monocamadas de DHP formadas

na presença conjunta do polissacarídeo e da enzima FANC, que também não permitiram a

observação de alteração do contraste ou presença de domínios. Dessa forma, a única

resposta que pudemos obter desse estudo é que se a enzima FANC interage com a

monocamada desse fosfolipídio ela deve consistir em uma única fase e com características

mais próximas de estado condensado. Por outro lado, pode-se também inferir que não

ocorra interação de FANC com DHP quando o polissacarídeo encontra-se presente

simultaneamente na subfase. Este resultado corroboraria os dados de QCM, para os quais a

109

tentativa de deposição da enzima a partir de monocamadas de DHP formadas sobre subfase

contendo (FANC+ι-car) resultou em massa correspondente unicamente ao fosfolipídio.

4.3.1.1.1 Glicolipídeos e Fosfatase Alcalina

Os resultados obtidos até então indicam que, por um lado o polissacarídeo pode atuar

como mediador da interação da enzima com o fosfolipídio mas que, por outro parece existir

uma competição entre fosfolipídio e enzima na interação com o fosfolipídio.

Diante desse quadro, optou-se por investigar a interação de uma espécie contendo

grupos carboidratos que interagissem especificamente na interface. Dessa forma, substituiu-

se o sistema (fosfolipídio-polissacarídeo-enzima) por (glicolipídeo-enzima), para o qual as

características principais do sistema seriam mantidas, uma vez que o glicolipídeo seria um

modelo para o fosfolipídio-polissacarídeo, mas que devido à sua natureza anfifílica

permanece na interface, mantendo grupos carboidratos em contato com a solução, mas

evitando a competição da interação em solução.

Esta parte do trabalho foi desenvolvida no Grupo de Biofísica da Universidade

Nacional de Córdoba-Argentina, em colaboração com Prof. Dr. Bruno Maggio.

Dois glicolipídeos foram utilizados neste estudo: galactocerebrosídeo (GalCer) e

galactocerebrosídeo sulfatado (Sul). Se compararmos a estrutura desses dois lipídeos

(Figura 48) com a estrutura da carragenana, podemos verificar a presença de unidades

galactose em ambos os lipídeos. Além disso, o glicolipídeo Sul apresenta na molécula um

grupo sulfato. Dessa forma, o sistema escolhido deveria permitir discernir se a ligação da

FAFANC se dá preferencialmente por meio de grupos hidroxila, sulfato ou ambos.

110

(a) (b)

Figura 48: Estrutura dos glicolipídeos (a) GalCer, (b) Sul.

Para os experimentos de microscopia de epifluorescência, conforme dito

anteriormente, os filmes foram formados a partir de soluções do lipídeo contendo 1 % em

mol de Rodamina PE, da Avanti Polar Lipids, que particiona, preferencialmente, em fases

líquido-expandidas. Durante os experimentos, a pressão superficial em função da área por

molécula foi monitorada.

A isoterma superficial completa para este lipídio é apresentada na (Figura 49). As

micrografias foram obtidas em função do tempo, primeiramente para monocamadas do

lipídeo GalCer sobre tampão tris 5 mM pH= 7,5, com π inicial de 5 mN.m-1 (Figura 50).

111

40 45 50 55 60 65

0

10

20

30

40

50

pres

são

supe

rfic

ial (

mN

/m)

área por molécula (Å2)

π x área por molécula para GalCer

Figura 49: Isoterma de pressão superficial versus área por molécula para o lipídeo GalCer.

(a) (b) (c)

112

Figura 50: Micrografias de epifluorescência de monocamadas de GalCer em 5 mN.m-1 obtidas

em diferentes tempos: (a) 0 min, (b) 30min, (c) 90 min.

Acompanhando a monocamada de GalCer por meio de microscopia de fluorescência,

podemos observar uma região cinza que não se modifica com o tempo durante um intervalo

de tempo de 90 minutos, indicando que não há formação de domínios para as

monocamadas formadas. Esta observação está de acordo com a isoterma obtida, que não

apresenta região de coexistência de fases, entretanto permitiu a solubilização da sonda por

ser expandida (Figura 49). A pressão superficial permaneceu constante durante esse

intervalo de tempo.

A adição de íons Zn2+ (0,1 mM) , não alterou as imagens, tampouco o valor da

pressão superficial, que permaneceu constante em 5,0 ± 0,5 mN.m-1.

Na seqüência, adicionou-se FANC em quantidade de enzima suficiente para fornecer

uma concentração final da enzima na cuba de 9nM. A morfologia da monocamada bem

como o valor da pressão superficial foram monitoradas em função do tempo (Figura 51).

113

0 min 10 min 20 min

30 min 40 min 50 min

60 min 70 min 80 min

90 min 100 min 110 min

Figura 51: Micrografias de epifluorescência para monocamadas de GalCer em subfase de FANC

em diferentes tempos.

114

A enzima foi injetada na subfase no tempo “zero”. Podemos verificar que após um

intervalo de tempo de aproximadamente 30 minutos, é nítida a presença de pequenos

domínios, que aumentam em tamanho e quantidade em função do tempo. Além disso, o

valor de pressão superficial começa a se alterar logo após 5 minutos da injeção da enzima

(Figura 52).

0 20 40 60 80 100 1204

6

8

10

12

14

16

pres

são

supe

rfic

ial (

mN

.m-1)

tempo (min)

Variação da pressão superficial em função do tempo para o lipídeo Galcer

Figura 52: Variação da pressão superficial para a monocamada de GalCer na presença de FANC

em função do tempo.

A formação desses domínios indica que a sonda, que antes se encontrava

homogeneamente distribuída na monocamada, agora é particionada em diferentes domínios

que devem estar associados a diferentes estados de compactação. Dessa forma, a presença

da FANC induz o crescimento dos domínios na fase líquida-condensada (no qual a sonda

115

não é solúvel) e líquido-expandido (onde a sonda está presente). Além disso, em 110

minutos parece ocorrer segregação da sonda, de modo que esta não mais se particiona na

monocamada.

Tanto o aparecimento de domínios quanto o aumento no valor da pressão superficial

são atribuídos a interação da enzima com o lipídeo.

A mesma série de experimentos foi realizada para o lipídeo Sul, que apresenta a

mesma estrutura de GalCer anteriormente relatado, com a presença adicional de um grupo

sulfato. A isoterma para este lipídio é apresentada na Figura 53, onde podemos notar que,

diferentemente de GalCer, Sul apresenta região de coexistência de fases. Dessa forma, é

esperado que domínios sejam observados na microscopia de fluorescência deste lipídeo.

40 50 60 70 80 90 100

0

10

20

30

40

50

60

pres

são

supe

rfic

ial (

mN

.m-1)

área por molécula ( Å 2)

π x área por molécula para Sul

Figura 53: Isoterma de pressão superficial versus área por molécula para o lipídeo Sul.

116

A monocamada formada na presença da mesma sonda fluorescente e sobre o

tampão foi observada durante um intervalo de tempo de 90 minutos (Figura 54).

(a) (b) (c)

Figura 54: Micrografias de Epifluorescência de monocamadas de Sul em diferentes tempos: (a) 0

min, (b) 30min, (c) 90 min.

Posteriomente, a enzima foi adicionada à subfase, na mesma concentração usada nos

experimentos com Galcer (9 nM), e as micrografias obtidas em função do tempo durante 90

minutos (Figura 55). Em ambas as situações a pressão superficial inicial foi ajustada para 5

mN.m-1.

117

(a) (b)

(c)

Figura 55: Micrografias de Epifluorescência de monocamadas de Sul em subfase de FANC à

diferentes tempos: (a) 10 min, (b)30min, (c) 60 min.

Como podemos notar, comparando as imagens das Figuras 54 e 55, a presença da

enzima não altera os domínios formados pelo lipídeo, o que pode ser interpretado como a

ausência de interação deste lipídeo com a enzima, nas condições descritas. Outro indício da

não interação é o fato de que o valor da pressão superficial permaneceu em 5 mN.m-1.

Conforme descrito, o lipídeo Sul apresenta uma galactose com um grupo sulfato como

grupo polar. Como nos experimentos com ι−car a interação somente ocorreu na presença de

íon zinco, adicionou-se íons Zn2+ na subfase para verificar se este influenciaria, ou

possibilitaria a interação entre Sul e FANC.

As micrografias apresentadas na Figura 56 foram realizadas de tal forma que o tempo

zero foi considerado a adição de íons zinco na subfase. Entretanto, anterior a esta adição, a

enzima já havia sido injetada há 60 minutos. Podemos notar uma modificação dos

domínios, que se tornaram maiores e em menor quantidade em função do tempo. Além

disso, a pressão superficial nesse caso aumentou de 5 para 13 mN.m-1 no período de

observação da monocamada, como pode ser visto na Figura 57.

118

0 min 10 min 20 min

30 min 40 min 50 min

60 min 70 min 80 min

Figura 56: Micrografias de epifluorescência para monocamadas de Sul em subfase de FANC, e

posterior adição de Zn 2+ em diferentes intervalos de tempo.

119

0 20 40 60 80 1004

6

8

10

12

14

pres

são

supe

rfic

ial (

mN

/m)

tempo (min)

Variação da pressão superficial em função do tempo para o lipídeo Sul

Figura 57: Variação da pressão superficial para a monocamada de Sul na presença de FANC /

Zn 2+em função do tempo.

Esses resultados indicam que a adição de íons zinco promove a interação da enzima

com o lipídio, uma vez que micrografias obtidas para monocamadas do glicolipídeo sobre

subfase contendo íons zinco, mas na ausência da enzima, também foram obtidas, e não se

observou variação, nem dos domínios formados anteriormente, e nem do valor de pressão

superficial.

120

4.3.1.2 Microscopia no Ângulo de Brewster.

As micrografias foram obtidas para os sistemas nas mesmas condições das

micrografias obtidas por epifluorescência.

As micrografias para as monocamadas dos lipídios puros formadas sobre tampão e a 5

mN.m-1 apresentaram elevada mobilidade e padrões de cinza claro e escuro se alternando

(Figura 58 (a) e (b)). Deve ser salientado que nesse caso, devido às características do

equipamento, o aumento é dez vezes menor que o obtido pela microscopia de fluorescência.

(a) (b) (c) (d)

Figura 58: Microscopias de BAM (a) GalCer 5mN/m, (b) Sul 5 mN/m, (c) GalCer em subfase de

CNC após 30 min, (d) Sul em subfase de CNC após 30 min.

A presença de FANC na subfase suporte da monocamada de Galcer, Figura 58 (c)

leva a uma interface com uma mobilidade bastante reduzida e muito mais homogênea, se

comparada à imagem apresentada na Figura 58(a), para Galcer sobre tampão. Esse padrão

não é alterado mesmo após 90 minutos de adição da enzima.

Entretanto, quando a monocamada foi sujeita à compressão até atingir uma pressão

superficial de 30 mN.m-1, observou-se um aumento na intensidade de luz, da ordem de 20

unidades arbitrárias. De acordo com Rosetti et al., (Rosetti et al., 2003) , que padronizaram

as escalas de intensidade de cinzas para este equipamento, este valor se encontra dentro do

121

erro experimental, no limite mais extremo, o que deve estar relacionado apenas a uma

variação na compactação da monocamada e não podem ser atribuídos a variações de

espessura da monocamada.

Uma interpretação para as diferenças de luminosidade das monocamadas pode ser a

adsorção da enzima entre as moléculas do lipídio, com uma variação de espessura que está

no limite de detecção do aparelho. Esse resultado estaria de acordo com os valores de

variação de pressão superficial detectados para a monocamada de Galcer na presença de

FANC.

Para o lipídio Sul, a monocamada formada em subfase da enzima, apresentou um

aumento de 23 unidades arbitrárias na refletividade, indicando um aumento na espessura na

monocamada. Entretanto, com a adição do íon, ocorreu uma diminuição do valor da

luminosidade, que retornou ao valor obtido para monocamadas do lipídio puro. Por meio

dos resultados obtidos pode-se concluir que nesse caso a enzima não esteja adsorvida na

interface, fato que se comprova inclusive pela não variação do valor de pressão superficial.

Comportamento análogo ao lipídio GalCer somente se observa nesse caso na presença do

íon divalente, que deve promover a interação fazendo uma ponte entre os grupos carregados

do fosfolipídio e aqueles da enzima. Nesse caso o valor de pressão aumenta, entretanto a

monocamada não varia sua espessura, provavelmente pela forma como essa enzima está

adsorvendo na interface.

A observação simultânea das monocamadas por BAM e Microscopia de

epifluorescência permitiu atestar a homogeneidade do filme em campos maiores e menor

resolução, no primeiro caso, e a detecção de domínios na segunda técnica.

122

Resumindo, as observações sobre os sistemas GalCer-FANC e Sul-FANC,

permitiram constatar que no caso do lipídio GalCer, neutro, as interações devem ocorrer

por meio de ligações de hidrogênio entre as hidroxilas do grupo polar galactose, que deve

apresentar grande afinidade pelos grupos carboidratos da enzima, que representam 40% da

sua constituição. Já para o lipídio Sul, que tem o grupo hidroxila da posição 2 da galactose

substituído por um grupo sulfato, verificou-se que a interação por ligações de hidrogênio

não ocorre. Alterações significativas, tanto da pressão superficial, quanto da morfologia da

monocamada somente foram detectadas após a adição de íons zinco. Dessa forma,

constata-se a necessidade da presença de íons zinco para promover a interação. Porém

pode-se interpretar a função dos íons zinco de duas formas: ou há necessidade nesse caso

de mediação desses íons para efetuar as ligações entre grupos negativamente carregados da

enzima e os grupos sulfato ou que a função dos íons zinco seja a de blindar a carga negativa

do sulfato para que a ligação ocorra, da mesma forma que para Galcer, por meio de ligações

de hidrogênio de Sul e FANC.

4.3.1.3 Espectroscopia por Geração de Soma de Freqüências

Os resultados apresentados até o momento indicam que, a presença do polissacarídeo

é fundamental na interação da enzima com o filme fosfolipídeo, porém não é conclusiva a

forma como se dá esta interação com o glicolipídeo negativamente carregado.

Uma técnica que permite a análise de quais grupos estão envolvidos em uma dada

ligação é a espectroscopia na região do infravermelho. Uma variação dessa técnica, que a

deixa específica para a interface, é a espectroscopia por geração de soma de freqüências

123

(SFG). Esta parte do trabalho foi desenvolvida no Grupo de Polímeros do Instituto de

Física de São Carlos-USP, em colaboração com Prof. Dr. Paulo Barbeitas Miranda. Para

esses estudos retornamos ao sistema DHP/Zn2+/i-car/FANC.

A Figura 59 apresenta o espectro de SFG para a região de estiramento dos grupos

ésteres-sulfato (OSO3-), para os filmes formados com quatro camadas de DHP/Zn2+(tipo

A), e com quatro camadas de DHP, sendo que as três primeiras formadas com DHP/Zn2+, e

a quarta formada apenas pelo fosfolipídeo, depositado em presença de ι-carragenana na

subfase.

1000 1050 1100 1150 1200 12500,0

0,1

0,2

0,3

0,4

(DHP)4 + iota-car com Zn+2

Inte

nsid

ade

SF

G /

a. u

.

número de onda / cm_1

1125

(DHP)4/Zn2+

(DHP)4 + iota-car sem Zn2+

Figura 59: Espectro de SFG na região de estiramento OSO3-.

O espectro para o filme tipo A (DHP/Zn2+) nesta região foi realizado como

experimento controle, e conforme esperado, observamos ausência de sinal.

124

Interessantemente, o mesmo comportamento é observado para o filme tipo B (DHP + ι-car

na ausência de íons Zn2+).

Este é um indicativo de que ι-car não interage com o filme fosfolipídico na ausência

de íons zinco, ou então que a interação ocorre de tal forma que os grupos ésteres sulfato se

encontram aleatoriamente distribuídos, dessa forma não contribuindo para o sinal de SFG

nesta região, uma vez já se verificou que polímeros randomicamente distribuídos não

contribuem para o sinal de SFG por não constituírem regiões de assimetria (Sousa e Silva,

2007) Entretanto, esta última hipótese é pouco provável por razões eletrostáticas, uma vez

que ambos, polissacarídeo e fosfolipídeo, apresentam cargas negativas.

O espectro do filme tipo C, com quatro camadas DHP/Zn2+ + ι-car, entretanto,

apresenta uma pico intenso, por volta de 1125 cm-1, conforme mostrado na Figura 59.

Este pico é correspondente ao estiramento do grupo –O–SO3- (Couthup et al., 1990), e

definitivamente comprova a ligação do grupo fosfato do DHP e do grupo sulfato da

carragenana, ocorrendo apenas quando mediada por íons Zn2+.

De modo a verificar o ordenamento do filme e relacionar com a conformação da

carragenana no filme LB, o espectro na região CH também foi estudado.

A Figura 60 mostra o espectro de SFG para os mesmos filmes descritos anteriormente

para a região de estiramento CH, realizados in situ.

125

2800 2825 2850 2875 2900 2925 2950 2975 30000,0

0,4

0,8

1,2

1,6

Inte

nsid

ade

SF

G /

a. u

.

número de onda / cm-1

(DHP)4

(DHP)4 + iota-car sem Zn+2

(DHP)4 + iota-car comZn+2

Figura 60: Espectro de SFG na região de estiramento CH.

Estas medidas foram realizadas em contato com a água de modo a evitar alguma

possível inversão do filme, uma vez que estes terminam expondo suas cabeças polares ao

ar. Vale ressaltar que apenas os espectros obtidos para a região dos grupos ésteres-sulfato

não foram realizados in situ pelo fato da espessura do substrato utilizado (Quartzo) não

permitir que o sinal de soma de freqüência fosse coletado, pois o mesmo sai com um

ângulo muito raso em relação à superfície.

Análogo a Figura 59, o espectro de SFG para o filme tipo A é praticamente nulo nesta

região. Isto ocorre devido à simetria do filme, formado pela transferência de quatro

camadas idênticas do lipídeo/íon, resultando em um meio centrossimétrico.

126

Para o filme tipo B, podemos observar picos em 2872 e 2944 cm-1 devido aos grupos

CH3, correspondentes às cadeias alifáticas do DHP, e atribuídas ao estiramento simétrico de

CH (r+) e a sua ressonância de Fermi (r+FR), respectivamente.

Uma banda em aproximadamente 2845 cm-1 é atribuída ao estiramento simétrico de

grupos metileno (d+), que é observada apenas na presença de defeitos gauche nas cadeias

alquílicas, quebrando a simetria local no arranjo dos grupos CH2 (Macphail et al., 1984;

Nicklov et al., 2006). A presença destes picos é explicada pela quebra de simetria, causada

pela ausência de íons zinco na última camada.

Por este motivo, e devido às cargas negativas das moléculas, estes picos não são

resultantes de nenhuma modificação promovida pela presença da carragenana no filme, mas

são decorrentes de diferenças na simetria deste filme comparado ao filme tipo A. Neste

sentido, podemos comprovar que a presença da carragenana não promove alterações no

filme, uma vez que não ocorrem interações entre as espécies.

Para o filme tipo C, formado com iota-carragenana na presença de Zn2+, podemos

notar significativas modificações no espectro, com picos em aproximadamente 2845, 2863

e 2929 cm-1.

Conforme observado pelas isotermas superficiais, a adição de ι-carragenana a

subfase, mesmo quando em presença de Zn2+, promove a expansão da monocamada de

DHP, e que em pressão superficial igual a 30 mN m-1, na quais as monocamadas foram

transferidas, a área por molécula ocupada é muito maior que aquela observada para a

monocamada de DHP formada sobre água pura.

127

Desta forma, a última camada do filme LB apresenta significativas diferenças quando

comparadas as camadas anteriores: o empacotamento das moléculas do lipídeo, além da

presença do polissacarídeo.

Para a Figura 60, o primeiro pico, em 2845 cm-1 coincide com o observado para o

filme tipo B, conforme já discutido. O segundo, em 2863 cm -1 é relatado na literatura e

atribuído ao estiramento simétrico de grupos CH2 adjacentes a CH3 terminais (dadj+) dos

fosfolipídeos (Himmelhaus et al., 2000).Entretanto, neste caso é pouco provável porque

esta banda é extremamente fraca com relação ao estiramento assimétrico do próprio CH3.

Um pico em aproximadamente 2863 cm-1 é encontrado na literatura como característico de

açúcares, como glicose e sacarose (Mizutani et al., 2005).

Além disso, outro pico, em aproximadamente 2944 cm-1, é descrito na literatura como

típico de estiramento CH2 quando ligado a O em compostos éteres (Wieser e Krueger,

1971), do tipo, –CH2–O–CH2–, presente na molécula de carragenana (grupo anidro-

galactose).

Dessa forma, o modelo da Figura 61 é proposto para a interação do sistema.

128

Figura 61: Modelo proposto para a interação da enzima com o filme fosfolipídico mediado pela

enzima.

Neste modelo, o fosfolipídeo está ligado a carragenana mediada pelos íons zinco, que

atua como uma ponte entre os grupos que apresentam carga de mesmo sinal. Esta interação

eletrostática resulta em uma mudança conformacional do polissacarídeo, que expões seus

grupos sulfato para a interface. Como conseqüência, a parte restante da molécula também

se orienta de modo a expor seus grupos hidroxila na direção oposta, tornando-a disponível

para a interação com as moléculas da enzima.

A atividade enzimática da fosfatase alcalina imobilizada ao filme também foi

determinada, entretanto, resultando em valores correspondentes a 0,4 % de sua atividade

em meio homogêneo.

O3PO- O3PO

- O3PO-

Zn2+

OSO3-

OH

Zn2+

OSO3-

OH

Zn2+

OSO3-

OH

129

O baixo valor de atividade obtido provavelmente seja um indicativo de que estes

grupos pelo qual a enzima interage com o filme sejam seus sítios catalíticos.

5. Conclusões

Este trabalho contribui para o entendimento do comportamento de sistemas mistos

contendo carragenanas e tensoativos.

Carragenanas não apresentam atividade superficial, entretanto, provocam um

abaixamento sinergístico da tensão superficial quando associadas a tensoativos. Medidas de

reologia superficial forneceram dados a respeito das propriedades viscoelásticas em função

do regime em que o sistema se encontrava, onde se observou que o máximo valor de

elasticidade coincidiu com a concentração crítica de agregação (CAC) do sistema. Medidas

de cinética de adsorção mostraram que o comportamento do sistema depende de parâmetros

como a razão entre cargas QTS/QPOL. O ambiente iônico em que o polieletrólito se encontra

influencia a conformação das carragenanas, que por sua vez leva a diferentes

comportamentos superficiais. Resultados com fosfolipídeos atestaram as proposições

colocadas.

Dessa forma, os resultados colocados para a interação entre carragenanas e

tensoativos, bem como as técnicas empregadas, como elasticidade superficial dilatacional,

consistem em importantes ferramentas para o estudo da estabilização de sistemas dispersos.

Além disso, a utilização de carragenanas em sistemas modelo de biomembranas constitui

um importante sistema para a imobilização de diversas classes de proteínas, inclusive com

potencial para o desenvolvimento de biomateriais e biosensores.

130

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