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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FFCLRP-DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS –GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA COMPARADA

PRODUÇÃO, PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA DAS

INVERTASES DO FUNGO FILAMENTOSO

Aspergillus phoenicis.

Cynthia Barbosa Rustiguel

Ribeirão Preto – SP

2009

Dissertação apresentada á Faculdade de

Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto da

USP, como parte das exigências para a obtenção

do título de Mestre em Ciências, Área: Biologia

Comparada.

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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FFCLRP-DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS –GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA COMPARADA

PRODUÇÃO, PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA DAS

INVERTASES DO FUNGO FILAMENTOSO


Cynthia Barbosa Rustiguel

ORIENTADOR: Prof. Dr. Luis Henrique S. Guimarães

Ribeirão Preto – SP

2009

Dissertação apresentada á Faculdade de

Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão

Preto da USP, como parte das exigências

para a obtenção do título de Mestre em

Ciências, Área: Biologia Comparada.

Rustiguel, Cynthia Barbosa

PRODUÇÃO, PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO

BIOQUÍMICA DAS INVERTASES DO FUNGO FILAMENTOSO


Ribeirão Preto, 2009

133 p.il.; 30cm

Dissertação de Mestrado, apresentada á Faculdade de Filosofia,

Ciências e Letras de Ribeirão Preto/ USP –Área de concentração:

Biologia Comparada.

Orientador: Guimarães, Luis Henrique Sousa.

1. Invertase – 2. β-D-frutofuranosidases – 3. Aspergillus

phoenicis – 4. Purificação de enzimas.

FICHA CATALOGRÁFICA

Os benefícios a longo prazo do uso de filtro solar estão provados e

comprovados pela ciência; Já o resto dos meus conselhos não tem outra base confiável além

de minha própria existência errante.

Mas agora eu vou compartilhar esses conselhos com vocês.

Aproveite bem, o máximo que puder, o poder e a beleza da juventude.

Ou, então, esquece... Você nunca vai entender mesmo o poder e a beleza da juventude

até que tenham se apagado. Mas, pode crer, daqui a 20 anos, você vai evocar as suas fotos e

perceber de um jeito - que você nem desconfia hoje em dia - quantas tantas alternativas se lhe escancaravam à sua frente,

e como você realmente estava com tudo em cima. Você não está gordo! Ou gorda...

Não se preocupe com o futuro.

Ou então preocupe-se, se quiser, mas saiba que pré-ocupação é tão eficaz quanto mascar chiclete para tentar

resolver uma equação de álgebra

As encrencas de verdade de sua vida tendem vir de coisas que nunca

passaram pela sua cabeça preocupada, e te pegam no ponto fraco às 4 da tarde

de uma terça feira modorrenta

Todo dia, enfrente pelo menos uma coisa que te meta medo mesmo.

Não seja leviano com o coração dos outros. Não ature gente de coração leviano.

Use o fio dental.

Não perca tempo com inveja. Às vezes se está por cima,

às vezes por baixo. A peleja é longa e, no fim,

é só você contra você mesmo.

Não esqueça os elogios que receber. Esqueça as ofenças.

Se conseguir isso, me ensine. Guarde as antigas cartas de amor.

Jogue fora os extratos bancários velhos. Estique-se.

Não se sinta culpado por não saber o que fazer da vida

As pessoas mais interessantes que eu conheço não sabiam, aos vinte e dois

o que queriam fazer da vida. Alguns dos quarentões mais interessantes que eu conheço ainda

não sabem. Tome bastante cálcio.

Seja cuidadoso com os joelhos. Você vai sentir falta deles.

Talvez você case, talvez não.

Talvez tenha filhos, talvez não. Talvez se divorcie aos quarenta, talvez dance ciranda em suas

bodas de diamante.

Faça o que fizer, não se auto-congratule demais, nem seja severo demais com você.

As suas escolhas tem sempre metade da chance de dar certo. É assim pra todo mundo.

Desfrute do seu corpo.

Use-o de toda a maneira que puder, mesmo. Não tenha medo de seu corpo ou do que as outras pessoas possam

achar dele. É o mais incrível instrumento que você jamais vai possuir.

Dance.

Mesmo que não tenha aonde além do seu próprio quarto.

Leia as instruções, mesmo que não vá segui-las depois. Não leia revistas de beleza. Elas só vão fazer você se achar

feio.

Dedique-se a conhecer seus pais. É impossível prever quando eles terão ido embora, de vez.

Seja legal com seus irmãos. Eles são a melhor ponte com o seu passado e

possivelmente quem vai sempre mesmo te apoiar no futuro.

Entenda que os amigos vão e vem, mas nunca abra mão de uns

poucos e bons. Esforce-se de verdade para diminuir as distâncias geográficas e

de estilos de vida, porque quanto mais velho você ficar, mais você

vai precisar das pessoas que conheceu quando era jovem.

More uma vez em Nova York, mas vá embora antes de endurecer.

More uma vez no Havaí, mas se mande antes de amolecer. Viaje.

Aceite certas verdades inescapáveis: Os preços vão subir. Os políticos vão saracotear.

Você, também, vai envelhecer.

Respeite os mais velhos.

E não espere que ninguém segure a sua barra.

Cuidado com os conselhos que comprar, mas seja paciente com aqueles que os oferecem.

Conselho é uma forma de nostalgia. Compartilhar conselhos é um jeito de pescar o passado do lixo,

esfregá-lo, repintar as partes feias e reciclar tudo por mais do que vale.

Mas, no filtro solar, acredite.

Letra de Pedro Bial

Dedico:

Aos meus Pais, Wanderley Rustiguel e Laúren Ap. Barbosa

Rustiguel, por estarem sempre comigo, pelo apoio, amor,

carinho, amizade.

A minha avó Therezinha e meu Irmão Wanderley Sammer

pelo amor e carinho.

Ao Luís Fernando. A. de Sousa pelo amor, respeito,

cumplicidade e dedicação.

Agradecimentos:

À Deus por estar sempre ao meu lado e por guiar meus

passos.

Ao orientador, Professor Luis Henrique, por acreditar em

mim, pelo apoio, e pelo conhecimento transmitido. Muito obrigada !

Ao Luís Fernando A. de Sousa, pela paciência, além de estar

sempre ao meu lado me apoiando e me incentivando nos momentos

difíceis.

À família Ozório por ter me auxiliado no início desta

jornada e à família Casa 13 -Pós-Graduação USP pelos momentos

de alegria, solidariedade e harmonia.

As minhas amigas de infância e todos os amigos que fiz

durante minha caminhada, agradeço pelo apoio e incentivo.

Aos amigos do Laboratório os quais foram, por todo o tempo

de desenvolvimento deste trabalho, companheiros, professores e

conselheiros.

Aos alunos de iniciação científica pelos momentos de

diversão.

À Simone por me transmitir paixão pela pesquisa e pelos

conselhos. Muito Obrigada!

À Marita por todas as palavras generosas e comidinhas

deliciosas !!

À Tatiane Beltramine (Taty Mel ) rsrsr!! Por compartilhar

comigo vários momentos. Muito obrigada principalmente pel0

companheirismo.

Aos técnicos Ricardo e Maurício pelo auxílio técnico e pela

amizade.

Aos professores da FFCL de Ituverava, pelos ensinamentos e

incentivos.

Aos professores Maria de Lourdes T. M. Polizeli, João Atílio

Jorge e Héctor Francisco Terenzi por todo o apoio e amizade.

À Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto,

local onde foi desenvolvido este trabalho.

À FAPESP pelo apoio financeiro.

À Todos aqueles que direta e indiretamente colaboram com a

realização deste trabalho.

Muito Obrigada !!!!!!!

xi

SUMÁRIO

ÍNDICE DE FIGURAS .......................................................................................................... xv

ÍNDICE DE TABELAS ......................................................................................................... xix

ABREVITURAS .................................................................................................................... xxi

RESUMO .............................................................................................................................. xxiii

ABSTRACT .......................................................................................................................... xxv

1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................. 29

1.1. FUNGOS FILAMENTOSOS ........................................................................................ 29

1.2 ENZIMAS ...................................................................................................................... 33

1.2.1 PRODUÇÃO DE ENZIMAS .............................................................................. 34

1.3 INVERTASES ............................................................................................................... 36

1.3.1 INVERTASES EM MICRORGANISMOS ....................................................... 39

1.3.1.1 INVERTSESE EM BACTÉRIAS ............................................................ 39

1.3.1.2 INVERTASE EM FUNGOS E LEVEDURAS ......................................... 40

1.4 APLICAÇÃO NA INDÚSTRIA .................................................................................... 43

2. OBJETIVOS ....................................................................................................................... 47

2.1. OBJETIVO GERAL ..................................................................................................... 47

2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ....................................................................................... 47

3. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................... 51 3.1 MICRORGANISMO ESTUDADO ............................................................................... 51

3.2 MANUTENÇÃO DA CEPA EM LABORATÓRIO .................................................... 51

3.3 OBTENÇÃO DAS CULTURAS EM FERMENTAÇÃO SUBMERSA ....................... 52

3.3.1 COMPOSIÇÃO DOS MEIOS DE CULTIVO .................................................... 52

3.3.1.1 MEIO SR ................................................................................................... 52

3.3.1.1.1 SOLUÇÕES DE SAIS DE SR [20X] .............................................. 52

3.3.1.2 MEIO ADAMS .......................................................................................... 53

3.3.1.3 MEIO KHANNA ....................................................................................... 53

3.3.1.3.1 SOLUÇÃO DE SAIS DE KHANNA .............................................. 53

xii

3.3.1.4 MEIO MÍNIMO DE VOGEL ................................................................... 54

3.3.1.4.1 SOLUÇÃO DE BIOTINA ............................................................... 54

3.3.1.4.2 SOLUÇÃO DE SAIS DE VOGEL .................................................. 54

3.4 OBTENÇÃO DAS CULTURAS EM FERMENTAÇÃO EM SUBSTRATO SÓLIDO ................................................................................................................................ 54

3.5 INFLUÊNCIA DA ADIÇÃO DE COMPOSTOS NA PRODUÇÃO DE INVERTASES EM FERMENTAÇÃO SUBMERSA ......................................................... 55

3.6 OBTENÇÃO DAS ENZIMAS INTRACELULARES E EXTRACELULARES .......... 55

3.6.1 FERMENTAÇÃO SUBMERSA (FSbm) ............................................................ 55

3.6.2 FERMENTAÇÃO EM SUBSTRATO SÓLIDO (FSS) ...................................... 56

3.7 DOSAGEM DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA ............................................................. 56

3.8 DOSAGEM DE PROTEÍNAS E CARBOIDRATOS .................................................... 57

3.9 DETERNIMAÇÃO DA TEMPERATURA E DO pH ÓTIMOS DE ATIVIDADE E TERMOESTABILIDADES E ESTABILIDADES AO pH ................................................. 57

3.10 INFLUÊNCIA DE DIFERENTES COMPOSTOS NA ATIVIDADE INVERTÁSICA .................................................................................................................... 58

3.11 PURIFICAÇÃO DAS INVERTASES INTRA E EXTRACELULAR ........................ 58

3.12 ELETROFORESE EM CONDIÇÕES NÃO DESNATURANTES ............................. 59

3.13 DETERMINAÇÃO DA MASSA MOLECULAR ....................................................... 59

3.14 HIDRÓLISE DE DIFERENTES SUBSTRATOS ........................................................ 60

3.15 ANÁLISE DOS PRODUTOS DE HIDRÓLISE POR TLC E HPLC .......................... 60

3.16 DERTERMINAÇÃO DOS PARÂMETROS CINÉTICOS (Kd e Vmax) .................... 61

3.17 DETERMINAÇÃO DO PONTO ISOELÉTRICO ....................................................... 61

3.18 ANÁLISE PROTÉICA POR ESPECTROMETRIA DE MASSA ............................... 62

4. RESULTADOS .................................................................................................................. 65

4.1 PRODUÇÃO DE INVERTASES EM FERMENTAÇÃO SUBMERSA ...................... 65

4.1.1 INFLUÊNCIA DA FONTE DE CARBONO NA PRODUÇÃO INVERTÁSICA ............................................................................................................ 66

4.1.2 PRODUÇÃO INVERTÁSICA EM FUNÇÃO DO TEMPO DE CULTIVO ..... 68

4.1.3 INFLUÊNCIA DA GLICOSE ADICIONADA AO MEIO DE CULTIVO NA PRODUÇÃO DE INVERTASES .......................................................................... 68

4.1.4 EFEITO DE DIFERENTES FONTES DE NITROGÊNIO E FOSFATO ADICIONADAS A FSbm NA PRODUÇÃO DE INVERTASES ............................... 70

4.2 PRODUÇÃO DE INVERTASES EM FERMENTAÇÃO SUBSTRATO SÓLIDO ..... 72

4.2.1 EFEITO DE FONTES DE CARBONO / SUBSTRATO NA PRODUÇÃO DE INVERTASES EM FSS ........................................................................................ 72

xiii

4.2.2 INFLUÊNCIA DE DIFERENTES SOLUÇÕES NA PRODUÇÃO DE INVERTASES .............................................................................................................. 73

4.2.3 PRODUÇÃO INVERTÁSICA EM FUNÇÃO DO TEMPO DE CULTIVO EM FSS ......................................................................................................................... 75

4.3 PURIFICAÇÃO DAS INVERTASES PRODUZIDAS EM FSbm ............................... 76

4.4 ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA ................................................ 79

4.5 DETERMINAÇÃO DA MASSA MOLECULAR ......................................................... 81

4.6 DETERMINAÇÃO DA TEMPERATURA ÓTIMA E pH ÓTIMO APARENTE DE ATIVIDADE PARA INVERTASES PRODUZIDAS POR A. phoenicis ........................... 83

4.7 ESTABILIDADE AO pH ............................................................................................... 85

4.8 DETERMINAÇÃO DA ESTABILIDADE .................................................................... 86

4.9 INFLUÊNCIA DE DIFERENTES COMPOSTOS NA ATIVIDADE INVERTÁSICA .................................................................................................................... 88

4.10 HIDRÓLISE DE DIFERENTES SUBSTRATOS ....................................................... 91

4.11 ANÁLISE DOS PRODUTOS DE HIDRÓLISE DA SACAROSE, INULINA E RAFINOSE ........................................................................................................................... 93

4.12 DETERMINAÇÃO DAS CONSTANTES CINÉTICAS Kd E Vmax ........................ 98

4.13 DETERMINAÇÃO DO PONTO ISOELÉTRICO .................................................... 100

4.14 ANÁLISE DOS FRAGMENTOS TRIPÍCOS DA INVERTASE EXTRACELULAR ............................................................................................................ 100

5. DISCUSSÃO E CONCLUSÃO ....................................................................................... 109

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................... 125

xv

ÍNDICE DE FIGURAS FIGURA.1 REPRESENTAÇÃO FILOGENÉTICA DO REINO FUNGI ....................................31

FIGURA.2 DIAGRAMA FILOGENÉTICO DE ASCOMICETOS ...............................................31

FIGURA 3. CICLO DE VIDA DE Aspergillus nidulans COM AS FASES SEXUAL,

ASSEXUAL E PARASSEXUAL ............................................................................................ 33

FIGURA 4. O MECANISMO DE REAÇÃO CATALISADA PELA INVERTASE ............. 37

FIGURA 5. MICROGRAFIA ELETRÔNICA DE VARREDURA DO CONIDIÓFORO

DO A. phoenicis CONTENDO OS CONIDIÓSPOROS ......................................................... 51

FIGURA 6. CRESCIMENTO E PRODUÇÃO DE INVERTASES INTRACELULAR E

EXTRACELULAR PELO A. phoenicis EM FUNÇÃO DO TEMPO DE CULTIVO ...............68

FIGURA 7. INFLUÊNCIA DE DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE PEPTONA

SULFATO DE AMÔNIO E FOSFATO NA PRODUÇÃO DE INVERTASES INTRA E

EXTRACELULAR POR A. phoenicis EM FSbm ................................................................... 71

FIGURA 8. INFLUÊNCIA DO TEMPO DE CULTIVO EM FSS NA SECREÇÃO DE

PROTEÍNAS E NA PRODUÇÃO DE INVERTASE POR A. phoenicis ................................ 76

FIGURA 9. PERFIS CROMATOGRÁFICOS EM COLUNA DE TROCA IÔNICA

DEAE-CELULOSE PARA AS INVERTASES INTRACELULAR E EXTRACELULAR

PRODUZIDAS EM FSbm POR A. phoenicis .......................................................................... 77

FIGURA 10. PERFIS CROMATOGRÁFICOS EM COLUNA DE EXCLUSÃO

MOLECULAR SEPHACRYL S-200 PARA AS INVERTASES INTRACELULAR E

EXTRACELULAR PRODUZIDAS EM FSbm POR A. phoenicis ......................................... 78

FIGURA 11. PERFIL ELETROFORÉTICO EM CONDIÇÕES NÃO

DESNATURANTES (PAGE 7%) PARA AS INVERTASES INTRACELULAR E

EXTRACELULAR CORADAS POR PRATA E PARA ATIVIDADE INVERTÁSICA ...... 80

FIGURA 12. DETERMINAÇÃO DA MASSA MOLECULAR NATIVA DAS

INVERTASES INTRA E EXTRACELULAR PRODUZIDAS POR A. phoenicis ................ 81

xvi

FIGURA 13. PERFIL ELETROFORÉTICO EM CONDIÇÕES DESNATURANTES

(SDS-PAGE 7%) PARA AS INVERTASES INTRACELULAR (raia 2) E

EXTRACELULAR (raia 3) ...................................................................................................... 82

FIGURA 14. DETERMINAÇÃO DA TEMPERATURA ÓTIMA APARENTE DE

ENSAIO E pH ÓTIMO APARENTE PARA AS INVERTASES PRODUZIDAS EM

FSbm E EM FSS ....................................................................................................................... 84

FIGURA 15. ESTABILIDADE AO pH DAS INVERTASES INTRACELULAR E

EXTRACELULAR PRODUZIDA EM FSbm E FSS ............................................................. 85

FIGURA 16. ESTABILIDADE TÉRMICA DAS INVERTASES INTRACELULAR E

EXTRACELULAR POR A. phoenicis ..................................................................................... 87

FIGURA 17. INFLUÊNCIA DE DIFERENTES CONCENTRAÇÕES AgNO3 SOBRE A

ATIVIDADE INVERTÁSICA INTRACELULAR E EXTRACELULAR PRODUZIDA

EM FSbm E EXTRACELULAR PRODUZIDA POR A. phoenicis ........................................ 90

FIGURA 18. CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA DOS PRODUTOS DE

HIDRÓLISE DA SACAROSE E DA RAFINOSE MEDIANTE AÇÃ ENZIMÁTICA DA

INVERTASE INTRACELULAR E EXTRACELULAR ........................................................ 94

FIGURA 19. PERFIL CROMATOGRÁFICO EM HPLC DOS PRODUTOS DE

HIDRÓLISE DA SACAROSE OBTIDOS PELA AÇÃO ENZIMÁTICA DA FORMA

EXTRACELULAR ................................................................................................................... 96

FIGURA 20. PERFIL CROMATOGRÁFICO EM HPLC DOS PRODUTOS DE

HIDRÓLISE DA RAFINOSE PELA AÇÃO DAS INVERTASES PURIFICADAS ............. 97

FIGURA 21. REPRESENTAÇÃO GRÁFICA SIGMOIDAL PARA A INVERTASE

INTRACELULAR E EXTRACELULAR NA AUSÊNCIA E NA PRESENÇA DE

AgNO3 ....................................................................................................................................... 99

FIGURA 22. DETERMINAÇÃO DO PONTO ISOELÉTRICO DAS INVERTASES

INTRACELULAR E EXTRACELULAR PRODUZIDA POR A. phoenicis ........................ 100

FIGURA 23. FINGERPRINT DE MASSA DOS PEPTÍDEOS TRIPÍTICOS DA

INVERTASE EXTRACELULAR PURIFICADA DE A. phoenicis ...................................... 101

xvii

FIGURA 24. DETERMINAÇÃO DOS RESÍDUOS DE AMINOÁCIDOS POR

ESPECTROMETRIA DE MASSA DE UM DOS PEPTÍDEOS TRIPÍTICOS (P1)

OBTIDOS PARA A INVERTASE EXTRACELULAR DE A. phoenicis ............................ 102







FIGURA 27. ALINHAMENTOS COM INVERTASE EXTRACELULAR DE A. niger E

OS FRAGMENTOS P1, P2 E P3 OBTIDOS PARA A INVERTASE EXTRACELULAR

DE A. niger ............................................................................................................................. 105

xix

ÍNDICE DE TABELAS

TABELA 1. DADOS BIOQUÍMICOS COMPARATIVOS DE INVERTASES

PRODUZIDAS POR FUNGOS E LEVEDURAS ................................................................... 43

TABELA 2. DADOS CINÉTICOS COMPARATIVOS DE INVERTASES

PRODUZIDAS POR FUNGOS E LEVEDURAS ................................................................... 43

TABELA 3. PRODUÇÃO DE INVERTASES INTRACELULAR E EXTRACELULAR

PELO FUNGO A. phoenicis EM DIFERRENTES MEIOS DE CULTIVO EM

CONDIÇÃO ESTACIONÁRIA OU SOB AGITAÇÃO ......................................................... 66

TABELA 4. INFLUÊNCIA DE DIFERENTES FONTES DE CARBONO NA

PRODUÇÃO DE INVERTASES PELO FUNGO A. phoenicis EM FSbm ............................ 67

TABELA 5. INFLUÊNICA DA ADIÇÃO DE GLICOSE E SACAROSE NA

PRODUÇÃO DE INVERTASES INTRACELULAR E EXTRACELULAR POR A.

phoenicis EM FSbm ................................................................................................................. 69

TABELA 6. INFLUÊNCIA DE DIFERENTES SUBSTRATOS/ FONTES DE

CARBONO NA PRODUÇÃO DE INVERTASES PELO FUNGO A. phoenicis EM FES .... 73

TABELA 7. INFLÊNCIA DE DIFERENTES SOLUÇÕES, ÁGUA DE TORNEIRA E

ÁGUA DESTILADA NA PRODUÇÃO DE INVERTASES PELO FUNGO A. phoenicis

FSS ........................................................................................................................................... 74

TABELA 8. EFEITO DE DIFERENTES PROPORÇÕES DE ÁGUA DE TORNEIRA

NA PRODUÇÃO DE INVERTASE POR A. phoenicis EM FSS ........................................... 75

TABELA 9. PURIFICAÇÃO DA INVERTASE INTRACELULAR PRODUZIDAS

PELO FUNGO A. phoenicis EM FSbm ................................................................................... 79

TABELA 10. PURIFICAÇÃO DA INVERTASE EXTRACELULAR PRODUZIDAS

PELO FUNGO A. phoenicis EM FSbm ................................................................................... 79

TABELA 11. INFLUÊNCIA DE DIFERENTES COMPOSTOS NA ATIVIDADE

INVERTÁSICA INTRACELULAR E EXTRACELULAR DE A. phoenicis......................... 89

xx

TABELA 12. HIDRÓLISE DE DIFERENTES SUBSTRATOS PELAS INVERTASES

PRODUZIDAS POR A. phoenicis EM FSbm .......................................................................... 92

TABELA 13. PARÂMETROS CINÉTICOS DAS INVERTASES PRODUZIDAS POR

A. phoenicis ............................................................................................................................... 98

TABELA 14. HOMOLOGIA ENTRE INVERTASE EXTRACELULAR DE A. phoenicis

E OUTRAS ENZIMAS MICROBIANAS ............................................................................. 106

xxi

ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

Atm.........................................................................Atmosfera ºC............................................................................Graus Celsius

cm...........................................................................Centímetros

Da...........................................................................Dalton DEAE.....................................................................Dietilaminoetil

DNS........................................................................Ácido 3’, 5’dinitrosalicílico EDTA.....................................................................Ácido etilrnodiaminotetracético FSbm......................................................................Fermentação submersa

FES.........................................................................Fermantação em extrato sólido

g..............................................................................Grama

g..............................................................................Aceleração da gravidade

h..............................................................................Hora

HPLC......................................................................Hight Performance Liquid Chromatography

kDa…......................................................................Kilo Dalton

Km...........................................................................Constante de Michaelis-Menten

L...............................................................................Litro

mg ...........................................................................Miligrama

min...........................................................................Minutos

mL............................................................................Mililitro

mM...........................................................................Milimolar

N...............................................................................Normal

nm.............................................................................Nanômetros

PAGE........................................................................Eletroforese em gel de poliacrilamida

PI...............................................................................Ponto isoelétrico

xxii

p/v.............................................................................Peso por volume

qsp.............................................................................Quantidade suficiente para SDS...........................................................................Dodecil sulfato de sódio

U...............................................................................Unidade enzimática µL.............................................................................Microlitro

µmols........................................................................Micromols

Vmáx .......................................................................Velocidade máxima

V/V...........................................................................Volume por volume

xxiii

RESUMO

Os microrganismos são importantes decompositores de matéria orgânica e por isso

reciclam elementos vitais através do uso de enzimas extracelulares, como celulases,

pectinases e invertases, entre outras. Neste contexto, os fungos filamentosos vêm atraindo

grande interesse como produtores de enzimas com potencial biotecnológico, destacando–se o

gênero Aspergillus. Este gênero pertence aos ascomicetos, que têm sido alvo de muitas

pesquisas para produção de diferentes enzimas, incluindo-se invertases.

Invertases (EC 3.2.1.26), também conhecidas como β-D-frutofuranosidases, tem

atraído grande interesse industrial. Esta enzima hidrolisa a sacarose levando a produção de

uma mistura de D-glicose e D-frutose, conhecida como açúcar invertido. A frutose é um

açúcar de interesse para a indústria de confeitaria, uma vez que apresenta uma constituição

líquida não cristalizável, podendo ainda ser utilizada como adoçante para diabéticos. Neste

contexto, o objetivo do presente trabalho foi investigar a produção de invertases por

Aspergillus phoenicis, purificando e caracterizando-as bioquimicamente. A purificação das

invertases do fungo Aspergillus phoenicis e a caracterização bioquímica forneceram dados

adicionais importantes para o entendimento da diversidade das propriedades destas enzimas,

para uma provável aplicação biotecnológica.

Entre os diferentes meios de cultura submersos testados, a maior produção invertásica

intracelular foi obtida em meio Vogel mantido em condição estacionária e a extracelular em

meio Khanna mantido sob agitação (100 rpm), ambos por 72h.

Uma vez que o meio Khanna foi selecionado para continuidade dos estudos, os

maiores níveis enzimáticos intra e extracelulares foram obtidos quando o meio foi adicionado

de rafinose e farelo de trigo como fonte de carbono, respectivamente. Adição suplementar de

nitrogênio favoreceu a atividade enzimática, ao passo que a adição de fosfato levou a uma

xxiv

diminuição. Quando adicionado 5% de glicose em meio submerso a produção invertásica foi

diminuída. Já para fermentação em substrato sólido a adição de solução de sais de Khanna

favoreceu a produção de invertases, mas a adição de água da torneira na proporção 1:0,5

(m\v) foi mais significativa com produção máxima em 72 horas usando farelo de soja como

fonte de carbono. A temperatura ótima de ensaio foi de 60-65°C para as invertases obtidas

em fermentação submersa e 55ºC para a obtida em fermentação em substrato sólido. Contudo,

a 65ºC as invertases intracelular e extracelular produzidas em FSbm tiveram uma meia vida

(t50) de 9 minutos e a forma extracelular produzida em FSS uma meia vida (t50) de 13

minutos. Quando armazenadas a 4ºC e -20ºC, ambas as formas enzimáticas mantiveram-se

estáveis por longos períodos. Já o pH ótimo de atividade foi 4,5 para ambas as formas intra e

extracelular, as quais mantiveram–se estáveis na faixa de pH de 4,5 a 7,0 por 1 hora.

As invertases intra e extracelular foram purificadas 18,19 vezes e 59,62 vezes,

respectivamente com recuperação de 24,36% e 7,46%. Ambas as enzimas são glicoproteínas com

massa molecular nativa de 131kDa e 158kDa respectivamente e pontos isoelétricos na faixa de

4,33 e 4,40. As atividades invertásicas intra e extracelular foram aumentadas na presença de Mn2+

e Na+, e Ag+. As invertases hidrolisaram sacarose, rafinose e inulina. Os valores de Vmax e Kd

com sacarose como substrato foram 124,9 U/mg e 22,55 mM para a forma intracelular e 954,6

U/mg e 59,89 mM para a extracelular, na ausência de AgNO3. Na presença de AgNO3, as

enzimas intra e extracelular tiveram Vmax de 152 U/mg e 1.234 U/mg, e Kd de 70,80 mM e

29,21 mM, respectivamente. Através de análise dos 3 fragmentos e comparação com as dados

disponíveis no banco de dados podemos afirmar que a enzima extracelular de A. phoenicis faz

parte da grande família das β-Fructosidades com certo grau de homologia com a invertase

extracelular de A. niger. Portanto A. phoenicis foi um bom produtor de invertases com elevada

temperatura de atividade e boa estabilidade térmica além de outras características distintivas como

ativação por prata, não observada anteriormente na literatura.

xxv

ABSTRACT

Microorganisms are important decompositors of organic compounds recycling vital

elements using extracellular enzymes as invertases, celulases and pectinases, among others. In

this context, the filamentous fungi have attracted great interest as producers of enzymes with

biotechnological potential, as for instance the genera Aspergillus. This genera belongs to the

Ascomycetes, that it has been objective of many studies of production of different enzymes,

including invertases.

Invertases (EC 3.2.1.26), also know as β-D-frutofuranosidases, have attracted great industrial

interest. This enzyme hydrolyzes the sucrose and produces a mixture of D-glucose and D-

frutose, known as inverted sugar. The fructose is a sugar of interest for the sweetener industry,

because it has a non liquid constitution crystallizable and can still be used as sweetener for

diabetic people. In this context, the aim of the present work was to investigate the invertases

production by Aspergillus phoenicis, purify and characterize these enzymes. The biochemical

characterization of the invertases from Aspergillus phoenicis can supply important additional

data for the understanding of the diversity of the properties of these enzymes. Among the all

submerged culture media tested, the highest production of intracellular invertase was obtained

in Vogel medium maintained in stationary condition and for the extracellular in Khanna

medium under orbital agitation (100 rpm), both for 72 hours. In addition, the highest levels of

intracellular enzyme were obtained with raffinose as carbon source and the extracellular form

with wheat bran, both in SbmF. The invertase production was favored by additional nitrogen

source, while the addition of phosphate source decreased the production. When 5% of glucose

was added in SbmF, the invertase production decreased. The invertase production in Solid-

State Fermentation was increased with Khanna salt solution, but the addition of faucet water

1:0.5; (w\v) was more significant with maximum production in 72 hours using soy bran as

xxvi

carbon source. The optima temperature of activity was 60-65°C for the invertases obtained in

SbmF and 55ºC for the extracellular form obtained it in SSF. However, the intracellular and

extracellular invertases produced in SbmF were stable at 60 ºC with half life (t50) of 9

minutes, while the extracellular form produced in SSF had half life (t50) of 13 minutes. The

invertases from A. phoenicis maintained their activities when storaged at 4 ºC and -20ºC for

long periods. The optimum pH of activity was 4.5 for both, intra and extracellular enzymes,

that stayed stable in a range of pH from 4.5 to 7.0 for 1 hour.

The invertases were purified 18.19 fold and 59.62 fold, with recuperation of 24,36%

and 7,46% for intra and extracellular enzymes, respectively. Both enzymes are glycoproteins

with native molecular mass of 131kDa and 158kDa, respectively and isoeletric point in range

of 4.40-4.33. The intra and extracellular invertase activities were increased in the presence of

Mn2+, Na+ and Ag+. The invertases hidrolyzed sucrose, raffinose and inulin. The Vmax and

Kd values with sucrose as substrate were 124.9 U/mg prot and 22.55mM for intracellular

form and 954.6 U/mg, and 59.89mM for extracellular enzyme, both without AgNO3.

However, in the presence of AgNO3 the intra and extracellular enzymes had Vmax of 152

U/mg and 1,234.0 U/mg, and Kd of 70.8 mM and 29,21 mM. The analyzes of the 3 peptides

and comparison with others data in the database we can affirm that the enzyme extracellular

of A. phoenicis is part of the great family of the β-Fructosidades with certain homology

degree with the extracellular invertase of A. niger. Henceforth, A. phoenicis was a good

producer of invertases with high temperature of activity, good thermal stability and other

important characteristics as activation by silver that was the first description in the literature.

29

1. INTRODUÇÃO

1.1 FUNGOS FILAMENTOSOS

Acredita-se que os primeiros fungos pertencentes ao reino Fungi tiveram sua origem no

período Pré–Cambriano. Atualmente de acordo com Raven et al.(2007) , estes organismos

podem ser divididos em quatro filos: Chytridiomycota, Zygomycota, Ascomycota e

Basidiomycota, sendo os dois últimos abrigados pelo subreino Dikarya (Figura 1), os quais

em geral, produzem dikarions (crozier), estruturas homólogas que permitem a troca de

núcleos. Tal característica permite visualizar estes dois filos como grupos irmãos, ambos

monofiléticos. É extremamente interessante a diversidade de ambos os filos, sendo que

existem aproximadamente 30.000 espécies descritas de basidiomicetos, o que equivale a 37%

das espécies conhecidas de fungos. Já os ascomicetos compreendem cerca de 32.300 espécies

descritas representando a maior parte do reino Fungi. Representantes de ambos os filos podem

ser encontrados em todos os continentes e em diversos ambientes, além de apresentar

importância econômica (BLACKWELL et al., 2008).

Entretanto, segundo Blackwell et al. (2008) os fungos podem ser separados em 10

filos os quais não possuem indícios de monofiletismo.

Os fungos conhecidos popularmente como quitrídeos parecem ser um grupo

parafilético baseado em fungos que retiveram o caráter de esporos flagelados. Neste caso são

propostos três filos de fungos flagelados (Blastocladiomycota, Chytridiomycota, e

Neocallimastigomycota) e dois gêneros de quitrídeos: Olpidium e Rozella, ambos com

posição filogenética incerta, sendo estes dois endoparasitas. Rozella aparece em uma posição

isolada na filogenia de fungos, pois é uma linhagem que divergiu muito antes do que as

outras. Em contraste, Olpidium brassicae parece ter divergido depois da maioria de quitrídeos

e está mais próximo de alguns fungos zigomicetos.

30

Já os fungos com hifas não septadas, ou hifas septadas irregularmente e esporos de

parede celular densa foram agrupados no filo Zygomycota, sendo subdividido em quatro

subfilos: Entomophthoromycotina, Kickxellomycotina, Mucoromycotina e Zoopagomycotina.

A separação dos fungos micorrízicos arbusculares no filo Glomeromycota foi proposta

anteriormente e este filo está mais próximo de Ascomycota e Basidiomycota do que de

Zigomycota (Figura 1) (BLACKWELL et al., 2008).

A classificação dos fungos vem sofrendo grandes alterações nos últimos anos como

por exemplo, os tricomicetos, habitantes de artrópodes que compartilham semelhanças com

zicomicetos. Entretanto estudos de filogenia molecular têm demonstrado que duas das quatro

ordens de tricomicetos são realmente membros do grupo protista Mesomycetozoea. Outros

organismos que eram anteriormente considerados fungos são atualmente classificados como

estraminófilos (Oomycota, Hyphochytriomycota, e Labyrinthulomycota) ou fungos limosos

(Myxomycota, Plasmodiomycota, Dictyosteliomycota, Acrasiomycota).

Por outro lado espécies anteriormente consideradas como protozoários, atualmente são

efetivamente classificadas como fungos. Por exemplo, a espécie Hyaloraphidium curvatum

foi considerada como sendo uma alga verde e agora no entanto é conhecida por ser um fungo

quitridiomiceto relacionado à Monoblephariomycetes.

Adicionalmente, uma das indagações mais interessantes dos estudos filogenéticos

aponta que os protozoários conhecidos como microsporídeos estão intimamente relacionados

com fungos e que possivelmente são derivados de Zygomycota. Microsporídeos são parasitas

intracelulares altamente especializados (principalmente de animais) que não têm

mitocôndrias, mas têm quitina e trealose em seus esporos (semelhantes aos fungos). Todos os

estudos moleculares têm demonstrado que os microsporídeos evoluíram em ritmo acelerado,

dificultando a sua colocação em uma árvore filogenética.

31

FIGURA 1. Representação filogenética do reino Fungi (Blackwell et al., 2008).

Entre todos os grupos fúngicos existentes, o filo Ascomycota tem chamado atenção

sob vários aspectos inclusive quanto à produção de biomoléculas como as enzimas.

Atualmente o filo Ascomicota está dividido em 6 subfilos os quais podem ser observados na

figura 2. Entre eles, Taphrinomycotina, Saccharomycotina e Pezizomycotina são provenientes

do período Pré-Devoniano, um pouco mais de 400 milhões de anos atrás. Algumas

estimativas porém, sugerem uma origem de Ascomycota de aproximadamente 727 milhões de

anos (Taylor et al.,2006).

FIGURA 2. Diagrama filogenético de Ascomicetos (TAYLOR et al., 2006).

Os ascomicetos são fungos filamentosos que atuam como decompositores de matéria

orgânica, reciclando elementos vitais através do uso de enzimas extracelulares, como

celulases (BAYER et al., 1998), pectinases (POLIZELI et al., 1991) e invertases (MONTIEL-

32

GONZALES et al., 2002). Eles são químio-heterotróficos, necessitando de componentes

orgânicos para energia e fonte de carbono.

Apresentam estruturas como o talo (corpo de um fungo filamentoso), que consiste de

hifas cenocíticas que podem ser apresentadas como células longas e contínuas, com muitos

núcleos ou apresentarem paredes cruzadas por septos os quais dividem as hifas em células

uninucleadas. Entretanto, existe um poro em cada septo que permite que o citoplasma e os

núcleos migrem entre as células. As hifas crescem por alongamentos das extremidades e cada

filamento que contém núcleos é capaz de crescer ou regenerar de algum dano. Em condições

favoráveis as hifas se desenvolvem originando uma massa filamentosa que recebe o nome de

micélio, visível a olho nú. As hifas podem ser vegetativas, as quais obtêm nutrientes ou

reprodutivas (aéreas), que produzem esporos (MICHAEL et al., 1996).

Os fungos filamentosos podem se reproduzir assexuadamente e sexuadamente

desenvolvendo sempre esporos. Estes podem ser sexuais ou assexuais, sendo que na Figura 3

está representado o ciclo de vida de Aspegillus nidulans, um ascomiceto.

Nos ascomicetos ocorre a presença de uma estrutura reprodutiva característica, o asco,

no qual são formados os ascósporos, geralmente em número de oito em cada asco. A

produção de esporos sexuais passa por três processos:

1. Um núcleo haplóide de uma célula doadora (+) penetra no citoplasma da célula

receptora (-);

2. Os núcleos (+) e (–) se fundem formando o núcleo zigoto diplóide;

3. Por meiose o núcleo diplóide origina um núcleo haplóide que é o esporo sexual.

33

FIGURA 3. Ciclo de vida de Aspergillus nidulans com as fases sexual (←), assexual (←) e

parassexual (←). Modificado de CASSELTON & ZOLAN, 2002.

1.2 ENZIMAS

Enzimas são macromoléculas importantes a qualquer ser vivo, pois tornam as reações

químicas mais rápidas mantendo e regulando os processos vitais. Elas atuam como

catalisadores biológicos de alta especificidade convertendo moléculas complexas em

moléculas simples sob condições favoráveis de pH, temperatura e concentração do substrato.

Em meados do século XX, com desenvolvimento tecnológico e científico na área da

Ascósporos

meiose

conidiósporos

Ascos

fusão

Hifa

Haplóide homozigose


cleistotecio Ascósporos

divisão mitótica

instável

heterozigose

fusão

Diplóide homorozigose


Ascósporos

Ascos

conidiósporos


Hifa ascógena

Meiose

34

bioquímica, iniciaram-se os processos de extração das enzimas a partir de células produtoras,

como de microrganismos, que têm a capacidade de produzir diversas enzimas que podem ser

aplicadas à vários processos industriais. Assim, as enzimas ganharam grande importância,

sendo comercializadas atualmente em escala industrial. No século 21 os catalisadores

biológicos têm alterado vários setores industriais, gerando melhorias e benefícios para a

humanidade, de tal forma que catalisadores químicos vêm sendo trocados por enzimas em

processos industriais, tendo em vista que elas desempenham as mesmas funções, mas com

várias vantagens, como por exemplo, não poluir o ambiente, além de reduzir gastos com

energia e tempo de produção (SAID & PIETRO, 2004).

As enzimas microbianas divergem das enzimas vegetais e animais, pois não dependem

diretamente do clima, já que podem ser produzidas em laboratório ou em indústrias onde se

controla todos os fatores que podem interferir na produção (SAID & PIETRO, 2004).

Assim como os extratos enzimáticos extraídos de vegetais, bactérias e animais, os de

fungos vêm sendo utilizados em diferentes processos industriais como fermentação,

panificação e elaboração de alimentos, remédios, bebidas alcoólicas e desenvolvimento de

rações. Antigas referências sobre a aplicação de enzimas nos processos industriais foram

encontradas em poemas épicos gregos de “A Ilíada” e “A Odisséia”, que datam do ano de IX

a.C (http://fomento.ugr.es/bioaset/segundodoc.htm). A escolha das enzimas a serem utilizadas

vai depender das necessidades da indústria e do tipo de produto que se quer produzir.

1.2.1 PRODUÇÃO DE ENZIMAS

A produção de enzimas por microrganismos pode ser realizada em fermentação

submersa (FSbm) ou em fermentação em substrato sólido (FSS), sendo que este último vêm

sendo utilizado amplamente para a obtenção de outros produtos como desentoxicadores

biológicos para resíduos agro-industriais, ácidos orgânicos, alcalóides, antibióticos, fatores de

35

crescimento para plantas, enriquecimento nutricional e produtos biofarmacêuticos. Este tipo

de fermentação tem chamado a atenção como uma nova opção para processos fermentativos

que não a fermentação submersa comum (PÉREZ-GUERRA et al., 2003).

Por definição, a fermentação em substrato sólido (FSS) é definida como o conjunto de

processos que permitem “o desenvolvimento de microorganismos (principalmente fungos) em

materiais sólidos úmidos na ausência de água livre”. Este processo tem sido aplicado na

produção de fármacos, alimentos e ração animal. Vários produtos agrícolas, tais como arroz,

trigo, cevada moída, grãos, feijão, milho, soja, bagaço de cana e centeio são utilizados como

substratos para a catálise das enzimas (PÉREZ-GUERRA et al., 2003).

Outra perspectiva é o de se utilizar o bagaço de cana, o resíduo agro-industrial mais

produzido no país, para produção enzimática (ORLANDO et al., 1994). Para cada tonelada de

cana-de-açúcar processada são gerados em média 230 Kg de bagaço. O baixo custo do bagaço

torna atrativo o uso desse material para produção de invertases, especialmente em processos

de conversão da sacarose quando conduzido em elevada pressão osmótica. Deve-se aproveitar

este resíduo agro-industrial para produzir invertases já que o país importa esta enzima

(SANTANA & SOUZA, 1984).

Pérez-Guerra et al. (2003), comparando resultados obtidos em fermentação submersa

(FSbm) e com fermentação em substrato sólido (FSS) mostraram que:

* Os rendimentos são semelhantes ou mais altos que os obtidos nas culturas submersas

correspondentes;

* A baixa disponibilidade de água reduz as possibilidades de contaminação por

bactérias e leveduras. Isto permite o trabalho em condições assépticas em alguns casos;

* As condições ambientais são semelhantes ao hábitat natural para os fungos, que

constituem o grupo principal de microorganismos usados em FSS;

36

* Os meios de cultura são freqüentemente bastante simples. O substrato normalmente

contém todos os nutrientes necessários para crescimento.

Entretanto, a FSS apresenta algumas desvantagens quando comparado a FSbm:

* Só podem ser utilizados microrganismos que conseguem crescer em níveis de baixa

umidade;

* Normalmente os substratos exigem pré-tratamento como redução de tamanho ou

mudança física, substância química e cozimento;

* Os substratos sólidos causam problemas no monitoramento de alguns parâmetros

físico-químicos como pH, umidade, oxigênio e concentração da biomassa, além de serem

difíceis de se determinar a biomassa.

Os microrganismos mais adaptados para FSS são os fungos filamentosos devido a sua

fisiologia e as propriedades bioquímicas. As hifas dos fungos filamentosos têm a capacidade

de penetrar nos substratos sólidos. Isto lhe proporciona vantagens sobre os microrganismos

unicelulares na colonização do substrato e no aproveitamento dos nutrientes disponíveis,

destacando sua capacidade de crescer sob baixo nível de umidade e em alta pressão osmótica

devido à grande concentração de nutrientes e a sua capacidade de aderência e percepção das

misturas de polissacarídeos diferentes (PÉREZ-GUERRA et al., 2003). Geralmente a FSS é

um processo mais barato e possui vantagens específicas sob a FSbm para a produção em larga

escala de bioprodutos (PÉREZ-GUERRA et al., 2003).

1.3 INVERTASES

Uma das primeiras carboidrases a ser estudada na história de enzimonologia foi à

invertase. Em 1828, identificou–se pela primeira vez sua atividade observando-se que a

levedura de panificação fermentava a sacarose em meio aquoso. A partir daí, a grande

quantidade de experimentos realizados sobre a invertase favoreceu seu uso como enzima

37

modelo para estudos de catálise enzimática. No século XX teve início a sua comercialização,

sendo uma enzima versátil que pode ser utilizada em diversos processos industriais (VITOLO

et al., 2004).

Também conhecida como β–D frutofuranosidase, a invertase hidrolisa a ligação

osídica (tipo α-β) de carboidratos possuidores de um radical β-fructofuranosil não substituído,

sendo a sacarose o substrato preferencial. O mecanismo de reação é baseado no esquema

abaixo (Figura 4).

FIGURA 4. Mecanismo de reação catalisada pela invertase.

Esta reação catalítica, geralmente ocorre em pH entre 4,6 e 5,0 e temperatura entre

35ºC e 50ºC, com concentração de substrato da ordem de 120g/l. Acima desta concentração a

solução de sacarose tem a viscosidade aumentada reduzindo a atividade enzimática na

presença de água (VITOLO et al., 2004). O produto final da hidrólise da sacarose são os

monossacarídeos glicose e frutose, onde a frutose pode ser utilizada como adoçante para

diabéticos, além da sua constituição líquida não cristalizável muito importante para

confeitarias.

Existem diferentes isoformas de invertases que diferem quanto ao seu pH ótimo de

atividade, podendo ser ácidas, neutras e alcalinas. As formas ácidas têm sido encontradas no

vacúolo, ao passo que as neutras e alcalinas no citoplasma. Estas diferenças não estão

sacarose glicose frutose

38

esclarecidas, mas parecem estar relacionadas com a entrada da sacarose em diferentes vias de

utilização (STURM & TANG 1999).

Atualmente as invertases estão incluídas na família GH32 das glicosidases, na qual são

encontrados 370 membros de origem vegetal, fúngica e bacteriana. Resíduos como aspartato

localizado na região N-terminal têm sido responsabilizados pelo mecanismo de

reconhecimento específico das glicosidases (ALBERTO et al., 2004).

Entre os vegetais as invertases têm sido encontradas em diversos representantes

atuando em diversos processos metabólicos podendo estar presente algumas isoformas. Sturm

& Tang (1999) conseguiram identificar três tipos de invertases: invertase ácida solúvel,

invertase I e invertase II, sendo que somente a primeira é de origem vacuolar (localização

simplástica), enquanto que as demais são apoplásticas, porém apresentando interações com a

parede celular em diferentes graus.

A invertase também influência no transporte do floema, pois ele transporta grande

quantidade de sacarose que é um ótimo substrato para invertase. Em órgãos com

descarregamento apoplástico, é necessário que a sacarose seja mantida em baixas

concentrações para que ocorra uma chegada contínua desses nutrientes às células receptoras.

As invertases e os carreadores de açúcares também podem funcionar como mecanismos de

recuperação de açúcares que se perdem para o apoplasto (PATRICK, 1997). O

descarregamento apoplástico é o acúmulo de açúcares solúveis reservado para situações

especiais, sendo comum em monocotiledôneas, órgãos de reserva que acumulam mono e

dissacarídeos ao invés de polímeros, frutos e em sementes em desenvolvimento (PERES,

2006).

39

1.3.1 INVERTASES EM MICRORGANISMOS

1.3.1.1 INVERTASE EM BACTÉRIAS

A atividade invertásica vem sendo estudada em procariotos como, por exemplo, em

cianobactéria, o que permitiu a descrição do primeiro isolamento e caracterização de

invertases (alcalina e neutra) neste grupo de organismos. Dois genes (invA e invB) foram

identificados em Anabaena sp. PCC 7120 e os produtos protéicos a partir desses genes foram

identificados e confirmados por estudos bioquímicos e imunológicos com proteínas

recombinantes (VARGAS et al., 2003).

A produção de invertases por bactérias tem sido também investigada. A β-

fructofuranosidase purificada de Lactobacillus reuteri CRL 1100, por exemplo, é composta

por uma única subunidade com massa molecular de 58 kDa sendo estável a temperaturas

menores que 45ºC. Possui pH ótimo de atividade entre 4,5 e 7,5, e atividade máxima a 37ºC

(GINÉS et al. 2000).

Já a linhagem de bacilos denominada YF43 estuda por Oda & Ito (2000), foi capaz de

se desenvolver em sacarose tão rapidamente quanto em glicose, sendo esta linhagem isolada

por mutação de Lactobacillus amylovorus JCM 1126, uma linhagem impermeável na

utilização de sacarose. A sacarose estimulou a produção de invertases pela linhagem YF43 e

JCM 1126 simultaneamente. Em meio contendo exclusivamente frutooligossacarídeos como

fonte de carbono, as células da linhagem YF43 mostraram alta atividade invertásica apesar de

um crescimento reduzido. As duas invertases produzidas nas células crescidas em sacarose e

frutooligossacarídeos eram β-D-fructofuranosidases idênticas (ODA & ITO, 2000).

Para Bifidobacterium infantis ATCC 15697 foi observada a presença de uma exo-

inulinase com atividade invertásica. Esta enzima monomérica possui massa molecular de 70

40

kDa com sua atividade ótima em pH 6,0, a 37ºC, sendo estável em temperaturas inferiores

55ºC (WARCHOL et al., 2002).

1.3.1.2 INVERTASE EM FUNGOS E LEVEDURAS

Desde sua descoberta em 1828, as invertases vêm sendo alvo de intensas investigações

principalmente aquelas obtidas a partir de microrganismos como a levedura Saccharomyces

cerevisiae (SHAFIQ et al., 2002), que é o microorganismo mais bem caracterizado quanto à

produção de invertase. Para esta levedura em especial, a invertase apresentou pH ótimo de

atividade entre 3,5 e 6,0, dependendo da concentração do substrato e dos tampões utilizados

(SIMIONESCU et al., 1987; WISEMAN & WOODWARD, 1975). De forma geral, a síntese

de invertases em leveduras é controlada por uma família de genes SUC os quais quando

expressos levam a síntese de invertases para a hidrólise da sacarose (PARRIZZI, 2006).

Segundo os trabalhos de Vitollo et al. (1989) e Perlman et al. (1981) as leveduras apresentam

duas formas enzimáticas, a forma localizada na parede celular e associada a manana

(carboidrato polimérico), e a forma intracelular localizada no citoplasma e não associada a

carboidrato polimérico. Porém, a enzima destinada a parede celular, apresenta uma sequência

de aminoácidos que as encaminha para o retículo endoplasmático, onde ocorre a glicosilação.

Após a invertase extracelular ser glicosilada ela é armazenada em vesículas no Complexo de

Golgi sendo finalmente liberada no espaço periplásmico durante a gemulação (reprodução

assexuada da levedura) (PERLMAN et al., 1981). Com relação a massa molecular destas

enzimas produzidas por leveduras foi descrito para Cândida utilis uma invertase composta

por duas subunidades com massa molecular de 150 kDa, sendo encontradas intra e

extracelularmente (BELCARZ et al., 2002).

Entre os microrganismos os fungos filamentosos têm se destacado quanto à produção

de enzimas de interesse industrial. Enzimas que possuam alta especificidade e que possam ser

41

usadas em pequenas quantidades são extremamente interessantes sob o ponto de vista

biotecnológico. Desta forma, a produção de invertases por fungos filamentosos também tem

sido investigada como, por exemplo, em Aspergillus niger (RASHID et al., 1998),

Aspergillus japonicus (CHENG et al., 2005), Aspergillus ochraceus (GUIMARÃES et al.,

2007), Rhodotorula glutinis (RUBIO et al., 2002) e Thermomyces lanuginosus

(CHAUDHURI et al., 1999).

Em cada microrganismo a produção da invertase apresenta suas particularidades, com

pequenas alterações na temperatura de incubação, pH do meio de cultivo, fonte de carbono,

influência de íons e curva de crescimento. Considerando as condições de cultivo, Chaudhuri

et al. (1999) observaram que a utilização de sacarose como fonte de carbono promoveu um

bom desenvolvimento do fungo T. lanuginosus e consequente aumento da produção

invertásica, chegando ao nível máximo entre 6 e 12 horas. Em A. japonicus, a invertase

estudada, apresentou pH ótimo e temperatura ótima de ensaio igual a 5,0 e 50ºC,

respectivamente (SU et al., 1991), diferindo do encontrado para a atividade invertásica em

Aspegillus sp. 27H, com pH ótimo de 4,0 e temperatura ótima de 55ºC (FERNÁNDEZ et al.,

2004). Resultados semelhantes foram encontrados por L´Hocine et al. (2000) para a enzima

de A. niger AS0023. Já para R. glutinis a atividade invertásica máxima foi em pH 4,5

mantendo-se estável nos pH 2,6 e 5,5, e em temperaturas entre 20ºC e 60ºC, sendo ativada

por Fe2+, K+, Co2+, Na+ e Cu2+ (RUBIO et al., 2002). Nos trabalhos de Guimarães et al.

(2007); (GUIMARÃES et al.,2009) a atividade invertásica máxima foi em pH 4,5 e na

temperatura de 60ºC, sendo ativada por Mn2+, Mg2+, Ba2+, Na+ e Cu2+. O fungo Alternaria sp.

(SANGALETTI et al., 2003) produziu invertase quando cultivado em meio semi-sólido.

Nestas condições o extrato enzimático bruto apresentou maior atividade em pH 5,0.

Segundo o trabalho de Rubio et al. (2006) o mecanismo de indução da síntese de

invertase em Aspergillus niger depende da interação da molécula de sacarose com o

42

respectivo receptor na membrana celular. Este contato geraria um sinal químico intracelular

amplificado via AMPc o qual dispararia a nível nuclear a síntese de RNAm a partir do DNA.

O RNAm formado seria então traduzido em invertase pela atividade dos ribossomos. A

invertase produzida é então secretada mais tarde para o espaço periplasmático, podendo ainda

ser detida na parede celular.

Com o fungo Cladosporium cladosporioides foram realizados estudos sobre auto-

imobilização da invertase, verificando-se que o valor de Km obtido para a enzima auto-

imobilizada é maior. Fato este que pode estar relacionado com a resistência ao transporte de

massa imposta pela estrutura celular, o que não ocorre com a invertase solúvel. Apesar das

limitações estruturais das células, esta atua como suporte de imobilização da enzima, que

parece melhorar a estabilidade operacional da invertase (SANGALETTI et al., 2003).

Para uma melhor visão do panorama atual do conhecimento sobre a produção e a

caracterização de invertases de fungos e leveduras, algumas propriedades bioquímicas foram

sumarizadas na tabela 1, assim como alguns parâmetros cinéticos na tabela 2.

43

TABELA 1. Dados bioquímicos comparativos de invertases produzidas por fungos e

leveduras.

Microrganismos Temperatura ºC pH Referência Aspergillus japonicus 50 5 SU et al., 1991 Aspegillus sp 27H 55 4 FERNÁDEZ et al., 2004 Aspergillus niger AS0023 55 4 L´HOCINE et al., 2000 Rhodotorula glutinis 60 4,5 RUBIO et al., 2002 Saccharomyces cerevisiae 30 3,5 e 6,0 SHAFIQ et al, 2002 Aspergillus ficuum 30 5 ETTALIBI et al., 1987 Thermomyces lanuginosus 50 6,5 CHAUDHURI et al., 1999 Aspergillus niveus 60 4,5 GUIMARÃES et al.,2009 Aureobasidium pullulans 30 5 YOSHIKAWA et al., 2007 Schwanniomyces occidentalis 45-55 5,5 A´LVARO-BENITO et al., 2007 Aspergillus ochraceus 60 4,5 GUIMARÃES et al., 2007 Rhodotorula glutinis 20-60 4,5 RUBIO et al., 2002 Aspergillus niger IMI 303386 50 6,5 NGUYEN et al., 1999 Candida utilis 60-65 3,5 e 7 CHÁVEZ et al., 1997

TABELA 2. Dados cinéticos comparativos de invertases produzidas por fungos e leveduras.

Microrganismos Parâmetros Cinéticos

Referência Km (mM) Vmax (U/mg protein) Aspergillus niveus 5.78 30.46 GUIMARÃES et al., 2009 Schwanniomyces occidentalis 4.9 * ÁLVARO-BENITO et al., 2007 Aspergillus ochraceus 7.37 22.39 GUIMARÃES et al., 2007 Rhodotorula glutinis 0.227 0.096 umol/min RUBIO et al., 2002 Aspergillus niger IMI 303386 * * NGUYEN et al., 1999 Candida utilis 11 * CHÁVEZ et al., 1997

1.4 APLICAÇÃO NA INDÚSTRIA

Industrialmente as enzimas podem ter várias aplicações como, por exemplo, o uso de

amilases (PEIXOTO et al., 2003), para diminuir a turbidez e clarificar sucos de frutas ou

produção de educorantes, a partir do amido e as proteases usadas como princípio ativo de

medicamentos digestivos e na fabricação de queijos (SAID & PIETRO, 2004). No caso das

invertases, grandes confeitarias utilizam-nas para hidrolisar a sacarose produzindo moléculas

44

de glicose e frutose (MONTIEL-GONZALES et al., 2002). A frutose é muito mais atrativa

para propósitos industriais que a sacarose, destacando-se sua constituição líquida e não

cristalizável. Também tem sido empregada no processo de fermentação do melaço da cana

para produção de etanol (SHAFIQ et al., 2002; ALBERTO et al., 2004).

As invertases podem ainda ser utilizadas para a produção de frutooligossacarídeos

(FOS) que são açúcares não metabolizados pelo organismo humano, não apresentando valor

calórico (MOLIS et al., 1996). São considerados prebióticos promovendo vários benefícios à

saúde humana, desde a redução de colesterol sérico até o auxílio na prevenção de alguns tipos

de câncer. Os FOS, principalmente de origem microbiana da fermentação de sacarose, têm

atraído atenção especial e são importantes principalmente por suas propriedades funcionais,

mais do que pela sua doçura (FERNÁNDEZ et al., 2004).

Bouhnik et al. (1996) demonstraram que a ingestão de FOS, em doses de 12,5g ao dia

por 3 dias (doses clinicamente toleradas), produziram efeitos significativos de queda na

contagem de anaeróbios totais nas fezes, queda de pH, atividade de nitroredutases,

azoredutases e beta glucoronidases, queda nas concentrações de bile ácida e esterol neutro,

levando ao aumento da colonização de bifidobactérias no trato digestivo. Além disso,

reduzem os níveis séricos de colesterol total e lipídeos (YAMASHITA et al., 1984;

MODLER et al., 1990; MODLER, 1994).

47

2. OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

O objetivo deste trabalho foi investigar a produção de invertases por Aspergillus

phoenicis em fermentação submersa e fermentação em substrato sólido, purificando e

caracterizando-as bioquimicamente.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Foram objetivos específicos deste trabalho:

Determinar e padronizar as melhores condições físico-químicas para a produção de

invertases;

Estabelecer as melhores condições de ensaio para atividade enzimática;

Comparar a produção invertásica em fermentação submersa e em fermentação em

substrato sólido;

Purificar e caracterizar bioquimicamente as invertases;

Determinar os parâmetros cinéticos, tais como Kd e Vmax para as enzimas

purificadas;

Analisar os produtos de hidrólise da sacarose, rafinose e inulina pela ação da

invertase;

Analisar comparativamente as propriedades bioquímicas das invertases purificadas

com as descritas na literatura;

Analisar os fragmentos tripíticos das invertases, comparando os com seqüências

disponíveis em bancos de dados, buscando-se uma provável homologia com enzimas

de outros microrganismos.

51

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1 MICRORGANISMO ESTUDADO

O fungo utilizado foi o Aspergillus phoenicis, obtido a partir de material em

decomposição, na região de Ribeirão Preto – São Paulo, sendo este identificado segundo a

descrição de RAPER & FENNELL (1965) e KLICH & PITT (1988). Na Figura 5 pode – se

observar os conidiósporos de A. phoenicis em microscopia eletrônica.

FIGURA 5. Micrografia eletrônica de varredura do conidióforo do Aspergillus phoenicis

contendo os conidiósporos. Fonte: RIZZATTI et al., 2004.

3.2 MANUTENÇÃO DA CEPA EM LABORATÓRIO

A cepa foi mantida no laboratório em meio sólido de aveia (4% aveia, 2% ágar), em

tubos de ensaios mantidos inclinados, previamente autoclavados por 15 minutos a 1,5 atm. Os

repiques foram realizados periodicamente de 20 a 30 dias, sendo mantidos em estufa à

temperatura de 30ºC durante uma semana, e posteriormente armazenados em geladeira a 4°C.

52

3.3 OBTENÇÃO DAS CULTURAS EM FERMENTAÇÃO SUBMERSA

As culturas em fermentação submersa foram obtidas a partir do inóculo de uma

suspensão de esporos (105 esporos/ml) obtida a partir da raspagem da cultura de Aspergillus

phoenicis em meio de aveia com o auxílio de uma alça de platina, sendo os esporos

ressuspensos em água destilada esterilizada. Foi inoculado 1 mL da suspensão em quatro

diferentes meios de cultivo, sendo eles: SR (RIZZATTI et al., 2001), Adams (ADAMS,

1990), Khanna (KHANNA et al., 1995) e Vogel (VOGEL, 1964), suplementados com

diferentes fontes de carbono (1% para fontes complexas e 2% para monossacarídeos).

Foram preparados 25mL de cada meio em frascos Erlenmeyer de 125mL sendo o pH

ajustado para 6,0. Os meios líquidos foram autoclavados durante 20 minutos a uma pressão de

1,5 atm e temperatura de 120ºC.

3.3.1 COMPOSIÇÃO DOS MEIOS DE CULTIVO

3.3.1.1 MEIO SR

Soluções de sais de SR [20x]..........................................................................................5,0mL

Peptona............................................................................................................................0,02g

Extrato de levedura..........................................................................................................0,45g

Fonte de carbono

Água destilada qsp...........................................................................................................100mL

3.3.1.1.1 SOLUÇÕES DE SAIS DE SR [20X]

MgSO4 . 7 H2O ................................................................................................................0,24g

KH2PO4.............................................................................................................................0,3g

NH4H2PO4.........................................................................................................................1,0g

Água destilada qsp............................................................................................................100mL

53

3.3.1.2 MEIO ADAMS

MgSO4. 7 H2O...................................................................................................................0,05g

Extrato de levedura............................................................................................................0,2g

KH2PO4..............................................................................................................................0,1g

Fonte de carbono

Água destilada qsp.............................................................................................................100mL

3.3.1.3 MEIO KHANNA

Solução de sais de Khanna [20x].......................................................................................5,0mL

Extrato de levedura............................................................................................................0,1g

Fonte de carbono


3.3.1.3.1 SOLUÇÃO DE SAIS DE KHANNA [20X]

NH4NO3..................................................................................................................................2,0g

KH2PO4 .................................................................................................................................1,3g

MgSO4.7 H2O ....................................................................................................................0,362g

KCl ....................................................................................................................................0,098g

ZnSO4.H2O.........................................................................................................................0,007g

MnSO4. H2O.....................................................................................................................0,0138g

FeCl3 .6H2O......................................................................................................................0,0066g

CuSO4. 5H2O ...................................................................................................................0,0062g


54

3.3.1.4 MEIO MÍNIMO DE VOGEL

Solução de biotina ............................................................................................................50,0µL

Soluções de Sais de Vogel [50x].......................................................................................2,0mL

Fonte de carbono


3.3.1.4.1 SOLUÇÃO DE BIOTINA

Biotina................................................................................................................................5mg

Etanol ( 50%).....................................................................................................................100mL

3.3.1.4.2 SOLUÇÃO DE SAIS DE VOGEL [50X]

Na3 C6H507. 5H2O................................................................................................................150g

NH4NO3................................................................................................................................100g

KH2PO4.................................................................................................................................250g

MgSO4 7 H2O........................................................................................................................10g

3.4 OBTENÇÃO DAS CULTURAS EM FERMENTAÇÃO EM SUBSTRATO SÓLIDO

As culturas em FSS foram obtidas mediante inóculo de uma solução de esporos (105

esporos/mL) em diferentes substratos / fontes de carbono (bagaço de cana, farelo de trigo,

farelo de soja, farinha de aveia, milho moído, farinha de centeio e palha de arroz) umedecidos

com diferentes soluções salinas (sais SR, sais de Khanna e sais de Vogel, como descrito

anteriormente), água destilada e água de torneira em diferentes proporções (0,5% a 5% p/v).

As culturas foram incubadas a 40ºC durante 72 horas, em estufa com umidade relativa ao

redor de 76%.

55

3.5 INFLUÊNCIA DE DIFERENTES COMPOSTOS NA PRODUÇÃO DE

INVERTASES EM FERMENTAÇÃO SUBMERSA

Os meios de cultivo foram suplementados com diferentes concentrações (0,5% a

5,0%) de uma fonte adicional de nitrogênio (peptona e sulfato de amônia), bem como uma

fonte adicional de fosfato (KH2PO4). Como controle foi usado meio de cultivo sem a adição

destes compostos.

Com o objetivo de se verificar a ocorrência ou não da repressão pela presença de

glicose no meio, o microrganismo em estudo foi inoculado em meio Khanna com farelo de

trigo como fonte de carbono (FSbm), acrescido de diferentes concentrações de glicose (0 a

5,0%; p/v), sendo incubados a 40ºC durante 72 horas.

3.6 OBTENÇÃO DAS ENZIMAS INTRACELULARES E EXTRACELULARES

3.6.1 FERMENTAÇÃO SUBMERSA (FSbm)

Após incubação as culturas foram filtradas a vácuo, obtendo–se um filtrado livre de

células chamado extrato bruto extracelular e a massa micelial, a qual foi lavada com dois

volumes de água destilada, prensada entre folhas de papel filtro, macerada e ressuspensa em

10mL de solução tampão acetato de sódio 50mM, pH 4,5. Essa suspensão foi centrifugada a

12.000g por 10 minutos, a 4°C. O sobrenadante contendo as enzimas intracelulares foi

separado e chamado de extrato bruto intracelular. Os extratos brutos contendo as enzimas

intracelulares e extracelulares foram dialisados em água destilada, durante 24 horas, a 4°C e

posteriormente utilizados no ensaio enzimático.

56

3.6.2 FERMENTAÇÃO EM SUBSTRATO SÓLIDO (FSS)

As culturas obtidas em FSS foram adicionadas de 50 mL de água destilada gelada,

sendo esta mistura mantida sob agitação com uma barra magnética por 30 minutos, a 40C.

Posteriormente, foram filtradas a vácuo em funil de Buchner, obtendo-se um filtrado livre de

células. O micélio com os resíduos utilizados como fontes de carbono foram descartados. O

filtrado foi dialisado em água destilada por 24h, a 4ºC e posteriormente, utilizado para a

determinação da atividade invertásica.

3.7 DOSAGEM DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA

A determinação da atividade enzimática sobre sacarose foi realizada através da

quantificação dos açúcares redutores formados durante a incubação da enzima com o

substrato (sacarose 1% em tampão acetato de sódio 100mM, pH 4,5). O reagente utilizado foi

o DNS (ácido 3’,5’-dinitrosalicílico) (MILLER, 1959).

A mistura de reação foi constituída de 200µL de uma solução de substrato e 200µL de

amostra enzimática. Após incubação da mistura de reação a 60°C, alíquotas de 100µL foram

retiradas nos tempos desejados e adicionadas em tubos contendo 100µL de DNS.

Posteriormente à coleta de todos os pontos, estes foram aquecidos em banho-maria

fervente por 5 minutos e após o resfriamento, adicionou-se 1mL de água destilada por tubo. O

branco consistiu de uma alíquota de 100µL da mistura de reação adicionada imediatamente a

100µL de DNS. Todos os experimentos foram realizados em duplicata.

O método foi previamente padronizado por uma curva de calibração de glicose (0,1 a

1,0 mg/mL) (ε = 0,018µmol mL-1 cm-1). As leituras foram realizadas a 540nm em

espectrofotômetro. Uma unidade de atividade (U) foi definida como a quantidade de enzima

que hidrolisa um µmol de substrato, por minuto, nas condições de ensaio. Para FSbm tem-se

U/mL e para a FSS, U/g de substrato. A atividade específica foi expressa em U / mg proteína.

57

3.8 DOSAGEM DE PROTEÍNAS E CARBOIDRATOS

As proteínas foram estimadas pelo método descrito por Lowry et al. (1951),

utilizando-se albumina de soro bovino como padrão (BSA).

A dosagem foi realizada com 50µL e 100µL da amostra enzimática, acrescida de

150µL e 100µL de água destilada, respectivamente, totalizando-se 200µL de solução final.

Posteriormente, acrescentou-se 1mL de uma solução, preparada no momento do uso,

composta de carbonato de sódio 2% (p/v) em NaOH 0,1N, sulfato de cobre 1% (p/v) e

tartarato de sódio e potássio 1% (p/v), na proporção de 100:1:1. Após 15 minutos,

acrescentou-se 100µL de Folin Ciocalteau em água destilada (1:1). Após 30 minutos foi feita

a leitura no espectrofotômetro a 660nm, sendo os resultados obtidos expressos em mg

proteína/mL.

O conteúdo de carboidratos das invertases purificadas intracelular e extracelular foi

estimado através da metodologia do fenol-sulfúrico de Dubbois et al. (1956), utilizando- se

manose como padrão. As amostras foram adicionadas de 10µL de fenol 80% e logo após de

1mL de ácido sulfúrico concentrado. Essa mistura foi deixada em repouso por 10 minutos em

gelo. Após este período, a reação foi colocada em banho maria em temperatura de 30ºC, por

um período de 15 minutos, em seguida foi feita a leitura da absorbância em 490nm.

3.9 DETERNIMAÇÃO DA TEMPERATURA E DO pH ÓTIMOS DE ATIVIDADE E

TERMOESTABILIDADES E ESTABILIDADES AO pH

Foram realizados ensaios em diferentes temperaturas (20ºC a 80ºC) e diferentes pH

(3,0 a 8,0) para definição da temperatura ótima e do melhor pH para a atividade invertásica,

respectivamente. Inicialmente utilizou-se tampão Mc Ilvaine, e posteriormente o tampão

específico acetato de sódio 100mM, pH 4,5.

58

Amostras enzimáticas foram previamente incubadas em diferentes temperaturas (50ºC,

60ºC, 65ºC e 70ºC) e diferentes pH (acetato de sódio 100mM, pH 3,5 e 4,5; tampão Mes 50

mM, pH 6,0; tampão Tris HCl 50mM, pH 7,0 e 8,0 e tampão CAPS 50 mM, pH 9,0 e 10,0)

por 1 hora e posteriormente utilizadas na reação enzimática para se avaliar a estabilidade

térmica e ao pH. Já para a escolha da melhor temperatura de armazenamento os extratos

enzimáticos foram mantidos em diferentes temperaturas (27ºC, 4ºC e – 20ºC) por até 200

horas, sendo retiradas alíquotas para dosagem enzimática por todo o período de análise.

3.10 INFLUÊNCIA DE DIFERENTES COMPOSTOS NA ATIVIDADE

INVERTÁSICA

A mistura de reação foi adicionada de diferentes compostos (HgCl2, NH4Cl, CaCl2,

BaCl2, AgNO3, AlCl3, CoCl2, FeSO4, KCl, KNO3, ZnCl2, Zn(NO3)2, EDTA, CuSO4, CuCl2,

NaCl, NaNO3, MgSO4, MnCl2 e MgCl2) em diferentes concentrações, sendo estas de 1 mM e

10 mM, a partir de uma solução estoque 100mM.

3.11 PURIFICAÇÃO DAS INVERTASES INTRA E EXTRACELULAR

Os procedimentos de purificação das invertases intracelular e extracelular produzidas por

A. phoenicis em FSbm foram similares iniciando-se pela precipitação do extrato bruto com sulfato

de amônio 45%. O precipitado foi ressuspenso em água destilada, dialisado contra tampão Tris-

HCl 10mM, pH 7,5, por 24 horas a 4ºC e posteriormente aplicado em coluna cromatográfica de

troca iônica DEAE-Celulose (10,0 x 2,0 cm) previamente equilibrada em tampão Tris-HCl

10mM, pH 7,5, sendo eluída pela aplicação de um gradiente contínuo de NaCl (0-1M) no mesmo

tampão. A coluna foi mantida a 28ºC e frações de 3mL foram coletadas, sendo a vazão mantida

em 1,9 mL/min. As frações que apresentaram atividade foram reunidas em um único pool o qual

foi dialisado contra água destilada por 24h, a 4ºC e posteriormente liofilizado. O conteúdo foi

59

então ressuspenso em solução tampão Tris-HCl 50mM pH 7,5 + NaCl 50 mM, e aplicado em

uma coluna cromatográfica de exclusão molecular Sephacryl S-200 (80,0 x 2,0 cm) previamente

equilibrada com tampão Tris-HCl 50mM pH 7,5 + NaCl 50 mM, sendo eluída neste mesmo

tampão. A coluna foi mantida a 4ºC e frações de 1mL foram coletadas, sendo a vazão mantida

em 0,38 mL/min. As frações que apresentaram atividade foram reunidas em único pool, o qual

foi dialisado contra água destilada por 24h, a 4ºC e posteriormente aplicado em eletroforese em

condições não desnaturantes e desnaturantes.

3.12 ELETROFORESE EM CONDIÇÕES NÃO DESNATURANTES

Amostras invertásicas intracelular e extracelular purificadas foram submetidas à

eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE 7%) de acordo com Davis (1964). A corrida

eletroforética foi realizada em tampão Tris-HCl 50mM, pH 8,9 + glicina 36mM, sendo a fonte

ajustada para 120V e 40mA, por um período de 2 horas. Após a corrida eletroforética o gel foi

retirado das placas e colocado em solução fixadora para revelação por prata segundo o

método descrito por Blum (Blum et al., 1987) ou então utilizado para determinação da

atividade invertásica em gel. Para determinação da atividade em gel, logo após a corrida o gel

foi lavado com tampão acetato de sódio 0,5M, pH 4,5 por 30 minutos e posteriormente lavado

mais 3 vezes tampão acetato de sódio 0,1M, pH 4,5 por 20 minutos cada vez. Após as

lavagens o gel foi incubado em banho-maria a 37ºC no escuro com uma solução contendo

0,2mg/mL de metil sulfato de fenazina, 0,4mg/mL de nitroblue tretazolium, 30 unidades/gel

de glicose oxidase e 1% de sacarose pelo tempo necessário para o surgimento da banda.

3.13 DETERMINÇÃO DA MASSA MOLECULAR

As massas moleculares nativas para as invertases intracelular e extracelular foram

estimadas por filtração em coluna cromatográfica Sephacryl-S200, utilizando-se como

60

padrões moleculares para cálculo da massa molecular: Álcool desidrogenase (150 kDa), BSA

(66 kDa), Ovoalbumina (43 kDa) e Anidrase carbônica (29 kDa).

As amostras invertásicas intracelular e extracelular purificadas foram submetida à

eletroforese em gel de poliacrilamida em condição desnaturante (SDS-PAGE 7%) de acordo

com Laemmli (1970). A corrida eletroforética foi realizada em tampão Tris-HCl 25mM, pH

8,9 + glicina 192mM + 0,1% SDS , sendo a fonte ajustada para 120V e 40 mA, por um

período de 2 horas. Foram utilizados os seguintes padrões moleculares para cálculo da massa

molecular: α 2-Macroglobulina (168 kDa), β-Galactosidase (112 kDa), Lactoferrina (91 kDa),

Piruvato quinase (67 kDa) e Dehidrogenase latica (36 kDa). Após a corrida eletroforética o

gel foi retirado das placas e colocado em solução fixadora para revelação por prata segundo o

método descrito por Blum (Blum et al., 1987).

3.14 HIDRÓLISE DE DIFERENTES SUBSTRATOS

A atividade hidrolítica das invertases intracelular e extracelular sobre inulina, rafinose

e sacarose foi determinada. As dosagens foram realizadas conforme descrito no item 3.8. Os

substratos utilizados estavam na concentração de 1% (p/v) em tampão acetato de sódio 100

mM, pH 4,5.

3.15 ANÁLISE DOS PRODUTOS DE HIDRÓLISE POR TLC E HPLC

Os produtos de hidrólise da sacarose, rafinose e inulina obtidos pela ação das

invertases, foram submetidos à cromatografia em placa delgada de sílica, cujas medidas

foram: 20x10cm. Utilizou-se como padrão sacarose, glicose, frutose, rafinose, inulina,

kestose, nistose, galactose e lactose a 1%. A solução para o desenvolvimento da

cromatografia continha butanol, etanol e água destilada na proporção de 5:3:2 (v/v/v). Após a

corrida e secagem completa das placas delgadas, revelou-se o cromatograma com solução

61

contendo orcinol 0,2% em ácido sulfúrico e metanol na proporção de 1:9(v/v), incubando-se

posteriormente a 100ºC para visualização dos “spots”.

Os produtos de hidrólise da sacarose e da rafinose obtidos pelas ações das invertases

foram submetidos a análise por HPLC equipado com uma coluna Shimadzu EC250/4.6

nucleosil-100.5 NH2 (30x0,75 cm) mantida a 60ºC. Soluções de sacarose, glicose, frutose,

kestose, nistose, rafinose, galactose e lactose foram utilizadas como padrões. Para

desenvolvimento da cromatografia utilizou uma solução de acetonitrila 82%.

3.16 DERTERMINAÇÃO DOS PARÂMETROS CINÉTICOS (Kd e Vmax)

A determinação dos parâmetros cinéticos Kd e Vmax para as enzimas purificadas foi

realizado utilizando-se sacarose (0,5mM- 300mM) como substrato na ausência ou na presença

de 1mM AgNO3. Os valores de Kd e Vmax foram calculados com o auxílio do programa

Computacional Sigraf (Leone et al., 1992).

3.17 DETERMINAÇÃO DO PONTO ISOELÉTRICO

Os pontos isoelétricos das invertases purificadas foram determinados em géis de

poliacrilamida de disco (0,5cm x 12 cm) de acordo com o método descrito por O´Farrel et al.

(1977) usando anfólitos com uma faixa de pH de 3 a 8 com concentração dos géis em 5%.

Foram preparados dois géis, sendo que em um a amostra purificada estava presente e em

outro tubo apenas água (controle). Após a focalização por 6 horas a 500V, o gel controle foi

fatiado em porções de 0,5cm, e cada porção foi imersa em 2,5mL de KCl (25mM), por uma

noite. Para determinação do gradiente de pH formado, foi feita a leitura do pH do anfólito

eluído de cada porção do gel controle em um potenciômetro.

Após a corrida os géis contendo as enzimas purificadas foram cortados em porções de

0,5cm, e cada porção foi imersa em 0,4 mL de solução tampão acetato de sódio 100 mM pH

62

4,5 adicionado de 1% de sacarose mantida por uma noite em banho Maria a 60ºC e

posteriormente quantificado os açúcares redutores formados.

3.18 ANÁLISE PROTÉICA POR ESPECTROMETRIA DE MASSA

Amostras purificadas das enzimas de interesse foram submetidas a eletroforese

conforme descrito no item 3.12. Após corrida eletroforética, o gel foi corado por Comassie

Brilliant Blue R-250. A banda protéica correspondente para cada enzima de interesse foi

recortada e submetida ao processo digestão “in situ” com tripsina, modificado a partir de

Shevchenko et al. (1996).

As bandas recortadas a partir dos géis obtidos foram lavadas com uma solução de

NH4HCO3 50mM contendo acetonitrila (ACN) 50% (1:1; v/v) até a remoção do corante,

sendo a primeira lavagem realizada “overnight”, a 4ºC e as demais em intervalos de 15

minutos em temperatura ambiente, intercalando-se agitação em “vortex”. Após total

descoloramento, os géis foram incubados com 100µl de ACN 100% por 20 minutos e

completamente secos em Speedvac (Savant Instrument, Farmingdale, NY). Em seguida, os

cristais obtidos foram rehidratados com aproximadamente 10µl de NH4HCO3 50mM

contendo 4µg de tripsina (Promega, Madison, WI). Após a rehidratação os géis foram

adicionados de 50-100µl de NH4HCO3 50mM, volume suficiente para cobrir o gel. A reação

foi mantida a 37ºC durante uma noite e interrompida pela adição de 10µl de ácido fórmico.

Os fragmentos polipeptídicos obtidos por digestão com a tripsina foram analisados por

espectrômetro de massa modelo Q-TOF (Quadrupole – Time of Flight) (Micromass,

Manchester, UK) de alta resolução com fonte de ionização eletrospray (ESI) operando em

modo positivo.

65

4. RESULTADOS

4.1 PRODUÇÃO DE INVERTASES EM FERMENTAÇÃO SUBMERSA

Para determinar as melhores condições de cultivo para a produção de invertases pelo

fungo A. phoenicis em fermentação submersa diversos meios de cultivo foram testados, tais

como SR, Adams, Khanna e Vogel, suplementados com farelo de trigo (1%) como fonte de

carbono, mantidos sob agitação ou em condição estacionária a 40ºC, por 72 horas.

Em todos os meios e condições analisados o fungo cresceu satisfatoriamente, sendo

que a maior produção invertásica total (intra + extracelular), foi obtida em meio Vogel e em

meio Khanna, em condição estacionária e agitação, respectivamente (Tabela 3). O maior nível

de atividade enzimática extracelular foi obtido em meio Khanna (9,61 U/mL) mantido sob

agitação, sendo seguido do meio SR (5,07 U/mL), na mesma condição. Quanto à atividade

invertásica intracelular esta foi maior quando o fungo foi crescido em meio Vogel (10,57

U/mL) mantido em condição estacionária, seguido pelo meio Adams (8,38 U/mL) na mesma

condição. Contudo, quando mantido sob agitação, o meio SR proporcionou uma maior

produção invertásica intracelular (8,98 U/mL) se comparada a condição estacionária (Tabela

3). Considerando-se o nível de atividade extracelular, o meio Khanna mantido sob agitação

foi selecionado para continuidade dos estudos.

66

TABELA 3. Produção de invertases intracelular e extracelular pelo fungo A. phoenicis em

diferentes meios de cultivo em condição estacionária ou sob agitação.

Atividade Invertásica (U/mL)

Meio de Estacionária Agitação

Cultivo Intra Extra Intra Extra

Adams 8,38 ± 4,61 3,40 ± 0,13 5,54 ± 0,98 2,92 ± 0,19

Khanna 4,96 ± 2,78 2,14 ± 0,03 7,93 ± 0,13 9,61 ± 0,27

SR 3,75 ± 2,07 1,33 ± 0,00 8,98 ± 0,33 5,07 ± 0,19

Vogel 10,57 ± 6,09 3,66 ± 0,41 3,61 ± 0,17 4,29 ± 0,39

As culturas foram mantidas à 40ºC por um período de 72 horas.

4.1.1 INFLUÊNCIA DA FONTE DE CARBONO NA PRODUÇÃO INVERTÁSICA

Na tabela 4 podemos observar a influência de diferentes fontes de carbono adicionadas

ao meio de cultivo na produção de invertases por A. phoenicis em fermentação submersa.

Considerando-se as diferentes fontes analisadas, o crescimento do fungo variou entre 0,02 e

0,49 mg de proteínas utilizando-se palha de arroz e aveia como fontes de carbono,

respectivamente. Quando crescido em meio suplementado com aveia, sacarose e amido foram

obtidos os maiores crescimentos (em média 0,41mg /mL) ao se comparar com o meio sem

fonte de carbono (0,13 mg/ mL). Já quando o meio foi adicionado de palha de arroz, farelo de

trigo e bagaço de cana, valores obtidos em relação ao controle foram menores.

Com relação à atividade invertásica total (intra + extracelular), pode-se afirmar que as

fontes de carbono que mais favoreceram a produção enzimática em relação ao controle foram

farelo de trigo (17,27 U/mL), rafinose (11,35 U/mL), bagaço de cana (9,48 U/mL) e aveia (9,05

U/mL) (Tabela 4). Na presença de glicose, palha de arroz, farinha de madioca, sacarose e amido

as atividades foram menores. Entretanto quando consideradas as atividades intracelular e

67

extracelular separadamente, rafinose e farelo de trigo foram as melhores fontes de carbono,

respectivamente. A atividade extracelular obtida em farelo de trigo foi aproximadamente 77 vezes

superior que na ausência de fonte de carbono e cerca de 10 vezes superior a obtida na presença de

sacarose. Quanto ao valor do pH final do cultivo, houve uma redução na presença de sacarídeos

como o amido, rafinose e glicose, variando entre 3,0 e 4,38. Para todas as outras fontes de

carbono testadas, houve aumento dos valores de pH final variando de 6,58 a 7,42 (Tabela 4).

Considerando-se a produção da forma extracelular, optamos por continuar nossos experimentos

utilizando-se farelo de trigo como fonte de carbono para FSbm.

TABELA 4. Influência de diferentes fontes de carbono na produção de invertases pelo fungo

A. phoenicis em FSbm.

Atividade Invertásica (U/mL) Proteína pH

Fonte de Intracelular Extracelular (mg /mL)

Carbono

Amido 2,29 ± 0,31 2,88 ± 0,59 0,32 4,30

Aveia 3,35 ± 0,31 5,70 ± 0,51 0,49 6,98

Bagaço de cana 5,16 ± 0,88 4,32 ± 1,00 0,09 6,95

Farelo de trigo 8,79 ± 1,14 8,48 ± 0,98 0,08 6,88

Farinha de mandioca 2,50 ± 0,35 1,07 ± 0,49 0,29 7,42

Glicose 0,11 ± 0,00 0,18 ± 0,08 0,27 4,38

Palha de arroz 1,07 ± 0,37 0,40 ± 0,00 0,02 6,96

Rafinose 10,37 ±0,26 0,98 ± 0,22 0,12 3,01

Sabugo 1,38 ± 0,18 3,87 ± 2,32 0,20 7,06

Sacarose 2,76 ± 0,45 0,81 ± 0,27 0,44 6,58

S / fonte de carbono 2,18 ± 0,20 0,11 ± 0,00 0,13 7,13

O microrganismo foi crescido em meio Khanna, mantido sob agitação (100rpm) durante 72 h, à 40ºC.

68

20 30 40 50 60 70 80 90 1000,20

0,22

0,24

0,26

0,28

0,30

0,32A

Prot

eina

(mg/

mL)

Tempo ( horas)

20 30 40 50 60 70 80 90 1000

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14 B

Ativ

idad

e in

vertá

sica

(U/m

L)

Tempo (horas)

4.1.2 PRODUÇÃO INVERTÁSICA EM FUNÇÃO DO TEMPO DE CULTIVO

Considerando-se o cultivo do microrganismo em meio Khanna com farelo de trigo como

fonte de carbono em diferentes períodos (24 – 96 h) e mantidos sob agitação orbital (100rpm) a 40

ºC, o crescimento máximo foi observado em 24h, diminuindo a seguir devido provavelmente, à

autólise das células fúngicas ou a exaustão dos nutrientes (Figura 6A). Quanto à atividade

invertásica, verificou-se que os níveis intracelulares foram máximos em 24 horas e os

extracelulares em 72 horas (Figura 6B) em FSbm. Assim sendo, de acordo com o resultado obtido

para a forma extracelular, foi padronizado o tempo de 72 horas para os cultivos subseqüentes.

FIGURA 6. Crescimento (A) e produção de invertases (B) intracelular (●) e extracelular (▄)

pelo A. phoenicis em função do tempo de cultivo.

4.1.3 INFLUÊNCIA DA GLICOSE ADICIONADA AO MEIO DE CULTIVO NA

PRODUÇÃO DE INVERTASES

Para verificar se a produção de invertases por A. phoenicis sofria repressão (regulação

negativa) ou não devido à presença de glicose, o fungo foi crescido em meio Khanna com

farelo de trigo como fonte de carbono principal e adicionado de glicose ou não.

69

A atividade invertásica intracelular não foi estimulada pela presença de glicose no

meio de cultura nas diferentes concentrações testadas, porém a suplementação com 1% de

sacarose elevou a atividade invertásica cerca de 27% quando comparada ao controle (Tabela

5). Na concentração de 2% de glicose a produção enzimática intracelular foi reprimida cerca

de 48,7% quando comparada ao valor obtido para o controle.

Resultados semelhantes foram obtidos para a invertase extracelular, que não foi

estimulada pela presença de glicose no meio de cultura. Com o aumento da concentração de

glicose utilizada, houve redução da produção e conseqüentemente da secreção da enzima,

sendo 51% do observado para o controle quando na concentração de 2%. No entanto a

produção enzimática com a suplementação do meio com 1% de sacarose foi semelhante ao

observado para o controle (farelo de trigo sem adição de glicose ou sacarose) (Tabela 5).

TABELA 5. Influência da adição de glicose e sacarose na produção de invertases intracelular

e extracelular por A. phoenicis em FSbm.

Fonte de Carbono Atividade Invertásica (U/mL)

Intra Extra

farelo de trigo 1% 4,19 ± 0,26 5,92 ±0,55

farelo de trigo 0,1% + 0,1% de glicose 3,55 ±0,31 6,56 ±1,23


farelo de trigo 0,1% + 0,5% de glicose 3,95 ± 0,42 4,27 ±0,68


farelo de trigo 0,1% + 1% de glicose 3,2 ±0,05 3,01 ±0,26



farelo de trigo 0,1% + 1% sacarose 5,33 ±0,24 5,7 ±0,71

O fungo foi crescido em meio Khanna, sob agitação orbital (100 rpm), a 40ºC, por 72h.

70

4.1.4 EFEITO DE DIFERENTES FONTES DE NITROGÊNIO E FOSFATO

ADICIONADAS A FSBM NA PRODUÇÃO DE INVERTASES

Ao suplementar o meio de cultivo com diferentes fontes de nitrogênio (peptona e

sulfato de amônio), em diferentes concentrações observou–se um aumento significativo das

atividades invertásicas intra e extracelular, quando comparado ao controle, considerando-se

principalmente o uso de uma fonte orgânica (peptona) (Figura 7A). Neste caso os maiores

níveis enzimáticos foram obtidos com a adição de 5% (m/v) de peptona sendo

aproximadamente 4,6 vezes e 2,2 vezes maior para a forma intracelular e extracelular,

respectivamente, se comparado ao controle. Quando utilizado sulfato de amônio, na

concentração de 0,5% (m/v), obtiveram-se os maiores níveis enzimáticos, diminuindo em

concentrações superiores (Figura 7B). Na figura 7C podemos observar a influência de

diferentes concentrações de fosfato (KH2PO4) na produção de invertases por A. phoenicis. A

medida que se aumenta a concentração de KH2PO4 ocorre um declínio significativo das

atividades invertásicas intracelular e extracelular, quando comparada ao controle, ressaltando–

se que a produção da forma extracelular, na concentração 5% de fosfato, teve uma diminuição

de 62% e a intracelular 43%.

71

FIGURA 7. Influência de diferentes concentrações de peptona (A) sulfato de amônio (B) e

fosfato (C) na produção de invertases intracelular (▄) e extracelular ( ▄ ) por A. phoenicis em

FSbm.

0 0,5 1 1,5 2 50

5

10

15

20B

Ativ

idad

e in

vert

ásic

a (U

/mL)

Sulfato de amônio (%)

0 0,5 1 1,5 2 50

5

10

15C

Ativ

idad

e in

vertá

sica

(U/m

L)

KH2PO4 (%)

0 0,5 1 1,5 2 50

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60A

Ativ

idad

e in

vert

ásic

a (U

/mL)

Peptona (%)

72

4.2 PRODUÇÃO DE INVERTASES EM FERMENTAÇÃO EM SUBSTRATO

SÓLIDO

4.2.1 EFEITO DE FONTES DE CARBONO/ SUBSTRATO NA PRODUÇÃO DE

INVERTASES EM FSS

Na tabela 6 podemos observar que a produção de invertases foi dependente do

substrato/ fonte de carbono empregada, sendo encontrada uma variação na quantidade de

proteínas secretadas na ordem de 2,30 a 12,76 mg/g de substrato.

Com relação à atividade invertásica extracelular, pode-se afirmar que os maiores

níveis enzimáticos foram obtidos com a utilização de misturas de duas fontes como a de

farelo de soja com farelo de trigo (566,43 U/g). Já quando consideramos uma única fonte, os

melhores resultados foram obtidos com farelo de soja (470,54 U/g). Na presença de milho

moído, farinha de centeio e bagaço de cana de açúcar as atividades foram cerca de 121, 29 e

26 vezes menores, respectivamente, se comparada ao farelo de soja (Tabela 6).

Para a continuidade dos estudos foi padronizada a utilização de farelo de soja como

substrato/ fonte de carbono, considerando-se não somente o nível enzimático, mas também a

maior facilidade para se purificar se comparada a condição em que o substratos são

misturados.

73

TABELA 6. Influência de diferentes substratos/ fontes de carbono na produção de invertases

pelo fungo A. phoenicis em FSS.

Atividade Invertásica

Tipos de Substrato Extracelular (U/g) Proteína (mg/g)

bagaço de cana de açúcar 18,00 ±0,00 4,95

farelo de aveia 21,34 ±0,03 2,37

farelo de soja 470,54 ±1,42 12,76

farelo de trigo 35,27 ±1,02 6,11

farinha de centeio 16,19 ±0,00 2,30

milho moído 3,88 ±0,08 6,19

palha de arroz 78,18 ±0,73 2,73

bagaço de cana de açúcar + farelo de soja 27,26 ±0,23 10,25

centeio + milho moído 79,70 ±1,13 4,75

farelo de soja+ farelo de trigo 566,43 ±2,72 11,41

milho moído + farelo de soja 456,43 ±1,36 10,75

palha de arroz + farelo de soja 64,79 ±1,02 10,49

As culturas foram mantidas em estufa à 40ºC com umidade relativa ao redor de 76% por um período de 72 horas.

4.2.2 INFLUÊNCIA DE DIFERENTES SOLUÇÕES NA PRODUÇÃO DE INVERTASES

Na tabela 7 pode se verificar a influência das diferentes soluções (sais SR, sais de

Khanna e sais de Vogel), água de torneira e água destilada utilizadas para umedecer o

substrato previamente sobre a produção enzimática. O fungo cresceu satisfatoriamente em

todas as condições analisadas. Porém a maior produtividade foi observada na presença de

água de torneira (207,19 U/g), sendo seguida pela solução de sais de Khanna (188,55 U/g) e

74

de sais SR (182,52 U/g). Padronizou-se, portanto, a utilização de água de torneira para

seqüência dos experimentos.

TABELA 7. Influência de diferentes soluções água de torneira e água destilada na produção

de invertases pelo fungo A. phoenicis FSS.

Tipos de

Soluções (1:1 m/v)

Atividade Invertásica Proteína

(U/g) (mg/g)

Água de torneira 207,19 ±0,24 10,15

Água destilada 79,47 ±1,74 9,25

Khanna 188,55 ±0,41 8,55

SR 182,52 ±0,41 7,20

Vogel 23,63 ±0,24 7,58

As culturas foram mantidas em estufa à 40ºC com umidade relativa ao redor de 76% por um período de 72 horas.

Considerando que a maior produção enzimática foi obtida em farelo de soja

umedecido com água de torneira, a melhor proporção (m/v) entre material sólido e líquido foi

definida. Na tabela 8 podemos verificar que os maiores níveis enzimáticos foram obtidos nas

culturas umedecidas na proporção de 1:0,5 (m/v), com 184,14 U/g. Também é notável que

quanto maior a umidade do meio de cultivo, menor a atividade enzimática, representando uma

queda de 14,31% na proporção 1:4 (m/v).

Para continuidade do estudo padronizou-se o cultivo em estado sólido com farelo de

soja umedecido com água de torneira (1:0,5; m/v), mantido em estufa a 40ºC, com umidade

relativa ao redor de 76%.

75

TABELA 8. Efeito de diferentes proporções de água de torneira na produção de invertases

por A. phoenicis em FSS.

Proporção

(m/v)

Atividade

(U/g)

AE

mg/g

1:0,5 184,14 ±0,24 20,39

1:1 89,74 ±4,32 3,76

1:2 25,76 ±0,08 0,64

1:3 27,42 ±0,83 0,85

1:4 26,39 ±0,41 0,68

As culturas foram incubadas a 40ºC durante 72 horas, em estufa com umidade relativa ao redor de 76%, AE= atividade específica.

4.2.3 PRODUÇÃO INVERTÁSICA EM FUNÇÃO DO TEMPO DE CULTIVO EM FSS

Em FSS o microrganismo foi cultivado em farelo de soja umedecido com água de

torneira (1:0,5; m/v) por diferentes períodos (24 – 96 h) em estufa à 40 ºC com umidade

relativa ao redor de 76%.

Nota - se que a produção invertásica pelo fungo estudado foi ascendente até 72h,

sendo que após este período ocorreu uma queda da atividade ao redor de 29% (Figura 8B). No

entanto, nessa condição, o maior nível de secreção protéica foi observado em 48h, diminuindo

a seguir, devido possivelmente a ação de proteases também secretadas (Figura 8A).

76

FIGURA 8. Influência do tempo de cultivo em FSS na secreção de proteínas (A) e na

produção de invertase (B) por A. phoenicis.

4.3 PURIFICAÇÃO DAS INVERTASES PRODUZIDAS EM FSbm

Na figura 9 podemos observar o perfil cromatográfico em DEAE-Celulose para

invertase intracelular (A) e extracelular (B) produzidas em FSbm. As formas intra e

extracelular interagiram com a resina, sendo eluídas como única forma com 205 mM e 90

mM de NaCl, respectivamente.

Para cada procedimento realizado separadamente, as frações que apresentaram atividade

invertásica foram reunidas em um único pool, o qual foi dialisado “overnight” contra água

destilada a 4ºC, liofilizado e posteriormente aplicado em coluna de exclusão molecular Sephacryl

S-200. Cada uma das formas enzimáticas foi eluída, com o mesmo tampão, como um único pico

de atividade como pode ser observado nos perfis cromatográficos mostrados na figura 10 para a

forma intra (A) e extracelular (B). Para cada procedimento as frações com atividade invertásica

foram reunidas em um único “pool” o qual foi dialisado contra água destilada “overnight” e

posteriormente empregado para estudos de caracterização bioquímica.

20 30 40 50 60 70 80 90 100

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24A

Prot

eína

(mg/

g)

Tempo (horas)20 30 40 50 60 70 80 90 100

0

100

200

300

400

500B

Ativ

idad

e in

vert

ásic

a( U

/g)

Tempo ( horas)

77

FIGURA 9. Perfis cromatográficos em coluna de troca iônica DEAE-Celulose para as

invertases intracelular (A) e extracelular (B) produzidas em FSbm por A. phoenicis.

0 50 100 1500,0

0,5

1,0

1,5

2,0B

Fração nº

Abs.

280

nm

0

10

20

30

40

NaC

l (0-

1M) Atividade invertásica (U

/mL)

0 50 100 150 200 2500,0

0,5

1,0

1,5

2,0

Fração nº

Abs.

280

nm

0

10

20

30

40

50AN

aCl (

0-1M

)

Atividade invertásica (U/m

L)

78

FIGURA 10. Perfis cromatográficos em coluna de exclusão molecular Sephacryl S-200 para

as invertases intracelular (A) e extracelular (B) produzidas em FSbm por A. phoenicis.

0 50 100 150 200 2500,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

A

Fração nº

Abs.

280

nm

0

5

10

15

20

25

Atividade invertásica (U/mL)

0 50 100 150 200 2500,00

0,05

0,10

0,15

0,20

B

Fração n°

Abs.

280

nm

0

5

10

15

20

25

Atividade invertásica ( U/m

L)

79

Nestas condições a invertase intracelular foi purificada 18,19 vezes com recuperação

de 24,36% (Tabela 9) e a extracelular 59,62 vezes com recuperação de 7,46% (Tabela 10).

TABELA 9. Purificação da invertase intracelular produzida pelo fungo A. phoenicis em

FSbm.

Volume

(mL) Proteína

(mg Totais) Atividade (U Totais)

AE (U/mg prot)

Rendimento (%)

Fator de Purificação (X)

Extrato bruto 224 24,64 806,4 32,72 100 1

Deae-Celulose 26 8,58 872,56 101,69 108,20 3,1

Sephacryl S200 8,7 0,33 196,44 595,27 24,36 18,19

TABELA 10. Purificação da invertase extracelular produzida pelo fungo A. phoenicis em

FSbm.

Volume

(mL) Proteína

(mg Totais) Atividade (U Totais)

AE (U/mg prot)

Rendimento (%)

Fator de Purificação

(X)

Extrato bruto 170 117,30 1.705,10 14,53 100 1

Deae – Celulose 67 31,49 1.271,66 40,38 74,57 2,78

Sephacryl S200 17 0,714 127,26 866,42 7,46 59,62

4.4 ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA

Na figura 11 podemos observar o perfil eletroforético em condições não desnaturantes

(PAGE 7%) para as invertases intracelular (A) e extracelular (B) purificadas reveladas por

prata (raia 1) e para atividade invertásica (raia 2). Em todos os perfis obtidos pode-se notar

uma única banda protéica para a qual corresponde uma única banda de atividade com

migração eletroforética semelhante.

80

FIGURA 11. Perfil eletroforético em condições não desnaturantes (PAGE 7%) para as

invertases intracelular (A) e extracelular (B) coradas por prata (raia 1) e para atividade

invertásica (raia 2).

1 2 1 2

A B

81

4.5 DETERMINAÇÃO DA MASSA MOLECULAR

A massa molecular nativa para as enzimas intracelular e extracelular foi determinada em

coluna cromatográfica de exclusão molecular Sephacryl-S200 como descrito anteriormente.

Ambas as enzimas são glicoproteínas, sendo que a invertase intracelular apresentou massa

molecular de 131kDa e a extracelular de 155kDa (Figura12), com conteúdo de carboidratos

de 2,14% e 1,64%, respectivamente. Em adição, o perfil eletroforético em condições

desnaturantes (SDS-PAGE 7%) para ambas as formas enzimáticas purificadas pode ser

visualizado na figura 13. Neste caso, obteve-se uma única banda protéica para as formas intra

e extracelular com massa molecular aproximadamente de 70 kDa e 79 kDa, respectivamente,

o que nos leva a inferir estruturas homodiméricas para ambas as formas enzimáticas.

FIGURA 12. Determinação da massa molecular nativa das invertases intra e extracelular

produzidas por A. phoenicis. Marcadores: anidrase carbônica (29kDa), ovolabumina (43 kDa),

BSA (66kDa) e álcool desidrogenase (150kDA).

1,15 1,20 1,25 1,30 1,35 1,40 1,451,4

1,5

1,6

1,7

1,8

1,9

2,0

2,1

2,2Inv Intra 131kDa

Inv Extra155kDa

Log

PM

Ve/Vo

150kDa

66kDa

43kDa

29kDa

82

FIGURA 13. Perfil eletroforético em condições desnaturantes (SDS-PAGE 7%) para as

invertases intracelular (raia 2) e extracelular (raia3). Marcadores (raia 1).

168 kDa α 2-Macroglobulina

Inv Extra79 kDa

67 kDa Piruvato quinase

91 kDa Lactoferrina 112 kDa β-Galactosidase

Inv Intra 70 kDa

1 2 3

36 kDa Dehidrogenase latica

83

4.6 DETERMINAÇÃO DA TEMPERATURA ÓTIMA E pH ÓTIMO APARENTE DE

ATIVIDADE PARA INVERTASES PRODUZIDAS POR A. phoenicis

Na figura 14 podemos observar que a temperatura ótima de atividade (A) para a

invertase intracelular foi de 65ºC e para a forma extracelular de 60ºC, assim como pH ótimo

de atividade (B), sendo este igual a 4,5 para ambas as formas enzimáticas. Valores de

temperatura e pH inferiores ou superiores levam as decréscimo da atividade invertásica de

ambas as formas.

Já a atividade invertásica extracelular obtida em FSS (extrato bruto) foi maior à

temperatura de 55ºC, verificando-se um decréscimo significativo da atividade enzimática à

60ºC (Figura 14C). Como ilustrado na figura 14B, esta forma enzimática apresentou pH ótimo

aparente de atividade igual a 4,5, sendo que em pH superiores, estas diminuem

gradativamente chegando praticamente a zero quando em pH 8,0.

As enzimas produzidas tanto em FSbm quanto em FSS apresentaram uma faixa de

temperatura ótima de ensaio entre 55ºC e 65Cº, no entanto o pH ótimo de ensaio foi o mesmo

para as 3 formas invertásicas.

84

FIGURA 14. Determinação da temperatura ótima aparente de ensaio (A e C) e pH ótimo

aparente (B e D) para as invertases produzidas em FSbm (A e B) e em FSS (C e D). símbolos

intracelular ( ▄ ) e extracelular ( ▄ ).

20 30 40 50 60 70 800

20

40

60

80

100A

Ativ

idad

e in

vertá

sica

rela

tiva

(%)

Temperatura (ºC)3 4 5 6 7 8

0

20

40

60

80

100 B

Ativ

idad

e in

vert

ásic

a re

lativ

a (%

)

pH

30 40 50 60 70 80

20

40

60

80

100C

Ativ

idad

e in

vertá

sica

rela

tiva

(%)

Temperatura (°C)3 4 5 6 7 8

0

20

40

60

80

100 D

ativ

idad

e in

vert

ásic

a re

lativ

a (%

)

pH

85

4.7 ESTABILIDADE AO pH

Na figura 15 podemos observar que a invertase intracelular manteve-se estável por

uma hora quando mantida em uma faixa de pH de 3,5 a 7,0. Já as formas extracelulares

(FSbm e FSS) mantiveram-se estáveis na faixa de pH de 4,5 a 8,0 durante 1 hora. Em pHs

superiores as enzimas perderam parcialmente suas atividades.

FIGURA 15. Estabilidade ao pH das invertases intracelular (█) e extracelulares produzidas

em FSbm (●) e FSS (▲).

3 4 5 6 7 8 9 10 1110

100

Log

Ativ

idad

e in

vertá

sica

resi

dual

(%)

pH

86

4.8 DETERMINAÇÃO DA ESTABILIDADE TÉRMICA

Analisando-se a figura 16A podemos observar que a invertase intracelular de A.

phoenicis manteve-se relativamente estável a 50ºC, por 60 minutos, ao passo que a 60ºC

ocorre uma pequena redução desta estabilidade, com t50 de aproximadamente 9 minutos a

65ºC e 3,5 minutos a 70ºC. A estabilidade à temperatura da forma extracelular foi similar a

intracelular, inclusive no que se refere ao tempo de meia vida nas temperaturas de 65ºC e

70ºC (Figura 16 B). Estes resultados são bastante satisfatórios, pois ambas as invertases

testadas nas temperaturas de 50ºC e 60ºC foram termoestáveis.

Em adição a forma intracelular (Figura 16 C) manteve-se ativa quando armazenada a

4ºC e a -20ºC, durante um período de até 175 horas, contudo quando mantida a 27ºC

permaneceu ativa por um período de no máximo 50 horas. Quanto à atividade invertásica

extracelular (Figura 16 D), a enzima também se manteve ativa quando armazenada em baixas

temperaturas (4ºC e -20ºC), por todo o período analisado, sendo que a 27ºC a enzima não

suportou mais que 45 horas.

87

FIGURA 16. Estabilidade térmica das invertases intracelular (A e C) e extracelular (B e D)

por A. phoenicis. Símbolos: -20ºC (▄), 4ºC (▄), 27ºC (▄), 50ºC (○), 60ºC (●), 65ºC (●) e

70ºC (○).

0 10 20 30 40 50 600

20

40

60

80

100

A

Ativ

idad

e in

vertá

sica

rela

tiva

(%)

Tempo (minutos)

0 10 20 30 40 50 60

0

20

40

60

80

100

120B

Ativ

idad

e in

vertá

sica

rela

tiva

(%)

Tempo (minutos)

0 50 100 150 200

0

20

40

60

80

100

120

140C

Ativ

idad

e in

vert

ásic

a re

dusi

dual

(%)

Tempo (horas)

0 50 100 150 200

0

20

40

60

80

100

120D

Ativ

idad

e in

vertá

sica

resi

dual

(%)

Tempo (horas)

88

4.9 INFLUÊNCIA DE DIFERENTES COMPOSTOS NA ATIVIDADE INVERTÁSICA

Na tabela 11 podemos observar a influência de diferentes compostos sobre a atividade

invertásica intracelular e extracelular de A. phoenicis. Quando considerada a atividade

invertásica intracelular, Mn2+ e Cu2+ promoveram os maiores aumentos da mesma, na ordem

de 177,83 à 104,54%, quando usados em baixas concentrações (1mM). A atividade

enzimática também foi incrementada pela presença de Ca2+, Mg2+ e Na+, bem como por

EDTA. Em altas concentrações (10mM) apenas Ag+ promoveu aumento de atividade

significativo.

Quanto à atividade invertásica extracelular (FSbm), pode-se observar que apenas Ag+

e K+ promoveram aumento significativo tanto em baixas como em altas concentrações. De

modo geral as maiores inibições foram observadas na presença de Hg2+ e Fe+. Considerando-

se a ativação obtida na presença de Ag+, na figura 17 podemos observar a influência de

diferentes concentrações deste íon sobre a atividade invertásica intra e extracelular produzidas

por A. phoenicis. Os maiores níveis de atividade para ambas as formas enzimáticas foram

obtidos nas concentrações de 40 mM.

89

TABELA 11. Influência de diferentes compostos na atividade invertásica intracelular e

extracelular de A. phoenicis.

Atividade Invertásica Relativa (%)

Compostos Intracelular Extracelular

1mM 10mM 1mM 10mM

AgNO3 94,28 ±4,31 191,56 ±5,35 118,68 ±1,07 196,26 ±1,02

AlCl3 97,26 ±5,27 78,17 ±0,66 86,43 ±5,49 109,34 ± 3,25

BaCl2 51,05 ±3,53 48,94 ±7,25 48,94 ±1,08 41,01 ±1,11

CaCl2 186,09 ±2,15 37,60 ±1,28 37,60 ±2,78 30,31 ±4,83

CoCl2 82,13 ±6,10 83,39 ±2,05 104,13 ±1,79 94,78 ±0,68

CuCl2 204,54 ±7,83 26,20 ±4,23 26,20 ±0,55 13,88 ±3,52

CuSO4 200,57 ±8,19 60,85 ±0,02 60,85 ±0,56 22,80 ±6,20

EDTA 189,81 ±6,10 78,02 ±0,51 78,02 ±1,15 78,98 ±1,84

FeSO4 37,45 ±2,68 18,60 ±3,23 0,00 ±0,00 60,37 ±1,01

HgCl2 63,61 ±5,79 4,61 ±1,95 57,96 ±5,77 0,00 ±0,00

KCl 92,80 ±0,24 86,60 ±3,79 140,58 ±4,24 132,25 ±1,46

KNO3 103,00 ±0,01 103,00 ±0,80 108,00 ±1,22 95,00 ± 0,75

MgCl2 193,20 ±2,97 87,25 ±5,47 87,25 ±2,18 64,84 ±1,21

MgSO4 200,12 ± 6,46 34,40 ±6,84 34,40 ±0,94 28,91 ±6,29

MnCl2 277,83 ±7,42 82,31 ±1,79 82,31 ±1,39 41,28 ±1,48

NaCl 200,96 ±7,80 84,68 ±6,73 84,68 ±2,24 43,82 ±5,73

NaNO3 104,00 ±0,05 91,91 ±0,21 102,00 ±0,20 100,00 ±0,10

NH4Cl 85,39 ±2,23 30,10 ±1,55 30,10 ±1,17 23,56 ±0,52

ZnCl2 86,49 ±4,24 82,38 ±1,79 99,64 ±2,00 99,34 ±0,23

Zn(No3)2 83,00 ±7,64 56,00 ±4,77 85,00 ±4,80 79,00 ±2,28 ausente 100,00 ±2,18 100,00 ±2,18 100,00 ±0,08 100,00 ±0,08 O fungo foi crescido em meio Khanna com farelo de trigo como fonte de carbono, sob agitação orbital (100 rpm) a 40ºC, por 72 horas.

90

FIGURA 17. Influência de diferentes concentrações AgNO3 sobre a atividade invertásica

intracelular (A) e extracelular (B) produzida por A. phoenicis.

0 10 20 30 40 50 60

100

150

200

250

300

350A

Ativ

idad

e R

eala

tiva

(%)

AgNo3 (mM)10 20 30 40 50 60

50

75

100

125

150B

Ativ

idad

e R

elat

iva

(%)

AgNo3 (mM)

91

4.10 HIDRÓLISE DE DIFERENTES SUBSTRATOS

Na tabela 12 podemos observar que as invertases produzidas por A. phoenicis foram

capazes de hidrolisar tanto sacarose quanto inulina e rafinose.

A enzima intracelular apresentou maior atividade na hidrólise da sacarose com 34,19

U/mL, sendo que as hidrólises da inulina e rafinose foram equivalentes a 16,49% e 30,27%,

respectivamente, se comparadas à taxa de hidrólise da sacarose. A invertase extracelular

proveniente da FSbm apresentou maior atividade quando utilizada sacarose como substrato

(24,31 U/mL). Contudo, também hidrolisou os substratos inulina e rafinose, apresentando

19,66% e 32,58% da atividade observada para a hidrólise da sacarose. As enzimas também

foram capazes de hidrolisar as diferentes misturas entre os substratos. Entretanto, nenhum dos

valores encontrados nesta situação superou os valores observados para a sacarose em

separado. Adicionalmente, os valores obtidos para a razão entre a hidrólise da sacarose sobre

a hidrólise da inulina (S/I) foram de 6,17 U/mL e 5,08 U/mL para as formas intra e

extracelular.

92

TABELA 12. Hidrólise de diferentes substratos pelas invertases produzidas por A. phoenicis

em FSbm

Atividade invertásica (U/mL)

Substratos Intracelular Extracelular

Sacarose 34,19±1,66 24,31±3,66

Inulina 5,64±0,00 4,78 ±0,67

Rafinose 10,35±2,00 7,92 ± 3,66

Sacarose + Inulina 23,21±2,33 17,01±0,67

Sacarose + Rafinose 21,64±0,00 5,56±0,92

Inulina + Rafinose 9,09±1,33 7,84±0,58

Sacarose + Inulina + Rafinose 19,76±0,00 15,68±1,41

O fungo foi crescido em meio Khanna com farelo de trigo como fonte de carbono, sob agitação orbital (100rpm) a 40ºC, por 72h.

93

4.11 ANÁLISE DOS PRODUTOS DE HIDRÓLISE

A análise dos produtos de hidrólise da sacarose, inulina e rafinose pela ação das

invertases intracelular e extracelular foi realizada em cromatografia de placa delgada (TLC) e

também por cromatografia líquida de alta afinidade (HPLC). Como podemos verificar na

figura 18, glicose e frutose foram obtidas como produtos de hidrólise da sacarose, mediante

análise em TLC, tanto para a ação da enzima intracelular como para a extracelular, não sendo

observada nenhuma atividade de transfructosilação uma vez que “spots” corresponde a

frutooligossacarídeos não foram observados.

Já Na figura 18 C, podemos observar claramente a formação de lactose no período de

24h de reação mediante ação enzimática da forma intracelular sobre rafinose. Já para a forma

extracelular (figura 18 D), no mesmo período de reação, verificamos “spots” correspondentes

aos produtos glicose e frutose. Entretanto, placas cromatográficas para os produtos de

hidrólise da inulina não foram obtidas satisfatoriamente.

94

FIGURA 18. Cromatografia em camada delgada dos produtos de hidrólise da sacarose (A e

B) e da rafinose (C e D) mediante ação enzimática da invertase intracelular (A e C),

extracelular (B e D). A reação foi conduzida a 60°C por diferentes períodos. Siglas: rafinose

(R), sacarose (S), glicose (G), frutose (F), galactose (Ga) e lactose (La).

A B

4 16 24h 0 GF S 4 16 0 GF S 24h

D

R Ga La G F 0h 5h 24h R Ga La S G F 0h 5h 24h

C

0

95

Em análise feita por HPLC, os produtos de hidrólise da sacarose encontrados pela ação

da invertase extracelular bruta, como podemos observar na figura 19, foram glicose e frutose.

Entretanto, a presença de nistose também foi detectada, assinalando uma possível atividade de

transfructosilação. Contudo ao realizamos uma a mesma análise para uma reação conduzida

com a enzima purificada, apenas picos correspondentes a glicose e frutose foram obtidos, não

havendo nenhum sinal correspondente ao oligossacarídeo.

Na análise feita por HPLC, os produtos de hidrólise da rafinose encontrados pela ação

catalítica da invertase intracelular foram frutose, galactose e lactose como podemos observar

na figura 20 B. Contudo, ao realizar uma a mesma análise para uma reação utilizando a forma

extracelular, os produtos formados foram frutose, galactose, lactose e sacarose (Figura 20 C).

96

0 2 4 6 8 10 12 14

0,0

0,1

0,2

0,3

saca

rose

Volts

Tempo de retenção(Minutos)

0 2 4 6 8 10 12 14

0,0

0,1

0,2

0,3

frutos

e

glico

se

Volts

Tempo de retenção (Minutos)

0 2 4 6 8 10 12 14

0,0

0,1

0,2

0,3

nistose

saca

rose

frutos

eglic

ose

Volts

Tempo de retençao (Minutos)

FIGURA 19. Perfil cromatográfico em HPLC dos produtos de hidrólise da sacarose (20%)

obtidos pela ação enzimática da forma extracelular. A reação foi conduzida a 60ºC por 24

horas. (A) mistura de reação adicionada de enzima inativa, (B) e (C) mistura de reação com

enzima ativa bruta e purificada, respectivamente.

A

C

B

97

0 2 4 6 8 10 12 14

0,00

0,01

0,02

0,03

rafinose

Volts

Tempo de rentenção (Minutos)

0 2 4 6 8 10 12 14

0,00

0,01

0,02

0,03

rafinose

lactose

sacarose

glicose galactose

frutose

Volts

Tempo de retenção (Minutos)

0 2 4 6 8 10 12 14

0,00

0,01

0,02

0,03

rafinose

lactosegalactose

frutose

Volts

Tempo de renteção (Minutos)

FIGURA 20. Perfil cromatográfico em HPLC dos produtos de hidrólise da rafinose (1%) pela

ação das invertases purificadas. A reação foi conduzida por 24 horas a 60°C. Controle (A),

intracelular (B) e extracelular (C).

A

B

C

98

4.12 DETERMINAÇÃO DAS CONSTANTES CINÉTICAS Kd E Vmax

A determinação dos parâmetros cinéticos das invertases produzidas em FSbm e

purificadas foram realizadas utilizando sacarose (0,1mM a 300mM) como substrato e

adicionadas de 1mM de AgNO3, ou não. Ambas as formas enzimáticas apresentaram

comportamento alostérico como pode ser visualizado através das representações gráficas

sigmoidais (Figuras 21). Como pode ser observado na tabela 13, a invertase intracelular teve

Vmax= 124,90 U/mg e Kd= 22,55 mM ao passo que a invertase extracelular teve Vmax=

954,60 U/mg e Kd= 59,89 mM, ambas na ausência de Ag+ . Quando utilizado 1mM de

AgNO3 na reação os valores de Vmax e Kd para a forma intra e extracelular foram de 152,00

U/mg e Kd = 70,80 mM e 1.234,00 U/mg e Kd = 29,21 mM, respectivamente.

TABELA 13. Parâmetros cinéticos das invertases produzidas por A. phoenicis.

Intracelular Extracelular

Parâmetros -Ag+ Ag+ -Ag+ Ag+

Vmax (U/mg) 124,90 152,00 954,60 1.234,0

Kd (mM) 22,55 70,80 59,89 29,21

Vmax/Kd (U/mg mM-1) 5,00 2,00 16,00 42,00

n 0,69 0,87 0,86 1,10

Os valores expressos referen-se as médias de 3 experimentos independestes

99

FIGURA 21. Representação gráfica sigmoidal para invertase intracelular (A e C) e

extracelular (B e D) na ausência (A e B) e na presença de AgNO3 (C e D).

-1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0D

V/Vm

ax

Log sacarose (mM)

-0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,50,0

0,2

0,4

0,6

0,8A

V

/ Vm

ax

Log sacarose ( mM )-1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0B

V / V

max

Log sacarose (mM)

-1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0-0,1

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8 C

V/Vm

ax

Log sacarose (mM)

100

0 2 4 6 8 10 12 14 16 180

2

4

6

8A

Frações do gel (0,5 cm)

pH

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

2,0

DO 540 nm

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

4

6

8

Frações do gel (0,5cm)

pH

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

2,0B

DO

540 nM

4.13 DETERMINAÇÃO DO PONTO ISOELÉTRICO

O ponto isoelétrico das invertases intra e extracelular foi determinado por focalização

isoelétrica em gel de poliacrilamida, conforme descrito no item 3.19.

Na figura 22, podemos observar que o ponto isoelétrico para as formas intracelular e

extracelular foram 4,40 e 4,33, respectivamente.

FIGURA 22. Determinação do ponto isoelétrico das invertases intracelular (A) e extracelular

(B) produzidas por A. phoenicis.

4.14 ANÁLISE DOS FRAGMENTOS TRIPÍCOS DA INVERTASE EXTRACELULAR

A análise dos fragmentos peptídicos da invertase extracelular produzida por A. phoenicis

gerados pela digestão com tripsina foi realizada por espectrometria de massa, como pode ser

verificado na figura 23, obtendo-se desta forma 6 peptídeos, dos quais foi possível a dedução

em composição de aminoácidos de apenas 3 peptídeos (P1,P2 e P3), para os quais são

apresentados os fingerprints e os respectivos resíduos de aminoácidos (figuras 24, 25 e 26).

As sequências de aminoácidos obtidos para os fragmentos foram comparadas com sequências

101

disponíveis em banco de dados. De forma geral, os fragmentos analisados foram homólogos a

β-xylanases e glucoamilases de diferentes fungos, como Aspergillus e Penicillium como

observado na tabela 14.

FIGURA 23. Fingerprint de massa dos peptídeos tripíticos da invertase extracelular

purificada de A. phoenicis.

102

FIGURA 24. Determinação dos resíduos de aminoácidos por espectrometria de massa de um

dos peptídeos tripíticos (P1) obtidos para a invertase extracelular de A. phoenicis.

103



104



105

Contudo, um alinhamento parcial foi obtido também entre os peptídeos obtidos para a

enzima de A. phoenicis e a invertase extracelular de A. niger (Figura 27).

(ATLDSWLSNEATVAR) MKLQTASVLLGSAAAASPSMQTRASVVIDYNVAPPNLSTLPNGSLFETWRPRAHVLPPNG -------------------------------------------ATLDSW------LSNEA 11 : :::* *. :. QIGDPCLHYTDPSTGLFHVGFLHDGSGISSATTDDLATYKDLNQGNQVIVPGGINDPVAV TVAR-------------------------------------------------------- :.

(AWFAVDGYGDVPSK) YWEFLGQWWHEPTNSTWGNGTWAGRWAFNFETGNVFSLDEYGYNPHGQIFSTIGTEGSDQ 300 ---------------AW------------------FAVDGYG----------------D- 10 :* *::* ** * PVVPQLTSIHDMLWVSGNVSRNGSVSFTPNMAGFLDWGFSSYAAAGKVLPSTSLPSTKSG 360 --VP---------------SK--------------------------------------- 14 ** *:

( LYINDYNLDSASYAK) SAEAGKLRLFDVLNGGEQAIETLDLTLVVDNSVLEIYANGRFALSTWVRSWYANSTNISF 600 -----------------------------------LYIN-DYNLDS---ASYAK------ 15 :* * : *.: : **: FQNGVGGVAFSNVTVSEGLYDAWPDRQS 628 ----------------------------

FIGURA 27. Alinhamentos com invertase extracelular de A. niger e os fragmentos P1, P2 e

P3 obtidos para a invertase extracelular de A. niger.

15

60

120

106

TABELA 14. Homologia entre invertase extracelular de A. phoenicis e outras enzimas

microbianas.

Obs: abreviações (DB:ID) identificação das enzimas em banco de dados, (Tam.) tamanho, (Ident.) identidade, (Simil.) similaridade.

DB:ID Fonte Tam. Ident. Simil.

109

5. DISCUSSÃO E CONCLUSÃO

Os fungos, de um modo especial têm se tornado muito interessantes como fontes de

biomoléculas para os processos biotecnológicos, pois têm grande capacidade de produzir

enzimas, além de servir de modelo para estudo do metabolismo em eucariotos. Sabe-se que

são poucos os estudos e registros na literatura referentes aos fungos do Estado de São Paulo.

Aproveitando a diversidade de fungos filamentosos que nosso laboratório coletou em várias

regiões deste Estado, o fungo termotolerante A. phoenicis, selecionado entre outros, foi um

bom produtor de invertases. A maior atividade invertásica intracelular foi obtida quando o

fungo foi crescido em meio Vogel a 40ºC mantido em condição estacionária, em comparação

com a extracelular, para a qual os melhores resultados foram obtidos em meio Khanna,

mantido em agitação a 40ºC ambos por 72h. Considerando a produção enzimática total

(intracelular e extracelular) em condição estacionária e sob agitação, as maiores atividades

invertásicas foram obtidas nos meios Vogel e Khanna, respectivamente. Silva & Peralta

(1988), o meio Khanna também favoreceu a produção de invertase para A. ochraceus

(GUIMARÃES et al., 2007) e A. niveus (GUIMARÃES et al., 2009). Observaram que o meio

Vogel favoreceu a produção de amilases por A. fumigatus (SILVA et al., 1988). Entretanto,

considerando – se a produção invertásica extracelular, foi padronizada a utilização do meio

Khanna sob agitação para continuidade dos estudos, uma vez que este favoreceu a secreção da

invertase para o meio de cultivo. Já para fermentação em substrato sólido a maior atividade

invertásica foi obtida quando utilizado farelo de soja como substrato umedecido com água de

torneira (1:0,5 m/v) e crescido em estufa a 40º C, com umidade relativa ao redor de 76%, por

72h. Água de torneira provavelmente apresenta alguns compostos que supriram alguma

necessidade nutricional do microrganismo favorecendo seu metabolismo e conseqüentemente

a produção enzimática.

110

Muitos elementos e fatores afetam o desenvolvimento do microrganismo e

consequentemente a produção de uma determinada enzima. Alguns parâmetros poderiam ser

citados como a composição do meio de cultivo, o pH, a temperatura, as fontes de carbono,

nitrogênio e fósforo, entre outros. Foi relatado que as fontes de carbono e de nitrogênio

interferem na produção e na secreção de amilases (CEREIA et al., 2000), invertases (SHAFIQ

et al.,2002) e de outras enzimas. Desta forma, considerando-se a fonte de carbono utilizada os

maiores níveis de atividade invertásica intracelular foram encontrados para o meio contendo

rafinose sendo seguido pelo meio com farelo de trigo. A atividade invertásica extracelular em

FSbm foi maior quando o meio foi suplementado com farelo de trigo como fonte de carbono,

diferindo do verificado para a invertase extracelular produzida em FSS, com maior atividade

obtida em uma mistura de farelo de soja e farelo de trigo. Para o fungo Alternaria sp. a

melhor condição para produção de invertase foi obtida quando utilizada a FSS com farelo de

trigo como fonte de carbono (SANGALETTI et al., 2003). Algumas fontes de carbono

utilizadas são resíduos agroindustriais e estes vem recebendo grande atenção no meio

científico e industrial. Estes resíduos geralmente não têm destino certo para serem

desprezados e acabam poluindo o meio ambiente, já que pode apresentar metais pesados.

Interessantemente alguns destes resíduos, principalmente os proveniente de vegetais,

apresentam grandes vantagens quando utilizados para o cultivo de microrganismos como por

exemplo: reduzir os custos de produção, favorecer o crescimento do microrganismo e a

produção de enzimas. Os resíduos são constituídos de vários nutrientes importantes como

carboidratos, lipídios, alguns minerais e vitaminas. A farinha de mandioca, soro de queijo,

melaço de cana, farinha de trigo e palha de milho são exemplos de resíduos agroindustriais ou

subprodutos facilmente disponíveis no Brasil favorecendo o seu uso (NITSCHKE et al.,

2004).

111

Entre os diferentes açúcares adicionados ao meio de cultivo para o crescimento de

Rhodotorula glutinis sacarose e a rafinose favoreceram a produção de invertases (RUBIO et

al., 2002). Resultados semelhantes foram obtidos com A. niger (RUBIO et al., 1997) e para a

produção de invertases por A. phoenicis. Ao se cultivar o microrganismo T. lanuginosus em

meio adicionado de sacarose como fonte de carbono, Chaudhuri et al. (1999) observaram um

crescimento mediano diferindo do observado por nós para A. phoenicis, para o qual o

crescimento foi considerado alto.

Organismos vivos, em presença de glicose, podem sofrer repressão catabólica da

síntese de enzimas (regulação negativa) (LEHNINGER et al., 2000). Verificamos que a

produção invertásica intracelular e extracelular não foi estimulada pela presença de glicose

adicionada ao meio de cultura e sim inibida à medida que se aumentou a concentração de

glicose adicionada. O mesmo fenômeno de repressão ocorreu para as invertases de R. glutinis

(Rubio et al., 2002) e A. ochraceus (Guimarães et al., 2007).

Considerando os cultivos microbianos, cada microrganismo apresenta seu melhor

tempo de crescimento e produção enzimática como, por exemplo, T. lanuginosus, com

produção invertásica máxima no período de 6 a 12 horas (CHAUDHURI et al., 1999). Já A.

phoenicis apresentou maior produtividade invertásica intracelular em 24 horas, sendo o

mesmo também observado para A. niger AS0023 (L’ HOCINE et al., 2000) e diferindo de R.

glutinis, com produção máxima em 36 horas (RUBIO et al., 2002). A maior produção da

forma extracelular em FSbm e FSS foi obtida em 72 horas, padronizando-se este tempo para

os demais experimentos. O tempo de incubação de um microrganismo influência muito a

produção enzimática, uma vez que a incubação por um período breve pode não resultar na

produção máxima da enzima, já que o microrganismo encontra-se na fase de crescimento

vegetativo. Em adição, o crescimento da cultura por um período longo pode levar a exaustão

112

dos nutrientes, conduzindo a um declínio no crescimento e na produção enzimática

(PELCZAR et al., 1996).

O crescimento microbiano divide-se em quatro fases, sendo elas, a fase de adaptação

do microrganismo ao meio de cultivo (fase LAG), uma fase caracterizada por um crescimento

rápido e uniforme (fase LOG), a qual o microrganismo já adaptado ao meio utiliza-se de todos

os recursos oferecidos por este para o seu desenvolvimento, uma fase estacionária na qual o

crescimento do microrganismo é interrompido pela escassez nutricional do meio e uma fase

de declínio, onde o meio não tem mais nutrientes e também apresenta uma série de compostos

do metabolismo do próprio microrganismo, os quais são responsáveis pela lise das hifas e

conseqüentemente mortes celulares (ESPOSITO et al., 2004).

A adição de compostos nitrogenados bem como os ricos em fosfato pode influenciar a

produção enzimática e o crescimento, como observada por Shafiq et al., (2002) em estudos

realizados com Saccharomyces ceresiae GCB-K5, para a qual o meio de cultivo

suplementado com peptona em concentrações de 0,3 a 0,6 % favoreceu uma maior produção

de invertase. Resultado semelhante foi por nós obtido com A. phoenicis, sendo que neste caso

a produção foi também favorecida por sulfato de amônio. Ainda no mesmo estudo realizado

por Shafiq et al. (2002), foi relatado que a utilização de KH2PO4 em concentrações crescentes

promove o declínio da produção de invertases por Saccharomyces ceresiae GCB-K5. Esta

resposta também foi por nós observada para a produção desta enzima por A. phoenicis.

Quando cultivos em substrato sólido são analisados, a disponibilidades de água no

meio exerce grande influência no desenvolvimento microbiano e consequentemente na

produção enzimática. Neste caso, constatamos que quanto maior a umidade do meio, menor é

a produção invertásica, sendo que à proporção que mais favoreceu a produção da enzima foi

1:0,5 (m/v). Segundo Pérez-Guerra et al. (2003) a produção de algumas enzimas é favorecida

com a baixa umidade do meio, considerando-se que a FSS com baixa umidade se assemelha

113

muito às condições reais encontradas pelos microrganismos quando expostos ao meio

ambiente natural. Em adição meios de cultivo com baixa umidade dificilmente são

contaminados por bactérias, além dos rendimentos serem semelhantes ou mais altos que os

obtidos em FSbm, geralmente os meios são simples e o substrato utilizado normalmente

contém todos os nutrientes necessários para crescimento do microrganismo e estas vantagens

têm chamado a atenção, sendo uma outra opção para processos fermentativos que não a

FSbm. Porém, algumas desvantagens devem ser consideradas quando comparada a FSbm,

como por exemplo, a utilização somente de microrganismos que conseguem crescer em meios

com baixa umidade, bem como o pré-tratamento dos substratos como a redução de tamanho

ou mudança física . Além disso problemas para monitoramento de alguns parâmetros físico-

químicos podem ocorrer, além da dificuldade de se determinar a biomassa (PÉREZ-

GUERRA et al., 2003).

Tendo-se otimizado as condições ideais para a produção de invertases por A.

phoenicis, as enzimas intra e extracelular obtidas de FSbm foram purificadas até a

homogeneidade eletroforética evidenciado pela análise do perfil eletroforético (PAGE 7%),

no qual mobilidades relativamente semelhantes foram observadas tanto para o gel corado por

prata como para atividade invertásica, para ambas as formas enzimáticas, ou seja, para cada

banda protéica revelada por prata correspondeu uma única banda de atividade.

Os processos utilizados neste trabalho foram semelhantes aos empregados por Ettalibi

et al. (1987), Liu et al. (2006) e Álvaro-Benito et al. (2007). Ambas as formas enzimáticas

intra e extracelular, são glicoproteínas com massa molecular nativa de 131 kDa e a 155 kDa,

respectivamente, estimada por filtração em gel e subunidades de 70 kDa e 79 kDa, estimada

por SDS-PAGE 7%. Desta forma, podemos dizer que ambas as enzimas são homodímeros

semelhantes a β-D-frutofuranosidases homodiméricas observadas para A. ochaceus, com

massa molecular de 135 kDa e subunidades de 79 kDa (GUIMARÃES et al., 2007), bem

114

como descrito por Rubio et al. (2002) para a invertase produzida por R. glutinis com massa

molecular de 100 kDa e subunidade de 47 kDa. Já para a invertase produzida por A. ficuum a

massa molecular foi de 80 kDa (ETTALIBI et al., 1987), semelhante a massa molecular

relatada para a enzima obtida de pêra que foi de 80 kDa, sendo ambas monoméricas

(Hashizume et al.,2003).

O conteúdo de carboidratos foi de 2,14% e 1,64%, para as invertases intra e

extracelular produzidas por A. phoenicis. Porém, tais valores obtidos foram menores do que

os obtidos para as invertases produzidas por Aspegillus niger (NGUYEN et al., 2005),

Rhodotorula glutinis (RUBIO et al., 2002), Aspergillus ficuum (ETTALIBI et al., 1987) e A.

niveus (GUIMARÃES et al., 2009). Já a temperatura ótima de atividade obtida para a

invertase extracelular produzida em FSS por A. phoenicis foi igual às temperaturas

observadas para Aspegillus sp. 27H (SU et al., 1991) e Aspergillus niger AS0023

(L´HOCINE et al., 2000), que apresentaram temperatura ótima de 55°C. Já as invertases

produzidas por A. phoenicis em FSbm apresentaram temperaturas de atividade superiores a

citada anteriormente e semelhante a observada para a invertase de R. glutinis (RUBIO et al.,

2002) que foi de 60°C. Já as enzimas dos microrganismos Saccharomyces ceresiae GCB-K5

(SHAFIQ et al., 2002) e Cyanobacteria (VARGAS et al., 2003) apresentaram temperaturas

ótimas inferiores as observadas por nós para as invertases produzidas por A. phoenicis.

Em adição, a invertase intracelular produzida por A. phoenicis em FSbm foi estável a

50ºC e a 60ºC por uma hora com meia vida de 9 minutos a 65ºC. O mesmo foi verificado para

a forma extracelular. No entanto, comparando a forma extracelular produzida em FSS com as

obtidas em FSbm, observou-se menor estabilidade na temperatura de 60ºC. Segundo

Sangaletti et al. (2003), a invertase produzida por Alternaria sp. quando incubada a 50ºC

reteve 50% de sua atividade após 120 minutos de tratamento. Yoshikawa et al. (2007)

relataram que a invertase produzida por Aureobasidium pullulans DSM 2404, se manteve

115

estável por uma hora na temperatura de 45ºC. Já a invertase produzida por Rhodotorula

glutinis apresentou meia vida de 3 minutos quando incubada a 60ºC (DELAVEGA et al.,

1991). Desta forma as enzimas produzidas por A. phoenicis foram mais termoestáveis que as

citadas anteriormente. Estes resultados por nós obtidos são relevantes mostrando que as

invertases produzidas por A. phoenicis têm grande potencial para análises bioquímicas

comparativas, estudos fisiológicos e também aplicação biotecnológica.

Dentro de um processo biotecnológico empregando-se enzimas muitos cuidados

devem ser tomados para se obter o melhor resultado no final do processo. Cuidados estes que

vão desde a escolha do fermentador para a produção da enzima até a melhor forma de

armazenamento. Neste contexto, as enzimas intracelular e extracelular produzidas por A.

phoenicis mantiveram-se ativas por longos períodos quando armazenadas a 4ºC e -20ºC.

Entretanto quando mantidas a 27ºC permaneceram ativas por um período de 45-50 horas.

Somente ressaltando-se a importância da temperatura na conservação estrutural da enzima,

segundo Lehninger et al. (2000), alterações bruscas na temperatura interferem nas interações

fracas das enzimas gerando um processo de desnovelamento, ocorrendo perda da capacidade

de hidrolisar o substrato. Desta forma as baixas temperaturas podem previnir a alteração

estrutural da enzima, a qual levaria a perda da atividade. Portanto, recomendamos para

transporte ou armazenamento que as invertases de A. phoenicis sejam mantidas em baixas

temperaturas, preservando-se assim sua viabilidade por mais tempo.

Os valores de pH ótimo de atividade para as invertases produzidas por A. phoenicis

foram coincidentes com aqueles relatados na literatura para outros microrganismos. Em A.

niger AS0023 a atividade invertásica máxima ocorreu em pH 4,4, diminuindo bruscamente

acima do pH 5,0, chegando praticamente a zero em pH 7,0 (L’ HOCINE et al., 2000), sendo o

mesmo observado para as enzimas de A. phoenicis. As enzimas dos microrganismos

Rhodotorula glutinis (RUBIO et al., 2002), Saccharomyces ceresiae GCB-K5 (SHAFIQ et

116

al., 2002) e Cyanobacteria (VARGAS et al., 2003) apresentaram uma faixa de pH ótimo que

variou de 4,0 a 6,0. Já a invertase secretada por Aureobasidium pullulans DSM 2404

apresentou pH ótimo de 5,0, diferindo do resultado encontrado por L’Hocine et al. (2000).

Chavéz et al. (1997) obtiveram resultados parecidos ao do nosso trabalho, onde a invertase de

Candida utilis apresentou pH ótimo de 5,5. Wallis et al. (1997), observaram a atividade

invertásica em uma grande faixa de pH que compreende do pH 4,5 ao 9,0, com máxima

atividade em pH 6,0, para a enzima de Aspergillus niger.

No que se refere à estabilidade ao pH a forma intracelular manteve-se estável por uma

hora em uma faixa de pH de 3,5 a 7,0, ao passo que a invertase extracelular, na faixa de pH

3,5 a 8,0. Comportamento semelhante ao da invertase extracelular produzida em FSbm foi

observado para a invertase extracelular obtida em FSS. Rubio et al. (2002), obtiveram

resultados semelhantes para as invertases produzidas por Rhodotorula glutinis, a qual

manteve 90% de sua atividade em pH 6,0 por 30 minutos. Porém à invertase secretada por

Aureobasidium pullulans DSM 2404, foi estável em uma faixa de pH 6,0 a 10,0 por até 1

hora, sendo o mesmo observado para a invertase de Aspergillus niger ATCC 20611

(YOSHIKAWA et al., 2007). Já a invertase de Candida utilis foi estável em uma faixa que

compreende do pH 3,0 ao pH 6,0 (CHAVÉZ et al., 1997). A estabilidade máxima para

invertase de Alternaria sp. foi em pH 6,0 após 3 horas de tratamento a 50 ºC. Em pH 5,0 a

enzima manteve 81% de sua atividade. Em pH abaixo de 4,0 e acima de 9,0 a enzima não foi

estável (SANGALETTI et al., 2003).

Ao longo da história os íons são onipresentes. Eles desempenham um importante papel

nas propriedades da água do mar, formam sais sólido, que estão presentes em todos os

organismos vivos, influenciam os processos industriais e a sua presença em soluções tem

grande efeito sobre as propriedades dos sistemas biológicos, como em células vivas ou tecidos

biológicos, para se ter uma idéia de tal envolvimento, a adição de uma pequena quantidade de

117

íons em água aumenta sua condutividade por várias ordens de grandeza. Para as enzimas uma

pequena mudança no pH do meio onde se encontram adição de íons que gera alterações

cinéticas, além de alterar sua estrutura terciária para uma forma mais ativa ou inativa. Ainda

podem interferir na solubilidade levando a precipitação da enzima, podendo inclusive

modificar a carga elétrica global desta molécula. (KUNZ 2006). Assim as invertases

produzidas por A. phoenicis foram ativadas, de forma geral por Ag+ e Mn2+

e inibidas

severamente pelo íon Hg2+. A inibição por Hg+ sugere a presença de grupos thiol no sítio

catalítico os quais são importantes para a atividade da invertase, como citado no trabalho de

Guimarães et al. (2009). Entretanto, Hg2+ não afetou a atividade invertásica em R. glutinis,

diferindo do resultado encontrado por nós para A. phoenicis.

Rubio et al. (2002) ao testar a influência de íons metálicos na atividade invertásica de

Rhodotorula glutinis, verificaram um aumento da atividade enzimática na presença de Ca2+,

Mg2+, Fe2+, Co2+, Na+, Cu2+ e K+. Guimarães et al. (2007), verificaram que os íons Mn2+,

Mg2+ e Na+, elevaram a atividade invertásica da enzima produzida por Aspergillus ochraceus.

Invertases de Fusarium solani (BHATTI et al.,2006), R. glutinis (RUBIO et al., 2002), A.

niger (RUBIO & MALDONADO, 1995) e S. cerevisiae (HOSHINO & MAMOSE, 1966)

também foram ativadas por Mg+2 e Na+. A inibição da atividade invertásica por íons metálicos

foi relatada para as enzimas de A. japonicus (HAYASHI et al., 1992) e de A. chroococcum

(DELAVEGA et al., 1991). Já o EDTA que é um agente quelante, não exerceu nenhuma

influência na atividade invertásica mostrando que os íons metálicos não são essenciais para

atividade enzimática segundo trabalho de Guimarães et al. (2009).

Geralmente os íons prata se ligam em grupos SH levando a uma alteração

conformacional da enzima ou alterando sua carga elétrica total, o que na maioria das vezes

leva a inibição da atividade enzimática, o que não aconteceu com as enzimas de A. phoenicis

estudadas. De forma geral os íons ou compostos podem afetar alguns resíduos de aminoácidos

118

localizados no sítio ativo da enzima ou na superfície externa da enzima alterando o sítio

catalítico ou distorcendo sua estrutura. Porém os efeitos de íons metálicos na atividade

enzimática podem ser pertinentes ao considerarmos o uso de matéria-prima com alto conteúdo

de sal (BHATTI et al., 2006). Pelo verificado até o momento na literatura, as invertases de A.

phoenicis parecem ser as únicas ativadas por Ag+, o que nos leva a sugerir um novo grupo de

invertases.

No que se refere à especificidade ao substrato as invertases produzidas por A.

phoenicis foram capazes de hidrolisar sacarose, inulina e rafinose, apresentando

provavelmente o mesmo sítio catalítico para todos os três substratos, uma vez que os valores

de atividade encontrados para a associação de substratos dois a dois foram intermediários aos

dos valores encontrados para a hidrólise dos substratos em separado, além de não

corresponder aos valores hipotéticos da soma destas hidrólises. Contudo as enzimas

apresentaram maior atividade na hidrólise da sacarose. Atualmente há uma discussão no que

se refere a definição de uma invertase e uma inulinase, de forma que há na literatura uma

relação entre especificidade para os substratos que ajuda a diferenciar tais enzimas. A relação

é definida como o quociente S/I, ou seja hidrólise da sacarose sobre a da inulina. Se o

resultado desta relação for maior que 50 tem-se invertase (ROUWENHORST et al., 1988).

Segundo Rouwenhorst et al. (1988) apesar da relação S/I ser utilizada para diferenciar

invertase e inulinase, ela deve ser analisada com cuidado, pois esta relação é influenciada pela

origem da inulina utilizada e pela concentração do substrato. Também deve ser considerado a

dependência da atividade que está diretamente relacionada com o pH e a temperatura. O valor

da relação encontrada para invertases produzida por A. phoenicis foi em média 5,6. Para um

melhor esclarecimento deste aspecto, a análise da eficiência catalítica para ambos as

substratos seria fundamental. No entanto dados cinéticos para a hidrólise da inulina não foram

obtidos satisfatoriamente.

119

Segundo Sturm et al., (1999) a invertases ácidas de plantas hidrolisaram sacarose e

outros oligossacarídeos constituídos de resíduos β–frutose, como rafinose e estaquiose. Rubio

et al. (2002) mostraram que a enzima de R. glutinis hidrolisou sacarose e rafinose, mas não

inulina. É interessante relatar que a capacidade que as invertases apresentam ao hidrolisar os

substratos sacarose e rafinose indica que esta enzima atua-nos β-D- fructofuranosídeos

terminais da frutose (GUIMARÃES et al., 2007). Os trabalhos de Guimarães et al. (2007),

Guimarães et al. (2009) e Ettalibi & Baratti (1987) relatam que as invertases produzidas pelos

microrganismos Aspergillus ochraceus, Aspergillus niveus e Aspergillus ficuum também

hidrolisaram o substrato inulina, como também observado por nós para a enzima produzida

por A. phoenicis.

A cromatografia de placa delgada e em HPLC foram utilizados para analisar os

produtos de hidrólise da sacarose, inulina e rafinose pela ação das invertases produzidas por

A. phoenicis. Glicose e frutose foram observadas como produtos de hidrólise da sacarose pela

ação das enzimas purificadas mediante análise em TLC e em HPLC não caracterizando-se

nenhuma atividade de transfructosilação. Entratanto, quando utilizada amostra enzimática

extracelular bruta, o frutooligossacarídeo nistose, foi também detectado.

Resultados semelhantes foram encontrados nos trabalhos de Nguyen et al.(1999) para

A. niger IMI 303386 e por Fernández et al. (2004) para Aspergillus sp. 27H. Já ao realizar o

mesmo experimento utilizando amostra enzimática pura, observamos apenas a presença de

glicose e frutose. Desta forma, podemos considerar algumas possibilidades: i) possivelmente

na amostra bruta extracelular tenha outra enzima com atividade de transfructosilação ou, ii) a

presença de cofatores que permitem a atividade de transfructosilação pela própria invertase

perdidos durante o processo de purificação e iii) a presença do frutoologossacarídeos no

extrato bruto empregado, o qual foi detectado.

120

Já para análise dos produtos de hidrólise da rafinose podemos observar claramente a

presença de galactose, lactose, glicose e frutose, confirmando que as invertases produzidas

por A. phoenicis realmente hidrolisam estes substratos como já foi relatado nos trabalhos de

Nguyen et al.(1999) para a invertase de A. Niger IMI 303386, de Rubio et al. (2002) para a

enzima de R. glutinis e de Guimarães et al. (2007) para a invertase de Aspergillus ochraceus.

No entanto, resultados satisfatórios pra a hidrólise da inulina não foram obtidos.

A análise dos parâmetros cinéticos para a hidrólise da sacarose na presença e ausência

Ag+ apresentou características interessantes. Os valores de Vmax na ausência de Ag+ (124,90

U/mg e 954,6 U/mg, intra e extracelular, respectivamente ) foram menores do que os valores

obtidos na presença de Ag+, com Vmax de 152,00 U/mg prot e 1.234 U/mg prot. Quanto ao

valor de Kd, este foi maior para a enzima intra e menor para extracelular na presença de Ag+,

(70,80 mM e 29,21 mM). Desta forma, a adição de prata além de promover o aumento da

Vmax também aumentou a afinidade pelo substrato para a forma extracelular. Em adição os

valores do coeficiente de Hill obtidos ficaram entre 0,69 e 1,1. Quando o valor deste

coeficiente é superior a 1,0 tem-se cooperatividade positiva e para valores inferiores,

cooperativade negativa. A afinidade de invertases produzidas por diferentes fontes pelo

substrato é muito diversificada, sendo que os valore de Kd encontrados para as invertases

produzidas por A. phoenicis quando usado sacarose como substrato, foram maiores que os

encontrados para a invertase de Rhodotorula glutinis (RUBIO et al., 2002), Saccharomyces

cerevisiae (TUBITAK et al., 2004), Schwanniomyces occidentalis (ÁLVARO-BEMITO et

al., 2007), Aspergillus ochraceus (GUIMARÃES et al., 2007), A. niveus (GUIMARÃES et

al., 2009), e Bambusa edulis (LIU et al., 2006). Porém, os valores por nós encontrados foram

menores que os observados para as invertases produzidas por A. niger (RUBIO &

MALDONADO et al., 1995) e por Aureobasidium pullulans (YOSHIKAWA et al., 2006),

tendo assim maior afinidade pelo substrato que os dois últimos trabalhos citados.

121

Um parâmetro bioquímico muito importante ivestigado foi a focalisação isolétrica que

para a invertase intracelular e extracelular foi de 4,40 e 4,33, respectivamente. Valores

próximos a estes foram relatados no trabalho Nguyen et al. (2005) para β-fructofuranosidase

produzida por A. niger IMI303386. Porém o pI da invertase ácida produzida por Bambusa

edulis (LIU et al., 2006) foi de 7,4. Segundo Spencer et al. (1988), a maioria das invertases

ácida apresenta pI na faixa de 3,2 a 8,7. Logo as invertase produzidas por A. phoenicis

apresentam pI nesta faixa.

Segundo o trabalho de Naumoff (2001), as invertases fazem parte da superfamília das

β-Fructosidades e esta apresenta homologia com β-xylosidades e α-L- Arabinases. Estas

enzimas pertencem às famílias GH 32, GH 43 e GH 62, respectivamente, sendo consideradas

homólogas, pois apresentam diversas regiões comuns conservadas. Todas as três famílias têm

o mesmo mecanismo molecular de reação de hidrólise que é um duplo deslocamento com

retenção completa da configuração anomérica do resíduo β-D-fructofuranosyl no caos das

invertases. Proteínas de diferentes famílias foram estudadas considerando um agrupamento

hidrofóbico com resíduos de aminoácidos conservados (V, I, L, F, M, W, e Y), revelando 3

cadeias β homólogas em todas as famílias (GH32, GH43, GH62, GH68 e ORFS). Além

disso, todas as proteínas desta superfamília têm um trio de ácido carboxílico no sítio ativo

(NAUMOFF, 2001).

Desta forma, até o presente momento com base nos resultados obtidos para os 3

fragmentos peptídicos analisados, em comparação com as dados disponíveis no banco de

dados podemos afirmar que a enzima extracelular de A. phoenicis faz parte da grande família

das β-Fructosidades homólogas com β-xilosidades e α-L- Arabinases, com certo grau de

homologia com a invertase extracelular de A. niger. Contudo, para uma conclusão definitiva,

novas análises serão necessárias.

122

Assim sendo, podemos concluir que o fungo filamentoso A. phoenicis foi um bom

produtor de invertases termoestáveis com elevada temperatura de atividade que apresentam

características bioquímicas diferentes das observadas para as enzimas de outros organismos,

como por exemplo, ativação por Ag+. Tal característica associada ao aumento da afinidade

por sacarose na presença de Ag+ nos permite supor a existência de um novo grupo de

invertases, o que de certaforma, é reforçado pelos dados de alinhamento, uma vez que

nenhuma homologia significativa com outras invertase foi obtida. No entanto com relação a

outros parâmetros bioquímicos como pH e temperatura ótima, ponto isoelétrico e hidrólise de

substrato, as invertases A. phoenicis se assemelham a outras invertases já descritas em

alguns aspectos, suplantando as em outros, o que nos permite especular um possível potencial

biotecnológico.

125

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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