UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO - Biblioteca Digital de Teses e … · 2016. 2. 17. · 1 UNIVERSIDADE...

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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

Faculdade de Ciências Farmacêuticas

Programa de Pós-Graduação em Fármacos e Medicamentos

Área de Insumos Farmacêuticos

Potenciais candidatos a novos antineoplásicos: síntese e

avaliação da atividade antitumoral de análogos da

queleritrina planejados por simplificação molecular

Rosania Yang

Dissertação para obtenção do

Título de Mestre

Orientador:

Prof. Dr. Roberto Parise Filho

São Paulo

2015

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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

Faculdade de Ciências Farmacêuticas

Programa de Pós-Graduação em Fármacos e Medicamentos

Área de Insumos Farmacêuticos


avaliação da atividade antitumoral de análogos da

queleritrina planejados por simplificação molecular

Rosania Yang

Versão Original

Dissertação para obtenção do

Título de Mestre

Orientador:


São Paulo

2015

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Rosania Yang


avaliação da atividade antitumoral de análogos da queleritrina

planejados por simplificação molecular

Comissão Julgadora

da

Dissertação para obtenção de Título de Mestre


orientador/presidente

________________________________________________


_________________________________________________

2º examinador

__________________________________________________

3º examinador

São Paulo, ____ de ___________ de 2015.

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DEDICATÓRIA

Dedico este trabalho aos meus pais, meus exemplos de vida. Mesmo nas

piores situações, souberam aproveitar o que a vida lhes ofereceu, mostrando que o

aprendizado e o esforço no trabalho sempre compensam.

À minha melhor amiga, Natália Miyuki Cazorla, a irmã que escolhi, pois sua

força e apoio foram indispensáveis para a minha trajetória.

5

AGRADECIMENTOS

Ao departamento de Farmácia da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da

Universidade de São Paulo, pela oportunidade de desenvolver este projeto. Às

agências CAPES, CNPq e FAPESP, pelo auxílio financeiro concedido.

Ao meu orientador, Prof. Dr. Roberto Parise Filho, pela oportunidade

oferecida e por ter acreditado em mim. Não é apenas um exemplo de profissional,

cuja ética e competência são inquestionáveis, mas também trata-se de uma pessoa

de bom coração. Sempre se preocupou com a formação profissional e pessoal de

seus alunos. Além disso, me proporcionou momentos de conforto, me deu bons

conselhos e boas conversas. Não teria escolhido melhor orientador para essa

jornada.

Aos meus pais, por sempre me incentivarem a estudar e sempre se

esforçarem para que isso fosse possível. Sem sua ajuda, eu não teria conseguido

realizar esse mestrado. Ao meu irmão, Ronaldo Yang, a pessoa da minha família

que mais me compreende e cujos conselhos sempre foram valiosos para mim.

À minha querida amiga Sarah Fernandes Teixeira, que, em pouquíssimo

tempo, se mostrou uma pessoa valiosa tanto no âmbito profissional, quanto no

pessoal. Representa um exemplo de profissional para mim. Sempre me deu bons

conselhos, sabendo quando eu precisava levar bronca. Junto ao Ricardo Alexandre

de Azevedo, me deu grande suporte nos ensaios biológicos, além de se

preocuparem com o meu aprendizado como um todo.

Ao meu colega de grupo e amigo Maurício Temotheo Tavares, a pessoa que

mais merece minha gratidão. Sempre se mostrou solícito a me ajudar e, em diversos

momentos que precisei de um conselho ou conforto, eu sabia que podia contar com

ele. Não posso deixar de comentar os momentos de extroversão, os quais renderam

boas risadas e momentos de alívio em nossa rotina.

À Elys Lima, por sempre ser o meu ombro amigo no laboratório, por enxugar

minhas lágrimas nos momentos de tristeza e tensão, e por sempre estar ao meu

lado. Seus conselhos sempre me trouxeram boas reflexões e mudaram meu ponto

de vista em diversos assuntos.

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Ao Fernando de Moura Gatti, pois, sem sua ajuda, eu não teria concluído

metade do meu trabalho. Sempre disposto a trocar informações sobre pesquisa, sua

criatividade e sede por conhecimento foram determinantes para o desenvolvimento

do meu trabalho. Além disso, partilhou de diversos momentos de descontração

comigo, dentro e fora do laboratório.

Aos amigos Ricardo Massarico Serafim, Natanael Segretti, Mariana Frojuello

Segretti e Fredson Torres, por toda a ajuda que me deram no mestrado. Seus

conselhos me ajudaram no desenvolvimento do trabalho e a refletir sobre minha

postura profissional. Vale mencionar os momentos de descontração também, que

renderam boas risadas e que ajudaram a deixar a rotina da pesquisa mais

prazerosa.

Às amigas e colegas de departamento Marina Cândido Primi, Drielli Gomes

Vital e Juliana Magalhães pelos diversos conselhos, momentos de desabafo e

compreensão, pelas risadas e pela companhia. Obrigada por acompanhar minha

jornada e sempre me manter positiva em relação ao meu trabalho.

À Thais Batista Fernandes que, não só me ofereceu sua amizade, como

também partilhou comigo muitos momentos do mestrado. Sua companhia foi muito

importante para a troca de aprendizado, de momentos de frustrações e alegrias, o

que tornou essa jornada mais agradável.

À Lorena Cristine Paes, por toda a disposição em ensinar a parte de química

analítica. Não só me ensinou as técnicas, mas também a ser bem criteriosa no

desenvolvimento e análise experimental. Obrigada pela paciência e pela amizade.

Aos colegas de grupo Gustavo Vasco, Micael Cunha, Nuno Tavares (e a

agregada Rafaela Landucci), Eugen Nesadal e o recém-integrante Alfredo Souza,

por proporcionarem momentos de alegria nos últimos seis meses. Obrigada por

todas as risadas, brincadeiras, conselhos, trocas de informações científicas e por

sempre me mostrarem que eu devo acreditar mais na minha capacidade.

Aos demais colegas de departamento Luciana de Moura Bueno, Silvestre

Modestia, Gláucio Monteiro, Soraya Santos, Profa. Dra. Jeanine Giarolla Vargas,

Marco Arribas e Juliana Pachioni, pelas conversas, conselhos e pelo apoio durante o

mestrado.

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À Profa. MSc Bárbara Vaz, por ter me orientado na graduação e cujos

conselhos me ajudaram na decisão por fazer mestrado na área de química

farmacêutica.

Aos pesquisadores Dr. Ricardo Alexandre de Azevedo, Dr. Kleber Adilson

Ferreira e Prof. Dr. José Alexandre Marzagão Barbuto, do Laboratório de Imunologia

dos tumores, pelo suporte nos ensaios biológicos, pelos ensinamentos e pelo

espaço concedido para a realização dos experimentos. Também não posso deixar

de agradecer os demais pesquisadores do laboratório Aline Arruda, Thiago Patente,

Mariana Pereira e Cecília Pessoa, os quais me acolheram como se eu fosse

integrante do grupo.

Ao Prof. Dr. Gustavo Trossini, pelo apoio e orientação nos estudos de

modelagem molecular. Muito obrigada por sempre se mostrar disposto a ajudar e

discutir sobre o meu projeto.

À Prof. Tit. Elizabeth Igne Ferreira e ao Prof. Dr. Jean Leandro dos Santos, os

quais fizeram parte da minha banca de qualificação. Muito obrigada pelas ideias e

correções do meu trabalho. Suas contribuições foram muito relevantes para mim.

Aos funcionários Célia (ICB), Charles, Inês, David e Irineu, pela ajuda que me

deram no decorrer do mestrado.

À minha amiga da Unisa, Renata Sousa, por todas as palavras de incentivo e

carinho que me deu ao longo dessa jornada. Sua amizade significa muito para mim.

Também não posso deixar de agradecer as outras amigas da Unisa, Karla Cristina,

Telma Cristina e Liliane Cabral, por todo o incentivo e apoio que me deram para

realizar o mestrado.

Aos meus amigos do peito, Natália Miyuki Cazorla, Caroline Bidinotto

Tincani, Talita Rodrigues, Thuane Araújo, Leandro Hayashi, Thiago Contine, Gabriel

Buss, Richard Salvazzini, Shirley Takiuti, Felipe Hiroshi, Marcella Ortega, Felipe

Iqueuti, Jackeline Aguiar, Natanne Socreppa e Leandro Lemos, os quais nunca

entenderam o que eu faço no mestrado, mas sempre se mostraram interessados no

assunto e me apoiaram em diversos momentos.

E vale um agradecimento a todas as outras pessoas que me ajudaram de

maneira direta ou indireta.

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“A vida é um dom – uma interconexão quase impossível de biologia, química, eletricidade e engenharia que se soma a um todo milagroso, muito maior do que a soma de suas partes. O universo inteiro está equipado para a desordem [...] Toda a vida na Terra, por menor que seja, é uma oposição à natureza entrópica do universo. Considerando-se todas as forças a favor da desordem, o mero fato de vivermos – e por tanto tempo, e tão bem – já é um milagre. Por isso, em vez de tomarmos nossa saúde como certa, devemos valorizá-la com toda a reverência que ela merece. [...]”

A Sobrevivência dos Mais Doentes – Dr. Sharon Moalem

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YANG, R. Potenciais candidatos a novos antineoplásicos: síntese e avaliação da

atividade antitumoral de análogos da queleritrina planejados por simplificação

molecular. 2015. 158 p. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Ciências Farmacêuticas,

Universidade de São Paulo, São Paulo, 2015.

RESUMO

Câncer é uma das principais causas de mortes no mundo. Foi responsável por aproximadamente 8,2 milhões de óbitos em 2012 e estima-se 13,2 milhões de mortes em 2030, o que o posiciona como um problema de saúde pública. A quimioterapia torna-se necessária para o tratamento, pois regride o crescimento tumoral e diminui as chances de metástases, as quais são responsáveis por 90% dos óbitos decorrentes do câncer. Linhagens tumorais que apresentam alta expressão de proteínas antiapoptóticas da família Bcl-2 mostram-se resistentes à ação de quimioterápicos antineoplásicos disponíveis na terapêutica. Portanto, o desenvolvimento de compostos que inibem essas proteínas, torna-se interessante para o tratamento do câncer. A queleritrina, um alcaloide presente em diversas espécies da família Papaveraceae, representa um atraente protótipo para o desenvolvimento de inibidores de Bcl-2, visto que esta molécula apresenta atividade citotóxica por meio da inibição da Bcl-XL, proteína supressora da apoptose. Face ao exposto, o objetivo deste trabalho foi sintetizar análogos da queleritrina planejados por simplificação molecular e testar sua atividade citotóxica. A síntese dos compostos foi realizada em duas etapas, com metodologias baseadas em reações de adição nucleofílica com posterior redução. Os análogos foram caracterizados por espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) 1H e 13C, cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) e análise elementar (CHN). A citotoxicidade dos compostos sintetizados e da queleritrina foi avaliada por meio do método de determinação da viabilidade celular por biorredução do sal de tetrazólio (MTT) nas linhagens não-tumorigênicas HUVEC e LL24, e nas linhagens tumorais Jurkat, SK-Mel-28 e A549. Os resultados obtidos no ensaio de citotoxicidade demonstraram que os compostos sintetizados não possuem citotoxicidade significante nas concentrações testadas. Ao avaliar o potencial citostático dos compostos frente à linhagem mutirresistente A549, o composto 2f (3-OH e 4-OH) apresentou atividade antiproliferativa interessante na concentração de 75 µM. Por não apresentar toxicidade em células não tumorais, o composto 2f mostra-se mais seletivo do que seu protótipo. Estudos de modelagem molecular sugerem que a perda da planaridade da queleritrina seja o principal responsável pela diminuição da atividade biológica. Dessa forma, embora os compostos tenham apresentado propriedades biológicas diferentes da esperada, os resultados obtidos podem auxiliar no planejamento de novas moléculas com atividade e seletividade potencialmente superiores à queleritrina, representando assim, potenciais candidatos a fármacos que podem ampliar o arsenal terapêutico para o tratamento de neoplasias.

Palavras-chave: câncer, queleritrina, simplificação molecular, compostos amínicos,

atividade citostática.

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YANG, R. Potenciais candidatos a novos antineoplásicos: síntese e avaliação da

atividade antitumoral de análogos da queleritrina planejados por simplificação

molecular. 2015. 158 p. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Ciências Farmacêuticas,

Universidade de São Paulo, São Paulo, 2015.

ABSTRACT

Cancer is a leading cause of death and was responsible for approximately 8.2 million of deaths in 2012 and 13.2 million of demises are estimated for 2030, which made cancer a public health problem. Chemotherapy is required for cancer treatment, because it decreases the chances of metastasis and regresses tumor growth. However, tumor cell lines which overexpress anti-apoptotic Bcl-2 proteins present resistance to most of anticancer drugs. In this context, the development of molecules with inhibitory activity against these proteins is a promising therapeutic strategy for cancer treatment. Chelerythrine, an alkaloid distributed in several species of Papaveraceae family, has shown considerable antiproliferative activity due to inhibition of Bcl-XL anti-apoptotic protein, which represents an attractive prototype to anticancer drug design. Then, the aim of this study was to synthesize chelerythrine analogues designed by molecular simplification and evaluate their cytotoxic activity. The synthetic strategy was performed into two steps, with methodologies based on nucleophilic addition reaction followed by reduction. The compounds were characterized by 1H and 13C nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy, high performance liquid chromatography (HPLC) and elemental analysis (CHN). The cytotoxic activity of the analogues were evaluated through MTT assay, a colorimetric assay for assessing cell viability, against human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) and lung fibroblasts (LL24) as non-tumorigenic cell lines, and also against tumor cell lines, such as human lymphoblastoid (Jurkat), human melanoma cells (SK-Mel-28) and carcinomic human alveolar basal epithelial cell line (A549). The compounds have not shown significant citotoxicity at the tested concentrations. However, the evaluation of cytostatic activity on multiresistant A549 cell line has demonstrated an antiproliferative potential of compound 2f (3-OH and 4-OH) at 75 µM. Since compound 2f (3-OH and 4-OH) did not show citotoxicity on non-tumorigenic cell lines, it presented higher selectivity than chelerythrine. Molecular modeling results indicate that the lack of planarity of the chelerythrine analogues might be responsible for their lower citotoxicity. Thus, it is expected that the results might help directing the design of new compounds with superior activity and more selective than chelerythrine, thereby representing potential drug candidates, which may enhance the therapeutic arsenal for cancer treatment.

Key words: cancer, chelerythrine, molecular simplification, amine compounds, cytostatic activity.

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Gráfico dos principais tipos de câncer que afetaram a população mundial

em 2012 .................................................................................................................... 21

Figura 2. Ciclo celular e suas fases .......................................................................... 23

Figura 3. Vias bioquímicas indutoras da apoptose ................................................... 27

Figura 4. Interações entre as proteínas da família Bcl-2 na apoptose ...................... 29

Figura 5. A sequência de nucleotídeos do Oblimersen® (1) e as estruturas químicas

dos inibidores de Bcl-2 ABT-737 (2), ABT-263 (navitoclax) (3), ABT-199 (4), GX 15-

070 (obatoclax) (5) e AT 101 (6) ............................................................................... 34

Figura 6. Estruturas químicas dos alcaloides da vinca: vincristina (7), vimblastina (8),

vinorelbina (9) e vindesina (10) ................................................................................. 37

Figura 7. Estruturas químicas da camptotecina (11), topotecana (12) e irinotecano

(13) ............................................................................................................................ 38

Figura 8. Estruturas químicas dos alcaloides benzofenantridínicos sanguinarina (14)

e queleritrina (15) ...................................................................................................... 39

Figura 9. Estruturas químicas da cocaína (16) e procaína (17) ................................ 42

Figura 10. Estruturas químicas da quinina (18) e mefloquina (19) ........................... 43

Figura 11. Representação das modificações propostas na molécula de queleritrina

.................................................................................................................................. 45

Figura 12. Representação esquemática das sínteses dos análogos. Reagentes e

condições: (i) piperonilamina, NaBH(OAc)3, DCM, t.a., N2, 3-5 h; (ii) HCl etérico; (iii)

formaldeído, ácido fórmico, 110 ºC, 2-4 h ................................................................. 48

Figura 13. Representação esquemática da formação de aminas secundárias a partir

de iminas de (a) forma indireta e (b) forma direta ou aminação redutiva .................. 56

Figura 14. Representação das estruturas de ressonância de iminas com um grupo

eletronegativo ligado ao nitrogênio: (a) oxima e (b) sulfonil-hidrazona ..................... 57

Figura 15. Mecanismo de formação de amina secundária por aminação redutiva ...

.................................................................................................................................. 58

Figura 16. Espectro de RMN 1H do produto 2d ........................................................ 60

Figura 17. Espectro de RMN 13C do produto 2d ....................................................... 61

Figura 18. Mecanismo de formação de amina terciária por SN2 ............................... 62

Figura 19. Mecanismo de formação de amina terciária por metilação redutiva ........ 64

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Figura 20. Espectro de RMN 1H do produto 3d ........................................................ 65

Figura 21. Espectro de RMN 13C do produto 3d ....................................................... 66

Figura 22. Estruturas químicas do gefitinibe (20) e temozolomida (21) .................... 70

Figura 23. (a) Efeito do composto 2f na Formação de colônias em A549, de maneira

dose-dependente. (b) O gráfico representa a media de três experimentos diferentes.

* p≤0.05; ** p≤0.01 comparado ao grupo controle (paired Student’s t test) ............... 71

Figura 24. Efeitos do composto 2f sobre o ciclo celular na linhagem A549, o qual o

histograma (a) representa o grupo controle, (b) o composto 2f a 100 µM, (c)

composto 2f a 75 µM e (d) 50 µM; a fase G0/G1 está em azul, S em verde e G2/M

em vermelho. (e) ilustra a % da distribuição de células em cada fase do ciclo. Os

resultados representam a média de dois experimentos diferentes ........................... 73

Figura 25. Estruturas químicas do composto 2f (22), da catequina (23), da

quercetina (24) e do ácido 3,4-di-idroxibenzóico (25), com o grupo catecólico em

destaque ................................................................................................................... 74

Figura 26. Representação de propriedades eletrônicas da queleritrina e dos

compostos 2a, 2c e 2f, por meio do mapa de potencial eletrostático, vetor do

momento dipolo (representados por setas amarelas), e mapas de orbitais

moleculares HOMO e LUMO ..................................................................................... 77

Figura 27. (a) Representação do alinhamento entre as estruturas da queleritrina e

do análogo 2f, nos quais os átomos de carbono estão representados em verde e

amarelo, respectivamente, os de oxigênio em vermelho e o nitrogênio em azul em

ambas. Os átomos de hidrogênio foram suprimidos para a melhor visualização. Em

(b), representação das distâncias interatômicas (em preto) mensuradas para a

queleritrina e em (c), representação das distâncias interatômicas (em preto) obtidas

para o análogo 2f. Ainda em (b) e (c), os ângulos diedros das estruturas da

queleritrina e do composto 2f, respectivamente, foram calculadas a partir dos

átomos circulados em vermelho ................................................................................ 78

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Distribuição proporcional dos dez tipos de câncer mais incidentes

estimados para 2015 por sexo, exceto pele não-melanoma ..................................... 22

Tabela 2. Fármacos inibidores de Bcl-2 em desenvolvimento .................................. 33

Tabela 3. Valores de IC50 da queleritrina em diversas linhagens celulares .............. 40

Tabela 4. Resultados obtidos na síntese dos análogos da queleritrina das séries das

aminas secundárias e terciárias ................................................................................ 55

Tabela 5. Análise elementar das aminas secundárias .............................................. 61

Tabela 6. Análise elementar das aminas terciárias ................................................... 66

Tabela 7. Valores de IC50 (µM) da queleritrina e do composto mais ativo das séries

.................................................................................................................................. 68

Tabela 8. Parâmetros físico-químicos calculados para a queleritrina e os compostos

2a, 2c e 2f ................................................................................................................. 79

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LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

3D – tridimensional

ɛHOMO – energia de orbital HOMO

ɛLUMO – energia de orbital LUMO

A1 – Bcl-2 related gene A1 (gene A1 relacionado ao Bcl-2)

𝐴𝑎 – absorbância das amostras

𝐴𝑏 – absorbância do branco

𝐴𝑐 – absorbância do controle positivo

ACS – American Cancer Society (Sociedade Americana do Câncer)

AIF – Apoptosis-Inducing Factor (fator indutor de apoptose)

Apaf-1 – Apoptotic Protease Activing Factor (fator apoptótico 1 de ativação de

protease)

Apo2L – Apoptosis antigen 2 (antígeno de apoptose 2)

Apo3L – Apoptosis antigen 3 (antígeno de apoptose 3)

ABC – ATP binding cassete

Bad – Bcl-2-Associated Death promoter (promotora de morte associada à Bcl-2)

Bak – Bcl-2 Antagonist/Killer protein (antagonista/assassino de Bcl-2)

Bax – Bcl-2-Associated X protein (Bcl-2 associada à proteína X)

Bcl-2 – B-Cell Lymphoma 2 protein (proteína de linfoma 2 de células B)

Bcl-w – B-Cell Lymphoma w protein (proteína de linfoma w de células B)

Bcl-XL – B-Cell Lymphoma-Extra Large protein (proteína de linfoma de células B

extra grandes)

BH – Bcl-2 Homology (homólogos de Bcl-2)

BH3 – Bcl-2 homology region 3 (homólogo da região 3 de Bcl-2)

Bid – BH3-interacting domain Death agonist (agonista de morte que interage com o

domínio BH3)

Bik – Bcl-2-Interacting Killer (assassino que interage com Bcl-2)

Bim – Bcl-2-Interacting Mediator of cell death (mediador de morte celular que

interage com Bcl-2)

Bmf – Bcl-2-Modifying Factor (fator modificador de Bcl-2)

Bok - Bcl-2-Related Ovarian Killer (assassino ovariano que interage com Bcl-2)

BSA – bovine serum albumin (albumina sérica bovina)

CAD – Caspase Activated DNase (DNase ativada por caspase)

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CCD – cromatografia em camada delgada

Cel – célula

CLAE – cromatografia líquida de alta eficiência

CLog P – logaritmo do coeficiente de partição calculado

COX-2 – ciclooxigenase-2

CRU – Cancer Research UK (Instituto do Câncer do Reino Unido)

Cyt c – citocromo C

DCM – diclorometano

DMEM – Dulbecco’s Modified Eagle’s medium

DIABLO – Direct IAP-Binding Protein with Low pI (proteína de ligação-IAP direta

com baixo pI)

DMSO – dimetilsulfóxido

DNA – Deoxyribonucleic acid (ácido desoxirribonucleico)

DNase – desoxirribonuclease

DR3 – Decoy Receptor 3 (Receptor Decoy 3)

DR4 – Decoy Receptor 4 (Receptor Decoy 4)

DR5 - Decoy Receptor 5 (Receptor Decoy 5)

EGFR – epidermal growth factor receptor (receptor de fator de crescimento

epidermal)

ELISA – Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ensaio de imunoabsorção ligado à

enzima)

EROS – espécies reativas de oxigênio

FADD – Fas Associated Death Domain (domínio de morte associada a Fas)

FasL – Ligante Fas

FasR – Receptor Fas

G0 – Gap 0 (intervalo celular 0)



GST-π – glutationa S-transferase Pi

HBA – Hydrogen Bond Acceptor (sítio aceptor de ligação de hidrogênio)

HBD - Hydrogen Bond Donor (sítio doador de ligação de hidrogênio)

HOMO – Highest Occupied Molecular Orbital (orbital molecular ocupado de maior

energia)

HPV – Human Papiloma Virus (vírus do papiloma humano)

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Hrk - Harakiri

HtrA2 – High Temperature Required protein A2

IAP – Inhibitors of Apoptosis Proteins (proteínas inibidoras de apoptose)

IARC – International Agency for Research on Cancer (Agência Internacional de

Pesquisa do Câncer)

IC50 – concentração inibitória 50 %

INCA – Instituto Nacional do Câncer “José Alencar Gomes da Silva”

LBDD – Ligand-Based Drug Design (planejamento de fármaco a partir do ligante)

LUMO - Lowest Unoccupied Molecular Orbital (orbital molecular não ocupado de

menor energia)

M – mitose

Mcl-1 – Myeloid Cell Leukemia-1 protein (proteína de célula mieloide de leucemia 1)

MMFF – Merck Molecular Force Field (campo de força molecular Merck)

MPE – mapa do potencial eletrostático

MTT – brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-1)2,5-difenil tetrazólio

NCI – National Cancer Institute (Instituto Nacional do Câncer)

Noxa – (Latin for Damage) Phorbol-12-myristate-13-acetate-induced protein 1

p21 – proteína de 21 kDa

p53 – proteína de 53 kDa

PBS – Phosphate Buffered Saline (tampão salina fosfato)

PM – peso molecular

PM6 – Parametric Method 6 (método paramétrico 6)

Puma – p53 Upregulated Modulator of Apoptosis (proteína moduladora de apoptose

modulada positivamente por p53)

R – ponto de restrição

Rf – Retenction fator (fator de retenção)

RMN – ressonância magnética nuclear

RNA – Ribonucleic acid (ácido ribonucleico)

RNase – ribonuclease

Ro5 – Regra dos Cinco de Lipinski

RPM – rotações por minuto

RPMI – Roswell Park Memorial Institute

S – fase celular de síntese de DNA

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SBDD – Structure-Based Drug Design (planejamento de fármaco a partir da

estrutura do alvo)

SFB – soro fetal bovino

Smac – Second Mitochondria-derived Activator of Caspases (segundo ativador

mitocôndrial de caspase)

TNF – Tumor Necrosis Factor (fator de necrose tumoral)

TNFR1 - Tumor-Necrosis Factor Receptor 1 (receptor de fator de necrose tumoral 1)

TRADD – Tumor Necrosis Factor Receptor type 1 – Associated Death Domain

(domínio de morte associada ao TNF)

TRAIL – TNF-related apoptosis-inducing ligand (ligante indutor de apoptose

relacionado ao TNF)

UV – ultravioleta

WHO – World Health Organization (Organização Mundial da Saúde)

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SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 20

1.1 Câncer ............................................................................................................. 20

1.1.1 Aspectos epidemiológicos ......................................................................... 20

1.1.2 Fisiopatologia............................................................................................. 23

1.1.3 Apoptose ................................................................................................... 25

1.1.4 Família Bcl-2 .............................................................................................. 28

1.2 Tratamento ...................................................................................................... 31

1.2.1 Inibidores de Bcl-2 ..................................................................................... 33

1.2.2 Produtos naturais ....................................................................................... 36

1.3 Planejamento racional ....................................................................................... 41

2 OBJETIVOS E JUSTIFICATIVA ............................................................................ 44

3 PLANEJAMENTO DOS ANÁLOGOS ................................................................... 45

4 MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................... 47

4.1 Material ............................................................................................................ 47

4.2 Métodos sintéticos ......................................................................................... 48

4.2.1 Síntese das aminas secundárias ............................................................... 48

4.2.2 Síntese das aminas terciárias .................................................................... 49

4.3 Métodos analíticos ......................................................................................... 50

4.3.1 Cromatografia em camada delgada (CCD) e cromatografia em coluna .... 50

4.3.2 Espectrometria por ressonância magnética nuclear (RMN) ...................... 50

4.3.3 Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) acoplado ao UV .............. 50

4.3.4 Análise elementar (CHN) ........................................................................... 51

4.4 Métodos biológicos ........................................................................................ 51

4.4.1 Cultura celular ............................................................................................ 51

4.4.2 Avaliação da citotoxicidade ....................................................................... 52

19

4.4.3 Ensaio clonogênico .................................................................................... 53

4.4.4 Análise do ciclo celular .............................................................................. 53

4.5 Métodos computacionais .............................................................................. 54

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................. 55

5.1 Síntese e caracterização das aminas secundárias ..................................... 56

5.2 Síntese e caracterização de aminas terciárias ............................................ 62

5.3 Ensaios biológicos ......................................................................................... 67

5.3.1 Ensaio de citotoxicidade ............................................................................ 67

5.3.2 Ensaio clonogênico e ciclo celular ............................................................. 70

5.4 Modelagem molecular .................................................................................... 75

6 CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS ...................................................................... 81

7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................... 84

8 ANEXOS ................................................................................................................ 99

20

1 INTRODUÇÃO

1.1 Câncer

1.1.1 Aspectos epidemiológicos

Câncer é o termo genérico designado a um grupo de doenças que pode afetar

qualquer parte do organismo. Esse grupo de doenças também pode ser denominado

como neoplasia maligna, na qual a palavra neoplasia significa “novo crescimento”,

ou tumor maligno (WHO, 2015).

O câncer foi considerado por muito tempo uma doença de países

desenvolvidos. Porém, nas últimas décadas, tornou-se um problema de saúde

pública mundial (INCA, 2012). Isso se fundamenta no fato de que os indivíduos

vivenciam um prolongamento da expectativa de vida e envelhecimento populacional.

Dessa forma, aumenta-se a incidência de doenças crônico-degenerativas, tais como

as doenças cardiovasculares e o câncer (INCA, 2014).

Embora as taxas de incidência sejam mais elevadas em países mais

desenvolvidos, (CRU, 2011), os países em desenvolvimento e com poucos recursos

são os mais afetados. Cerca de 70% das mortes por neoplasias são atribuídos a

esses locais (WHO, 2015), principalmente porque países em desenvolvimento

concentram mais pessoas de baixa renda, e estas, por sua vez, têm prognóstico

menos favorável após o diagnóstico da doença (ACS, 2014).

Este padrão está associado a barreiras financeiras, estruturais e pessoais aos

auxílios médico-hospitalares, dentre eles o reduzido acesso a cuidados preventivos,

ao tratamento adequado, bem como o diminuto acesso a informações. Desta forma,

frequentemente o diagnóstico é feito quando a doença está em um estado

avançado, no qual o tratamento não é capaz de atribuir qualidade e sobrevida ao

paciente (ACS, 2014).

Existem mais de 200 tipos de câncer, cada um com uma diferente causa,

quadro de sintomas e tratamento (CRU, 2014). Em 2012, os principais tipos de

tumores malignos que acometeram a população mundial foram os de pulmão,

21

1590000

745000 723000 694000521000

400000

0200000400000600000800000

10000001200000140000016000001800000

Pulmão Fígado Estômago Colorretal Mama Esôfago

Principais tipos de Câncer em 2012

fígado, estômago, colorretal, de mama e de esôfago, conforme a Figura 1 (WHO,

2015).

Figura 1. Gráfico dos principais tipos de câncer que afetaram a população mundial em 2012 (WHO, 2015).

Ademais, a incidência destas neoplasias varia de acordo com a distribuição

de recursos dos países. Naqueles com maior renda per capita, os cânceres de

pulmão, cólon e reto, mama e próstata predominam. Já em países de menor produto

interno bruto, a predominância é dos cânceres de pulmão, estômago, fígado, mama

e colo de útero (ACS, 2014; INCA, 2014; WHO, 2015).

Alguns fatores podem contribuir para a instalação do câncer. Maus hábitos de

vida, como o tabagismo, são responsáveis pelo aumento da incidência de cânceres,

como o de pulmão. Além disso, o estilo de vida adotado pela população no que se

refere à má alimentação e ao sedentarismo, aumenta a incidência de tumores

malignos como os de cólon e reto, estômago, fígado, mama e próstata. O menor

acesso a programas preventivos como o exame Papanicolau e a vacinação contra o

Papilomavírus humano (HPV) é responsável pela predominância de câncer de colo

do útero em países em desenvolvimento (ACS, 2014; INCA, 2014; WHO, 2015).

Ainda assim, os padrões podem mudar, já que historicamente cânceres de

pulmão, mama, cólon e reto não apresentavam a mesma importância e magnitude

que apresentam atualmente (INCA, 2014; WHO, 2015). Como o aumento na

prevalência de câncer no mundo está diretamente relacionado ao tabagismo,

sedentarismo, má alimentação, uso de álcool, exposição à poluição, suscetibilidade

22

ao Papilomavírus humano (HPV) e ao vírus da hepatite, o câncer se configura como

uma doença que pode ser prevenida ao modificar ou evitar esses fatores de risco

(ACS, 2014; WHO, 2015).

No Brasil, segundo dados do Instituto Nacional do Câncer “José Alencar

Gomes da Silva” (INCA), estima-se que para o ano de 2015 ocorram

aproximadamente 576 mil novos casos de câncer, incluindo os casos de pele não-

melanoma e, excluindo este último, estima-se um total de 394 mil novos casos. A

distribuição dos dez tipos de câncer mais incidentes por sexo está representada na

Tabela 1, na qual pode-se observar que os tumores mais incidentes em homens e

mulheres no Brasil são, respectivamente, próstata e mama (INCA, 2014).

Tabela 1. Distribuição proporcional dos dez tipos de câncer mais incidentes estimados para 2015 por sexo, exceto pele não-melanoma (Adaptado de INCA, 2014).

Homens Mulheres

Localização Primária

Casos Novos

Percentual Localização

Primária Casos Novos

Percentual

Próstata 68800 22,8% Mama Feminina 57120 20,8% Traqueia,

Brônquio e Pulmão

16400 5,4% Cólon e Reto 17530 6,4%

Cólon e Reto 15070 5,0% Colo do Útero 15590 5,7%

Estômago 12870 4,3% Traqueia,

Brônquio e Pulmão

10930 4,0%

Cavidade Oral 11280 3,7% Glândula Tireóide

8050 2,9%

Esôfago 8010 2,6% Estômago 7520 2,7% Laringe 6870 2,3% Corpo do Útero 5900 2,2% Bexiga 6750 2,2% Ovário 5680 2,1%

Leucemias 5050 1,7% Linfoma não

Hodgkin 4850 1,8%

Sistema Nervoso Central

4960 1,6% Leucemias 4320 1,6%

Atualmente, o câncer é uma das principais causas de mortes no mundo, o

qual foi responsável por aproximadamente 8,2 milhões de óbitos e 14,1 milhões de

casos novos em 2012 (IARC, 2012; WHO, 2015). De acordo com o INCA, em 2030,

a projeção do número de óbitos relacionados ao câncer pode alcançar 13,2 milhões

de indivíduos e a incidência será de 21,4 milhões de pessoas (INCA, 2014).

Diante da magnitude e do impacto da doença, medidas preventivas e a

descoberta de novas alternativas para o combate ao câncer tornam-se necessárias.

23

Os tratamentos utilizados atualmente são muitas vezes ineficazes e muitas

linhagens tumorais já não respondem à farmacoterapia disponível, ou até mesmo

desenvolvem resistência a esses agentes. Desta forma, a introdução de novas

opções terapêuticas torna-se um dos focos para o controle do câncer e suas

consequências (AVENDAÑO; MENÉNDEZ, 2008).

1.1.2 Fisiopatologia

Os cânceres surgem a partir de alterações na homeostase celular, com um

componente genético fortemente associado. Estas alterações culminam no

crescimento desordenado de células anômalas, incapazes de formar uma estrutura

funcional e que têm a capacidade de invasão a tecidos adjacentes e órgãos

distantes (FLOOR et al., 2012; PATRICK, 2009).

Em uma célula normal, o ciclo celular é regulado por inúmeros mecanismos

que visam a correta divisão celular, a qual é dividida em dois estágios: a mitose, que

é subdividida em prófase, metáfase, anáfase e telófase; e a intérfase, que é o

intervalo entre duas mitoses e também é subdivida em G0, G1, S e G2, conforme

Figura 2 (FISCHER, 2008).

Figura 2. Ciclo celular e suas fases (VERMEULEN; VAN BOCKSTAELE; BERNEMAN, 2003).

24

A preparação para a síntese de DNA ocorre na fase G1. Nesta fase, a célula

encontra-se suscetível às condições ambientais e caso elas não sejam favoráveis, o

ciclo é interrompido. Entretanto, se o ciclo celular já tiver ultrapassado o ponto de

restrição (R) (Figura 2), o ciclo celular progredirá independente dos estímulos

ambientais (GUEMBAROVSKI; CÓLUS, 2008).

O processo de síntese replicação do DNA ocorre na fase S, enquanto na fase

G2 ocorre a preparação para a mitose, estado no qual ocorre a divisão nuclear.

Quando a célula se caracteriza em um estado de quiescência, ou repouso,

permanecendo na intérfase, ela encontra-se na fase G0, a qual sob estímulo, pode

retornar à fase G1 e dar continuidade ao ciclo celular (VERMEULEN; VAN

BOCKSTAELE; BERNEMAN, 2003).

O controle do ciclo celular é mediado pelo ponto de restrição e pelos pontos

de checagem, que podem pausar o ciclo celular em qualquer etapa do processo. Isto

ocorre quando é identificado algum dano ou alteração no DNA, para que haja os

reparos ou, na sua impossibilidade, indução da célula à apoptose (GABRIELLI;

BROOKS; PAVEY, 2012).

A desregulação do ciclo celular e crescimento descontrolado das células

podem surgir por meio de mutações que ocorrem em duas classes de genes: os

proto-oncogenes e os genes supressores de tumor. Os proto-oncogenes possuem a

função de estimular a proliferação celular e, quando sofrem mutação, passam a ser

denominados de oncogenes, os quais permitirão ganho de função à célula mutada

(LUO; SOLIMINI; ELLEDGE, 2009).

Em contrapartida, os genes supressores de tumor codificam proteínas

envolvidas no controle negativo do ciclo celular e, quando mutados, perdem sua

função. A perda desse mecanismo, em conjunto com as alterações em proto-

oncogenes, levam a uma característica marcante da maioria das células tumorais,

que é a proliferação desordenada das células (VOGELSTEIN; KINZLER, 2004).

A tumorigênese, ou seja, o processo de formação tumoral, é descrita como

um processo de várias etapas. Diversas mutações genéticas estão envolvidas e

permitem que as células atingidas adquiram novas capacidades (HANAHAN;

WEINBERG, 2011). Hanahan e Weinberg (2011) sugerem oito alterações essenciais

25

na fisiologia de uma célula normal que permitem o crescimento tumoral maligno.

Dentre elas estão a autossuficiência de sinais de crescimento, a insensibilidade a

sinais de supressão tumoral, a evasão a apoptose, o potencial replicativo ilimitado, a

indução de angiogênese, a invasão tecidual e metástase, reprogramação metabólica

e evasão ao sistema imune.

A apoptose tem importância na homeostase tecidual, pois pode evitar a

perpetuação de potenciais mutações oncogênicas ao induzir a célula mutada à

morte. Como a evasão à apoptose é um mecanismo presente em muitas células

cancerígenas, este processo é um dos alvos para o desenvolvimento de agentes

anticâncer. Além disso, a atenuação da apoptose é observada em tumores que

progridem a estágios malignos e são resistentes à terapia (BROWN; ATTARDI,

2005; HANAHAN; WEINBERG, 2011).

1.1.3 Apoptose

A apoptose é o fenômeno de indução à morte celular programada que ocorre

em diversos processos fisiológicos e patológicos (FULDA; DEBATIN, 2006). Pode

ocorrer durante o desenvolvimento e o envelhecimento tecidual, sendo um

mecanismo homeostático necessário para a manutenção da população celular

(ELMORE, 2007). A desregulação desse processo pode causar um desequilíbrio

entre proliferação e morte celular, favorecendo o aparecimento de doenças como o

câncer (IGNEY; KRAMMER, 2002).

Esse fenômeno se caracteriza por uma série de mudanças morfológicas

celulares, dentre as quais há a condensação nuclear (picnose) e fragmentação

(cariorréxis). Nota-se também a formação de uma protuberância irregular da

membrana plasmática que culmina na produção de corpos apoptóticos (MARIÑO et

al., 2014).

Os corpos apoptóticos, por sua vez, são constituídos de citoplasma com as

organelas compactadas com ou sem um fragmento nuclear. Estes são

subsequentemente fagocitados e degradados por macrófagos, células parenquimais

ou células neoplásicas. A apoptose não envolve um processo inflamatório, o que a

diferencia de outras vias de morte celular, como a necrose (ELMORE, 2007).

26

A apoptose apresenta um mecanismo altamente complexo e sofisticado que

envolve uma cascata de eventos moleculares dependentes de ativação energética.

Basicamente, engloba a ativação de cisteína proteases, denominadas de caspases,

as quais possuem atividade proteolítica e têm como função a amplificação da via de

sinalização apoptótica (FULDA; DEBATIN, 2006).

As caspases são sintetizadas como proformas inativas (procaspases) e

quando ativadas, clivam outras procaspases nas proximidades dos resíduos de

aspartato presentes nessas enzimas. Além disso, as caspases podem se autoativar

ou ativar umas às outras em sequência (ELMORE, 2007).

Na apoptose, essas proteases podem ser divididas em ativadoras e

executoras. As ativadoras (caspases-8 e 9) clivam proformas inativas de caspases

executoras (caspases-3, 6 e 7), e estas, por sua vez, clivam outros substratos

proteicos da célula resultando no processo apoptótico (FAN et al., 2005).

Em princípio, a apoptose pode ser ativada por duas vias alternativas, uma via

extrínseca mediada por receptores de morte celular, e uma via intrínseca, mediada

pela mitocôndria. Entretanto, há evidências de que essas vias estão interligadas,

pois alguns fatores de uma via podem influenciar na outra. Ademais, ambas as vias

convergem na ativação das caspases executoras, conforme Figura 3 (FULDA;

DEBATIN, 2006; IGNEY; KRAMMER, 2002).

A via extrínseca da apoptose ocorre em resposta a estímulos aos receptores

de morte. Estes pertencem à superfamília de receptores de fator de necrose tumoral

(TNF – Tumor Necrosis Factor) que são ativados por determinados ligantes e

transmitem o sinal de morte da superfície celular para vias sinalizadoras

intracelulares (Figura 3). Os FasL/FasR, TNF-α/TNFR1, Apo3L/DR3, Apo2L/DR4 e

Apo2L/DR5 são alguns exemplos de ligantes e seus respectivos receptores

(ELMORE, 2007; FULDA; DEBATIN, 2006; IGNEY; KRAMMER, 2002).

Após a ativação dos receptores de morte, ocorre o recrutamento de diversas

proteínas citoplasmáticas. Dentre elas, há a proteína adaptadora de domínio de

morte associada a Fas (FADD – Fas Associated Death Domain), resultante da

interação FasL/FasR; e a proteína adaptadora de domínio de morte associada ao

TNF (TRADD – Tumor Necrosis Factor Receptor type 1 – Associated Death

Domain), resultante da interação TNF-α/TNFR1, a qual recruta diretamente o FADD

27

(Figura 3). Esta última forma um complexo com a procaspase-8 que resulta em sua

ativação para caspase-8. Uma vez ativada, a caspase-8 inicia o processo de

apoptose por meio da clivagem das caspases executoras 3, 6 e 7, que culmina em

uma cascata proteolítica e posterior morte celular (Figura 3) (ASHKENAZI, 2008).

Figura 3. Vias bioquímicas indutoras da apoptose (FERNANDES, 2015).

A via intrínseca ou mitocondrial, por sua vez, é iniciada por estímulos

produtores de sinais intracelulares que podem agir de maneira positiva ou negativa

sobre os eventos celulares (Figura 3). Sinais negativos envolvem a ausência de

fatores de crescimento, hormônios e citocinas que conduzem a falhas na supressão

de morte celular, induzindo à apoptose. Os estímulos que podem agir de maneira

positiva são a radiação, toxinas, hipóxia, hipertermia, infecções virais e radicais livres

(ELMORE, 2007).

28

Todos esses estímulos provocam modificações na membrana mitocondrial,

que resulta em formação de poros, perda do potencial transmembrânico e liberação

de dois grupos principais de proteínas proapotóticas do espaço intermembrana para

o citosol (Figura 3). O primeiro grupo consiste de citocromo c, Smac/DIABLO e a

serina protease HtrA2/Omi. Estas proteínas ativam a via mitocondrial caspase-

dependente (FULDA; DEBATIN, 2006).

O citocromo c se liga à Apaf-1 e à procaspase-9, formando o apoptossomo, o

qual é responsável pela ativação da caspase-9. Já a Smac/DIABLO e a HtrA2/Omi

são relacionadas à promoção de apoptose por meio da inibição de proteínas

inibidoras de apoptose (IAP – Inhibitors of Apoptosis Proteins) (ELMORE, 2007;

RENAULT; CHIPUK, 2014).

O segundo grupo de proteínas proapoptóticas, formado pelo fator indutor de

apoptose (AIF – Apoptosis-Inducing Factor), endonuclease G e DNase ativada por

caspase (CAD – Caspase Activated DNase), é liberado da mitocôndria tardiamente,

após a célula já ter iniciado o processo de morte (FULDA; DEBATIN, 2006).

O controle e regulação da apoptose associada à via mitocondrial são

realizados por membros da família Bcl-2 de proteínas, as quais tem papel

fundamental na permeabilidade da membrana desta organela. A proteína supressora

de apoptose p53 tem papel crucial na regulação desta família de proteínas,

induzindo-as ao efeito pró-apoptótico ou antiapoptótico, dependendo dos membros

envolvidos no processo (Figura 3) (MARTINOU; YOULE, 2011).

1.1.4 Família Bcl-2

A família Bcl-2 de proteínas representa o centro regulador da apoptose por

meio da via mitocondrial. Os membros desta família podem ser divididos de acordo

com a sua estrutura e função. Considerando-se a sua estrutura, as proteínas podem

conter quatro sequências homólogas, denominadas de domínios homólogos de Bcl-

2 (BH – Bcl-2 Homology). De acordo com a sua função, as proteínas podem ser

antiapoptóticas ou proapotóticas (PLACZEK et al., 2010).

29

As proteínas que apresentam os quatro domínios BH, podem atuar como

supressores de apoptose (por exemplo, Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-w, Mcl-1 e A1) (GARCÍA-

SÁEZ, 2012) ou promotores de apoptose (por exemplo, Bax, Bak e Bok) (LONDON

et al., 2012). O mecanismo pelo qual essas proteínas regulam a apoptose está

representado na Figura 4 (DEWSON; KLUCK, 2010).

Figura 4. Interações entre as proteínas da família Bcl-2 na apoptose (PLACZEK et al., 2010).

As proteínas denominadas de BH3-only (Bid, Bim, Puma, Noxa, Bad, Bmf,

Hrk e Bik), as quais possuem apenas o domínio homólogo BH3, desempenham a

função de promover a apoptose pela sensibilização ou ativação das proteínas

proapoptóticas efetoras (Figura 4) (DEWSON; KLUCK, 2010).

A proteína Bid, uma proteína proapoptótica do tipo BH3-only ativadora, atua

na indução da apoptose de maneira direta, ao se ligar à Bak, Bax e/ou Bok ativando-

as (1). Esta ativação resulta na dimerização entre Bak, Bax e/ou Bok (2) e

consequente oligomerização destas proteínas (3). O oligodímero formado se liga na

membrana mitocondrial e, consequentemente, promove a liberação de citocromo c

(4). Este, em conjunto a outras substâncias, forma o apoptossomo, um complexo

30

que tem como função a ativação da caspase 9, a qual dará continuidade ao

processo de apoptose (PLACZEK et al., 2010).

As proteínas antiapoptóticas, tais como Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-w, Mcl-1 e A1, tem

como função a conjugação com proteínas proapoptóticas efetoras, tais como Bak,

Bax e Bok, representadas pelo evento (5), na Figura 4. A interação de uma proteína

antiapoptótica com uma proapoptótica efetora interfere na atividade da última, visto

que as proteínas supressoras de apoptose vão ocupar sítios de ligação nos quais as

proteínas BH3-only interagem, resultando na ausência de ativação de Bak, Bax e

Bok (CZABOTAR et al., 2014).

A promoção da apoptose pode ocorrer de maneira indireta, mediada pela

proteína Bid, a qual pode se ligar às proteínas da família antiapoptótica, promovendo

a inibição das mesmas (6). Em outras palavras, as proteínas responsáveis pela

supressão da apoptose sofrem inibição pelo Bid e perdem a capacidade de se ligar a

Bak, Bax e Bok (SCHROEDER et al., 2012).

A inibição dos membros antiapoptóticos da família Bcl-2 também pode ocorrer

por meio da ligação das proteínas proapoptóticas BH3-only do tipo sensibilizadoras,

como a Noxa e a Bad (6). Este mecanismo é denominado de sensibilização à

apoptose porque Noxa e Bad não se ligam a Bak, Bax e/ou Bok e, portanto, não

desempenham função na ativação direta das proteínas efetoras (SCHROEDER et

al., 2012).

Altos níveis de concentração dos agentes supressores de apoptose da família

de proteínas Bcl-2 estão associados a tumores resistentes à quimioterapia

(VOGLER et al., 2009). O tipo de proteína superexpressa pode variar entre os

diversos tipos de câncer existentes. A própria Bcl-2, por exemplo, tem alta

expressão em linfoma folicular de células B, no qual essa proteína foi descoberta

primeiramente, dando origem ao seu nome (IGNEY; KRAMMER, 2002).

A Mcl-1, por sua vez, apresenta-se superexpressa em tumores

hematopoéticos e linfóides, incluindo o mieloma múltiplo e leucemia linfoide crônica

(LESSENE; CZABOTAR; COLMAN, 2008), enquanto a proteína Bcl-w está

relacionada aos tumores de origem epitelial, tais como o adenocarcinoma colorretal

e o câncer gástrico (LEE et al., 2003). A alta expressão de Bcl-XL é observada em

tumores como melanoma, câncer de mama, de próstata, de pulmão, linfoma de

31

células B, câncer colorretal e adenocarcinomas em geral (MENA et al., 2012;

RAGHAV; VERMA; GANGENAHALLI, 2012).

Amudson e colaboradores (2000) coordenaram um estudo utilizando o painel

NCI (National Cancer Institute) de 60 linhagens de células tumorais humanas de

diferentes origens. Este estudo demonstrou forte correlação entre altos níveis de

Bcl-XL e sensibilidade das células tumorais à maioria dos fármacos utilizados na

terapêutica. Desta forma, a Bcl-XL representa um alvo interessante para o

desenvolvimento de novos fármacos que podem apresentar atividade biológica em

linhagens tumorais resistentes aos quimioterápicos da terapia atual (ADAMS; CORY,

2007; KAZI et al., 2011; VOGLER et al., 2009).

1.2 Tratamento

O tratamento do câncer pode variar de acordo com o tempo de detecção, pois

quanto mais cedo for o diagnóstico, menor será o tamanho do neoplasma e mais

eficiente será o tratamento. Além disso, o tipo de tratamento estabelecido varia de

acordo com tecido afetado, com a velocidade de crescimento tumoral, com o grau de

diferenciação das células que compõem o tumor maligno e se este sofreu

metástase. Desta forma, mais de uma estratégia para o correto tratamento do

câncer pode ser necessária, e dentre elas há a cirurgia, a radioterapia e a

quimioterapia (INCA, 2012; WHO, 2012).

O que muitas vezes agrava o quadro do paciente e torna o tratamento do

câncer exponencialmente mais difícil é a metástase. Responsável por 90% das

mortes oriundas de quadros neoplásicos, a metástase é um processo extremamente

complexo, que ocorre por meio de uma série de eventos. Esses podem ser

representados pela invasão de tecidos adjacentes ao de origem do tumor, transporte

das células pela circulação sanguínea ou linfática, seguida pela fixação e

crescimento de novos focos tumorais em órgãos ou tecidos secundários (CHAFFER;

WEINBERG, 2011; MEHLEN; PUISIEUX, 2006; WAN; PANTEL; KANG, 2013).

Em busca de um tratamento que diminua as chances de metástases dos

tumores malignos e que seja capaz de regredir o seu crescimento, torna-se

necessária uma abordagem sistêmica. Esta é obtida por meio do tratamento

quimioterápico, pois as células tumorais, por estarem em constante divisão, são

32

mais suscetíveis aos fármacos antineoplásicos, dado o aumento da sua atividade

metabólica (DE ALMEIDA et al., 2005).

O tratamento quimioterápico também se mostra importante em casos nos

quais os tumores têm a característica de não serem sólidos, como os que afetam o

sistema hematopoiético. Como as células encontram-se disseminadas, esses tipos

tumorais têm uma dependência maior da quimioterapia antineoplásica, pois esta tem

uma capacidade maior de difundir-se (INCA, 2008).

Os fármacos disponíveis na terapia anticâncer têm diversos mecanismos de

ação e agem em diferentes etapas do ciclo celular. Dentre eles, podem-se destacar

os que atuam diretamente no DNA, por meio de alquilação; os antimetabólitos, que

atuam diretamente ou indiretamente na síntese de DNA; os intercalantes de DNA; os

inibidores de mitose e os inibidores de tirosina-quinase (DE ALMEIDA et al., 2005).

Entretanto, a maioria dos fármacos é altamente tóxica, principalmente sobre

células de rápida divisão celular o que causa os efeitos adversos como queda de

cabelo, náuseas e destruição da medula óssea (ROCHE, 2013). Além disso, muitos

pacientes exibem ou desenvolvem resistência aos agentes quimioterápicos

antineoplásicos existentes, ou seja, uma resistência intrínseca ou adquirida

(GARRAWAY; JANNE, 2012).

A resistência intrínseca é observada desde o início do tratamento e pode

estar relacionada ao crescimento lento das células, diminuição da captação dos

fármacos pelas células ou por propriedades bioquímicas/genéticas das células

(PATRICK, 2009). Entre estas propriedades, pode-se citar a alta expressão de

proteínas antiapoptóticas da família Bcl-2, que, como citado anteriormente, está

diretamente relacionada à resistência de diversas linhagens tumorais aos agentes

antineoplásicos utilizados na terapêutica (AMUNDSON et al., 2000; NÉMATI et al.,

2014; SAVRY et al., 2013).

Na resistência adquirida, o tumor inicialmente apresenta sensibilidade ao

fármaco e torna-se resistente ao longo do tratamento. Isto pode ocorrer devido a

uma mistura de células tumorais sensíveis e células resistentes ao fármaco. Com a

exposição do tumor ao agente antineoplásico, somente as células resistentes

sobrevivem e o neoplasma torna-se menos sensível ao quimioterápico (PATRICK,

2009).

33

Adicionalmente, células tumorais podem adquirir resistência a partir de

alterações em genes regulatórios, decorrentes da exposição ao próprio

quimioterápico (WU; HSIEH; WU, 2011). Portanto, torna-se evidente a importância

da introdução de novos fármacos para a terapia antineoplásica (GARRAWAY;

JANNE, 2012).

1.2.1 Inibidores de Bcl-2

Tendo em vista a necessidade de se ampliar as opções terapêuticas contra o

câncer, o desenvolvimento de compostos capazes de promover a inibição dos

membros antiapoptóticos da família Bcl-2 torna-se relevante, uma vez que

favoreceriam a apoptose em células cancerígenas, além de sensibilizá-las frente a

outros agentes quimioterápicos (KANG; REYNOLDS, 2009; MUKHERJEE et al.,

2010). Neste sentido, alguns agentes que possuem estas proteínas como alvo foram

desenvolvidos, conforme mostra a Tabela 2, e suas respectivas estruturas químicas

estão agrupadas na Figura 5.

Tabela 2. Fármacos inibidores de Bcl-2 em desenvolvimento.

Composto Alvo Estágio

Oblimersen® Bcl-2 Fase III

ABT-737 Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-w Fase I/II

ABT-263 (navitoclax) Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-w Fase I/II

ABT-199 (venetoclax) Bcl-2 Fase I/II

GX 15-070 (obatoclax) Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-w, Mcl-1 Fase I/II

AT 101-(R-(-)-gossypol) Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-w, Mcl-1 Fase I/II

(Fonte: KANG; REYNOLDS, 2009; SOUERS et al., 2013; YAP; WORKMAN, 2012).

O Oblimersen® (1) é um fármaco sintético oligonuclotídeo antisenso de DNA

de 18 bases e fita única, que foi desenvolvido para diminuir a expressão de RNA

mensageiro da proteína Bcl-2 (CHESON, 2007). Este fármaco está envolvido em

estudos clínicos para o tratamento de câncer de mama, melanoma, linfoma, entre

outros tumores, tanto em monoterapia ou associado a outro fármaco

(CLINICALTRIALS, 2015).

34

Figura 5. A sequência de nucleotídeos do Oblimersen® (1) e as estruturas químicas dos inibidores de

Bcl-2 ABT-737 (2), ABT-263 (navitoclax) (3), ABT-199 (4), GX 15-070 (obatoclax) (5) e AT 101 (6).

O Oblimersen® se liga seletivamente aos primeiros seis códons do RNAm,

formando um complexo que recruta a enzima RNase. Esta, consequentemente,

degrada a fita de RNA, liberando o fármaco para atuar em outras fitas. Como

resultado, ocorre a diminuição da expressão de proteínas Bcl-2, o que leva ao

35

aumento da sensibilidade das células neoplásicas aos agentes quimioterápicos

antineoplásicos (CHESON, 2007).

O ABT-737 (2) (Figura 5) foi um dos primeiros inibidores a serem

desenvolvidos pelo planejamento baseado no fragmento (Fragment-Based Drug

Design – FBDD), e possui alta afinidade com as proteínas Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-w

(ZHOU et al., 2012). Este fármaco está sendo testado em ensaios ex vivo de câncer

ovariano, sozinho e em associação (CLINICALTRIALS, 2015). Porém, o progresso

dos estudos foi prejudicado devido a sua baixa solubilidade e biodisponibilidade por

via oral (TSE et al., 2008).

O ABT-263 (3) (Figura 5), ou navitoclax, foi planejado a partir da otimização

do ABT-737 e tem afinidade pelas mesmas proteínas que seu precursor apresenta.

Ao contrário do ABT-737, o navitoclax pode ser administrado por via oral (ZHOU et

al., 2012), e já está sendo testado em tumores sólidos, linfomas e leucemias, em

monoterapia e em associação (CLINICALTRIALS, 2015).

Já o ABT-199 (4) (Figura 5), foi planejado para exibir seletividade apenas para

a proteína Bcl-2, pois os inibidores de Bcl-XL estão relacionados à toxicidade sobre

plaquetas, provocando trombocitopenia (SOUERS et al., 2013). O ABT-199 está em

teste para leucemia mieloide aguda e linfoma não-Hodgkin (CLINICALTRIALS,

2015).

O GX 15-070 (5) (Figura 5), ou obatoclax, é um análogo da cicloprodigiosina

com capacidade de inibição na Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-w e Mcl-1 (GOARD; SCHIMMER,

2013). Este composto está em estudo clínico para a terapia de diversos tipos de

tumor, dentre eles linfomas e câncer de pulmão, tanto em monoterapia quanto em

associação (CLINICALTRIALS, 2015).

Por fim, o AT 101 (6), um atropoisômero do gossipol, é um composto

polifenólico isolado de sementes e raízes da planta do algodão e também exibe

capacidade de inibição na Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-w e Mcl-1. Evidências sugerem que a

citotoxicidade do AT 101 também pode ser resultante de mecanismos adicionais,

como clivagem do DNA ou geração de espécies reativas de oxigênio (NI et al.,

2013).

O AT 101 está envolvido em estudos clínicos frente a diversos tumores como

os de próstata, pulmão e linfoma (CLINICALTRIALS, 2015). Este composto, bem

36

como o GX 15-070, se originou por meio da descoberta de produtos naturais com

potencial de inibição às proteínas da família Bcl-2, ressaltando a importância dessa

abordagem na descoberta de candidatos a fármaco.

1.2.2 Produtos naturais

O uso de produtos naturais para o tratamento do câncer reporta-se a tempos

remotos. Cerca de 60% dos agentes utilizados atualmente na terapia antineoplásica

advém de fontes naturais. O reino vegetal é o que mais contribui na utilização de

substâncias naturais para o tratamento de diversas doenças (BHANOT; SHARMA;

NOOLVI, 2011; COSTA-LOTUFO et al., 2010).

Este fato é devido à grande variedade e complexidade de metabólitos

secundários que as plantas podem fornecer. Esses compostos caracterizam-se pela

disposição de diversos heterociclos e centros quirais em suas estruturas, o que

justifica a sua variedade e complexidade. Muitos metabólitos secundários originam-

se a partir da adaptação e regulação das plantas ao ambiente, bem como em sua

proteção contra predadores (CHIN et al., 2006; MONTANARI; BOLZANI, 2001;

NEWMAN; CRAGG, 2012).

Os alcaloides merecem destaque dentre os diversos tipos de metabólitos

secundários existentes. Caracterizados por conter átomos de nitrogênio e anéis

heterocíclicos, essas substâncias estão presentes em muitas terapias para diversas

doenças, servindo tanto como fármaco, quanto protótipo para o planejamento de

novos compostos bioativos (KITTAKOOP; MAHIDOL; RUCHIRAWAT, 2014).

A vincristina (7) e a vimblastina (8) (Figura 6), de origem natural, junto à

vinorelbina (9) e à vindesina (10) (Figura 6), de origem semissintética, representam

um sucesso terapêutico no emprego de alcaloides para o tratamento do câncer

(FUMOLEAU; GUIU, 2013). Conhecidos como alcaloides da vinca, os compostos de

origem natural podem ser encontrados nas folhas da espécie Catharanthus roseus,

conhecida popularmente como vinca (BRANDÃO et al., 2010).

Os alcaloides da vinca atuam como desestabilizadores de microtúbulos,

atividade esta que resulta na lentidão ou bloqueio da mitose, ou seja, da divisão

celular (GIGANT et al., 2005). Devido a isso, são altamente empregados na terapia

37

contra o câncer, visto que as células tumorais estão em constante divisão.

Entretanto, a neuropatia apresenta-se como um importante efeito colateral

decorrente destes fármacos. Acredita-se que os microtúbulos sejam componentes

chave para os neurônios, o que justificaria tal neurotoxicidade (BRANDÃO et al.,

2010).

Figura 6. Estruturas químicas dos alcaloides da vinca: vincristina (7), vimblastina (8), vinorelbina (9) e

vindesina (10).

A camptotecina (11) (Figura 7), que pode ser encontrada na espécie vegetal

Camptotheca acuminata, é outro exemplo de alcaloide empregado para a terapia

anticâncer. Entretanto, devido à toxicidade promovida pelo metabólito carboxilato da

camptotecina, esta foi descontinuada durante os ensaios clínicos (CAO et al., 2005).

Contudo, a camptotecina apresenta um mecanismo de ação interessante

devido à sua atuação na inibição da síntese de DNA e RNA. Em estudos

38

mecanísticos mais aprofundados, verificou-se que essa atividade era devido à

interação da camptotecina com a topoisomerase I, que desempenha papel

importante nos processos de replicação e empacotamento de DNA (ULUKAN;

SWAAN, 2002).

Figura 7. Estruturas químicas da camptotecina (11), topotecana (12) e irinotecano (13).

Devido a isso, houve uma busca por derivados que apresentassem o mesmo

mecanismo de ação, porém com uma toxicidade menor. Dessa forma, a

camptotecina originou a topotecana (12) (Figura 7) e o irinotecano (13) (Figura 7),

ambos alcaloides de origem sintética. Embora menos tóxicos que seu protótipo,

esses compostos são empregados na terapia antineoplásica com precaução, pois

podem causar toxicidade em doses altas (XU; BARCHET; MAGER, 2010).

Um grupo de compostos que vem sendo bem estudado é o dos alcaloides

quaternários benzofenantridínicos. Essas substâncias podem ser encontradas em

diversas espécies da família Papaveraceae, tais como Sanguinaria canadensis,

Dicranostigma lactucoides, Chelidonium majus, Macleaya cordata and M. microcarpa

(SUCHOMELOV et al., 2007).

39

A sanguinarina (14) (Figura 8) e a queleritrina (15) (Figura 8) são consideradas

os alcaloides mais importantes deste grupo por demonstrarem propriedades

biológicas de maior interesse farmacológico (LIU et al., 2006).

Figura 8. Estruturas químicas dos alcaloides benzofenantridínicos sanguinarina (14) e queleritrina

(15).

A queleritrina está associada a diversos efeitos biológicos, apresentando ação

antimicrobiana (ZUO et al., 2008), anti-inflamatória (PENCIKOVA et al., 2012), na

doença de Alzheimer (BRUNHOFER et al., 2012) e efeito antitumoral (KAH et al.,

2008).

Hebert e colaboradores (1990) relacionaram a queleritrina à inibição de

proteína quinase C (PKC) no sítio de ligação do substrato dessa enzima, que é

muito relacionada à promoção de tumores (KOIVUNEN; AALTONEN; PELTONEN,

2006).

Além disso, Yu e colaboradores (2000) identificaram outro mecanismo pelo

qual a queleritrina exibe atividade antitumoral. Esse mecanismo consiste na ativação

das proteínas quinases c-Jun N-terminal (JNK) e a p38, relacionadas à regulação da

diferenciação celular e apoptose.

A hipótese mais discutida e aceita é que a queleritrina interage com proteínas

antiapoptóticas da família Bcl-2 (CHAN et al., 2003; KAH et al., 2008; LIU; WANG,

2012). Alguns estudos demonstraram que o alcaloide se liga à Bcl-XL em uma região

hidrofóbica da proteína, denominada sulco BH, que é próxima ao domínio BH3, no

qual as proteínas proapoptóticas tendem a se ligar.

A ligação da queleritrina no sulco BH da Bcl-XL promove sua inibição e o

deslocamento e liberação da proteína proapotótica (Bid, Bak ou Bax), anteriormente

40

ligada na região BH3 da Bcl-XL, induzindo, assim, a promoção da apoptose

(BERNARDO et al., 2008; ZHANG et al., 2006).

Ainda em relação à atividade antitumoral, a queleritrina exibiu atividade

citotóxica em diversas linhagens celulares humanas. Dentre elas a de carcinoma de

próstata humano (LNCaP e DU-145) (MALÍKOVÁ et al., 2006), de adenocarcinoma

de mama humano (MDA-MB-231) (MATKAR; WRISCHNIK; HELLMANN-

BLUMBERG, 2008) e de câncer gástrico humano (BGC-823) (ZHANG et al., 2012).

Esses dados demonstram a abrangência de linhagens nas quais a queleritrina pode

atuar.

Entretanto, observa-se uma baixa seletividade desse alcaloide às linhagens

tumorais em comparação às linhagens não tumorigênicas, como por exemplo a de

cultivo primário de fibroblastos gengivais humano (FGH) (MALÍKOVÁ et al., 2006) e

fibroblastos de pele humana (KF-II) (SLANINOVÁ et al., 2007). Isso pode ser

observado pelos valores de IC50 nas diversas linhagens relatadas, demonstrados na

Tabela 3.

Tabela 3. Valores de IC50 da queleritrina em diversas linhagens celulares.

Linhagens celulares IC50 (µM) da queleritrina Referências

LNCaP 22,0 (MALÍKOVÁ et al., 2006)

DU-145 6,0 (MALÍKOVÁ et al., 2006)

MDA-MB-231 6,7 (MATKAR; WRISCHNIK; HELLMANN-BLUMBERG,

2008)

BCG-823 6,31 (ZHANG et al., 2012)

FGH 4,7 (MALÍKOVÁ et al., 2006)

KF-II 1,5 (SLANINOVÁ et al., 2007)

LNCaP e DU-145 – carcinoma de próstata humano; MDA-MB-231 – adenocarcinoma de mama humano; BGC-

823 – câncer gástrico humano; FGH – cultivo primário de fibroblastos gengivais humano; KF-II – fibroblastos de

pele humana.

Sendo assim, o desenvolvimento de análogos mais seletivos e menos tóxicos

da queleritrina torna-se relevante, tendo em vista que este composto apresenta

diversos mecanismos de ação relatados e citotoxicidade em diversas linhagens

tumorais (BERNARDO et al., 2008; ZHANG et al., 2006).

41

1.3 Planejamento de fármacos

Com a existência de diversas moléculas com grande potencial para tornarem-

se fármacos, a descoberta de novas entidades químicas sempre foi um grande

desafio. Com a modernização do processo de planejamento de novos compostos

bioativos, essa descoberta pôde ser conduzida de maneira mais racional, baseado

no mecanismo farmacológico envolvido no processo fisiopatológico. A esta forma de

descoberta, é atribuído o termo planejamento racional de fármacos (BARREIRO;

FRAGA, 2005; CHAST, 2008; NEUMEYER, 2013; WEINER; WILLIAMS, 1994).

O advento do projeto genoma humano revolucionou a área da proteômica

(ANDERSON, 2003), que é o estudo de todas as interações, modificações,

isoformas e características estruturais das proteínas existentes em uma célula

(TYERS et al., 2003). A proteômica auxiliou no conhecimento de diversas

biomacromoléculas envolvidas nos processos fisiopatológicos, que foram

identificadas, então, como alvos terapêuticos para o planejamento de compostos

bioativos (SCHAFFHAUSEN, 2012). O planejamento racional a partir dessas

biomacromoléculas denomina-se de planejamento de fármaco a partir da estrutura

do alvo (SBDD – Structure-Based Drug Design) (AMARAL et al., 2003; MCKAY et

al., 2012).

Com o conhecimento da estrutura dos alvos terapêuticos surge a possibilidade

de elaborar substâncias com perfis farmacológicos melhor estabelecidos. Com a

informação acerca dos ligantes e de como eles interagem na biomacromolécula,

pode-se prever com maior precisão a resposta celular consequente (ANDERSON,

2003). A ressonância magnética nuclear (RMN) e a cristalografia de raio-x, permitiu

o acesso à estruturas tridimensionais (3D) dessas biomacromoléculas, possibilitando

a obtenção de maiores informações sobre a interação de ligantes nos alvos

(SCHAFFHAUSEN, 2012).

Quando não há informações sobre o alvo envolvido no processo fisiopatológico

ou o conhecimento da estrutura da biomacromolécula é incipiente, o planejamento

também pode se dar a partir de ligantes, denominado, então, de planejamento de

fármaco a partir do ligante (LBDD – Ligand-Based Drug Design). Leva-se em

consideração as propriedades estruturais, conformacionais e físico-químicas de uma

42

dada molécula, denominada de protótipo, que pode ser um ligante endógeno, um

composto natural ou outras substâncias com propriedades biológicas interessantes

para uma determinada doença (SHIM; MACKERELL, JR., 2011).

A abordagem por LBDD tem como objetivo a otimização dos ligantes

selecionados e pode ser aplicada com o intuito de melhorar parâmetros como

potência, seletividade, toxicidade e perfil farmacocinético. Dessa forma, o

planejamento de um fármaco pode se dar racionalmente, e a modificação molecular

torna-se base para que isso ocorra (SILVERMAN, 2004).

De maneira geral, as modificações moleculares podem alterar a

estereoquímica, as dimensões, a flexibilidade das estruturas moleculares, bem como

propriedades físico-químicas, como basicidade, lipofilicidade e distribuição

eletrônica. Portanto, as modificações moleculares podem alterar a resposta biológica

que um ligante pode desencadear, visto que as propriedades estruturais,

conformacionais e físico-químicas determinam a forma como o ligante interage com

o receptor (GALDINO; PITTA; BOUCHERLE, 2011).

Uma das modalidades de modificação molecular é a simplificação molecular,

uma estratégia que, ao ser empregada, pode reduzir rotas sintéticas e gerar

compostos com atividade biológica semelhante ou superior ao seu protótipo. Além

disso, é possível obter informações sobre a mínima estrutura química necessária

para a atividade biológica, ou seja, o grupo farmacofórico (PINACHO CRISÓSTOMO

et al., 2009).

Os anestésicos locais derivados da cocaína ilustram esse tipo de modificação,

conforme Figura 9. A simplificação empregada na estrutura do alcaloide cocaína (16)

gerou o composto procaína (17), que manteve o efeito anestésico local característico

de seu protótipo, sem apresentar as propriedades narcóticas (MORICE; WERMUTH,

2008).

Figura 9. Estruturas químicas da cocaína (16) e procaína (17).

43

Outro exemplo de sucesso terapêutico alcançado por meio da simplificação

molecular é a mefloquina (19) (Figura 10). Originada a partir da quinina (18) (Figura

10), um alcaloide componente da casca de Cinchona officinalis, a mefloquina possui

atividade antimalárica e tornou-se importante ao suplantar os fármacos mais antigos

da classe dos antimaláricos (BARREIRO, 2002).

Figura 10. Estruturas químicas da quinina (18) e mefloquina (19).

Como pode ser observado, o emprego da simplificação molecular, ainda que

tenha sido aplicado nos exemplos citados de maneira empírica, é uma estratégia de

extrema relevância. Com as ferramentas disponíveis atualmente, como por exemplo,

o uso de banco de dados e modelagem molecular, a estratégia de simplificação

molecular pode ser empregada de maneira racional (BARREIRO, 2002; PINACHO

CRISÓSTOMO et al., 2009; TOROPOV et al., 2012).

A aplicação de métodos computacionais em complemento ao planejamento

de compostos bioativos pode facilitar o processo de desenvolvimento.

Adicionalmente, pode integrar todas as informações obtidas a partir das estruturas e

correlacioná-las à atividade biológica dos compostos planejados. Dessa forma,

torna-se possível traçar uma relação-estrutura atividade dos compostos a partir da

modelagem molecular, o que pode contribuir de forma impactante no planejamento

racional de fármacos (SANT’ANNA, 2009).

Face ao exposto, pode-se observar que o processo de desenvolvimento de

fármacos é desafiador, demanda tempo, recursos e necessita de uma abordagem

multidisciplinar. Por isso, o planejamento racional de fármacos pode oferecer

subsídios de modo a reduzir alguns problemas provenientes do processo de

desenvolvimento, podendo ao mesmo tempo aumentar a probabilidade de formação

de uma nova molécula bioativa (GALDINO; PITTA; BOUCHERLE, 2011).

44

2 OBJETIVOS E JUSTIFICATIVA

De acordo com os dados acerca do câncer, pode-se notar que este grupo de

doenças representa problema de grande impacto mundial. Devido à problemática da

terapia antineoplásica, composta principalmente de quimioterápicos tóxicos e pouco

seletivos, é de extrema importância que sejam realizadas pesquisas na área para o

alcance de uma terapia mais eficiente e que aumente a qualidade de vida dos

pacientes acometidos.

Dessa forma, o objetivo geral deste trabalho foi o planejamento, a síntese e a

avaliação da citotoxicidade de análogos da queleritrina planejados por simplificação

molecular, no intuito de se obter compostos mais seletivos para as linhagens

tumorais. Esse projeto ainda conta com os seguintes objetivos específicos:

Síntetizar e purificar os análogos propostos da queleritrina;

Avaliar a citotoxicidade dos compostos em culturas de células de linhagens

não-tumorigênicas de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC)

e fibroblasto de pulmão (LL24), e em linhagens tumorais como a linfoblastoide

humana (Jurkat), de melanoma humano (SK-Mel-28) e em carcinoma de

pulmão humano epitelial alveolar basal (A549);

Realizar estudos mecanísticos complementares nas linhagens tumorigênicas

as quais os análogos mais promissores apresentarem atividade biológica;

Determinar, por estudos teóricos, as propriedades eletrônicas e lipofílicas, tais

como os mapas de potencial eletrostático, mapas de orbital molecular, vetor

de momento dipolo, CLog P (logaritmo do coeficiente de partição calculado),

peso molecular, HBA (sítios aceptores de ligação de hidrogênio) e HBD (sítios

doadores de ligação de hidrogênio) dos compostos sintetizados para

correlacionar com a atividade biológica.

45

3 PLANEJAMENTO DOS ANÁLOGOS

Foi utilizado como protótipo a queleritrina, um produto natural que possui 5

anéis em sua estrutura, representados pelas letras A, B, C, D e E (Figura 11). Foram

propostas modificações moleculares à estrutura do protótipo, cujo intuito foi o auxílio

nos estudos de elucidação de grupo farmacofórico, dos grupos acessórios e a

obtenção dos análogos em etapas sintéticas reduzidas.

Figura 11. Representação das modificações propostas na molécula de queleritrina.

Para todas as séries de análogos, as regiões A e B foram mantidas, pois em

estudo coordenado por Bernardo e colaboradores (2008), ao retirar a estrutura

benzodioxol da queleritrina e mantendo os anéis C, D e E na mesma composição a

desse alcaloide, verificou-se ausência de atividade sobre a Bcl-XL nas

concentrações testadas no estudo. Dessa forma, pode-se supor que o benzodioxol

pode ser necessário para a atividade da queleritrina.

Já nas regiões C e D, foi proposta a abertura dos anéis, com o intuito de

verificar se estes representam grupos acessórios, bem como obter os análogos em

etapas sintéticas reduzidas. No nitrogênio presente na região D, pode ser adicionado

uma metila ou hidrogênio, visando à verificação da contribuição destes

46

grupos/átomos para a atividade biológica. Além disso, a carga formal positiva será

retirada no intuito de aumentar a lipofilicidade do composto com possível melhoria

dos parâmetros farmacocinéticos que os análogos podem apresentar em relação à

queleritrina.

Por fim, na região E, foram feitas variações de posição e de número de

grupos metoxilas e hidroxilas ligados ao anel, pois no estudo coordenado por

Bernardo e colaboradores (2008), foi observado também que ao substituir os grupos

metoxilas por hidroxilas houve aumento de potência dos análogos. A variação de

posição dos substituintes no anel auxiliará na verificação se esse aumento é

promovido apenas nas posições R1 e R2 (Figura 11), conforme verificado nesse

mesmo estudo.

47

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Material

Para o desenvolvimento do presente trabalho utilizaram-se as vidrarias e

equipamentos usualmente empregados em laboratório, em conjunto aos reagentes e

solventes listados a seguir:

Reagentes

Piperonilamina (Sigma-Aldrich);

Benzaldeído (Vetec);

4-metoxibenzaldeído (Merck);

3,4-dimetoxibenzaldeído (Sigma-Aldrich);

3,4,5-trimetoxibenzaldeído (Sigma-Aldrich);

3-metoxi-4-hidroxibenzaldeído (Sigma-Aldrich);

3,4-di-hidroxibenzaldeído (Sigma-Aldrich);

Triacetoxiboroidreto de sódio (Sigma-Aldrich);

Ácido acético glacial (Jt. Baker);

Ácido fórmico (Merck);

Formaldeído (Quimex).

Solventes

Diclorometano (Synth);

Acetona (Synth);

Acetato de etila (Synth);

Hexano (Synth)

Metanol (Synth);

Éter etílico (Synth);

Trietilamina (Vetec);

Ácido clorídrico (Synth);

Ácido sulfúrico (Synth);

48

Água destilada;

Clorofórmio deuterado (Cambridge Isotope Laboratories);

Dimetilsulfóxido deuterado (Cambridge Isotope Laboratories).

4.2 Métodos sintéticos

Os compostos análogos à queleritrina foram divididos em duas séries, das

quais a série 2a-g é caracterizada pelo grupo funcional amina secundária e a série

3a-d, pela amina terciária, conforme Figura 12.

Figura 12. Representação esquemática das sínteses dos análogos. Reagentes e condições: (i)

piperonilamina, NaBH(OAc)3, DCM, t.a., N2, 3-5 h; (ii) HCl etérico a 6,8 M; (iii) formaldeído, ácido

fórmico, 110 ºC, 2-4 h.

4.2.1 Síntese das aminas secundárias

Para a formação das aminas secundárias, o método selecionado foi adaptado

a partir de reações realizadas por Abdel-Magid e colaboradores (1996), no qual o

agente redutor é adicionado junto à amina e ao aldeído, sem o isolamento prévio da

imina, com a redução seletiva deste grupo ao invés do aldeído. Experimentalmente,

2 mmol do aldeído e 2,3 mmol de ácido acético glacial (146 µL, 1,15 eq) foram

dissolvidos em 10 mL de diclorometano e, após 30 minutos, 2,2 mmol do nucleófilo

(281,6 µL, 1,1 eq de piperonilamina) foram adicionados ao sistema. A mistura

reacional foi mantida sob agitação e atmosfera inerte de nitrogênio por 30 minutos e,

então, 2,8 mmol (593,6 mg, 1,4 eq) do agente redutor NaBH(OAc)3 foram

adicionados. O sistema foi mantido sob as mesmas condições até o consumo total

49

do aldeído e o acompanhamento da reação foi realizado por cromatografia em

camada delgada (CCD), com fase móvel de hexano/acetato de etila 4:1 (v/v) e 5%

de trietilamina para os compostos 2a e 2b; fase móvel de hexano/acetato de etila 1:1

(v/v) e 5% de trietilamina para os compostos 2c, 2d e 2e; ou fase móvel de

clorofórmio/metanol 9:1 (v/v) para o composto 2f. Ao final da reação, acrescentou-se

10 mL de solução de NaOH 1,25 M para os compostos 2a-e e 10 mL de água

destilada para o composto 2f.

Para purificação, realizou-se extração com diclorometano (3 x 20 mL),

solução NaOH 1,25 M (1 x 20 mL), e solução saturada de NaCl (1 x 60 mL) para os

compostos 2a-e. Para o composto 2f, realizou-se extração com diclorometano (1 x

20 mL), acetato de etila (3 X 20 mL) e solução saturada de NaHCO3 (1 x 20 mL).

Posteriormente, a fase orgânica foi seca com Na2SO4 anidro e removeu-se o

solvente por rotaevaporação. Realizou-se coluna cromatográfica quando necessário.

O produto resultante foi transformado em sal de cloridrato por meio de uma solução

saturada de HCl a 6,8 M em éter e o sólido foi posteriormente lavado com éter ou

clorofórmio gelado. O armazenamento e as análises foram feitos com os compostos

na forma de cloridrato.

4.2.2 Síntese das aminas terciárias

Para a formação das aminas terciárias, o método selecionado foi adaptado a

partir de reações realizadas por Minarini e colaboradores em 2008.

Experimentalmente, 1,0 mmol da amina secundária na forma de cloridrato foi

solubilizada em 8 mL de ácido fórmico (98-100%) sob refluxo de aproximadamente

120 ºC. Logo em seguida, 8 mL de formaldeído (36-38%) foram adicionados gota a

gota. O acompanhamento da reação foi realizado por cromatografia em camada

delgada (CCD), com fase móvel de hexano/acetato de etila 4:1 (v/v) e 5% de

trietilamina para os compostos 3a e 3b e fase móvel de hexano/acetato de etila 1:1

(v/v) e 5% de trietilamina para os compostos 3c e 3d. A condições reacionais foram

mantidas até o consumo total da amina secundária.

Para purificação, a solução foi basificada com NaOH 10 M e, em seguida,

procedeu-se a uma extração com diclorometano (2 x 60 mL) e acetato de etila (2 x

60 mL). Posteriormente, a fase orgânica foi seca com Na2SO4 anidro e o solvente foi

50

removido sob pressão reduzida. A coluna cromatográfica foi utilizada quando

necessário. O produto resultante foi purificado através da formação de sal de

cloridrato por meio de uma solução saturada de HCl a 6,8 M em éter. O

armazenamento e a caracterização dos compostos foram feitos com as aminas na

forma de cloridrato.

4.3 Métodos analíticos

4.3.1 Cromatografia em camada delgada (CCD) e cromatografia em

coluna

O acompanhamento das reações foi realizado por CCD, utilizando

cromatofolhas de alumínio cobertas com sílica GF254 (Merck). A observação das

placas foi feita por luz ultravioleta (UV) e a revelação destas, com as soluções de

vanilina, 2,4-dinitrofenil-hidrazina ou ácido fosfórico molibdato, conforme

necessidade. Foram utilizadas colunas de vidro e sílica gel 60 (Merck) para a

separação e purificação dos compostos obtidos.

4.3.2 Espectrometria por ressonância magnética nuclear (RMN)

As análises espectroscópicas de RMN 1H e 13C foram realizadas em

espectrômetro Bruker 300 MHz, modelo Advanced DPX-300, na Faculdade de

Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo.

4.3.3 Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) acoplado ao UV

As análises cromatográficas por CLAE foram feitas no laboratório de química

analítica do departamento de Farmácia da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da

universidade de São Paulo. As purezas cromatográficas dos compostos sintetizados

foram determinadas no cromatógrafo Shimadzu Proeminence com coluna analítica

C-18 da marca Gemini® (5µ, 150 x 4,6 mm). A detecção foi conduzida por

51

ultravioleta (UV) em 230 nm. A separação foi realizada em gradiente de eluição com

fase móvel de metanol e solução aquosa de ácido trifluoracético (0,1%).

4.3.4 Análise elementar (CHN)

A análise elementar das moléculas foi realizada na Central Analítica do

Instituto de Química da USP em analisador elementar Perkin Elmer® 2400 CHN. A

variação dos valores experimentais não poderá exceder a ± 0,5% dos valores

teóricos calculados para cada composto.

4.4 Métodos biológicos

Os ensaios de atividade antitumoral contaram com a colaboração dos

pesquisadores Dr. Ricardo A. Azevedo, Dr. Adilson K. Ferreira e da mestranda

Sarah Fernandes Teixeira, vinculados ao Laboratório de Imunologia de Tumores do

Instituto de Ciências Biomédicas da USP (ICB/USP) do Prof. Dr. José Alexandre M.

Barbuto.

4.4.1 Cultura celular

Para a realização dos ensaios foram utilizadas as linhagens não-

tumorigênicas de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) e

fibroblasto de pulmão (LL24), e linhagens tumorais linfoblastoide humana (Jurkat),

de melanoma humano (SK-Mel-28) e em carcinoma de pulmão humano epitelial

alveolar basal (A549).

As linhagens HUVEC, Jurkat, SK-Mel-28 e A549 foram cultivadas em meio de

cultura RPMI-1640, pH 7.0, suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB)

inativado, penicilina (100 U/mL) e estreptomicina (100 μg/mL). A linhagem LL24 foi

cultivada em meio de cultura DMEM, pH 7.0, suplementado com 20% de soro fetal

bovino (SFB) inativado, penicilina (100 U/mL) e estreptomicina (100 μg/mL). Os

52

frascos de cultura de 75 cm2 foram mantidos em estufa contendo atmosfera úmida

com 5% de CO2 a 37°C.

4.4.2 Avaliação da citotoxicidade

Para a avaliação da viabilidade celular foi utilizado o teste colorimétrico do

MTT [brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-1)2,5-difenil tetrazólio]. Foram plaqueadas em

triplicata 104 células das linhagens utilizadas em 100 µL em placas de 96 poços e

cultivadas por 2 horas em estufa contendo 5% de CO2 a 37°C. Após o período de

incubação, as células foram tratadas durante 24 horas com os compostos

sintetizados, a queleritrina e o paclitaxel (como controle positivo) nas concentrações

de 50, 100 e, em alguns casos, 150 µM, para a triagem dos compostos. Para a

determinação da concentração inibitória (IC50), foram escolhidas 5 concentrações

diferentes que variaram de acordo com o resultado da triagem dos compostos. Após

o tratamento foram adicionados 5 μL de MTT (5 mg/mL) às células e estas foram

incubadas por 2 horas. Após este período, o meio foi removido e acrescentou-se 100

μL de Dimetilsulfóxido (DMSO) para dissolver os cristais de formazan formados e

precipitados. A quantificação da absorbância foi realizada em leitor de ELISA com

comprimento de onda de 540 nm. Os resultados de citotoxicidade, em triplicada intra

e interexperimento, foram transformados em porcentagem de células viáveis,

conforme a equação a seguir:

% células viáveis= (𝐴𝑎−𝐴𝑏)×100 𝐴𝑐−𝐴𝑏

Onde: 𝐴𝑎 = absorbância das amostras; 𝐴𝑏 = absorbância do branco; 𝐴𝑐 =

absorbância do controle positivo.

Os dados foram plotados no software Prism 5 versão 5.03 (GraphPad

Software, Inc, 2009), onde calculou-se a IC50 segundo o tutorial fornecido pelo

Prism.

53

4.4.3 Ensaio clonogênico

O composto mais promissor do ensaio de citotoxicidade em A549 foi avaliado

também quanto ao seu potencial de inibição da proliferação celular por meio do

ensaio clonogênico.

Para a avaliação do efeito inibitório do composto sobre a proliferação das

células, foram plaqueadas, em triplicata, 200 células da linhagem A549 em 500 µL

em placas de 12 poços e cultivadas por 2 horas em estufa contendo 5% de CO2 a 37

°C. Após o período de incubação, as células foram tratadas durante 24 horas com o

composto selecionado nas concentrações de 100, 75 e 50 µM. Após o tratamento, o

meio foi trocado por 1 mL de meio não metabolizado e as células foram cultivadas

por 10 dias. O meio foi, então, removido e os poços foram lavados com 500 µL de

tampão salina fosfato (PBS) não estéril por duas vezes e as colônias formadas

foram fixadas com solução de glutaraldeído 6% e coradas com cristal de violeta

0,5% diluídos em PBS. As colônias foram contadas e as placas foram fotografadas

para a comparação do crescimento das colônias nos diferentes tratamentos em

relação ao controle não tratado. Os dados foram plotados no software Prism 5

versão 5.03 (GraphPad Software, Inc, 2009), onde obtiveram-se o gráfico e os dados

estatísticos do ensaio.

4.4.4 Análise do ciclo celular

Para o estudo das fases do ciclo celular, as células da linhagem A549 foram

plaqueadas em placas de 12 poços na concentração de 1 x 105 céls/poço e

cultivadas por 2 horas em estufa contendo 5% de CO2 a 37°C. Para a sincronização,

o meio foi trocado por RPMI sem adição de soro fetal bovino. Após 12 h de

incubação, o meio foi removido e as células foram tratadas com o composto

estudado no ensaio clonogênico, nas concentrações utilizadas no mesmo, diluído

em meio RPMI suplementado com 10% de SFB e incubadas em estufa contendo 5%

de CO2 a 37°C. Após 24 h de incubação, as células foram extraídas dos poços,

lavadas três vezes com solução de PBS/BSA 0,5% azida 0,05% e centrifugadas por

10 min a 1200 RPM. O pellet foi ressuspenso em 2 mL de etanol 70% gelado e

54

mantido sob refrigeração por 1 h. Logo após, a amostra foi centrifugada e o pellet

resultante foi ressuspenso em 300 μL de solução composta de 0,1% de Triton X-

100, 0,1% de citrato de sódio, 50 μg/mL de Iodeto de Propídeo e 10 μg/mL de

RNAse (Sigma); e incubado a 37 ºC por 1h na ausência de luz. Os dados foram

adquiridos em citometria de fluxo (FACSCalibur). Para a determinação da

porcentagem de células em cada fase do ciclo, utilizou-se o algoritmo Dean Jett-Fox,

do software FlowJo (TreeStar Inc., Ashland, OR, EUA).

4.5 Métodos computacionais

Os estudos de modelagem molecular foram realizados em colaboração com o

prof. Dr. Gustavo Henrique Goulart Trossini, do Departamento de Farmácia da FCF-

USP. Foram utilizados os programas Spartan’10 versão 1.1.0 (Wavefunction Inc,

2011), HyperChem versão 8.0.7 (Hypercube Inc) e ViewerLite versão 4.2 (Accelrys

Inc, 2001) em computador PC Windows 7 professional de configuração Intel(R)

Xeon(R) CPU 31270, 3.40 GHz, RAM 12.0 GB, sistema operacional de 64 bits.

Os modelos tridimensionais das estruturas dos compostos foram construídos

considerando-se sua forma catiônica, uma vez que a queleritrina possui carga formal

positiva e as aminas sintetizadas encontram-se, em maioria, protonadas em pH

fisiológico. A otimização da geometria se deu pelos métodos de mecânica molecular

MMFF, semi-empírico PM6 e Hartree-Fock 6-31G* no programa Spartan’10.

A partir das estruturas otimizadas foram calculados os mapas de potencial

eletrostático, mapas de orbital molecular, vetor de momento dipolo, CLog P

(logaritmo do coeficiente de partição calculado), peso molecular, HBA (sítios

aceptores de ligação de hidrogênio) e HBD (sítios doadores de ligação de

hidrogênio) utilizando o método Hartree-Fock 6-31G*. O alinhamento dos ligantes foi

realizado pelo programa HyperChem versão 8.0.7 (Hypercube Inc) e a determinação

de distâncias interatômicas, bem como dos ângulos diedros das estruturas foi

realizada no programa ViewerLite versão 4.2 (Accelrys Inc, 2001) (SANT’ANNA,

2009).

55

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Foram sintetizados dez compostos das séries propostas, dentre eles seis

aminas secundárias e quatro aminas terciárias. Os valores de rendimento, fator de

retenção, aspecto físico e pureza cromatográfica podem ser verificados na Tabela 4.

Os seus respectivos espectros de RMN 1H e 13C, cromatogramas e dados de análise

elementar constam no Anexo I.

Tabela 4. Resultados obtidos na síntese dos análogos da queleritrina das séries das aminas

secundárias e terciárias.

Composto Estrutura CLAE Aspecto físico Rf Rendimento

global (%)

2a

t = 11,9 min

pureza >95% Sólido branco 0,371 44

2b

t = 6,1 min

pureza >98%

Sólido branco 0,331 54

2c

t = 7,7 min

pureza >99%


2d

t = 8,0 min

pureza >99%


2e

t = 8,1 min

pureza >98%


2f

t = 8,1 min

pureza >96% Sólido amarelo 0,113 4

3a

t = 12,2 min


3b

t = 6,0 min


3c

t = 9,3 min


3d

t = 7,7 min


1 Fator de retenção, obtido com o sistema eluente acetato de etila e hexano na proporção 1:4 e 2,5% de trietilamina; 2 Fator de retenção, obtido com o sistema eluente acetato de etila e hexano na proporção 1:1 e 5% de trietilamina; 3 Fator de retenção, obtido com o sistema eluente clorofórmio e metanol na proporção 9:1.

56

5.1 Síntese e caracterização das aminas secundárias

Para a formação de aminas secundárias, a melhor metodologia descrita na

literatura e geralmente a de primeira escolha é a redução de iminas

(BHATTACHARYYA, 1995; PELTER; ROSSER; MILLS, 1984; SALVATORE; YOON;

JUNG, 2001).

Essa metodologia pode ser desenvolvida de duas formas (Figura 13): (a)

forma indireta, na qual há a formação, isolamento da imina e posterior redução e se

processa em duas etapas e; (b) forma direta ou aminação redutiva, na qual há a

formação da imina e redução imediata desse grupo funcional, processando-se, desta

forma, em apenas uma etapa (ABDEL-MAGID et al., 1996).

Figura 13. Representação esquemática da formação de aminas secundárias a partir de iminas de (a)

forma indireta e (b) forma direta ou aminação redutiva (CHO; KANG, 2005).

Para este trabalho, a principal dificuldade na utilização da forma indireta

consistiu no fato de que as iminas que seriam obtidas são instáveis e acabavam se

decompondo à amina primária e aldeído. Isto se deve, provavelmente, à falta de um

grupo eletronegativo ligado diretamente ao nitrogênio da ligação imínica, pois esse

tipo de substituinte pode participar da conjugação da dupla ligação entre o carbono e

o nitrogênio, diminuindo a carga parcial positiva sobre o carbono e sua

suscetibilidade a um ataque nucleofílico (Figura 14) (CLAYDEN; GREEVES;

WARREN, 2012a).

57

Figura 14. Representação das estruturas de ressonância de iminas com um grupo eletronegativo

ligado ao nitrogênio: (a) oxima e (b) sulfonil-hidrazona (CLAYDEN; GREEVES; WARREN, 2012a).

A forma direta é vantajosa nos casos em que o equilíbrio de formação da

imina não é favorável o suficiente para permitir o seu isolamento (SCHELLENBERG,

1963), como no caso deste trabalho. Porém demanda a utilização de um agente

redutor seletivo para a ligação imínica e que não reduza o aldeído (CLAYDEN;

GREEVES; WARREN, 2012a).

O uso do cianoboroidreto de sódio (NaBH3CN) foi introduzido por Borch,

Bernestein e Durst em 1971. Este agente redutor foi relatado como um composto

versátil que, em condições adequadas, teria a capacidade de reduzir seletivamente

as iminas. Ao testar a metodologia descrita por Borch (1972), foi observado um

baixo rendimento e a formação de muitos subprodutos, o que dificultou a purificação

do composto. Além disso, o NaBH3CN é descrito na literatura como um composto

que pode gerar subprodutos altamente tóxicos como o HCN e o NaCN e, portanto,

está sendo pouco utilizado atualmente (CHO; KANG, 2005; GRENGA et al., 2009;

SAXENA; BORAH; SARMA, 2000).

A metodologia de Abdel-Magid e colaboradores (1996), baseada nas

descobertas de Gribble e colaboradores (1974), descreve também a formação de

aminas secundárias por meio da aminação redutiva. Esta metodologia contempla o

uso do triacetoxiboroidreto de sódio (NaBH(OAc)3) como agente redutor (Figura 15),

visto que há relatos de que este reagente pode reduzir seletivamente o grupo imina,

e em menores proporções, o aldeído (ABDEL-MAGID; MARYANOFF; CARSON,

1990). Devido a vantagem de produzir menos produtos tóxicos e gerar maiores

58

rendimentos dos compostos desejados, essa foi a metodologia utilizada neste

trabalho.

Figura 15. Mecanismo de formação de amina secundária por aminação redutiva (ABDEL-MAGID;

MEHRMAN, 2006; EVANS; CHAPMAN; CARREIRA, 1988).

A redução seletiva do NaBH(OAc)3 é atribuída à sua característica de agente

redutor moderado, que é devido à presença dos três grupos acetoxi promotores de

efeito estérico e elétron-retirador sobre o boro. Estes efeitos estabilizam a ligação do

boro com o hidrogênio, responsável pela propriedade redutora do composto

(ABDEL-MAGID; MEHRMAN, 2006; EVANS; CHAPMAN; CARREIRA, 1988).

Foi empregado o uso de ácido acético glacial na reação, pois na ausência

deste, a reação se processava mais lentamente, favorecendo a formação de

subprodutos que não foram caracterizados. O excesso de ácido acético

(quantidades superiores a 2 eq) também pode favorecer a formação de subprodutos,

porém estes podem estar relacionados à redução do aldeído (ABDEL-MAGID;

MEHRMAN, 2006).

Os produtos foram obtidos na forma de sal de cloridrato que variaram a

coloração de branco (2a-e) a amarelo claro (2f). Cada composto se diferencia pela

presença e quantidade de substituintes metoxila e hidroxila. O produto 2a é

59

caracterizado pela ausência de substituintes e os demais compostos são

caracterizados pela presença de uma metoxila na posição 4 (2b); duas metoxilas em

3 e 4 (2c); três em 3, 4 e 5 (2d), uma metoxila na posição 3 e uma hidroxila na

posição 4 (2e) e duas hidroxilas nas posições 3 e 4 (2f).

A grande vantagem da obtenção dos produtos na forma salina consiste na

melhoria de certas propriedades, tais como o aumento da estabilidade das

substâncias e o aumento de sua solubilidade em meio aquoso. Esta última pode ser

favorável para o uso dos compostos em ensaios biológicos in vitro, visto que o meio

utilizado é formado principalmente de água, assim como os fluidos biológicos

(PAULEKUHN; DRESSMAN; SAAL, 2007; SERAJUDDIN, 2007).

Os rendimentos das reações variaram de 4 a 54 %, valores os quais são

considerados de moderados a pouco apreciáveis. Estes podem estar relacionados à

formação de subprodutos, como, por exemplo, as aminas terciárias formadas pela

condensação da piperonilamina com duas moléculas de aldeído, ou aos métodos de

purificação utilizados (ABDEL-MAGID; MEHRMAN, 2006).

O análogo 2f possui característica anfortérica, ou seja, a molécula pode atuar

como base ou ácido (IUPAC, 2014). Esta característica é atribuída à presença do

grupo amino básico e das duas hidroxilas fenólicas ácidas e, dependendo do pH do

meio, ficam protonados ou desprotonados (CLAYDEN; GREEVES; WARREN,

2012b; MCMURRY, 2011a). Dessa forma, ao realizar uma extração básica, ácida ou

neutra, detectou-se baixa concentração da forma molecular do composto na fase

orgânica, o que gerou grande perda do composto, uma vez que a fase aquosa

concentrou não apenas o produto, como diversas impurezas provenientes da

reação, o que justifica o baixo rendimento de 4%.

A Figura 16 ilustra o espectro de RMN 1H do composto 2d, um representante

da série das aminas secundárias, na qual observa-se a formação da amina

secundária pela ausência dos deslocamentos em 9,88 ppm e em 3,77 ppm que são

característicos da carbonila do aldeído e do metileno ligado ao nitrogênio da

piperonilamina respectivamente. Na amina secundária, estes sinais foram

substituídos pelos deslocamentos em 4,03-4,01 ppm (H7 e H9) dos metilenos

ligados ao nitrogênio.

60

Figura 16. Espectro de RMN 1H do produto 2d.

Na figura 17, o espectro de RMN 13C do produto 2d exemplifica o perfil dos

espectros dessa série, no qual os deslocamentos em 49,6 e 49,4 ppm dos carbonos

C9 e C7, respectivamente, indicam a presença da amina secundária.

Concomitantemente, pode-se observar a ausência dos deslocamentos químicos em

191,0 e 46,2 ppm característicos da carbonila do aldeído e do metileno ligado ao

nitrogênio da piperonilamina, respectivamente, indicando que houve a formação da

amina secundária.

H7,9

H7,9

61

Figura 17. Espectro de RMN 13C do produto 2d.

Para complementar a caracterização, os compostos foram submetidos à

análise elementar (Tabela 5), e os resultados obtidos encontram-se dentro dos

limites de variação aceitáveis (±0,50% de variação).

Tabela 5. Análise elementar das aminas secundárias.

Composto Análise elementar (%)

Teórico Amostra Desvio

2a

C= 64,87

H= 5,81

N= 5,04

C= 64,43

H= 5,61

N= 5,09

C= 0,44

H= 0,20

N= 0,05

2b

C= 62,44

H= 5,89

N= 4,55

C= 62,44

H= 5,80

N= 4,69

C= 0,00

H= 0,09

N= 0,14

2c

C= 60,44

H= 5,97

N= 4,15

C= 60,36

H= 6,05

N= 4,36

C= 0,08

H= 0,08

N= 0,21

C7,9

62

2d

C= 58,78

H= 6,03

N= 3,81

C= 58,28

H= 5,91

N= 3,74

C= 0,50

H= 0,12

N= 0,07

2e

C= 59,35

H= 5,60

N= 4,33

C= 59,05

H= 5,58

N= 4,43

C= 0,30

H= 0,02

N= 0,10

2f

C= 58,17

H= 5,21

N= 4,52

C= 58,06

H= 5,86

N= 4,26

C= 0,11

H= 0,65

N= 0,26

Determinaram-se também as purezas cromatográficas dos compostos por

cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) e todas as aminas secundárias

sintetizadas nesse trabalho mostraram-se com pureza de 95% (Tabela 4),

considerada aceitável para dar prosseguimento aos ensaios biológicos.

5.2 Síntese e caracterização de aminas terciárias

A formação de aminas terciárias N-metiladas pode ocorrer por meio da reação

de substituição nucleofílica do iodeto de metila com as aminas secundárias

formadas (Figura 18).

Figura 18. Mecanismo de formação de amina terciária por SN2 (REGAN; CRAIG; BRAUMAN, 2002).

Trata-se de uma substituição nucleofílica de segunda ordem (SN2), pois o

grupo alquílico do iodeto de metila é primário e formaria carbocátions instáveis.

Dessa forma, a velocidade de reação depende do ataque do nucleófilo (amina

secundária) ao substrato (iodeto de metila) e não da formação de um intermediário

(carbocátion), ou seja, o aumento da velocidade é dependente da concentração de

ambos os reagentes (SMITH; MARCH, 2007).

63

Ao testar a metodologia de formação de aminas terciárias N-metiladas por

SN2, o iodeto de metila foi escolhido como agente alquilante devido ao fato do iodo

constituir um bom grupo de saída, pois o iodeto resultante é um ânion estável

(CAREY, 2000). As aminas constituem bons nucleófilos, uma vez que possuem um

par eletrônico disponível (SALVATORE; YOON; JUNG, 2001).

O emprego de bases em reações que aconteçam via SN2 é desejável, visto

que essas podem aumentar a nucleofilicidade das aminas secundárias, por meio da

abstração do hidrogênio ligado ao nitrogênio (MCMURRY, 2011b).

A acetona, solvente utilizado na metodologia, é uma escolha comum para a

realização desse tipo de reação, pois é polar o suficiente para dissolver o nucleófilo,

porém não tão polar a ponto de solvatá-lo, tornando o nucleófilo mais reativo perante

o substrato (CLAYDEN; GREEVES; WARREN, 2012c; SOLOMONS, T. W. G.

FRYHLE, 2011).

Entretanto, as aminas secundárias são passíveis de dialquilação (DA SILVA;

ESTEVAM; BIEBER, 2007), ou seja, além de gerar as aminas terciárias, formavam-

se também os sais de amônio quaternário, mesmo controlando a estequiometria

com o uso em excesso da amina.

Em busca de metodologia mais seletiva para a formação de aminas terciárias

N-metiladas, a metilação redutiva mostrou-se mais adequada para a formação das

aminas desejadas. Também denominada de reação de Eschweiler-Clark, foi

nomeada em homenagem ao químico alemão Wilhelm Eschweiler, quem

inicialmente reportou essa reação em 1905 e ao químico britânico Hans Thacher

Clarke, que em colaboração com Gillespie e Weisshaus em 1933, reportou o uso da

reação para a metilação de aminas e aminoácidos (CLARKE; GILLESPIE;

WEISSHAUS, 1933; ESCHWEILER, 1905).

A reação de Eschweiler-Clark tem o mecanismo semelhante à aminação

redutiva, porém ao invés de possuir a versatilidade de escolha de diversos aldeídos

ou cetonas, a metilação redutiva ocorre apenas com o formaldeído e utiliza somente

o ácido fórmico como agente redutor e também como solvente (Figura 19) (PINE;

SANCHEZ, 1971).

64

Figura 19. Mecanismo de formação de amina terciária por metilação redutiva (PINE, 1968).

A reação de Eschweiler-Clarke tem como principal vantagem, a formação

seletiva de aminas terciárias a partir de aminas secundárias, se comparado à reação

de alquilação. Isto se deve ao fato das aminas terciárias não formarem iminas com o

formaldeído, portanto não sendo possível a formação de sal de amônio quaternário,

que é o principal subproduto da alquilação de aminas secundárias (DA SILVA;

ESTEVAM; BIEBER, 2007; SALVATORE; YOON; JUNG, 2001).

Dessa forma, os compostos foram obtidos a partir da metilação redutiva e

transformados em sal de cloridrato. E, assim como seus precursores, os sais

possuem coloração branca e cada produto se diferencia pela presença e quantidade

de substuintes metoxila. Os rendimentos globais das reações foram de 31% para o

3a; 13% para o 3b; 23% para o 3c e 22% para o 3d.

As aminas terciárias correspondentes aos compostos 2e e 2f não foram

obtidas com sucesso devido à presença de hidroxila fenólica em sua estrutura. Os

sais das aminas terciárias já demonstravam ser mais higroscópicos que os sais das

aminas secundárias e a presença destas hidroxilas só aumentou essa característica,

além de ser observado sinais de degradação dos compostos mesmo armazenados

protegidos de luz e umidade. Dessa forma, a purificação e o armazenamento desses

compostos não foi possível e estratégias para melhorar estes processos devem ser

feitas para a obtenção desses análogos.

65

Para as aminas terciárias obtidas com sucesso, confirmou-se a sua formação

por meio de RMN 1H, principalmente pelo surgimento do deslocamento químico em

2,59 ppm (H25) referente à metila ligada ao nitrogênio (Figura 20), exemplificado

pelo composto 3d. A mudança dos deslocamentos químicos de 4,03-4,01 ppm (H7 e

H9, Figura 12) da amina secundária, para 4,24-4,01 ppm (H9 e H7) no espectro de

RMN 1H da amina terciária formada, também confirma a formação do produto

desejado.

Figura 20. Espectro de RMN 1H do produto 3d.

Na figura 21, no RMN 13C, nota-se a presença do deslocamento químico em

38,6 ppm, correspondente à metila ligada ao nitrogênio (C25), exemplificado pelo

espectro de RMN 13C do produto 3d. O aparecimento deste sinal indica a formação

da amina terciária, corroborando com o que fora indicado no espectro RMN 1H.

H7,9

H25

H7,9

66

Figura 21. Espectro de RMN 13C do produto 3d.

Além de RMN 1H e 13C, realizou-se também a análise elementar dos

compostos (Tabela 6), e os resultados obtidos encontram-se dentro dos limites de

variação aceitáveis (±0,50% de variação).

Tabela 6. Análise elementar das aminas terciárias.

Composto Análise elementar (%)

Teórico Amostra Desvio

3a

C= 65,86

H= 6,22

N= 4,80

C= 65,40

H= 5,78

N= 4,74

C= 0,46

H= 0,44

N= 0,06

3b

C= 63,45

H= 6,26

N= 4,35

C= 63,03

H= 6,22

N= 4,31

C= 0,42

H= 0,04

N= 0,04

3c

C= 61,45

H= 6,30

N= 3,98

C= 61,44

H= 6,34

N= 4,12

C= 0,01

H= 0,04

N= 0,14

C25

67

Foram determinadas também as purezas cromatográficas das aminas

terciárias (Tabela 4) por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) e a pureza

de todos os compostos sintetizados encontraram acima de 95%, um valor aceitável

para dar prosseguimento aos ensaios in vitro.

5.3 Ensaios biológicos

5.3.1 Ensaio de citotoxicidade

Para determinar o potencial citotóxico dos compostos sintetizados, bem como

da queleritrina, foi utilizado o ensaio de biorredução do MTT (brometo de 3-(4,5-

dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio) ou sal de tetrazólio. Trata-se de um método

colorimétrico que avalia a atividade metabólica celular (BILLACK; RADKAR;

ADIABOUAH, 2008).

O produto resultante do metabolismo mitocondrial do MTT é o formazan, uma

substância de cor azul escura que é insolúvel em meio aquoso. Este composto pode

ser quantificado por espectrofotometria após lise celular induzida e solubilização em

solvente adequado, neste caso, o dimetilsulfóxido (DMSO) (SCHERLIES, 2011).

Essa técnica tem como fundamento traçar uma correlação entre a quantidade

de formazan produzido e a concentração de células viáveis no meio. Desta forma,

quanto maior for a concentração de células viáveis no meio, maior será a taxa de

biotranformação do MTT e consequentemente, a densidade óptica dos poços será

mais elevada (AZIZ, 2006).

Portanto, é possível estimar a taxa de viabilidade das células expostas aos

compostos sintetizados neste trabalho. O principal problema que é observado nos

ensaios biológicos em geral é a dificuldade de solubilização dos compostos em meio

3d

C= 59,76

H= 6,34

N= 3,67

C= 59,50

H= 6,27

N= 3,79

C= 0,26

H= 0,07

N= 0,12

68

aquoso. Porém, isso não foi observado com os análogos da queleritrina, uma vez

que se trata de compostos na forma de cloridrato.

Em princípio, foram preparadas soluções dos compostos em DMSO a 20 mM,

e a partir dessas, foram feitas diluições sucessivas de 100 e 50 μM para a triagem

dos compostos e de 150 a 12,5 μM para a determinação de IC50. É importante para

a correta condução dos ensaios que a concentração final de DMSO seja de no

máximo 1%, pois é amplamente conhecido o potencial citotóxico deste solvente,

quando em concentrações superiores a 2% (BRAYTON, 1986).

Dos compostos testados, apenas a queleritrina apresentou citotoxidade nas

linhagens não-tumorigênicas Huvec e LL24 e em todas as linhagens tumorais

testadas, tais como a Jurkat, SK-Mel-28 e A549. Esse resultado indica a falta de

seletividade da queleritrina em relação às diversas linhagens, o que corrobora com

dados de outros trabalhos (MALÍKOVÁ et al., 2006; MATKAR; WRISCHNIK;

HELLMANN-BLUMBERG, 2008; SLANINOVÁ et al., 2007; ZHANG et al., 2012). Os

valores de IC50 podem ser observados na Tabela 7.

Tabela 7. Valores de IC50 (µM) da queleritrina e do composto mais ativo das séries.

Linhagens celulares

IC50 (µM) ± DP

queleritrina 2f

SKMel-28 9,76 ± 2,15 > 100

Jurkat 3,13 ± 1,80 > 100

A549 7,46 ± 1,67 118,31 ± 17,9

Huvec 4,93 ± 1,73 > 100

LL24 3,73 ± 0,69 > 100

Dos compostos sintetizados, nenhum apresentou atividade citotóxica nas

concentrações testadas nas linhagens não-tumorigênicas Huvec e LL24, bem como

nas linhagens tumorais SK-Mel-28 e Jurkat. Na linhagem A549, o único composto

que apresentou citotoxicidade foi o 2f, conforme Tabela 7.

A determinação da curva dose-resposta e cálculo de IC50 para o 2f em A549

foi realizado com cinco pontos e concentração máxima de 150 µM. Essa

69

concentração ultrapassa os valores escolhidos para a triagem dos compostos nas

outras linhagens celulares. Entretanto, a escolha de uma concentração mais alta é

justificável uma vez que a A549 é uma linhagem multirresistente (JARAMILLO et al.,

2008; LAMORAL-THEYS et al., 2010; MATHIEU et al., 2004).

Dentre os diversos mecanismos de resistência da linhagem A549 relatados na

literatura, a alta expressão de ciclooxigenase-2 (COX-2) (DOHADWALA et al., 2001)

e a resistência à TRAIL (AZIJLI et al., 2012; VOORTMAN et al., 2007) conferem

fenótipo resistente à apoptose para a linhagem A549. Já a alta expressão de

transportadores ABC (ATP binding cassete) e de glutationa S-transferase Pi (GST-

π), também presentes na A549, aumenta o efluxo de fármacos antineoplásicos e a

destoxificação das células tumorais (DONG et al., 2014; MATHIEU et al., 2004; VAN

DER DEEN et al., 2005), respectivamente. Estas características conferem

resistência da A549 a compostos antitumorais, tais como a cisplatina (BARR et al.,

2013; WU et al., 2010), a gencitabina (IKEDA et al., 2011; WANG et al., 2008) e o

paclitaxel (GONÇALVES et al., 2001; SUN et al., 2011).

Como pode ser observado, os compostos planejados não apresentaram

atividade citotóxica interessante no painel de linhagens determinado para este

trabalho. Contudo, isso não descarta uma possível atividade anticâncer, uma vez

que a atividade citostática pode ser considerada na análise de uma atividade

antitumoral (BASSO et al., 2002; DRAPPATZ; WEN, 2004; RIXE; FOJO, 2007).

Além disso, fármacos citotóxicos são relatados como compostos mais passíveis de

resistência tumoral, assim como são responsabilizados pelos efeitos adversos mais

severos da terapia antineoplásica (BOCK; LENGAUER, 2012).

A capacidade citostática, combinada com o potencial citotóxico de compostos

antineoplásicos, representam uma modalidade terapêutica mais eficiente do que o

uso desses diferentes tipos de agentes sozinhos (RIXE; FOJO, 2007). Isto se deve

ao fato de que os compostos citostáticos podem retardar o surgimento de resistência

aos agentes citotóxicos ao diminuir a taxa de proliferação celular e surgimento de

células resistentes. Além disso, substâncias citostáticas podem desacelerar o

crescimento dos tumores entre as doses dos antineoplásicos citotóxicos

(GARDNER; FERNANDES, 2004; KIM; CHEN; LIAO, 2007).

O uso do gefitinibe (20) (Figura 22) para o tratamento do glioma maligno, um

tipo de câncer de pobre prognóstico, ilustra a aplicabilidade de compostos

70

citostáticos para uma melhor resposta terapêutica (CHANG et al., 2014; DRAPPATZ;

WEN, 2004). Este efeito citostático é observado em concentrações menores que 25

µM e, ultrapassando esse valor, o efeito citotóxico do gefitinibe é predominante

(CHANG et al., 2014).

Figura 22. Estruturas químicas do gefitinibe (20) e temozolomida (21).

O mecanismo de ação do gefitinibe consiste na inibição do receptor de fator

de crescimento epidermal (EGFR – epidermal growth factor receptor), cuja

expressão está exarcebada neste tipo de tumor (JUN et al., 2012; PÉDEBOSCQ et

al., 2008). O efeito do gefitinibe sobre o EGFR foi capaz de aumentar a sensibilidade

dos gliomas resistentes à radioterapia (ANDERSSON et al., 2007), e, quando

utilizado no início da doença, melhorou a resposta tumoral à temozolomida (21)

(Figura 22), um composto antitumoral citotóxico (PRADOS et al., 2008).

As evidências demonstram que o potencial citostático dos compostos pode

desempenhar um papel importante na quimioterapia antineoplásica. Devido a isso,

realizou-se o ensaio clonogênico do composto 2f com o intuito de verificar se,

apesar da baixa citotoxicidade apresentada pelo composto, este possui atividade

citostática.

5.3.2 Ensaio clonogênico e ciclo celular

O ensaio clonogênico, ou ensaio de formação de colônia é um método que

mensura a sobrevivência e capacidade de proliferação celular a partir de uma única

71

célula. É considerada uma colônia se o aglomerado for formado por pelo menos 50

células (CELIS et al., 2005).

Um pequeno número de células é plaqueado em placas com poços grandes

para que uma célula não fique próxima à outra. As células passam, então, a ter

contato com a substância a ser testada por um período curto de tempo, e logo após,

são incubadas por um período maior sem o contato com os compostos (MUNSHI;

HOBBS; MEYN, 2005). Para a visualização das colônias, utiliza-se o glutaraldeído

para a fixação das células e o cristal de violeta para a marcação das colônias. A

contagem é feita pelo microscópio (FRANKEN et al., 2006).

Após o tratamento da A549 com o composto 2f, observou-se uma atividade

inibitória do crescimento de colônias em todas as concentrações testadas (50 µM, 75

µM e 100 µM), conforme Figura 23.

Figura 23. (a) Efeito do composto 2f na Formação de colônias em A549, de maneira dose-

dependente. (b) O gráfico representa a média de três experimentos diferentes. * p≤0.05; ** p≤0.01

comparado ao grupo controle (paired Student’s t test).

No ensaio, o grupo controle apresentou uma média de 60 colônias, enquanto

os grupos tratados apresentaram médias de 9, 19 e 34 colônias nas concentrações

72

100 µM, 75 µM e 50 µM do 2f, respectivamente. A formação de colônias foi reduzida

de maneira dose-dependente, conforme ilustra a Figura 23.

O ensaio clonogênico mimetiza o desenvolvimento de um tumor a partir de

uma célula, o que o aproxima ao comportamento tumoral in vivo (ZHOU et al., 2015).

Diferente do ensaio de citotoxicidade por MTT, o ensaio clonogênico é analisado

após um período maior depois do tratamento e pode-se então, observar os efeitos

do composto testado de modo mais aproximado à resposta terapêutica, ou seja,

analisa-se os efeitos do composto a longo prazo (BROWN; ATTARDI, 2005).

O fato do composto 2f inibir o crescimento de colônias, indica seu potencial

como substância anticâncer. Ademais, como o composto 2f não demonstrou

toxicidade na linhagem de fibroblasto de pulmão humano (LL24), mostra-se ser mais

seletivo do que a queleritrina.

Para complementar os resultados obtidos no ensaio clonogênico, procedeu-se

à análise do ciclo celular a fim de verificar alterações induzidas pelo composto 2f.

Esta análise mostrou que o composto 2f provocou aumento na porcentagem de

células na fase G0/G1. Enquanto o grupo controle apresentou 36,55% da população

celular em G0/G1, os grupos tratamento apresentaram 54,55%, 50,6 % e 49,2 %

para as concentrações 100 µM, 75 µM e 50 µM do 2f, respectivamente (Figura 24).

Em detrimento, houve redução da população celular nas fases S e G2/M,

ilustrado pela diminuição das áreas verdes (fase S) e vermelhas (fase G2/M) dos

histogramas do grupo tratado (Figura 24). Isto caracteriza interrupção do ciclo celular

na fase G0/G1, o que pode indicar que as células estão em quiescência, ou seja,

em repouso, fenótipo típico de células que não se proliferam (JANUMYAN et al.,

2008). Este resultado corrobora com o achado no ensaio clonogênico, que indica

que o composto 2f tem o potencial de inibir a proliferação celular.

A capacidade de interromper o ciclo celular na fase G0/G1 também foi

observado em estudos relacionados ao gefitinibe (20) (Figura 22) nas linhagens

tumorais de adenocarcinoma de pulmão (A549) (HUANG et al., 2013), câncer

pancreático humano (PANC-1) (ZHOU et al., 2009) e câncer de mama humano

(HCC1937) (CORKERY et al., 2009). Como o gefitinibe é descrito como composto

citostático (MILLAR; LYNCH, 2003), a interrupção do ciclo celular na fase G0/G1

indica relação entre este fenômeno ao potencial citostático de um composto.

73

Figura 24. Efeitos do composto 2f sobre o ciclo celular na linhagem A549, o qual o histograma (a)

representa o grupo controle, (b) o composto 2f a 100 µM, (c) composto 2f a 75 µM e (d) 50 µM; a fase

G0/G1 está em azul, S em verde e G2/M em vermelho. (e) ilustra a % da distribuição de células em

cada fase do ciclo. Os resultados representam a média de dois experimentos diferentes.

O análogo 2f foi o único composto que apresentou atividade biológica frente à

linhagem A549. Uma particularidade deste composto é a presença do grupo

catecólico em sua estrutura, como observado na Figura 25 (22). Este tipo de grupo é

encontrado em diversas substâncias naturais com potencial antitumoral, tais como a

catequina (23) (SUGANUMA; SAHA; FUJIKI, 2011; YU et al., 2014), a quercetina

74

(24) (KUMAR; PANDEY, 2013) e o éster fenetil do ácido caféico (25) (CHUU et al.,

2012).

Figura 25. Estruturas químicas do composto 2f (22), da catequina (23), da quercetina (24) e do éster

fenetil do ácido caféico (25), com o grupo catecólico em destaque.

Os principais mecanismos relatados para compostos catecólicos são a

geração de espécies reativas de oxigênio (EROS), danos ao DNA por oxidação ou

formação de adutos e danos à proteínas por arilação ou oxidação sulfidrílica (Figura

26) (SCHWEIGERT; ZEHNDER; EGGEN, 2001).

Os mecanismos de geração de EROS e de danos ao DNA em geral induzem

à morte celular (KANG et al., 2012). Como este efeito não foi observado como

predominante após o tratamento pelo composto 2f, o mecanismo por danos a

proteínas pode ser uma hipótese a ser considerada.

Além disso, estudos mecanísticos acerca da catequina, quercetina e do éster

fenetil do ácido caféico, indicam que estes, em doses sub-citotóxicas, induzem

interrupção do ciclo celular na fase G0/G1 em diversas linhagens, assim como o

composto 2f sobre a linhagem A549. Nesses estudos, o acúmulo de células na fase

G0/G1 aponta para um provável mecanismo de modulação de proteínas-alvo

específicas, as quais estão inseridas em vias de sinalização necessárias para o

desenvolvimento tumoral. Observou-se também que, possivelmente, os compostos

75

catecólicos exercem alguma influência na atividade de algumas enzimas (CHUU et

al., 2012; KUMAR; PANDEY, 2013; SCHWEIGERT; ZEHNDER; EGGEN, 2001;

SUGANUMA; SAHA; FUJIKI, 2011; YU et al., 2014). Entretanto, estudos

mecanísticos mais aprofundados teriam que ser conduzidos para a compreensão do

exato mecanismo de ação do 2f.

5.4 Modelagem molecular

A queleritrina, o composto 2f (análogo ativo) e os compostos 2a e 2c

(compostos inativos), foram submetidos aos estudos de modelagem molecular.

Desse modo, foi possível determinar teoricamente propriedades físico-químicas e

estereoeletrônicas que podem ser correlacionadas com a atividade biológica.

Ao empregar modificações moleculares em uma dada estrutura, podem-se

alterar propriedades físico-químicas e, consequentemente, a sua atividade biológica.

Nesse contexto, os estudos de modelagem molecular tem grande valia na discussão

sobre relação estrutura-atividade, uma vez que por meio do cálculo de propriedades

pode-se correlacionar os efeitos biológicos com as características físico-químicas de

uma molécula e, desse modo, determinar os perfis farmacocinéticos e

farmacodinâmicos de um composto (ARROIO; HONÓRIO; DA SILVA, 2010).

Iniciaram-se os estudos pela construção dos modelos tridimensionais dos

quatro compostos. Após a construção, a geometria molecular das estruturas foi

otimizada e, por meio do cálculo de carga de ponto único, foram calculadas

propriedades estereoeletrônicas.

Entre as propriedades, foram determinados: mapa de potencial eletrostático,

mapas dos orbitais moleculares HOMO (orbital molecular ocupado de maior energia)

e LUMO (orbital molecular não ocupado de menor energia) e de momento dipolo.

Propriedades hidrofóbicas também foram levadas em consideração, tais como o

logaritmo do coeficiente de partição calculado – CLog P, uma vez que este

parâmetro reflete a propriedade lipofílica dos compostos e, consequentemente,

possibilita a extrapolação da capacidade dos compostos de serem solubilizados e

absorvidos nos sistemas biológicos (TAVARES, 2004).

76

Em relação ao mapa de potencial eletrostático (MPE) (Figura 26), a coloração

apresentada indica que regiões de tom vermelho intenso (60,000 kJ/mol) possuem

maior densidade eletrônica, enquanto que regiões de colocação azul escuro

(580,000 kJ/mol) possuem menor distribuição de densidade eletrônica. Nota-se uma

diferença da distribuição eletrônica das moléculas estudadas, principalmente

influenciada pela rigidez ou flexibilidade dos compostos e pela presença ou ausência

de metoxilas e hidroxilas nas estruturas (Figura 26).

No MPE é possível observar que a estrutura planar da queleritrina, a qual é

composta por anéis aromáticos fundidos, favorece a distribuição mais uniforme da

densidade eletrônica em diversas regiões da molécula, padrão ilustrado pela

coloração verde (Figura 26). Além disso, o sistema conjugado dos anéis aromáticos

diminui a carga positiva sobre o nitrogênio da queleritrina (WHEELER; HOUK, 2009).

Esses fenômenos não foram observados nos análogos 2a, 2c e 2f, uma vez

que, com a simplificação molecular, os compostos perderam o sistema de

conjugação entre os anéis aromáticos e o nitrogênio das estruturas. Como os

compostos 2a, 2c e 2f não apresentaram atividade citotóxica significante, a perda da

planaridade da queleritrina e a falta de distribuição uniforme da densidade eletrônica

sobre a molécula podem estar relacionadas à diminuição da atividade citotóxica dos

análogos.

Assim como no MPE, o valor encontrado de vetor de momento dipolo (μ) da

queleritrina apresentou-se distinto, se comparado aos compostos sintetizados. O

vetor de momento dipolo representa o produto da soma total de cargas positivas ou

negativas e a distância entre seus centroides (DE-SÁ-JÚNIOR et al., 2013). A

queleritrina apresenta valor μ = 4,82 Debye, enquanto 2a, 2c e 2f apresentam

valores mais próximos entre si, de 6,45, 7,10 e 6,16 Debye, respectivamente. Como

o momento dipolo pode variar de acordo com geometria da molécula, a queleritrina

possui um valor μ menor em comparação aos análogos, devido à sua estrutura

planar e conjugada (SINEGOVSKAYA; KEIKO; TROFIMOV, 1987). Além disso, com

os resultados teóricos obtidos, pode-se inferir que quanto menor o valor de μ, maior

a atividade biológica, visto que a queleritrina e o composto 2f (composto ativo) foram

os que apresentaram os valores mais inferiores de μ.

77

Figura 26. Representação de propriedades eletrônicas da queleritrina e dos compostos 2a, 2c e 2f, por meio do mapa de potencial eletrostático, vetor do

momento dipolo (representados por setas amarelas), e mapas de orbitais moleculares HOMO e LUMO.

77

78

Em relação aos valores de energia do HOMO (ɛHOMO) e LUMO (ɛLUMO), nota-

se que a queleritrina apresenta menor diferença (Gap) entre ɛHOMO e ɛLUMO, cujo

∆ɛ(LUMO-HOMO) = 8,98 eV, se comparado aos análogos 2a, 2c e 2f, os quais possuem

os valores semelhantes de Gap de 11,64, 11,71 e 11,69 eV, respectivamente. O

valor inferior de Gap encontrado para a queleritrina sugere que ela seja menos

estável e mais reativa (ZHANG; MUSGRAVE, 2007).

A menor diferença entre os valores de ɛHOMO e ɛLUMO resulta em uma

transferência acentuada de energia entre os orbitais, permitindo ressaltar as

características elétron-aceptoras ou doadoras dos grupos funcionais da queleritrina,

logo acentuando a sua reatividade e diminuindo a sua estabilidade

(GOPALAKRISHNAN; KALAIARASI, 2014).

As estruturas da queleritrina e do composto 2f foram alinhados no programa

HyperChem versão 8.0.7 (Hypercube Inc) e a imagem foi gerada pelo programa

ViewerLite versão 4.2 (Accelrys Inc, 2001) (Figura 27). Esse alinhamento foi

realizado a fim de observar se as distâncias interatômicas de determinados grupos

funcionais se mantiveram mesmo realizando a simplificação molecular sobre a

queleritrina.

Figura 27. (a) Representação do alinhamento entre as estruturas da queleritrina e do análogo 2f, nos

quais os átomos de carbono estão representados em verde e amarelo, respectivamente, os de

oxigênio em vermelho e o nitrogênio em azul em ambas. Os átomos de hidrogênio foram suprimidos

para a melhor visualização. Em (b), representação das distâncias interatômicas (em preto)

mensuradas para a queleritrina e em (c), representação das distâncias interatômicas (em preto)

79

obtidas para o análogo 2f. Ainda em (b) e (c), os ângulos diedros das estruturas da queleritrina e do

composto 2f, respectivamente, foram calculadas a partir dos átomos circulados em vermelho.

Ao calcular as distâncias interatômicas entre o grupo metilenodioxi e o

nitrogênio de ambas as estruturas, obtiveram-se os valores 6,61 Å e 6,66 Å para a

queleritrina e o 2f, respectivamente (Figura 27). Além disso, a distância entre o

nitrogênio e o carbono do anel aromático ligado a um oxigênio é de 4,77 Å e 4,97 Å

para a queleritrina e o 2f, respectivamente.

Entretanto, os ângulos diedros obtidos entre o benzodioxol, o nitrogênio e o

carbono do anel aromático ligado a um oxigênio de ambas as estruturas,

apresentaram grande diferença. Para a queleritrina, o valor obtido foi de 96,5 º e

para o 2f, o valor foi de 164,1 º, e este valor superior reflete em uma flexibilidade

estrutural acentuada apresentada pelo composto 2f (KEEPERS et al., 1982; MAO,

1992).

Esses dados sugerem que a simplificação molecular pode não ter alterado a

distância interatômica entre grupos característicos das moléculas de maneira

significativa. Entretanto, a perda da planaridade da queleritrina pode ter sido

responsável pela diminuição da atividade biológica, fato também observado ao

analisar o mapa de potencial eletrostático.

Ademais, foram calculados outros parâmetros físico-químicos adicionais como

o peso molecular, CLogP e os sítios de ligação de hidrogênio, conforme Tabela 8.

Estes parâmetros permitem estimar a biodisponibilidade oral dos compostos com

base na Regra dos Cinco de Lipinski (Ro5). A “Regra dos cinco de Lipinski” – Ro5 -,

é definida como um conjunto de parâmetros capazes de identificar compostos com

problemas de absorção e permeabilidade (LIPINSKI et al., 1997).

Tabela 8. Parâmetros físico-químicos calculados para a queleritrina e os compostos 2a, 2c e 2f.

Composto PM CLogP HBA HBD

queleritrina 348,37 4,05 5 0

2a 277,75 2,62 3 0

2c 337,80 2,36 5 0

2f 309,74 1,84 5 2

80

Esta regra abrange características físico-químicas como massa molecular,

lipofilicidade e sítios doadores e aceptores de ligação hidrogênio. Dessa forma,

determina que uma boa absorção e permeação sejam mais comuns quando:

O peso molecular é menor ou igual a 500 Daltons (Da);

O CLog P é menor ou igual a 5;

O número de grupos aceptores de ligação hidrogênio é menor ou igual a 10;

O número de grupos doadores de ligação hidrogênio é menor ou igual a 5.

Sendo assim, verifica-se, portanto, que o composto 2f apresenta valores

compatíveis com o determinado por Lipinski, podendo ser considerado uma

molécula com características mais favoráveis de apresentar atividade quando

administrado por via oral.

81

6 CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS

O presente trabalho consistiu na síntese de dez compostos, dentre os quais,

seis da série de aminas secundárias e quatro da série de aminas terciárias. Cada

série foi composta por um análogo não substituído (2a/3a), um análogo 4-

monometoxilado (2b/3b), um análogo 3,4-dimetoxilado (2c/3c), um 3,4,5-

trimetoxilado (2d/3d) e os análogos 3-metoxi-4-hidroxilado (2e) e 3,4-di-idroxilado

(2f) pertencem somente à série de aminas secundárias.

A síntese proposta para a formação da amina secundária pela metodologia

com o agente redutor NaBH(OAc)3 proporcionou a formação dos compostos de

modo satisfatório. Entretanto, os rendimentos obtidos nessa série foram de

moderados a pouco satisfatórios e podem ser devido aos métodos de purificação

utilizados e à possível formação de subprodutos. As estruturas das aminas

secundárias foram confirmadas por meio de análise espectrométrica de RMN 1H e

13C, cromatografia líquida de alta eficiência e análise elementar.

A partir das aminas secundárias, testaram-se metodologias de obtenção das

aminas terciárias e a reação de metilação redutiva demonstrou ser a mais

adequada, uma vez que não havia a formação de subprodutos comuns de reações

como a substituição nucleofílica. As estruturas dos compostos, assim como as

aminas secundárias, foram confirmadas por meio de análise espectrométrica de

RMN 1H e 13C, cromatografia líquida de alta eficiência e análise elementar.

Os compostos com grau de pureza cromatográfica acima de 95% foram

testados quanto ao seu potencial citotóxico em comparação à queleritrina. O

alcaloide não demonstrou seletividade ao comparar a citotoxicidade em linhagens

tumorigênicas e não-tumorigênicas, o que ressalta a necessidade do planejamento

de análogos mais seletivos.

Em contrapartida, os compostos sintetizados não apresentaram atividade

citotóxica significativa em nenhuma linhagem testada. Apenas o composto 2f

apresentou potencial citostático frente à linhagem A549 no ensaio clonogênico. O

seu mecanismo foi corroborado por outro estudo, a análise do ciclo celular, no qual

observou-se a interrupção do ciclo celular na fase G0/G1, o que pode indicar que as

células estão em quiescência, fenótipo típico de células que não se proliferam.

82

Essa atividade é promissora, visto que o composto 2f apresentou-se ativo em

uma linhagem tumoral sem ser citotóxico à uma linhagem não-tumorigênica, o que

indica maior seletividade do análogo se comparado à queleritrina.

Os estudos de modelagem molecular inferem que a perda da planaridade da

queleritrina pode ser a principal responsável pela diminuição da atividade biológica.

Entretanto, o composto mais ativo apresentou propriedades distintas que o difere

dos outros análogos inativos e da queleritrina, fato que pode ser relacionado ao seu

potencial citostático. Além disso, o composto 2f apresenta os parâmetros físico-

químicos avaliados pela Ro5 dentro dos valores preconizados, apresentando uma

característica drug-like, passível de ser administrado por via oral.

Dessa forma, novas modificações moleculares devem ser planejadas a fim de

otimizar a atividade da queleritrina para fornecer compostos mais ativos e mais

seletivos. Vale ressaltar também, a otimização do composto 2f, pois o seu potencial

citostático também é interessante para a atividade antitumoral.

Tendo em vista os resultados obtidos, sugere-se:

Realizar a reação de proteção das hidroxilas fenólicas do composto 2f,

a fim de obter maiores rendimentos;

Obter a amina terciária a partir do análogo 2f para verificar se a metila

ligada ao nitrogênio pode influenciar na atividade, uma vez que a

influência dessa modificação não foi observada nos análogos

metoxilados;

Realizar estudos mecanísticos complementares do composto 2f, como,

por exemplo, o western blot, a fim de verificar se o mesmo influencia na

expressão de proteínas relacionadas ao ciclo celular, como as ciclinas,

as enzimas ciclina-dependentes, a p21 e p53, ou não relacionadas ao

ciclo celular;

Realizar estudos de atividade biológica do análogo 2f para verificar o

seu potencial em terapia combinada com um fármaco citotóxico, como

a oxaliplatina, que é utilizada no tratamento de câncer de pulmão

(KNIGHT et al., 2004);

Obter outros análogos da queleritrina planejados por simplificação

molecular, com maior rigidez estrutural;

83

Obter outros compostos que contenham padrão de mono-, di- e

trissubstituição por hidroxilas fenólicas e em diferentes posições.

84

7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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2008.

99

8 ANEXOS

100

ANEXO I

Espectros de RMN 1H e 13C

Cromatograma de HPLC

Análise Elementar

101

Cloridrato de (2H-1,3-benzodioxol-5-ilmetil)(benzil)amina

Espectro de RMN 1H do composto 2a (RPF800)

RMN 1H (300 MHz, DMSO-d6, δ = ppm): 9,60

(s, 2H, H-19,20), 7,56-7,53 (m, 2H, H-12,14),

7,46-7,40 (m, 3H, H-11,13,15), 7,18 (s, 1H, H-

6), 7,00 (dd, J1 = 8,0 Hz, J2 = 1,2 Hz, 1H, H-4),

6,95 (d, J = 7,9 Hz, 1H, H-3), 6,05 (s, 2H, H-

17), 4,09 (s, 2H, H-9), 4,05 (s, 2H, H-7)

DMSO

H2O-DMSO

102


Espectro de RMN 13C do composto 2a (RPF800)

RMN 13C (75 MHz, DMSO-d6, δ = ppm): 152,9

(C1), 152,5 (C2), 137,2 (C10), 135,3 (C11,

C15), 134,0 (C5), 133,7 (C12, C14), 130,5

(C13), 129,5 (C4), 115,7 (C6), 113,4 (C3),

106,5 (C17), 54,7 (C7), 54,6 (C9)

DMSO

106

Cloridrato de (2H-1,3-benzodioxol-5-ilmetil)[(4-metoxifenil)metil]amina

Espectro de RMN 1H do composto 2b (RPF801)


(s, 2H, H-21,22), 7,48 (d, J = 8,6 Hz, 2H, H-

11,15), 7,21 (s, 1H, H-6), 7,00 (dd, J1 = 8,0 Hz,

J2 = 1,3 Hz, 1H, H-3), 6,97 (s, 1H, H-4), 6,93

(d, J = 7,8, 2H, H-12,14), 6,04 (s, 2H, H-19),

4,00 (t, J = 5,7, 4H, H-7,9), 3,77 (s, 3H, H-17)

DMSO

H2O-DMSO

107

Cloridrato de (2H-1,3-benzodioxol-5-ilmetil)[(3,4-dimetoxifenil)metil]amina

Espectro de RMN 13C do composto 2b (RPF801)


(C13), 147,6 (C1), 147,2 (C2), 131,7 (C11, C15),

125,3 (C5), 124,2 (C10), 123,7 (C4), 113,9 (C12,

C14), 110,4 (C6), 108,2 (C3), 101,2 (C19), 55,2

(C17), 49,2 (C7), 48,9 (C9)

DMSO

111


Espectro de RMN 1H do composto 2c (RPF802)


(s, 2H, H-22,23), 7,28 (s, 1H, H-18), 7,20 (s, 1H,

H-6), 7,04-6,93 (m, 4H, H-3,4,14,15), 6,04 (s,

2H, H-8), 4,00 (s, 4H, H-10,12), 3,77 (s, 3H, H-

21), 3,76 (s, 3H, H-22)

DMSO

H2O-DMSO

112


Espectro de RMN 13C do composto 2c (RPF802)


(C17), 148,6 (C1), 147,6 (C16), 147,2 (C2),

125,3 (C13), 124,2 (C5), 124,0 (C14), 122,7

(C4), 113,9 (C18), 111,5 (C6), 110,4 (C15),

108,1 (C3), 101,2 (C8), 55,6 (C21), 55,5 (C22),

49,2 (C10), 49,2 (C12)

DMSO

116

Cloridrato de (2H-1,3-benzodioxol-5-ilmetil)[(3,4,5-trimetoxifenil)metil]amina

Espectro de RMN 1H do composto 2d (RPF803)


(s, 2H, H-24,25), 7,20 (s, 1H, H-6), 7,01 (d, J =

8,0 Hz, 1H, H-4), 6,96 (s, 1H, H-3), 6,94 (s, 2H,

H-11,15), 6,04 (s, 2H, H-23), 4,03-4,01 (m, 4H,

H-7,9), 3,79 (s, 6H, H-19,21), 3,66 (s, 3H, H-

20)

DMSO

H2O-DMSO

117

Cloridrato de (2H-1,3-benzodioxol-5-ilmetil)[(3,4,5-trimetoxifenil)metil]amina

Espectro de RMN 13C do composto 2d (RPF803)


(C12, C14), 147,6 (C1), 147,3 (C2), 137,6

(C13), 127,3 (C10), 125,2 (C5), 124,3 (C4),

110,4 (C6), 108,2 (C3), 107,6 (C11, C15),

101,2 (C23), 60,0 (C20), 56,0 (C19, C21), 49,6

(C9), 49,4 (C7)

DMSO

121

Cloridrato de 4-{[(2H-1,3-benzodioxol-5-ilmetil)amino]metil}-2-metoxifenol

Espectro de RMN 1H do composto 2e (RPF804)


(s, 2H, H-22,23), 9,22 (s, 1H, H-20), 7,21 (d, J

= 1,4 Hz, 1H, H-6), 7,18 (d, J = 1,4 Hz, 1H, H-

18), 7,00 (dd, J1 = 8,0 Hz, J2 = 1,3 Hz, 1H, H-

3), 6,94 (d, J = 7,9 Hz, 1H, H-4), 6,88 (dd, J1 =

8,0 Hz, J2 = 1,3 Hz, 1H, H-15), 6,79 (d, J = 8,0

Hz, 1H, H-14), 6,04 (s, 2H, H-8), 3,98 (t, J =

5,5 Hz, 4H, H-10,12), 3,78 (s, 3H, H-21)

DMSO

H2O-DMSO

122

Cloridrato de 4-{[(2H-1,3-benzodioxol-5-ilmetil)amino]metil}-2-metoxifenol

Espectro de RMN 13C do composto RPF804 (2e)


(C1), 147,4 (C17), 147,2 (C2), 147,1 (C16),

125,4 (C13), 124,2 (C5), 122,9 (C14), 122,3

(C4), 115,2 (C15), 114,4 (C18), 110,4 (C6),

108,2 (C3), 101,2 (C8), 55,7 (C21), 49,4 (C12),

49,1 (C10)

DMSO

126

Cloridrato de 4-{[(2H-1,3-benzodioxol-5-ilmetil)amino]metil}benzeno-1,2-diol

Espectro de RMN 1H do composto 2f (RPF806)


(s, 2H, H-11), 9,12 (s, 2H, H-19,20), 7,13 (s,

1H, H-6), 6,98 (d, J = 8,0 Hz, 1H, H-4), 6,93 (d,

J = 8,0 Hz, 1H, H-3), 6,89 (s, 1H, H-18), 6,76

(s, 2H, H-14,15), 6,03 (s, 2H, H-11), 3,99 (t, J =

6 Hz, 2H, H-10), 3,89 (t, J = 6 Hz, 2H, H-12)

DMSO

H2O-DMSO

127

Cloridrato de 4-{[(2H-1,3-benzodioxol-5-ilmetil)amino]metil}benzeno-1,2-diol

Espectro de RMN 13C do composto 2f (RPF806)


(C1), 147,3 (C2), 146,0 (C17), 145,2 (C16),

125,2 (C13), 124,1 (C5), 122,2 (C14), 121,3

(C4), 117,5 (C18), 115,5 (C15), 110,2 (C6),

108,2 (C3), 101,3 (C8), 49,4 (C10), 49,3 (C12)

DMSO

131

Cloridrato de (2H-1,3-benzodioxol-5-ilmetil)(benzil)metilamina

Espectro de RMN 1H do composto 3a (RPF850)

RMN 1H (300 MHz, CDCl3, δ = ppm): 12,55 (s,

1H, H-20), 7,69-7,64 (m, 2H, H-12,14), 7,45-

7,43 (m, 3H, H-11,13,15), 7,23 (s, 1H, H-6),

7,09 (d, J = 7,8 Hz, 1H, H-4), 6,83 (d, J = 7,9

Hz, 1H, H-3), 5,99 (s, 2H, H-17), 4,30-4,08 (m,

4H, H-7,9), 2,59 (s, 3H, H-19)

TMS

CHCl3

132


Espectro de RMN 13C do composto 3a (RPF850)

RMN 13C (75 MHz, CDCl3, δ = ppm): 149,1

(C1), 148,4 (C2), 131,3 (C11, C15), 130,0

(C10), 129,4 (C12, C14), 128,8 (C5), 125,6

(C13), 122,0 (C4), 111,4 (C6), 108,8 (C3),

101,7 (C17), 59,0 (C7), 58,9 (C9), 38,5 (C19)

CHCl3

136

Cloridrato de (2H-1,3-benzodioxol-5-ilmetil)[(4-metoxifenil)metil]metilamina

Espectro de RMN 1H do composto 3b (RPF851)


(s, 1H, H-22), 7,55 (s, 1H, H-15), 7,55 (s, 1H, H-

11), 7,28 (d, J = 1,1 Hz, 1H, H-6), 7,06 (dd, J1 =

8,0 Hz, J2 = 1,3 Hz, 1H, H-4), 7,01 (s, 1H, H-3),

6,96 (d, J = 7,8 Hz, 2H, H-12,14), 6,06 (s, 2H, H-

19), 4,32-4,25 (m, 2H, H-7), 4,12-4,04 (m, 2H,

H-9), 3,78 (s, 3H, H-17), 2,44 (d, J = 4,2 Hz, H-

21)

DMSO

H2O-DMSO

DMSO

137

Cloridrato de (2H-1,3-benzodioxol-5-ilmetil)[(4-metoxifenil)metil]metilamina

Espectro de RMN 13C do composto 3b (RPF851)


(C13), 148,0 (C1), 147,4 (C2), 132,9 (C11,

C15), 125,5 (C5), 123,5 (C10), 121,8 (C4),

114,0 (C12, C14), 111,3 (C6), 108,3 (C3),

101,4 (C19), 57,7 (C7), 57,4 (C9), 55,2 (C17),

37,3 (C21)

DMSO

141

Cloridrato de (2H-1,3-benzodioxol-5-ilmetil)[(3,4-dimetoxifenil)metil]metilamina

Espectro de RMN 1H do composto 3c (RPF852)


1H, H-24), 7,61 (s, 1H, H-18), 7,15 (s, 1H, H-

6), 7,04 (d, J = 7,9 Hz, 1H, H-14), 6,96 (d, J =

8,1 Hz, 1H, H-4), 6,85 (d, J = 7,8 Hz, 2H, H-

3,15), 6,01 (s, 2H, H-8), 4,25-4,17 (m, 2H, H-

10), 4,02-3,89 (m, 8H, H-12,21,22), 2,54 (d, J =

4,8 Hz, 3H, H-23)

TMS

CHCl3

142

Cloridrato de (2H-1,3-benzodioxol-5-ilmetil)[(3,4-dimetoxifenil)metil]metilamina

Espectro de RMN 13C do composto 3c (RPF852)


(C17), 149,7 (C1), 149,1 (C16), 148,4 (C2),

125,6 (C13), 123,5 (C5), 121,9 (C14), 121,2

(C4), 114,1 (C18), 111,4 (C6), 111,0 (C15),

108,8 (C3), 101,6 (C8), 59,1 (C10), 58,9 (C12),

56,5 (C21), 55,9 (C22), 38,4 (C23)

CHCl3

146

Cloridrato de (2H-1,3-benzodioxol-5-ilmetil)[(3,4,5-trimetoxifenil)metil]metilamina

Espectro de RMN 1H do composto 3d (RPF853)


1H, H-26), 7,16 (s, 1H, H-6), 7,05 (d, J = 8,2

Hz, 1H, H-4), 7,01 (s, 2H, H-11,15), 6,85 (d, J

= 7,9 Hz, 1H, H-3), 6,01 (s, 2H, H-23), 4,24-

4,16 (m, 2H, H-7), 4,10-4,01 (m, 2H, H-9), 3,92

(s, 6H, H-19,21), 3,86 (s, 3H, H-20), 2,59 (s,

3H, H-25)

TMS

CHCl3

147

Cloridrato de (2H-1,3-benzodioxol-5-ilmetil)[(3,4,5-trimetoxifenil)metil]metilamina

Espectro de RMN 13C do composto 3d (RPF853)


(C12, C14), 149,2 (C1), 148,4 (C2), 139,1

(C13), 125,7 (C10), 124,4 (C5), 124,3 (C4),

121,7 (C6), 111,4 (C3), 108,8 (C15), 108,2

(C11), 101,7 (C23), 60,8 (C20), 59,4 (C7), 59,2

(C9), 56,7 (C19, C21), 38,6 (C25)

CHCl3

151

ANEXO II

Ficha da aluna

155

ANEXO III

Currículo Lattes

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