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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS DE RIBEIRÃO PRE TO

Produtos naturais de micro-organismos marinhos: estudo químico e biológico de fungos endofíticos associados à alga vermelha Bostrychia

radicans

Bárbara Boretti Galizoni

Ribeirão Preto 2014

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS DE RIBEIRÃO PRE TO

Produtos naturais de micro-organismos marinhos: estudo químico e biológico de fungos endofíticos associados à alga vermelha Bostrychia

radicans

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas para obtenção do Título de Mestre em Ciências Área de Concentração: Produtos Naturais e Sintéticos Orientada: Bárbara Boretti Galizoni

Orientadora: Hosana Maria Debonsi Versão corrigida da Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas no dia 22/09/2014. A versão original encontra-se disponível na Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto/USP.

Ribeirão Preto 2014

AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.

Galizoni, Bárbara Boretti

Produtos naturais de micro-organismos marinhos: estudo químico e biológico de fungos endofíticos associados à alga vermelha Bostrychia radicans. Ribeirão Preto, 2014.

103p.; 30cm.

Dissertação de Mestrado, apresentada à Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto/USP – Área de concentração: Produtos Naturais e Sintéticos.

Orientadora: Hosana Maria Debonsi.

1. Produtos naturais marinhos. 2. Fungos endofíticos. 3. Elucidação estrutural, 4. Potencial biológico.

FOLHA DE APROVAÇÃO

Bárbara Boretti Galizoni Produtos naturais de micro-organismos marinhos: estudo químico e biológico de fungos endofíticos associados à alga vermelha Bostrychia radicans.

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas para obtenção do Título de Mestre em Ciências. Área de Concentração: Produtos Naturais e Sintéticos. Orientadora: Hosana Maria Debonsi

Aprovado em:

Banca Examinadora Prof. Dr. ____________________________________________________________

Instituição: _____________________________ Assinatura:____________________

Prof. Dr. ____________________________________________________________


Prof. Dr. ____________________________________________________________


Dedico este trabalho...

Aos meus pais, Airton (in memorian) e Maria Silvia, pelo amor, carinho, apoio e confiança.

Vocês sempre foram e sempre serão meus maiores exemplos de honestidade e determinação;

Ao meu irmão Breno, pelo companheirismo e amizade;

Ao meu querido Erik, pelo amor, incentivo, paciência e por ser uma pessoal muito especial

em minha vida.

Agradecimentos

A Deus, por me conceder saúde e sabedoria para trilhar meus caminhos e alcançar meus

objetivos.

A minha orientadora Profa. Dra. Hosana Maria Debonsi pelos ensinamentos, amizade e

acolhimento.

A Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto e a Universidade de São Paulo.

Aos professores, técnicos, alunos e demais funcionários do Núcleo de Pesquisa em Produtos

Naturais e Sintéticos (NPPNS) pelo auxílio e ensinamentos.

Aos queridos amigos do Laboratório de Química Orgânica do Ambiente Marinho, pelo

companheirismo, amizade e apoio.

À FAPESP pela bolsa concedida e apoio financeiro.

A CAPES e CNPq pelo apoio financeiro.

Aos técnicos José Carlos Tomaz, Daniela Ricardo Engracia Caluz, Isabel Cristina Turatti, Ms.

Jacqueline Nakau Mendonça, Maria Angélica, Ms. Vinícius Palaretti, Dr. Nivaldo Boralle e

Clóvis Reis da Silva Júnior.

Às professoras Profa. Dra. Niege Araçari Jacometti Cardoso Furtado, Profa. Dra. Letícia

Veras Costa-Lotufo e Profa. Dra. Maria Cláudia Marx Young pela colaboração científica.

Aos meus amigos, em especial a Marina, Lívia, Alyne e Ju, que fizeram meus momentos em

Ribeirão mais alegres.

A toda minha família pela torcida e orações.

“ Nas grandes batalhas da vida, o primeiro passo para a vitória é o desejo de vencer.” (Mahatma Gandhi)

i

RESUMO GALIZONI, B. B. Produtos naturais de micro-organismos marinhos: estudo químico e biológico de fungos endofíticos associados à alga vermelha Bostrychia radicans. 2014. 103f. Dissertação (Mestrado). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2014.

O ambiente marinho tem sido reconhecido como uma importante fonte de metabólitos secundários biologicamente ativos. Neste contexto, fungos endofíticos associados a algas ganharam importância nas últimas décadas, como alvos alternativos para a pesquisa de produtos naturais. O presente trabalho teve como o objetivo o estudo químico e biológico de duas linhagens de fungos endofíticos associados à alga vermelha Bostrychia radicans. Inicialmente foi realizada a triagem química e biológica (atividade antitumoral e antimicrobiana) dos extratos brutos das duas linhagens selecionadas, linhagens M20 (Hypocrea lixii) e M23 (Eutypella sp), obtidos a partir de cultivos em escala piloto, tanto variando-se os meios de cultivo e bem como períodos de crescimento. O extrato da linhagem M20 cultivada em arroz apresentou potencial citotóxico interessante quando submetido a ensaios utilizando células tumorais HCT-116. Ainda, após a análise química, esta linhagem foi selecionada para o cultivo em escala ampliada, visando o isolamento e elucidação estrutural dos metabólitos secundários presentes neste fungo. O estudo químico em escala ampliada da linhagem M20, espécie Hypocrea lixii, proporcionou o isolamento e identificação de quatro metabólitos: ácido 3-hidroxi-5-metóxi-6-metil-1,3-diidro-isobenzofurano-4-carboxílico (S1), 3,7-dimetóxi-6-metil-1-oxo-1,3-diidro-isobenzofurano-4-carbaldeído (S3), galactitol (S4), convolvulol (S5), além do isolamento de dois metabólitos que ainda não foram completamente elucidados, S2 e S6. Os metabólitos S1 e S3 são metabólitos inéditos como produtos naturais. Além disso, foi possível a identificação de 14 substâncias via cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM), entre elas hidrocarbonetos, ácidos graxos, inclusive insaturados, aldeídos, aldeídos α,β-insaturados e esteróide. As substâncias S1 e S4 foram submetidas à avaliação de atividade biológica (atividade antibacteriana, antifúngica, anticolinesterásica e antitumoral), porém nenhum resultado positivo foi constatado. Foi realizada avaliação da atividade tumoral das frações da linhagem M20, e as frações M20F e M20H apresentaram atividade citotóxica seletiva para linhagens de células tumorais. Em um segundo momento foi realizado o cultivo em escala ampliada da linhagem M23 (Eutypella sp) que proporcionou o isolamento da R-5-metilmeleína (S7). Dessa forma, o estudo químico de fungos endofíticos associados à alga Bostrychia radicans mostrou-se promissor na busca de novas estruturas químicas, visto que já foram isoladas e identificadas duas estruturas inéditas como produtos naturais. Palavras chave: Produtos naturais marinhos, fungos endofíticos, elucidação estrutural, avaliação biológica

ii

ABSTRACT GALIZONI, B. B. Natural products from marine microorganisms: chemical and biological study of endophytes associated to red algae Bostrychia radicans. 2014. 103f. Dissertation (Master). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2014. The marine environment has been recognized as an important source of biologically active secondary metabolites. In this context, endophytic fungi associated with algae gained importance in recent decades, as alternative to natural products research targets. The present work had as goal the chemical and biological study of two strains of endophytic fungi associated with red algae Bostrychia radicans. The chemical and biological screening (antimicrobial and antitumor activity) of the crude extracts of two selected strains, M20 (Hypocrea lixii) and M23 (Eutypella sp), were obtained from pilot-scale cultivation, by means of culture media and growth period variation. The M20 strain extract, grown in rice, showed an interesting cytotoxic potential front HCT -116 tumor cells and after chemical analysis, this strain was selected for cultivation on a large scale, with the purpose of secondary metabolites isolation. Chemical studies of M20 species strain Hypocrea lixii, performed on an enlarged scale, afforded the isolation and identification of four metabolites: 3-hydroxy-5-methoxy-6- methyl-1,3-dihydro-isobenzofuran-4-carboxylic acid (S1), 3,7 dimethoxy-6-methyl-1-oxo-1,3-dihydro-isobenzofuran-4-carbaldehyde (S3), galactitol (S4), convolvulol (S5), in addition the isolation of two metabolites which have not yet been fully elucidated, S2 and S6. The S1 and S3 metabolites are novel metabolites as natural products. Furthermore, it was possible to identify 14 compounds by gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS), including hydrocarbons, fatty acids, besides unsaturated ones, aldehydes, α,β–unsaturated aldehydes and steroid. The S1 and S4 compounds were subjected to biological activity evaluation (antibacterial, antifungal, antitumor and acetylcholinesterase potential), but without any positive result. Assessment of tumor activity of fractions of the M20 strain was performed, and the M20F and M20H fractions showed selective cytotoxicity to tumor cell lines. In a second step, the M23 strain (Eutypella sp) was grown on a large scale, resulting in the R-5-metilmeleina (S7) isolation. Thus, the chemical study of endophytic fungi associated to Bostrychia radicans algae proved to be promising concerning the search for new chemical compounds discovery, since it yielded two new structures as natural products. Keywords: Marine natural products, endophytic fungi, structural elucidation, biological evaluation

iii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Origem dos fármacos aprovados por agências reguladoras entre os anos de 1981 a 2010 (adaptado de NEWMAN; GRAG, 2012). 1

Figura 2. Metabólitos secundários isolados de fungos do gênero Eutypella spp 7

Figura 3. Esquema geral de cultivo das linhagens de fungos endofíticos selecionadas 13

Figura 4. Fluxograma geral de obtenção dos extratos de fungos endofíticos cultivados nos diferentes meios de cultura 13

Figura 5. Fluxograma do isolamento das substâncias S1-S6 a partir do extrato bruto do fungo Hypocrea lixii, cultivado em arroz por 21 dias 17

Figura 6. Esquema geral dos extratos obtidos do cultivo em escala piloto das duas linhagens selecionadas para a triagem química e biológica 21

Figura 7. Cromatogramas dos extratos da linhagem M20 cultivada em Arroz. Fase Móvel gradiente exploratório: 5 – 100% de Acetonitrila em Água. Coluna analítica Supelcosil LC-18 (25cm x 4,6mm x 5µm). Vazão 1ml/minuto. Detecção em 254 nm. Em preto – cultivo por 7 dias; em azul – cultivo por 14 dias; em rosa – cultivo por 21 dias; em verde – cultivo por 28 dias 22

Figura 8. Cromatogramas dos extratos da linhagem M20 cultivada em Czapek. Fase Móvel gradiente exploratório: 5 – 100% de Acetonitrila em Água. Coluna analítica Supelcosil LC-18 (25cm x 4,6mm x 5µm). Vazão 1ml/minuto. Detecção em 254 nm. Em preto – cultivo por 7 dias; em azul – cultivo por 14 dias; em rosa – cultivo por 21 dias; em verde – cultivo por 28 dias 23

Figura 9. Cromatogramas dos extratos da linhagem M20 cultivada em PDB. Fase Móvel gradiente exploratório: 5 – 100% de Acetonitrila em Água. Coluna analítica Supelcosil LC-18 (25cm x 4,6mm x 5µm). Vazão 1ml/minuto. Detecção em 254 nm. Em preto – cultivo por 7 dias; em azul – cultivo por 14 dias; em rosa – cultivo por 21 dias; em verde – cultivo por 28 dias 23

Figura 10. Cromatogramas dos extratos da linhagem M23 cultivada em Arroz. Fase Móvel gradiente exploratório: 5 – 100% de Acetonitrila em Água. Coluna analítica Supelcosil LC-18 (25cm x 4,6mm x 5µm). Vazão 1ml/minuto. Detecção em 254 nm. Em preto – cultivo por 7 dias; em azul – cultivo por 14 dias; em rosa – cultivo por 21 dias; em verde – cultivo por 28 dias 24

Figura 11. Cromatogramas dos extratos da linhagem M23 cultivada em Czapek. Fase Móvel gradiente exploratório: 5 – 100% de Acetonitrila em Água. Coluna analítica Supelcosil LC-18 (25cm x 4,6mm x 5µm). Vazão 1ml/minuto. Detecção em 254 nm. Em preto – cultivo por 7 dias; em azul – cultivo por 14 dias; em rosa – cultivo por 21 dias; em verde – cultivo por 28 dias. 24

Figura 12. Cromatogramas dos extratos da linhagem M23 cultivada em PDB. Fase Móvel gradiente exploratório: 5 – 100% de Acetonitrila em Água. Coluna analítica Supelcosil LC-18 (25cm x 4,6mm x 5µm). Vazão 1 ml/minuto. Detecção em 254 nm. Em preto – cultivo por 7 dias; em azul – cultivo por 14 dias; em rosa – cultivo por 21 dias; em verde – cultivo por 28 dias 25

iv

Figura 13. Espectro de RMN de 1H do extrato M20A21d, CDCl3, 400 MHz 26

Figura 14. Espectro de RMN de 1H do extrato M20C28d, CDCl3, 400 MHz 26

Figura 15. Espectro de RMN de 1H do extrato M20P28d, CDCl3, 400 MHz 27

Figura 16. Espectro de RMN de 1H do extrato M23A28d, CDCl3, 400 MHz 27

Figura 17. Espectro de RMN de 1H do extrato M23C28d, CDCl3, 400 MHz 28

Figura 18. Espectro de RMN de 1H do extrato M23P28d, CDCl3, 400 MHz 28

Figura 19. Cromatograma da Fração M20D. Fase Móvel gradiente exploratório: 5 – 100% de Acetonitrila em Água. Coluna analítica Supelcosil LC-18 (25cm x 4,6mm x 5µm). Vazão 1ml/minuto. Detecção em 220 nm 34

Figura 20. Cromatograma da Fração M20E. Fase Móvel gradiente exploratório: 5 – 100% de Acetonitrila em Água. Coluna analítica Supelcosil LC-18 (25cm x 4,6mm x 5µm). Vazão 1ml/minuto. Detecção em 254 nm 35

Figura 21. Cromatograma da Fração M20F. Fase Móvel gradiente exploratório: 5 – 100% de Acetonitrila em Água. Coluna analítica Supelcosil LC-18 (25cm x 4,6mm x 5µm). Vazão 1ml/minuto. Detecção em 254 nm 35

Figura 22. Cromatograma da Fração M20G1. Fase Móvel gradiente exploratório: 5 – 100% de Acetonitrila em Água. Coluna analítica Supelcosil LC-18 (25cm x 4,6mm x 5µm). Vazão 1ml/minuto. Detecção em 254 nm 36

Figura 23. Cromatograma da Fração M20G2. Fase Móvel gradiente exploratório: 5 – 100% de Acetonitrila em Água. Coluna analítica Supelcosil LC-18 (25cm x 4,6mm x 5µm). Vazão 1ml/minuto. Detecção em 254 nm 36

Figura24. Cromatograma da Fração H. Fase Móvel gradiente exploratório: 5 – 100% de Acetonitrila em Água. Coluna analítica Supelcosil LC-18 (25cm x 4,6mm x 5µm). Vazão 1ml/minuto. Detecção em 220 nm 37

Figura 25. Cromatograma da Fração I. Fase Móvel gradiente exploratório: 5 – 100% de Acetonitrila em Água. Coluna analítica Supelcosil LC-18 (25cm x 4,6mm x 5µm). Vazão 1ml/minuto. Detecção em 254 nm 37

Figura 26. Proposta estrutural para substância S1 38

Figura 27. Correlações observadas no mapa de contorno HMBC para a substância S1 39

Figura 28. Espectro de RMN de 1H do composto S1, CD3OD, 400 MHz 40

Figura 29. Espectro de RMN de 13C do composto S1, CD3OD, 100 MHz 40

Figura 30. Experimento DEPT 135 do composto S1, CD3OD, 100 MHz 41

Figura 31. Mapa de contorno HMQC da substância S1, CD3OD, 100-400 MHz 41

Figura 32. Mapa de contorno HMBC da substância S1, CD3OD, 100-400 MHz 42

Figura 33. Mapa de contorno COSY da substância S1, CD3OD, 400 MHz 42

v

Figura 34. Espectro de massas de alta resolução (EM-ESI), da substância S1, obtido em modo negativo 43

Figura 35. Espectro de absorção na região do Infravermelho, em KBr, da substância S1 43

Figura 36. Reação intramolecular do ácido diidrogladiólico formando a substância S1 44

Figura 37. Cromatograma da Fração M20E escala semi-preparativa. Fase Móvel gradiente exploratório: 5 – 50% de Acetonitrila em Água (40 minutos) e 50-100% Acetonitrila em água (5minutos). Coluna semi-preparativa Supelcosil LC-18 (25cm x 10mm x 5µm). Vazão 4ml/minuto. Detecção em 245 nm 44

Figura 38. Proposta estrutural para substância S3 45

Figura 39. Correlações observadas no mapa de contorno HMBC para a substância S3 46

Figura 40. Espectro de RMN de 1H da substância S3, CDCl3, 400 MHz 47

Figura 41. Espectro de RMN de 13C do composto S3, CDCl3, 100 MHz 48

Figura 42. Experimento DEPT 135 do composto S3, CDCl3, 100 MHz 48

Figura 43. Mapa de contorno HMQC da substância S3, CDCl3, 100-400 MHz 49

Figura 44. Mapa de contorno HMBC da substância S3, CDCl3, 100-400 MHz 49


Figura 46. Espectro de massas de alta resolução (EM-ESI), da substância S3, obtido em modo positivo 50

Figura 47. Proposta estrutural para a substância S4 (Galactitol) 51

Figura 48. Espectro de RMN de 1H da substância S4, D2O, 400 MHz 52

Figura 49. Espectro de RMN de 13C da substância S4, D2O, 100 MHz 53




Figura 53. Cromatograma da Fração M20F obtido em escala semi-preparativa. Fase Móvel gradiente exploratório: 5 – 20% de Acetonitrila em Água (10 minutos), 30-50% Acetonitrila em água (30 minutos) e 50-100% Acetonitrila em água (10 minutos). Coluna semi-preparativa Supelcosil LC-18 (25cm x 10mm x 5µm). Vazão 4ml/minuto. Detecção em 210 nm 55

Figura 54. Proposta estrutural para a substância S5 (convolvulol) 56

vi

Figura 55: Correlações observadas no mapa de contorno HMBC para a substância S5 57

Figura 56. Espectro de RMN de 1H da substância S5, CD3OD3, 600 MHz 58

Figura 57. Mapa de contorno HMQC da substância S5, CD3OD3, 150-600 MHz 58

Figura 58. Mapa de contorno HMBC da substância S5, CD3OD3, 150-600 MHz 59

Figura 59. Mapa de contorno COSY da substância S5, CD3OD3, 600 MHz 59


Figura 61: Espectro de RMN de 1H da substância S2, CD3OD3, 600 MHz 61





Figura 66: Espectro de RMN de 1H da substância S5, CD3OD3, 600 MHz 63



Figura 69. Mapa de contorno COSY da substância S5, CD3OD3, 600 MHz 65



Figura 72. CCDP da fração M23B, com destaque para a mancha 3 (placa de sílica gel, fase móvel uma mistura de hexano e acetato de etila na proporção (7:3) e revelação com UV 254 nm).

68

Figura 73. Cromatograma da Fração M23B3 escala semi-preparativa. Fase Móvel gradiente exploratório: 70 – 100% de Acetonitrila em Água (25 minutos). Coluna semi-preparativa Supelcosil LC-18 (25cm x 10mm x 5µm). Vazão 5ml/minuto. Detecção em 195 nm 69

Figura 74. Proposta estrutural para a substância S7 (R-5-metilmeleina) 69

Figura 75: Correlações observadas no mapa de contorno HMBC para a substância S7 71

Figura 76. Espectro de RMN de 1H da substância S7, CDCl3, 400 MHz 72

Figura 77. Experimento de RMN de 13C da substância S7, CDCl3, 100 MHz 72

vii

Figura 78. DEPT 135 da substância S7, CDCl3, 100 MHz 73

Figura 79. Mapa de contorno HMQC da substância S7, CDCl3, 100-400 MHz 73

Figura 80. Mapa de contorno HMBC da substância S7, CDCl3, 100-400 MHz 74

Figura 81. Mapa de contorno COSY da substância S7, CDCl3, 400 MHz 74


viii

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Produtos naturais de origem marinha aprovados como fármacos (adaptado de GERWICK; MOORE, 2012) 2

Tabela 2. Estrutura química de metabólitos secundários isolados de fungos associados a algas marinhas e respectiva atividade biológica, segundo BLUNT e colaboradores, 2012 e 2014 4

Tabela 3. Metabólitos isolados de fungos do gênero Hypocrea spp 6

Tabela 4. Percentual de inibição da proliferação celular (%) das amostras M20A21d, M20C28d, M20P28d, M23A28d, M23C28d e M20P28d, frente à linhagem tumoral HCT-116. Valores são médias ± desvio padrão da média. Em destaque estão as amostras que apresentaram inibição da proliferação celular ≥75%. 30

Tabela 5. Rendimento das frações de CLV 31

Tabela 6. Principais substâncias encontradas nas frações apolares analisadas via CG-EM, com similaridade maior que 90%, de acordo com banco de dados do equipamento. 32

Tabela 7. Estrutura das substâncias encontradas frações apolares analisadas via CG-EM. 33

Tabela 8. Dados de RMN de 1H e 13C em CD3OD da substância S1 38

Tabela 9. Dados de RMN de 1H e 13C em CDCl3 da substância S3 45

Tabela 10. Dados de RMN de 1H e 13C em D2O da substância S4 e comparação com dados já descritos para o Galactitol, segundo Parameswaran e colaboradores, 1996. 51


Tabela 12. Resultados dos ensaios de citotoxicidade frente a diferentes células tumorais e células sadias, realizados com o extrato bruto e frações do fungo H. lixii 67


ix

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AcOEt Acetato de Etila

ATCC American type culture collection

BDA Batata dextrose ágar

BDC Batata dextrose caldo

CBM Concentração bactericida mínima

CCDC Cromatografia em camada delgada comparativa

CCDP Cromatografia em camada delgada preparativa

CG-EM Cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas

CIM Concentração inibitória mínima

CLAE Cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a detector de arranjo de diodos

CLV Cromatografia líquida a vácuo

COSY Homonuclear correlation spectroscopy

d Dupleto

dd Duplo dupleto

DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer

DMSO Dimetilsulfóxido

EM Espectrometria de massas

FM Fase Móvel

Hex Hexano

HMBC Heteronuclear multiple bond correlation

HMQC Heteronuclear multiple quantum correlation

IES Ionização por eletrspray

J Constante de acoplamento (em Hz)

m Multipleto

MeOH Metanol

RMN Ressonância Magnética Nuclear

s simpleto

TMS tetrametilsilano

UV Ultra violeta

δ Deslocamento químico

SUMÁRIO

RESUMO i

ABSTRACT ii

LISTA DE FIGURAS iii

LISTA DE TABELAS viii

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ix

1. INTRODUÇÃO 1

1.1. Produtos Naturais e o Ambiente Marinho 1

1.2. Fungos Endofíticos 3

1.3. Fungo Hypocrea lixii 6

1.4. Fungo Eutypella sp 7

2. OBJETIVOS 8

3. MATERIAL e MÉTODOS 10

3.1. Especificações do material e equipamentos utilizados 11

3.2. Métodos 12

3.2.1. Obtenção das culturas dos micro-organismos 12

3.2.2. Obtenção dos extratos brutos 13

3.2.3. Triagem química dos extratos brutos obtidos do cultivo em escala piloto 14

3.2.4. Ensaio para avaliação da atividade antibacteriana 14

3.2.5. Ensaio para avaliação da atividade antitumoral 14

3.2.6. Identificação da linhagem M20 15

3.2.7. Fracionamento dos extratos obtidos do cultivo em escala ampliada 15

3.2.8. Análise das frações apolares via CG-EM 16

3.2.9. Análise das frações de média e alta polaridade via CLAE-DAD 16

3.2.10. Isolamento das substâncias S1 a S6 16

3.2.11. Isolamento da substância S7 17

3.2.12. Identificação estrutural das substâncias isoladas 17

3.2.13. Ensaio para avaliação da atividade antifúngica frente espécies de Candida spp 18

3.2.14. Ensaio para avaliação da atividade anticolinesterásica por bioautografia 18

3.2.15. Ensaio para avaliação da atividade antifúngica por bioautografia 19

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 20

4.1. Cultivo dos fungos e obtenção dos extratos em escala piloto 21

4.2. Triagem química dos extratos obtidos a partir do cultivo em escala piloto 21

4.3. Triagem biológica dos extratos obtidos a partir do cultivo em escala piloto 29

4.3.1. Avaliação da atividade antibacteriana 29

4.3.2. Avaliação da atividade antitumoral 29

4.4. Identificação da linhagem M20 30

4.5. Obtenção dos extratos em escala ampliada 30

4.6. Estudo químico e biológico do fungo Hypocrea lixii (linahgem M20 – cultivo em

escala ampliada) 31

4.6.1. Fracionamento do extrato bruto via CLV – linhagem M20 (H. lixii ) 31

4.6.2. Análise das frações apolares via CG-EM 32

4.6.3. Análise das frações M20E – M20I via CLAE-DAD 34

4.6.4. Elucidação estrutural da substância S1 36

4.6.5. Isolamento das substâncias S2 e S3 44

4.6.6. Elucidação estrutural da substância S3 45

4.6.7. Determinação estrutural da substância S4 51

4.6.8. Isolamento das substâncias S5 e S6 54


4.6.10. Determinação estrutural das substâncias S2 e S6 60

4.6.11. Avaliação da atividade antitumoral do extrato e frações 66

4.6.12. Avaliação da atividade biológica das substâncias S1 e S4 67

4.7. Estudo químico do fungo Eutypella sp (linhagem M23 – escala ampliada) 68

4.7.1. Isolamento da substância S7 68


5. CONCLUSÃO 76

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 79

Introdução

1 Introdução

1. Introdução

1.1. Produtos Naturais e o Ambiente Marinho

Na constante busca por novos compostos com atividade biológica e terapêutica, os

produtos naturais apresentam um papel importante como fonte de diversidade química para

substâncias candidatas a novos fármacos (CIAVATTA et al., 2008; LI; VEDERAS, 2009).

Muitos produtos naturais apresentam estrutura química complexa e com estereoquímica

definida. Estas substâncias evoluíram de tal forma que interagem de maneira eficiente com

alvos biológicos, e, assim, representam um ponto de partida valioso para a descoberta de

novos fármacos. (MONTASER; LUESCH, 2011). Prova disso, como mostra a Figura 1, é que

aproximadamente 64% dos fármacos aprovados por agências reguladoras entre os anos de

1981 e 2010 apresentam algum tipo de relação com produtos naturais, seja na totalidade da

estrutura, derivados semi-sintéticos, sintéticos miméticos de produtos naturais, ou mesmo

puramente sintéticos com grupos farmacofóricos encontrados em produtos naturais

(NEWMAN; CRAGG, 2012).

Figura 1. Origem dos fármacos aprovados por agências reguladoras entre os anos de

1981 a 2010 (adaptado de NEWMAN; GRAG, 2012).

Neste contexto, o ambiente marinho caracteriza-se por ser um nicho ainda pouco

explorado, sendo uma alternativa promissora na pesquisa de novos produtos naturais

(CLARDY; WALSH, 2004; MAYER et al., 2010; WATERS et al., 2010). Este ambiente

apresenta algumas características peculiares que o difere significativamente do ambiente

terrestre, tais com salinidade, exposição a períodos de incidência solar continua, influência da

tábua de marés, clima e predadores. Todas essas características reunidas favorecem a

produção de metabólitos estruturalmente diferenciados (FELÍCIO; OLIVEIRA; DEBONSI,

2012; VIEGAS JR; BOLZANI; BARREIRO, 2006).

2 Introdução

Ainda neste cenário de grande diversidade estrutural, muitos metabólitos do ambiente

marinho apresentam um interessante potencial biológico, o que tem inspirado o

desenvolvimento de novos fármacos a partir dessas substâncias (GERWICK; MOORE, 2012;

LI; VEDERAS, 2009; NEWMAN, 2008). Atualmente existem sete medicamentos

comercializados nos quais o princípio ativo consiste em uma substância de origem marinha

(Tabela 1). A finalidade terapêutica desses fármacos é variada, incluindo tratamento de câncer

(citarabina - Cytosar-U® e a trabectedina - Yondelis®), antiviral (vidarabina - Vira-A®),

analgésico (ziconotide - Prialt®) (GERWICK; MOORE, 2012; MAYER et al., 2010).

Tabela 1. Produtos naturais de origem marinha aprovados como fármacos (adaptado de GERWICK; MOORE, 2012).

Fármaco Estrutura Alvo terapêutico

Citarabina (Ara-C)

Tratamento Leucemia mielóide

aguda

Vidarabina (Ara-A)

Antiviral

Ziconotide

Analgésico

Eribulina

Tratamento câncer de mama

H3C

HN

OO

OH

NH

O

NH

OH HN

OHN

NHOHN

NH

NH2

O

NH

O

HN

O NH

NH2

NH2

O

OH

S

SHN

O NH2OHN

HN

OO

NH2

NH

O

HN

CH3

O

HN

OS

S

O

NH

OH

O

HNO

NH

NHH2NN

NH

CH3

CH3

O

HN

HN

O

SCH3

OH

SS

NH

O

HN

O

O

OH

NHO

O

H

H

3 Introdução

Dentre os seres que habitam o ambiente marinho, recentes descobertas enfatizam os

micro-organismos marinhos como uma fonte potencialmente produtiva de metabólitos

secundários biologicamente ativos. Mais de 30 substâncias derivadas de micro-organismos

marinhos estão em estudos clínicos ou pré-clínicos para o tratamento de diferentes tipos de

câncer (BLUNT et al., 2013; BLUNT et al., 2014; HU et al., 2011; XIONG et al., 2013).

1.2. Fungos Endofíticos

Um micro-organismo endofítico é aquele que passa ao menos parte de seu ciclo de

vida dentro de tecidos saudáveis de um hospedeiro, sem causar-lhe nenhum prejuízo, em uma

relação que pode variar de fitopatogênese latente ao mutualismo (ALY; DEBBAB;

PROKSCH, 2011; SOUZA et al., 2011; STROBEL et al., 2004).

Diversos estudos relatam que a interação com um endófito pode proporcionar diversos

benefícios ao hospedeiro, tais como adaptação ao estresse ambiental, sinalização celular,

produção de hormônios e antibiose (ALY et al., 2010; SCHULZ; BOYLE, 2005). Porém um

ponto em comum entre todas as interações endófito-hospedeiro é o fornecimento de nutrientes

e proteção contra o estresse ambiental externo e contra a competição microbiana para o

micro-organismo endofítico (SCHULZ; BOYLE, 2005).

Fármaco Estrutura Alvo terapêutico

Trabectedina (Yondelis ®)

Tratamento de sarcoma de tecido mole e câncer de ovário reincidente

Brentuximabe vedotina

Tratamento de linfoma de Hodgkin

Ésteres do ácido Ômega-3

Tratamento Hipertrigliceremia

4 Introdução

Os micro-organismos endofíticos receberam uma maior atenção a partir da descoberta

da produção de paclitaxel (Taxol ®) pelo fungo endofítico Taxomyces andreanae. Este

endófito foi isolado da planta Taxus brevifolia, sendo esta planta o primeiro organismos no

qual o paclitaxel foi encontrado (ALY et al., 2010). O paclitaxel é um agente anti-microtúbulo

com atividade antitumoral, utilizado no tratamento de diversos tipos de câncer, como câncer

de mama, ovário, pulmão entre outros (ALY et al., 2010; VELDHOEN et al., 2012).

Neste trabalho duas espécies de fungos endofíficos associados à alga marinha

Bostrychia radicans, a linhagem M20 (Hypocrea lixii) e a linhagem M23 (Eutypella sp),

foram estudadas com o objetivo de conhecer a química do micro-organismo, buscando o

isolamento de novos metabólitos secundários e/ou metabólitos bioativos.

Recentes trabalhos já descreveram alguns metabólitos isolados de fungos associados a

algas marinhas que apresentaram interessantes atividades biológicas. Como demonstra a

Tabela 2, já foram isoladas substâncias com atividade antitumoral, antibacteriana, antifúngica

e inibidor da elastase leucocitária (BLUNT et al., 2012; BLUNT et al., 2014). Até 2010,

número total de novos produtos naturais marinhos de derivados de fungos já havia

ultrapassado 1.000 substâncias (SUN et al., 2012).

Tabela 2. Estrutura química de metabólitos secundários isolados de fungos associados a algas marinhas e respectiva atividade biológica, segundo BLUNT e colaboradores, 2012 e 2014.

Metabólito Estrutura Atividade Biológica

Penicisteróide A

Antifúngico

Cereolactama

Inibidor de elastase leucocitária humana

Metabólito Estrutura Atividade Biológica

5 Introdução

1.3. Fungo Hypocrea lixii

O gênero Hypocrea é a forma telomórfica do gênero Trichoderma, constituído por

fungos oportunistas encontrados em uma grande variedade de ecossistemas, como terrestre,

marinho e de água doce (GAL-HEMED et al., 2011; HERMOSA et al., 2012; SCHUSTER;

SCHMOLL, 2010; ZHANG et al., 2013).

Algumas espécies do gênero Hypocrea apresentam relevância no controle biológico

contra fitopatógenos, protegendo plantas contra doenças e estimulando seu crescimento e

produtividade (HERMOSA et al., 2012; ZHANG et al., 2013). Essa proteção se deve ao

Esclerodinol

Antibacteriano

albican-11,14-diol

Antibacteriano

Conioscleroderolida

Inibidor elastase leucocitária humana

Helicascolidio C

Fungicida

Cristatumina A

Antibacteriano

6 Introdução

elevado potencial de micoparasitismo, antibiose e competição do gênero (GAL-HEMED et

al., 2011; HERMOSA et al., 2012; SOLANKI et al., 2011). Neste contexto, eficientes

espécies de Hypocrea spp estão sendo utilizadas como fungicidas biológicos (SCHUSTER;

SCHMOLL, 2010; SOLANKI et al., 2011).

Algumas espécies marinhas de Hypocrea apresentaram atividade larvicida e

antitumoral (ZHANG et al., 2013). Como ilustrado na Tabela 3, há relatos de isolamento de

metabólitos diversificados e com atividade biológica interessante (LIU et al., 2011;

OHKAWA et al., 2010; ZHAO et al., 2013).

Tabela 3. Metabólitos isolados de fungos do gênero Hypocrea spp.

Em estudos recentes, extratos orgânicos do fungo Hypocrea lixii apresentaram

atividade antibacteriana, antioxidante, citotóxica frente linhagens de células tumorais e

atividade anti-Trichomonas vaginalis (BHIMBA et al., 2012; CUI; GUO; XIAO, 2011;

SCOPEL et al., 2013). Portanto, estes dados nos motivam a prosseguir com os estudos quanto

a conhecer o metabolismo secundário deste fungo sob condições de cultivos diversas.

1.4. Fungo Eutypella sp

Espécies do gênero Eutypella spp apresentam uma grande diversidade de habitats,

incluindo desde solos da Antártica até florestas tropicais da Austrália e Tailândia. No

Metabólito Estrutura Atividade Biológica Referência

2-metilimidazo [1,5-b]isoquinolina-1,3,5(2H)-

triona

N

OO

O

- LIU et al, 2011

Hypocromina B

O

OOHOH

HO

OHO

OH

O

OH O

Antiangiogênico OHKAWA et al,

2010

Cajonol

O

OOH

HO

OH

OH

Agente citotóxico ZHAO et al, 2013

7 Introdução

ambiente marinho, espécies de Eutypella spp já foram isoladas do molusco pulmonado

Onchidium sp e de sedimento marinho (SUN et al., 2012; SUN et al., 2012).

Diferentes metabólitos de espécies do gênero Eutypella spp já foram isolados,

incluindo diterpenos, derivados de citocalasinas, lactonas, sesquiterpenos e derivados de

citosporina (CIAVATTA et al., 2008; ISAKA et al., 2009; ISAKA et al., 2011;

PONGCHAROEN et al., 2006; SOUZA et al., 2011; SUN et al., 2012; SUN et al., 2012).

Portanto, a pesquisa dos diferentes organismos que habitam o ambiente marinho torna-

se importante para a descoberta de substâncias estruturalmente diferenciadas e com possível

atividade biologia e terapêutica. Mesmo com a enorme biodiversidade brasileira, a pesquisa

científica sobre o ambiente marinho no Brasil é recente e os estudos nesta área são ainda

escassos.

Figura 2. Metabólitos secundários isolados de fungos do gênero Eutypella spp.

8

Objetivos

9 Objetivos

2. Objetivos

� Cultivo em escala piloto de dois fungos endofíticos associados à alga marinha

Bostrychia radicans (Linhagens M20 e M23), com variação de meio de cultivo e

período de crescimento;

� Triagem química (CCDC, CLAE-DAD e RMN de 1H) dos extratos obtidos da cultura

em escala piloto das linhagens selecionadas;

� Triagem biológica (atividade antibacteriana e atividade antitumoral) dos extratos

brutos obtidos da cultura em escala piloto das linhagens selecionadas;

� Adequação em escala ampliada da cultura do fungo que apresentar atividade biológica

significativa e/ou perfil químico mais interessante;

� Isolamento e elucidação estrutural das substâncias obtidas a partir da cultura em escala

ampliada;

� Avaliação da atividade biológica das substâncias isoladas.

10

Material e Métodos

11 Material e Métodos

3. Material e Métodos

3.1. Especificações do material e equipamentos utilizados

Solventes

� Solventes para extração, fracionamento e isolamento: solventes orgânicos grau técnico

(purificados por destilação fracionada) e de grau analítico.

� Solventes deuterados: CDCl3 (Aldrich contendo TMS como padrão interno) e CD3OD

(Aldrich).

� Solventes grau cromatográfico da marca Merck e J.T. Backer.

Meios de Cultivo

� Meios sólidos: BDA (Batata Dextrose Agar) marca Himedia; arroz parboilizado Uncle

Bean’s Agroparr Alimentos Ltda.

� Meios líquidos: BDC (Batata Dextrose Caldo) marca Himedia; meio líquido Czapek,

marca Himedia.

Cromatografia em Camada Delgada

� Placas de alumínio impregnadas com sílica Micro TLC/AL com indicador de

fluorescência no UV da marca Silicycle.

� Reveladores: câmara saturada com iodo ressublimado, irradiação com UV nos

comprimentos de onda de 254 e 366 nm, iodo platinado e anisaldeído.

Cromatografia líquida a vácuo

� Colunas de vidro com placa sinterizada

� Sílica gel fase normal 60H (Merck)

� Bomba de vácuo

Equipamentos

� Cromatógrafo Shimadzu, modelo SCL-10AVP, equipado com detector de arranjo de

diodos UV-Vis DAD Shimadzu, modelos SPD-M10AVP e sistema de integração

computadorizado com software CLASS-VP;

� Ponto de Fusão Fisatom, modelo 431;


� Polarímetro Jasco P-2000;

� Espectrômetro de Infravermelho por Transformada de Fourier FTIR Shimadzu IR-

Prestige 21;

� Espectrofotômetros de RMN BRUKER DRX 400, BRUKER DRX 500 e BRUKER

DRX 600, operando respectivamente em 400, 500 e 600 MHz para experimentos de 1H e em 100, 125 e 150 MHz para os experimentos de 13C;

� Espectrofotômetro de massas ESI-MS MicrO-TOF Bruker-daltonics; Rotaevaporador

Buchi R-210;

� Cromatógrafo a gás Shimadzu, modelo QP 2010, com detector de massas por impacto

de elétrons (70eV) com injetor split (250°C).

3.2. Métodos

3.2.1. Obtenção das culturas dos micro-organismos

Para o estudo piloto foram selecionadas as linhagens M20 e M23, ambas isoladas da

alga marinha Bostrychia radicans, coletadas no manguezal do Rio Escuro, em Ubatuba-SP

(23o29´30,0´´S/ 45o09´46,2´´W), em setembro de 2008. As linhagens em questão estão

preservadas e mantidas em óleo mineral no Laboratório de Química Orgânica do Ambiente

Marinho - NPPNS da FCFRP-USP.

A fim de reativar a linhagem microbiana, foram transferidas amostras das linhagens

preservadas em óleo mineral para placas de Petri com meio sólido BDA (Batata Dextrose

Agar). As placas foram mantidas a 25°C, acompanhando até o crescimento do micro-

organismo por toda a placa de Petri. Após esse período, foram transferidos 10 plugs de cada

linhagem para três frascos tipo Erlenmeyer com os meios de cultura. O esquema geral do

cultivo dos fungos endofíticos está ilustrado na Figura 3. Vale ressaltar que todos os

procedimentos envolvendo a manipulação do micro-organismo foram realizados em capela de

fluxo laminar e com material esterilizado, e que todos os meios de cultura foram preparados

com água do mar.

Linhagens selecionadas para cultivo em escala piloto:

- M20: identificada como Hypocrea lixii

- M23: identificada em trabalhos anteriores como Eutypella sp.

Para avaliar a melhor condição de crescimento dos micro-organismos selecionados,

foram avaliados três diferentes meios de cultivo: arroz, BDC (Batata Dextrose Caldo) e

Czapek, por diferentes períodos: 7, 14, 21 e 28 dias (três frascos tipo Erlenmeyer para cada


condição de cultivo). Já para o cultivo em escala ampliada, a linhagem M20 foi cultivada em

arroz (10 frascos tipo Erlenmeyer) e a linhagem M23 foi cultivada em meio líquido PDB (60

frascos tipo Erlenmeyer). Para ambos os cultivos, escala piloto e escala ampliada, foram

utilizados frascos tipo Erlenmeyer de 500 mL, com 100 mL de meio líquido ou 200 g de

arroz.

Figura 3. Esquema geral de cultivo das linhagens de fungos endofíticos selecionadas.

3.2.2. Obtenção dos extratos brutos

Os extratos foram obtidos a partir da trituração do micélio em ambiente asséptico,

seguido por três extrações do meio com CH2Cl2:MeOH (2:1) (Figura 4). O micélio foi

removido por filtração a vácuo e o filtrante foi separado em funil de separação, sendo que a

fase aquosa, proveniente do meio de cultura, foi descartada. A fase orgânica foi concentrada a

pressão reduzida, obtendo-se os extratos brutos. O micélio foi descartado após esterilização

em autoclave. A massa obtida para cada extrato está descrita no item 4.1, na Figura 6 (página

24).

Figura 4. Fluxograma geral de obtenção dos extratos de fungos endofíticos cultivados nos diferentes meios de cultura.

1. Reativação da linhagem selecionada em meio sólido BDA

2. Inoculação dos plugs no meio de cultivo escolhido para crescimento

(BDC, Czapek ou arroz)

3. Período de cultivo: 7, 14, 21 ou 28 dias

4. Cultivo finalizado para a extração


3.2.3. Triagem química dos extratos brutos obtidos do cultivo em escala piloto

Os extratos obtidos foram submetidos à análise através de cromatografia em camada

delgada comparativa (CCDC) em fase normal e a revelação foi realizada sob luz UV (254 e

365 nm), em câmara saturada de iodo sublimado, com solução de anisaldeído e iodo

platinado.

Para as análises por cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa foi

utilizada coluna analítica C18 Supelco (5µm x 4,4mm x 25cm), como fase móvel gradiente de

acetonitrila em água e fluxo de 1 ml/min. Foi utilizado o cromatógrafo Shimadzu, modelo

SCL-10AVP, equipado com detector de arranjo de diodos UV-Vis DAD Shimadzu, modelos

SPD-M10AVP e sistema de integração computadorizado com software CLASS-VP.

As análises de RMN de 1H foram realizadas nos espectrofotômetros BRUKER DRX

400 E BRUKER DRX 500, operando respectivamente em a 400 e 500 MHz para

experimentos de 1H e em 100 e 125 MHz para os experimentos de 13C. Ambos os

equipamentos estão localizados no Departamento de Química da Faculdade de Filosofia

Ciências e Letras de Ribeirão Preto, USP.

3.2.4. Ensaio para avaliação da atividade antibacteriana

Os experimentos para a avaliação de atividade antibacteriana foram realizados no

Departamento de Ciências Farmacêuticas da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de

Ribeirão Preto, USP, no laboratório de Farmacognosia, sob supervisão da Profa. Dra. Niege

A.J.C. Furtado.

As bactérias utilizadas no experimento foram: Staphylococcus aureus ATCC 25923

(gram positiva) e Escherichia coli ATCC 25922 (gram negativa). Para determinação da

concentração inibitória mínima (CIM) foi utilizado o método de microdiluição em microplaca

segundo a metodologia preconizada pelo “National Committee for Clinical Laboratory

Standards” (NCCLS, 2003), com adaptações. Para determinação da Concentração Bactericida

Mínima (CBM), após a revelação das placas de MIC, amostras dos poços da microplaca

foram transferidas para Placas de Petri contendo Meio Ágar Mueller Hinton e observou-se o

crescimento bacteriano após incubação a 37°C por 24 horas.

3.2.5. Ensaio para avaliação da atividade antitumoral

Os experimentos de atividade antitumoral foram realizados no Laboratório de

Oncologia Experimental do Departamento de Fisiologia e Farmacologia da Universidade

Federal do Ceará, sob a responsabilidade da Profa. Dra. Letícia Veras Costa-Lotufo.


Foram realizados testes de citotoxicidade através do método do MTT, utilizando a

linhagem celular: HCT-116 (cólon humano), em concentração única de 50 µg/mL, para a

seleção dos extratos mais ativos. Os extratos e frações ativas frente à linhagem HCT-116,

foram também testadas nas seguintes linhagens: HL-60 (leucemia); OVCAR-8 (câncer de

ovário); SF-295 (gliobastoma); PC-3M (câncer de próstata) e uma linhagem de célula normal

MRC-5 (célula normal de pulmão), para verificação da seletividade e especificidade da

atividade citotóxica da amostra.

As células serão cultivadas em meio de cultura contendo 10% de soro fetal bovino e

1% de antibióticos, mantidas a 37ºC em atmosfera de 5% de CO2. As células foram

plaqueadas na concentração 0,5 x 105 cél/mL. As placas foram incubadas por 72 horas em

estufa a 5% de CO2 a 37°C. Como controle positivo foi utilizado a doxorubicina na

concentração de 0,3µg/mL.

Ao término do período de incubação, o meio foi aspirado e em seguida, foram

adicionados 150 µL da solução de MTT (sal de tetrazolium), e as placas foram incubadas por

3h. A absorbância foi lida após dissolução do precipitado com 150 µL de DMSO puro em

espectrofotômetro de placa a 595nm.

3.2.6. Identificação da linhagem M20

A identificação da linhagem M20 foi realizada pela empresa Genotyping

Biotecnologia LTDA., utilizando sequenciamento automático por eletroforese capilar no

equipamento ABI 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) e alinhamento das sequências

de nucleotídeos produzidas com as sequências de referência depositadas no banco de dados

GenBank.

3.2.7. Fracionamento dos extratos obtidos do cultivo em escala ampliada

O extrato bruto do cultivo em escala ampliada foi submetido à análise por

Cromatografia Líquida a Vácuo (CLV) em fase normal e fase móvel com gradiente crescente

de polaridade, obtendo-se 9 frações, de A a I.

- Fração A: 100% Hexano

- Fração B: 90% Hexano e 10% Acetato de etila

- Fração C: 80% Hexano e 20% Acetato de etila

- Fração D: 60% Hexano e 40% Acetato de etila

- Fração E: 40% Hexano e 60% Acetato de etila


- Fração F: 20%Hexano e 80% Acetato de etila

- Fração G: 100% Acetato de etila

- Fração H: 25% Acetato de etila e 75% Metanol

- Fração I: 100% Metanol

3.2.8. Análise das frações apolares via CG-EM

Nas análises via CG-EM foi utilizada uma coluna DB-5 (30m x 0,25mm x 0,25 mm),

gás hélio como gás carreador, com fluxo de 1,41 ml/min, pressão de 87,1 kPa e aquecimento

com programação de temperatura de 60-240°C a 3°C/min e a fibra foi mantida exposta na

câmara de injeção por 3 minutos.

3.2.9. Análise das frações de média e alta polaridade via CLAE-DAD

Nas análises das frações via CLAE-DAD foi utilizada coluna analítica C18 Supelco

(5µm x 4,4mm x 25cm), como fase móvel gradiente de acetonitrila em água e fluxo de 1

ml/min. Foi utilizado o cromatógrafo Shimadzu, modelo SCL-10AVP, equipado com detector

de arranjo de diodos UV-Vis DAD Shimadzu, modelos SPD-M10AVP e sistema de

integração computadorizado com software CLASS-VP.

3.2.10. Isolamento das substâncias S1 a S6

As substâncias S1 a S6 foram isoladas do extrato da linhagem Hypocrea lixii (M20)

cultivada em arroz por 21 dias. A substância S1 foi isolada a partir da fração M20G, através

de lavagem do precipitado formado com Diclorometano, uma vez que a substância S1 se

mostrou insolúvel neste solvente.

As substâncias S2 e S3 foram isoladas a partir da fração M20E via CLAE em escala

semi-preparativa. Utilizou-se coluna Coluna Supelcosil LC-18 (25cm x 10mm x 5µm) e fase

móvel com gradiente exploratório 5-50% de Acetonitrila em água, por 40 min, seguido de 50-

100% de Acetonitrila em água por 5 minutos e vazão 4ml/minuto.

Já a substância S4 foi isolada da fração M20I após realização de uma coluna clássica,

com sílica gel e fase móvel gradiente de diclorometano-metanol. Na última etapa, as

substâncias S5 e S6 foram isoladas a partir da fração M20F via CLAE em escala semi-

preparativa. Utilizou-se coluna Coluna Supelcosil LC-18 (25cm x 10mm x 5µm) e fase móvel

com gradiente exploratório 5-20% de Acetonitrila em água, por 10 min, seguido de 20-50%

de Acetonitrila em água por 30 minutos e 50-100% de Acetonitrila em água por 10 minutos e

vazão 5ml/minuto. A Figura 5 a seguir ilustra o fluxograma do processo de isolamento.


Figura 5. Fluxograma do isolamento das substâncias S1-S6 a partir do extrato bruto do fungo Hypocrea lixii, cultivado em arroz por 21 dias.

3.2.11. Isolamento da substância S7

A substância S7 foi isolada a partir do extrato da linhagem Eutypella sp (M23)

cultivada em meio líquido PDB por 28 dias. Após o fracionamento via CLV, a fração M23B

(90% Hexano: 10% Acetato de Etila) foi submetida à CCDP em placas de sílica e fase móvel

Hexano : Acetato de Etila (7:3), o que possibilitou a separação de três manchas.

A mancha 3 (amostra M23B3) foi submetida a separação via CLAE semi-preparativa,

resultando no isolamento da substância S7. Para a realização da CLAE, foi utilizada coluna

Coluna Supelcosil LC-18 (25cm x 10mm x 5µm) e fase móvel com gradiente exploratório 70-

100% de Acetonitrila em água, por 25 min e vazão 5ml/minuto.

3.2.12. Identificação estrutural das substâncias isoladas

Para a elucidação estrutural das substâncias isoladas foram utilizadas as seguintes

técnicas espectrométricas: RMN uni e bidimensional, Espectrometria de massas de alta

resolução, Espectroscopia de absorção na região do infravermelho.

A

Extração com CH2Cl2:MeOH (2:1) 3x

Fracionamento via CLV Sílica Gel FM: Gradiente Hex-AcOEt-MeOH

Metodologias de Separação A: CLAE semi-preparativa B: Lavagem com CH2Cl2 C: CC (sílica gel) – FM: CH2Cl2-MeOH

A B C


3.2.13. Ensaio para avaliação da atividade antifúngica frente espécies de

Candida spp

Os experimentos para a avaliação de atividade antifúngica foram realizados no

Departamento de Ciências Farmacêuticas da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de

Ribeirão Preto, USP, no laboratório de Farmacognosia, sob supervisão da Profa. Dra. Niege

A.J.C. Furtado.

Foram utilizadas as seguintes cepas: Candida albicans ATCC, Candida tropicalis

ATCC 750, Candida krusei ATCC 34135, Candida parapsilosis ATCC 22019, Candida

glabrata ATCC 2001. Como controle positivo utilizou-se Fluconazol. Para determinação da

concentração inibitória mínima (MIC) foi utilizado o método de microdiluição em microplaca

segundo a metodologia preconizada pelo “National Committee for Clinical Laboratory

Standards” (NCCLS, 2003), com adaptações. Este ensaio foi realizado para as substâncias

isoladas S1 e S4.

3.2.14. Ensaio para avaliação da atividade anticolinesterásica por bioautografia

Os ensaios para avaliação da atividade anticolinesterásica foram realizados no

Instituto de Botânica de São Paulo, sob supervisão da Dra. Maria Cláudia Marx Young. Para a

realização do ensaio de atividade anticolinesterásica, amostras das substâncias S1 e S4 (50

µg) foram analisadas em CCDC de sílica gel 60 F254 (Merck). Como controle positivo foi

utilizado fisostigmina (0,05 µg).

Após o desenvolvimento da cromatografia, a placa foi borrifada com uma solução de

enzima acetilcolinesterase (6,66 U) acrescida de albumina bovina fração V (0,1%). Logo

após, a placa cromatográfica foi incubada em uma câmara úmida fechada a 37°C por 20

minutos, e em seguida borrifada com uma mistura da solução etanólica de acetato de 1-naftila

(5 mL; 0,25%) e aquosa do sal Fast Blue B (20 mL; 0,25%). Uma coloração roxa aparece em

aproximadamente 2 minutos.

O aparecimento de mancha branca, sobre o fundo de coloração roxa indica inibição da

atividade da enzima acetilcolinesterase. As cromatoplacas obtidas foram observadas em (λ)

254 nm e 366 nm.


3.2.15. Ensaio para avaliação da atividade antifúngica por bioautografia

Os ensaios para avaliação da atividade antifúngica em placas de sílica-gel foram

realizados no Instituto de Botânica de São Paulo, sob supervisão da Dra. Maria Cláudia Marx

Young. Para isso, cepas dos fungos Cladosporium sphaerospermum, obtidos da micoteca do

Instituto de Botânica de São Paulo, foram incubadas em meio de cultura BDA a 25ºC por 14

dias. Após esse período foi feita a extração dos esporos com solução de sais e glicose (6:1). A

suspensão foi filtrada e armazenada a -18ºC para posterior nebulização nas cromatofolhas.

As amostras (substâncias S1 e S4, 50 µg) e o controle positivo Nistatina (5 µg)

diluídos foram aplicados em cromatofolhas. As cromatofolhas foram nebulizadas com uma

suspensão de esporos dos fungos (> 2x106 esporos mL-1) em solução de glicose e sais (6:1) e

incubadas em câmara úmida a 27ºC por 48 h, no escuro (HOMANS; FUCHS, 1970;

RAHALISON et al., 1994). Após o tempo de incubação, zonas claras corresponderam à área

de inibição dos fungos pela ação das amostras analisadas.

20

Resultados e Discussão

21 Resultados e Discussão

4. Resultados e Discussão

4.1. Cultivo dos fungos e obtenção dos extratos em escala piloto

Com a finalidade de estabelecer as melhores condições de cultivo dos fungos para

produção de metabólitos secundários, foram analisadas as seguintes variações: meio de

cultura e tempo de cultivo.

- Meios de cultura analisados: arroz, Czapek e BDC

- Tempos de cultivo analisados: 7, 14, 21 e 28 dias

Ao final do cultivo e extração foram obtidos 12 extratos brutos de cada linhagem,

como demonstrado na figura 6, a seguir.

Figura 6. Esquema geral dos extratos obtidos do cultivo em escala piloto das duas linhagens selecionadas para a triagem química e biológica.

Nota-se que o cultivo em arroz fornece maiores quantidades de extrato bruto. A

utilização de meios sólidos favorece o crescimento de fungos filamentosos, pois além da fonte

de nutrientes, a matriz sólida fornece apoio para o crescimento das hifas e com isso alcança

uma maior área de crescimento, concentração de nutrientes e circulação de oxigênio. Há

relatos que até mesmo micro-organismos marinhos preferem o crescimento em matrizes

sólidas, uma vez que mais de 98% dos isolados de ambiente marinho têm sido obtidos a partir

de superfícies de substratos sólidos, encontrados em habitats marinhos (SINGHANIA et al.,

2009).

4.2. Triagem química dos extratos obtidos a partir do cultivo em escala piloto

Para a triagem química dos extratos brutos foram realizadas análises via CCDC,

CLAE-DAD e RMN de 1H. Após as análises por CLAE-DAD (Figuras 7-12) e CCDC, os


extratos considerados mais promissores para posterior isolamento de metabólitos foram os

extratos M20 cultivados em arroz por 21 dias e M23 cultivados em meio PDB por 28 dias.

Nos espectros de RMN de 1H (Figuras 13-18), os diferentes extratos mostraram-se

semelhantes, com sinais de deslocamentos químicos na região entre 3,0 e 6,0 ppm, sugerindo

a presença de açúcares e/ou ligações duplas, e sinais de deslocamento químico entre 6,7 a 7,8

ppm sugerindo a presença de substâncias aromáticas. Mas vale ressaltar que muitos sinais

observados nos espectros de RMN de 1H podem ser referentes aos constituintes do meio de

cultura.

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

Todos os extratos obtidos, tanto da linhagem M20 como da linhagem 23, foram

submetidos à análise por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com detector de arranjo de

diodos (CLAE-DAD), em fase reversa com coluna analítica RP-18, fase móvel com gradiente

exploratório (5-100% de Acetonitrila em água) e fluxo de 1 ml/min.

Figura 7. Cromatogramas dos extratos da linhagem M20 cultivada em Arroz. Fase Móvel gradiente exploratório: 5 – 100% de Acetonitrila em Água. Coluna analítica Supelcosil LC-18 (25cm x 4,6mm x 5µm). Vazão 1ml/minuto. Detecção em 254 nm. Em preto – cultivo por 7 dias; em azul – cultivo por 14 dias; em rosa – cultivo por 21 dias; em verde – cultivo por 28 dias.


Figura 8. Cromatogramas dos extratos da linhagem M20 cultivada em Czapek. Fase Móvel gradiente exploratório: 5 – 100% de Acetonitrila em Água. Coluna analítica Supelcosil LC-18 (25cm x 4,6mm x 5µm). Vazão 1ml/minuto. Detecção em 254 nm. Em preto – cultivo por 7 dias; em azul – cultivo por 14 dias; em rosa – cultivo por 21 dias; em verde – cultivo por 28 dias.

Figura 9. Cromatogramas dos extratos da linhagem M20 cultivada em PDB. Fase Móvel gradiente exploratório: 5 – 100% de Acetonitrila em Água. Coluna analítica Supelcosil LC-18 (25cm x 4,6mm x 5µm). Vazão 1ml/minuto. Detecção em 254 nm. Em preto – cultivo por 7 dias; em azul – cultivo por 14 dias; em rosa – cultivo por 21 dias; em verde – cultivo por 28 dias.


Figura 10. Cromatogramas dos extratos da linhagem M23 cultivada em Arroz. Fase Móvel gradiente exploratório: 5 – 100% de Acetonitrila em Água. Coluna analítica Supelcosil LC-18 (25cm x 4,6mm x 5µm). Vazão 1ml/minuto. Detecção em 254 nm. Em preto – cultivo por 7 dias; em azul – cultivo por 14 dias; em rosa – cultivo por 21 dias; em verde – cultivo por 28 dias.

Figura 11. Cromatogramas dos extratos da linhagem M23 cultivada em Czapek. Fase Móvel gradiente exploratório: 5 – 100% de Acetonitrila em Água. Coluna analítica Supelcosil LC-18 (25cm x 4,6mm x 5µm). Vazão 1ml/minuto. Detecção em 254 nm. Em preto – cultivo por 7 dias; em azul – cultivo por 14 dias; em rosa – cultivo por 21 dias; em verde – cultivo por 28 dias.


Figura 12. Cromatogramas dos extratos da linhagem M23 cultivada em PDB. Fase Móvel gradiente exploratório: 5 – 100% de Acetonitrila em Água. Coluna analítica Supelcosil LC-18 (25cm x 4,6mm x 5µm). Vazão 1 ml/minuto. Detecção em 254 nm. Em preto – cultivo por 7 dias; em azul – cultivo por 14 dias; em rosa – cultivo por 21 dias; em verde – cultivo por 28 dias.

Ressonância Magnética Nuclear de 1H

Para a análise de RMN de 1H, foram selecionados os extratos com maior potencial de

produção de metabólitos secundários, de acordo com as análises de CCDC e CLAE-DAD:

- M20A21d: linhagem M20 cultivada em Arroz por 21 dias

- M20C28d: linhagem M20 cultivada em Czapek por 28 dias

- M20P28d: linhagem M20 cultivada em PDB por 28 dias

- M23A28d: linhagem M23 cultivada em Arroz por 21 dias

- M23C28d: linhagem M23 cultivada em Czapek por 28 dias

- M23P28d: linhagem M23 cultivada em PDB por 28 dias


M20A21d.esp

8 7 6 5 4 3 2 1 0Chemical Shift (ppm)

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40

0.45

0.50

Nor

mal

ized

Inte

nsity

7.49

86

7.27

007.

2656

7.24

66

5.38

285.

3791

5.36

525.

3620

5.35

635.

3475

5.34

245.

3330

4.31

964.

2899

4.27

924.

1725

4.15

744.

1428

4.12

773.

7419

2.79

112.

7608

2.37

002.

3352

2.32

322.

3169

2.29

802.

0625

2.04

481.

6205

1.30

551.

2575

0.91

210.

9014

0.89

450.

8907

0.88

500.

8774

0.86

730.

6356

Figura 13. Espectro de RMN de 1H do extrato M20A21d, CDCl3, 400 MHz.

M20C28d.esp


0.05

0.10

0.15

0.20

Nor

mal

ized

Inte

nsity

7.72

467.

5579

7.51

94

5.35

06

4.10

184.

0848

3.74

193.

6737

3.05

69

2.37

312.

3542

2.33

522.

0631

1.62

241.

5706

1.30

551.

2588

1.00

310.

9866

0.90

200.

8951

0.88

500.

8780

0.86

790.

0838

0.06

55

Figura 14. Espectro de RMN de 1H do extrato M20C28d, CDCl3, 400 MHz.


m20p28.001.esp


0

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

Nor

mal

ized

Inte

nsity

7.42

407.

2125

7.19

55

5.30

835.

3051

5.29

445.

2906

5.28

685.

2761

5.27

295.

2704

4.65

044.

0266

4.00

963.

7899

3.66

673.

1800

2.98

172.

8940

2.70

142.

6862

2.29

672.

2777

2.25

941.

9715

1.56

301.

5447

1.24

801.

2391

1.23

031.

2227

1.21

331.

1836

1.17

350.

8269

0.81

990.

8098

0.00

04

Figura 15. Espectro de RMN de 1H do extrato M20P28d, CDCl3, 400 MHz.

m23a28.001.esp


0

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

Nor

mal

ized

Inte

nsity

7.26

69

5.36

085.

3570

5.35

135.

3425

5.33

995.

3374

4.34

304.

3152

4.30

454.

2856

4.27

484.

1681

4.15

304.

1385

4.12

33

3.73

633.

2609

2.77

032.

3378

2.33

082.

3189

2.31

192.

0581

2.04

041.

3005

1.29

041.

2834

1.27

581.

2531

0.89

700.

8901

0.88

630.

8800

0.86

29

0.00

05



m23c28.001.esp

11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0Chemical Shift (ppm)

0

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

Nor

mal

ized

Inte

nsity

10.9

355

7.19

59

5.30

505.

2911

5.28

735.

2760

5.27

035.

2589

4.21

594.

0985

4.08

33

3.66

662.

7012

2.68

612.

2959

2.27

762.

2587

1.54

461.

2857

1.23

081.

2207

1.21

311.

1841

0.82

730.

8204

0.81

030.

7926

0.00

03-0

.069

2


m23p28.001.esp


0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40

Nor

mal

ized

Inte

nsity

7.64

897.

4822

7.19

93

5.30

405.

2901

5.28

695.

2813

5.27

435.

2674

5.25

794.

2155

4.20

484.

0981

4.08

294.

0684

4.05

324.

0261

4.00

903.

6656

3.57

472.

7002

2.26

022.

2482

2.24

191.

9874

1.97

041.

3826

1.23

041.

2197

1.18

300.

9280

0.91

090.

8263

0.81

940.

8156

0.80

990.

7922

0.00

870.

0005

-0.0

702

Figura 18. Espectro de RMN de 1H do extrato M23P28d, CDCl3, 400 MHz.


4.3. Triagem Biológica dos extratos obtidos a partir do cultivo em escala piloto

4.3.1. Avaliação da atividade antibacteriana

A atividade antibacteriana foi realizada através da determinação da concentração

inibitória mínima (CIM) pelo método de microdiluição em microplaca, segundo a

metodologia preconizada pelo “National Committee for Clinical Laboratory Standards”

(NCCLS, 2003).

Para a revelação das placas foi utilizado o substrato resarzurina (7-hidroxi-10-óxido-

3H-fenoxazin-3-ona). A resarzurina é um corante redox, que apresenta uma alteração

colorimétrica relacionada com a atividade metabólica celular. O ensaio é baseado na

capacidade de células metabolicamente viáveis em reduzir a resazurina (coloração azul) em

resorufina (coloração vermelha). Esta conversão ocorre intracelularmente, pela atividade de

enzimas mitocondriais (VEGA-AVILA; PUGSLEY, 2011). Dessa forma, a coloração azul

indica que houve uma inibição do crescimento bacteriano, e a coloração vermelha indica

presença de células bacterianas viáveis.

Para experimento de CBM, foram coletadas pequenas amostras dos poços com

resultado positivo (inibição do crescimento – coloração azul) no experimento de CIM. O

experimento de CBM verifica se há crescimento bacteriano após o tratamento e incubação e

com isso pode-se analisar a possível ação bactericida ou bacteriostática da amostra.

Foram realizados ensaio de atividade antibacteriana com os extratos brutos das duas

linhagens, M20 e M23, faixa de concentrações de 400µg/ml a 0,2µg/ml. Apenas na

concentração de 400µg/ml, houve inibição do crescimento bacteriano, com ação

bacteriostática no experimento de CBM. Para uma ação antibacteriana efetiva, é interessante

que o extrato apresente atividade em concentrações menores que 100µg/ml (RIOS; RECIO,

2005). Sendo assim, nenhum dos extratos analisados apresentou potencial atividade

antibacteriana.

4.3.2. Avaliação da atividade antitumoral

Com base no estudo químico dos extratos brutos, foram selecionados os seguintes

extratos para o ensaio antitumoral: M20A21d, M20C28d, M20P28d, M23A28d, M23C28d e

M23P28d. Foram consideradas amostras com potencial citotóxico relevante os extratos que

apresentaram inibição ≥ 75% na concentração de 50 µg/mL. Extratos da linhagem M20

(Hypocrea lixii) apresentaram um interessante potencial de inibição da proliferação celular da

linhagem HCT-116 (células de câncer de cólon humano), com destaque para o extrato

M20A21d (Linhagem M20 cultivada em arroz por 21 dias), que apresentou 98% de inibição


do crescimento celular, um valor ainda maior que o controle positivo utilizado

(Doxorubicina), como descrito na Tabela 4.

Tabela 4. Percentual de inibição da proliferação celular (%) das amostras M20A21d, M20C28d, M20P28d, M23A28d, M23C28d e M20P28d, frente à linhagem tumoral HCT-116. Valores são médias ± desvio padrão da média. Em destaque estão as amostras que apresentaram inibição da proliferação celular ≥75%.

4.4. Identificação da linhagem M20

A identificação da linhagem M20 foi realizada pela empresa Genotyping

Biotecnologia LTDA., uma incubadora localizada em Botucatu-SP. Foi utilizado

sequenciamento automático por eletroforese capilar no equipamento ABI 3500 Genetic

Analyzer (Applied Biosystems) e alinhamento das sequências de nucleotídeos produzidas com

as sequências de referência depositadas no banco de dados. O resultado do sequenciamento

demonstrou maior identidade da linhagem M20 com o fungo Hypocrea lixii, apresentando

100% de identificação com esta espécie.

A linhagem M23 já havia sido identificada anteriormente, como pertencente ao gênero

Eutypella, não sendo possível a identificação da espécie.

4.5. Obtenção dos extratos em escala ampliada

Com base nos resultados de análise química dos extratos obtidos a partir do

experimento piloto, primeiramente, foi selecionada a linhagem M20 cultivada em Arroz para

o crescimento em escala ampliada, sendo que os critérios utilizados para a escolha foram:

- Massa do extrato bruto

- Perfil cromatográfico obtido via CLAE-DAD

- Resultado da triagem biológica

Amostras Inibição da proliferação celular (%)

M20A21d 98,39 ± 3,13

M20C28d 87,00 ± 2,12

M20P28d 83,37 ± 7,33

M23A28d 30,08 ± 3,27

M23C28d 39,06 ± 0,43

M23P28d 9,36 ± 1,26

Doxorubicina 93,09 ± 0,03


Foi escolhido o período de 21 dias de cultivo, uma vez que as análises cromatográficas

do extrato da linhagem M20 em arroz não diferem significativamente entre os períodos de 21

e 28 dias. Além disso, o extrato bruto da linhagem M20 cultivado em arroz apresentou um

interessante potencial citotóxico frente células tumorais HCT-116 (câncer de cólon humano).

Assim, após a reativação, cultivo (10 frascos tipo Erlenmeyer) e extração, foi obtido o extrato

bruto com massa de 14,98g.

Em um segundo momento, foi realizado o cultivo em escala ampliada da linhagem

M23 (Eutypella sp) em meio PDB por 28 dias, e a massa do extrato obtido foi de 1,04g.

4.6. Estudo químico e biológico do fungo Hypocrea lixii (linhagem M20 – cultivo em

escala ampliada)

4.6.1. Fracionamento do extrato bruto via CLV – linhagem M20 (H. lixii )

O fracionamento do extrato bruto teve início com a cromatografia líquida a vácuo

(CLV) em fase normal e fase móvel com gradiente crescente de polaridade (100% hexano –

100% acetato de etila – 100% metanol). Foram utilizados 9,0g do extrato bruto da linhagem

M20A cultivada em arroz em escala ampliada, resultando em nove frações, M20A a M20I

(Tabela 5). Todas as frações foram concentradas em rotaevaporador e armazenadas.

Após a concentração, a fração M20G apresentou uma porção líquida amarelada e um

precipitado branco, sendo o precipitado insolúvel em diclorometano. Essas porções foram

separadas, sendo a porção líquida denominada M20G1 e o precipitado M20G2. O precipitado

foi lavado com diclorometano, obtendo-se um cristal branco.

Tabela 5. Rendimento das frações de CLV

Fração Fase Móvel Massa Obtida

M20A 100% H 0,016g

M20B 90%H : 10%A 0,875g

M20C 80%H: 20%A 0,163g

M20D 60%H: 40%A 1,056g

M20E 40%H : 60%A 0,096g

M20F 20%H: 80%A 0,055g

M20G1 100%A 0,112g

M20G2 100%A 0,038g

M20H 25%A : 75%M 0,029g

M20I 100%M 5,218g

H = hexano; A = acetato de etila; M = metanol


4.6.2. Análise das frações apolares via CG-EM

As frações apolares (frações M20A, M20B, M20C, M20D) foram analisadas via CG-

EM. Em todas as frações analisadas o sinal majoritário foi referente ao ácido n-hexadecanóico

(ácido palmítico). Foram observados sinais de hidrocarbonetos e outros ácidos graxos. Na

fração B observa-se que as principais substâncias são aldeídos. Os sinais majoritários, com

área maior que 3%, de cada fração são apresentados nas Tabelas 6 e 7.

Tabela 6. Principais substâncias encontradas nas frações apolares analisadas via CG-EM, com similaridade maior que 90% quando comparado com banco de dados do equipamento.

Substância Índice de

Similaridade Índice de Retenção

obtido

Índice de retenção da literatura*

Fração M20 A

Heptadecano 97% 1707 1711

Octadecano 97% 1924 1810

Ácido palmítico 96% 1967 1968

Ácido oleico 95% 2142 2175

Tetracosano 97% 2414 2407

Tetratetracontano 97% 4436 4395

Fração M20 B

Nonanal 94% 1128 1102

2-decenal 95% 1270 1212

2-undecenal 95% 1372 1311


Fração M20 C



Ácido esteárico 97% 2185 2167

Fração M20 D



Ácido octadecanóico 96% 2175 2167

Estigmasterol 95% 4450 4456 * valores de índice de retenção observados no banco de dados do equipamento de CG-EM.


Tabela 7. Estrutura das substâncias encontradas frações apolares analisadas via CG-EM.

Substância Estrutura

Heptadecano

Octadecano

Ácido palmítico

O OH

Ácido oleico O OH

Tetracosano

Tetratetracontano

Nonanal O

2-decenal O

2-undecenal O

Estigmasterol

HO

H

H

H

4.6.3. Análise das frações M20E – M20I via CLAE-DAD

As frações de média a alta polaridade (frações M20E, M20F, M20G1, M20G2, M20H

e M20I) foram analisadas por CLAE-DAD em coluna analítica fase reversa RP-18 com fase

móvel gradiente exploratório (5-100% de acetonitrila em água).

As frações M20D e M20G1(Figuras 19 e 22) apresentaram cromatogramas

complexos, com a presença de diversos picos sobrepostos e sem uma boa resolução. A fração

M20I (Figura 25) apresentou picos sobrepostos e com rápida eluição, sendo que não foi


possível o estabelecimento de um sistema de fase móvel que proporcionasse uma boa

resolução, com picos bem separados.

Na sequência, as frações M20E e, M20F (Figuras 20 e 21) apresentaram

cromatogramas com uma boa separação dos picos. Para essas amostras foram desenvolvidos

métodos de eluição distintos para a posterior realização de cromatografia em escala semi-

preparativa. A fração M20H (Figura 24) também a presentou cromatograma com boa

separação dos picos, porém devido à pequena quantidade obtida dessa fração, não foi possível

a realização de cromatografia em escala semi-preparativa.

Por fim, fração M20G2 apresentou cromatograma (Figura 23) com uma única

substância majoritária, com tempo de retenção de 15,63 minutos. Esta fração passou a ser

denominada como substância S1 e foi submetida aos experimentos de RMN uni e

bidimensionais. As frações M20E e M20F foram selecionadas para a realização de CLAE em

escala semi-preparativa.

Figura 19. Cromatograma da Fração M20D. Fase Móvel gradiente exploratório: 5 – 100% de Acetonitrila em Água. Coluna analítica Supelcosil LC-18 (25cm x 4,6mm x 5µm). Vazão 1ml/minuto. Detecção em 220 nm.


Figura 20. Cromatograma da Fração M20E. Fase Móvel gradiente exploratório: 5 – 100% de Acetonitrila em Água. Coluna analítica Supelcosil LC-18 (25cm x 4,6mm x 5µm). Vazão 1ml/minuto. Detecção em 254 nm.

Figura 21. Cromatograma da Fração M20F. Fase Móvel gradiente exploratório: 5 – 100% de Acetonitrila em Água. Coluna analítica Supelcosil LC-18 (25cm x 4,6mm x 5µm). Vazão 1ml/minuto. Detecção em 254 nm.


Figura 22. Cromatograma da Fração M20G1. Fase Móvel gradiente exploratório: 5 – 100% de Acetonitrila em Água. Coluna analítica Supelcosil LC-18 (25cm x 4,6mm x 5µm). Vazão 1ml/minuto. Detecção em 254 nm.

Figura 23. Cromatograma da Fração M20G2. Fase Móvel gradiente exploratório: 5 – 100% de Acetonitrila em Água. Coluna analítica Supelcosil LC-18 (25cm x 4,6mm x 5µm). Vazão 1ml/minuto. Detecção em 254 nm.

S1


Figura 24. Cromatograma da Fração H. Fase Móvel gradiente exploratório: 5 – 100% de Acetonitrila em Água. Coluna analítica Supelcosil LC-18 (25cm x 4,6mm x 5µm). Vazão 1ml/minuto. Detecção em 220 nm.

Figura 25. Cromatograma da Fração I. Fase Móvel gradiente exploratório: 5 – 100% de Acetonitrila em Água. Coluna analítica Supelcosil LC-18 (25cm x 4,6mm x 5µm). Vazão 1ml/minuto. Detecção em 254 nm.

4.6.4. Elucidação estrutural da substância S1

A substância S1 (38 mg), foi identificada como sendo o ácido 3-hidroxi-5-metoxi-6-

metil-1,3-diidro-isobenzofurano-4-carboxílico (Figura 26), e apresentou-se como um sólido

branco que cristaliza com água e metanol, αD = +0,06 (metanol, Concentração = 1%), e pf =

295°C. Sua elucidação estrutural foi baseada nos espectros de RMN de 1H, 13C, DEPT 135,

COSY 1H-1H, HMQC, HMBC, espectrometria de massas e espectroscopia de absorção na

região do infravermelho (Tabela 8 e Figuras 28-33).


Figura 26. Proposta estrutural para substância S1

Tabela 8. Dados de RMN de 1H e 13C em CD3OD da substância S1

No espectro de RMN de 1H (Figura 28) podemos verificar a presença de:

- um simpleto com deslocamento químico δ 7,25, integrando para 1H, indicando a presença

de um hidrogênio aromático;


de hidrogênios de grupo metílico ligado a um anel aromático;


hidrogênios de grupo metoxílico;

- um dupleto desblindado, com deslocamento químico δ 6,26, integrando para 1H, indicando a

presença de um hidrogênio de um grupo hemiacetal.

- um dupleto com deslocamento químico δ 4,91, integrando para 1H e um duplo dupleto em δ

5,04, integrando para 1H. Esses sinais foram atribuídos a um CH2 presente no anel

diidrofurano. Por estar em um anel, os hidrogênios ligados ao mesmo carbono (Carbono 1)

Carbono δ 1H – 400 MHz δ 13C – 100 MHz

1 a 4,91 (d, J=12,6; 1H)

b 5,04 (dd, J=12,6; 2,0; 1H) 72,7

3 6,26 (d, J=2,0 Hz, 1H) 108,7

3a - 134,0

4 - 135,1

5 - 157,9

6 - 136,8

7 7,25 (s, 1H) 126,7

7a - 137,8

8 - 166,1

9 3,80 (s, 3H) 62,2

10 2,30 (s, 3H) 16,5


são magneticamente diferentes, apresentando sinais distintos no espectro de RMN de 1H. A

presença de um centro estereogênico no carbono 3 é responsável pela diferença de

deslocamentos químicos para os sinais destes hidrogênios, quando submetidos a um campo

magnético.

No espectro de RMN de 13C (Figura 29) foi possível observar sinais em δ 125 a 158,

indicando a presença de carbonos aromáticos. Os sinais em δ 16,5 e 62,2 indicam a presença

de um grupo metílico e um grupo metoxílico respectivamente. A presença de um sinal em δ

166,1 sugere a presença de um grupo carboxílico, atribuída ao carbono do ácido carboxílico.

A presença de um ácido carboxílico pode ser confirmada no espectro de absorção do

Infravermelho (Figura 35), que apresentou uma banda intensa de absorção em 1720 cm-1

(estiramento C=O) e uma banda forte e alargada em 3342 cm-1 (estiramento O–H).

A confirmação da estrutura se deu pelos espectros de RMN bidimensionais HSQC,

HMQC e COSY (Figuras 31-33). No mapa de contorno HMBC (Figuras 32) foi possível

observar as seguintes correlações (também esquematizadas na Figura 27):

- H7 (δ 7,25) com C1 (δ 72,7), C10 (δ 126,7) e C5 (δ 157,9)

- H9 (δ 3,80) com C5 (δ 157,9)

- H10 (δ 2,30) com C5 (δ 157,9), C6 (δ 136,8) e C7 (δ 126,7)

- H3 (δ 6,26) com C1 (δ 72,7)

- H1a (δ 4,91) com C3 (δ 108,7)

Figura 27. Correlações observadas no mapa de contorno HMBC para a substância S1

No mapa de contorno COSY (Figura 33), foram observadas as seguintes correlações

entre Hidrogênios:

- H7 (δ 7,25) com H1a (δ 4,91), H1b (δ 5,04) e H10 (δ 2,30)

- H1b (δ 5,04) com H1a (δ 4,91) e H3 (δ 6,26)


M20G2.001.esp

8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0Chemical Shift (ppm)

0

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40

Nor

mal

ized

Inte

nsity

3.383.041.651.171.031.01

Methanol

7.24

84

6.26

536.

2603

5.06

005.

0550

5.02

855.

0234

4.93

124.

9300

4.89

974.

8984

4.87

00

3.79

92

2.30

22

Figura 28. Espectro de RMN de 1H da substância S1, CD3OD, 400 MHz.

m20g2.Carbono.esp


0

0.005

0.010

0.015

0.020

0.025

0.030

0.035

0.040

0.045

0.050

0.055

0.060

0.065

Nor

mal

ized

Inte

nsity

166.

1195

157.

9583

137.

7953

136.

8643

135.

1477

134.

0493

126.

6591

108.

7220

72.7

166

62.2

278

16.5

556

Figura 29. Espectro de RMN de 13C da substância S1, CD3OD, 100 MHz.


m20g2.DEPT.esp


-0.5

0

0.5

1.0

Nor

mal

ized

Inte

nsity

126.

6591

108.

7220

72.7

166

62.2

278

16.5

556

Figura 30. Experimento DEPT 135 da substância S1, CD3OD, 100 MHz.

7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0F2 Chemical Shift (ppm)

0

20

40

60

80

100

120

140

F1

Che

mic

al S

hift

(ppm

)

Figura 31. Mapa de contorno HMQC da substância S1, CD3OD, 100-400 MHz.



0

50

100

150 F1

Che

mic

al S

hift

(ppm

)

Figura 32. Mapa de contorno HMBC da substância S1, CD3OD, 100-400 MHz.

7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0F2 Chemical Shift (ppm)

2

3

4

5

6

7

F1

Che

mic

al S

hift

(ppm

)

Figura 33. Mapa de contorno COSY da substância S1, CD3OD, 400 MHz.


A estrutura proposta apresenta fórmula molecular C11H12O5 (massa molecular

calculada = 224,0685). A fórmula molecular pode ser confirmada pela análise do Espectro de

Massas de alta resolução por ionização por electrospray em modo negativo (Figura 34), no

qual foi observado o pico base com m/z 223,0609, indicando a formação do íon [M-H]-, com

erro de -1,3 ppm.

Figura 34. Espectro de massas de alta resolução (EM-ESI), da substância S1, obtido em modo negativo.

4 5 0 0 4 0 0 0 3 5 0 0 3 0 0 0 2 5 0 0 2 0 0 0 1 5 0 0 1 0 0 0 5 0 0

6 5

7 0

7 5

8 0

8 5

9 0

9 5

1 0 0

1 0 5

% T

rans

mita

nce

W a v e n u m b e r (c m -1)

M 2 0 G 2

Figura 35. Espectro de absorção na região do Infravermelho, em KBr, da substância S1.

112.9848

151.0748

179.0706

223.0609

311.1655

337.0539

353.1264

447.1283

-MS, 38.8min #2319

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

5x10Intens.

100 200 300 400 500 m/z


Na literatura, a estrutura proposta foi descrita apenas como um possível estado de

equilíbrio do ácido diidrogladiólico, onde ocorre uma reação intramolecular entre a hidroxila

e o grupo aldeído (Figura 36) (DUNCANSON; GROVE; ZEALLEY, 1953). Portanto esta

substância ainda não foi descrita na literatura como produto natural. Contudo, o ácido

diidrogladiólico, um metabólito com atividade antifúngica, foi isolado de fungos do gênero

Penicillium, com maior predominância na espécie Penicillium gladioli (AVENT; HANSON;

TRUNEH, 1990).

Figura 36. Reação intramolecular do ácido diidrogladiólico formando a substância S1.

4.6.5. Isolamento das substâncias S2 e S3

Para o isolamento das substâncias S2 e S3 foi realizada CLAE semi-preparativa com a

fração M20E (Figura 37). Foram coletados 4 picos, porém apenas foi possível a realização

dos experimentos espectroscópicos para elucidação estrutural com os picos 3 e 4 (substância

S2 e S3 respectivamente).

Figura 37. Cromatograma da Fração M20E escala semi-preparativa. Fase Móvel gradiente exploratório: 5 – 50% de Acetonitrila em Água (40 minutos) e 50-100% Acetonitrila em água (5minutos). Coluna semi-preparativa Supelcosil LC-18 (25cm x 10mm x 5µm). Vazão 4ml/minuto. Detecção em 245 nm.

Ácido Diidrogladiólico S1

Pico 4 (S3)

Pico 3 (S2)

Pico 1

Pico 2


4.6.6. Elucidação estrutural da substância S3

A substância S3 (2,2mg), foi identificada como o 3,7-dimetoxi-6-metil-1-oxo-1,3-

diidro-isobenzofurano-4-carbaldeído (Figura 38), e apresentou-se como um sólido branco, αD

+0,916 (metanol, Concentração = 0,4%). A elucidação estrutural da substância S3 foi baseada

nos espectros de RMN de 1H, 13C, DEPT 135, HMQC, HMBC, espectrometria de massas e

espectroscopia de absorção na região do infravermelho (Tabela 9 e Figuras 40-46).

7a

3a

4

5

6

71

O

3

O

9

OH

11

O

O8

10

Figura 38. Proposta estrutural para substância S3.

Tabela 9. Dados de RMN de 1H e 13C em CDCl3 da substância S3

* valor observado indiretamente pelo mapa de contorno HMBC

Carbono δ 1H – 400 MHz δ 13C – 100 MHz 1 - 165,1*

3 6,55 (s, 3H) 101,6

3a - 146,3

4 - 125,8

5 7,96 (s, 1H) 134,5

6 - 138,4

7 - 161,8

7a - 116,4

8 3,74 (s, 3H) 57,9

9 10,04 (s, 1H) 188,1

10 2,38 (s, 3H) 16,3

11 4,28 (s, 3H) 66,1



- um simpleto com deslocamento químico δ 2,38, integrando para 3H, indicando a

presença de hidrogênios metílicos ligados a um anel aromático;

- dois simpletos, um com deslocamento químico δ 3,74, e outro δ 4,28, ambos

integrando para 3H, indicando a presença de hidrogênios pertencentes a grupo metoxílico;

- um simpleto desblindado, com deslocamento químico δ 6,55, integrando para 1H.

Esse valor de deslocamento químico sugere a presença de hidrogênio em um grupo acetal.

- um simpleto com deslocamento químico δ 7,96, integrando para 1H, sugerindo a

presença de um hidrogênio aromático desblindado;

- um simpleto com deslocamento químico δ10,04, integrando para 1H indicando a

presença de um hidrogênio de aldeído.

No espectro de RMN de 13C (Figura 41) foi possível observar sinais entre δ 116 e

161, indicando a presença de carbonos aromáticos. Pode-se também confirmar a presença de

um grupo metílico e dois substituintes metoxílicos por meio dos sinais com deslocamento

químico 16,3, 55,9 e 63,1, respectivamente. O sinal em δ 188,1 sugere a presença de um

grupo carbonílico. Podemos confirmar que esse grupo é referente a um aldeído pelo espectro

DEPT 135 (Figura 42), onde podemos inferir que o carbono δ 188,1 está ligado a um

hidrogênio.

Pelo espectro de absorção na região do infravermelho (Figura 45), foi possível

confirmar a presença de um grupo carbonílico (atribuído ao aldeído), e um grupo carboxílico

(atribuído a lactona) na estrutura da substância S3, devido à presença das bandas de absorção

em 1703 e 1774 cm-1 respectivamente. A confirmação da estrutura foi corroborada pelos

espectros de RMN bidimensionais HSQC (Figura 43) e HMQC (Figuras 39 e 44).

Figura 39. Correlações observadas no mapa de contorno HMBC para a substância S3.


A fórmula molecular da molécula proposta é C12H12O5 e massa teórica de 236,0685.

Essa estrutura pode ser confirmada pela análise por EM-IES em modo positivo (Figura 46),

onde é possível observar um pico em m/z 259,0577, correspondente a molécula cationizada

[M+Na]+, com erro de 2,5 ppm.

Foi atribuído ao carbono quiral (C3) a configuração R, uma vez que a substância S3

apresentou αD = +0,916 (metanol, Concentração = 1%), e dados da literatura mostram que o 3-

S e 3-R ftalidas apresentam rotação específica negativa e positiva respectivamente

(SOMMART et al., 2012; TAKAHASHI et al., 1998; TIANPANICH et al., 2011)

Foi realizada revisão bibliográfica e a estrutura S3 foi proposta apenas como um

derivado sintético do ácido gladiólico (DUNCANSON; GROVE; ZEALLEY, 1953), sendo

assim inédita como um metabólito secundário.

M20E7_Hidrogenio02.esp

10 9 8 7 6 5 4 3 2 1Chemical Shift (ppm)

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

Nor

mal

ized

Inte

nsity

3.453.243.141.031.351.01

10.0

891

7.95

76

7.27

00

6.54

46

4.30

074.

2761

3.73

69

2.37

75

Figura 40. Espectro de RMN de 1H da substância S3, CDCl3, 400 MHz.


M20E7_Carbono.esp

220 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 -20Chemical Shift (ppm)

0

0.005

0.010

0.015

0.020

0.025

Nor

mal

ized

Inte

nsity

188.

1144

161.

7251

146.

3265

138.

3617

134.

5357

125.

8872

116.

3658

101.

6436

77.3

200

77.2

037

77.0

000

76.6

872

63.1

071

57.8

772

16.2

638

-0.0

222

Figura 41. Espectro de RMN de 13C da substância S3, CDCl3, 100 MHz

M20E7_DEPT 135.esp

220 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 -20Chemical Shift (ppm)

-0.5

0

0.5

1.0

Nor

mal

ized

Inte

nsity

188.

1573

63.1

426

57.9

055

16.2

921

Figura 42. Experimento DEPT 135 da substância S3, CDCl3, 100 MHz



0

20

40

60

80

100

120

F1

Che

mic

al S

hift

(ppm

)

Figura 43. Mapa de contorno HMQC da substância S3, CDCl3, 100-400 MHz.

10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0F2 Chemical Shift (ppm)

0

50

100

150 F1

Che

mic

al S

hift

(ppm

)

Figura 44. Mapa de contorno HMBC da substância S3, CDCl3, 100-400 MHz.


4500 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 50060

65

70

75

80

85

90

95

100

105

% T

rans

mita

nce

W avenum ber (cm -1)

M 20E 7


Figura 46. Espectro de massas de alta resolução (EM-ESI), da substância S3, obtido em modo positivo.


4.6.7. Determinação estrutural da substância S4

A substância S4 (24mg), isolada da fração M20I, apresentou-se como um sólido

branco, cristalizado com água e metanol, apresentando ponto de fusão a 189°C, sendo

identificada como sendo o poliol galactitol (Figura 47). A determinação estrutural da

substância S4 foi baseada nos espectros de RMN de 1H e 13C, DEPT 135, espectrometria de

massas e espectroscopia na região do infravermelho (Tabela 10 e Figuras 48-52).

Figura 47. Proposta estrutural para a substância S4 (Galactitol)

Tabela 10. Dados de RMN de 1H e 13C em D2O da substância S4 e comparação com dados já descritos para o Galactitol, segundo Parameswaran e colaboradores, 1996.

No espectro de RMN de 1H (Figura 48) foi possível observar vários sinais entre δ 3,51

e 3,75, sinais característicos de monossacarídeos. Já o espectro de RMN de 13C (Figura 49)

apresentou apenas três sinais em δ 63,1, 69,14 e 70,71, o que sugere uma molécula simétrica.

Comparando os dados obtidos de RMN de 13C com os dados apresentados por Parameswaran

e colaboradores, 1996 (Tabela 9), pode-se concluir que a substância isolada S4 consiste no

monossacarídeo galactitol. O galactitol apresenta fórmula molecular C6H14O6 e massa de

182,0790, que pode ser confirmado pelos espectros de massas de alta resolução obtidos via

IES (Figuras 51 e 52), os quais apresentaram:

- Em modo negativo: pico m/z 181,0741 que representa o íon [M-H]-, com erro de -11,5

ppm

- Em modo positivo: pico m/z 205,0672 que representa o íon [M+Na]+, com erro de 8,7

ppm.

Carbono δ 1H – 400 MHz δ 13C – 100 MHz Galactitol - δ 13C (D2O)

Parameswaran et al, 1996

1 a 3,73 (dd, J=2,5 e 11,9, 1H)

b 3,53 (dd, J=6,0 e 11,9, 1H) 63,1 63,2

2 3,63 (m, 1H) 69,1 69,1

3 3,66 (m, 1H) 70,7 70,8

HO

1

2(S) (R)

3

3(S)

2(R)

1

OH

OH

OH3

OH

OH


O espectro na região do infravermelho da substância S4 (Figura 50) também confirma

a proposta, pois apresenta uma banda larga e bem intensa entre 3650 e 3100 cm-1, sinal

característico de estiramento O–H, além de bandas de estiramento C–O em 1083 e 1022 cm-1.

O galactitol já foi descrito como um produto natural marinho isolado do extrato da

alga parda Padina tetrastromatic (PARAMESWARAN et al., 1996) . Esse poliol caracteriza-

se por ser um regulador osmótico orgânico, apresentando assim uma importante função

fisiológica (DAVIS; BURLAK; MONEY, 2000; REYES-CHILPA et al., 2003).

O acúmulo de solutos orgânicos como os polióis, açúcares, aminoácidos, etc, consiste

em uma estratégia do micro-organismo para adaptação ao estresse osmótico, circunstância

encontrada por exemplo no ambiente marinho (COSTA; SANTOS; GALINSKI, 1998). Como

no cultivo do fungo H. lixii foi mimetizado o ambiente marinho, utilizando água do mar para

dissolução dos meios de culruta, o isolamento deste metabólico pode ter uma estreita relação

com a salinidade do meio no qual o micro-organismo cresceu.

Figura 48. Espectro de RMN de 1H da substância S4, D2O, 400 MHz.

M20I4_Hidrog.esp

4.0 3.9 3.8 3.7 3.6 3.5 3.4 3.3 3.2Chemical Shift (ppm)

0

0.05

0.10

Nor

mal

ized

Inte

nsity

3.74

753.

7412

3.71

783.

7121

3.67

053.

6496

3.63

57

3.62

943.

6212

3.61

43

3.55

493.

5398

3.52

593.

5107


Figura 49. Espectro de RMN de 13C da substância S4, D2O, 100 MHz.

4500 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

20

40

60

80

100

% T

rans

mita

nce

W avenum ber (cm -1)

M20I4


M20I4_Carbono.esp

84 82 80 78 76 74 72 70 68 66 64 62 60Chemical Shift (ppm)

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

Nor

mal

ized

Inte

nsity

70.7

074

69.1

362

63.1

426



Figura 52. Espectro de massas de alta resolução (EM-ESI), da substância S4, obtido em

modo positivo.


4.6.8. Isolamento das substâncias S5 e S6

Para o isolamento das substâncias S5 e S6 foi utilizando o sistema CLAE em modo

semi-preparativo, a partir da fração M20F (Figura 53). Foram coletados cinco picos, porém

foi possível apenas a realização dos experimentos espectroscópicos para elucidação estrutural

utilizando as frações respectivas aos os picos 1, 2, 3 e 4.

Duas substâncias isoladas desta fração já haviam sido identificadas, a substância S1

(pico 1), isolada da fração G2 e a substância S2 (pico 4), isolada da fração E. Foi possível

então o isolamento e identificação de duas novas substâncias denominadas S5 e S6, pico 2 e 3

respectivamente.

Figura 53. Cromatograma da Fração M20F obtido em escala semi-preparativa. Fase Móvel gradiente exploratório: 5 – 20% de Acetonitrila em Água (10 minutos), 30-50% Acetonitrila em água (30 minutos) e 50-100% Acetonitrila em água (10 minutos). Coluna semi-preparativa Supelcosil LC-18 (25cm x 10mm x 5µm). Vazão 4ml/minuto. Detecção em 210 nm.


A substância S5 (2,3mg), foi identificada como 4-(Hidroximetil)-7-metoxi-6-metil-

1(3H)-isobenzofuranona, também conhecida como convolvulol (Figura 54), e apresentou-se

como um sólido branco. A elucidação estrutural da substância S5 foi baseada nos espectros de

RMN de 1H, HMQC, HMBC e espectrometria de massas (Tabela 11 e Figuras 56-60). Devido

à pequena quantidade de massa obtida, não foi possível realizar os experimentos para

determinação do ponto de fusão, nem para o espectro de absorção na região do infravermelho.

Pico 1 (S1)

Pico 2 (S5)

Pico 3 (S6)

Pico 4 (S2)

Pico 5


Figura 54. Proposta estrutural para a substância S5 (convolvulol).

Tabela 11. Dados de RMN de 1H e 13C em CDCl3 da substância S5.

* valores de δ de 13C foram obtidos indiretamente pelos mapas de contorno HMQC e HMBC

# Segundo YANG et al, 2011


- um simpleto com deslocamento químico em δ 2,34, integrando para 3H, indicando a

presença de hidrogênios metílicos ligados a um anel aromático;

- um simpleto, um com deslocamento químico em δ 4,01 integrando para 3H,

indicando a presença de hidrogênios metoxílicos;

- dois simpletos com deslocamento químico em δ 4,66 e 5,38, ambos integrando para

2H, indicando a presença de hidrogênios de CH2 ligado a um oxigênio.

Carbono S5

δ 1H – 400 MHz (CDCl3)

S5 * δ 13C – 100 MHz

(CDCl3)

Literatura# δ 1H – 400 MHz

(acetona-d6)

Literatura# δ 13C – 100 MHz

(acetona-d6) 1 - 170,1 - 170,2

3 5,38 (s, 2H) 68,7 5,33 (s, 2H) 70,1

3a - 145,3 - 147,1

4 - 131,0 132,8

5 7,51 (s, 1H) 135,9 7,48 (s, 1H) 137,1

6 - 131,4 - 133,3

7 - 156,4 - 158,0

7a - 117,1 - 118,7

8 4,66 (s, 2H) 60,8 4,69 (s, 2H) 62,9

9 2,34 (s, 3H) 14,1 2,29 (s, 3H) 16,4

10 4,01 (s, 3H) 61,1 3,99 (s, 3H) 63,2


- um simpleto com deslocamento químico em δ7,51, integrando para 1H indicando a

presença de um hidrogênio ligado a um carbono aromático.

Devido a pouca massa obtida, não foi possível a observação dos sinais no espectro de

RMN de 13C, dessa forma, os dados de deslocamento químico dos átomos de carbono da

substância S5 foram atribuídos de forma indireta, pelos mapas de contorno HMQC (Figura

57), HMBC (Figuras 55 e 58) e COSY (Figura 59).




onde é possível observar um pico em m/z 231,0633, correspondente a molécula cationizada

[M+Na]+, com erro de 2,2 ppm.

Dados da literatura mostram que o convolvulol (S5) já foi isolado de fungos do

gênero Phomopsis, inclusive de uma espécie marinha isolada do manguezal (TSANTRIZOS;

OGILVIE; WATSON, 1992; XIANG YANG et al., 2011). Além disso, tem-se relatado que a

substância apresenta uma interessante atividade herbicida (XIANG YANG et al., 2011).


Figura 56. Espectro de RMN de 1H da substância S5, CD3OD3, 600 MHz.

7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0F2 Chemical Shift (ppm)

0

20

40

60

80

100

120

140

F1

Che

mic

al S

hift

(ppm

)

Figura 57. Mapa de contorno HMQC da substância S5, CD3OD3, 150-600 MHz.

Barbara M2O2 F2.001.esp

8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5Chemical Shift (ppm)

0

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

0.07

Nor

mal

ized

Inte

nsity

3.173.012.102.221.03

Methanol

Methanol

7.51

12

5.38

48

4.66

18

4.00

90

2.33

62


12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0F2 Chemical Shift (ppm)

0

50

100

150 F1

Che

mic

al S

hift

(ppm

)

Figura 58. Mapa de contorno HMBC da substância S5, CD3OD3, 150-600 MHz.

7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5F2 Chemical Shift (ppm)

1

2

3

4

5

6

7

F1

Che

mic

al S

hift

(ppm

)

Figura 59. Mapa de contorno COSY da substância S5, CD3OD3, 600 MHz.



4.6.10. Determinação estrutural das substâncias S2 e S6

Para caracterizar estruturalmente a substância S2, foram realizados os experimentos de

RMN de 1H, HMQC, HMBC e espectrometria de massas (Figuras 62 a 65).

No espectro de RMN de 1H, foi possível observar a presença de:

- hidrogênios ligados a carbonos aromáticos (δ 7,62; δ 7,22; δ 6,41 e δ6,31);

- hidrogênios pertencentes a grupos metoxilícos (δ 4,52 e δ 3,82);

- um hidrogênio metílico (δ 2,47).

Já na caracterização estrutural da substância S6, foram realizados os experimentos de

RMN de 1H, HMQC, HMBC, COSY e espectrometria de massas (Figuras 66 a 71).

No espectro de RMN de 1H, foi possível observar a presença de:

- hidrogênios ligados a carbonos aromáticos (δ 6,45 e δ6,29);

- hidrogênios desblindados, possivelmente pertencentes a grupos de CH2 ligado a um

oxigênio (δ 4,94; δ 4,74 e δ4,63)

- hidrogênios pertencentes a grupos metoxilícos (δ 4,02; δ 3,85 e δ3,60);

- hidrogênios metílicos (δ 2,35 e δ2,33).

Os sinais encontrados no espectro de RMN de 1H, HMQS e HMBC de ambas as

substâncias isoladas (S2 e S6) apontam uma similaridade estrutural com os demais

metabólitos isolados do fungo H. lixxi apresentados neste trabalho, porém não foi possível a


conclusão da elucidação estrutural das substâncias S1 e S6. Para tanto, seria necessário a

realização de outros experimentos, porém as amostras foram isoladas em quantidades muito

pequenas, o que dificulta a conclusão da elucidação estrutural.

M20E5_HIDROGENIO.ESP

6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0Chemical Shift (ppm)

0

0.05

0.10

Nor

mal

ized

Inte

nsity

3.053.171.961.031.00

Methanol6.46

346.

4589

6.29

466.

2901

4.87

00

4.52

54

3.83

43

2.47

76

Figura 61. Espectro de RMN de 1H da substância S2, CD3OD3, 600 MHz

7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5F2 Chemical Shift (ppm)

0

20

40

60

80

100

120

140

F1

Che

mic

al S

hift

(ppm

)

Figura 62. Mapa de contorno HMQC da substância S2, CDCl3, CD3OD3, 600 MHz.



0

50

100

150 F1

Che

mic

al S

hift

(ppm

)

Figura 63. Mapa de contorno HMBC da substância S2, CDCl3, CD3OD3, 600 MHz.




S6_HIDROGêNIO.001.ESP

8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0Chemical Shift (ppm)

0

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40

0.45

Nor

mal

ized

Inte

nsity

2.933.871.912.843.632.842.551.591.001.180.991.24

MethanolMethanol

7.62

00

7.18

73

6.41

596.

3175

6.31

39

5.09

705.

0945

5.07

624.

9869

4.95

094.

9295

4.78

224.

7602

4.73

824.

6288

4.60

62

4.01

823.

8544

3.60

50

3.36

853.

3147

2.34

782.

3240

Figura 66. Espectro de RMN de 1H da substância S6, CD3OD3, 600 MHz.


8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0F2 Chemical Shift (ppm)

0

20

40

60

80

100

120

140

F1

Che

mic

al S

hift

(ppm

)

Figura 67. Mapa de contorno HMQC da substância S6, CDCl3, CD3OD3, 600 MHz.


0

50

100

150 F1

Che

mic

al S

hift

(ppm

)

Figura 68. Mapa de contorno HMBC da substância S6, CDCl3, CD3OD3, 600 MHz.



1

2

3

4

5

6

7

8

F1

Che

mic

al S

hift

(ppm

)

Figura 69. Mapa de contorno COSY da substância S6, CDCl3, CD3OD3, 600 MHz.

Figura 70. Espectro de massas de alta resolução (EM-ESI), da substância S6, obtido em

modo positivo.


Figura 71. Espectro de massas de alta resolução (EM-ESI), da substância S6, obtido em modo negativo

4.6.11. Avaliação da atividade antitumoral do extrato e frações

Como observado na triagem biológica dos extratos cultivados em escala piloto, o

extrato bruto da linhagem M20 cultivado em arroz apresentou atividade citotóxica frente

células tumorais da linhagem HCT-116. A fim de avaliar o real potencial antitumoral desse

extrato, foram realizados ensaios de citotoxicidade frente outras linhagens tumorais e frente

células sadias. Também foram realizados ensaios com as frações desse extrato cultivado em

escala ampliada e obtidas após fracionamento via CLV. Essa avaliação da citotoxicidade das

frações do extrato tem como objetivo encontrar uma fração ainda mais ativa que o extrato,

buscando com isso a possibilidade de isolamento de um metabólito ativo.

Nesta etapa do estudo, foram realizados experimentos para determinação da CI50

(concentração da amostra que inibe 50% do crescimento celular), com as seguintes linhagens

celulares: HCT-116 (câncer de cólon humano), HL-60 (leucemia), OVCAR-8 (câncer de

ovário), SF-295 (gliobastoma), PC-3M (câncer de próstata) e MRC-5 (célula normal de

pulmão). A Tabela 12 a seguir traz o resultado obtido com esses experimentos.


Tabela 12. Resultados dos ensaios de citotoxicidade frente diferentes células tumorais e células sadias, realizados com o extrato bruto e frações do fungo H. lixii .

Amostra CI50 (µg/mL)

HL-60 HCT-116 OVCAR-8 SF-295 PC-3M MRC-5

Extrato M20A 9,25 13,43 16,07 6,04 20,08 18,74

Fração M20D N.T. 36,73 N.T. N.T. > 50 > 50

Fração M20E N.T. 47,84 N.T. N.T. > 50 > 50

Fração M20F N.T. 2,72 N.T. N.T. > 50 > 50

Fração M20G N.T. 10,62 N.T. N.T. 16,76 > 50

Fração M20H N.T. 2,79 N.T. N.T. 11,93 > 50

N.T. = Não testado

As linhagens HL-50, OVCAR-8 e SF-295 não foram testadas frente às frações devido

a problemas de contaminação das linhagens. Com o resultado obtido pode-se verificar que o

extrato bruto M20A apresenta potencial citotóxico frente a todas as linhagens analisadas,

inclusive linhagem de células normais. Porém, quando analisamos as frações verificamos que

estas apresentaram ação citotóxica seletiva para as células de linhagens tumorais, uma vez que

todas as frações testadas apresentaram uma citotoxicidade relevante frente à linhagem tumoral

HCT-116, porém não frente à linhagem de células normais MRC-5.

Dentre as frações analisadas, destacam-se as frações M20F e M20H, as quais

apresentaram os menores valores de IC50 para os ensaios de citotoxicidade com linhagens

tumorais. A ideia inicial do trabalho seria realizar os mesmos ensaios para as substâncias

isoladas, porém devido às pequenas quantidades de substâncias isoladas, os experimentos

com as mesmas foram inviáveis. Mesmo assim, os resultados da avaliação da atividade

antitumoral do extrato e frações do fungo endofítico H. lixii sinalizam para uma promissora

atividade biológica das substâncias isoladas, já que nas essas substâncias foram isoladas das

frações que apresentaram atividade citotóxica seletiva para células tumorais.

4.6.12. Avaliação da atividade biológica das substâncias S1 e S4

Após o isolamento e elucidação estrutural, foram realizados ensaios para avaliação da

atividade biológica das substâncias isoladas, porém foi possível realizar os experimentos

apenas com as substânciasS1 e S4, uma vez que estas foram obtidas em maiores quantidades.

Os seguintes ensaios foram executados: atividade antibacteriana (frente S. aureus e E. coli),

antifúngica (frente Candida albicans, Candida tropicalis, Candida krusei, Candida

parapsilosis, Candida glabrata e Cladosporium cladosporioides), anticolinesterásica e


antitumoral (frente linhagem HCT-11), porém não houve resultado favorável em nenhum dos

ensaios realizados.

Apesar das análises de atividade biológica com as substâncias S1 e S4 não apresentarem

resultado favorável, este trabalho abriu portas para que haja continuidade do mesmo dentro do

grupo, isolando-se maior quantidade dos demais metabólitos a fim de prosseguir com as

avaliações de atividade biológica.

4.7. Estudo químico do fungo Eutypella sp (linhagem M23 – escala ampliada)

4.7.1. Isolamento da substância S7

A substância S4 foi isolada a partir da fração M23B, após realização de CCDP,

seguida de CLAE-DAD em escala semi-preparativa. Após a CCDP foi possível a separação

três manchas (Figura 61). A mancha 3 (fração M23B3) foi submetida a separação via CLAE

semi-preparativa (Figura 62), resultando no isolamento da substância S7.

Figura 72. CCDP da fração M23B, com destaque para a mancha 3 (placa de sílica gel, fase móvel uma mistura de hexano e acetato de etila na proporção (7:3) e revelação com UV 254 nm).

Mancha 3 (M23B3)


Figura 73. Cromatograma da Fração M23B3 escala semi-preparativa. Fase Móvel gradiente exploratório: 70 – 100% de Acetonitrila em Água (25 minutos). Coluna semi-preparativa Supelcosil LC-18 (25cm x 10mm x 5µm). Vazão 5ml/minuto. Detecção em 195 nm.


A substância S7 (5,3mg) apresentou-se como um sólido cristalino incolor e αD -2,76

(metanol, Concentração = 1%). A elucidação estrutural da substância S7 foi baseada nos

espectros de RMN de 1H, 13C, DEPT 135, HMQC, HMBC e espectrometria de massas

(Tabela 13 e Figuras 65-52). Comparando os dados espectrais obtidos com a literatura, a

substância S7 foi identificada como a R-5-metilmeleina. (Figura 63).

Figura 74. Proposta estrutural para a substância S7 (R-5-metilmeleina)

S7


Tabela 13. Dados de RMN de 1H e 13C em CDCl3 da substância S7.

* Segundo BI et al, 2007


- um dupleto com deslocamento químico em δ 1,56,com J 6,3 e integrando para 3H,

indicando a presença de hidrogênios metílicos que acoplam com outro átomo de hidrogênio;

- um simpleto, um com deslocamento químico em δ 2,20, integrando para 3H,

indicando a presença de um grupo metila ligado a um anel aromático;

- dois duplos dupletos, com deslocamento químico em δ 2,74 e 2,95, ambos

integrando para 1H, sugerindo a presença de hidrogênios magneticamente diferentes ligados a

um mesmo carbono;

- um multipleto com deslocamento químico em δ 4,69, integrando para 1H, sugerindo

a presença de um hidrogênio de um carbono terciário;

- dois dupletos, com deslocamento químico em δ 6,83 e 7,29, integrando para 1H e

acoplando entre si com J 8,3, indicando a presença de dois hidrogênios aromáticos com

acoplamento orto.

No espectro de RMN de 13C (Figura 66) foi possível observar sinais entre δ 108 e

160, indicando a presença de carbonos aromáticos. Pode-se também confirmar a presença de

dois grupos metílicos por meio dos sinais com deslocamento químico δ 18,1 e 20,9. O sinal

em δ 170,3 sugere a presença de um grupo carboxílico. A confirmação da estrutura se deu

C S7

δ 1H – 400 MHz (CDCl3)

S7 δ 13C – 100 MHz

(CDCl3)

Literatura* δ 1H – 500 MHz

(CDCl3)

Literatura* δ 13C – 100 MHz

(CDCl3) 1 - 170,3 - 169,2

3 4,69 (m, 1H) 31,9 4,68 (m, 1H) 29,6

4 a 2,95 (dd, J 3,3; 16,6,1H)

b 2,74 (dd, J 11,6; 16,6, 1H) 75,4

2,95 (dd, J 3,7; 16,5, 1H) 2,80 (dd, J 10,7; 16,5, 1H)

77,8

4a - 137,0 - 134,6

5 - 124,9 - 126,2

6 7,29 (d, J 8,3, 1H) 137,9 7,21 (d, J 8,6, 1H) 140,6

7 6,83 (d, J 8,3, 1H) 115,7 6,75 (d, J 8,6, 1H) 112,8

8 - 160,5 - 154,4

8a - 108,1 - 106,4

9 1,56 (d, J 6,3, 3H) 20,9 1,56 (d, J6,5, 3H) 20,8

10 2,20 (s, 3H) 18,1 2,18 (s, 3H) 19,7

8-OH 11,00 (s, 1H) - 10,97 (sl,1H) -


pelos espectros de DEPT (Figura 67), RMN bidimensionais HSQC (Figura 68), HMQC

(Figuras 64 e 69) e COSY (Figuras 70).




onde é possível observar um pico em m/z 215,0660, correspondente ao aduto [M+Na]+, com

erro de 8,8 ppm.

Foi atribuído ao carbono quiral (C3) a configuração R, uma vez que a substância S7

apresentou αD -2,76 (metanol, Concentração = 1%), e dados da literatura mostram que o

estereoisômero R-5-metilmeleina apresenta rotação específica negativa (CAMBIE et al.,

1991; OKUNO et al., 1986).

A 5-metilmeleina já foi encontrada em diversas espécies de fungos, como

Cephalosporium sp (BI et al., 2007), Cytospora eucalypticola (KOKUBUN et al., 2003),

Phomopsis sp (DAI et al., 2005; HUSSAIN et al., 2011; LIN et al., 2011), Valsa

ceratosperma (OKUNO et al., 1986), Xylaria sp (RUKACHAISIRIKUL et al., 2013),

inclusive de fungos marinhos isolados da alga verde Codium fragile (EL-BEIH et al., 2007), e

de fungos endofíticos marinhos isolados de Kandelia candel (espécie de planta que habita

manguezais) (CHEN et al., 2006). Além disso, na literatura há relatos que a 5-metilmeleina

apresenta uma moderada atividade antimicrobiana (DAI et al., 2005).


Figura 76. Espectro de RMN de 1H da substância S7, CDCl3, 400 MHz.

Figura 77. Espectro de RMN de 13C da substância S7, CDCl3, 100 MHz.

M23_B31.001.esp

11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0Chemical Shift (ppm)

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

Nor

mal

ized

Inte

nsity

3.403.081.181.141.151.001.000.93

11.0

028

7.30

307.

2822

6.83

836.

8162

4.71

824.

7100

4.70

244.

6942

4.68

984.

6810

4.67

402.

9731

2.96

492.

9314

2.92

322.

7603

2.73

132.

7187

2.69

032.

1984

1.56

451.

5487

0.00

820.

0000

M23_B31.015.esp


0.05

0.10

0.15

Nor

mal

ized

Inte

nsity

170.

3449

160.

5253

137.

9402

137.

0455

124.

8983

115.

7188

108.

1031

77.3

350

77.2

186

77.0

149

76.7

021

75.4

292

31.9

392

20.9

412

18.1

045

0.00

00


Figura 78. Experimento DEPT 135 da substância S7, CDCl3, 100 MHz.

Figura 79. Mapa de contorno HMQC da substância S7, CDCl3, 100-400 MHz.

M23_B31.016.esp

170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0Chemical Shift (ppm)

-0.5

0

0.5

1.0

Nor

mal

ized

Inte

nsity

137.

9463

115.

7321

75.4

353

31.9

453

20.9

474

18.1

106


0

20

40

60

80

100

120

140

F1

Che

mic

al S

hift

(ppm

)


Figura 80. Mapa de contorno HMBC da substância S7, CDCl3, 100-400 MHz.

Figura 81. Mapa de contorno COSY da substância S7, CDCl3, 400 MHz.


2

4

6

8

10

F1

Che

mic

al S

hift

(ppm

)


0

50

100

150 F1

Che

mic

al S

hift

(ppm

)

76

Conclusão

77 Conclusão

Conclusão

O estudo químico do fungo endofítico marinho Hypocrea lixii mostrou-se promissor

na busca de novas estruturas químicas, visto que foram isoladas e identificadas duas

substâncias inéditas como produtos naturais, o ácido 3-hidroxi-5-metoxi-6-metil-1,3-diidro-

isobenzofurano-4-carboxílico e o 3,7-dimetoxi-6-metil-1-oxo-1,3-diidro-isobenzofurano-4-

carbaldeído.

Além desses produtos naturais inéditos também foram isolados o galactitol, um poliol

com possível função de regulador osmótico, e o convolvulol, uma substância com relatos de

atividade herbicida. A partir das frações de baixa polaridade, foram identificadas 13

substâncias: hidrocarbonetos; ácidos graxos, inclusive insaturados, aldeídos, aldeídos α,β-

insaturados e esteroide.

Na triagem biológica, o extrato bruto do fungo Hypocrea lixii apresentou potencial

atividade citotóxica frente à linhagem tumoral HTC-116. Além disso, as frações M20D,

M20E, M20F, M20G e M20H, apresentaram atividade citotóxica seletiva para células de

linhagens tumorais, sendo que as frações M20F e M20H foram as frações mais potentes na

atividade citotóxica, uma vez que apresentaram os valores mais baixos de IC50. Os

metabólitos S5 e S6 foram isolados da fração M20F, e podem assim apresentarem atividade

citotóxica relevante, porém como foram obtidos em pequenas quantidades não foi possível

realizar os ensaios para avaliação da atividade antitumoral. Para trabalhos futuros do grupo de

pesquisa, uma alternativa seria a obtenção de maiores quantidades da fração M20F e M20H

para o isolamento de dos metabólitos existentes nessas frações e a avaliação da atividade

citotóxica das mesmas.

A substância S1 (ácido 3-hidroxi-5-metoxi-6-metil-1,3-diidro-isobenzofurano-4-

carboxílico) e a S4 (galactitol), obtidos em maiores quantidades, além da avaliação da

atividade antitumoral, também foram realizados ensaios para a verificação da atividade

antimicrobiana, antifúngica, anticolinesterásica, porém sem nenhum resultado positivo.

Já no estudo da linhagem M23, Eutypella sp, foi possível o isolamento da substância

S7, a R-5-metilmeleina, um metabólito já encontrado em diversas espécies fungos, inclusive

em fungos marinhos. Para a substância R-5-metilmeleina já foi descrita atividade

antimicrobiana.

Dessa forma, o estudo químico e biológico de fungos endofíticos marinhos associados

à alga vermelha Bostrychia radicans, em especial a linhagem Hypocrea lixii, consiste em uma

alternativa promissora na busca de novas estruturas químicas e de produtos naturais com

78 Conclusão

atividade biológica antitumoral. Além disso, o presente trabalho disponibiliza ao grupo do

LQOAM uma outra opção de pesquisa, ou seja, o estudo mais aprofundado da atividade

antitumoral das frações M20F e M20H do extrato do fungo Hypocrea lixii.

79

Referências Bibliográficas

80 Referências bibliográficas

5. Referencias bibliográficas

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