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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO

Élen Rizzi Sanchez

Efeito da inibição das metaloproteinases da matriz extracelular e do tratamento com antioxidantes sobre as

alterações cardíacas decorrentes da hipertensão renovascular

Ribeirão Preto – SP

2010

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Élen Rizzi Sanchez

Efeito da inibição das metaloproteinases da matriz extracelular e do tratamento com antioxidantes sobre as

alterações cardíacas decorrentes da hipertensão renovascular

Tese apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Doutora em Ciências. Área de concentração: Farmacologia Orientadora: Profa. Dra. Raquel Fernanda Gerlach

Ribeirão Preto

2010

AUTORIZO A REPRODUÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.

FICHA CATALOGRÁFICA

Sanchez, Élen Rizzi Participação das metaloproteinases da matriz extracelular nas

alterações cardíacas associada à hipertensão renovascular: efeitos de antioxidantes. Ribeirão Preto, 2010.

123 p. : il. ; 30cm Tese de Doutorado, apresentada à Faculdade de Medicina de

Ribeirão Preto/USP. Área de concentração: Farmacologia. Orientadora: Gerlach, Raquel Fernanda.

1. Metaloproteinases. 2.Hipertrofia cardíaca. 4. Estresse oxidativo. 5. Hipertensão renovascular.

FOLHA DE APROVAÇÃO

Élen Rizzi Sanchez

Efeito da inibição das metaloproteinases da matriz extracelular e do tratamento com antioxidantes sobre as alterações cardíacas decorrentes da hipertensão renovascular

Tese apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Doutora em Ciências. Área de concentração: Farmacologia

Aprovado em:______________________________________

Banca examinadora:

Profa. Dra.: Raquel Fernanda Gerlach

Instituição: FORP - USP Assinatura: _________________________

Profa. Dra.: Lusiane Maria Bendhack

Instituição: FCFRP - USP Assinatura: _________________________

Profo. Dro.: Marcus Vinicius Simões

Instituição: FMRP - USP Assinatura: _________________________

Profo. Dro.: Kleber Gomes Franchini

Instituição: FCM - UNICAMP Assinatura: _________________________

Profo. Dro.: Sérgio Roberto Peres Line

Instituição: FOP - UNICAMP Assinatura: _________________________

Dedico esse trabalho aos meus pais, meu marido e aos meus amigos, pela dedicação, amor e por acreditarem sempre em mim.

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus, que me acompanhou em todos os momentos e abençoou os

caminhos que percorri durante toda minha vida.

Ao meu marido e amigo Juliano que me compreende e ainda alegra os meus dias.

Obrigada por suportar todos os meus problemas com tanto carinho e paciência.

À minha família que nos momentos difíceis foram minha sustentação. Obrigada pelo

carinho, respeito, amor e especialmente, pela educação e ensinamentos. Obrigada

por existirem em minha vida!

À professora Raquel Fernanda Gerlach meus agradecimentos e respeito por tudo

que me ensinou. Guardarei com muito carinho e gratidão todos os seus

ensinamentos. Muitas vezes se importou comigo pessoalmente, me ajudando a

enfrentar diversos problemas e se orgulhou comigo a cada conquista. Foi gratificante

trabalhar no seu laboratório e aprender com você.

Ao professor José Eduardo Tanus dos Santos pela paciência, confiança,

oportunidade e ensinamentos acadêmicos. Agradeço especialmente a orientação

que contribuiu muito para meu crescimento profissional. Alguns conselhos e frases

eu levarei comigo para sempre e praticarei diariamente.

Ao professor Marcos Antonio Rossi por todos os ensinamentos. Agradeço por todos

os aprendizados que obtive em seu laboratório. Obrigada pela paciência, disposição,

respeito e atenção de sempre. Sábias palavras quando ditas no momento certo, são

muito bem aproveitadas e jamais serão esquecidas.

Agradeço aos professores Dra Lusiane Maria Bendhack, Dro. Marcus Vinicius

Simões, Dro. Kleber Gomes Franchini e Dro. Sérgio Roberto Peres Line a

disponibilidade de fazer parte desta banca e a atenção concedida. Agradeço

também à Dra. Lusiane por todos os ensinamentos e agradável convivência durante

estes anos.

À minha amiga Michele que fez parte deste trabalho, mas especialmente fez parte

de minha vida e carreira. Sua amizade é fundamental para mim e me ajudou a

superar diversos momentos. Agradeço a paciência e carinho, além do respeito que

conquistamos dia a dia nessa amizade. "O valor das coisas não está no tempo em

que elas duram, mas na intensidade com que acontecem. Por isso existem

momentos inesquecíveis, coisas inexplicáveis e pessoas incomparáveis" (Fernando

Pessoa).

Ao apoio financeiro da CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e

Tecnológico).

Ao professor Dr. Rubens Fazan Junior pela atenção e colaboração com este

trabalho.

À professora Dra. Maria Cristina pela atenção, compreensão, incentivo e

ensinamentos acadêmicos.

Ao excelente apoio dos amigos e técnicos Maria Helena, Beto, Elaine, Júnia, Mônica

e Orlando. Sempre me ajudaram com muita dedicação, responsabilidade e com uma

qualidade admirável. Foi um prazer e muito produtivo trabalhar com todos vocês.

Aos meus amigos queridos Carla, Bárbara e ao Evandro que se dedicaram muito

seriamente a este trabalho.

À amiga Cibele por todos os ensinamentos e dedicação. Agradeço pela

preocupação, prontidão e por toda ajuda. Foi um prazer trabalhar com você,

especialmente por sua competência e seriedade profissional.

Aos amigos Carla, Danielle, Stefany e Alisson pela amizade, carinho e

compreensão. Obrigada por tudo que fizeram por mim, por estarem ao meu lado nos

momentos ruins e bons, me escutarem e se preocuparem comigo.

Ao grupo hipertensão pelos momentos que vivemos juntos, tão intensos quando

ruins e tão imensos quando bons. É um privilégio trabalhar e conviver nesse grupo.

Obrigada pelo carinho, compreensão e preocupação. Agradeço especialmente pelo

respeito e admiração que conquistamos uns com os outros, dia a dia.

Às minhas amigas Izabel, Glauce, Andréa, Andrezza, Ana Laura e ao amigo César

pelo carinho e amizade de sempre. Obrigada pelas conversas, conselhos e por

todos os momentos que convivemos juntas.

Aos amigos do laboratório da professora Raquel, do professor José Eduardo e do

professor Marcos Antonio Rossi pela convivência, paciência, carinho e apoio de

sempre.

Aos funcionários Ramon, Fátima e Sonia pelo excelente auxílio técnico, pela

competência e prontidão para resolver meus problemas. Agradeço a amizade que

colaboraram direta ou indiretamente para meu crescimento pessoal e profissional.

Aos funcionários do biotério da FORP, especialmente ao Sérgio, pela competência,

profissionalismo e disposição. Agradeço também a todos os funcionários e amigos

do departamento de Farmacologia pela amizade e serviços prestados.

“A sabedoria não nos é dada. É preciso descobri-la por nós mesmos, depois de uma

viagem que ninguém nos pode poupar ou fazer por nós."

(Valentin-Louis-Georges-Eugène-Marcel Proust)

RESUMO

Sanchez, E. R. Efeito da inibição das metaloproteinases da matriz extracelular e

do tratamento com antioxidantes sobre as alterações cardíacas decorrentes da

hipertensão renovascular. 2010. 123 f. Tese (Doutorado) - Faculdade de Medicina

de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2010.

A hipertensão arterial sistêmica (HAS) é frequentemente acompanhada por

hipertrofia ventricular esquerda (HVE) que contribui para as altas taxas de

mortalidade por doenças cardiovasculares associadas à HAS. As metaloproteinases

da matriz extracelular (MMPs), enzimas que degradam constituintes da matriz, estão

aumentadas no miocárdio em diversos modelos experimentais de HVE, incluindo

HAS. Recentemente, foi mostrado que a MMP-2 pode ser uma das principais

proteases envolvidas nas alterações morfológicas e funcionais cardíacas. O estresse

oxidativo é um dos fatores presentes na HAS e poderia ativar as MMPs devido à

ativação da NADPH oxidase em resposta à angiotensina II. Devido ao aumento de

angiotensina II e estresse oxidativo observado no modelo experimental 2 rins, 1 clipe

(2R1C), estes animais foram escolhidos para a realização deste trabalho. Os

objetivos deste trabalho foram (1) Verificar se aumentos nas concentrações e

atividade das MMPs (especialmente MMP-2) podem contribuir para as alterações

cardíacas associadas à hipertensão renovascular (2R-1C); e (2) verificar se o

estresse oxidativo modula as concentrações e atividade da MMP-2 contribuindo para

para as alterações cardíacas associadas à hipertensão 2R-1C. Para isso, foi

utilizada a doxiciclina, um inibidor não seletivo de MMPs e drogas antioxidantes

(tempol e apocinina). A HAS foi acompanhada durante todo o período do estudo por

pletismografia de cauda e no final dos tratamentos, este parâmetro também foi

avaliado através de uma análise invasiva. Todos os tratamentos atenuaram os

aumentos na pressão arterial nos animais 2R1C (P<0,05). Porém, a pressão arterial

nos animais 2R1C tratados com doxiciclina ou antioxidantes permanceram elevadas

no final do tratamento em comparação com seus respectivos controles (P<0,05). Os

tratamentos com doxiciclina ou antioxidantes atenuaram as disfunções na

contratilidade cardíaca nos animais 2R1C, avaliadas através da primeira derivada

temporal de pressão ventricular (±dP/dt, P<0,05). A HVE foi verificada através de

análises morfológicas e de um índice do peso cardíaco. Através destes parâmetros,

foi encontrado que os animais 2R1C (sem tratamento) apresentaram HVE com

características adaptativas. Os tratamentos com doxiciclina e antioxidantes

atenuaram a HVE nos animais 2R1C (P<0,05). Além das disfunções morfofuncionais

observadas nos animais 2R1C (não tratados), foram encontrados aumentos

significativos nas concentrações de MMP-2 no miocárdio detectados por zimografia

em gel, bem como por imunomarcação (P<0,05). Estes aumentos ocorreram em

paralelo ao aumento na atividade gelatinolítica total observado por zimografia in situ

no ventrículo esquerdo dos animais 2R1C (P<0,05). Os tratamentos com doxiciclina

e antioxidantes não afetaram as concentrações de MMP-2 no miocárdio dos animais

2R1C (P>0,05). Porém, estes tratamentos reduziram a atividade gelatinolítica nos

animais hipertensos (P<0,05). Os antioxidantes reduziram o estresse oxidativo

presente no miocárdio dos animais 2R1C (P<0,05). Em conjunto, nossos resultados

sugerem que as MMPs, especialmente a MMP-2, participem das alterações

cardíacas associadas à hipertensão 2R1C. Além disso, o estresse oxidativo pode

estar relacionado com a ativação das MMPs observada neste modelo de

hipertensão. Palavras-chave: hipertrofia cardíaca, metaloproteinases, hipertensão

renovascular, estresse oxidativo.

ABSTRACT

Sanchez, E. R. Effects of matrix metalloproteinases and antioxidant treatment

on the cardiac alterations induced by renovascular hypertension. 2010. 123f.

Tese (Doutorado) Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São

Paulo, Ribeirão Preto, 2010.

Systemic arterial hypertension (SAH) is frequently followed by left ventricular

hypertrophy (LVH) that contributes to higher mortality rates in hypertension induced-

cardiovascular diseases. The matrix metalloproteinases (MMPs), enzymes

responsible for extracellular matrix degradation, are increased in the myocardium of

animals in various experimental models of left ventricular hypertrophy (LVH),

including hypertension. It has been recently shown that MMP-2 may be one of the

most important proteases involved in the structural and functional alterations of the

heart. Oxidative stress described in SAH may activate MMPs, due to the angiotensin

II induced-NADPH oxidase activation. Since angiotensin II and oxidative stress are

increased in the 2 kidney, 1 clip (2K1C) hypertensive rats, this experimental model of

hypertension was chosen for this study, whose aims were: (1) to evaluate whether

the increase of MMPs (particularly MMP-2) levels and activity may contribute to

cardiac alterations found in renovascular hypertension (2K1C), and (2) to assess

whether oxidative stress modulates MMP-2 levels and activity, contributing for the

cardiac alterations found in 2K1C rats. To test these hypotheses doxycycline and

antioxidants drugs (tempol and apocyanin) were used as treatment. The

hypertension was evaluated during all study by tail-cuff pletysmography; and at the

end of the study the blood pressure was evaluated by invasive analysis. All

treatments attenuated the increases in blood pressure from 2R1C animals (P<0.05).

However, the blood pressure of 2K1C rats treated with doxycycline or antioxidants

drugs was still higher than that of the respective control animals at the end of the

experiment (P<0.05). The treatments with doxycycline or antioxidants attenuated the

cardiac contractile dysfunction in 2K1C rats, assessed by the first derivative of left

ventricular pressure (±dP/dt) analysis (P<0.05). The LVH was evaluated by

morphological analysis and by cardiac weight and body weight ratio. The 2K1C

untreated rats showed adaptive characteristics of LVH. The doxycycline or

antioxidant treatments attenuated the LVH in 2K1C animals (P<0.05). In parallel to all

these structural and functional alterations in the heart of 2K1C untreated rats, we

found that cardiac MMP-2 levels were increased by gelatin zymography and by

immunohistochemistry (P<0.05). The treatments with doxycycline and antioxidants

did not affect the cardiac MMP-2 levels from 2K1C rats. However, these treatments

did reduce the total gelatinolytic activity observed by in situ zymography (P<0.05).

The antioxidant treatments reduced oxidative stress present in 2K1C animals

(P<0.05). In conclusion our results suggest that MMPs, particularly MMP-2,

contribute to cardiac alterations associated to 2K1C hypertension. Furthermore, the

oxidative stress may be associated with activation of MMPs present in this model of

hypertension. Key words: Cardiac hypertrophy, metalloproteinases, Renovascular

hypertension and oxidative stress.

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS

2R1C – Dois-rins, um-clipe

ANOVA – Análise de Variância

APS- Persulfato de amônio

BH4 - Tetrahidrobiopterina

BSA- Albumina do soro bovino

CaCl2- Cloreto de cálcio

DHE- Dihidroetídeo

DNA- Ácido ribonucleico

DQ gelatin- Substrato fluorescente para determinar a atividade gelatinolítica

EPM- Erro padrão da média

EROS- Espécies reativas de oxigênio

g- Gramas

µg- Microgramas

H+- Hidrogênio

H2O2- Peróxido de hidrogênio

i.p.- Intra peritoneal

HCl- Ácido clorídrico

HVE- Hipertrofia ventricular esquerda

H&E- Hematoxilina e eosina

K+- Potássio

KCl- Cloreto de potássio

KDa- Quilodaltons

Kg- Quilograma

KH2PO4- Hidrogenofosfato de potássio

L- Litro

µL- Microlitros

M- Molar

mM- Milimolar

µmol- Micromol

mmol – Milimol

mL- Mililitros

mg- Miligramas

mmHg – Milímetros de mercúrio

MMPs- Metaloproteinases

MgSO4- Sulfato de magnésio

MT-MMPs- MMP de membrana

N- Número

nmol- Nanomol

Na+- Sódio

NaCl- Cloreto de sódio

NADPH - β-Nicotinamida adenosina dinucleotído fosfato

NEM – N-etilmaleimida

NaHCO3- Bicarbonato de sódio

.O2-Ânion superóxido

OCT- Composto para congelar tecidos

OH-- Radical hidroxil

OONO-- Peroxinitrito

PA- Pressão arterial

PAD- Padrão interno

PBS- Tampão salina fosfato

PFA- Paraformaldeído

pH- Potencial hidrogeniônico

PMSF- Fenilmetilsulfonil

RLU- Unidades relativas de luminescência

RNAm- Ácido ribonucleico mensageiro

SDS- Dodecil sulfato de sódio

Sham- Rato controle

SHR- Ratos espontaneamente hipertensos

SRAA- Sistema renina-angiotensina-aldosterona

TBA- Ácido tiobarbitúrico

TBARS- Espécies reativas do ácido tiobarbitúrico

TEMED- Tetrametil etilenodiamina

TIMPs- Inibidores endógenos de MMPs

U.A.– unidades arbitrárias

VSMC- Células musculares lisas vasculares

ZnCl2- Cloreto de zinco

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 – Carcterística morfológica do remodelamento cardíaco decorrente da

hipertensão arterial crônica .......................................................................................24

Figura 2 – Aumento na deposição de colágeno em pacientes com hipertesão

arterial crônica...........................................................................................................26

Figura 3 – Principais MMPs e suas características estruturais.................................28

Figura 4 – Esquema ilustrativo da modulação na formação de espécies reativas

do oxigênio ................................................................................................................35

Figura 5 – Esquema ilustarativo da importância da NADP(H) oxidase na

hipertrofia cardíaca....................................................................................................36

Figura 6 – Esquema ilustarativo da ativação de MMPs por EROs ..........................39

Figura 7 – Efeitos da doxiciclina sobre a pressão arterial ........................................62

Figura 8 – Efeito da doxiciclina sobre a contratilidade cardíaca.....................................65

Figura 9 – Efeito da doxiciclina sobre as alterações estruturais associadas à

hipertensão 2R1C ......................................................................................................67

Figura 10 – Efeito da doxiciclina sobre a hipertrofia dos miócitos associadas à

hipertensão 2R1C .....................................................................................................68

Figura 11 – Efeito da doxiciclina sobre as concentrações cardíacas de MMP-2......70

Figura 12 – Efeito da doxiciclina sobre a atividade gelatinolítica in situ e para

expressão da MMP-2 por imunofluorescência ..........................................................72

Figura 13 – Efeito dos antioxidantes sobre a pressão arterial ..................................75

Figura 14 – Efeito da doxiciclina sobre a contratilidade cardíaca ................................77

Figura 15 – Efeito dos antioxidantes sobre as alterações estruturais associadas à

hipertensão 2R1C ......................................................................................................79

Figura 16 – Efeito dos antioxidantes sobre a hipertrofia dos miócitos associadas

à hipertensão 2R1C ..................................................................................................80

Figura 17 – Efeito dos antioxidantes sobre as concentrações cardíaca de EROs ...82

Figura 18 – Efeito dos antioxidantes sobre as concentrações cardíaca de MMP-2 ......84

Figura 19 – Efeito dos antioxidantes sobre a atividade gelatinolítica in situ e para

expressão da MMP-2 por imunofluorescência ..........................................................86

Tabelas

Tabela 1 – Valores de Freqüência cardíaca, Peso do coração, Peso corporal e

Razão entre peso cardíaco e peso corporal..............................................................63

Tabela 2 – Valores de Frequência cardíaca, Peso do coração, Peso corporal

Razão entre Peso Cardíaco e Corporal e Espessura da Câmera Ventricular

Esquerda. ..................................................................................................................74

SUMÁRIO

INTRODUÇÃO..........................................................................................................22

1 - Hipertensão arterial...........................................................................................22

2. Remodelamento cardíaco associado à HAS......................................................23

2.1. Remodelamento da matriz extracelular cardíaca (MEC) associado à HAS.25

3. Metaloproteínases da matriz extracelular ..........................................................27

3.1. Importância da MMP-2 para as alterações morfofuncionais cardíacas associadas à hipertensão ...................................................................................29

3.2. Mecanismos de ação da MMP-2 independentes da degradação da matriz extracelular cardíaca (MEC) ...............................................................................31

3.3. Inibição da MMP-2 como estratégia terapêutica..........................................32

4. Importância do estresse oxidativo para a hipertrofia cardíaca ...........................33

5. Possível envolvimento de EROs com MMPs .....................................................38

HIPÓTESE ................................................................................................................43

OBJETIVOS..............................................................................................................45

MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................................47

1 - Considerações gerais .......................................................................................47

1.1 - Hipertensão arterial induzida pela técnica de Goldblatt:.............................47

1.2 - Grupos experimentais.................................................................................48

2 - Materiais ...........................................................................................................49

2.1 - Soluções utilizadas nos experimentos:.......................................................49

2.2 - Drogas administradas diretamente nos animais: ........................................51

2.3 - Equipamentos utilizados nos experimentos:...............................................51

2.4 - Programas de aquisição de dados: ............................................................51

3 - Métodos ............................................................................................................52

3.1 - Parâmetros hemodinâmicos .......................................................................52

3.1.1 - Avaliação da pressão arterial sistólica e peso corporal ........................52

3.1.2 - Avaliação da contratilidade cardíaca....................................................52

3.2 - Parâmetros estruturais ...............................................................................53

3.2.1 - Análise morfológica do coração ...........................................................53

3.3 - Parâmetros bioquímicos e moleculares......................................................54

3.3.1 - Determinação de espécies reativas de oxigênio in situ ........................54

3.3.2 - Determinação dos níveis de MMP-2 por zimografia em gel .................55

3.3.2.A - Dosagem de proteína pelo método de Bradford ............................55

3.3.2.B - Eletroforese em gel de poliacrilamida 12%....................................56

3.3.3 - Determinação da atividade gelatinolítica por zimografia In situ............57

3.3.4 - Imunofluorescência para MMP-2..........................................................58

4 - Análise estatística .............................................................................................59

RESULTADOS..........................................................................................................61

1 - PROTOCOLO 1: Efeitos cardíacos do tratamento de ratos 2R1C com doxiciclina ..............................................................................................................61

1.1 - Efeito da doxiciclina sobre a pressão arterial sistólica e peso corporal: .....61

1.2 – Efeito da doxiciclina sobre a contratilidade cardíaca em ratos 2R1C: .......64

1.3 – Efeito da doxiciclina sobre o remodelamento cardíaco em ratos 2R-1C:...66

1.3 – Efeito da doxiciclina sobre o remodelamento cardíaco em ratos 2R-1C:...66

1.4 - Efeito da doxiciclina na expressão da MMP-2 e na atividade das MMPs: ..69

2 - PROTOCOLO 2: Efeitos cardíacos do tratamento de ratos 2R1C com antioxidantes..........................................................................................................73

2.1 - Efeito dos tratamentos antioxidantes sobre a pressão arterial sistólica e peso corporal ......................................................................................................73

2.2 – Efeitos dos antioxidantes sobre a contratilidade cardíaca em ratos 2R1C:..................................................................................................................76

2.3 – Efeito dos antioxidantes sobre o remodelamento cardíaco em ratos 2R1C:..................................................................................................................78

2.4 - Efeito dos antioxidantes sobre as concentrações de EROs em ratos 2R1C:..................................................................................................................81

2.5 - Efeito dos antioxidantes sobre a expressão da MMP-2 e a atividade das MMPs:.................................................................................................................83

DISCUSSÃO.............................................................................................................88

CONCLUSÃO ...........................................................................................................99

REFERÊNCIAS.......................................................................................................101

ANEXOS .................................................................................................................114

INTRODUÇÃO

Introdução 22

INTRODUÇÃO

1 - Hipertensão arterial

A hipertensão arterial sistêmica (HAS) é um crescente problema de saúde

pública que afeta aproximadamente 25% da população mundial (Kearney, Whelton

et al. 2005). No Brasil, de acordo com dados epidemiológicos, a hipertensão atinge

aproximadamente 43,9% da população urbana adulta (Freitas, Resende de Carvalho

et al. 2001) e sua incidência aumenta proporcionalmente com a idade (Chobanian,

Bakris et al. 2003). A HAS é responsável por aproximadamente 7,1 milhões de

mortes por ano (Chobanian, Bakris et al. 2003) decorrentes principalmente, das suas

complicações no aparelho cardiovascular, tais como doença arterial coronariana,

infarto do miocárdio, insuficiência cardíaca e insuficiência renal, dentre outras

(Chobanian, Bakris et al. 2003).

A fisiopatologia da HAS é considerada poligênica e multifatorial envolvendo

alterações morfológicas e funcionais no sistema cardiovascular. Neste contexto, é

crescente o número de evidências sugerindo que o estresse oxidativo (Cai and

Harrison 2000; Griendling, Sorescu et al. 2000; Lassegue and Griendling 2004;

Escobales and Crespo 2005) e o aumento de metaloproteinases da matriz

extracelular (Galis and Khatri 2002; Lehoux, Lemarie et al. 2004; Raffetto and Khalil

2008) estão associados às disfunções morfofuncionais nos vasos e coração,

presentes nesta doença.

Devido à importância dessa doença para a saúde pública, muitos estudos

fazem uso de modelos experimentais para uma melhor compreensão e descrição

dos mecanismos envolvidos na HAS. O modelo de hipertensão renovascular 2 rins,

Introdução 23

1 clipe (2R1C) apresenta altas concentrações de angiotensina II e espécies reativas

de oxigênio (EROs) (Lerman, Chade et al. 2005), que são fatores de fundamental

interesse para este trabalho.

Harry Goldblatt, em 1934, desenvolveu o modelo de hipertensão renal 2R1C

pela constrição da artéria renal de cães com auxílio de um clipe, sendo que o rim

contra lateral permanece intacto. O clampeamento de um dos rins promove ativação

do sistema renina-angiotensina-aldosterona (SRAA) que está envolvido na

fisopatologia da hipertensão arterial devido à vasoconstrição acentuada e retenção

de sódio e água. Observa-se um aumento progressivo na pressão arterial nesse

modelo experimental, associado à hipertrofia cardíaca, hipertrofia vascular e

disfunção endotelial, dentre outras alterações (Griendling, Lassegue et al. 1996;

Welch, Mendonca et al. 2003; Levy 2005). Angiotensina II tem sido descrita como

um dos principais mediadores envolvidos nessas disfunções (Martinez-Maldonado

1991), principalmente devido à formação de EROs via ativação da β-nicotinamida

adenina dinucleotídeo fosfato (NADPH oxidase) (Seshiah, Weber et al. 2002; Touyz

2004). Estudos prévios em nosso laboratório, mostraram um aumento de MMP-2 e

EROs na aorta de ratos 2R1C, porém nenhum estudo avaliou as concentrações de

MMP-2 no coração desses animais (Castro, Rizzi et al. 2008; Martinez, Castro et al.

2008; Ceron, Castro et al. 2010).

2. Remodelamento cardíaco associado à HAS

A HAS é frequentemente acompanhada por hipertrofia ventricular esquerda

(HVE) (Levy, Larson et al. 1996); (Kannel, Levy et al. 1987). A hipertrofia do

miocárdio ocorre como resposta morfológica adaptativa, compensatória, cujo

Introdução 24

objetivo é normalizar o aumento da tensão na parede do VE (Lorell and Carabello

2000). Essa hipertrofia caracteriza-se pelo aumento da massa cardíaca normal,

devido ao aumento no volume dos miócitos, que pode ser decorrente da síntese e

deposição de novos sarcômeros. Com a hipertrofia dos cardimiócitos, a espessura

da parede ventricular esquerda fica aumentada e a câmara do VE diminuída,

podendo apresentar disfunção diastólica e sistólica (Berk, Fujiwara et al. 2007)

(Figura 1).

Figura 1. Característica morfológica do remodelamento cardíaco decorrente da hipertensão arterial crônica. Aumento crônico da pressão arterial (PA) promove inicialmente, aumento na espessura da parede do ventrículo esquerdo e diminuição da câmara ventricular esquerda. Aumento crônico e persitente da PA direciona a progressão do remodelamento adaptativo para o remodelamento mal-adaptativo. O coração se mantém hipertrofiado com diminuição na espessura da parede do VE e aumento na câmara ventricular esquerda. Imagens gentilmente cedidas pelo professor Marcos Antonio Rossi.

Embora a hipertrofia seja adaptativa, compensatória, o remodelamento do VE

pode progredir para uma hipertrofia descompensada, mal-adaptativa. Nesta fase, os

miócitos ainda se mantêm com aumento de volume. Entretanto, estas células se

alongam e promovem dilatação da câmara ventricular esquerda. Normalmente

nessas condições, ocorre diminuição na contratilidade cardíaca com disfunção

Coração normal Coração hipertrofiado (remodelamento adaptativo)

Coração hipertrofiado (remodelamento mal-adaptativo)

A B C

Introdução 25

sistólica e diastólica (Opie, Commerford et al. 2006). Em função disso, a capacidade

do coração de bombear o sangue fica prejudicada, insuficiente. Assim sendo, HVE é

um importante fator de risco para insuficiência cardíaca (IC) e mortalidade por

doenças cardiovasculares (Levy, Garrison et al. 1990) (Figura 1C).

2.1. Remodelamento da matriz extracelular cardíaca (MEC) associado à HAS

Paralelamente às alterações celulares, na HVE ocorrem modificações na

composição bioquímica da matriz extracelular, cujo principal componente é o

colágeno. O estroma do coração mantém a estrutura do miocárdio assim,

contribuindo para a função ventricular através da transmissão de força gerada pelos

miócitos para as câmaras atrial e ventricular e para o realinhamento dos miócitos

durante a diástole (Robinson, Cohen-Gould et al. 1983; Robinson, Factor et al. 1986;

Robinson, Factor et al. 1987). Em relação à hipertensão, Rossi e colaboradores

mostraram que quanto mais severa for a HVE, maior é a deposição de colágeno na

matriz extracelular do VE de pacientes hipertensos (Figura 2) (Rossi 1998). Outros

autores sugerem que essa fibrose está associada à progressivas disfunções no

enchimento ventricular diastólico e comprometimento no relaxamento dos miócitos.

Dessa maneira, na HVE inicialmente ocorre disfunção diastólica e finalmente,

disfunção sistólica (Weber, Jalil et al. 1989; Weber, Pick et al. 1989; Pearson,

Pasierski et al. 1991; Swynghedauw 1999).

Introdução 26

Figura 2. Matriz extracelular de VE de humanos após digestão celular. Aumento na deposição de colágeno em pacientes com hipertesão arterial crônica. As setas indicam deposição de colágeno acentuada nos pacientes com hipertensão, quando comparados com pacientes controles. End: endomísio e Per: perimísio (Modificado de Rossi 1998).

Em condições normais, a síntese e degradação de colágeno é controlada por

fibroblastos. Entretanto, em condições patológicas, fatores como angiotensina II,

fator de crescimento transformador β1 (TGF-β1) e aldosterona, estimulam o

aumento da síntese de colágeno levando à formação de fibrose. Além do aumento

na deposição de colágeno, também pode ocorrer aumento de sua degradação,

promovendo alterações na integridade da MEC. (Opie, Commerford et al. 2006;

Berk, Fujiwara et al. 2007).

A degradação do colágeno pode estar envolvida na progressão do

remodelamento hipertrófico adaptativo para mal-adaptivo (Bradham, Bozkurt et al.

2002; Iwanaga, Aoyama et al. 2002; Opie, Commerford et al. 2006; Takenaka,

Kihara et al. 2006). Alguns autores sugerem que o aumento de proteínas que

Paciente Controle Paciente

Introdução 27

degradam a matriz extracelular inicia-se na HVE adaptativa promovendo

desestruturação da MEC (Peterson, Hallak et al. 2001; Iwanaga, Aoyama et al. 2002;

Takenaka, Kihara et al. 2006). Com isso, os miócitos se alongam e promovem

dilatação da câmara ventricular esquerda (Opie, Commerford et al. 2006). Pelos

motivos expostos, proteínas que degradam a matriz extracelular possuem

fundamental importância no remodelamento cardíaco e muitos estudos evidenciam

uma contribuição das metaloproteinases da matriz extracelular (MMPs) para esse

processo (Spinale 2007).

3. Metaloproteínases da matriz extracelular

Metaloproteinases da matriz extracelular são endopeptidases cálcio-

dependentes responsáveis pela degradação da matriz extracelular. São expressas

em várias células e tecidos, inclusive nas células do músculo liso vascular, músculo

cardíaco, endotélio vascular, fibroblastos e células inflamatórias (Nagase and

Woessner 1999; Schulz 2007). Atualmente, são conhecidas mais de 28 MMPs, que

se subdividem em famílias como colagenases, estromelisinas, matrilisinas, MMPs de

membrana (MT-MMPs) e gelatinases. As metaloproteinases apresentam domínios

estruturais semelhantes (Figura 3), que se diferem pela especificidade em relação

aos seus substratos (Nagase, Visse et al. 2006).

Introdução 28

Seqüência Sinal

Pró-peptídeo

Domínio contendo cisteína

Domínio Hemopexin

Domínio

Domínios “Fibronectin like”

Domínio Transmembrânico

Domínio Citosólico

Porção Peptídeo de ligação

Sítio de clivagem por

furinas

MMPs de membrana

Matrilisinas MMP-7, -26

Colagenases (MMP-1,-8,-13)

Estromelisinas (MMP-3,-10)

Figura 3. Principais MMPs e suas características estruturais. As gelatinases MMP-2 e MMP-9 se diferem das demais, apresentando três domínios “fibronectin-like” (Modificado de Chow, Cena et al. 2007).

Essas proteases são sintetizadas e secretadas como pró-forma latente

(zimogênios), e sua atividade depende, na maioria das vezes, da ruptura dos seus

domínios pró-peptídicos, do sítio ativo da enzima (Visse and Nagase 2003; Schulz

2007). Dessa forma, a regulação das MMPs pode ser feita por indução da expressão

gênica e ativação do zimogênio. Além disso, a atividade das MMPs ainda pode ser

regulada pelos inibidores teciduais de metaloproteinases (TIMPs)(Donnelly,

Collinson et al. 2003).

Uma vez em sua forma ativa, as MMPs participam do processo fisiológico de

remodelamento da matriz extracelular (MEC) pela degradação de vários

Introdução 29

componentes da matriz extracelular, incluindo componentes da membrana basal,

colágeno intersticial, fibronectina e várias proteoglicanas (Ohbayashi 2002; Visse

and Nagase 2003). Porém, a atividade excessiva ou desequilibrada de MMPs pode

estar associada à patogênese de várias doenças como: doenças neoplásicas

(Murphy and Nagase 2008; Kessenbrock, Plaks et al. 2010), doenças inflamatórias

crônicas (Nagase and Woessner 1999) e doenças cardiovasculares (Spinale, Coker

et al. 2000; Lynch, Blessing et al. 2004; Schulz 2007; Spinale 2007; Schulz 2009).

3.1. Importância da MMP-2 para as alterações morfofuncionais cardíacas

associadas à hipertensão

A MMP-2, também conhecida como gelatinase A, é constitutivamente

expressa em vários tecidos, inclusive no coração. Como observado na figura 3, a

MMP-2 possui domínios “fibronectin like” que confere a ela a capacidade de clivar

elastina, fibronectina e colágeno especialmente do tipo IV, que é o principal

componente da lâmina basal (Murphy and Nagase 2008). Assim como outras MMPs,

essa gelatinase contribui para o remodelamento tecidual.

Um aumento significativo na expressão e atividade da MMP-2 no soro,

tecidos vasculares e cardíacos tem sido evidenciado em estudos clínicos e em

diferentes modelos de hipertensão experimental (Castro, Rizzi et al.; Peterson,

Hallak et al. 2001; Yasmin, McEniery et al. 2005; Castro, Rizzi et al. 2008; Rizzi,

Castro et al. 2009), o que indica que a MMP-2 pode participar da fisiopatologia da

HAS.

Aumento da atividade da MMP-2 cardíaca foi associado à progressão da

hipertrofia cardíaca em animais hipertensos, sugerindo que a MMP-2 aumentada,

Introdução 30

pode contribuir para dilatação da câmara cardíaca (Iwanaga, Aoyama et al. 2002).

Camundongos transgênicos, que apresentam superexpressão de MMP-2 no

miocárdio, sem apresentar quadro patológico, desenvolveram hipertrofia dos

miócitos, fibrose e dilatação da câmara ventricular esquerda. Todas essas

alterações associadas ao aumento de MMP-2 são características da HVE mal-

adaptativa, sugerindo que esta gelatinase contribui para o remodelamento mal-

adaptativo (Bergman, Teerlink et al. 2007).

Para avaliar se a diminuição da MMP-2 poderia contribuir para uma redução

nas alterações cardíacas, foi realizado estudo com animais “knockouts” para MMP-2

em modelo experimental de coarctação de aorta (Matsusaka, Ide et al. 2006). Nesse

estudo, os autores observaram qua a HVE foi reduzida nos animais “knockouts”

indicando a contribuição da MMP-2 para hipertrofia cardíaca. O modelo de

coarctação de aorta, assim como a HAS, também induz HVE devido ao aumento na

sobrecarga cardíaca, reforçando a hipótese de que a inibição da MMP-2 poderia

contribuir para o tratamento da HVE associada à HAS.

Em conjunto, esses resultados sugerem uma relação causal entre aumento

da MMP-2 e a progressão da HVE, o que poderia ser testado com inibidores desta

enzima.

A participação da MMP-2 no remodelamento cardíaco envolve principalmente

a síntese e degradação ( “turnover”) de colágeno. Como comentado anteriormente, a

degradação de colágeno é um dos mecanismos propostos para dilatação da câmara

ventricular esquerda que ocorre na progressão do remodelamento cardíaco

associado à HAS (Peterson, Hallak et al. 2001; Iwanaga, Aoyama et al. 2002;

Takenaka, Kihara et al. 2006). A MMP-2 pode ativar vias de sinalização intracelular

Introdução 31

que culminam em apoptose, que poderia estar envolvida com disfunções

morfofuncionais da hipertrofia cardíaca (Schulz 2009). Além desses mecanismos, foi

demonstrado que a MMP-2 pode contribuir para ativação do receptor para fator de

crescimento epidermal (EGFr) (Wang, Zhao et al. 2006), ativação do fator de

necrose tumoral-α (TNF- α ) (Manso, Elsherif et al. 2006) e ativação do fator de TGF-

β1 que são fatores críticos envolvidos na via de sinalização da hipertrofia celular

(Manso, Elsherif et al. 2006; Wang, Chow et al. 2009). Sendo assim, a ativação da

MMP-2 encontrada na HAS, pode estar envolvida tanto na hipertrofia da MEC, como

na hipertrofia dos cardiomiócitos.

3.2. Mecanismos de ação da MMP-2 independentes da degradação da matriz

extracelular cardíaca (MEC)

Recentemente, foi demonstrado que a MMP-2 está presente não somente na

MEC, mas também no citoplasma dos cardiomiócitos, interage com troponina I e a

miosina de cadeia leve, prejudicando o funcionamento da maquinaria contrátil do

coração (Wang, Schulze et al. 2002; Sawicki, Leon et al. 2005). Nesses trabalhos, os

autores mostram que a inibição da MMP-2 melhora a disfunção ventricular

associada à isquemia cardíaca. Assim, além da função de degradação da MEC, a

MMP-2 também pode ser importante para a contração cardíaca (Wang, Schulze et

al. 2002; Sawicki, Leon et al. 2005). Outros autores mostram que a MMP-2 pode

estar localizada dentro do núcleo de cardiomiócitos, podendo degradar proteínas

envolvidas na reparação do DNA (poli (ADP-ribose) polimerase – PARP) (Kwan,

Schulze et al. 2004). Até o momento, a MMP-2 é a única MMP descrita no interior

dos cardiomiócitos.

Introdução 32

3.3. Inibição da MMP-2 como estratégia terapêutica

Não existem inibidores seletivos para MMP-2 comercialmente disponíveis. Por

isso, muitos trabalhos fazem uso do inibidor não seletivo de MMPs, doxiciclina

(Schulz 2007; Spinale 2007). Doxicilina é um antibiótico da classe das tetraciclinas

que quando administrado em doses subantimicrobianas atua como um potente

inibidor de MMPs (Golub, Lee et al. 1998). Atualmente, a doxiciclina é um

medicamento aprovado pelo FDA (Food and Drugs Administration) chamado

Periostat®, utilizado como inibidor de MMPs para o tratamento de doença

periodontal. Por ser medicamento em uso e pelo seu baixo custo, a doxicicilina é

particularmente interessante como ferramenta farmacológica. A inibição não seletiva de MMPs por doxiciclina promoveu efeitos benéficos

em modelos animais de remodelamento e disfunção cardíaca, como por exemplo,

infarto do miocárdio e isquemia/reperfusão (Griffin, Jinno et al. 2005; Garcia, Go et

al. 2007). Não existem estudos que avaliaram os efeitos da doxiciclina no coração

de animais hipertensos. Porém, um outro inibidor não-seletivo de MMPs (PD166793)

foi avaliado em ratos espontaneamente hipertensos (SHR, do inglês spontaneous

hypertensive rats), que é um modelo animal de progressão de insuficiência cardíaca

(Peterson, Hallak et al. 2001). O inibidor de MMPs foi administrado nos animais por 4

meses, iniciando o tratamento após 9 meses de HAS, período no qual os animais

apresentaram hipertrofia adaptativa, confirmada pelo aumento na espessura do VE e

da força de contração cardíaca. Os resultados mostraram que a inibição de MMPs

(por 4 meses) impediu a progressão da hipertrofia adaptativa para insuficiência

cardiaca nos animais SHR, após 13 meses de HAS (Peterson, Hallak et al. 2001).

Introdução 33

Embora alguns estudos tenham mostrado aumento da atividade da MMP-2 na

hipertensão arterial (Yasmin, McEniery et al. 2005; Castro, Rizzi et al. 2008) e no

remodelamento cardíaco (Spinale, Coker et al. 2000), nenhum estudo até o

momento, mostrou se a MMP-2 pode participar das alterações cardíacas, tanto

estruturais quanto funcionais, associadas ao modelo de hipertensão renovascular

2R-1C. Neste modelo experimental de HAS, ocorre aumento na produção de

angiotensina II e estresse oxidativo, relacionados com a ativação das MMPs. Dessa

maneira, é altamente sugestivo que a ativação das MMPs ocorra nestes animais e

possa contribuir para alterações cardíacas neste modelo de HAS (Donnelly,

Collinson et al. 2003; Tsuruda, Costello-Boerrigter et al. 2004; Luchtefeld, Grote et

al. 2005).

4. Importância do estresse oxidativo para a hipertrofia cardíaca

Espécies reativas de oxigênio (EROs) são derivados reativos do metabolismo

do oxigênio que em condições fisiológicas são produzidas de maneira controlada,

em baixas concentrações, participando da sinalização e regulação intracelular

envolvidas nos processos de transcrição gênica e síntese protéica (Freeman and

Crapo 1982). O aumento na formação de EROs é denominado de estresse

oxidativo, que ocorre devido ao aumento da expressão ou atividade de enzimas

responsáveis pela formação de EROS e/ou uma diminuição de enzimas

responsáveis pela inativação de EROS (Touyz and Schiffrin 2004).

As EROs mais importantes são o anion superóxido (.O2-), peróxido de

hidrogênio (H2O2), radical hidroxil (OH-) e peroxinitrito (OONO-). O ânion superóxido

é o precursor de outras EROs (Lassegue and Griendling 2004; Cai 2005; Zimmet

Introdução 34

and Hare 2006), e sua produção é predominantemente catalisada pela enzima

NADPH oxidase (Griendling, Sorescu et al. 2000; Touyz and Schiffrin 2004) (Figura

4). A xantina oxidase e enzima óxido nítrico sintase (na ausência de seu cofator

tetrahidrobiopterina, BH4) são enzimas presentes no miocárdio e capazes de

produzir EROs (Touyz and Schiffrin 2004).

Entretanto, a NADPH oxidase, que é expressa nos fibroblastos e

cardiomiócitos, é considerada a principal fonte cardíaca de EROs no miocárdio (Li,

Gall et al. 2002; Borchi, Bargelli et al. 2010), sendo composta de várias subunidades

essenciais para sua atividade (Griendling, Sorescu et al. 2000; Landmesser, Cai et

al. 2002; Modlinger, Chabrashvili et al. 2006; Murdoch, Grieve et al. 2006; Murdoch,

Zhang et al. 2006; Akki, Zhang et al. 2009). As isoformas Nox2 e Nox4, que são

associadas à membrana celular, são encontradas nos cardiomiócitos, células

endoteliais e fibroblastos e parecem contribuir para as alterações cardíacas

associadas com a hipertensão (Murdoch, Zhang et al. 2006; Akki, Zhang et al. 2009).

Estas isoformas são ativadas quando associadas às outras subunidades (por

exemplo, p22phox e p47phox dentre outras) (Touyz and Schiffrin 2004; Murdoch,

Zhang et al. 2006)(Figura 4).

A enzima NADPH oxidase é constitutivamente ativa, produzindo O2-. em

baixas concentrações de forma lenta e contínua (Touyz and Schiffrin 2004).

Entretanto, vários estímulos de fundamental relevância para fisiopatologia da

hipertensão arterial e insuficiência cardíaca podem estar associados com a ativação

da NADPH oxidase. Por exemplo, estresse cíclico, endotelina-1 e fator de necrose

tumoral-α (TNF-α) (Touyz and Schiffrin 2004). Além desses fatores, a angiotensina II

é considerada um potente ativador de NADP(H) oxidase, sendo essa enzima

oxidante sugerida como um dos mecanismos responsáveis pela hipertensão e

Introdução 35

alterações cardiovasculares induzidas pela angiotensina II (Griendling, Sorescu et al.

2000; Landmesser, Cai et al. 2002; Modlinger, Chabrashvili et al. 2006; Murdoch,

Grieve et al. 2006; Murdoch, Zhang et al. 2006; Akki, Zhang et al. 2009)

Figura 4. Esquema ilustrativo da modulação na formação de EROs. Um desequilíbrio nesses fatores que favorece a formação de EROs leva a formação do estresse oxidativo (Modificado de Touyz and Schiffrin 2004).

O aumento na formação de EROs via ativação da NADPH oxidase,

especialmente pela angiotensina II e sobrecarga cardíaca, está associado à

disfunção na contratilidade de cardiomiócitos, ativação de fibroblastos, fibrose e

hipertrofia cardíaca (Murdoch, Zhang et al. 2006; Akki, Zhang et al. 2009) (Figura 5).

Consistente com os resultados acima, muitas evidências mostram um importante

envolvimento de EROs nas alterações morfofuncionais cardíacas presentes na

Introdução 36

Fibrose Hipertrofia Fibrose

Disfunção na contratilidade

Sobrecarga cardíaca

Ativação do sistema renina-

angiotensina

insuficiência cardíaca (Giordano 2005; Sirker, Zhang et al. 2007; Takimoto and Kass

2007; Liu, Zhou et al. 2010), que pode envolver a ativação da NADPH oxidase. Essa

enzima parece acompanhar a evolução desta insuficiência em ratos indicando sua

participação na fisiopatologia dessa doença (Li, Gall et al. 2002).

Figura 5. Esquema ilustrativo da importância da NADP(H) oxidase na hipertrofia cardíaca induzida pela ativação do sistema renina-angiotensina ou HAS (sobrecarga cardíaca. Observa-se que quando a enzima está ativada, as subunidades citosólica estão associadas à subunidade Nox2 (de membrana). Modificado de Murdoch EC e colaboradores (Murdoch, Zhang et al. 2006).

Como na HAS e na insuficiência cardíaca, um aumento na formação de EROs

também é observado na isquemia/reperfusão (Wang, Sawicki et al. 2002; Schulz

2009) e aterosclerose (Warnholtz, Nickenig et al. 1999; Rueckschloss, Duerrschmidt

et al. 2003) podendo estar associado com alterações cardiovasculares como:

disfunção endotelial, alterações na contralidade dos miócitos, hipertrofia celular e

Introdução 37

ativação de MMPs e outros mediadores envolvidos com a fisiopatologia dessas

doenças (Sirker, Zhang et al. 2007; Akki, Zhang et al. 2009; Castro, Rizzi et al.

2009).

A constante formação de EROs pode ser controlada por enzimas

antioxidantes como, por exemplo, superóxido dismutase (SOD), catalase e

glutationa peroxidase entre outras (Touyz and Schiffrin 2004) (Figura 4). Além do

aumento da atividade de enzimas prooxidantes, como NADPH oxidase, uma

redução das enzimas antioxidantes pode estar associada ao aumento de EROs,

contribuindo para as alterações cardiovasculares. Por exemplo, camundongos

“knockout” para a SOD, quando sujeitos à sobrecarga cardíaca, apresentam

hipertrofia ventricular esquerda mais severa do que animais controle, também

sujeitos à mesma sobrecarga cardíaca (Lu, Xu et al. 2008). A sobrecarga cardíaca

promove aumento da hipertrofia de miócitos, na deposição de colágeno e redução

na contralidade cardíaca mais severa nos animais “knockouts” do que nos animais

controle (Lu, Xu et al. 2008). Os efeitos foram associados com aumento de EROs e

MMPs no miocárdio dos animais “knockouts” e indicam a importância da enzima

antioxidante SOD nas alterações presentes na hipertrofia cardíaca (Lu, Xu et al.

2008).

Alguns estudos avaliam o uso de drogas na tentativa de reduzir o estresse

oxidativo de maneira farmacológica. As vitaminas C e E foram as primeiras drogas a

serem utilizadas em modelos animais de hipertensão, por diminuírem as

concentrações de EROs (Chen, Touyz et al. 2001; Ulker, McKeown et al. 2003;

Lassegue and Griendling 2004; Escobales and Crespo 2005). Outros estudos

mostraram que o tratamento com apocinina, inibidor da NADPH oxidase, atenuou a

hipertrofia cardíaca em associação com a diminuição na formação de EROs na

Introdução 38

hipertensão induzida por angiotensina II (Rugale, Delbosc et al. 2007; Liu, Zhou et

al. 2010). O tratamento com tempol (mimético da SOD) foi efetivo em reduzir o

estresse oxidativo e atenuar a hipertrofia e a disfunção cardíaca, em modelos

animais de hipertrofia cardíaca pela administração de isoproterenol ou sobrecarga

cardíaca (Zhang, Kimura et al. 2005; Chess, Xu et al. 2008).

Algumas evidências têm mostrado a eficácia de drogas como captopril e

estatinas para o tratamento da hipertrofia cardíaca (Khattab, Mostafa et al. 2005;

Mollnau, Oelze et al. 2005; Rugale, Delbosc et al. 2007; Kassan, Montero et al.

2009). Esses trabalhos associam os benefícios encontrados com os efeitos

pleiotrópicos das drogas como, por exemplo, a redução do estresse oxidativo. A

redução na formação de EROs está geralmente associada com a diminuição do

peso cardíaco, da deposição de colágeno e melhora da contratilidade cardíaca

(Sorescu and Griendling 2002).

Alguns trabalhos associam a contribuição de EROs para disfunções

morfofuncionais do coração com a ativação de diversos fatores (Beswick, Dorrance

et al. 2001; Akki, Zhang et al. 2009), incluindo ativação de enzimas como MMPs

(Sorescu and Griendling 2002).

5. Possível envolvimento de EROs com MMPs

Como descrito anteriormente, as MMPs são sintetizadas e secretadas como

pró-formas latentes, chamadas de zimogênios, que precisam ser ativados (Visse and

Nagase 2003; Schulz 2007). O sítio catalítico contém o zinco que interage com a

cisteína da região do propeptídeo e a manutenção dessa conformação é requerida

para que a enzima continue inativa. EROs, especialmente H2O2 e OONO-, podem

Introdução 39

interagir com o resíduo de cisteína do propeptídeo, promovendo a ruptura da

interação do grupo tiol com o zinco. Essas alterações levam à exposição do sítio

catalítico, resultando na sua ativação mesmo com a presença do propetídeo. (Van

Wart and Birkedal-Hansen 1990; Nelson and Melendez 2004; Schulz 2007;

Kandasamy, Chow et al. 2009) (Figura 6).

Baseado no exposto acima, alguns estudos avaliaram a participação de EROs

no aumento da atividade das MMPs. Por exemplo, nos estudos realizados em

animais com isquemia e reperfusão cardíaca foi evidenciado que a disfunção

cardíaca induzida por EROs, direcionando a degradação de troponina I e miosina de

cadeia leve, pode ser devido à ativação de MMP-2 (Wang, Sawicki et al. 2002).

Figura 6. Esquema ilustarativo da ativação de MMPs por EROs (Modificado de Nelson and Melendez 2004).

O estresse oxidativo está envolvido com a ativação de fibroblastos, que são

células responsáveis pela produção de MMPs e produtos da MEC (Sorescu and

Introdução 40

Griendling 2002). Assim sendo, quando fibroblastos cardíacos foram estimulados

com EROs, as células apresentaram aumento na atividade de MMPs-2, -9 e -13,

além de uma diminuição na síntese de colágeno (Siwik, Pagano et al. 2001). Outro

estudo realizado com camundongos, mostrou que o aumento de fibrose e hipertrofia

ventricular pode ser consequência do aumento de EROs e MMPs no miocárdio,

devido à supressão da enzima SOD (Lu, Xu et al. 2008). Esses resultados indicam

uma possível participação das MMPs nos efeitos de EROs sobre o remodelamento

cardíaco.

Estudos in vitro mostram que o aumento da expressão (RNAm) e atividade da

MMP-2 induzido pelo estiramento mecânico pode ser devido à formação de EROs.

Esses efeitos parecem ser devido ao aumento da atividade da NADPH oxidase

(Grote, Flach et al. 2003). Sendo assim, muitos estudos evidenciam um aumento de

EROs paralelamente ao aumento na expressão de MMPs, o que levaria a

disfunções cardiovasculares maiores, inclusive na hipertensão (Takenaka, Kihara et

al. 2006).

Resultados obtidos em nosso laboratório mostraram que o aumento da

atividade da NADP(H) oxidase e altas concentrações de EROs em aorta de ratos

com hipertensão 2R1C ocorreu paralelamente à hipertrofia e disfunção endotelial na

aorta dos animais (Ceron, Castro et al. 2010). Em outro estudo, também realizado

em nosso laboratório, foi mostrado que apocinina ou tempol promoveram

significativa melhora das disfunções na aorta dos ratos, possivelmente devido à

redução da atividade das MMPs (Castro, Rizzi et al. 2009).

Em conjunto, esses estudos sugerem que o aumento de EROs poderia ser

um mecanismo para ativação das MMPs na hipertensão, contribuindo para as

Introdução 41

alterações presentes na hipertrofia cardíaca. Alguns trabalhos evidenciaram que

drogas antioxidantes, como tempol e apocinina, podem reduzir as alterações

presentes na hipertrofia cardíaca (Rugale, Delbosc et al. 2007; Chess, Xu et al.

2008; Liu, Zhou et al. 2010). Porém, ainda é incerto se a ativação das MMPs por

EROs pode contribuir para hipertrofia cardíaca em modelos animais de hipertensão;

e se esta ativação pode estar relacionada às alterações cardíacas associadas à

hipertensão.

HIPÓTESE

Hipótese 43

HIPÓTESE

Levando-se em consideração que:

1. A MMP-2 pode contribuir para remodelamento cardíaco e disfunções na

contratilidade cardíaca em modelos experimentais não relacionados à HAS;

2. A MMP-2 e EROs estão aumentadas em situações de HAS;

3. As EROs podem contribuir para alterações morfofuncionais na hipertrofia

cardíaca;

4. Aumentos nas concentrações EROs promovem ativação de MMPs;

a hipótese deste trabalho é de que aumentos na concentração e

atividade de MMPs, especialmente da MMP-2, participem da

fisiopatologia da hipertrofia cardíaca associada à hipertensão 2R1C e de

que aumentos de EROs estejam envolvidos nesse processo.

OBJETIVOS

Objetivos 45

OBJETIVOS

1- Verificar a expressão e atividade das MMPs (especialmente MMP-2) e sua

possível contribuição para as alterações morfofuncionais cardíacas, associadas à

hipertensão renovascular (2R-1C).

2- Verificar se as EROs modulam a expressão e atividade da MMP-2, contribuindo

para as alterações morfofuncionais cardíacas associadas à hipertensão

renovascular (2R-1C).

MATERIAIS E MÉTODOS

Materiais e Métodos 47

MATERIAIS E MÉTODOS

1 - Considerações gerais

Os experimentos foram realizados utilizando ratos machos Wistar (180 a 200

gramas), provenientes do Biotério Central do Campus de Ribeirão Preto, da

Universidade de São Paulo. Os animais foram mantidos no biotério do

Departamento de Odontologia da Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto, em

salas com ciclo claro/escuro de 12 horas, temperatura controlada (22-25 °C) e livre

acesso à ração e água. Esse estudo foi previamente aprovado pelo Comitê de Ética

Animal dessa universidade. (Protocolo número 122-2006)

1.1 - Hipertensão arterial induzida pela técnica de Goldblatt:

A indução da hipertensão arterial foi realizada através da colocação de um

clipe de prata com abertura de 0,2 milímetros sobre a artéria renal esquerda,

levando à estenose da artéria. Esse procedimento leva a ativação do sistema renina-

angiotensina, com conseqüente aumento da pressão arterial (Goldblatt, 1958). Os

animais controle foram submetidos à laparotomia, sem introdução do clipe. Como

anestésicos, foram utilizados ketamina (100mg/kg) e xilazina (10 mg/kg), por via

intra-peritoneal (i.p.).


1.2 - Grupos experimentais

Protocolo 1

Sham: animais controle, submetidos apenas à laparotomia e que receberam água;

Sham + doxi: animais controle, submetidos apenas à laparotomia e que receberam

doxiciclina na dose de 30 mg/kg/dia;

2R1C: animais submetidos à estenose da artéria renal, que receberam água;

2R1C + doxi: animais submetidos à estenose da artéria renal que receberam

doxiciclina na dose de 30 mg/kg/dia

Protocolo 2

Sham: animais controle, submetidos apenas à laparotomia e que receberam água;

Sham+tempol: animais controle, submetidos apenas à laparotomia e que receberam

tempol (antioxidante, mimético da SOD) na dose de 18 mg/kg/dia;

Sham+apocinina: animais controle, submetidos apenas à laparotomia e que receberam

apocinina (antioxidante, inibidor da NADP(H) oxidase) na dose de 25 mg/kg/dia;

2R1C: animais submetidos à estenose da artéria renal, que receberam água;

2R1C+tempol: animais submetidos à estenose da artéria renal e que receberam

tempol (antioxidante, mimético da SOD) na dose de 18 mg/kg/dia;

2R1C+apocinina: animais submetidos à estenose da artéria renal e que receberam

apocinina (antioxidante, inibidor da NADP(H) oxidase) na dose de 25 mg/kg/dia;


Observações

As doses de doxiciclina, tempol e apocinina foram escolhidas de acordo com

trabalhos prévios realizados em nosso laboratório, que mostram que estas doses

inibiram a atividade das MMPs e EROs nas aortas de ratos 2R1C (Castro, Rizzi et al.

2008; Castro, Rizzi et al. 2009).

Somente os animais que apresentaram pressão arterial sistólica acima de 160

mmHg foram utilizados no estudo. Os tratamentos tiveram início duas semanas após

a indução da hipertensão arterial renovascular. Os animais que ficaram hipertensos

foram distribuídos aleatoriamente em cada um dos grupos experimentais citados

acima. Os tratamentos foram realizados por gavagem, por um período de oito

semanas, seguido da coleta de tecidos para análises estruturais, bioquímicas e

moleculares.

2 - Materiais

2.1 - Soluções utilizadas nos experimentos:

- Solução de Krebs modificada (em mmol/L: NaCl 130; CaCl2 1,6; MgSO4 1,2;

KH2PO4 1,2; KCl 4,7; NaHCO3 14,9 e glicose 5,5);

- Paraformaldeído (PFA) 4% v/v tamponado;

- Hematoxilina e Eosina (H&E);

- Tampão de extração de proteínas: 20mmol/L de Tris-HCl, 1 mmol/L de 1,10-

fenantrolina, 1 mmol/L de fluoreto de fenilmetilsulfonil (PMSF), 1 mmol/L de NEM e

10 mmol/L de CaCl2.


- Albumina sérica bovina (BSA), 8 mg/mL;

- Reagente de Bradford;

- Dodecil sulfato de sódio (SDS) 12%, co-polimerizado com gelatina (1 mg/mL);

- Tampão utilizado no gel de separação: Tris-HCl/SDS, pH 8,8;

- Tampão utilizado no gel de largada: Tris-HCl/SDS, pH 6,8;

- Tampão de amostra não-redutor: SDS2%, Tris-HCl 125 mmol/L, glicerol 10% e azul

de bromofenol 0,001%; ph 6,8;

- Solução de TritonX-100 a 2%;

- Solução de Agarose 3%;

- Persulfato de Amônio (APS) 10%;

- TEMED (tetrametil etilenodiamina);

- Solução de acrilamida 30% e bisacrilamida (0,8%);

- Solução de coloração: Coomassie Brilliant Blue G-250 0,05%;

- Solução fixadora e de descoloração: Metanol 30% e Ácido acético 10%;

- Solução tampão de Tris-CaCl2 (Tris 50 mmol/L, CaCl2 10 mmol/L, ZnCl2 1 µmol/L );

- Solução de DQ Gelatin 5 µg/mL (Molecular Probes, Oregon, USA)

- DHE (dihidroetídio) 10 µmol/L

- PBS (tampão salina fosfato);

- Anticorpos monoclonais: anti-MMP-2 (MAB 3308), anti-TIMP-2 (MAB 13446);

diluição 1:1000 em PBS, a partir da solução inicial de 1 mg/mL (Chemicon,

Termecula, CA USA);

- Anticorpo secundário rodamina (AP 160P), diluição 1:200 em PBS, a partir da

solução inicial de 1 mg/mL (Chemicon, Termecula, CA USA);

Os demais reagentes não especificados foram adquiridos da Sigma (St. Louis, MO, USA).


2.2 - Drogas administradas diretamente nos animais:

- Doxiciclina 30 mg/kg/dia, Tempol 18/mg/kg/dia e apocinina 25/mg/kg/dia (Sigma

Aldrich) foram diluídas em água e administradas por gavagem (1mL);

- Ketamina (100 mk/kg) e xilazina (10 mg/kg) foram administradas por via intra peritoneal.

2.3 - Equipamentos utilizados nos experimentos:

- Balança de precisão (Shimadzu AY220), pHmetro (Incibrás) e centrífuga

refrigerada (CELM – 3 plus);

- Transdutor de pressão acoplado a um manguito (MTL125R pulse

transducer/pressure cuff; Castle Hill, Austrália);

- Transdutor de pressão IBM/PC equipado com uma interface digital (DI-220; Dataq

Instruments, Akron, OH)

- Micrótomo (Leica RM2025) e criostato (CM 1900; Leica, Alemanha);

- Microscópio de luz branca e fluorescência (Leica Imaging Systems Ltd.,

Cambridge, England) acoplado a câmara fotográfica;

- Espectrofotômetro;

- Fonte de eletroforese (Eletrophoresis Power Supply – EPS 301);

- Sistema de documentação de eletroforese Kodak (Kodak, Rochester, NY);

2.4 - Programas de aquisição de dados:

- Advanced CODAS; Dataq Instruments;

- ImageJ Program (NIH – National Institutes of Health);

- Analysis System (EDAS) 290 (Kodak, Rochester, NY);


- KCJunior (Molecular Devices, Sunyale, CA);

- SigmaStat for Windows (Jadel Scientific, USA).

3 - Métodos

3.1 - Parâmetros hemodinâmicos

3.1.1 - Avaliação da pressão arterial sistólica e peso corporal

A pressão arterial sistólica foi verificada pelo método de pletismografia de

cauda. Para isso, um manguito acoplado a um transdutor de pressão foi colocado

em torno da cauda dos animais acordados, previamente aquecidos (em gabinetes a

37 °C). As variações da pressão foram capturadas por um programa específico de

aquisição de dados: PowerLab 4/S analog-to-digital converter (AD Instruments Ltd.,

Csdtle Hill, Australia) e os resultados representados pela média de três medidas

consecutivas para cada animal. A pressão arterial e o peso corporal foram avaliados

semanalmente, durante as 10 semanas do estudo.

3.1.2 - Avaliação da contratilidade cardíaca

Os animais foram anestesiados com tribromoetanol (250mg/Kg, i.p.) após a

oitava semana de tratamento com doxiciclina, tempol ou apocinina. No protoclo 1, a

medida de pressão arterial invasiva foi avaliada através de catéter de polietileno inserido

na artéria femoral direita. No protoclo 2, a medida de pressão arterial invasiva foi


avaliada através de catéter de polietileno inserido na carótida. Para as medidas das

pressões no VE, foi inserido um catéter na artéria carótida que posteriormente, foi

cuidadosamente avançado até o VE. Os catéteres foram conectados a um transdutor

(P23Gb; Statham, Hato Rey, Brazil) e os sinais forma amplificados apropriadamente. As

pressões arterial e ventriculares foram amostradas continuamente (1kHz) em um

equipamento IBM/PC equipado com uma interface digital (DI-220; Dataq Instruments,

Akron, OH). Um programa de computador (Advanced CODAS; Dataq Instruments) foi

utilizado para analisar os dados e extrair séries de tempos de batimento-por-batimento

(FC) e a pressão arterial média. A primeira derivada da pressão ventricular (dP/dt) foi

calculada e os valores da freqüência máxima de desenvolvimento de pressão

isovolumétrica (+dP/dt) e de decaimento de pressão isovolumétrica (-dP/dt) foram

utilizados como índices de função cardíaca da fase sistólica e diastólica,

respectivamente (Salgado, Simoes et al. 2007). Ao final dos experimentos, os corações

foram coletados, lavados em solução salina e estocados a -80ºC até o momento do uso

para as avaliações bioquímicas.

3.2 - Parâmetros estruturais

3.2.1 - Análise morfológica do coração

Ao final da décima semana do estudo, os animais foram anestesiados, e sua

cavidade torácica foi aberta para expor o coração ainda batendo. Os corações foram

rapidamente removidos, lavados em solução em solução salina gelada, secados,

pesados e colocados em formol tamponado a 10% (pH7,3) por 2 horas. A seguir,

com auxílio de uma gilete, os ventrículos foram cortados transversalmente na porção


médio ventricular, equidistante entre o ápice e a base, e devolvidos ao fixador por

mais 20 horas. Após este período, o fixador foi trocado por álcool 70% v/v e

desidratados em diferentes concentrações de álcool para serem inseridos em

parafina com as duas metades de cada coração voltadas para cima. Os corações

foram cortados transversalmente, sempre na mesma direção, em um micrótomo

(Leica RM2025), a uma espessura de quatro micrômetros. Esses cortes foram

colocados em um banho Maria com temperatura 37-39 °C para promover a abertura

dos cortes em parafina para posterior aderência em lâminas de vidro. As lâminas

foram coradas com hematoxilina e eosina (H&E) para determinação dos parâmetros

estruturais correspondentes à área da câmara ventricular esquerda e espessura da

parede do VE e septo. As análises morfométricas foram realizadas com ajuda do

software Image J, disponível na internet (http,//rsb.info.nih.gov/nih-image/). O

diâmetro dos miócitos foi determinado pela média de 30 medidas em cada

ventrículo, em aumento de 400X nas fibras orientadas longitudinalmente. As

medidas foram realizadas sem o conhecimento de qual grupo de animal a lâmina

pertencia, com um software Leica Qwin (Leica Imaging Systems Ltd., Cambridge,

UK) em conjunto a um microscópio (Leica DMR, Leica Microsystems Wetzlar GmbH,

Wetzlar, Germany), uma câmera e um computador.

3.3 - Parâmetros bioquímicos e moleculares

3.3.1 - Determinação de espécies reativas de oxigênio in situ

As concentrações cardíacas de EROs foram analisadas, in situ, no VE,

utilizando dihidroetídeo (DHE) na concentração de 10 µg/mL(Hao, Nishimura et al.


2006; Viel, Benkirane et al. 2008). Esse “probe” reage com o O2- presente nos

tecidos, resultando na formação de 2-hidroxietídeo e de etídeo, produtos que emitem

fluorescência vermelha no local. Os tecidos foram congelados em OCT (Sakura

Finetek, Torrance, CA, USA), utilizando acetona e gelo seco. Eles foram cortados

em criostato, a 5 µm de espessura, e incubados com DHE por 30 minutos em

câmara úmida e escura. Após a incubação, os cortes foram lavados com tampão

salina fosfato (PBS) e fixados em PFA 4%. Com auxílio de um microscópio de

fluorescência (Leica Imaging Systems Ltd., Cambridge, England) acoplado à câmera

fotográfica, as imagens dos cortes foram fotografadas com aumento de 400x. A

quantificação da intensidade de fluorescência vermelha emitida foi realizada

utilizando o programa ImageJ.

3.3.2 - Determinação dos níveis de MMP-2 por zimografia em gel

Método muito utilizado para determinação dos níveis de MMPs no plasma e

amostras de tecidos biológicos (Gerlach, Uzuelli et al. 2005; Gerlach, Demacq et al.

2007; Castro, Rizzi et al. 2008). No caso de zimografia de tecidos, é preciso

determinar a quantidade de proteína presente em cada amostra, para aplicar no gel

a mesma quantidade de proteína por amostra, pois variações protéicas entre uma e

outra podem interferir nos resultados finais desse método.

3.3.2.A - Dosagem de proteína pelo método de Bradford

Para a quantificação de proteínas, foi utilizado o método de Bradford, que

consiste em um ensaio colorimétrico quantitativo, em que ao se ligar às proteínas do


tecido o reagente adquire uma coloração azul. As amostras de VE foram triturados e

homogeneizados em tampão de extração de proteínas (CaCl2 10 mM, Tris 50 mM

pH 7,4, Brij 1%, NaCl 0,5%, fenantrolina 1 mM, PMSF 1 mM, NEM 1 mM) e

incubadas por 16 horas em geladeira. Para cada 0,1 g de tecido foram

acrescentados 300 µL do tampão. Após as 16 horas, as amostras foram

centrifugadas por 15 minutos (10000 G), e os sobrenadantes retirados para

determinação protéica. A curva padrão foi realizada com albumina do soro bovino

(BSA) diluído em água destilada nas seguintes concentrações em mg/mL: 0,085;

0,0175; 0,035; 0,7; e 1,4.

O reagente de Bradford foi utilizado para determinar as concentrações de

proteína para cada amostra analisada. A coloração azul desenvolvida no contato

com as proteínas pode ser quantificada em espectrofotêmetro de luz visível (595

nm). A intensidade da cor varia de acordo com a quantidade de proteína presente na

amostra. Para cada 5 µL de amostra foi adicionado 250 µL de reagente de Bradford.

Pelos valores obtidos após a leitura, em µg/µL, foi possível aplicar 40 µg de proteína

por canaleta do gel.

3.3.2.B - Eletroforese em gel de poliacrilamida 12%

As amostras foram previamente misturadas ao tampão de amostra (SDS 2%,

Tris-HCl 125 mM, glicerol 10% e azul de bromofenol 0,001%) e aplicadas em géis de

poliacrilamida a 12% contendo 1mg/mL de gelatina e separadas por eletroforese,

conforme a técnica SDS-PAGE. Concluída a eletroforese, os géis foram submetidos

a dois banhos de Triton X-100 a 2%, para remover o SDS e colocados em solução

de Tris CaCl2 50 mM, por 48 horas, a 37 °C. Posteriormente, foram fixados e


corados em solução Coommassie Blue 0,05% por 4 horas. Para a visualização das

bandas referentes às MMPs os géis foram descorados com metanol a 30% e ácido

acético a 10%. Observa-se a formação de bandas claras contra o fundo azul do

Coommassie devido à degradação da gelatina incorporada ao gel pelas MMPs.

Para cada gel, foi utilizado um padrão interno (soro fetal bovino a 2%),

representado nas figuras como PAD. Por ele foi possível normalizar as eventuais

variações nas bandas decorrentes de diferenças na intensidade de coloração dos géis.

Essa normalização é necessária para que se possa comparar resultados obtidos em

diferentes géis. A quantificação das bandas da MMP-2 foi feita utilizando-se o sistema

Kodak Eletrophoresis Documentation and Analisys System – EDAS 290 (Kodak,

Rochester, NY). As formas da MMP-2 foram identificadas pelos seus pesos

moleculares: 75, 72 e 64 KDa. Elas foram inibidas por fenantrolina, mas não por outros

inibidores de proteases.

3.3.3 - Determinação da atividade gelatinolítica por zimografia In situ

Esse método reflete a atividade in situ das MMPs e não seus níveis como a

zimografia convencional. Esse método permite a quantificação dessa atividade

diretamente no tecido (Galis, Sukhova et al. 1995). Para essa análise utilizou-se DQ

gelatin (E12055, Molecular Probes, Oregon, USA) na concentração de 1,0 µg/mL em

tampão Tris-CaCl2 50 mM. Os tecidos foram congelados em OCT (Sakura Finetek,

Torrance, CA, USA), utilizando acetona e gelo seco. Eles foram cortados em

criostato, a 5 µm de espessura, e incubados com o substrato DQ gelatin por 60

minutos em câmara úmida e escura. Após a incubação, os cortes foram lavados com

PBS e fixados em PFA 4% v/v por 10 minutos. Com auxílio de um microscópio de


fluorescência (Leica Imaging Systems Ltd., Cambridge, England) acoplado a câmera

fotográfica, as imagens dos cortes foram fotografadas num aumento de 400x. A

quantificação da atividade gelatinolítica in situ observada como intensidade de

fluorescência verde emitida, foi realizada utilizando o programa ImageJ.

3.3.4 - Imunofluorescência para MMP-2

Método utilizado para determinar os níveis de MMP-2 e co-localizar a

atividade gelatinolítica in situ com a expressão dessa enzima, uma vez que outras

MMPs também possuem a capacidade de degradar a gelatina. Após a incubação

com DQ gelatin e PFA 4%, os cortes de coração foram incubados com anticorpo

primário anti-MMP-2 (MAB 3308, Chemicon, USA), na concentração de 0,1 µg/mL

por uma hora, em câmara úmida e escura e em seguida os cortes foram lavados

com PBS. Após esse período, os cortes foram incubados com anticorpo secundário

rodamina (AP160P, Chemicon, USA) PA 5,0 µg/mL por uma hora nas mesmas

condições citadas. Esse anticorpo emite fluorescência vermelha quando ligado ao

antcorpo primário. Com auxílio de um microscópio de fluorescência (Leica Imaging

Systems Ltd., Cambridge, England) acoplado a câmera fotográfica, as imagens dos

cortes foram fotografadas num aumento de 400x. A quantidade de MMP-2 foi

determinada como intensidade de fluorescência vermelha emitida e a quantificação

foi realizada utilizando o programa ImageJ. Para sobreposição da atividade

gelatinolítica com a expressão da MMP-2 foi utilizado o programa aTube Catcher. A

co-localização da MMP-2 e atividade gelatinolítica nas imagens sobrepostas

apresenta coloração amarela.


4 - Análise estatística

Os resultados obtidos nesse estudo foram analisados com ANOVA de duas

vias (análise de variância) ou ANOVA de uma via seguido de teste Tukey (SigmaStat

for Windows, Jadel Scientific, USA). Foram considerados estatísticamente diferentes

valores com p<0,05. Os gráficos foram representados como média ± erro padrão da

média (EPM), com 4-10 animais por grupo.

RESULTADOS

Resultados 61

RESULTADOS

1 - PROTOCOLO 1: Efeitos cardíacos do tratamento de ratos 2R1C com

doxiciclina

1.1 - Efeito da doxiciclina sobre a pressão arterial sistólica e peso corporal:

Os valores basais de pressão arterial sistólica foram similares nos quatro

grupos experimentais, antes da cirurgia. A elevação da pressão arterial sistólica foi

observada nos grupos 2R1C a partir da segunda semana após a cirurgia (P<0,05

versus grupos sham; Figura 7A). O tratamento com doxiciclina não afetou a pressão

arterial no grupo sham, mas atenuou significativamente o aumento na pressão

arterial do grupo 2R1C de 220 ± 5,2 mmHg para 172 ± 4,8 mmHg (P<0,05; Figura

7A). Ao final da última semana de tratamento, esses resultados foram confirmados

pelo registro da pressão arterial pelo método invasivo. O tratamento com doxiciclina

atenuou o aumento das pressões arteriais sistólica (de 218 ± 12 mmHg para 185 ± 8

mmHg), diastólica (de 163 ± 6 mmHg para 140 ± 11 mmHg) e média (de 189 ± 7

mmHg para 160 ± 10 mmHg) nos animais 2R1C (P<0,05, Figura 7B, C e D).

Não houve diferenças significativas no peso corporal e frequência cardíaca

entre os grupos desse estudo, mas foi observado um aumento no peso cardíaco dos

animais 2R1C não tratados (P<0,05 versus todos os outros grupos do estudo;

Tabela 1).

Resultados 62

Figura 7 – A doxiciclina atenuou os aumentos na pressão arterial dos ratos 2R1C. Aferição da pressão arterial pelo método não-invasivo (pletismografia de cauda) (A) e invasivo (B, C e D). Valores expressos como média± EPM (n= 8-10 por grupo) *P<0,05 para 2R1C versus todos os outros grupos. # P<0,05 para 2R-1C + doxi versus grupo sham.

Resultados 63

Tabela 1. Valores de Freqüência cardíaca, Peso do coração, Peso corporal e Razão entre peso cardíaco e peso corporal.

Grupos Sham Sham + doxi 2R1C 2R1C + doxi

Freqüência cardíaca (batimentos/min) 328.2 ± 16.7 345.3 ± 18.1 363.3 ± 19.2 329.0 ± 11.4

Peso do coração (g) 1,49 ± 0,05 1,55 ± 0,07 1,72 ± 0,20* 1,56 ± 0,07

Peso corporal (g) 533,1 ± 18,0 534,0± 27,1 446,0 ± 23.1 512,3 ± 23,7

Razão: Peso cardíaco (mg)/Peso corporal (g) 2,81 ± 0,05 2,91 ± 0,11 3,82 ± 0,28* 3,05 ± 0,06

2R1C: 2 rins -1clipe. Valores expressos como média ± EPM (n= 7 por grupo) *P<0,05 para 2R1C versus todos os outros grupos.

Resultados 64

1.2 – Efeito da doxiciclina sobre a contratilidade cardíaca em ratos 2R1C:

Os animais 2R1C apresentaram um aumento significativo na primeira

derivada temporal de pressão ventricular positiva (+dP/dt: de 7965 ± 468 mmHg/s

para 11170 ± 459 mmHg/s) e negativa (-dP/dt: de -5781 ± 375 mmHg/s para -7356 ±

171 mmHg/s), quando comparados com o grupo sham (P<0,05). O tratamento com

doxiciclina reduziu em aproximadamente 50% os aumentos nas +dP/dt (9274 ± 412

mmHg/s) e –dP/dt (-6365 ± 247 mmHg/s) observados nos animais 2R1C (P<0,05).

Nenhuma diferença significativa foi observada entre os outros grupos do estudo

(Figura 8).

Resultados 65

Figura 8 – (A) Máxima +dP/dt e (B) máxima –dP/dt. Valores expressos como média ± EPM (n=8 por grupo) *P<0,05 para 2R1C versus todos os outros grupos.

Resultados 66

1.3 – Efeito da doxiciclina sobre o remodelamento cardíaco em ratos 2R-1C:

Como mostrado na figura 9B e na tabela 1, os animais 2R1C apresentaram

um aumento de aproximadamente 25% na razão peso cardíaco/peso corporal

quando comparados com o grupo sham (P<0,05), indicando a presença de

hipertrofia cardíaca, a qual foi confirmada pela histologia, caracterizando hipertrofia

adaptativa, como observado na figura 9. Os animais 2R1C apresentaram aumento

de 30% e 38%, respectivamente na espessura da parede ventricular esquerda e no

septo, quando comparado com o grupo sham (P<0,05). Além disso, foi observada

uma diminuição na área da câmara ventricular esquerda de 23% nos animais 2R1C

(Sham: 19,4 ± 1 mm2 versus 2R1C: 15,0 ± 1 mm2 e, P<0,05). As alterações no VE

foram associadas a um aumento no diâmetro dos miócitos nos ratos 2R1C de 12,6 ±

0,3 µm para 13,8 ± 0,1 µm (Figura 10; P<0,05 versus grupo sham). O tratamento

com doxiciclina reverteu todas as alterações morfológicas encontradas nos animais

2R1C (P<0,05, Figuras 9 e 10).

Resultados 67

Figura 9 – (A) Painel representativo dos cortes de coração para determinação dos parâmetros histológicos. (B) Razão peso cardíaco/peso corporal e (C, D e E) espessura da parede ventricular esquerda, espessura da parede do septo e medida da área da câmara ventricular esquerda. Valores expressos como média± EPM (n=8 por grupo) *P<0,05 para 2R1C versus todos os outros grupos do estudo.

Sham Sham + doxi 2R1C 2R1C + doxi0

1

2

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Resultados 68

Figura 10 – (A) Fotomicrografias representativas de VE (x400, microscopia óptica convencional). (B) Valores do diâmetro dos miócitos. Valores expressos como média± EPM (n=6 por grupo) *P<0,05 para 2R1C versus todos os outros grupos do estudo.

Resultados 69

1.4 - Efeito da doxiciclina na expressão da MMP-2 e na atividade das MMPs:

Géis de zimografia com gelatina foram utilizados para detecção das

concentrações de MMP-2 no extrato de VE dos animais. Como mostrado no

zimograma representativo foram detectadas duas bandas de MMP-2 (72 kDA e 64

kDa) e nenhuma banda da MMP-9 (Figura 11A). Houve um aumento significativo, de

aproximadamente 27%, na concentração de 72 kDa MMP-2 no VE dos animais

2R1C quando comparados com o grupo sham (em unidades arbitrárias (U.A.): de

0,25 ± 0,02 para 0,37 ± 0,04; P<0,05) (Figura 11B). O tratamento com doxiciclina

não atenuou de maneira estatisticamente significativa as concentrações de MMP-2

no VE dos animais 2R1C (0,31 ± 0,04 U.A.; P>0,05). Nenhuma diferença estatística

foi observada entre os animais controles, quando comparados com o grupo 2R1C

tratado com doxiciclina. (Figura 11; P>0,05).

Resultados 70

Figura 11 – (A) Gel representativo de zimografia SDS-PAGE de extrato de VE. P: padrão interno. (B, C e D) Representação gráfica dos valores para o as bandas de peso molecular 72 kDa MMP-2, 64 kDa MMP-2 e para a MMP-2 total, respectivamente. Valores expressos como média± EPM. (n=10 por grupo) *P<0,05 para 2R1C versus grupo sham.

Resultados 71

Durante o processamento das amostras para a zimografia, os inibidores de

proteases são separados da proteína. Dessa maneira, a atividade gelatinolítica,

observada no zimograma, não reflete a atividade gelatinolítica existente nos tecidos,

reflete somente a expressão das proteínas.

Por esse motivo, foi realizado um ensaio de atividade gelatinolítica no VE dos

animais (zimografia in situ), que reflete a atividade gelatinolítica total (Figura 12A e

12B). Como observado na figura 12B, os animais 2R1C apresentaram aumento de

32% na atividade gelatinolítica quando comparados com o grupo sham (de 43 ± 1,9

U.A. para 64 ± 5,7 U.A.; P<0,05). O tratamento com doxiciclina diminuiu a atividade

gelatinolítica dos animais 2R1C para valores semelhantes aos encontrados no grupo

sham (P<0,05, Figura 12B).

Para evidenciar além dos níveis, a localização da MMP-2 no VE, foi realizado

o método de imunohistoquímica (Figura 12A). Os resultados adicionais confirmaram

um aumento nas concentrações de MMP-2 no VE dos animais 2R1C (de 40 ± 3,2

para 52 ± 3,5; P<0,05) (Figura 12C), e mostraram que o tratamento com doxiciclina

atenuou, mas não significativamente, as concentrações de MMP-2 (42,9 ± 4 U.A.;

P>0,05). Nenhuma diferença estatística foi observada entre os animais 2R1C

tratados com doxiciclina e os grupos sham (Figura 12C; P>0,05)

Resultados 72


20

40

60 #

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Figura 12- (A) Fotomicrografias representativas de VE incubadas com DQ gelatin e/ou anticorpo anti-MMP-2 (x400, microscopia de fluorescência). (B) Atividade gelatinolítica in situ e (B) níveis de MMP-2 nos ventrículos esquerdo. Valores expressos como média± EPM. (n=10 por grupo) *P<0,05 para 2R1C versus todos os grupos do estudo. #P<0,05 versus grupo sham.

Resultados 73

2 - PROTOCOLO 2: Efeitos cardíacos do tratamento de ratos 2R1C com

antioxidantes

2.1 - Efeito dos tratamentos antioxidantes sobre a pressão arterial sistólica e

peso corporal

Os valores basais de pressão arterial sistólica foram similares nos seis grupos

experimentais, antes da cirurgia. A elevação da pressão arterial sistólica foi

observada a partir da primeira semana após a cirurgia (P<0,05 versus grupos sham;

Figura 13A). Os tratamentos com tempol ou apocinina não afetaram a pressão

arterial nos grupos sham, mas atenuaram em aproximadamente 33% o aumento da

pressão arterial nos grupos 2R1C (Figura 13A, em mmHg: sham : 124 ± 11; 2R1C:

217 ± 8,8; 2R1C+tempol:184 ± 8,8 e 2R1C+ apocinina 182 ±8,5; P<0,05 versus

2R1C).

Ao final da última semana de tratamento, os resultados foram confirmados

através da aferição da pressão arterial pelo método invasivo. Como observado nas

figuras 13B, 13C e 13D, os tratamentos com os dois antioxidantes atenuaram a

pressão arterial sistólica (em mmHg: 2R1C: 244 ± 11; 2R1C+tempol: 179 ± 12 e

2R1C+apocinina: 198 ± 13) e a pressão arterial média (em mmHg: 2R1C: 207 ± 8;

2R1C+tempol: 157 ± 11 e 2R1C+apocinina: 179 ± 11), quando comparado com os

animais hipertensos não tratados (P<0,05). Porém, somente o tratamento com

tempol reduziu o aumento na pressão arterial diastólica, quando comparado com

animais hipertensos não tratados (em mmHg: 2R1C: 179 ± 7; 2R1C+tempol: 137 ±

11 e 2R1C+apocinina: 162 ± 11; P<0,05 para 2R1C versus 2R1C+tempol).

Resultados 74

Não houve diferença significativa no peso corporal e frequência cardíaca

entre os grupos do estudo (Tabela 2). O peso do coração foi maior nos grupos 2R1C

tratados ou não com tempol, quando comparado com os grupos sham (Tabela 2;

P<0,05).

Tabela 2. Valores de Frequência cardíaca, Peso do coração, Peso corporal Razão entre Peso Cardíaco e Corporal e Espessura da Câmera Ventricular Esquerda.

Valores expressos como média± EPM (n= 8 por grupo) *P<0,05 versus respectivo grupo sham. **P<0,05 versus 2R1C tratados com antioxidantes. .

Grupos Freqüência cardíaca

(batimentos/min)

Peso do coração (g)

Peso corporal (g)

Razão: peso

cardíaco(mg)/ peso corporal

(g)

Câmara ventricular esquerda

(mm2)

sham 345,1 ± 14.1 1,56 ± 0,05 546,0 ± 16,2 2,87 ± 0,06 20,7 ± 0,78 sham+tempol 359,7 ± 13,7 1,55 ± 0,04 555,3 ± 17,9 2,81 ± 0,06 22,3 ± 1,05

sham+apocinina 373,3 ± 14,4 1,54 ± 0,06 543,6 ± 12,1 2,84 ± 0,12 20,7 ±1,18 2R1C 347,0 ± 10,9 1,91 ± 0,09* 499,3 ± 29,3 4,03 ± 0,38** 21,1 ± 1,3

2R1C+tempol 351,4 ± 12,6 1,80 ± 0,05* 538,4 ± 24,4 3,41 ± 0,14* 22,3 ± 1,6 2R1C+apocinina 373,7 ± 14,9 1,61 ± 0,08 496,0 ± 17,33 3,31 ± 0,22* 21,9 ± 1,8

Resultados 75

Figura 13 – Tratamentos com tempol e apocinina atenuaram os aumentos na pressão arterial dos ratos 2R1C. Aferição da pressão arterial pelo método não-invasivo (pletismografia de cauda) (A) e invasivo (B, C e D). Valores expressos como média± EPM (n= 8-10 por grupo) *P<0,05 para 2R1C versus todos os outros grupos. # P<0,05 para 2R1C+tempol ou 2R-1C+apocinina versus respectivos grupos sham.

Resultados 76

2.2 – Efeitos dos antioxidantes sobre a contratilidade cardíaca em ratos 2R1C:

Os animais 2R1C apresentaram um aumento de aproximadamente 34%, na

primeira derivada temporal de pressão ventricular (dP/dt) positiva (de 6735 ± 756

mmHg/s para 10497 ± 921) e negativa (de 5000 ± 526 para 7522 ± 707), quando

comparado com o grupo sham (P<0,05). Os tratamentos com tempol ou apocinina

reduziram os valores nas ±dP/dt observados nos animais 2R1C para valores

próximos aos obtidos nos grupos sham (P<0,05). Os tratamentos não afetaram as

±dP/dt do grupo sham (Figura 14).

Resultados 77

sham

sham

+tempo

l

sham

+apo

cinina

2R1C

2R1C

+tempo

l

2R1C

+apo

cinina

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000 *

+dP/

dt (m

mH

g/m

in)

Figura 14 – (A) Máxima +dP/dt e (B) máxima –dP/dt. Valores expressos como média ± EPM (n=8 por grupo) *P<0,05 para 2R1C versus todos os outros grupos.

A B

-10000

-8000

-6000

-4000

-2000

0

*

-dP/

dt (m

mHg

/min

)

sham

sham

+tempo

l

sham

+apo

cinina

2R1C

2R1C

+tempo

l

2R1C

+apo

cinina

Resultados 78

2.3 – Efeito dos antioxidantes sobre o remodelamento cardíaco em ratos 2R1C:

Foi observado um aumento significativo na razão peso cardíaco/peso corporal

nos grupos de ratos hipertensos quando comparados com seus respectivos grupos

sham (Figura 15A, 15B e tabela 2; P<0,05 para grupos 2R1C tratados ou não versus

grupos sham). Porém, os animais 2R1C não tratados apresentaram um aumento de

30% na referida razão, a qual foi atenuada em 15% pelos tratamentos com tempol

ou apocinina.

A presença de hipertrofia cardíaca foi confirmada pela histologia

caracterizando hipertrofia adaptativa como observado na figura 15 C e D. Os

animais 2R1C apresentaram aumento de 21% e 11% respectivamente, na

espessura da parede ventricular esquerda e do septo, quando comparado com o

grupo sham (P<0,05). Não foi observada nenhuma alteração na área da câmara

ventricular esquerda entre os animais do estudo (Tabela 2, P>0,05 versus grupos

sham). Como observado na figura 16, as alterações no VE foram associadas a um

aumento no diâmetro dos miócitos nos ratos 2R1C (em µm: grupo sham: 6,5 ± 0,6 e

grupos 2R1C: 9,2 ± 0,4, 2R1C+tempol: 7,6 ± 0,2 e 2R1C+apocinina: 7,2 ± 0,3;

P<0,05 versus grupo sham). Os tratamentos com antioxidantes atenuaram todas as

alterações morfológicas encontradas nos animais 2R1C (P<0,05, Figuras 15 e16).

Resultados 79

sham

sham

+tempo

l

sham

+apo

cinina

2R1C

2R1C

+tempo

l

2R1C

+apo

cinina

0

1

2

3

4

5

*# #

Peso

cor

ação

(mg)

/ Pes

o co

rpor

al (g

)

sham

sham

+tempo

l

sham

+apo

cinina

2R1C

2R1C

+tempo

l

2R1C

+apo

cinina

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

*

Espe

ssur

a da

par

ede

do s

epto

(m

m)

Figura 15 – (A) Painel representativo dos cortes de coração para determinação dos parâmetros histológicos. (B) Razão peso cardíaco/peso corporal e (C e D) espessura da parede do septo e espessura da parede ventricular esquerda. Valores expressos como média± EPM (n=8 por grupo) *P<0,05 para 2R1C versus todos os outros grupos desse estudo, e #P<0,05 versus respectivos grupos sham.

A B

C D

sham

sham

+tempo

l

sham

+apo

cinina

2R1C

2R1C

+tempo

l

2R1C

+apo

cina

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0*

Espe

ssur

a da

par

ede

do v

entr

ícul

oes

quer

do (m

m)

Resultados 80

Figura 16 – (A) Fotomicrografias representativas de VE (x400, microscopia óptica convencional). (B) Valores do diâmetro dos miócitos expressos como média± EPM (n=6 por grupo) *P<0,05 para 2R1C versus todos os outros grupos do estudo, e #P<0,05 versus respectivos grupos sham. Barra representa 200µm.

A

B

sham

sham

+tempo

l

sham

+apo

cinina

2R1C

2R1C

+tempo

l

2R1C

+apo

cinina

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0 *#

Diâ

met

ro d

o m

ióci

to (

µm

)

Resultados 81

2.4 - Efeito dos antioxidantes sobre as concentrações de EROs em ratos 2R1C:

A hipertensão promoveu um aumento significativo de aproximadamente 23%

na formação de EROS comparado com o grupo controle (de 26,4 ± 1,5 U.A. para

34,4 ± 2,5 U.A., P<0,05, Figura 17). O aumento na formação de EROS foi revertido

pelos tratamentos com tempol e apocinina (P<0,05, Figura 17).

Resultados 82

Sham+tempol Sham+apocinina

2R1C+apocinina 2R1C+tempol2R1C

Sham

50 µm

sham

sham

+tempo

l

sham

+apo

cinina

2R1C

2R1C

+tempo

l

2R1C

+apo

cinina

0

10

20

30

40*

Inte

nsid

ade

de fl

uore

scên

cia

(Uni

dade

s ar

bitr

ária

s)

Figura 17 - Efeito dos tratamentos sobre a produção cardíaca de EROs. Fotografias representativas de VE (x400) incubadas com DHE (A). Representação gráfica da intensidade de fluorescência vermelha dos produtos da reação do DHE com O2

- (B). Valores expressos como média± EPM (n=4/grupo) *P<0,05 para 2R1C versus todos os grupos do estudo.

A

B

Resultados 83

2.5 - Efeito dos antioxidantes sobre a expressão da MMP-2 e a atividade das

MMPs:

Como observado no protocolo 1, pelo zimograma representativo, foram

detectadas três bandas de MMP-2 (75 kDa, 72 kDa e 64 kDa) e nenhuma banda da

MMP-9 (Figura18A). Os animais 2R1C apresentaram um aumento significativo nas

concentrações de 72 kDa MMP-2 (de 5,3 ± 0,2 para 8,6 ± 0,7; P<0,05; Figura 18B).

Os tratamentos com os antioxidantes não afetaram as concentrações de 72 kDa

MMP-2 no VE dos animais hipertensos ou sham (P>0,05 versus grupo 2R1C não

tratado, Figura 18).

Resultados 84

Figura 18 – (A) Gel representativo de zimografia SDS-PAGE de extrato de VE. P: padrão interno. (B) Representação gráfica dos valores para as bandas de peso molecular 72 kDa MMP-2, 75 kDa MMP-2, 64kDa MMP-2 e para MMP-2 total. Valores expressos como média± EPM. (n=10 por grupo) *P<0,05 versus grupo sham.

A

Sham Sham+tempol Sham+apocinina 2R1C 2R1C+tempol 2R1C+apocinina P

B

sham

sham

+tempo

l

sham

+apo

cinina

2R1C

2R1C

+tempo

l

2R1C

+apo

cinina

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

64 k

Da

MM

P-2

(Uni

dade

s ar

bitr

ária

s)

sham

sham

+tempo

l

sham

+apocin

ina2R

1C

2R1C

+tempol

2R1C

+apocin

ina0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

75 k

Da

MM

P-2

(Uni

dade

s ar

bitr

ária

s)

sham

sham

+tempol

sham+apo

cinina

2R1C

2R1C+te

mpol

2R1C+apocin

ina0.0

2.5

5.0

7.5

10.0 * * *

72 k

Da

MM

P-2

(U

nid

ades

arb

itrá

rias

)

sham

sham

+tempo

l

sham

+apo

cinina

2R1C

2R1C

+tempo

l

2R1C

+apo

cinina

0

2

4

6

8

10

12

* * *

MM

P-2

tota

l (U

nida

des

arbi

trár

ias)

B

Resultados 85

Para verificar se o tratamento com antioxidantes afetam a atividade das

MMPs, foi realizado o ensaio de atividade gelatinolítica no VE dos animais

(zimografia in situ). Como observado no protocolo 1, os animais 2R1C apresentaram

aumento de 32% na atividade gelatinolítica, quando comparados com o grupo sham

(de 11,5 ± 0,7 para 17,1 ± 1,0, P<0,05). Os tratamentos com antioxidantes reduziram

a atividade gelatinolítica dos animais 2R1C para valores semelhantes aos

encontrados no grupo sham. Como mostrado na figura 19 A e B, a atividade

gelatinolítica no grupo 2R1C+tempol ou 2R1C+apocinina foi significativamente

menor, quando comparada com o grupo 2R1C (P<0,05).

Para evidenciar além dos níveis, a localização da MMP-2 no VE, foi realizado

o método de imunohistoquímica (Figura19A). Os resultados adicionais confirmam um

aumento nas concentrações de MMP-2 no VE dos animais 2R1C (de 8,0 ± 0,4 U.A.

para 14,7 ± 1,5 U.A.; P<0,05), e mostram que o tratamento com antioxidantes não

diminuem as concentrações de MMP-2 no VE dos animais hipertensos

(2R1C+tempol: 13,2 ± 1,3 U.A.e 2R1C+apocinina: 13,7 ± 0,9 U.A; P>0,05. versus

grupo 2R1C; Figura 19C)

Resultados 86

Atividade gelatinolítica

MMP-2

Sobreposição

Sham Sham+apocinina 2R1C 2R1C+tempol 2R1C+apocinina Sham+tempol

50

sham

sham

+tempo

l

sham

+apo

cinina

2R1C

2R1C

+tempo

l

2R1C

+apo

cinina

0

5

10

15

20 *

Ativ

idad

e ge

latin

olíti

caIn

situ

(Uni

dade

s ar

bitr

ária

s)

sham

sham

+tempo

l

sham

+apo

cinina

2R1C

2R1C

+tempo

l

2R1C

+apo

cinina

0

5

10

15

20

## #

Expr

essã

o da

MM

P-2

(Uni

dade

s ar

bitr

ária

s)

Figura 19- (A) Fotomicrografias representativas de VE incubadas com DQ gelatin e/ou anticorpo anti-MMP-2 (x400, microscopia de fluorescência). (B) Atividade gelatinolítica in situ e (C) níveis de MMP-2 nos ventrículos esquerdo. Valores expressos como média± EPM. (n=5 por grupo) *P<0,05 para 2R1C versus todos os grupos do estudo. #P<0,05 versus respectivos grupos sham.

A

B C

DISCUSSÃO

Discussão 88

DISCUSSÃO

Há um crescente número de estudos evidenciando que as MMPs,

responsáveis pela degradação de colágeno e outros componentes da MEC, podem

contribuir para as alterações na estrutura e função presentes na hipertrofia cardíaca

(Wang, Bergman et al. 2006; Bergman, Teerlink et al. 2007; Schulz 2007; Spinale

2007). Porém, o envolvimento das MMPs, especialmente MMP-2, no remodelamento

cardíaco associado ao modelo experimental 2R1C ainda não foi avaliado em

nenhum estudo prévio.

Neste sentido, esse foi o primeiro trabalho a mostrar um aumento nas

concentrações e na atividade da MMP-2 paralelamente às alterações morfológicas e

funcionais no remodelamento cardíaco em ratos 2R1C. O presente estudo, mostra

que a doxiciclina (um inibidor não-seletivo de MMPs) normalizou o aumento da

atividade gelatinolítica total, atenuou o aumento na pressão arterial e preveniu as

alteração morfofuncionais cardíacas associadas à hipertensão. Além disso, foi

encontrado que o tratamento com antioxidantes reduziram a formação de EROs e a

atividade gelatinolítica cardíaca nos animais hipertensos, sugerindo que a ativação

das MMPs associadas à hipertensão 2R1C podem ser moduladas via EROs.

A degradação da matriz extracelular é fundamental para o remodelamento

cardíaco, por isso a contribuição de várias MMPs foi relatada em diversos estudos

experimentais de HVE (Lopez, Gonzalez et al. 2006; Manso, Elsherif et al. 2006;

Wang, Chow et al. 2009). Entretanto, evidências sugerem que a MMP-2 pode estar

mais amplamente relacionada às alterações morfofuncionais cardíacas (Wang,

Bergman et al. 2006; Bergman, Teerlink et al. 2007; Schulz 2007). Foi mostrado que

Discussão 89

animais transgênicos que superexpressam esta gelatinase, sem a indução de

nenhuma doença, desenvolveram HVE e disfunção na contratilidade cardíaca

(Bergman, Teerlink et al. 2007). Com isso, é altamente sugestivo que o aumento da

MMP-2 e da atividade gelatinolítica total encontradas no miocárdio dos ratos 2R1C,

pode estar associada às disfunções morfofuncionais cardíacas secundárias à

hipertensão.

Para avaliar se o aumento da MMP-2 contribuiu para a hipertrofia cardíaca

nos animais 2R1C, foi administrada doxiciclina (inibidor não seletivo de MMPs).

Estudos mostraram que a dose de 30mg/kg/dia diminui a atividade das MMPs de

forma independente de seus efeitos antibióticos (Golub, Lee et al. 1998).

O tratamento com doxiciclina inibiu o aumento da atividade gelatinolítica total

e reverteu as alterações estruturais associadas à hipertensão 2R1C. Os efeitos

benéficos ocorreram apesar da persistência da sobrecarga cardíaca, pois mesmo

atenuando a hipertensão nos animais 2R1C, a pressão arterial sistólica se manteve

elevada após o tratamento com doxiciclina. O aumento da expressão da MMP-2

(por imunomarcação) coincide com o aumento da atividade gelatinolítica observada

nos ratos 2R1C, sugerindo a possível contribuição desta gelatinase no aumento da

proteólise observada nestes animais. Dessa maneira, a doxiciclina pode não atenuar

significativamente as concentrações da MMP-2 no tecido, mas pode ter inibido sua

atividade sugerindo a contribuição desta protease nas alterações morfofuncionais

associadas à hipertensão 2R1C.

Aumento de MMP-2 cardíaca foi observado em outros estudos com diferentes

modelos de hipertensão como, ratos Dahl sensíveis ao sal e SHR (Mujumdar, Smiley

et al. 2001; Iwanaga, Aoyama et al. 2002). Esses estudos encontraram resultados

Discussão 90

semelhantes ao nosso mostrando que a MMP-2 aumentada pode estar associada ao

remodelamento cardíaco (Iwanaga, Aoyama et al. 2002) e na disfunção da

contratilidade cardíaca (Mujumdar, Smiley et al. 2001). Além disso, em animais

“knockouts” para MMP-2 foi mostrado que a supressão desta gelatinase atenuou a

hipertrofia cardíaca associada à coarctação de aorta (Matsusaka, Ide et al. 2006),

sugerindo a participação da MMP-2 para a HVE.

Existem evidências da contribuição das MMPs, incluindo MMP-2, na

progressão da hipertrofia cardíaca. Foi mostrado que a MMP-2, dentre outras MMPs,

aumentam progressivamente acompanhando a evolução do remodelamento

cardíaco para insuficiência cardíaca em animais hipertensos (Mujumdar and Tyagi

1999; Peterson, Hallak et al. 2001; Iwanaga, Aoyama et al. 2002). Um outro estudo

avaliou os efeitos de um inibidor de MMPs não seletivo (PD166793), em animais

SHR. Os autores observaram que a inibição das MMPs, incluindo MMP-2, impediu a

progressão do remodelamento cardíaco, mas não reverteu as alterações cardíacas

encontradas antes do tratamento nos animais SHR (Peterson, Hallak et al. 2001).

No nosso estudo, os animais 2R1C apresentaram características de

hipertrofia adaptativa devido ao aumento na espessura da parede ventricular

esquerda e aumento na contratilidade cardíaca. Por isso, nosso resultados mostram

que o aumento da MMP-2 está presente desde a hipertrofia cardíaca adaptativa e

que a inibição das MMPs na fase adaptativa do remodelamento favorece a

regressão ou atenuação deste remodelamento cardíaco.

Em conjunto aos nossos resultados, as evidências sugerem que a inibição

das MMPs pode ser uma possível estratégia terapêutica para tratar da hipertrofia

cardíaca secundária à HAS.

Discussão 91

Os efeitos associados ao tratamento com doxiciclina são semelhantes à

recentes resultados obtidos em nosso laboratório em aortas de animais 2R1C

(Castro, Rizzi et al. 2009). Foi observado que esse inibidor de MMPs preveniu

completamente as alterações na aorta de ratos associadas a um aumento de MMP-2

em animais 2R1C, mesmo a pressão arterial sendo parcialmente reduzida (Castro,

Rizzi et al. 2009). Em conjunto aos resultados do presente estudo, estes achados

sugerem que as MMPs, especialmente MMP-2, participam do remodelamento

cardiovascular associado à hipertensão renovascular 2R1C.

Como comentado anteriormente, a doxiciclina é uma ferramenta

farmacológica de grande interesse para o tratamento de doenças cardiovasculares,

pois seu uso como inibidor de MMPs já é aprovado pelo FDA. Neste sentido, vários

estudos foram realizados com doxiciclina avaliando seus efeitos sobre o aparelho

cardiovascular (Griffin, Jinno et al. 2005; Tessone, Feinberg et al. 2005; Garcia, Go

et al. 2007; Schulz 2007; Spinale 2007). Este inibidor (30 mg/Kg/dia, v.o.) reduziu a

área de infarto associado a uma melhora na disfunção sistólica de animais (Griffin,

Jinno et al. 2005; Garcia, Go et al. 2007). Em oposição a estes resultados,

doxiciclina (100 mg/Kg/dia, subcutânea) não preveniu o remodelamento ventricular e

prejudicou a hipertrofia adaptativa depois do infarto (Tessone, Feinberg et al. 2005).

Além disso, em outro estudos, doxiciclina (160 mg/Kg/dia, v.o.) acelerou a

progressão para insuficiência cardíaca em ratos sujeitos à coarctação de aorta

(Vinet, Rouet-Benzineb et al. 2008). As discrepâncias encontradas nestes estudos

podem ser devido à dose de doxiciclina administrada. Doses menores (30

mg/Kg/dia) mostram efeitos benéficos, enquanto doses maiores (>100 mg/Kg/dia)

mostram efeitos deletérios. Consistente com esta sugestão, no presente estudo a

doxiciclina (30 mg/Kg/dia) foi efetiva em reduzir as alterações morfofuncionais

Discussão 92

cardíacas associadas a hipertensão. Devido a importância desta droga para inibição

de MMPs, estes resultados reforçam a necessidade de mais estudos dose-resposta

para avaliar melhor os efeitos produzidos pela doxiciclina.

Existem evidências sugerindo que além de inibir as MMPs, a doxiciclina pode

atuar como anti-inflamatório, anti-apoptótico e antioxidante (Lai, Yeh et al.; Golub,

Lee et al. 1998; Webster and Del Rosso 2007). Um aumento na formação de ROS,

inflamação e apoptose estão envolvidos na fisiopatologia da hipertensão, e podem

direcionar a disfunções cardíacas (Grieve and Shah 2003; Touyz and Schiffrin 2004;

Opie, Commerford et al. 2006; Savoia and Schiffrin 2006; Berk, Fujiwara et al. 2007;

Sirker, Zhang et al. 2007). Dessa maneira, estes efeitos adicionais associados à

doxiciclina podem estar envolvidos com os efeitos benéficos desta droga observados

neste estudo.

De maneira geral, nossos resultados sugerem que as MMPs estão envolvidas

no desenvolvimento das alterações cardíacas estruturais e funcionais na hipertrofia

induzida pela hipertensão 2R1C. Assim sendo, fatores responsáveis pela ativação

dessas proteases poderiam contribuir para fisiopatologia da hipertrofia cardíaca

nestes animais.

As MMPs podem ser reguladas em três níveis: (i) expressão do RNAm, (ii)

atividade: através da remoção do propeptídeo inibitório e (iii) inibição por TIMPs

(Visse and Nagase 2003). Entretanto, o mecanismo responsável pelo aumento da

MMP-2 e atividade gelatinolítica nos animais 2R1C ainda não está claro. Como já

comentado na introdução, o estresse oxidativo pode aumentar a atividade das

MMPs indiretamente (aumentando as concentrações de MMPs) e diretamente

(ativando MMPs) (Rajagopalan, Meng et al. 1996; Siwik, Pagano et al. 2001;

Discussão 93

Martinez, Lopes et al. 2006; Lu, Xu et al. 2008; Castro, Rizzi et al. 2009; Schulz

2009). Isso sugere que EROs poderia contribuir para a ativação das MMPs e as

disfunções cardíacas associadas à hipertensão 2R1C.

Já foi mostrado in vitro (Viappiani, Nicolescu et al. 2009) que a incubação de

MMP-2 recombinante com diferentes concentrações de OONO- leva ao aumento da

atividade da MMP-2 nas doses de 0,3 -10 µM e à diminuição da atividade desta na

concentração de 100 µM. Quando a glutationa é adicionada, esta parece proteger a

MMP-2 da oxidação. Esse estudo também caracterizou o efeito do OONO- e da

glutationa em um peptídeo de 17 aminoácidos que corresponde à seqüência do

propeptídeo da MMP-2 que contém o sulfidril, e mostrou que este se oxida e

também sofre glutationação. Essas formas da MMP-2 modificada por OONO- e

glutationa não foram ainda descritas na hipertensão, e se encontrados nessa doença

podem talvez, ser marcadores do estresse oxidativo no tecido. Nossos resultados

mostraram apenas o estresse oxidativo no coração e sua associação com o

aumento da atividade gelatinolítica, mas futuros estudos do nosso grupo abordarão

a caracterização das formas da MMP-2 encontradas no coração e aortas de animais

hipertensos.

Em relação ao exposto acima, nosso estudo foi o primeiro a mostrar que os

tratamentos com tempol e apocinina atenuaram as alterações cardíacas associadas

à hipertensão, em paralelo a uma redução da atividade gelatinolitica total.

Tratamentos com tempol e apocinina têm sido amplamente utilizados para avaliar a

contribuição de EROs na hipertrofia cardíaca em diversos modelos experimentais

(Liu, Zhou et al.; Rugale, Delbosc et al. 2007; Alvarez, Caldiz et al. 2008; Chess, Xu

et al. 2008), e assim como observado em nossos resultados, muitos estudos

sugerem importante participação de EROS na fisiopatologia da hipertrofia ventricular

Discussão 94

esquerda (Liu, Zhou et al.; Zhang, Kimura et al. 2005; Rugale, Delbosc et al. 2007;

Alvarez, Caldiz et al. 2008; Chess, Xu et al. 2008; Stefanska and Pawliczak 2008;

Wang, Shimosawa et al. 2008; Wilcox 2010).

Como descrito anteriormente, um aumento das concentrações de EROs pode

levar a várias das alterações cardíacas observadas na hipertensão. Dentre elas,

podem ser destacadas: a disfunção endotelial, disfunção na contratilidade cardíaca,

a peroxidação lipídica e o aumento da atividade de algumas MMPs (Cai and

Harrison 2000; Griendling, Sorescu et al. 2000; Akki, Zhang et al. 2009; Ceron,

Castro et al. 2010). De acordo com isso, nossos resultados mostraram que os

tratamentos crônicos com antioxidantes reduziram a formação de EROs e

preveniram as alterações estruturais e funcionais, encontradas nos animais

hipertensos, sugerindo, assim, a contribuição de EROs nas disfunções

morfofuncionais cardíacas.

Nossos resultados mostram que os dois tratamentos antioxidantes, com

tempol e apocinina foram igualmente benéficos. Muitos trabalhos descrevem

apocinina como inibidor de NADPH oxidase, e que os efeitos do tempol podem ser

atribuídos à redução de anion O2-., que é o primeiro EROS a ser formado após

ativação da NADPH oxidase, como comentado anteriormente (Touyz and Schiffrin

2004). Embora a atividade de NADPH oxidase e a quantidade específica de cada

EROs formado não foram avaliados neste estudo, nossos resultados sugerem uma

importante contribuição da ativação da ativação de NADPH oxidase para a

hipertrofia cardíaca nos animais 2R1C. Essa sugestão está de acordo com outros

trabalhos em outros modelos de hipertrofia cardíaca (Landmesser, Cai et al. 2002;

Modlinger, Chabrashvili et al. 2006; Murdoch, Grieve et al. 2006; Murdoch, Zhang et

al. 2006; Akki, Zhang et al. 2009)

Discussão 95

A redução na formação de EROs pelos tratamentos antioxidantes, foi

concomitante à redução na atividade gelatinolítica no VE dos animais hipertensos.

Embora os tratamentos com antioxidantes não afetaram as concentrações de MMP-

2 no tecido, tem sido descrito que EROs pode ativar MMPs mesmo na presença do

propeptídeo. Como descrito na introdução, EROs pode interagir com o grupo tiol

presente no propeptídeo e com o zinco presente no domínio catalítico, assim

resultando na ativação da enzima mesmo na presença do propetídeo (Okamoto,

Akaike et al. 2001; Schulz 2007; Viappiani, Nicolescu et al. 2009). Por isso, nossos

resultados sugerem que os tratamentos com antioxidantes não diminuem a

expressão tecidual da MMP-2 no animais hipertensos, mas possivelmente diminuem

a atividade da MMP-2 (da 72 kDa MMP-2, com seu propeptídeo).

Recentemente, têm sido descrito que a capacidade de inibição das MMPs

pelos TIMPs pode ser perdida na presença dos EROs, como ONOO- ou HOCl

(Frears, Zhang et al. 1996; Brown 2008; Donnini, Monti et al. 2008) favorecendo,

assim um aumento na atividade das MMPs quando EROs está aumentado como

observado nos animais 2R1C não tratados do nosso estudo. Consequentemente,

mesmo se as concentrações de TIMPs estiverem aumentadas na hipertensão

contrabalançando o aumento na atividade das MMPs, esses TIMPs poderiam ter

perdido sua atividade funcional, sendo menos efetivos em inibir as MMPs.

Como já comentado, muitas evidências têm chamado a atenção para

importância das MMPs, especialmente MMP-2, no remodelamento cardíaco

associado a várias doenças que afetam o coração como: isquemia, infarto, HAS ou

outras doenças que aumentem pré ou pós carga cardíaca (Peterson, Hallak et al.

2001; Iwanaga, Aoyama et al. 2002; Spinale 2002; Matsusaka, Ide et al. 2006;

Schulz 2007; Spinale 2007). Em concordância com estes achados, as

Discussão 96

concentrações de MMP-2 e a atividade gelatinolítica total foram aumentadas nos

animais 2R1C com hipertrofia do miocárdio. Como os tratamentos antioxidantes

reduziram as alterações morfológicas associadas à hipertensão, concomitantemente

com uma redução na atividade das MMPs, nosso resultados sugerem que EROs

poderia aumentar a atividade das MMPs, contribuindo para o remodelamento

cardíaco observado nos animais hipertensos.

Além da matriz extracelular a MMP-2, dentro dos cardiomiócitos, pode

contribuir diretamente para a disfunção cardíaca através da degradação de

proteínas contráteis como miosina de cadeia leve e troponina (Schulz 2007) que

poderia estar implicada na disfunção da contratilidade cardíaca, observada nos

animais 2R1C no presente estudo. Existem evidências de que disfunção cardíaca

por EROs, em modelos animais de isquemia e reperfusão, pode ser devido à

ativação da MMP-2 no miocárdio destes animais (Wang, Sawicki et al. 2002; Wang,

Schulze et al. 2002; Sawicki, Leon et al. 2005). Sendo assim, nosso resultados

mostraram que o tratamento com antioxidantes reverteram completamente as

alterações na contratilidade cardíaca ventricular esquerda, encontrada nos animais

2R1C, paralelo à redução da atividade das MMPs no tecido desses animais.

As disfunções na contratilidade, associadas ao aumento de EROS em

modelos experimentais de hipertensão, podem ser devido a vários mecanismos

como, ativação do receptor mineralocorticóide (Wang, Shimosawa et al. 2008),

redução da biodisponibilidade do óxido nítrico (Moens, Takimoto et al. 2008; Wilcox

2010), e alterações na sinalização intracelular de cálcio(Akki, Zhang et al. 2009).

Nosso estudo, considerando possíveis limitações, pode sugerir que a ativação de

MMP-2 pode ser um possível mecanismo para a disfunção cardíaca associada a

EROs na hipertensão renovascular.

Discussão 97

Os tratamentos antioxidantes produziram efeitos, tanto na pressão arterial,

como na atividade das MMPs, e por isso, é difícil separar os dois efeitos. Em outros

estudos a inibição da atividade da NADPH oxidase por RNA de interferência, reduz a

pressão arterial em animais após infusão de angiotensina II (Modlinger, Chabrashvili

et al. 2006). Por outro lado, animais knockouts para SOD aumentam estresse

oxidativo e MMP-2 exacerbando a hipertrofia ventricular esquerda após coarctação

de aorta (Lu, Xu et al. 2008). Estes achados, em conjunto, estão de acordo com

nossos resultados mostrando que os dois efeitos, redução na pressão arterial e

redução da atividade gelatinolítica, podem ocorrer quando EROs é diminuído.

Os tratamentos normalizaram a atividade gelatinolítica tecidual, indicando que

efeitos benéficos associados aos tratamentos antioxidantes parecem ser mais

relacionados à inibição das MMPs, do que a redução na pressão arterial. Além

disso, a pressão arterial nos animais 2R1C tratados com doxiciclina ou antioxidantes

foi mantida em níveis elevados e sustentados por oito semanas, induzindo um

aumento significativo na pós-carga cardíaca destes animais. Por isso,

provavelmente os efeitos dos tratamentos são mais associados à redução da

atividade gelatinolítica do que à redução na pressão arterial.

De forma geral, nossos resultados sugerem que as MMPs podem contribuir

para HVE presente nos animais 2R1C. Além disso, o estresse oxidativo pode estar

relacionado com o aumento da atividade das MMPs observado nesse modelo

experimental. Contudo, sugere-se que a inibição das MMPs pode ter efeitos

protetores contra as alterações cardíacas associadas à hipertensão.

CONCLUSÃO

Conclusão 99

CONCLUSÃO

1- A análise conjunta destes resultados sugere que as MMPs, especialmente a

MMP-2, participem das alterações cardíacas associadas ao modelo de hipertensão

renovascular 2R-1C.

2- Há fortes evidências de que a redução do estresse oxidativo modula

negativamente o aumento da MMP-2 e das alterações cardíacas observadas neste

modelo experimental.

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ANEXOS

Anexos 114

ANEXOS

Anexos 115

Anexos 116

Anexos 117

Anexos 118

Anexos 119

Anexos 120

Anexos 121

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Anexos 123

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